JP2023529545A - ポリペプチドアルブミンナノ粒子、およびその調製方法と使用 - Google Patents

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Abstract

本願は、ポリペプチドアルブミンナノ粒子、およびその調製方法と使用に関する。前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子は、カチオン性の両親媒性ポリペプチドとアルブミンにより組付けて形成する。前記カチオン性の両親媒性ポリペプチドは、その疎水性部分がアルブミンと結合し、カチオン性の両親媒性ポリペプチドに運ばれる正電荷がアルブミンの表面における負電荷と相互作用できることにより、カチオン性の両親媒性ポリペプチドとアルブミンを組付けさせてポリペプチドアルブミンナノ粒子を形成する。前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子は、カチオン性の両親媒性ポリペプチドがアルブミンと相互作用することにより、安定性を向上させるとともに、溶血毒性を低下させ、高いターゲティングを性有しながら、腫瘍細胞のオンコーシスを誘導して、生体自身の抗腫瘍免疫反応を誘発することができることで、ターゲティング性が高く、腫瘍細胞を効率的に殺傷する効果を実現する。【選択図】図１

Description

本願は、バイオ医薬の技術分野に属し、ポリペプチドアルブミンナノ粒子、およびその調製方法と使用に関する。
アルカリ性アミノ酸および疎水性アミノ酸からなるカチオン性の両親媒性ポリペプチドは、そのカチオン（正電荷）および両親媒性（親水性と疎水性）の特徴によりバイオフィルムにおけるリン脂質および糖類分子が静電作用や疎水作用を生じることで、膜分裂又は膜貫通の殺傷作用を発揮することができる。
バイオフィルムは、機能が重要であり、構造が均一であり、且つ遺伝子変異と関係がない。多くの研究によれば、膜分裂又は膜貫通の殺傷メカニズムによる薬物が腫瘍の薬物耐性を引き起こすことはないと考えられており、さらに、腫瘍細胞が正常の細胞よりも表面に多い負電荷を有し、多めのカチオンを含有する両親媒性ポリペプチドが腫瘍細胞に対してより高い選択的な殺傷効果を発生することができるため、カチオン性の両親媒性ポリペプチドは、抗腫瘍薬物の分野において広い発展見込みを有すると認められている。しかしながら、カチオン性の両親媒性ポリペプチドは、溶血反応を引き起こしやすく、インビボ動力学、ターゲティング性および毒性・副作用などの問題が存在するので、その抗腫瘍薬物の調製における使用が限定されている。
現在、カチオン性の両親媒性ポリペプチドの製薬最適化方法には、主に化学修飾、および担体システムの採用が含まれている。化学修飾は、例えば、非天然のＤ型アミノ酸でＬ型アミノ酸を置き換えること、ポリペプチドを環化させること、および、ペプチド鎖の側鎖を保留し主鎖を修飾してアナログペプチドを調製することなどにより、酵素の分解に抵抗する可能性がある程度あるが、安全性および腫瘍のターゲティング性の問題を解決することはできず、さらにＤ型ポリペプチドの経済的コストが高い。ポリエチレングリコール修飾（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）は、組織における非特異的摂取を減少し、細胞の毒性を低減し、血液の半減期を増加し、タンパク質分解を減少するという利点を有するが、ポリペプチドの活性を低減させる。脂質修飾は、カチオン性の両親媒性ポリペプチドの製薬に最も有利な方法であると考えられおり、脂肪酸のタイプ、脂質アンカー位置又はインターバル挿入などを含む脂質化手段の微細な変化は、いずれも、脂質化ペプチドの物性、バイオ活性および薬物動態に対して大きな影響があるが、脂質化手段の設計過程は複雑で、難度が高い。
担体システムを用いてカチオン性の両親媒性ポリペプチドの安定性、毒性、半減期およびターゲティング性を改善することは、別の製薬化ポリシーである。しかし、構造の類似性により、一部の、同様に疎水性末端および親水性末端を含有するモノマーからなるポリマーミセル又はリポソームは、カチオン性の両親媒性ポリペプチドにより破壊される可能性があり、ある程度配達の難度が増加してしまう。現在、このような担体システムは、基礎研究の段階にとどまっている。ある研究者により、シリカナノ粒子が薬物担持系として抗菌ペプチドＬＬ－３７を担持していることが報告されている。しかし、抗菌ペプチドＬＬ－３７をシリカナノ粒子に担持することにより、ポリペプチドの酵素分解に対する抵抗能力を向上させるが、薬物担持量が低く、溶血毒性があるなどの問題が依然として存在している（Ｂｒａｕｎ Ｋ、Ｐｏｃｈｅｒｔ Ａ、Ｌｉｎｄｅｎ Ｍｉｋａ、ｅｔ ａｌ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ＆Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ、２０１６、４７５：１６１－１７０．）。Ｈｕａｎｇらにより、カチオン性の両親媒性ポリペプチドｍｅｌｉｔｔｉｎのＮ端に、ナノ構造を調節・制御可能なα－ヘリックスペプチドを１本結合して、ｍｅｌｉｔｔｉｎのカチオンをリポソームのリン脂質に深く埋め込むことにより、ある程度ｍｅｌｉｔｔｉｎの溶血効果を回避することができることが報告されている。しかしながら、このように別のポリペプチドを１本結合するという方法は、ポリペプチドの物性を変える恐れがあり、その適用範囲もさらに検証する必要がある（Ｈｕａｎｇ Ｃ、Ｊｉｎ Ｈ、Ｑｉａｎ Ｙ、ｅｔ ａｌ．Ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｌｉｔｔｉｎ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｄｒｉｖｅｎ ｕｌｔｒａｓｍａｌｌ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｂｌｏｃｋ ｍｅｌａｎｏｍａ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ．［Ｊ］．ＡＣＳ Ｎａｎｏ、２０１３、７（７）：５７９１－８００．）。また、ある研究により、Ａｕ－Ｓ結合で膜分裂ペプチドｃＴＬを金ナノケージに結合し、外層においてＳＨ－ｍＰＥＧでさらに修飾することにより、該ナノ粒子が近赤外光により照射された後、溶血毒性が明らかに向上することで、照射後および未照射の腫瘍細胞のいずれを損傷させることが報告されている。しかし、このような金属担体のポリペプチド系には、光／近赤外光がトリガすると、非腫瘍細胞に対して細胞毒性を有する潜在的なリスクが存在し、その安全性をさらに評価する必要がある（Ｊｉ－Ｇａｎｇ Ｐｉａｏ、Ｄｏｎｇ Ｌｉｕ、Ｋａｎ Ｈｕ、ｅｔ ａｌ．Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ Ｔｕｍｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｓｋｉｎ Ｄａｍａｇｅ［Ｊ］．ＡＣＳ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ＆Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、２０１６、８（４）：ａｃｓａｍｉ．５ｂ１１６６４．）。
要するに、従来技術において薬物担持系が安定せず、調製難度が高く、薬物担体のバイオ安全性が疑わしいなどの問題が存在することに対して、本願は、バイオ安全性、安定性、腫瘍ターゲティング性および腫瘍殺傷作用が良好なカチオン性の両親媒性ポリペプチドを提供し、カチオンフィルム活性抗腫瘍薬物の製剤の調製に用いられ、薬物の体内配達および治療使用を実現し、抗腫瘍薬物の調製分野において重要な意義を有する。
本願は、ポリペプチドアルブミンナノ粒子、およびその調製方法と使用を提供する。前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子は、高い安定性およびターゲティング性を有し、溶血毒性・副作用が低く、オンコーシスメカニズム（Ｏｎｃｏｓｉｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）によって腫瘍細胞を殺傷しながら、生体自身の抗腫瘍免疫反応を誘発することができ、抗腫瘍薬物の調製において広い発展見込みがある。
第１の態様として、本願は、カチオン性の両親媒性ポリペプチドおよびアルブミンにより組付けて形成するポリペプチドアルブミンナノ粒子を提供する。
本願において、前記カチオン性の両親媒性ポリペプチドは、その疎水性部分がアルブミンと結合し、カチオン性の両親媒性ポリペプチドに運ばれる正電荷がアルブミンの表面における負電荷と相互作用できることにより、カチオン性の両親媒性ポリペプチドとアルブミンを組付けさせてポリペプチドアルブミンナノ粒子を形成する（図１に組付模式図を示す）。組付けでポリペプチドアルブミンナノ粒子を形成し、カチオン性の両親媒性ポリペプチドをアルブミンに埋め込むことで、カチオン性の両親媒性ポリペプチドが分解酵素および赤細胞膜に接触することを回避して、カチオン性の両親媒性ポリペプチドの安定性および安全性を向上させることができる。
本願において、ポリペプチドアルブミンナノ粒子は、ナノメータサイズであり、透過が高く、滞留が長いという効果を有し、そのうちのアルブミンが腫瘍細胞により主動的に吸収されて集積されることができることから、高いターゲティング性を有しながら、腫瘍細胞のオンコーシスを誘導して、生物自身の抗腫瘍免疫反応を誘発することができることで、ターゲティング性が高く、腫瘍細胞を効率的に殺傷するという効果を実現する。
好ましくは、前記カチオン性の両親媒性ポリペプチドは、疎水性部分および親水性部分を含む。
好ましくは、前記親水性部分は、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）又はヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せを含む。そのうち、典型的であるが非限定的な組合せは、アルギニンとリジンの組合せ、アルギニンとヒスチジンの組合せ又はアルギニン、リジンおよびヒスチジンの組合せを含み、アルギニンであることが好ましい。
好ましくは、前記疎水性部分は、［Ｉｒ（ｐｐｙ）２（Ｈ２Ｏ）２］ＯＴｆ、疎水性アミノ酸又は脂質のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せを含む。そのうち、典型的であるが非限定的な組合せは、［Ｉｒ（ｐｐｙ）２（Ｈ２Ｏ）２］ＯＴｆと疎水性アミノ酸の組合せ又は疎水性アミノ酸と脂質の組合せを含む。
好ましくは、前記疎水性アミノ酸は、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｆ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）又はアラニン（Ａｌａ、Ａ）のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せを含む。そのうち、典型的であるが非限定的な組合せは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンおよびトリプトファンの組合せ；フェニルアラニン、ロイシンおよびトリプトファンの組合せ又はロイシン、イソロイシン、トリプトファンおよびバリンの組合せを含む。
好ましくは、前記脂質は、コレステロールおよびその誘導体又は脂肪酸およびその誘導体のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せを含む。
好ましくは、前記カチオン性の両親媒性ポリペプチドの構造式は、式Ｉ又は式IIで表される。ただし、ｎは、アルギニン残基の数で、１～９の整数であり、２、３、５、６、７又は８を含むがそれらに限定されず、５～９であることが好ましく、８であることがより好ましい。
Figure 2023529545000002
本願において、疎水性イリジウム配位子［Ｉｒ（ｐｐｙ）２（Ｈ２Ｏ）２］ＯＴｆと親水性オリゴアルギニン（ｏｌｉｇｏａｒｇｉｎｉｎｅ）を結合することにより、両親媒性イリジウム配位オリゴアルギニンポリペプチドを得ることができる。前記両親媒性イリジウム配位オリゴアルギニンポリペプチドは、静電作用および疎水作用でバイオフィルムにおけるリン脂質および糖類分子と吸着することにより、膜分裂又は膜貫通の殺傷作用を果たし、腫瘍細胞の活性を抑制する能力を向上させることができる。
好ましくは、前記カチオン性の両親媒性ポリペプチドの一段構造は、ＣＨ３ＣＯ－ＸＲｎ－ＣＯＮＨ２又は脂質－Ｒｎ－ＣＯＮＨ２である。ただし、Ｘは、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ又はＡｌａのうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せを含み、ｎは、アルギニン残基の数で、１～１２の整数であり、２、３、５、６、８、９又は１１を含むがそれらに限定されず、３～９であることが好ましく、５～９であることがより好ましく、８であることがさらに好ましい。
好ましくは、Ｘは、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、ＭｅｔおよびＡｌａをそれぞれ１～５個含み、２個、３個又は４個を含むがそれらに限定されず、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｒｐをそれぞれ１～５個含むことが好ましい。
好ましくは、前記カチオン性の両親媒性ポリペプチドの一段構造は、ＣＨ３ＣＯ－ＦＷＬＦＬＲＲＲＲＲＲＲＲ－ＣＯＮＨ２又はｃｈｏｌ－ＲＲＲＲＲＲＲＲ－ＣＯＮＨ２であり、ｃｈｏｌは、コレステロールである。
好ましくは、前記アルブミンは、哺乳動物アルブミンを含む。
好ましくは、前記哺乳動物アルブミンは、ヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ、ＨＳＡ）及び／又は牛血清アルブミンを含む。
第２の態様として、本願は、第１の態様に記載されたポリペプチドアルブミンナノ粒子の調製方法であって、
それぞれ、カチオン性の両親媒性ポリペプチド溶液とアルブミン溶液を調製し、モル比で前記カチオン性の両親媒性ポリペプチド溶液とアルブミン溶液を混合し、前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子を得ることを含む調製方法を提供する。
好ましくは、前記カチオン性の両親媒性ポリペプチド溶液の濃度は、２０～５０００μＭであり、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭ、１０００μＭ、２０００μＭ、３０００μＭ、３５００μＭ、４０００μＭ、４２００μＭ、４４００μＭ、４８００μＭ又は４９００μＭを含むがそれらに限定されない。
好ましくは、前記アルブミン溶液の濃度は、２０～５０００μＭであり、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭ、１０００μＭ、２０００μＭ、３０００μＭ、３５００μＭ、４０００μＭ、４２００μＭ、４４００μＭ、４８００μＭ又は４９００μＭを含むがそれらに限定されない。
好ましくは、前記カチオン性の両親媒性ポリペプチド溶液におけるカチオン性の両親媒性ポリペプチドと前記アルブミン溶液におけるアルブミンのモル比は、（０．１～１０）：１であり、０．２：１、０．８：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１又は９：１を含むがそれらに限定されない。
好ましくは、前記混合の温度は、５～１００℃であり、６℃、７℃、９℃、１０℃、１５℃、３０℃、４０℃、５０℃、７０℃、８０℃、８５℃、９０℃、９２℃、９４℃又は９８℃を含むがそれらに限定されない。
好ましくは、前記混合の時間は、０．５～１２０ｍｉｎであり、０．６ｍｉｎ、０．７ｍｉｎ、０．９ｍｉｎ、１．５ｍｉｎ、２ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、５０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、８０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１００ｍｉｎ、１１０ｍｉｎ又は１１５ｍｉｎを含むがそれらに限定されない。
好適な技術態様としては、前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子の調製方法は、
カチオン性の両親媒性ポリペプチドを、水、４０～６０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩緩衝液又は１０～２０ｍＭのリン酸塩緩衝液に添加し、２０～５０００μＭのカチオン性の両親媒性ポリペプチド溶液を得て、アルブミンを、水又は１０～２０ｍＭのリン酸塩緩衝液に添加し、２０～５０００μＭのアルブミン溶液を得るステップ（１）；
カチオン性の両親媒性ポリペプチドとアルブミンのモル比（０．１～１０）：１で、カチオン性の両親媒性ポリペプチド溶液とアルブミン溶液を混合し、水又はリン酸塩緩衝液を添加し、５～１００℃で０．５～１２０ｍｉｎ混合し、前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子を得るステップ（２）を含む。
本願において、常圧の条件下で、単純にカチオン性の両親媒性ポリペプチド溶液およびアルブミン溶液を混合すれば、前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子を得ることができ、他の化学修飾が要らず、コストが低く、再現性がよい。
第３の態様として、本願は、第１の態様に記載されたポリペプチドアルブミンナノ粒子を含む医薬組成物を提供する。
好ましくは、前記医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せをさらに含む。
第４の態様として、本願は、第１の態様に記載されたポリペプチドアルブミンナノ粒子又は第３の態様に記載された医薬組成物の抗腫瘍薬物の調製における使用を提供する。
従来技術と比べ、本願は、以下の有益な効果を有する。
（１）本願において、前記カチオン性の両親媒性ポリペプチドは、疎水性部分がアルブミンと結合し、カチオン性の両親媒性ポリペプチドに運ばれる正電荷がアルブミン表面における負電荷と相互作用できることにより、カチオン性の両親媒性ポリペプチドとアルブミンを組付けさせてポリペプチドアルブミンナノ粒子を形成する。前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子は、カチオン性の両親媒性ポリペプチドがアルブミンと相互作用して、安定性を向上させるとともに溶血毒性を低下させ、高いターゲティング性を有しながら、腫瘍細胞のオンコーシスを誘導し、生物自身の抗腫瘍免疫反応を誘発することができることで、ターゲティング性が高く、腫瘍細胞を効率的に殺傷するという効果を実現する。
（２）本願に係るポリペプチドアルブミンナノ粒子は、酵素分解を効果的に抑制することができ、血液における消失半減期が長く、高い安定性を有する；溶血作用が小さく、安全性が高い；腫瘍細胞が腫脹して細胞内容物を吐き出すことができ、オンコーシスを誘発する腫瘍殺傷メカニズムを有する；腫瘍箇所において効果的に蓄積することができ、ターゲティング性が高い；リンパ節の樹状細胞の成熟を促進し、Ｔ細胞（ＣＤ８＋）を増加させ、生体自身の抗腫瘍免疫反応を誘発することができる；完全にマウス乳がん皮下腫瘍を消失させるとともに、マウスが腫瘍細胞から二次侵害されないように保護することができる。
（３）本願において、常圧条件下で、単純にカチオン性の両親媒性ポリペプチド溶液とアルブミン溶液を混合すれば、前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子を得ることができ、他の化学修飾が要らず、コストが低く、再現性がよい
本願に係るポリペプチドアルブミンナノ粒子の組付模式図であり、そのうち、ｉ）は、ポリペプチドとアルブミンの結合モデル、ｉｉ）は、ポリペプチドアルブミン組成物の表面静電展示モデル、ｉｉｉ）およびｉｖ）は、ポリペプチドアルブミン組成物により組付けたナノ粒子である。 Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子の水和粒径の分布図である。 Ｉｒ－ｃＲ５－ＨＳＡナノ粒子の水和粒径の分布図である。 Ｉｒ－ａＲ８－ＨＳＡナノ粒子の水和粒径の分布図である。 ＦＲ－ＨＳＡナノ粒子の水和粒径の分布図である。 ＣＲ－ＨＳＡナノ粒子の水和粒径の分布図である。 Ｉｒ－ｃｒ８－ＨＳＡナノ粒子の水和粒径の分布図である。 Ｉｒ－ｍＫ８－ＨＳＡナノ粒子の水和粒径の分布図である。 Ｉｒ－ｃＫ８－ＨＳＡナノ粒子の水和粒径の分布図である。 Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子の透過型電子顕微鏡像である。 Ｉｒ－ｃＲ５－ＨＳＡナノ粒子の透過型電子顕微鏡像である。 Ｉｒ－ａＲ８－ＨＳＡナノ粒子の透過型電子顕微鏡像である。 ＦＲ－ＨＳＡナノ粒子の透過型電子顕微鏡像である。 ＣＲ－ＨＳＡナノ粒子の透過型電子顕微鏡像である。 カチオン性の両親媒性ポリペプチドの電荷数、およびカチオン性の両親媒性ポリペプチドとアルブミンの割合の、ポリペプチドアルブミンナノ粒子の組付けに対する影響を示す図である。 競合化合物の有無の条件下で、Ｉｒ－ｃＲ８とアルブミンにより組付た水和粒径の分布図である。 Ｉｒ－ｃＲ８およびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子の４Ｔ１細胞の活性に対する抑制作用を示す図である。 Ｉｒ－ｃＲ５およびＩｒ－ｃＲ５－ＨＳＡナノ粒子の４Ｔ１細胞の活性に対する抑制作用を示す図である。 Ｉｒ－ａＲ８およびＩｒ－ａＲ８－ＨＳＡナノ粒子の４Ｔ１細胞の活性に対する抑制作用を示す図である。 Ｉｒ－ｃＲ８およびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子を用いて孵化した４Ｔ１細胞のオンコーシス様子を示す図である。 Ｉｒ－ｃＲ５－ＨＳＡナノ粒子を用いて孵化した４Ｔ１細胞のオンコーシス図である。 Ｉｒ－ａＲ８－ＨＳＡナノ粒子を用いて孵化した４Ｔ１細胞のオンコーシス図である。 Ｉｒ－ｃＲ８およびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子の異なるｐＨ下での放出グラフである。 Ｉｒ－ｃＲ８およびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子の血清安定性を示す図である。 異なる時点でのＩｒ－ｃＲ８およびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子の血液における濃度を示す図である。 Ｉｒ－ｃＲ８およびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子の溶血毒性を示す図である。 Ｉｒ－ｃＲ８およびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子を尾静脈に注射した後の２４時間後のマウス体内における組織分布図である。 ＰＢＳ、ＨＳＡ、Ｉｒ－ｃＲ８およびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子を尾静脈に注射することによる、マウスの樹状細胞に対する成熟促進率を示す図である。 腫瘍組織におけるＴ細胞の割合を示す図である。 各実験群における腫瘍成長のグラフである。 ２２日目の各実験群における腫瘍サイズおよびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子群のマウスの写真であり、丸は、マウスがその前に死亡したことを示し、枠は、腫瘍がないことを示す。 腫瘍細胞がもう一度接種された後のマウスの腫瘍の成長情況を示すグラフである。 腫瘍細胞がもう一度接種された後の３０日目のマウスの写真である。
本願に用いられる技術手段およびその効果をさらに説明するために、以下、実施例及び図面を結び付けて本願について詳しく説明する。ここで記載される具体的な実施形態は、本願を解釈するためのものに過ぎず、本願を限定するものではないことを理解すべきである。
実施例において記載されていない具体的な技術または条件については、いずれも当該分野における文献に記載される技術または条件、若しくは製品マニュアルに基づいて行われるべきである。用いられる試料又は装置について、メーカーが記載されていないものは、いずれも正常のルートによって購入可能な通常の製品である。
実施例１
本実施例は、イリジウム配位オリゴアルギニンポリペプチドおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）により組付けて形成するポリペプチドアルブミンナノ粒子を提供する。前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子の調製方法は、以下のステップを含む。
３７℃で、モル比１：１で、オリゴアルギニンポリペプチドと［Ｉｒ（ｐｐｙ）２（Ｈ２Ｏ）２］ＯＴｆを、５０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）に１２ｈ混合し、式IIIで表されるイリジウム配位オリゴアルギニンポリペプチド（Ｉｒ－ｃＲ８）を得た。
Figure 2023529545000003
（２）Ｉｒ－ｃＲ８を超純水に添加し、５００μＭのＩｒ－ｃＲ８溶液を得た。ヒト血清アルブミンを取り、水で溶解させて同じ濃度のヒト血清アルブミン溶液を調製した。
（３）モル比１：１でＩｒ－ｃＲ８溶液およびヒト血清アルブミン溶液を混合し、同じ体積のリン酸塩緩衝液（１×ＰＢＳ）を添加した。室温下で２ｈ混合した後、１倍の現在体積の１×ＰＢＳを添加し、Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子を得た。
実施例２
本実施例は、イリジウム配位オリゴアルギニンポリペプチドおよびヒト血清アルブミンにより組付けて形成するポリペプチドアルブミンナノ粒子を提供する。前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子の調製方法は、以下のステップを含む。
（１）３７℃で、モル比１：１で、オリゴアルギニンポリペプチドとＩｒ（ｐｐｙ）２（Ｈ２Ｏ）２］ＯＴｆを５０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）に１２ｈ混合し、式ＩＶで表されるイリジウム配位オリゴアルギニンポリペプチド（Ｉｒ－ｃＲ５）を得た。
Figure 2023529545000004
（２）Ｉｒ－ｃＲ５を超純水に添加し、５００μＭのＩｒ－ｃＲ５溶液を得た。ヒト血清アルブミンを取り、水で溶解させて同じ濃度のヒト血清アルブミン溶液を調製した。
（３）モル比３：１でＩｒ－ｃＲ５溶液とヒト血清アルブミン溶液を混合し、同じ体積の超純水を添加した。室温下で２ｈ混合した後、１倍の現在体積の１×ＰＢＳを添加し、Ｉｒ－ｃＲ５－ＨＳＡナノ粒子を得た。
実施例３
本実施例は、イリジウム配位オリゴアルギニンポリペプチドおよびヒト血清アルブミンにより組付けて形成するポリペプチドアルブミンナノ粒子を提供する。前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子の調製方法は、以下のステップを含む。
（１）３７℃で、モル比１：１でオリゴアルギニンポリペプチドとＩｒ（ｐｐｙ）２（Ｈ２Ｏ）２］ＯＴｆを５０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）に１２ｈ混合し、式Ｖで表されるイリジウム配位オリゴアルギニンポリペプチド（Ｉｒ－ａＲ８）を得た。
Figure 2023529545000005
（２）Ｉｒ－ａＲ８を超純水に添加し、５００μＭのＩｒ－ａＲ８溶液を得た。ヒト血清アルブミンを取り、超純水で溶解させて同じ濃度のヒト血清アルブミン溶液を調製した。
（３）モル比２：１で、Ｉｒ－ａＲ８溶液とヒト血清アルブミン溶液を混合し、同じ体積の超純水を添加した。室温下で２ｈ混合し、１倍の現在体積の１×ＰＢＳを添加し、Ｉｒ－ａＲ８－ＨＳＡナノ粒子を得た。
実施例４
本実施例は、ＣＨ３ＣＯ－ＦＷＬＦＬＲＲＲＲＲＲＲＲ－ＣＯＮＨ２（ＦＲ）およびヒト血清アルブミンにより組付けて形成するポリペプチドアルブミンナノ粒子を提供する。前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子の調製方法は、以下のステップを含む。
（１）ＦＲを超純水に添加し、５００μＭのＦＲ溶液を得た。ヒト血清アルブミンを取り、超純水で溶解させて同じ濃度のヒト血清アルブミン溶液を調製した。
（２）モル比１：１でＦＲ溶液とヒト血清アルブミン溶液を混合し、同じ体積の超純水を添加し、５０℃で１ｍｉｎ水浴した。清澄になるまで、１×ＰＢＳを滴下した。そして、１倍の現在体積の超純水を添加し、ＦＲ－ＨＳＡナノ粒子を得た。
実施例５
本実施例は、ｃｈｏｌ－ＲＲＲＲＲＲＲＲ－ＣＯＮＨ２（ＣＲ）およびヒト血清アルブミンにより組付けて形成するポリペプチドアルブミンナノ粒子を提供する。前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子の調製方法は、以下のステップを含む。
（１）ＣＲを超純水に添加し、５００μＭのＣＲ溶液を得た。ヒト血清アルブミンを取り、超純水で溶解させて同じ濃度のヒト血清アルブミン溶液を調製した。
（２）モル比２：１で、ＣＲ溶液とヒト血清アルブミン溶液を混合し、同じ体積の超純水を添加した。５０℃で１ｍｉｎ水浴した。清澄になるまで、１×ＰＢＳを滴下した。そして、１倍の現在体積の超純水を添加し、ＣＲ－ＨＳＡナノ粒子を得た。
実施例６
本実施例は、イリジウム配位オリゴアルギニンポリペプチドおよびヒト血清アルブミンにより組付けて形成するポリペプチドアルブミンナノ粒子を提供する。前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子の調製方法は、以下のステップを含む。
（１）３７℃で、モル比１：１で、オリゴアルギニン（Ｄ型）ポリペプチドＣＨ３ＣＯ－ｈｒｒｒｒｒｒｒｒｈ－ＣＯＮＨ２と［Ｉｒ（ｐｐｙ）２（Ｈ２Ｏ）２］ＯＴｆを５０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）に２ｈ混合し、式VIで表されるイリジウム配位オリゴアルギニンポリペプチド（Ｉｒ－ｃｒ８）を得た。
Figure 2023529545000006
（２）Ｉｒ－ｃｒ８を超純水に添加し、５００μＭのＩｒ－ｃｒ８溶液を得た。ヒト血清アルブミンを取り、水で溶解させて同じ濃度のヒト血清アルブミン溶液を調製した。
（３）モル比１：１でＩｒ－ｃｒ８溶液とヒト血清アルブミン溶液を混合し、同じ体積の超純水を添加した。室温下で２ｈ混合した後、１倍の現在体積の１×ＰＢＳを添加し、Ｉｒ－ｃｒ８－ＨＳＡナノ粒子を得た。
実施例７
本実施例は、イリジウム配位オリゴポリペプチドおよびヒト血清アルブミンにより組付けて形成するポリペプチドアルブミンナノ粒子を提供する。前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子の調製方法は、以下のステップを含む。
（１）３７℃で、モル比１：１で、オリゴポリペプチドＣＨ３ＣＯ－ＫＫＫＫＨＨＫＫＫＫ－ＣＯＮＨ２と［Ｉｒ（ｐｐｙ）２（Ｈ２Ｏ）２］ＯＴｆを５０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）に２ｈ混合し、式VIIで表されるイリジウム配位オリゴアルギニンポリペプチド（Ｉｒ－ｍＫ８）を得た。
Figure 2023529545000007
（２）Ｉｒ－ｍＫ８を超純水に添加し、５００μＭのＩｒ－ｍＫ８溶液を得た。ヒト血清アルブミンを取り、水で溶解させて同じ濃度のヒト血清アルブミン溶液を調製した。
（３）モル比１：１でＩｒ－ｍＫ８溶液とヒト血清アルブミン溶液を混合し、同じ体積の超純水を添加した。室温下で６０ｍｉｎ混合し、１倍の現在体積の１×ＰＢＳを添加し、Ｉｒ－ｍＫ８－ＨＳＡナノ粒子を得た。
実施例８
本実施例は、イリジウム配位オリゴポリペプチドおよびヒト血清アルブミンにより組付けて形成するポリペプチドアルブミンナノ粒子を提供する。前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子の調製方法は、以下のステップを含む。
（１）３７℃で、モル比１：１でオリゴポリペプチドＣＨ３ＣＯ－ＨＫＫＫＫＫＫＫＫＨ－ＣＯＮＨ２と［Ｉｒ（ｐｐｙ）２（Ｈ２Ｏ）２］ＯＴｆを５０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）に２ｈ混合し、式VIIIで表されるイリジウム配位オリゴアルギニンポリペプチド（Ｉｒ－ｃＫ８）を得た。
Figure 2023529545000008
（２）Ｉｒ－ｃＫ８を超純水に添加し、５００μＭのＩｒ－ｃＫ８溶液を得た。ヒト血清アルブミンを取り、水で溶解させて同じ濃度のヒト血清アルブミン溶液を調製した。
（３）モル比１：１でＩｒ－ｃＫ８溶液とヒト血清アルブミン溶液を混合し、同じ体積の超純水を添加した。室温下で６０ｍｉｎ混合し、１倍の現在体積の１×ＰＢＳを添加し、Ｉｒ－ｃＫ８－ＨＳＡナノ粒子を得た。
試験例１
本試験例は、動的光散乱装置および透過型電子顕微鏡を用いて実施例１～８で調製したポリペプチドアルブミンナノ粒子の粒径を測定した。
１×ＰＢＳを用いて、それぞれＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子、Ｉｒ－ｃＲ５－ＨＳＡナノ粒子、Ｉｒ－ａＲ８－ＨＳＡナノ粒子、Ｉｒ－ｃｒ８－ＨＳＡナノ粒子、Ｉｒ－ｍＫ８－ＨＳＡナノ粒子およびＩｒ－ｃＫ８－ＨＳＡナノ粒子を１０μＭに希釈させ、ＦＲ－ＨＳＡナノ粒子およびＣＲ－ＨＳＡナノ粒子を２０μＭに希釈させた。２５℃で、動的光散乱装置を用いて測定した。形成したポリペプチドアルブミンナノ粒子のピークのみを算出し、結果は図２～図９に示すとおりである。
図２～図９からわかるように、Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子の平均水和粒径が１５５．６ｎｍ、Ｉｒ－ｃＲ５－ＨＳＡナノ粒子の平均水和粒径が２４０．６ｎｍ、Ｉｒ－ａＲ８－ＨＳＡナノ粒子の平均水和粒径が２５８．７ｎｍ、Ｉｒ－ｃｒ８－ＨＳＡナノ粒子の平均水和粒径が１４４．９ｎｍ、Ｉｒ－ｍＫ８－ＨＳＡナノ粒子の平均水和粒径が２６６．５ｎｍ、Ｉｒ－ｃＫ８－ＨＳＡナノ粒子の平均水和粒径が３２２．４ｎｍ、ＦＲ－ＨＳＡナノ粒子の平均水和粒径が３９６．１ｎｍ、ＣＲ－ＨＳＡナノ粒子の平均水和粒径が２９５．３ｎｍである。
１×ＰＢＳを用いて、それぞれ、Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子、Ｉｒ－ｃＲ５－ＨＳＡナノ粒子、Ｉｒ－ａＲ８－ＨＳＡナノ粒子、ＦＲ－ＨＳＡナノ粒子およびＣＲ－ＨＳＡナノ粒子を５００μＭに希釈させた後、それぞれ３００メッシュのカーボン支持膜へ滴下した。液滴が乾燥する直前に、１滴の３％のリンタングステン酸染色溶液を滴下して１～２ｍｉｎネガティブ染色した後、染色溶液を抽出した。水で３回洗浄した後、乾かした。透過型電子顕微鏡で分析し、結果は図１０～図１４に示すとおりである。
図１０～図１４からわかるように、Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子の粒径が４０～１００ｎｍ、Ｉｒ－ｃＲ５－ＨＳＡナノ粒子の粒径が５０～２００ｎｍ、Ｉｒ－ａＲ８－ＨＳＡナノ粒子の粒径が４０～２００ｎｍ、ＦＲ－ＨＳＡナノ粒子の粒径が４０～４００ｎｍ、ＣＲ－ＨＳＡナノ粒子の粒径が４０～４００ｎｍである。
試験例２
本試験例は、カチオン性の両親媒性ポリペプチドの電荷数、およびカチオン性の両親媒性ポリペプチドとヒト血清アルブミンの割合の、ポリペプチドアルブミンナノ粒子の組付けに対する影響を考察した。
それぞれ、Ｉｒ－ｃＲ３（式IXで表される）、Ｉｒ－ｃＲ５、Ｉｒ－ｃＲ８およびヒト血清アルブミンを取り、モル比２：１、１：１、１：２および１：３で混合し、ヒト血清アルブミンの最終濃度が１０μＭとなった。動的光散乱装置でポリペプチドアルブミン混合溶液における水和粒径の分布状況を測定し、結果は図１５に示すとおりである。これからわかるように、カチオン性の両親媒性ポリペプチドの親水性部分の正電荷の数が多いほど（アルギニンの数が多いほど）、アルブミンの割合が小さくなっており、カチオン性の両親媒性ポリペプチドとアルブミンがポリペプチドアルブミンナノ粒子を組付けやすくなった。
Figure 2023529545000009
試験例３
本試験例は、イリジウム配位オリゴアルギニンポリペプチドの腫瘍細胞活性に対する抑制能力を測定した。
ヒト子宮頸癌細胞であるＨｅｌａ細胞を取り、１０％牛胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地に分散させた後、ウェルごとに８０００の細胞があるように、９６ウェルプレートに播種した。細胞が接着した後、２、４、８、１６、３２、６４および１２８μＭのＩｒ－ｃＲ５、Ｉｒ－ｃＲ８およびＩｒ－ａＲ８、並びに対応するオリゴアルギニンポリペプチドｃＲ５、ｃＲ８およびａＲ８を添加し、２４ｈ孵化した。チアゾリルブルー法を用いて細胞の活性を測定し、半阻害濃度（ＩＣ５０）を算出し、結果は表１に示すとおりである。イリジウム配位オリゴアルギニンポリペプチドは、半阻害濃度（ＩＣ５０）が配位前のオリゴアルギニンポリペプチドに対して顕著して減少し、Ｈｅｌａ細胞に対する殺傷毒性が明らかに向上した。
Figure 2023529545000010
試験例４
ヒト血清アルブミンは、一本鎖ポリペプチドであり、ＡとＢの２つのサブドメインに分けられている。各々のサブドメインは、さらにＩ、II、IIIの３つの部分に分けられてもよい。それには、３種の主な薬物結合サイトがあり、それぞれ、IIＡに位置する薬物結合サイト１（Ｓｕｄｌｏｗサイト１とも呼ばれる）、IIIＡに位置する薬物結合サイト２（Ｓｕｄｌｏｗサイト２とも呼ばれる）、およびＩＢに位置する薬物結合サイト３である。本試験例においてＩｒ－ｃＲ８のヒト血清アルブミンにおける結合位置が測定されている。１０μＭのヒト血清アルブミンの水溶液、および１０μＭの、ヒト血清アルブミンと、ヒト血清アルブミンの薬物結合サイト１、２、３における競合化合物であるフェニルブタゾン、イブプロフェンおよびリドカインとの混合溶液を調製し、５分間混合した後、それぞれ、０、２、４、６、８、および１０μＭのＩｒ－ｃＲ８を添加し、２８０ｎｍの光で励起し、３００～４５０ｎｍにおける励起スペクトルを走査した。数式（１）から、競合化合物の有無下でのＩｒ－ｃＲ８とアルブミンとの結合定数および結合サイトの数を算出した。
Figure 2023529545000011
ただし、Ｆ０は、競合化合物が添加されていない場合の体系の蛍光強度、Ｆは、競合化合物が添加された場合の体系の蛍光強度、Ｋａは、結合定数、ｃは、クエンチャー濃度、ｎは、結合サイトの数である。
結果は表２に示すとおりである。これから分かるように、Ｉｒ－ｃＲ８は、ヒト血清アルブミンにおける結合サイトの数が１個であり、主にサイト１で結合した。
Figure 2023529545000012
上述した結論をさらに検証するために、１０μＭのヒト血清アルブミンと各サイトにおける競合化合物を１：４のモル比で混合した後、１０μＭのＩｒ－ｃＲ８を添加した。等濃度の競合化合物を添加しない時のヒト血清アルブミンとＩｒ－ｃＲ８の混合溶液を対照として、動的光散乱装置で、各競合化合物が存在する条件、および競合化合物が存在しない条件下でのポリペプチドアルブミンナノ粒子の組付け情況を測定した。結果は図１６に示すとおりである。Ｉｒ－ｃＲ８のヒト血清アルブミンにおける主な結合サイトがサイト１であることがさらに検証された。
試験例５
本試験例は、Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子、Ｉｒ－ｃＲ５－ＨＳＡナノ粒子およびＩｒ－ａＲ８－ＨＳＡナノ粒子の腫瘍の殺傷能力および殺傷メカニズムについて検討した。
マウス乳がん細胞４Ｔ１を取り、１０％の牛胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地で分散させて、ウェルごとに８０００の細胞があるように、９６ウェルプレートに播種した。細胞が接着した後、それぞれ２、４、８、１６、３２、６４、１２８μＭのＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子、Ｉｒ－ｃＲ５－ＨＳＡナノ粒子、Ｉｒ－ａＲ８－ＨＳＡナノ粒子、Ｉｒ－ｃＲ８、Ｉｒ－ｃＲ５およびＩｒ－ａＲ８を添加し、２４ｈ孵化した。チアゾリルブルー法で細胞の活性を測定した。結果は図１７～図１９に示すとおりである。これから分かるように、Ｉｒ－ｃＲ８およびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子の半阻害濃度は、それぞれ１０．１μＭおよび１３．９μＭ、Ｉｒ－ｃＲ５およびＩｒ－ｃＲ５－ＨＳＡナノ粒子の半阻害濃度はそれぞれ２５．４５μＭおよび２９．６４μＭ、Ｉｒ－ａＲ８およびＩｒ－ａＲ８－ＨＳＡナノ粒子の半阻害濃度は、１３．１６μＭおよび１６．２０μＭである。カチオン性の両親媒性ポリペプチドは、ポリペプチドアルブミンナノ粒子に調製された後、腫瘍細胞に対する殺傷活性による顕著な影響を受けていないことが検証された。
直径１５ｍｍのガラス培養皿を用意し、３×１０５の４Ｔ１細胞を添加した。それが接着した後、それぞれ半阻害濃度１ｍＬのＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子、Ｉｒ－ｃＲ５－ＨＳＡナノ粒子、Ｉｒ－ａＲ８－ＨＳＡナノ粒子およびＩｒ－ｃＲ８（５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを含む）を添加し、４０５ｎｍおよび５６１ｎｍにおいてレーザの共焦点を励起させた。細胞の死亡過程を観察し、結果は図２０～図２２に示すとおりである。腫瘍細胞は、細胞が腫脹して細胞内容物を吐き出したことを示しており、ポリペプチドアルブミンナノ粒子が、オンコーシスを誘発する腫瘍殺傷メカニズムを有することが検証された。
試験例６
本試験例は、Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子の安定性および安全性について分析した。
５００μＬのＩｒ－ｃＲ８およびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子（２００μＭ）を取り、分子量８０００～１４０００Ｄの透析バッグに置いた。透析バッグを１５ｍＬの遠心分離管に置き、遠心分離管毎に、それぞれ５ｍＬのｐＨが５．０、６．５および７．４のＰＢＳ緩衝液を添加した。遠心分離管を３７℃、２００ｒｐｍの恒温型発振器に置き、それぞれ１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、１６ｈおよび２４ｈで５００μＬの緩衝液を取り出して５００μＬの新鮮な緩衝液を遠心分離管に補充した。波長３２８ｎｍで、取り出した緩衝液の３５０～５５０ｎｍにおける発光スペクトルを測定するように励起した。Ｉｒ－ｃＲ８の緩衝液における蛍光マークから、緩衝液におけるＩｒ－ｃＲ８濃度を定量した。結果は図２３に示すとおりである。これから分かるように、Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子におけるＩｒ－ｃＲ８が遊離Ｉｒ－ｃＲ８と比べて放出されにくくなった。
１００μＬのＩｒ－ｃＲ８およびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子（１６０μＭ）をそれぞれ９００μＬの１０％の牛胎児血清を含有するＰＢＳ溶液と混合し、２、４、１６および２４ｈ孵化した。孵化した混合溶液を、４Ｔ１細胞が播種された９６ウェルプレートに添加し、２４ｈ孵化した。チアゾリルブルーを添加して細胞抑制活性を測定した。血清処理されていないＩｒ－ｃＲ８およびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子の細胞抑制活性と比較し、結果は図２４に示すとおりである。Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子は８７．０５％の細胞抑制活性を保留し、Ｉｒ－ｃＲ８は４２．７４％の細胞抑制活性しか残らなかった。ポリペプチドアルブミンナノ粒子を調製することにより、血清における各酵素のカチオン性の両親媒性ポリペプチドに対する分解を抑制することができ、カチオン性の両親媒性ポリペプチドの体内におけるサイクルに寄与することが検証された。
３６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを取り、２群に分けた。尾静脈にそれぞれ５００μＭのＩｒ－ｃＲ８、およびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子をそれぞれ１００μＬ注射した。それぞれ、０．５ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、２４ｈおよび４８ｈで、眼球を取り出して血液を抽出した。１００００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した。遠心分離した血清を１００μＬ取り、１ｍＬの過塩素酸および３ｍＬ王水を添加し、２６０℃で２ｈ消化した。１０ｍＬまでに水を添加し、ＩＣＰ－ＭＡＳＳで各時点での血液における金属イリジウムの含有量を測定した。結果は図２５に示すとおりである。結果から、Ｉｒ－ｃＲ８の血液における消失半減期は０．５ｈ未満、Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子の血液における消失半減期は１５ｈ超えであり、Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子の血液におけるサイクル時間が明らかに向上することが検証された。
１ｍＬのマウスの血液を取り、１ｍＬのＰＢＳを添加し、均一に吹き付けた後、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。上記ステップを繰り返し、ＰＢＳを捨て、５２．５ｍＬの新鮮なＰＢＳを添加した。空白の対照群（１４０μＬのＰＢＳ／ウェル）、陰性対照群（７０μＬの赤細胞懸濁液＋７０μＬのＰＢＳ／ウェル）、陽性対照群（７０μＬ赤細胞の純水ライセート＋７０μＬの純水／ウェル）、実験群（７０μＬのＩｒ－ｃＲ８又はＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子＋７０μＬ赤細胞懸濁液）を設定した。３７℃、８７ｒｐｍで２ｈ発振し、３０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。９０μＬの上澄みを取り出して４０５ｎｍにおける吸収値を測定した。結果は図２６に示すとおりである。Ｉｒ－ｃＲ８は、濃度７８．１２５μＭの場合に５２．８７％の溶血を引き起こし、Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子は、濃度６２５μＭの場合に１５．７０％の溶血しか引き起こさなかった。カチオン性の両親媒性ポリペプチドをポリペプチドアルブミンナノ粒子に調製することにより、ポリペプチド自身の溶血作用を明らかに低下させ、バイオ安全性を向上させることができることが検証された。
試験例７
本試験例は、Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子の腫瘍ターゲティング性、および生体自身の抗腫瘍免疫反応の誘発の効果について検討した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスの股間における皮下に１０６の４Ｔ１細胞を注射し、ＢＡＬＢ／ｃマウス皮下腫瘍モデルを構築した。腫瘍の体積（体積＝Ｌ×Ｄ２／２、Ｌは、腫瘍の長さ、Ｄは、腫瘍の幅である）が１００ｍｍ３に達した後、尾静脈に５００μＭのＩｒ－ｃＲ８およびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子をそれぞれ１００μＬ注射し、２４ｈ後にマウスを殺した。心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓および腫瘍を取り出して、重量を量った後にせん断し、１ｍＬのＰＢＳを添加してホモジネート粉砕した。１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを取り出し、波長３２８ｎｍで励起し、各サンプルの５０２ｎｍにおける蛍光放射強度を測定した。Ｉｒ－ｃＲ８およびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子のＰＢＳ溶液の同様の励起条件下での５０２ｎｍにおける蛍光放射強度に基づいて各組織の上澄み液におけるＩｒ－ｃＲ８およびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子の濃度を算出した。結果は図２７に示すとおりである。Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子の腫瘍箇所における濃度は１２．１９μｇ／ｇ、Ｉｒ－ｃＲ８の腫瘍箇所における濃度は４．１４μｇ／ｇである。尾静脈に２４ｈ注射した後、Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子の腫瘍箇所における蓄積量が約Ｉｒ－ｃＲ８の３倍となった。Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子は、Ｉｒ－ｃＲ８と比べて腫瘍箇所においてより良好な蓄積作用を有し、高いターゲティング性を有することが検証された。
ＢＡＬＢ／ｃマウスの股間における皮下に１０６の４Ｔ１細胞を注射し、ＢＡＬＢ／ｃマウス皮下腫瘍モデルを構築した。腫瘍の体積（体積＝長さ＊幅＾２／２）が１００ｍｍ３に達した後、４日間連続してそれぞれ、尾静脈に５００μＭのＨＳＡ、Ｉｒ－ｃＲ８、Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子を１００μＬ注射し、および尾静脈に体積が同様なＰＢＳを対照として注射した。投薬した後の５日目、腫瘍側の股間リンパ節を取り出し、単一の細胞に分散させた。７０μｍのフィルタで濾過し、４℃で、抗マウスＣＤ１１ｃ－ＦＩＴＣ、ＣＤ８０－ＰＥおよびＣＤ８６－ＡＰＣの抗体で、細胞染色緩衝液中に１５ｍｉｎ染色した後、細胞染色緩衝液で３回洗浄した。５００μＬの細胞染色緩衝液で再懸濁し、フローサイトメーターで測定し、結果は図２８に示すとおりである。Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子は、腫瘍において蓄積することができ、オンコーシスによって腫瘍細胞を殺傷して近傍の股間リンパ節の樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ、ＤＣ）が腫瘍の関連抗原を摂取して、より成熟することが検証された。
ＢＡＬＢ／ｃマウスの股間における皮下に１０６の４Ｔ１細胞を注射し、ＢＡＬＢ／ｃマウス皮下腫瘍モデルを構築した。腫瘍の体積（体積＝長さ＊幅＾２／２）が１００ｍｍ３に達した後、４日間連続して、それぞれ尾静脈に５００μＭのＨＳＡ、Ｉｒ－ｃＲ８およびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子を１００μＬ注射し、および尾静脈に体積が同様なＰＢＳを対照として注射した。投薬した後の７日目、腫瘍を取り、単一の細胞に分散させた。７０μｍのフィルタで濾過して、４℃で抗マウスＣＤ３－ＦＩＴＣ、ＣＤ４－Ｐｅｒｃｐ－Ｃｙ５．５およびＣＤ８ａ－ＡＰＣの抗体で、細胞染色緩衝液中に１５ｍｉｎ染色した後、細胞染色緩衝液で３回洗浄した。５００μＬの細胞染色緩衝液で再懸濁し、フローサイトメーターで測定した。結果は図２９に示すとおりである。Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子は、股間リンパ節における樹状細胞の成熟、および腫瘍箇所に死亡した腫瘍細胞の粉砕を促進するため、腫瘍箇所における細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）が顕著して増加し、抗腫瘍免疫をさらに補強することができることが検証された。
６周齢の成年雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを用意した。その背部皮下に１０６の４Ｔ１細胞を注射して皮下腫瘍マウスモデルを構築した。腫瘍の体積が５０～６０ｍｍ３に達した後、マウスを群ごとに５匹があるように４群に分けた。その後、４日間連続して尾静脈にＰＢＳ、５００μＭのＨＳＡ、Ｉｒ－ｃＲ８およびＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子をそれぞれ１００μＬ注射した。各マウス腫瘍の成長情況を観察し、結果は図３０および図３１に示すとおりである。Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子群は、良好な腫瘍抑制効果を有し、マウスの腫瘍を完全に消失させることができるが、他の群は、腫瘍の成長を効果的に抑制することができないことが検証された。
第１回目の皮下腫瘍が消失したＩｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子群におけるマウスを５匹用意した。もう一度、他方側の皮下に８×１０５の４Ｔ１細胞を注射した。週齢が同様な処理されていないマウスを対照群（未治療）として５匹用意した。同様に皮下に８×１０５の４Ｔ１細胞を注射した。２群の腫瘍の成長情況を観察し、結果は図３２および図３３に示すとおりである。Ｉｒ－ｃＲ８－ＨＳＡナノ粒子で治療されたマウスは、腫瘍に対して抗腫瘍免疫記憶を形成して、腫瘍の二次侵害を受けにくい。本願に係るポリペプチドアルブミンナノ粒子は、生体自身の抗腫瘍免疫反応を誘導することができることが検証された。
要するに、本願に係るポリペプチドアルブミンナノ粒子は、酵素分解を効果的に抑制することができ、血液における消失半減期が長く、高い安定性を有する；溶血作用が小さく、安全性が高い；腫瘍細胞が腫脹して細胞内容物を吐き出すことができ、オンコーシスを誘発する腫瘍殺傷メカニズムを有する；腫瘍箇所において効果的に蓄積することができ、ターゲティング性が高い；リンパ節の樹状細胞の成熟を促進し、Ｔ細胞（ＣＤ８＋）を増加させ、生体自身の抗腫瘍免疫反応を誘発することができる；完全にマウス乳がん皮下腫瘍を消失させるとともに、マウスが腫瘍細胞から二次侵害されないように保護することができる。
本願は上記実施例によって本願の詳しい方法を説明したが、本願は上記詳しい方法に限られるものではない、即ち、本願は上記詳しい方法によって実施しなければならないものではないと出願人は声明する。当業者にとって、本願に対する如何なる改良、本願の製品の各原料への等価置換及び補助成分の追加、具体的な実施形態の選択等はいずれも本願の保護範囲及び開示範囲に入ることが明瞭である。

Claims (13)

  1. カチオン性の両親媒性ポリペプチドおよびアルブミンにより組付けて形成する、
    ポリペプチドアルブミンナノ粒子。
  2. 前記カチオン性の両親媒性ポリペプチドが、疎水性部分および親水性部分を含む、
    請求項１に記載のポリペプチドアルブミンナノ粒子。
  3. 前記親水性部分が、アルギニン、リジン又はヒスチジンのうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せを含み、アルギニンであることが好ましい、
    請求項１又は２に記載のポリペプチドアルブミンナノ粒子。
  4. 前記疎水性部分が、［Ｉｒ（ｐｐｙ）２（Ｈ２Ｏ）２］ＯＴｆ、疎水性アミノ酸又は脂質のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せを含む、
    請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチドアルブミンナノ粒子。
  5. 前記疎水性アミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、バリン、メチオニン又はアラニンのうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せを含み、
    好ましくは、前記脂質が、コレステロールおよびその誘導体又は脂肪酸およびその誘導体のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せを含み、
    好ましくは、前記カチオン性の両親媒性ポリペプチドの構造式が、式Ｉ又は式IIで表され、
    Figure 2023529545000013
     ただし、ｎは、アルギニン残基の数であり、１～９の整数であり、
    好ましくは、前記カチオン性の両親媒性ポリペプチドの一段構造がＣＨ３ＣＯ－ＸＲｎ－ＣＯＮＨ２又は脂質－Ｒｎ－ＣＯＮＨ２であり、ただし、Ｘは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、バリン、メチオニン又はアラニンのうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せを含み、ｎは、アルギニン残基の数で、１～１２の整数である、
    請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチドアルブミンナノ粒子。
  6. 前記アルブミンが、哺乳動物アルブミンを含み、
    好ましくは、前記哺乳動物アルブミンが、ヒト血清アルブミン及び／又は牛血清アルブミンを含む、
    請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチドアルブミンナノ粒子。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチドアルブミンナノ粒子の調製方法であって、
    カチオン性の両親媒性ポリペプチド溶液とアルブミン溶液をそれぞれ調製し、前記カチオン性の両親媒性ポリペプチド溶液とアルブミン溶液を混合して前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子を得ることを含む、
    調製方法。
  8. 前記カチオン性の両親媒性ポリペプチド溶液の濃度が２０～５０００μＭであり、
    好ましくは、前記アルブミン溶液の濃度が２０～５０００μＭである、
    請求項７に記載の調製方法。
  9. 前記カチオン性の両親媒性ポリペプチドと前記アルブミンのモル比が（０．１～１０）：１である、
    請求項７又は８に記載の調製方法。
  10. 前記混合の温度が５～１００℃であり、
    好ましくは、前記混合の時間が０．５～１２０ｍｉｎである、
    請求項７～９のいずれか一項に記載の調製方法。
  11. 前記調製方法は、
    カチオン性の両親媒性ポリペプチドを、水、４０～６０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩緩衝液又は１０～２０ｍＭのリン酸塩緩衝液に添加し、２０～５０００μＭのカチオン性の両親媒性ポリペプチド溶液を得て、アルブミンを、水又は１０～２０ｍＭのリン酸塩緩衝液に添加し、２０～５０００μＭのアルブミン溶液を得るステップ（１）と、
    カチオン性の両親媒性ポリペプチドとアルブミンのモル比（０．１～１０）：１で、カチオン性の両親媒性ポリペプチド溶液とアルブミン溶液を混合し、水又はリン酸塩緩衝液を添加し、５～１００℃で０．５～１２０ｍｉｎ混合して前記ポリペプチドアルブミンナノ粒子を得るステップ（２）と、を含む、
    請求項７～１０のいずれか一項に記載の調製方法。
  12. 請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチドアルブミンナノ粒子を含む医薬組成物であって、
    好ましくは、前記医薬組成物が、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せをさらに含む、医薬組成物。
  13. 請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチドアルブミンナノ粒子又は請求項１２に記載の医薬組成物の、抗腫瘍薬物の調製における使用。
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