JP2021508465A - Ｍｕｃ１７及びｃｄ３に向けられる二重特異性抗体コンストラクト - Google Patents

Ｍｕｃ１７及びｃｄ３に向けられる二重特異性抗体コンストラクト Download PDF

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Abstract

本発明は、ＭＵＣ１７に結合する第１のドメイン、ヒト及びマカクＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープに結合する第２のドメイン並びに任意選択的に特定のＦｃ様式である第３のドメインを含むことによって特徴付けられる二重特異性抗体コンストラクトを提供する。さらに、本発明は、抗体コンストラクトをコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含むベクター、そのコンストラクトを発現する宿主細胞及びそれを含む医薬組成物を提供する。

Description

本発明は、生物工学の生成物及び方法、特に二重特異性抗体コンストラクト、それらの製剤及びそれらの使用に関する。
最も迅速且つ有望に開発されている治療薬の中には、すでにほぼ全ての医療分野で重要な役割を果たしているタンパク質に基づく医薬品があり、（前）臨床開発及び市販品として最も急速に成長している治療薬に含まれる（Ｌｅａｄｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２００８ Ｊａｎ ７，２１−３９）。低分子化学薬剤と比較して、タンパク質医薬品は、比較的低い濃度で高い特異性及び活性を有し、通常、種々の癌、自己免疫疾患及び代謝障害などの大きい影響のある疾患の療法を提供する（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｊｕｌ；３２（７）：３７２−８０、Ｗａｎｇ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．１９９９ Ａｕｇ ２０；１８５（２）：１２９−８８）。
このような新規のタンパク質に基づく医薬品は、例えば、通常、２つの異なる型の抗原に同時に結合できる二重特異性（モノクローナル）抗体を含む。それらは、いくつかの構造形式において知られており、現在では癌免疫療法及び薬物送達への応用が模索されている（Ｆａｎ，Ｇａｏｗｅｉ；Ｗａｎｇ，Ｚｕｊｉａｎ；Ｈａｏ，Ｍｉｎｇｊｕ；Ｌｉ，Ｊｉｎｍｉｎｇ（２０１５）．「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．８：１３０）。
二重特異性抗体は、ＩｇＧ様、すなわち全長二重特異性抗体であり得るか、又は全長抗体コンストラクトではない非ＩｇＧ様二重特異性抗体であり得る。全長二重特異性抗体は、通常、２つのＦａｂ部位が異なる抗原に結合することを除いて、２つのＦａｂアーム及び１つのＦｃ領域の通常のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）構造を保持する。非全長二重特異性抗体は、Ｆｃ領域を完全に欠く場合がある。これらとしては、Ｆａｂ領域のみからなる化学的に連結されたＦａｂ並びに様々な型の二価及び三価の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が挙げられる。２つの抗体の可変ドメインを模倣する融合タンパク質もある。そのような形式の例は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））である（Ｙａｎｇ，Ｆａ；Ｗｅｎ，Ｗｅｉｈｏｎｇ；Ｑｉｎ，Ｗｅｉｊｕｎ（２０１６）．「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ａ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｎｅｗ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．１８（１）：４８）。
ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトなどの二重特異性抗体に由来する分子は、２つの柔軟に連結された抗体に由来する結合ドメインから構成される組換え体タンパク質コンストラクトである。ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの１つの結合ドメインは、標的細胞上の選択された腫瘍関連表面抗原に特異的であり、第２の結合ドメインは、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体複合体のサブユニットであるＣＤ３に特異的である。それらの特別な設計により、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトは、Ｔ細胞を標的細胞と一過的に結び付け、同時に標的細胞に対するＴ細胞の固有の細胞溶解能を強力に活性化するのに独特に適している。ＡＭＧ１０３及びＡＭＧ１１０としてクリニックに展開された第一世代のＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの重要なさらなる開発（国際公開第９９／５４４４０号パンフレット及び国際公開第２００５／０４０２２０号パンフレットを参照されたい）は、ＣＤ３ε鎖のＮ末端のコンテクスト非依存的なエピトープに結合する二重特異性抗体コンストラクトを提供した（国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレット）。この選出されたエピトープに結合するＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトは、ヒト及びマカク（Ｍａｃａｃａ）又はマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ ｏｅｄｉｐｕｓ）若しくはリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）ＣＤ３ε鎖に対する種間特異性を示さないだけでなく、（二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子において以前に記載されたＣＤ３結合体のエピトープの代わりに）この特異的エピトープを認識するため、前世代のＴ細胞エンゲージ抗体で観察されたのと同程度にＴ細胞の非特異的な活性化を示さない。このＴ細胞活性化の低下は、患者におけるより少ない又は減少したＴ細胞再分布と関係し、後者は、例えば、パソツキシマブ（ｐａｓｏｔｕｘｉｍａｂ）において副作用のリスクがあると判断された。
国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットに記載された抗体コンストラクトは、体内からの迅速なクリアランスによって特徴付けられ；したがって、それらは、体内のほとんどの部分に迅速に到達することができるが、それらのインビボ適用は、それらのインビボにおける短い持続性によって制限され得る。一方で、それらの体内における濃度は、直ちに適合され且つ微調整され得る。この小さい一本鎖分子は、インビボ半減期が短いため、治療効果を達成するために持続点滴静注による継続投与が使用される。しかしながら、より長い半減期を含むより有利な薬物動態特性を有する新規の二重特異性抗体コンストラクトが利用可能である。長い半減期は、一般に、例えば患者コンプライアンスのために、免疫グロブリン、特に抗体、また最も特定すると小サイズの抗体フラグメント又はコンストラクトのインビボ適用において有用である。
ムチンは、炎症性疾患及び癌性疾患の興味深いマーカーとして同定された。ムチンは、タンデムリピートドメイン内のセリン及びスレオニン残基での高いレベルのＯ−グリコシル化によって特徴付けられる高分子量糖タンパク質である（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１６）。様々な組織において上皮細胞によって発現される分泌タンパク質及び膜貫通タンパク質を含む、少なくとも２０種類のムチンファミリーメンバーが存在する（Ｃｏｒｆｉｅｌｄ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２０１３）。ムチンの主要な機能は、上皮細胞と環境との間に防護壁を形成する粘膜層の構造及び制御にある（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ２００４；Ｈａｔｔｒｕｐ ａｎｄ Ｇｅｎｄｌｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００８）。膜貫通ムチンは、増殖及びアポトーシスの制御を含む細胞性シグナル伝達及び腫瘍形成にも役割を果たす（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ２００４）。ムチンの中で、ムチン１７（ＭＵＣ１７）は、ＭＵＣ３に対するその相同性によって最初に同定された膜貫通ムチンである（Ｇｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２００２）。
ＭＵＣ１７の完全なコード配列の分析により、それが６１個のタンデムリピートの中心領域、上皮増殖因子（ＥＧＦ）ドメイン、ウニ精子タンパク質、エンテロキナーゼ及びアグリン（ＳＥＡ）ドメイン及び第２のＥＧＦドメインで構成される大きい細胞外ドメインを有することが明らかになった。ＳＥＡドメインは、他のムチンにおいて保存される推定上の切断部位を含有する（Ｍｏｎｉａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６）。ＭＵＣ１７は、細胞内にある８０アミノ酸の細胞質側末端を有する一回膜貫通タンパク質である（Ｍｏｎｉａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６）。健常な成人におけるＭＵＣ１７の発現は、腸管を覆う腸細胞又は成熟した吸収性上皮細胞の尖端表面に限定される（Ｍｏｎｉａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６；Ｊｏｈａｎａｓｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１６）。ＭＵＣ１７は、胃及び膵臓によっても発現される（Ｍｏｎｉａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６；Ｍｏｅｈｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００６）。ＭＵＣ１７の生物学的機能は、粘膜修復などによる腸管の粘膜障壁の完全性の維持であると考えられる（Ｌｕｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１０；Ｒｅｓｔａ−Ｌｅｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２０１１；Ｊｏｈａｎａｓｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１６）。
ＭＵＣ１７は、一部の癌において異常に発現される。ＭＵＣ１７のｍＲＮＡは、１種の膵臓癌細胞株及び３種の結腸癌株において発現されることが示された（Ｇｕｍ ｅｔ ａｌ．２００２）。免疫組織化学試験により、膵臓癌におけるＭＵＣ１７タンパク質の発現が確認された（（Ｍｏｎｉａｕｘｅｔ ａｌ．２００６）。しかしながら、結腸癌において、ＭＵＣ１７タンパク質の発現は、低減することが示された（Ｓｅｎａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２０１０）。それにもかかわらず、ＭＵＣ１７の発現パターンは、様々な形態の悪性腫瘍の治療のための潜在的な標的となる。
潜在的標的としてのＭＵＣ１７がいずれの病態のためのものであるかに関する文献における相反する意味を考慮すると、ＭＵＣ１７の上方制御に関連する特定の状態を明確に特定し、且つＭＵＣ１７関連状態においてＭＵＣ１７を結合するのに特に好適である、好ましくは前記特定の状態の治療における使用のための、Ｔ細胞エンゲージ分子などの二重特異性抗体コンストラクトを提供することが本発明の目的である。したがって、本発明は、ＭＵＣ１７に結合する第１のドメイン、ヒト及び非ヒト、例えばマカクＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープに結合する第２のドメイン並びに好ましくは特定のＦｃ様式である第３のドメインを含むことによって特徴付けられる抗体コンストラクトを提供する。さらに、本発明は、抗体コンストラクトをコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含むベクター及びそのコンストラクトを発現する宿主細胞並びにそれを含む医薬組成物を提供する。
第１の態様では、本発明に関連して、
・ＭＵＣ１７に結合する第１のドメイン、及び
・ヒト及びマカクＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープに結合する第２のドメイン
を含む抗体コンストラクトを提供することが想定される。
前記態様では、本発明に関連して、抗体コンストラクトは、それぞれヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド単量体を含む第３のドメインであって、前記２つのポリペプチド単量体は、ペプチドリンカーを介して互いに融合される、第３のドメインを含むことがさらに想定される。
前記態様では、本発明に関連して、一本鎖抗体コンストラクトである抗体コンストラクトを提供することがさらに想定される。
前記態様では、本発明に関連して、前記第３のドメインが、アミノからカルボキシの順に、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む、抗体コンストラクトを提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、前記ポリペプチド単量体の各々が、配列番号１７〜２４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、抗体コンストラクトを提供することがさらに想定される。
前記態様では、本発明に関連して、前記ポリペプチド単量体の各々が、配列番号１７〜２４から選択されるアミノ酸配列を有する、抗体コンストラクトを提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、ＣＨ２ドメインがドメイン内システインジスルフィド架橋を含む、抗体コンストラクトを提供することがさらに想定される。
前記態様では、本発明に関連して、
（ｉ）第１のドメインが、２つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインが、２つの抗体可変ドメインを含むか；
（ｉｉ）第１のドメインが、１つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインが、２つの抗体可変ドメインを含むか；
（ｉｉｉ）第１のドメインが、２つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインが、１つの抗体可変ドメインを含むか；又は
（ｉｖ）第１のドメインが、１つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインが、１つの抗体可変ドメインを含む、抗体コンストラクトを提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、第１のドメイン及び第２のドメインが、ペプチドリンカーを介して第３のドメインに融合される、抗体コンストラクトを提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、抗体コンストラクトが、アミノからカルボキシルの順に、
（ａ）第１のドメイン；
（ｂ）配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｃ）第２のドメイン
を含む、抗体コンストラクトを提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、抗体コンストラクトが、（ａ）〜（ｃ）に加えて、アミノからカルボキシルの順に、
（ｄ）配列番号１、２、３、９、１０、１１及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｅ）第３のドメインの第１のポリペプチド単量体；
（ｆ）配列番号５、６、７及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；及び
（ｇ）第３のドメインの第２のポリペプチド単量体
を含む、抗体コンストラクトを提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、抗体コンストラクトの第１のドメインが、配列番号５２８（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４１７１〜４２９６）に対応するＭＵＣ１７内のエピトープに結合する、抗体コンストラクトを提供することがさらに想定される。
前記態様では、本発明に関連して、抗体コンストラクトの第１のドメインが、配列番号５２９（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４１８４〜４２９１）に対応するＭＵＣ１７内のエピトープに結合する、抗体コンストラクトを提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、抗体コンストラクトの第１のドメインが、配列番号５３０（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４１３１〜４２４３）に対応するＭＵＣ１７内のエピトープに結合する、抗体コンストラクトを提供することがさらに想定される。
前記態様では、本発明に関連して、抗体コンストラクトの第１のドメインが、配列番号５３１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４２４４〜４３８９）に対応するＭＵＣ１７内のエピトープに結合する、抗体コンストラクトを提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、抗体コンストラクトの第１のドメインが、配列番号５３０（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４１３１〜４２４３）に対応するＭＵＣ１７内のエピトープに結合するが、配列番号５３１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４２４４〜４３８９）に対応するＭＵＣ１７内のエピトープに結合しない、抗体コンストラクトを提供することがさらに想定される。
前記態様では、本発明に関連して、抗体コンストラクトの第１のドメインが、配列番号５３２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４１７１〜４３９０）又は配列番号５３３（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４１８４〜４３９０）に対応するＭＵＣ１７内のエピトープに結合するが、配列番号５３４（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４２９１〜４３９０）に対応するＭＵＣ１７内のエピトープ又は配列番号５３５（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４３４１〜４３９０）に対応するＭＵＣ１７内のエピトープに結合しない、抗体コンストラクトを提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、ＶＨ ＶＬ配置が４ラムダ３として特徴付けられる、抗体コンストラクトを提供することがさらに想定される。命名法は、当技術分野において知られる。
前記態様では、本発明に関連して、細胞傷害性と結合親和性との間の比率（ＥＣ５０／ＫＤ）＊１０００が２５０未満であり、細胞傷害性がｐＭ単位で示され、且つ標的細胞としてのＮＵＧＣ−４細胞及びエフェクター細胞としてのｈｕＰＢＭＣにおいて決定され、結合親和性がｎＭ単位で示され、且つＢｉａｃｏｒｅアッセイなどの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって決定される、抗体コンストラクトを提供することがさらに想定される。典型的なＥＣ５０値とＫＤ値との間の次元の違いを考慮して、読みやすさを向上させるために因数１０００が導入されている。
前記態様では、本発明に関連して、細胞傷害性と結合親和性との間の比率（ＥＣ５０／ＫＤ）＊１０００が１２５未満であり、細胞傷害性がｐＭ単位で示され、且つ例えば標的細胞としてのＮＵＧＣ−４細胞及びエフェクター細胞としてのｈｕＰＢＭＣにおいて決定され、結合親和性がｎＭ単位で示され、且つ例えば表面プラズモン共鳴に基づくアッセイによって決定される、抗体コンストラクトを提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、細胞傷害性と結合親和性との間の比率（ＥＣ５０／ＫＤ）＊１０００が２１未満であり、細胞傷害性がｐＭ単位で示され、且つ例えば標的細胞としてのＮＵＧＣ−４細胞及びエフェクター細胞としてのｈｕＰＢＭＣにおいて決定され、結合親和性がｎＭ単位で示され、且つ表面プラズモン共鳴に基づくアッセイによって決定される、抗体コンストラクトを提供することがさらに想定される。好ましくは、細胞傷害性（ＥＣ５０）は、＜１００ｐＭであり、及び結合親和性（ＫＤ）は、＜２５ｎＭである。
前記態様では、本発明に関連して、第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号３３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｂ）配列番号４４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｃ）配列番号５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号５７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号６６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号６８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｅ）配列番号７７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号７９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｆ）配列番号８８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号９０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｇ）配列番号９９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１００に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１０１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｈ）配列番号１１０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１１１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１１２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉ）配列番号１２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１２３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｊ）配列番号１３２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１３４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｋ）配列番号１４３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１４４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１４５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｌ）配列番号１５４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｍ）配列番号１６５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１６７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｎ）配列番号１７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１７８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｏ）配列番号１８７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１８８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１８９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｐ）配列番号１９８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１９９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２００に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｑ）配列番号２０９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２１０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２１１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｒ）配列番号２２０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｓ）配列番号２３１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２３２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２３３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｔ）配列番号２４２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２４３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２４４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｕ）配列番号２５３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２５４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｖ）配列番号２６４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２６５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２６６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｗ）配列番号２７５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｘ）配列番号２８６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２８７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２８８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｙ）配列番号２９７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２９８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２９９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｚ）配列番号３０８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３０９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３１０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａａ）配列番号３１９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３２０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｂ）配列番号３３０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３３１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３３２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｃ）配列番号３４１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３４２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３４３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｄ）配列番号３５２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３５３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３５４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｅ）配列番号３６３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３６４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３６５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｆ）配列番号３７４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３７５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｇ）配列番号３８５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３８６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｈ）配列番号３９６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３９７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３９８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｉ）配列番号４０７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４０８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４０９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｊ）配列番号４１８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４１９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４２０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｋ）配列番号４２９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４３０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４３１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｌ）配列番号４４０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４４２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｍ）配列番号４５１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４５２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４５３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｎ）配列番号４６２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４６３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４６４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｏ）配列番号４７３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４７４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４７５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｐ）配列番号４８４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４８５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４８６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｑ）配列番号４９５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４９６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４９７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｒ）配列番号５０６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５０７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号５０８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；及び
（ａｓ）配列番号５１７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５１８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号５１９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３
から選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を含み；
（ｃ）配列番号５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号５７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｎ）配列番号１７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１７８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｃ）配列番号３４１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３４２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３４３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；及び
（ａｊ）配列番号４１８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４１９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４２０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３
が好ましい、抗体コンストラクトを提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号３６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｂ）配列番号４７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｃ）配列番号５８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号６０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｄ）配列番号６９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号７０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号７１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｅ）配列番号８０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号８２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｆ）配列番号９１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号９３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｇ）配列番号１０２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１０３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１０４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｈ）配列番号１１３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１１５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｉ）配列番号１２４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１２６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｊ）配列番号１３５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１３７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｋ）配列番号１４６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１４７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１４８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｌ）配列番号１５７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１５９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｍ）配列番号１６８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１７０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｎ）配列番号１７９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１８０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１８１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｏ）配列番号１９０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１９１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１９２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｐ）配列番号２０１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２０２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２０３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｑ）配列番号２１２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２１３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２１４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｒ）配列番号２２３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２２４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２２５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｓ）配列番号２３４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２３５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２３６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｔ）配列番号２４５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２４６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２４７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｕ）配列番号２５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２５７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２５８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｖ）配列番号２６７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２６８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２６９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｗ）配列番号２７８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２７９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２８０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｘ）配列番号２８９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２９０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２９１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｙ）配列番号３００に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３０１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３０２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｚ）配列番号３１１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３１２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３１３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａａ）配列番号３２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３２３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３２４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａｂ）配列番号３３３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３３５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａｃ）配列番号３４４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３４５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３４６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａｄ）配列番号３５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３５７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａｅ）配列番号３６６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３６７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３６８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａｆ）配列番号３７７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３７８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３７９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａｇ）配列番号３８８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３９０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａｈ）配列番号３９９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４００に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４０１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａｉ）配列番号４１０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４１１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４１２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａｊ）配列番号４２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４２３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａｋ）配列番号４３２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４３３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４３４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａｌ）配列番号４４３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４４４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４４５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａｍ）配列番号４５４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａｎ）配列番号４６５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４６７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａｏ）配列番号４７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４７７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４７８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａｐ）配列番号４８７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４８８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４８９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａｑ）配列番号４９８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４９９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号５００に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａｒ）配列番号５０９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５１０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号５１１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；及び
（ａｓ）配列番号５２０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号５２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３
から選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含み；
（ｃ）配列番号５８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号６０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｎ）配列番号１７９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１８０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１８１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ａｃ）配列番号３４４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３４５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３４６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；及び
（ａｊ）配列番号４２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４２３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３
が好ましい、抗体コンストラクトを提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号４０に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３９に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｂ）配列番号５１に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号５０に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｃ）配列番号６２に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号６１に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｄ）配列番号７３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号７２に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｅ）配列番号８４に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号８３に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｆ）配列番号９５に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号９４に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｇ）配列番号１０６に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１０５に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｈ）配列番号１１７に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１１６に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｉ）配列番号１２８に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１２７に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｊ）配列番号１３９に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１３８に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｋ）配列番号１５０に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１４９に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｌ）配列番号１６１に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１６０に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｍ）配列番号１７２に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１７１に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｎ）配列番号１８３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１８２に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｏ）配列番号１９４に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１９３に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｐ）配列番号２０５に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２０４に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｑ）配列番号２１６に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２１５に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｒ）配列番号２２７に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２２６に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｓ）配列番号２３８に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２３７に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｔ）配列番号２４９に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２４８に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｕ）配列番号２６０に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２５９に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｖ）配列番号２７１に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２７０に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｗ）配列番号２８２に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２８１に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｘ）配列番号２９３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２９２に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｙ）配列番号３０４に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３０３に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｚ）配列番号３１５に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３１４に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａａ）配列番号３２６に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３２５に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｂ）配列番号３３７に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３３６に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｃ）配列番号３４８に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３４７に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｄ）配列番号３５９に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３５８に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｅ）配列番号３７０に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３６９に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｆ）配列番号３８１に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３８０に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｇ）配列番号３９２に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３９１に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｈ）配列番号４０３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４０２に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｉ）配列番号４１４に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４１３に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｊ）配列番号４２５に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４２４に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｋ）配列番号４３６に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４３５に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｌ）配列番号４４７に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４４６に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｍ）配列番号４５８に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４５７に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｎ）配列番号４６９に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４６８に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｏ）配列番号４８０に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４７９に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｐ）配列番号４９１に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４９０に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｑ）配列番号５０２に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号５０１に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｒ）配列番号５１３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号５１２に示されるとおりのＶＨ領域；及び
（ａｓ）配列番号５２４に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号５２３に示されるとおりのＶＨ領域
からなる群から選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含む、抗体コンストラクトを提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、抗体コンストラクトが、配列番号４１、５２、６３、７４、８５、９６、１０７、１１８、１２９、１４０、１５１、１６２、１７３、１８４、１９５、２０６、２１７、２２８、２３９、２５０、２６１、２７２、２８３、２９４、３０５、３１６、３２７、３３８、３４９、３６０、３７１、３８２、３９３、４０４、４１５、４２６、４３７、４４８、４５９、４７０、４８１、４９２、５０３、５１４及び５２５のいずれかに示されるとおりのアミノ酸配列から選択される配列を含む、抗体コンストラクトを提供することがさらに想定される。
前記態様では、本発明に関連して、抗体コンストラクトが、アミノからカルボキシルの順に、
（ａ）配列番号４１、５２、６３、７４、８５、９６、１０７、１１８、１２９、１４０、１５１、１６２、１７３、１８４、１９５、２０６、２１７、２２８、２３９、２５０、２６１、２７２、２８３、２９４、３０５、３１６、３２７、３３８、３４９、３６０、３７１、３８２、３９３、４０４、４１５、４２６、４３７、４４８、４５９、４７０、４８１、４９２、５０３、５１４及び５２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第１のドメイン；
（ｂ）配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｃ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５若しくは１８７からなる群から選択されるか又は配列番号１５に示されるとおりのアミノ酸配列を有する第２のドメイン；及び
（ｄ）配列番号１、２、３、９、１０、１１及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー
を含む、抗体コンストラクトを提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、抗体コンストラクトが、（ａ）〜（ｄ）に加えて、アミノからカルボキシルの順に、
（ｅ）配列番号１７〜２４からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する第３のドメインの第１のポリペプチド単量体；
（ｆ）配列番号５、６、７及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；及び
（ｇ）配列番号１７〜２４からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する第３のドメインの第２のポリペプチド単量体
をさらに含む、抗体コンストラクトを提供することも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、配列番号４２、４３、５３、５４、６４、６５、７５、７６、８６、８７、９７、９８、１０８、１０９、１１９、１２０、１３０、１３１、１４１、１４２、１５２、１５３、１６３、１６４、１７４、１７５、１８５、１８６、１９６、１９７、２０７、２０８、２１８、２１９、２２９、２３０、２４０、２４１、２５１、２５２、２６２、２６３、２７３、２７４、２８４、２８５、２９５、２９６、３０６、３０７、３１７、３１８、３２８、３２９、３３９、３４０、３５０、３５１、３６１、３６２、３７２、３７３、３８３、３８４、３９４、３９５、４０５、４０６、４１６、４１７、４２７、４２８、４３８、４３９、４４９、４５０、４６０、４６１、４７１、４７２、４８２、４８３、４９３、４９４、５０４、５０５、５１５、５１６、５２６及び５２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する抗体コンストラクトを提供することも想定される。
第２の態様では、本発明に関連して、本発明の抗体コンストラクトをコードするポリヌクレオチドを提供することがさらに想定される。
第３の態様では、本発明に関連して、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供することも想定される。
第４の態様では、本発明に関連して、ポリヌクレオチド又は本発明のベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供することがさらに想定される。
第５の態様では、本発明に関連して、本発明の抗体コンストラクトの作製のための方法であって、抗体コンストラクトの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養することと、産生された抗体コンストラクトを培養物から回収することとを含む方法を提供することも想定される。
第６の態様では、本発明に関連して、本発明の抗体コンストラクト又は本発明の方法に従って作製される抗体コンストラクトを含む医薬組成物を提供することがさらに想定される。
前記態様では、本発明に関連して、医薬組成物は、約−２０℃で少なくとも４週間にわたって安定であることも想定される。
本発明に関連して、増殖性疾患、腫瘍性疾患、癌又は免疫障害から選択される疾患の予防、治療又は改善における使用のための、本発明の抗体コンストラクト又は本発明の方法に従って作製される抗体コンストラクトを提供することがさらに想定される。
前記態様では、本発明に関連して、疾患は、胃腸癌（例えば、胃癌、食道癌、胃食道癌若しくは結腸直腸癌）又は膵臓癌であることも想定される。
前記態様では、本発明に関連して、疾患は、胃癌であることも想定される。
第７の態様では、本発明に関連して、増殖性疾患、腫瘍性疾患、癌又は免疫障害の治療又は改善のための方法であって、それを必要とする対象に、本発明の抗体コンストラクト又は本発明の方法に従って作製される抗体コンストラクトを投与する工程を含み、疾患は、好ましくは、胃腸癌又は膵臓癌、最も好ましくは胃癌である、方法を提供することがさらに想定される。
第８の態様では、本発明に関連して、本発明のコンストラクト若しくは本発明の方法に従って作製される抗体コンストラクト、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター及び／又は本発明の宿主細胞を含むキットを提供することも想定される。
第９の態様では、本発明に関連して、胃腸癌の治療又は改善のための方法であって、それを必要とする対象に、ＭＵＣ１７及びＣＤ３に対して向けられる二重特異性抗体コンストラクトを投与する工程を含む方法を提供することがさらに想定される。
第１０の態様では、本発明に関連して、胃腸癌の治療又は改善における使用のための、ＭＵＣ１７及びＣＤ３に対して向けられる二重特異性抗体コンストラクトを提供することがさらに想定される。
ＭＵＣ１７のエピトープクラスタリングを示す。エピトープＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５Ａ及び５Ｂ並びにＥ２の短縮型（それぞれＴＲ２、ＴＲ３、ＴＲ４及びＴＲ５）に印が付けられる。ヒトＭＵＣ１７（茶色／灰色）が非機能性マウスＭＵＣ３によって置き換えられたコンストラクトに対する実験により、それぞれのエピトープが明らかになった。ＳＥＡドメインを含むエピトープ空間Ｅ２を覆う４５ ＭＵＣ−１７−ｓｃＦｃ二重特異性抗体コンストラクトが同定された。 ヒト／マウスキメラコンストラクトを発現する細胞に対するＭＵＣ１７−ｓｃＦｃ二重特異性抗体コンストラクトの細胞上結合によるＭＵＣ１７エピトープマッピングである。細胞上結合は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって評価され、キメラコンストラクトに対する結合の減少は、それぞれの（変異）ドメインがＭＵＣ−ｓｃＦｃ二重特異性抗体コンストラクト結合に必須であることを示す。例えば、Ｅ２は、変異に対する結合の減少を示す。したがって、Ｅ２は、全ての４つの試験された二重特異性抗体コンストラクトに対する結合に必須である。 ＭＵＣ１７は、胃癌細胞株、膵臓癌細胞株及び結腸直腸癌細胞株において発現される。ＭＵＣ１７細胞の表面タンパク質発現は、生細胞のフローサイトメトリーによって決定され、ＦＡＣＳ読み出し情報として示される（Ａ）。癌細胞株におけるＭＵＣ１７ ｍＲＮＡレベルは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって決定された。値は、構成的に発現される遺伝子のものに正規化される（Ｂ）。 異なるＭＵＣ発現を伴う３種の異なるＭＵＣ１７保有細胞株に対する細胞傷害アッセイ（Ａ：ＧＳＵ、Ｂ：ＮＵＧＣ−４及びＣ：Ｌｓ１７４Ｔ）である。試験されたコンストラクトは、１＝３２−Ｇ６；２＝１−Ｂ６；３＝２−Ｃ２及び４＝８−Ｂ７である。コンストラクト８−Ｂ７は、細胞傷害性の点からわずかに有利である。 可溶性ＭＵＣ１７タンパク質（ｓＭＵＣ１７、ａａ ４１３１〜４２４３ Ｕｎｉｐｒｏｔ）は、０〜１０００ｎｇ／ｍｌでＴＤＣＣアッセイに加えられ、ＭＵＣ１７−ｓｃＦｃの二重特異性抗体コンストラクトの活性は、４８時間のインキュベーション後に評価された（標的細胞ＧＳＵ（Ａ）又はＮＵＧＣ−４（Ｂ）、１０：１ ヒトＴ細胞対標的細胞、Ｓｔｅａｄｙ Ｇｌｏによる読み出し情報）。ｓＭＵＣ１７の添加は、二重特異性抗体コンストラクトの細胞傷害活性に影響を及ぼさなかった。 ＭＵＣ１７−ｓｃＦｃ抗体コンストラクト８−Ｂ７は、結腸直腸癌の異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する。雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、２×１０６個のＬｓ１７４Ｔ結腸直腸癌細胞を移植された。１５日目に、２×１０７個に増殖された活性化Ｔ細胞が腹腔内（ＩＰ）注射によって投与された。ＭＵＣ１７−ｓｃＦｃ抗体コンストラクトは、１６日目及び２２日目にＩＰ投与された。腫瘍サイズは、キャリパーで測定された。 群コード（最適化ライブラリ）、分子名称、それぞれのコンストラクトが結合するエピトープクラスター、［ｎＭ］単位のＳＰＲに従う親和性（ＫＤ）、［ｐＭ］単位のＮＵＧＣ−４細胞における細胞傷害活性（ＥＣ５０）、その比率（ＥＣ５０／ＫＤ）＊１０００及びＶＨ ＶＬ配置による、本発明による好ましい二重特異性抗体コンストラクトに対する調査である。 ＭＵＣ１７−ｓｃＦｃ抗体コンストラクト８−Ｂ７は、カニクイザルにおいて延長された半減期を有する（Ａ）。暴露レベルは、予測される暴露と一致する。（Ｂ）カニクイザル（１群当たりｎ＝３）は、０時間及び１６８時間目に１００ｍｇ／ｋｇ又は１０００ｍｇ／ｋｇのＭＵＣ１７ ＨＬＥ ＢｉＴＥ（登録商標）を投与された。指定の時点で血清が回収され、抗ＣＤ３抗体又は抗ＭＵＣ１７抗体のいずれかに基づくＥＬＩＳＡを用いて、ＭＵＣ１７ ｓｃＦｃ二重特異性抗体コンストラクトの存在について分析された。データを２コンパートメントモデルにフィットさせた。グラフは、個々のデータ（点）及び平均値（線）を示す。
本発明に関連して、悪性腫瘍に関連するＭＵＣ１７を特異的に標的化する二重特異性抗体コンストラクトが提供される。この目的のため、最初のＭＵＣ１７が、正常組織発現に対して胃腫瘍において上方制御される遺伝子として同定される。この点に関して、ＭＵＣ１７タンパク質は、当技術分野で一般的な免疫組織化学の方法に従って、４０〜７７％の胃腫瘍において発現されることが示される。ＭＵＣ１７タンパク質は、一部の膵臓癌細胞株及び結腸直腸癌細胞株に加えて、胃癌細胞株及び食道癌細胞株の細胞表面上に発現されることがフローサイトメトリーによっても実証される。そのような発現は、中国人患者における胃腫瘍において特に高いこともさらに示されている。したがって、ＭＵＣ１７は、胃腸癌、すなわち胃、小腸及び大腸（結腸）の癌、食道癌並びに膵臓癌に関連する有効な標的として同定される。
本発明に関連して、本発明による二重特異性抗体コンストラクトが、好ましくは、ＭＵＣ１７を有する胃及び胃腸癌細胞などの癌細胞を標的化し、対照的に非癌細胞をより少なく標的化することは、驚くべき発見である。ＭＵＣ１７は、通常、非癌腸上皮細胞の尖端表面（すなわちそれぞれの細胞の基部の反対に位置する）上に発現され、且つ粘膜層の一部を形成する。しかしながら、ＭＵＣ１７は、胃及び胃腸癌において過剰発現され、そのような状況において、粘膜表面に限定されるだけでなく非粘膜表面上にも発現される。理論に束縛されるものではないが、粘膜表面上のＭＵＣ１７は、本発明による二重特異性抗体コンストラクトに近づきにくいと考えられるが、癌細胞における非粘膜表面上に発現されるＭＵＣ１７は、より近づきやすい。したがって、本発明による二重特異性抗体コンストラクトは、好ましくは、ＭＵＣ１７関連癌細胞を標的化し、非癌細胞をより少なく標的化する。これは、驚くべきことに、健康な動物における良好な忍容性とインビボの癌モデルにおける高い抗腫瘍効果を比較したときに見出された。詳細には、免疫組織化学により、探索性の毒性学試験において評価されたサルから採取された小腸などの胃腸組織の粘膜表面上でＭＵＣ１７発現が確認されたが、有利には、ＭＵＣ１７を発現する組織における病理組織学的変化はなかった。本発明による二重特異性抗体コンストラクトに関する非癌細胞の良好な忍容性は、インビトロにおいて同様に確認される。対照的に、本発明による二重特異性抗体コンストラクトによる担腫瘍マウスの静脈内治療は、対照群におけるプラセボ治療マウスと比較して、統計学的に有意且つ用量依存的な腫瘍増殖の阻害をもたらす。したがって、本発明による二重特異性抗体コンストラクトは、好ましくは、患者によって許容され、好ましくは、いずれかのＭＵＣ１７に対処する薬剤について以前に記載されていない十分に管理しやすい治療域を特徴とする。
ＭＵＣ１７タンパク質のＥＧＦ−ＳＥＡ−ＥＧＦ領域に対する二重特異性抗体コンストラクトは、本発明に関連して提供される。有利には、タンパク質のこの領域の標的化は、最も近いファミリーメンバー（ＭＵＣ３Ａ、ＭＵＣ３Ｂ、ＭＵＣ１２；例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ２００４）からの選択性及び細胞膜結合性ＭＵＣ１７に結合する能力をもたらす。ＭＵＣ１７は、他の膜貫通ムチンのように、ＳＥＡドメイン内に潜在的な切断部位を含有する。
したがって、ＭＵＣ１７ ＥＧＦ−ＳＥＡ−ＥＧＦ領域及びＣＤ３を標的化し、且つ半減期標的化を延長する一本鎖Ｆｃ様式を有する二重特異性抗体コンストラクトが本明細書とともに想定される。有利には、本発明の二重特異性抗体コンストラクトは、好ましくは、ＭＵＣ１７標的を保有する標的細胞に対して高い親和性（一桁ｎＭのＫＤ）及び効力（＜５０ｐＭ ＥＣ５０）を有して、目的の腫瘍細胞における低い又は不均一なレベルのＭＵＣ１７の標的化を可能にする。
本発明による二重特異性抗体コンストラクトは、例えば、カニクイザルＭＵＣ１７（ヒトＭＵＣ１７に加えて）に対して交差反応性を有して、非臨床毒性学試験を可能にする。カニクイザルＭＵＣ１７のＥＧＦ−ＳＥＡ−ＥＧＦドメイン配列の詳細の重要性は、本明細書において最初に示される。
本発明に関連して、二重特異性抗体コンストラクトは、結合親和性、強力な細胞傷害活性を呈し、且つＳＥＡドメインに対して最も安定なマップであることが想定される。
本発明に関連して、二重特異性抗体コンストラクトは、安定性の向上のために標的結合体においてシステインクランプ、すなわち分子内ジスルフィド結合を有することが想定される。
本発明に関連して、半減期延長（ＨＬＥ）部分としての一本鎖Ｆｃ（ｓｃＦｃ）とともに提供され、且つＭＵＣ１７に向けられる二重特異性抗体コンストラクトは、胃癌、胃食道癌、食道癌、膵臓癌及び結腸直腸癌を含む胃腸癌の治療における使用を対象とすることが想定される。
さらに、本発明に関連して、任意選択的であるが有利には、ｓｃＦｃ、すなわちＨＬＥ、抗体コンストラクトは、１週間毎に１回のみ、２週間毎に１回、３週間毎に１回若しくはさらに４週間毎に１回又はそれより少ない頻度で投与される静脈内投与を可能にすることが想定される。
本発明に関連して、治療的に標的化されることになる好ましいエピトープは、それらが高度にグリコシル化され、且つ配列中で反復性であるため、最初にＭＵＣ１７のタンデムリピートを除去することによって同定される。これにより、例えば、３７６ａａの下線の領域及び１７７ａａのＥＧＦ様／ＳＥＡドメイン領域がもたらされる。有利には、ＥＧＦ様／ＳＥＡドメインの標的化は、ＭＵＣ３などの最も近いファミリーメンバーからの選択性、カニクイザルＭＵＣ１７との交差反応性及び細胞膜結合性ＭＵＣ１７への結合を可能にする。引き続いて、本発明者らは、結合並びにＴ細胞リダイレクトによる溶解、活性化及びサイトカイン放出を評価するための試薬及びアッセイを作製した。これらのアッセイを使用して、好ましい二重特異性抗体コンストラクトが、親和性、細胞傷害活性及びコンストラクト安定性の点から予め定義された候補生成物プロファイルを満たすことが確認された。
ＭＵＣ１７に向けられる好ましい二重特異性抗体コンストラクトのエピトープを決定するために、エピトープマッピングが本明細書に記載されるとおりに実施された。好ましい二重特異性抗体コンストラクトは、ＳＥＡドメインを含むエピトープＥ２に向けられる。Ｅ２エピトープは、配列番号５２８として本明細書で特徴付けられるアミノ酸（ａａ）配列を含む。これは、本質的にｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うＭＵＣ１７のａａ ４１７１〜４２９６に対応する。一般に、本発明に関連して、ＭＵＣ１７のａａ付番は、常に、ＭＵＣ１７のｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番を参考にして作成されるか又は作成されるように意図される。一方、ＭＵＣ１７のＥ１エピトープ、すなわちＳＥＡドメインのエピトープＮ末端（図１を参照されたい）を標的化する二重特異性抗体コンストラクトは、驚くべきことに、オフターゲット活性及び最終的に副作用のリスクの増大をもたらすことになるＭＵＣ３Ａ及びＭＵＣ３Ｂとの望ましくない交差反応性を示す。さらに、ＳＥＡドメインのＣ末端に位置するエピトープＥ３及びＥ４（図１を参照されたい）に向けられる二重特異性抗体コンストラクトは、予想外にもカニクイザルＭＵＣ１７と交差反応しない。したがって、本発明による二重特異性抗体コンストラクトは、ＭＵＣ１７のＥ２エピトープに特異的且つ排他的に結合することが想定される。
本発明によるそのような好ましい二重特異性抗体コンストラクトは、それらの構造又はそれらの固有の詳細なエピトープ結合特性に基づいてさらに特定され得る。本発明による好ましい二重特異性抗体コンストラクトは、本明細書に提供されるとおりの細胞傷害性及び親和性の新規の指標となる比率を計算することによって決定され得る。例えば、前記比率（ＥＣ５０／ＫＤ）＊１０００は、好ましくは、＜２５０（未満）である。そのような比率は、通常、エピトープＥ２の短縮型、すなわちＴＲ２（ｔｒｕｎｋ２：配列番号５３２）及びＴＲ３（ｔｒｕｎｋ３：配列番号５３３）に対する良好な結合を示すが、比率＞２５０（を超える）は、通常、ＴＲ３ではなく、ＴＲ２に対する良好な結合をさらに示す。詳細には、最も好ましいコンストラクトは、通常、エピトープクラスターＥ２／Ｅ５Ａ／５Ｂの一部及び／又はＴＲ２／ＴＲ３に結合する。それらは、例えば、約２１未満の（ＥＣ５０：ＫＤ）＊１０００比率を示し、関連する配列ファミリー（例えば、最適化（ＯＰＴ）ライブラリ名称４ａ、４ｂ、５ａ及び１０に属する。それらのＶＨ／ＶＬ配置は、好ましくは、４ラムダ３又は「４Ｉ３」として本明細書で特徴付けられる）。そのようなコンストラクトは、本発明に関連して、例えば８−Ａ７、８−Ｂ７、８−Ｂ８、８−Ｃ７、８−Ｈ８、８−Ｄ７、４−Ｅ７、８−Ｆ９、１−Ａ６、８−Ｈ９、１−Ｂ６、８−Ｆ１１及び５−Ｈ１として同定される。エピトープクラスターＥ２／Ｅ５Ａ／５Ｂの一部及び／又はＴＲ２／ＴＲ３に結合し、且つ約１２５未満のＥＣ５０：ＫＤ比率を示し、配列ファミリー（ＯＰＴライブラリ名称）１ａ、１ｃ及び９に属するコンストラクトも好ましい。それらのＶＨ／ＶＬ配置は、３ラムダ３又は「３Ｉ３」として特徴付けられる。そのようなコンストラクトは、本発明に関連して、例えば２−Ｄ１１、８−Ｅ３、３２−Ｇ６、２−Ｃ２、９−Ｃ２、１−Ｂ１０、４−Ｂ１、４−Ｆ６、４−Ｇ４、４−Ａ８、４−Ｂ１０、４−Ｈ１１及び４−Ｈ２として同定される。エピトープクラスターＥ２／Ｅ５Ａの一部／５Ｂの一部及び／又はＴＲ２／ＴＲ３の一部に結合し、且つ約１５００未満、典型的には２５０〜１４５０の（ＥＣ５０／ＫＤ）＊１０００比率を示し、且つ配列ファミリー（ＯＰＴライブラリ名称）６、７及び８に属する結合体が好ましいが、前述の２つの配列ファミリーより好ましくない。それらのＶＨ／ＶＬ配置は、２カッパ３又は「３ｋ３」として特徴付けられる。本明細書で特に好ましいのは、コンストラクト３２−Ｇ６（配列番号６５）；１−Ｂ６（配列番号４８３）；２−Ｃ２（配列番号４２８）及び８−Ｂ７（配列番号１８６）である。本発明に関連して、親和性は、一般に、ＢｉａｃｏｒｅＢ分析などのＳＰＣによって測定され、結果は、通常、ｎＭ単位で与えられる。細胞傷害活性は、通常、ＭＵＣ１７標的細胞としてのＮＵＧＣ−４細胞及びＣＤ３エフェクター細胞としての未刺激のヒトＰＢＭＣを使用して決定される。
本発明に関連して、好ましい二重特異性抗体コンストラクトは、細胞傷害性と親和性の好ましい比率を示すだけではなく、さらに前記コンストラクトを製剤化し、保管し且つ投与する際の実用的な取扱いを容易にするために十分な安定性特性を示すことが想定される。十分な安定性は、例えば、分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定されるとおり、少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％及びさらにより好ましくは少なくとも７５％など、標準的な調製後の高い単量体含量（すなわち凝集しておらず且つ／又は会合していない未変性の分子）によって特徴付けられる。また、例えば、２．５ｍｇ／ｍｌの濃度において光吸収として３４０ｎｍで測定された混濁度は、例えば、望ましくない凝集物の本質的な欠如と結論するために、好ましくは０．０２５以下、より好ましくは０．０２０以下であるべきである。有利には、高い単量体含量は、凍結／解凍などのストレス条件におけるインキュベーション又は３７若しくは４０℃でのインキュベーション後に維持される。
したがって、本発明は、
・ＭＵＣ１７に結合する第１のドメイン、
・ヒト及びマカクＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープに結合する第２のドメイン；及び任意選択的に、
・２つのポリペプチド単量体であって、それぞれヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド単量体を含み、前記２つのポリペプチド単量体は、ペプチドリンカーを介して互いに融合される、第３のドメイン
を含む抗体コンストラクトを提供する。
ある実施形態では、本発明は、３つ全てのそのようなドメインを含む二重特異性抗体コンストラクトを提供する。
用語「抗体コンストラクト」は、その構造及び／又は機能が抗体、例えば全長又は完全免疫グロブリン分子の構造及び／若しくは機能に基づく分子を指す。したがって、抗体コンストラクトは、その特異的な標的又は抗原に結合することができ、且つ／又は抗体若しくはそのフラグメントの可変重鎖（ＶＨ）及び／若しくは可変軽鎖（ＶＬ）ドメインから導き出される。さらに、本発明による結合パートナーに結合するドメインは、本発明による抗体コンストラクトの結合ドメインとして本明細書で理解される。通常、本発明による結合ドメインは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。この最小要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）、好ましくは６つ全てのＣＤＲの存在によって定義され得る。抗体の最小構造要件を定義する代替の手法は、特異的な標的の構造、それぞれエピトープ領域を構成する標的タンパク質のタンパク質ドメイン（エピトープクラスター）内での抗体のエピトープの定義であるか、又は定義された抗体のエピトープと競合する特異的な抗体を参照することによる。本発明によるコンストラクトが基づく抗体は、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体を含む。
本発明による抗体コンストラクトの結合ドメインは、例えば、上で参照されたグループのＣＤＲを含み得る。好ましくは、それらのＣＤＲは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）のフレームワーク内に含まれるが、それが両方を含む必要はない。Ｆｄフラグメントは、例えば、２つのＶＨ領域を有し、多くの場合、インタクトな抗原結合ドメインの一部の抗原結合機能を保持している。抗体フラグメント、抗体バリアント又は結合ドメインの形式についてのさらなる例としては、（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを有する一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（２）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを有する二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（３）２つのＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント；（４）抗体の１つのアームのＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖフラグメント、（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに（７）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられ、後者が好ましい（例えば、ｓｃＦＶライブラリ由来のもの）。本発明による抗体コンストラクトの実施形態の例は、例えば、国際公開第００／００６６０５号パンフレット、国際公開第２００５／０４０２２０号パンフレット、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレット、国際公開第２０１０／０３７８３８号パンフレット、国際公開第２０１３／０２６８３７号パンフレット、国際公開第２０１３／０２６８３３号パンフレット、米国特許出願公開第２０１４／０３０８２８５号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３０２０３７号明細書、国際公開第２０１４／１４４７２２号パンフレット、国際公開第２０１４／１５１９１０号パンフレット及び国際公開第２０１５／０４８２７２号パンフレットに記載されている。
「結合ドメイン」又は「〜に結合するドメイン」の定義には、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は「ｒＩｇＧ」（「半抗体」）などの全長抗体のフラグメントも含まれる。本発明による抗体コンストラクトは、抗体バリアントとも呼ばれる、抗体の改変されたフラグメント、例えばｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖ又はｂｉ（ｓ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−ジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ’ｓ）、タンデムｄｉ−ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ−ｓｃＦｖ、「マルチボディ」、例えばトリアボディ又はテトラボディ及び単一ドメイン抗体、例えばナノボディ又は他のＶ領域若しくはドメインに非依存的に抗原若しくはエピトープに特異的に結合するＶＨＨ、ＶＨ若しくはＶＬであり得る１つのみの可変ドメインを含む単一可変ドメイン抗体も含み得る。
本明細書で使用する場合、用語「一本鎖Ｆｖ」、「一本鎖抗体」又は「ｓｃＦｖ」は、重鎖及び軽鎖の両方の由来の可変領域を含むが、定常領域を欠く単一ポリペプチド鎖抗体フラグメントを指す。通常、一本鎖抗体は、ＶＨ及びＶＬドメイン間において、抗原への結合を可能にする所望の構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをさらに含む。一本鎖抗体は、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）においてＰｌｕｃｋｔｈｕｎによって詳細に議論されている。一本鎖抗体を作製する様々な方法が知られており、米国特許第４，６９４，７７８号明細書及び同第５，２６０，２０３号明細書；国際特許出願公開国際公開第８８／０１６４９号パンフレット；Ｂｉｒｄ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４４２；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４５４；Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１に記載されるものを含む。特定の実施形態において、一本鎖抗体は、二重特異性、多重特異性、ヒト及び／若しくはヒト化並びに／又は合成性でもあり得る。
さらに、用語「抗体コンストラクト」の定義は、一価、二価及び多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）／多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）コンストラクト、したがって２つのみの抗原性構造に特異的に結合する二重特異性コンストラクト並びに異なる結合ドメインを通じて３つ以上の抗原性構造、例えば３つ、４つ以上に特異的に結合する多重特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）／多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）コンストラクトを含む。さらに、用語「抗体コンストラクト」の定義は、１つのみのポリペプチド鎖からなる分子及び鎖が同一（ホモ二量体、ホモ三量体若しくはホモオリゴマー）であるか、又は異なる（ヘテロ二量体、ヘテロ三量体若しくはヘテロオリゴマー）かのいずれかであり得る２つ以上のポリペプチド鎖からなる分子を含む。上記で特定された抗体及びそのバリアント又は誘導体の例は、とりわけ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）及びＵｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９９），Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２ｎｄ ｅｄ．２０１０及びＬｉｔｔｌｅ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ２００９に記載されている。
本明細書で使用する場合、用語「二重特異性」は、「少なくとも二重特異性」である抗体コンストラクトを指し、すなわち、それは、少なくとも第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含み、ここで、第１の結合ドメインは、１つの抗原又は標的（本明細書ではＭＵＣ１７ＭＵＣ１７）に結合し、第２の結合ドメインは、別の抗原又は標的（本明細書ではＣＤ３）に結合する。したがって、本発明による抗体コンストラクトは、少なくとも２つの異なる抗原又は標的に対する特異性を備える。例えば、第１のドメインは、好ましくは、本明細書に記載される種の１つ以上のＣＤ３εの細胞外エピトープに結合しない。用語「標的細胞の表面抗原」は、細胞によって発現され、且つ本明細書に記載される抗体コンストラクトがアクセスできるようにその細胞表面に存在する抗原性構造を指す。それは、タンパク質、好ましくはタンパク質の細胞外部分又は糖質構造、好ましくは糖タンパク質などのタンパク質の糖質構造であり得る。それは、腫瘍抗原であることが好ましい。本発明の用語「二重特異性抗体コンストラクト」は、多重特異性抗体コンストラクト、例えば３つの結合ドメインを含む三重特異性抗体コンストラクト又は４つ以上（例えば、４つ、５つ．．．）の特異性を有するコンストラクトも包含する。
本発明による抗体コンストラクトが（少なくとも）二重特異性である場合、それらは、天然に存在せず、且つそれらは、天然に存在する産物と顕著に異なる。したがって、「二重特異性」抗体コンストラクト又は免疫グロブリンは、異なる特異性を有する少なくとも２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体又は免疫グロブリンである。二重特異性抗体コンストラクトは、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’フラグメントの連結を含む様々な方法によって生成することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）を参照されたい。
本発明の抗体コンストラクトの少なくとも２つの結合ドメイン及び可変ドメイン（ＶＨ／ＶＬ）は、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含んでも含まなくてもよい。用語「ペプチドリンカー」は、本発明によれば、本発明の抗体コンストラクトの一方の（可変及び／又は結合）ドメイン及びもう一方の（可変及び／又は結合）ドメインのアミノ酸配列を相互に連結するアミノ酸配列を含む。ペプチドリンカーは、第３のドメインを本発明の抗体コンストラクトの他のドメインに融合するためにも使用され得る。そのようなペプチドリンカーの必須の技術的特徴は、それがいかなる重合活性も含まないことである。好適なペプチドリンカーには、米国特許第４，７５１，１８０号明細書及び同第４，９３５，２３３号明細書又は国際公開第８８／０９３４４号パンフレットに記載されるものがある。ペプチドリンカーは、他のドメイン又はモジュール又は領域（半減期延長ドメインなど）を本発明の抗体コンストラクトに結合するためにも使用され得る。
本発明の抗体コンストラクトは、「インビトロで作製された抗体コンストラクト」であることが好ましい。本用語は、可変領域の全て又は一部（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ）が非免疫細胞の選択、例えばインビトロファージディスプレイ、タンパク質チップ又は抗原結合能に関して候補配列を試験することができる任意の他の方法において作製される、上記定義による抗体コンストラクトを指す。したがって、本用語は、好ましくは、動物の免疫細胞におけるゲノム再編成によってのみ作製される配列を除外する。「組換え抗体」は、組換えＤＮＡ技術又は遺伝子工学の使用により作製された抗体である。
本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）又はモノクローナル抗体コンストラクトは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体、すなわち少量存在する可能性がある、考えられる天然に存在する変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である集団を含む個々の抗体を指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、異なる決定基（又はエピトープ）に対して誘導された異なる抗体を通常含む従来の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、抗原上の単一の抗原部位又は決定基に対して誘導される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成されるため、他の免疫グロブリンが混入しない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。
モノクローナル抗体の調製には、継続的な細胞株培養により産生される抗体をもたらす任意の技術を用いることができる。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）によって作製され得る。ヒトモノクローナル抗体を産生するさらなる技術の例としては、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４（１９８３），７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７−９６）が挙げられる。
次に、ハイブリドーマを、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴分析、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）などの標準的な方法を使用してスクリーニングして、指定の抗原に特異的に結合する抗体を産生する１つ以上のハイブリドーマを同定することができる。例えば、組換え抗原、天然に存在する形態、その任意のバリアント又はフラグメント並びにその抗原性ペプチドなど、任意の形態の関連抗原が免疫原として使用され得る。Ｂｉａｃｏｒｅシステムで採用されている表面プラズモン共鳴を使用して、標的細胞の表面抗原のエピトープにファージ抗体が結合する効率を高めることができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７（１９９６），９７−１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３（１９９５），７−１３）。
モノクローナル抗体を作製する別の例示的な方法としては、タンパク質発現ライブラリ、例えばファージディスプレイ又はリボソームディスプレイライブラリのスクリーニングが挙げられる。ファージディスプレイは、例えば、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２２３，４０９号明細書；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−１３１７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される。
ディスプレイライブラリの使用に加えて、関連抗原を使用して、非ヒト動物、例えば齧歯類（マウス、ハムスター、ウサギ又はラットなど）を免疫化することができる。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、マウス抗体産生が欠損したマウス系統を、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）遺伝子座の大きいフラグメントを用いて改変することが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子由来の抗原特異的モノクローナル抗体を作製し、選択し得る。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１、米国特許出願公開第２００３−００７０１８５号明細書、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット及び国際公開第９６／３３７３５号パンフレットを参照されたい。
モノクローナル抗体は、非ヒト動物から得た後、当技術分野で知られる組換えＤＮＡ技術を用いて、例えばヒト化、脱免疫、キメラ化などの改変を行うこともできる。改変抗体コンストラクトの例としては、非ヒト抗体のヒト化バリアント、「親和性成熟」抗体（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４，８８９−８９６（１９９２）及びＬｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０，１０８３２−１０８３７（１９９１）を参照されたい）及びエフェクター機能が改変された抗体変異体（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号明細書、前掲のＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ（２０１０）及び前掲のＬｉｔｔｌｅ（２００９）を参照されたい）が挙げられる。
免疫学において、親和性成熟とは、免疫反応の過程で抗原に対する親和性の増大した抗体をＢ細胞が産生するプロセスである。同一抗原への反復暴露により、宿主は、親和性が連続的に増大する抗体を産生することになる。天然のプロトタイプと同様に、インビトロ親和性成熟は、変異及び選択の原理に基づいている。インビトロ親和性成熟を問題なく使用して、抗体、抗体コンストラクト及び抗体フラグメントを最適化している。ＣＤＲ内部のランダム変異は、放射線、化学的変異原又はエラープローンＰＣＲを用いて導入される。加えて、遺伝的多様性は、チェイン・シャッフリング法によって増大させることができる。ファージディスプレイのようなディスプレイ方法を用いた２又は３ラウンドの変異及び選択により、通常、低ナノモル範囲の親和性を有する抗体フラグメントが得られる。
抗体コンストラクトの好ましいタイプのアミノ酸置換変種は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を伴うものである。一般に、さらなる開発のために選択されて得られるバリアントは、それらが生成された親抗体と比べて向上した生物学的特性を有することになる。そのような置換バリアントを生成するための簡便な方法には、ファージディスプレイを用いる親和性成熟が含まれる。簡潔に説明すると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）は、それぞれの部位で可能な全てのアミノ酸置換が生じるように変異される。そのようにして生成された抗体バリアントは、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として、繊維状ファージ粒子から一価形態で提示される。次に、ファージディスプレイされたバリアントを、本明細書に開示されるとおりにそれらの生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための超可変領域部位候補を同定するために、アラニンスキャニング変異導入法を実施して、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定し得る。代わりに又は加えて、結合ドメインと例えばヒトＭＵＣ１７との間の接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益な場合がある。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書で詳述される技術による置換の候補である。そのようなバリアントを生成してから、バリアントのパネルに対して、本明細書に記載されるとおりのスクリーニングを施し、１つ以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択し得る。
本発明のモノクローナル抗体及び抗体コンストラクトは、特に重鎖及び／若しくは軽鎖の一部が特定の種に由来するか、又は特定の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一若しくは相同である一方、鎖の残部は、所望の生物活性を示す限り、別の種に由来するか、又は別の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体並びにそのような抗体のフラグメント中の対応する配列と同一若しくは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書における目的のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる。キメラ抗体を作製するための様々な方法が記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１，１９８５；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，１９８５、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号明細書；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０１７１４９６号明細書；欧州特許第０１７３４９４号明細書；及び英国特許第２１７７０９６号明細書を参照されたい。
抗体、抗体コンストラクト、抗体フラグメント又は抗体バリアントは、国際公開第９８／５２９７６号パンフレット又は国際公開第００／３４３１７号パンフレットの実施例に開示される方法によるヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失（「脱免疫化」と呼ばれる方法）によっても改変され得る。簡潔に説明すると、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて、抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインを分析することができる。これらのペプチドは、潜在的なＴ細胞エピトープ（国際公開第９８／５２９７６号パンフレット及び国際公開第００／３４３１７号パンフレットに定義される）に相当する。潜在的なＴ細胞エピトープの検出には、国際公開第９８／５２９７６号パンフレット及び国際公開第００／３４３１７号パンフレットに記載されるとおり、「ペプチドスレッディング法」と呼ばれるコンピュータモデリング手法を適用することができ、加えて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースにおいて、ＶＨ及びＶＬ配列に存在するモチーフを検索することができる。これらのモチーフは、１８個の主要ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプのいずれかに結合するため、潜在的なＴ細胞エピトープとなる。検出された潜在的なＴ細胞エピトープは、可変ドメイン内の少数のアミノ酸残基を置換することにより、又は好ましくは単一のアミノ酸置換により除去することができる。通常、保存的置換がなされる。全てではないが多くの場合、ヒト生殖細胞系列の抗体配列内の位置に共通するアミノ酸が使用され得る。ヒト生殖細胞系列配列については、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ Ｖｏｌ．１６（５）：２３７−２４２；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１４：４６２８−４６３８に開示される。Ｖ ＢＡＳＥ総覧は、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的な総覧を提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ＬＡ．ｅｔ ａｌ．ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによる編集）。これらの配列をヒト配列の供給源として、例えばフレームワーク領域及びＣＤＲに使用することができる。例えば、米国特許第６，３００，０６４号明細書に記載されるコンセンサスヒトフレームワーク領域を使用することもできる。
「ヒト化」抗体、抗体コンストラクト、バリアント又はそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合部分配列）は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、大部分がヒト配列である抗体又は免疫グロブリンである。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲともいう）由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ハムスター又はウサギなどの非ヒト（例えば齧歯類）種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基により置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置換される。さらに、本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基も含む場合がある。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練させ、最適化するためになされる。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分も含む場合がある。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
ヒト化抗体又はそのフラグメントは、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変ドメインの配列をヒトＦｖ可変ドメイン由来の均等な配列で置換することによって生成することができる。ヒト化抗体又はそのフラグメントを生成するための例示的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４並びに米国特許第５，５８５，０８９号明細書、米国特許第５，６９３，７６１号明細書、米国特許第５，６９３，７６２号明細書、米国特許第５，８５９，２０５号明細書及び米国特許第６，４０７，２１３号明細書により提供される。それらの方法は、重鎖又は軽鎖の少なくとも１つに由来する免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全て又は一部分をコードする核酸配列を単離、操作及び発現することを含む。そのような核酸を、上記のとおりの所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマ及び他の供給源から得ることができる。次に、ヒト化抗体分子をコードする組換えＤＮＡが適切な発現ベクターにクローニングされ得る。
ヒト化抗体は、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子を発現するが、内在性のマウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することができないマウスなどのトランスジェニック動物を用いても作製され得る。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載されるヒト化抗体の調製に使用され得る例示的なＣＤＲ移植法を記載している（米国特許第５，２２５，５３９号明細書）。特定のヒト抗体のＣＤＲの全ては、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部分で置換されるか又はＣＤＲの一部のみが非ヒトＣＤＲで置換され得る。所定の抗原に対するヒト化抗体の結合に必要とされる数のＣＤＲを置換することのみが必要である。
ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖細胞系列置換及び／又は復帰変異の導入によって最適化することができる。このような改変免疫グロブリン分子は、当技術分野で知られる複数の技術のいずれによって作製することができる（例えば、Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：７３０８−７３１２，１９８３；Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２７９，１９８３；Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：３−１６，１９８２及び欧州特許第２３９４００号明細書）。
用語「ヒト抗体」、「ヒト抗体コンストラクト」及び「ヒト結合ドメイン」は、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）（前掲）によって記載されたものを含む、当技術分野で知られるヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変及び定常領域又はドメインなどの抗体領域を有する抗体、抗体コンストラクト及び結合ドメインを含む。本発明のヒト抗体、抗体コンストラクト又は結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム変異誘発若しくは部位特異的変異誘発により又はインビボでの体細胞変異により導入される変異）を例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３に含み得る。ヒト抗体、抗体コンストラクト又は結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基で置換された少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれを超える位置を有し得る。本明細書で使用する場合、ヒト抗体、抗体コンストラクト及び結合ドメインの定義は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅなどの技術又はシステムを使用することによって得ることができる、非人為的且つ／又は遺伝的に改変された抗体のヒト配列のみを含む完全ヒト抗体も意図している。好ましくは、「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンによってコードされないアミノ酸残基を含まない。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体コンストラクトは、「単離された」又は「実質的に純粋な」抗体コンストラクトである。本明細書に開示される抗体コンストラクトを記載するために使用する場合、「単離された」又は「実質的に純粋な」は、その産生環境の成分から同定、分離及び／又は回収された抗体コンストラクトを意味する。好ましくは、抗体コンストラクトは、その産生環境由来の他の全ての成分との会合を有しないか又は実質的に有しない。組換えトランスフェクト細胞から生じる成分などのその産生環境の混入成分は、通常、ポリペプチドについての診断又は治療用途を妨げる材料であり、これは、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を含み得る。抗体コンストラクトは、例えば、所与の試料中の全タンパク質の少なくとも約５重量％又は少なくとも約５０重量％を構成し得る。単離されたタンパク質は、環境に応じて総タンパク質含量の５重量％〜９９．９重量％を構成し得ると理解される。ポリペプチドが高い濃度レベルで作製されるように、誘導性プロモーター又は高発現プロモーターの使用によって著しく高濃度でポリペプチドが作製され得る。この定義は、当技術分野で知られる多様な生物体及び／又は宿主細胞での抗体コンストラクトの産生を含む。好ましい実施形態では、抗体コンストラクトは、（１）スピニングカップシークエネーターを使用して、Ｎ末端若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（２）クーマシーブルー若しくは好ましくは銀染色を用いた非還元若しくは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製されることになる。ただし、通常、単離された抗体コンストラクトは、少なくとも１つの精製工程によって調製されることになる。
用語「結合ドメイン」は、本発明との関係では、標的分子（抗原）、本明細書においてそれぞれＭＵＣ１７及びＣＤ３上の所与の標的エピトープ又は所与の標的部位と（特異的に）結合する／それらと相互作用する／それらを認識するドメインを特徴とする。第１の結合ドメイン（ＭＵＣ１７を認識する）の構造及び機能、好ましくは第２の結合ドメイン（ＣＤ３を認識する）の構造及び／又は機能も、抗体の例えば全長又は完全免疫グロブリン分子の構造及び／又は機能に基づき、且つ／又は抗体若しくはそのフラグメントの可変重鎖（ＶＨ）及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）ドメインから導き出される。好ましくは、第１の結合ドメインは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）の存在によって特徴付けられる。第２の結合ドメインは、好ましくは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件も含む。より好ましくは、第２の結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。第１及び／又は第２の結合ドメインは、既存の（モノクローナル）抗体由来のＣＤＲ配列をスキャフォールドに移植する以外のファージディスプレイ又はライブラリスクリーニング法によって作製されるか又は得られることが想定される。
本発明によれば、結合ドメインは、１つ以上のポリペプチドの形態である。このようなポリペプチドは、タンパク質性部分及び非タンパク質性部分（例えば、化学的リンカー又はグルタルアルデヒドなどの化学的架橋剤）を含み得る。タンパク質（そのフラグメント、好ましくは生物学的に活性なフラグメント及び通常３０個未満のアミノ酸を有するペプチドを含む）は、（アミノ酸の鎖をもたらす）共有ペプチド結合を通じて相互に結合された２つ以上のアミノ酸を含む。
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、通常、３０個を超えるアミノ酸からなる分子群を表す。ポリペプチドは、二量体、三量体及びより高次のオリゴマーなどのマルチマーをさらに形成し、すなわち２つ以上のポリペプチド分子からなる場合もある。このような二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一であっても同一でなくてもよい。このようなマルチマーの対応する高次構造は、したがって、ホモ又はヘテロ二量体、ホモ又はヘテロ三量体などと称される。ヘテロ多量体の例は、その天然形態において、２つの同一のポリペプチド軽鎖及び２つの同一のポリペプチド重鎖からなる抗体分子である。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などのような翻訳後修飾による修飾がなされた天然修飾ペプチド／ポリペプチド／タンパク質も指す。本明細書で参照される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペグ化などの化学修飾されたものでもあり得る。このような修飾は、当技術分野でよく知られており、本明細書で以下に記載される。
好ましくは、ＭＵＣ１７に結合する結合ドメイン及び／又はＣＤ３εに結合する結合ドメインは、ヒト結合ドメインである。少なくとも１つのヒト結合ドメインを含む抗体及び抗体コンストラクトは、齧歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター又はウサギ）などの非ヒト可変及び／又は定常領域を有する抗体又は抗体コンストラクトに伴う問題の一部を回避する。このような齧歯類由来タンパク質が存在すると、抗体又は抗体コンストラクトの迅速なクリアランスをもたらす可能性があるか、又は患者による抗体又は抗体コンストラクトに対する免疫反応を発生させる可能性がある。齧歯類由来抗体又は抗体コンストラクトの使用を避けるために、齧歯類が完全ヒト抗体を産生するようにヒト抗体機能を齧歯類に導入することにより、ヒト又は完全ヒト抗体／抗体コンストラクトを生成することができる。
酵母人工染色体ＹＡＣにおいてメガベースサイズのヒト遺伝子座をクローニングし、且つ再構築する能力及びそれらをマウス生殖細胞系列に導入する能力は、非常に大きいか又は粗くマッピングされた遺伝子座の機能的要素の解明並びにヒト疾患の有用なモデルの生成にとって強力な手法を提供する。さらに、マウス遺伝子座をそれらのヒト均等物で置換するそのような技術を使用すれば、発生期のヒト遺伝子産物の発現及び調節、それらと他の系との伝達並びに疾患の誘発及び進行へのそれらの関与について独特の見解を得ることができるであろう。
このような戦略の重要な実用化は、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。内在性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子が不活性化されたマウスへのヒトＩｇ遺伝子座の導入により、抗体のプログラムされた発現及び構築並びにＢ細胞の発生におけるそれらの役割の基礎となる機構を研究する機会が得られる。さらに、このような戦略であれば、ヒト疾患における抗体療法の可能性を実現する上で重要なマイルストーンとなる完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の作製にとって理想的な供給源を得ることができるであろう。完全ヒト抗体又は抗体コンストラクトは、マウスｍＡｂ又はマウス由来ｍＡｂに固有の免疫原性及びアレルギー反応を最小化し、それによって投与される抗体／抗体コンストラクトの有効性及び安全性を増大させることが期待される。完全ヒト抗体又は抗体コンストラクトの使用により、化合物の反復投与を必要とする慢性及び再発性のヒト疾患、例えば炎症、自己免疫及び癌の治療に大幅な利点が得られるものと期待され得る。
この目標に向けた手法の１つは、マウス抗体の産生に欠損があるマウス系統をヒトＩｇ遺伝子座の大きいフラグメントを用いて操作することであり、これは、このようなマウスが、マウス抗体を生じずに広範なレパートリーのヒト抗体を産生するであろうとの予測に立つものであった。大きいヒトＩｇフラグメントは、可変遺伝子の広範な多様性並びに抗体の産生及び発現の適切な調節を保持すると考えられる。抗体の多様化及び選択並びにヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如ためにマウス機構を利用することにより、このマウス系統において再現されるヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含む目的の任意の抗原に対して高親和性の抗体を産生するはずである。ハイブリドーマ技術を使用すれば、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂを容易に作製及び選択することができるであろう。この一般的な戦略は、最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウス系統の生成と関連して実証された（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）を参照されたい）。このＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統は、可変領域及び定常領域のコア配列を含有したヒト重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座のそれぞれ２４５ｋｂ及び１９０ｋｂサイズの生殖細胞系列配置フラグメントを含有するＹＡＣを用いて操作された。このヒトＩｇを含有するＹＡＣは、抗体の再編成及び発現の両方に関してマウス系への適合性があることが証明されており、不活性化されたマウスＩｇ遺伝子を置換することが可能であった。これは、それらがＢ細胞の発生を誘導して、完全ヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトｍＡｂを産生する能力によって実証された。これらの結果は、多数のＶ遺伝子、追加の調節エレメント及びヒトＩｇ定常領域を含有するヒトＩｇ遺伝子座の大部分の導入が、感染及び免疫化に対するヒト液性応答を特徴とする実質的に完全なレパートリーを再現し得ることも示唆した。最近、Ｇｒｅｅｎらの研究を発展させ、ヒト重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座のそれぞれのメガベースサイズの生殖細胞系列配置ＹＡＣフラグメントの導入により、ヒト抗体レパートリーのおよそ８０％超が導入された。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）及び米国特許出願公開第０８／７５９，６２０号明細書を参照されたい。
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物の作製は、米国特許出願公開第０７／４６６，００８号明細書、同第０７／６１０，５１５号明細書、同第０７／９１９，２９７号明細書、同第０７／９２２，６４９号明細書、同第０８／０３１，８０１号明細書、同第０８／１１２，８４８号明細書、同第０８／２３４，１４５号明細書、同第０８／３７６，２７９号明細書、同第０８／４３０，９３８号明細書、同第０８／４６４，５８４号明細書、同第０８／４６４，５８２号明細書、同第０８／４６３，１９１号明細書、同第０８／４６２，８３７号明細書、同第０８／４８６，８５３号明細書、同第０８／４８６，８５７号明細書、同第０８／４８６，８５９号明細書、同第０８／４６２，５１３号明細書、同第０８／７２４，７５２号明細書及び同第０８／７５９，６２０号明細書；並びに米国特許第６，１６２，９６３号明細書；同第６，１５０，５８４号明細書；同第６，１１４，５９８号明細書；同第６，０７５，１８１号明細書及び同第５，９３９，５９８号明細書並びに日本特許第３０６８１８０Ｂ２号公報、同第３０６８５０６Ｂ２号公報及び同第３０６８５０７Ｂ２号公報でさらに議論され詳述されている。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）及びＧｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）、欧州特許第０４６３１５１Ｂ１号明細書、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、国際公開第００／７６３１０号パンフレット及び国際公開第０３／４７３３６号パンフレットも参照されたい。
別の手法では、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，を含む他社が「ミニ遺伝子座」の手法を利用している。このミニ遺伝子座の手法において、外来性Ｉｇ遺伝子座は、このＩｇ遺伝子座由来の断片（個々の遺伝子）を含めることにより模倣される。したがって、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、ミュー定常領域及び第２の定常領域（好ましくは、ガンマ定常領域）は、動物に挿入されるコンストラクトを形成する。この手法は、Ｓｕｒａｎｉらに対する米国特許第５，５４５，８０７号明細書並びにＬｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙのそれぞれに対する米国特許第５，５４５，８０６号明細書；同第５，６２５，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；同第５，７７０，４２９号明細書；同第５，７８９，６５０号明細書；同第５，８１４，３１８号明細書；同第５，８７７，３９７号明細書；同第５，８７４，２９９号明細書；及び同第６，２５５，４５８号明細書、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ及びＢｅｒｎｓに対する米国特許第５，５９１，６６９号明細書及び同第６，０２３．０１０号明細書、Ｂｅｒｎｓらに対する米国特許第５，６１２，２０５号明細書；同第５，７２１，３６７号明細書；及び同第５，７８９，２１５号明細書並びにＣｈｏｉ及びＤｕｎｎに対する米国特許第５，６４３，７６３号明細書並びにＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願公開第０７／５７４，７４８号明細書、同第０７／５７５，９６２号明細書、同第０７／８１０，２７９号明細書、同第０７／８５３，４０８号明細書、同第０７／９０４，０６８号明細書、同第０７／９９０，８６０号明細書、同第０８／０５３，１３１号明細書、同第０８／０９６，７６２号明細書、同第０８／１５５，３０１号明細書、同第０８／１６１，７３９号明細書、同第０８／１６５，６９９号明細書、同第０８／２０９，７４１号明細書に記載されている。欧州特許第０５４６０７３Ｂ１号明細書、国際公開第９２／０３９１８号パンフレット、国際公開第９２／２２６４５号パンフレット、国際公開第９２／２２６４７号パンフレット、国際公開第９２／２２６７０号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／００５６９号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９６／１４４３６号パンフレット、国際公開第９７／１３８５２号パンフレット及び国際公開第９８／２４８８４号パンフレット並びに米国特許第５，９８１，１７５号明細書も参照されたい。さらに、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）及びＴｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）を参照されたい。
Ｋｉｒｉｎも、マイクロセル融合によって大きい染色体片又は染色体全体が導入された、マウスからのヒト抗体の産生を実証した。欧州特許出願公開第７７３２８８号明細書及び同第８４３９６１号明細書を参照されたい。Ｘｅｎｅｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、有望なヒト抗体産生技術を開発している。この技術では、ＳＣＩＤマウスをヒトリンパ細胞、例えばＢ細胞及び／又はＴ細胞で再構成する。その後、マウスは、抗原で免疫化され、その抗原に対する免疫反応を発生させることができる。米国特許第５，４７６，９９６号明細書；同第５，６９８，７６７号明細書；及び同第５，９５８，７６５号明細書を参照されたい。
ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応は、産業界がキメラ又は別の方法でヒト化された抗体を作製する要因となった。しかしながら、ある種のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）反応は、特に慢性又は複数回用量での抗体の利用において観察されることになると予想される。したがって、ＨＡＭＡ若しくはＨＡＣＡ反応の懸念及び／又は影響をなくすために、ＭＵＣ１７に対するヒト結合ドメイン及びＣＤ３εに対するヒト結合ドメインを含む抗体コンストラクトを提供することが望ましいと考えられる。
用語「（特異的に）結合する」、「（特異的に）認識する」、「（特異的に）誘導される」及び「（特異的に）反応する」は、本発明によれば、結合ドメインが標的分子（抗原）、本明細書ではそれぞれＭＵＣ１７及びＣＤ３ε上の所与のエピトープ又は所与の標的部位と相互作用するか又は特異的に相互作用することを意味する。
用語「エピトープ」は、抗体若しくは免疫グロブリン又は抗体若しくは免疫グロブリンの誘導体、フラグメント若しくはバリアントなどの結合ドメインが特異的に結合する抗原上の部位を指す。「エピトープ」は、抗原性であり、したがって、エピトープという用語は、本明細書において「抗原性構造」又は「抗原決定基」と称する場合もある。したがって、結合ドメインは、「抗原相互作用部位」である。前記結合／相互作用は、「特異的認識」も定義すると理解される。
「エピトープ」は、連続したアミノ酸又はタンパク質の三次元フォールディングによって並列される非連続アミノ酸の両方によって形成され得る。「線状エピトープ」は、アミノ酸一次配列が認識されるエピトープを含むエピトープである。線状エピトープは、通常、特有の配列内に少なくとも３つ又は少なくとも４つ及びより一般的に少なくとも５つ、又は少なくとも６つ、又は少なくとも７つ、例えば約８〜約１０のアミノ酸を含む。
「立体構造エピトープ」は、線状エピトープとは対照的に、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープを定義する唯一の要素ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が必ずしも結合ドメインによって認識されないエピトープ）である。一般に、立体構造エピトープは、線状エピトープと比較して多数のアミノ酸を含む。立体構造エピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原、好ましくはペプチド若しくはタンパク質又はそれらのフラグメントの三次元構造を認識する（本発明に関連して、結合ドメインの１つに対する抗原性構造が標的細胞の表面抗原タンパク質内に含まれる）。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造が形成する場合、立体構造エピトープを形成する特定のアミノ酸及び／又はポリペプチド骨格が並列した状態になり、それによって抗体がそのエピトープを認識できるようになる。エピトープの立体構造を決定する方法としては、ｘ線結晶構造解析、二次元核磁気共鳴（２Ｄ−ＮＭＲ）分光分析及び部位特異的スピンラベル法及び電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法が挙げられるが、これらに限定されない。
エピトープマッピングの方法を以下に記載する。ヒトＭＵＣ１７タンパク質の領域（隣接するひと続きのアミノ酸）が、非ヒト及び非霊長類のＭＵＣ１７（例えば、マウスＭＵＣ１７であるが、他にニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなどのものも考えられ得る）の対応する領域で交換又は置換される場合、使用されている非ヒト、非霊長類のＭＵＣ１７に対して結合ドメインが交差反応性でない限り、結合ドメインの結合性の低減が起こると予想される。前述の低減は、ヒトＭＵＣ１７タンパク質の対応する領域への結合を１００％とした場合、ヒトＭＵＣ１７タンパク質内の対応する領域への結合と比較して好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％；より好ましくは少なくとも６０％、７０％又は８０％及び最も好ましくは９０％、９５％又はさらに１００％である。上記のヒトＭＵＣ１７／非ヒトＭＵＣ１７のキメラは、ＣＨＯ細胞において発現されることが想定される。また、ヒトＭＵＣ１７／非ヒトＭＵＣ１７のキメラは、ＥｐＣＡＭなどの異なる膜結合タンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインと融合されることも想定される。
エピトープマッピングの代替的又は追加の方法では、結合ドメインによって認識される特定の領域を決定するために、ヒトＭＵＣ１７細胞外ドメインのいくつかの短縮型が作製され得る。これらの短縮型では、細胞外の異なるＭＵＣ１７ドメイン／サブドメイン又は領域は、Ｎ末端から開始して段階的に欠失される。短縮型のＭＵＣ１７は、ＣＨＯ細胞で発現され得ることが想定される。また、短縮型のＭＵＣ１７は、ＥｐＣＡＭなどの異なる膜結合タンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインと融合される場合があることも想定される。また、短縮型のＭＵＣ１７は、それらのＮ末端にシグナルペプチドドメイン、例えばマウスＩｇＧ重鎖シグナルペプチドに由来するシグナルペプチドを包含する場合があることも想定される。さらに、短縮型のＭＵＣ１７は、細胞表面上でのそれらの正確な発現を確認できる（シグナルペプチドに続く）Ｎ末端におけるｖ５ドメインを包含する場合があることも想定される。結合ドメインによって認識されるＭＵＣ１７領域をもはや包含しない短縮型のＭＵＣ１７では、結合の低減又は喪失が起こると予想される。結合の低減は、ヒトＭＵＣ１７タンパク質全体（又はその細胞外領域若しくはドメイン）への結合を１００％とした場合、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％；より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％及び最も好ましくは９０％、９５％又はさらに１００％である。
抗体コンストラクト又は結合ドメインによる認識に対するＭＵＣ１７の特定の残基の寄与を決定するためのさらなる方法は、分析される各残基を例えば部位特異的変異誘発によってアラニンで置換するアラニンスキャニング（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＫＬ＆Ｗｅｉｓｓ ＧＡ．Ｃｕｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｊｕｎ；５（３）：３０２−７を参照されたい）である。アラニンが使用される理由は、嵩高くなく、化学的に不活性であり、それでも多くの他のアミノ酸が有している二次構造基準を模倣するメチル官能基を有しているためである。変異される残基のサイズを保存することが望ましい場合、ときにバリン又はロイシンなどの嵩高いアミノ酸を使用し得る。アラニンスキャニングは、長期にわたり使用されてきた成熟した技術である。
結合ドメインとエピトープ又はエピトープを含む領域との間の相互作用は、結合ドメインが特定のタンパク質又は抗原（本明細書ではそれぞれＭＵＣ１７及びＣＤ３）上のエピトープ／エピトープを含む領域に対して測定可能な親和性を示し、且つ一般にＭＵＣ１７又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に対して著しい反応性を示さないことを意味する。「測定可能な親和性」は、約１０−６Ｍ（ＫＤ）又はそれより強い親和性を有する結合を含む。好ましくは、結合親和性が約１０−１２〜１０−８Ｍ、１０−１２〜１０−９Ｍ、１０−１２〜１０−１０Ｍ、１０−１１〜１０−８Ｍ、好ましくは約１０−１１〜１０−９Ｍである場合、結合を特異的と見なす。結合ドメインが標的と特異的に反応するか又は標的に結合するかどうかは、とりわけ、標的タンパク質又は抗原に対する前記結合ドメインの反応をＭＵＣ１７又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に対する前記結合ドメインの反応と比較することにより、容易に試験することができる。好ましくは、本発明の結合ドメインは、ＭＵＣ１７又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に本質的に又は実質的に結合しない（すなわち第１の結合ドメインは、ＭＵＣ１７以外のタンパク質に結合することができず、第２の結合ドメインは、ＣＤ３以外のタンパク質に結合することができない）。他のＨＬＥ形式と比較して優れた親和性特性を有することは、本発明による抗体コンストラクトの想定される特徴である。このような優れた親和性は、結果として、インビボでの半減期の延長を示唆する。本発明による抗体コンストラクトのより長い半減期は、投与期間及び頻度を減少させる場合があり、これは、通常、患者のコンプライアンスの改善に寄与する。これは、特に重要なことであり、なぜなら、本発明の抗体コンストラクトは、非常に衰弱した又はさらに多疾患である癌患者に特に有益であるためである。
用語「本質的／実質的に結合しない」又は「結合することができない」は、本発明の結合ドメインがＭＵＣ１７又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に結合せず、すなわちＭＵＣ１７又はＣＤ３のそれぞれに対する結合を１００％とした場合、ＭＵＣ１７又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に対して３０％超、好ましくは２０％超、より好ましくは１０％超、特に好ましくは９％、８％、７％、６％又は５％超の反応性を示さないことを意味する。
特異的結合は、結合ドメイン及び抗原のアミノ酸配列内の特異的モチーフによってもたらされると考えられる。したがって、結合は、それらの一次、二次及び／又は三次構造の結果として並びに前記構造の二次的修飾の結果として生じる。抗原相互作用部位とその特異抗原との特異的相互作用により、抗原に対する前記側の単純な結合が生じ得る。さらに、抗原相互作用部位とその特異抗原との特異的相互作用により、例えば抗原の立体構造変化の誘導、抗原のオリゴマー化などにより、代替的に又は追加的にシグナルの開始がもたらされ得る。
用語「可変」は、配列内で可変性を示し、特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関与する、抗体又は免疫グロブリンドメインの一部分（すなわち「可変ドメイン」）を指す。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）との対がともに単一の抗原結合部位を形成する。
可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく、重鎖及び軽鎖可変領域の各々のサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「超可変領域」又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存的な（すなわち非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲＭ又はＦＲ）と呼ばれ、抗原結合表面を形成する三次元空間内における６つのＣＤＲのための足場を提供する。天然に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、大部分がβシート配置をとる４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）をそれぞれ含み、これらは、ループ接続を形成し、場合によりβシート構造の一部を形成する３つの超可変領域によって接続される。各鎖の超可変領域は、ＦＲＭによって近接して共同で保持されており、他の鎖の超可変領域とともに抗原結合部位の形成に寄与する（前掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。
用語「ＣＤＲ」及びその複数形である「ＣＤＲｓ」は、相補性決定領域を指し、そのうちの３つが軽鎖可変領域の結合特性を構成し（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３）、３つが重鎖可変領域の結合特性を構成する（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）。ＣＤＲは、抗体と抗原との特異的相互作用を担う残基の大部分を含み、したがって抗体分子の機能的活性に寄与する。すなわち、それらは、抗原特異性の主要な決定基である。
ＣＤＲの境界及び長さの厳密な定義は、各種の分類及び付番方式に従う。したがって、ＣＤＲは、本明細書に記載される付番方式を含む、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ｃｏｎｔａｃｔ又は任意の他の境界定義によって表わされ得る。境界が異なっていても、これらの方式の各々は、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成する部分において、ある程度の重複を有する。したがって、これらの方式によるＣＤＲの定義は、長さ及び隣接するフレームワーク領域に関する境界領域が相違する場合がある。例えば、Ｋａｂａｔ（異種間の配列可変性に基づく手法）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法）及び／又はＭａｃＣａｌｌｕｍを参照されたい（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，前掲；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１−９１７；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）を参照されたい。抗原結合部位を特徴付けるさらに別の標準は、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されるＡｂＭ定義である。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照されたい。２つの残基同定技術が同一の領域ではなく重複する領域を定義する程度まで、それらを組み合わせて、ハイブリッドＣＤＲを定義することができる。しかしながら、いわゆるＫａｂａｔ方式に従う付番が好ましい。
通常、ＣＤＲは、カノニカル構造として分類することができるループ構造を形成する。用語「カノニカル構造」は、抗原結合（ＣＤＲ）ループがとる主鎖の立体構造を指す。比較構造研究から、６つの抗原結合ループの５つは、利用可能な立体構造の限られたレパートリーのみを有することが見出された。各カノニカル構造をポリペプチド骨格のねじれ角によって特徴付けることができる。したがって、抗体間の対応するループは、ループの大部分において、高いアミノ酸配列可変性が見られるにもかかわらず、非常に類似した三次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７；Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００）。さらに、採用されたループ構造とその周辺のアミノ酸配列との間に関連性が存在する。特定のカノニカルクラスの立体構造は、ループの長さにより、且つそのループ内並びに保存的フレームワーク内（すなわちループ外）の重要な位置に存在するアミノ酸残基により決定される。したがって、特定のカノニカルクラスへの割り当ては、これらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて行われ得る。
用語「カノニカル構造」は、例えば、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，前掲）により分類されるとおり、抗体の線状配列に関する考慮も含み得る。Ｋａｂａｔの付番スキーム（方式）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を一貫した様式で付番するために広く採用されている標準であり、本明細書の他の箇所でも言及されるとおり本発明での適用に好ましいスキームである。さらなる構造的な考慮が抗体のカノニカル構造を決定するために使用される場合もある。例えば、Ｋａｂａｔの付番法では十分に反映されない相違をＣｈｏｔｈｉａらの付番方式によって記載することができ、且つ／又は他の技術、例えば結晶学及び二次元若しくは三次元コンピュータモデリングによって明らかにすることができる。したがって、所与の抗体配列は、とりわけ、（例えば、種々のカノニカル構造をライブラリに含めるという要求に基づいて）適切なシャーシ配列の同定が可能であるカノニカルクラスに分類され得る。抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔ付番法及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（前掲）に記載される構造的な考慮並びに抗体構造のカノニカルな側面の解釈に対するそれらの意義については、文献に記載されている。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置は、当技術分野でよく知られている。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照されたい。
軽鎖のＣＤＲ３及び特に重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖及び重鎖可変領域内での抗原結合において最も重要な決定因子となる場合がある。いくつかの抗体コンストラクトでは、重鎖ＣＤＲ３が抗原と抗体との間の主要な接触領域になると思われる。ＣＤＲ３のみを変化させるインビトロ選択スキームを使用して、抗体の結合特性を変化させることができるか、又はいずれの残基が抗原の結合に寄与するかを決定することができる。したがって、ＣＤＲ３は、通常、抗体結合部位内での分子的多様性の最大の源である。例えば、Ｈ３は、２個のアミノ酸残基程度の短いもの又は２６個超のアミノ酸であり得る。
古典的な全長抗体又は免疫グロブリンでは、各軽（Ｌ）鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重（Ｈ）鎖に連結される一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。ＶＨに最も近接するＣＨドメインは、通常、ＣＨ１と称される。定常（「Ｃ」）ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、抗体依存性、細胞介在性の細胞傷害性及び補体活性化などの種々のエフェクター機能を示す。抗体のＦｃ領域は、重鎖定常ドメイン内に含まれ、例えば細胞表面に位置するＦｃ受容体と相互作用することができる。
構築及び体細胞変異後の抗体遺伝子の配列は、極めて多様であり、これらの多様化した遺伝子は、１０１０の異なる抗体分子をコードすると推定される（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）。したがって、免疫系は、免疫グロブリンのレパートリーを提供する。用語「レパートリー」は、少なくとも１つの免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列に全体又は一部が由来する少なくとも１つのヌクレオチド配列を指す。この配列は、重鎖のＶ、ＤＪセグメント並びに軽鎖のＶ及びＪセグメントのインビボでの再編成によって生成され得る。代わりに、この配列は、再編成を生じさせる、例えばインビトロ刺激に応答して細胞から生成され得る。代わりに、この配列の一部又は全ては、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、変異誘発及び他の方法によって得られる場合がある（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号明細書を参照されたい）。レパートリーは、１つの配列のみを含むか、又は遺伝的に多様なコレクション内のものを含む複数の配列を含み得る。
用語「Ｆｃ部分」又は「Ｆｃ単量体」は、本発明との関係では、免疫グロブリン分子のＣＨ２ドメインの機能を有する少なくとも１つのドメイン及びＣＨ３ドメインの機能を有する少なくとも１つのドメインを含むポリペプチドを意味する。「Ｆｃ単量体」という用語から明らかなとおり、それらのＣＨドメインを含むポリペプチドは、「ポリペプチド単量体」である。Ｆｃ単量体は、少なくとも重鎖の第１の定常領域免疫グロブリンドメイン（ＣＨ１）を除く免疫グロブリンの定常領域のフラグメントを含むが、少なくとも１つのＣＨ２ドメインの機能的部分及び１つのＣＨ３ドメインの機能的部分を維持しており、ＣＨ２ドメインがＣＨ３ドメインのアミノ末端側にあるポリペプチドであり得る。本定義の好ましい態様において、Ｆｃ単量体は、Ｉｇ−Ｆｃヒンジ領域の一部、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、ヒンジ領域がＣＨ２ドメインのアミノ末端側にあるポリペプチド定常領域であり得る。本発明のヒンジ領域は、二量体化を促進することが想定される。このようなＦｃポリペプチド分子は、例えば、免疫グロブリン領域のパパイン消化（当然のことながら、２つのＦｃポリペプチドの二量体を生じる）によって入手され得るが、これに限定されない。本定義の別の態様において、Ｆｃ単量体は、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の一部を含むポリペプチド領域であり得る。このようなＦｃポリペプチド分子は、例えば、免疫グロブリン分子のペプシン消化によって入手され得るが、これに限定されない。一実施形態において、Ｆｃ単量体のポリペプチド配列は、ＩｇＧ１Ｆｃ領域、ＩｇＧ２Ｆｃ領域、ＩｇＧ３Ｆｃ領域、ＩｇＧ４Ｆｃ領域、ＩｇＭＦｃ領域、ＩｇＡＦｃ領域、ＩｇＤＦｃ領域及びＩｇＥＦｃ領域のＦｃポリペプチド配列と実質的に同様である（例えば、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３１（３），１６９−２１７（１９９３）を参照されたい）。免疫グロブリン間に一定の変種が存在するため、且つ単に明確性のために、Ｆｃ単量体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの末尾の２つの重鎖定常領域免疫グロブリンドメイン並びにＩｇＥ及びＩｇＭの末尾の３つの重鎖定常領域免疫グロブリンドメインを指す。言及されるとおり、Ｆｃ単量体は、これらのドメインのＮ末端側に可動性のヒンジも含み得る。ＩｇＡ及びＩｇＭの場合、Ｆｃ単量体は、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧの場合、Ｆｃ部分は、免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３並びに最初の２つのドメインとＣＨ２との間のヒンジを含む。Ｆｃ部分の境界は、異なる場合があるが、機能的ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ部分の例は、例えば、Ｋａｂａｔに従う付番でＣＨ３ドメインのカルボキシル末端の残基Ｄ２３１（ヒンジドメインの−以下の表１のＤ２３４に対応する）〜Ｐ４７６、Ｌ４７６（ＩｇＧ４の場合）をそれぞれ含むように定義され得る。ペプチドリンカーを介して互いに融合される２つのＦｃ部分又はＦｃ単量体は、本発明の抗体コンストラクトの第３のドメインを定義し、これは、ｓｃＦｃドメインとも定義され得る。
本発明の一実施形態において、本明細書に開示されるｓｃＦｃドメイン、それぞれ互いに融合されるＦｃ単量体は、抗体コンストラクトの第３のドメインにのみ含まれることが想定される。
本発明に一致して、ＩｇＧヒンジ領域は、表１に記述されるＫａｂａｔ付番を用いた類似性によって同定され得る。上記に一致して、本発明のヒンジドメイン／領域に関して、最小要件は、Ｋａｂａｔ付番によるＤ２３１ Ｄ２３４〜Ｐ２４３の一続きのＩｇＧ１配列に対応するアミノ酸残基を含むことが想定される。本発明のヒンジドメイン／領域がＩｇＧ１ヒンジ配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４７７）（以下の表１に示される一続きのＤ２３４〜Ｐ２４３に対応する − ヒンジ領域がなお二量体化を促進する限り、前記配列の変種も想定される）を含むか又はそれからなることも同様に想定される。本発明の好ましい実施形態において、抗体コンストラクトの第３のドメイン内のＣＨ２ドメインのＫａｂａｔ位置３１４のグリコシル化部位は、Ｎ３１４Ｘ置換によって除去され、ここで、Ｘは、Ｑではない任意のアミノ酸である。前記置換は、好ましくは、Ｎ３１４Ｇ置換である。より好ましい実施形態において、前記ＣＨ２ドメインは、以下の置換（位置は、Ｋａｂａｔに従う）Ｖ３２１Ｃ及びＲ３０９Ｃ（これらの置換は、Ｋａｂａｔ位置３０９及び３２１でドメイン内システインジスルフィド架橋を導入する）をさらに含む。
本発明の抗体コンストラクトの第３のドメインは、アミノからカルボキシルの順に、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４７７）（すなわちヒンジ）−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４７７）（すなわちヒンジ）−ＣＨ２−ＣＨ３を含むか又はそれからなることも想定される。上記抗体コンストラクトのペプチドリンカーは、好ましい実施形態において、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１）又はそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘによって特徴付けられ、ここで、ｘは、５又はそれを超える整数（例えば、５、６、７、８など又はそれを超える）であり、６が好ましい（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６）。前記コンストラクトは、上記の置換：Ｎ３１４Ｘ、好ましくはＮ３１４Ｇ並びに／又はさらなる置換Ｖ３２１Ｃ及びＲ３０９Ｃをさらに含み得る。本明細書に上記で定義される本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態において、第２のドメインは、ヒト及び／又はマカクＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープに結合することが想定される。
表１：ヒンジ領域のアミノ酸残基のＫａｂａｔ付番
本発明のさらなる実施形態において、ヒンジドメイン／領域は、ＩｇＧ２サブタイプのヒンジ配列ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号４７８）、ＩｇＧ３サブタイプヒンジ配列ＥＬＫＴＰＬＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号４７９）若しくはＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号４８６）及び／又はＩｇＧ４サブタイプヒンジ配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４８０）を含むか又はそれからなる。ＩｇＧ１サブタイプヒンジ配列は、次の配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（表１及び配列番号４８７に示される）であり得る。したがって、これらのコアヒンジ領域も本発明に関連して想定される。
ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＤ３ドメインの位置並びに配列は、表２に記述されるＫａｂａｔ付番を用いて類似性によって同定され得る。
本発明の一実施形態では、第１又は両方のＦｃ単量体のＣＨ３ドメイン内の太字で強調表示されたアミノ酸残基は、欠失される。
第３のドメインのポリペプチド単量体（「Ｆｃ部分」又は「Ｆｃ単量体」）が互いに融合されるペプチドリンカーは、好ましくは、少なくとも２５アミノ酸残基（２５、２６、２７、２８、２９、３０など）を含む。より好ましくは、このペプチドリンカーは、少なくとも３０アミノ酸残基（３０、３１、３２、３３、３４、３５など）を含む。リンカーが最大４０アミノ酸残基を含むことも好ましく、より好ましくは最大３５アミノ酸残基、最も好ましくはちょうど３０アミノ酸残基である。このようなペプチドリンカーの好ましい実施形態は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１）又はそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘによって特徴付けられ、ここで、ｘは、５又はそれを超える整数（例えば、６、７又は８）である。好ましくは、整数は、６又は７であり、より好ましくは、整数は、６である。
第１のドメインを第２のドメインと融合するために、又は第１のドメイン若しくは第２のドメインを第３のドメインと融合するためにリンカーが使用される場合、このリンカーは、好ましくは、第１のドメイン及び第２のドメインの各々が互いに独立してそれらの異なる結合特異性を確実に保持できる十分な長さ及び配列のリンカーである。本発明の抗体コンストラクト内の少なくとも２つの結合ドメイン（又は２つの可変ドメイン）を接続するペプチドリンカーの場合、それらのペプチドリンカーは、数個のアミノ酸残基のみを含むもの、例えば１２アミノ酸残基以下を含むものが好ましい。したがって、１２、１１、１０、９、８、７、６又は５アミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。５アミノ酸未満を有する想定されるペプチドリンカーは、４、３、２又は１アミノ酸を含み、Ｇｌｙに富んだリンカーが好ましい。第１及び第２のドメインの融合のためのペプチドリンカーの好ましい実施形態は、配列番号１に示される。第２及び第３のドメインを融合するためのペプチドリンカーの好ましいリンカー実施形態は、（Ｇｌｙ）４−リンカーであり、Ｇ４−リンカーとも呼ばれる。
上記の「ペプチドリンカー」の１つに関連して特に好ましい「単一」のアミノ酸は、Ｇｌｙである。したがって、上記のペプチドリンカーは、単一のアミノ酸Ｇｌｙからなり得る。本発明の好ましい実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１）又はそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘによって特徴付けられ、ここで、ｘは、１又はそれより大きい整数（例えば、２又は３）である。好ましいリンカーは、配列番号１〜１２に示される。二次構造を促進しないことを含む前記ペプチドリンカーの特徴は、当技術分野で知られており、例えばＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６−９２７３）、Ｃｈｅａｄｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）２９，２１−３０）及びＲａａｇ ａｎｄ Ｗｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１），７３−８０）に記載されている。さらにいかなる二次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。上記のドメインの相互の連結は、例えば、実施例に記載される遺伝子操作によって提供することができる。融合され作動可能に連結された二重特異性一本鎖コンストラクトを調製し、それらを哺乳動物細胞又は細菌において発現させる方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット又はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）。
抗体コンストラクト又は本発明の好ましい実施形態において、第１のドメイン及び第２のドメインは、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−単一ドメインｍＡｂ、ダイアボディ及びこれらの形式のいずれかのオリゴマーからなる群から選択される形式の抗体コンストラクトを形成する。
特に好ましい実施形態に従い、且つ付属の実施例において記述されるとおり、本発明の抗体コンストラクトの第１及び第２のドメインは、「二重特異性一本鎖抗体コンストラクト」、より好ましくは二重特異性「一本鎖Ｆｖ」（ｓｃＦｖ）である。Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域が１価分子を形成するように対をなす単一のタンパク質鎖としてそれらが作製されることを可能にする、本明細書の上記のとおりの合成リンカーによって結合することができる；例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照されたい。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られる従来技術を用いて得られ、且つそのフラグメントは、完全又は全長抗体と同じ様式で機能について評価される。したがって、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、通常、約１０〜約２５アミノ酸、好ましくは約１５〜２０アミノ酸の短いリンカーペプチドによって接続される、免疫グロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可動性のためにグリシン及び溶解性のためにセリン又はスレオニンを豊富に含み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか又はその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。
二重特異性一本鎖抗体コンストラクトは、当技術分野で知られており、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット、Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５−３９７０、Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１−７０２５、Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３−１９７、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８−２１０３、Ｂｒｕｅｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０−２４２６、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），２９３，４１−５６に記載されている。一本鎖抗体の作製に関して記載された技術（とりわけ米国特許第４，９４６，７７８号明細書、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ（２０１０），前掲及びＬｉｔｔｌｅ（２００９），前掲を参照されたい）は、選出された標的を特異的に認識する一本鎖抗体コンストラクトを作製するために適合させることができる。
二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）（二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）とも呼ばれる）又は二重特異性一本鎖可変フラグメント（形式（ｓｃＦｖ）２を有するｂｉ−ｓｃＦｖ又はｄｉ−ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖ分子を（例えば、本明細書の上記に記載されるリンカーを用いて）連結することにより作り出すことができる。これらの２つのｓｃＦｖ分子が同じ結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子を二価と呼ぶことが好ましい（すなわち、それは、同じ標的エピトープに対して２の価数を有する）。これらの２つのｓｃＦｖ分子が異なる結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子を二重特異性と呼ぶことが好ましい。連結は、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖を作製して、タンデムｓｃＦｖを生成することによってなされ得る（例えば、Ｋｕｆｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：２３８−２４４を参照されたい）。別の可能性は、２つの可変領域を一体に折り畳むには短すぎる（例えば、約５アミノ酸の）リンカーペプチドを用いてｓｃＦｖ分子を作製し、ｓｃＦｖを二量体化させることである。この型は、ダイアボディとして知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｐ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｕｌｙ １９９３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９０（１４）：６４４４−８を参照されたい）。
本発明に一致して、第１のドメイン、第２のドメイン又は第１及び第２のドメインのいずれかは、それぞれ単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体の可変ドメイン又は単一ドメイン抗体の少なくともＣＤＲを含み得る。単一ドメイン抗体は、他のＶ領域又はドメインに非依存的に特異抗原に選択的に結合することができる１つのみの（単量体の）抗体可変ドメインを含む。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダにおいて見出される重鎖抗体から作り出され、これらは、ＶＨＨフラグメントと呼ばれる。軟骨魚類も重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ）を有し、それから、ＶＮＡＲフラグメントと呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。代替的な手法は、例えば、ヒト又は齧歯類由来の一般的な免疫グロブリン由来の二量体可変ドメインを単量体に分割し、それによって単一ドメインＡｂとしてＶＨ又はＶＬを得ることである。単一ドメイン抗体に関する大部分の研究は、現時点で重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖由来のナノボディも標的エピトープに特異的に結合することが示されている。単一ドメイン抗体の例は、ｓｄＡｂ、ナノボディ又は単一可変ドメイン抗体と呼ばれる。
したがって、（単一ドメインｍＡｂ）２は、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ及びＶＮＡＲを含む群から個別に選択される（少なくとも）２つの単一ドメインモノクローナル抗体から構成されるモノクローナル抗体コンストラクトである。リンカーは、好ましくは、ペプチドリンカーの形態である。同様に、「ｓｃＦｖ−単一ドメインｍＡｂ」は、少なくとも１つの上記の単一ドメイン抗体及び１つの上記のｓｃＦｖ分子から構成されるモノクローナル抗体コンストラクトである。この場合も、リンカーは、ペプチドリンカーの形態であることが好ましい。
抗体コンストラクトが別の所与の抗体コンストラクトと競合して結合するかどうかは、競合ＥＬＩＳＡ又は細胞を用いた競合アッセイなどの競合アッセイで測定することができる。アビジンを結合したマイクロ粒子（ビーズ）を使用することもできる。アビジンでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートと同様に、ビオチン化タンパク質と反応させる際、これらのビーズのそれぞれを基材として使用することができ、その上でアッセイを実施することができる。抗原をビーズ上にコーティングし、次に一次抗体でプレコーティングする。二次抗体を添加して、任意のさらなる結合を確認する。読み取りのために可能な手段としては、フローサイトメトリーが挙げられる。
Ｔ細胞又はＴリンパ球は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球（それ自体白血球の一種）の一種である。Ｔ細胞には、それぞれ異なる機能を有するいくつかのサブセットが存在する。Ｔ細胞は、その細胞表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が存在する点で他のリンパ球、例えばＢ細胞及びＮＫ細胞と区別することができる。ＴＣＲは、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与し、２つの異なるタンパク質鎖から構成される。９５％のＴ細胞において、ＴＣＲは、アルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖からなる。ＴＣＲが抗原ペプチド及びＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ複合体）と結合するとき、Ｔリンパ球が、関連酵素、共受容体、特化したアダプター分子及び活性化又は放出された転写因子によって媒介される一連の生化学的事象を通じて活性化される。
ＣＤ３受容体複合体は、タンパク質複合体であり、４つの鎖から構成される。哺乳動物において、この複合体は、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びいわゆるζ（ゼータ）鎖と会合してＴ細胞受容体ＣＤ３複合体を形成し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＣＤ３γ（ガンマ）、ＣＤ３δ（デルタ）及びＣＤ３ε（イプシロン）鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含有する、関連性の高い免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面タンパク質である。ＣＤ３分子の細胞内尾部は、ＴＣＲのシグナル伝達能に必須である免疫受容活性化チロシンモチーフ、すなわち略称ＩＴＡＭとして知られる単一の保存的モチーフを含有する。ＣＤ３イプシロン分子は、ヒトの第１１染色体に存在するＣＤ３Ｅ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。最も好ましいＣＤ３イプシロンのエピトープは、ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸残基１〜２７の範囲に含まれる。本発明による抗体コンストラクトは、典型的且つ有利には、特異的免疫療法において望ましくない非特異的Ｔ細胞活性化をわずかにのみ示すと想定される。これは、副作用のリスクが低いことになる。
多重特異性、少なくとも二重特異性抗体コンストラクトによるＴ細胞の動員を介するリダイレクトされた標的細胞の溶解は、細胞溶解性シナプスの形成並びにパーフォリン及びグランザイムの送達を伴う。結合したＴ細胞は、連続的な標的細胞の溶解が可能であり、ペプチド抗原のプロセシング及び提示又はクローナルなＴ細胞分化を妨げる免疫回避機構による影響を受けない（例えば、国際公開第２００７／０４２２６１号パンフレットを参照されたい）。
本発明の抗体コンストラクトによって媒介される細胞傷害性は、様々な方法で測定することができる。エフェクター細胞は、例えば、刺激された濃縮（ヒト）ＣＤ８陽性Ｔ細胞又は未刺激の（ヒト）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり得る。標的細胞がマカク起源である場合又は第１のドメインによって結合されるマカクＭＵＣ１７を発現するか若しくはそれでトランスフェクトされる場合、エフェクター細胞もマカクＴ細胞株、例えば４１１９ＬｎＰｘなどのマカク起源のものであるべきである。標的細胞は、ＭＵＣ１７、例えばヒト又はマカクＭＵＣ１７（の少なくとも細胞外ドメイン）を発現するはずである。標的細胞は、ＭＵＣ１７、例えばヒト又はマカクＭＵＣ１７で安定的又は一過的にトランスフェクトされている細胞株（ＣＨＯなど）であり得る。通常、ＥＣ５０値は、細胞表面に高レベルのＭＵＣ１７を発現する標的細胞株で低くなると予想される。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、通常、約１０：１であるが、これは、変動することもできる。ＭＵＣ１７二重特異性抗体コンストラクトの細胞傷害活性は、５１Ｃｒ放出アッセイ（約１８時間のインキュベーション時間）又はＦＡＣＳを用いた細胞傷害性アッセイ（約４８時間インキュベーション時間）において測定することができる。アッセイのインキュベーション時間（細胞傷害性反応）の変更も可能である。細胞傷害性を測定する他の方法は、当業者によく知られており、ＭＴＴ又はＭＴＳアッセイ、生物発光アッセイを含むＡＴＰ系アッセイ、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ、ＷＳＴアッセイ、クローン原性アッセイ及びＥＣＩＳ技術を含む。
本発明のＭＵＣ１７×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトによって媒介される細胞傷害活性は、好ましくは、細胞を用いた細胞傷害性アッセイで測定される。これは、５１Ｃｒ放出アッセイでも測定され得る。細胞傷害活性は、ＥＣ５０値によって表され、これは、半数効果濃度（ベースラインと最大値との中間の細胞傷害性反応を誘導する抗体コンストラクトの濃度）に対応する。好ましくは、ＭＵＣ１７×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトのＥＣ５０値は、≦５０００ｐＭ又は≦４０００ｐＭ、より好ましくは≦３０００ｐＭ又は≦２０００ｐＭ、さらにより好ましくは≦１０００ｐＭ又は≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦４００ｐＭ又は≦３００ｐＭ、さらにより好ましくは≦２００ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ、さらにより好ましくは≦５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦２０ｐＭ又は≦１０ｐＭ及び最も好ましくは≦５ｐＭである。
様々なアッセイにおいて、上記の所与のＥＣ５０値を測定することができる。刺激された／濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用する場合、未刺激のＰＢＭＣと比較してＥＣ５０値が低くなると予想できることを当業者は認識している。さらに、ＥＣ５０値は、標的細胞が多数のＭＵＣ１７を発現する場合、標的発現の少ないラットと比較して低くなると予想することができる。例えば、刺激された／濃縮ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用する場合（及びＣＨＯ細胞などのＭＵＣ１７でトランスフェクトされた細胞又はＭＵＣ１７陽性ヒト細胞株のいずれかを標的細胞として使用する場合）、ＭＵＣ１７×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトのＥＣ５０値は、好ましくは、≦１０００ｐＭ、より好ましくは≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦２５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ、さらにより好ましくは≦５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１０ｐＭ及び最も好ましくは≦５ｐＭである。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用する場合、ＭＵＣ１７×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトのＥＣ５０値は、好ましくは、≦５０００ｐＭ又は≦４０００ｐＭ（特に標的細胞がＭＵＣ１７陽性ヒト細胞株である場合）、より好ましくは≦２０００ｐＭ（特に標的細胞がＣＨＯ細胞などのＭＵＣ１７でトランスフェクトされた細胞である場合）、より好ましくは≦１０００ｐＭ又は≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦２００ｐＭ、さらにより好ましくは≦１５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ及び最も好ましくは≦５０ｐＭ又はそれ未満である。ＬｎＰｘ４１１９などのマカクＴ細胞株をエフェクター細胞として使用し、ＣＨＯ細胞などのマカクＭＵＣ１７でトランスフェクトされた細胞株を標的細胞株として使用する場合、ＭＵＣ１７×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトのＥＣ５０値は、好ましくは、≦２０００ｐＭ又は≦１５００ｐＭ、より好ましくは≦１０００ｐＭ又は≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦３００ｐＭ又は≦２５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ及び最も好ましくは≦５０ｐＭである。
好ましくは、本発明のＭＵＣ１７×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトは、ＣＨＯ細胞などのＭＵＣ１７陰性細胞の溶解を誘導／媒介しないか、又は溶解を本質的に誘導／媒介しない。用語「溶解を誘導しない」、「溶解を本質的に誘導しない」、「溶解を媒介しない」又は「溶解を本質的に媒介しない」は、ＭＵＣ１７陽性ヒト細胞株の溶解を１００％とした場合、本発明の抗体コンストラクトがＭＵＣ１７陰性細胞の３０％超、好ましくは２０％超、より好ましくは１０％超、特に好ましくは９％、８％、７％、６％又は５％超の溶解を誘導又は媒介しないことを意味する。これは、通常、５００ｎＭまでの抗体コンストラクトの濃度で当てはまる。当業者は、さらなる労力を伴わずに細胞溶解を測定する方法を知っている。さらに、本明細書では細胞溶解の測定方法の具体的な指示を教示する。
個々のＭＵＣ１７×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの単量体アイソフォームと二量体アイソフォームとの間の細胞傷害活性の差を「効力ギャップ」と称する。この効力ギャップは、例えば、その分子の単量体形態のＥＣ５０値と二量体形態のＥＣ５０値との間の比率として算出することができる。本発明のＭＵＣ１７×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの効力ギャップは、好ましくは、≦５、より好ましくは≦４、さらにより好ましくは≦３、さらにより好ましくは≦２及び最も好ましくは≦１である。
本発明の抗体コンストラクトの第１及び／又は第２の（又は任意のさらなる）結合ドメインは、好ましくは、霊長類の哺乳動物目のメンバーにおいて異種間特異的である。異種間特異的ＣＤ３結合ドメインは、例えば、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットに記載されている。一実施形態によれば、第１及び／又は第２の結合ドメインは、ヒトＭＵＣ１７及びヒトＣＤ３への結合に加えて、新世界霊長類（マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ Ｏｅｄｉｐｕｓ）又はリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）など）、旧世界霊長類（ヒヒ及びマカクなど）、テナガザル及び非ヒトのヒト亜科動物を含む（ただし、これらに限定されない）霊長類のＭＵＣ１７／ＣＤ３にもそれぞれ結合することになる。
本発明の抗体コンストラクトの一実施形態では、第１のドメインは、ヒトＭＵＣ１７に結合し、且つさらにカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＭＵＣ１７などのマカクＭＵＣ１７に結合し、より好ましくは、例えば、ＣＨＯ又は２９３細胞などの細胞の表面上に発現されるマカクＭＵＣ１７に結合する。ＭＵＣ１７、好ましくはヒトＭＵＣ１７に対する第１のドメインの親和性は、好ましくは、≦１００ｎＭ又は≦５０ｎＭ、より好ましくは≦２５ｎＭ又は≦２０ｎＭ、より好ましくは≦１５ｎＭ又は≦１０ｎＭ、さらにより好ましくは≦５ｎＭ、さらにより好ましくは≦２．５Ｍ又は≦２Ｍ、さらにより好ましくは≦１ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．６ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．５ｎＭ及び最も好ましくは≦０．４ｎＭである。親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ又はスキャッチャードアッセイにおいて測定され得る。親和性を決定する他の方法も当業者によく知られている。マカクＭＵＣ１７に対する第１のドメインの親和性は、好ましくは、≦１５ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、さらにより好ましくは≦５ｎＭ、さらにより好ましくは≦１ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．５ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．１ｎＭ及び最も好ましくは≦０．０５ｎＭ又はさらに≦０．０１ｎＭである。
好ましくは、本発明による抗体コンストラクトの（例えば、ＢｉａＣｏｒｅ又はスキャッチャード分析により決定される）マカクＭＵＣ１７対ヒトＭＵＣ１７［ｍａ ＭＵＣ１７：ｈｕ ＭＵＣ１７］の結合に関する親和性ギャップは、＜１００、好ましくは＜２０、より好ましくは＜１５、さらに好ましくは＜１０、さらにより好ましくは＜８、より好ましくは＜６及び最も好ましくは＜２である。本発明による抗体コンストラクトのマカクＭＵＣ１７対ヒトＭＵＣ１７の結合に関する親和性ギャップの好ましい範囲は、０．１〜２０、より好ましくは０．２〜１０、さらにより好ましくは０．３〜６、さらにより好ましくは０．５〜３又は０．５〜２．５及び最も好ましくは０．５〜２又は０．６〜２である。
本発明の抗体コンストラクトの第２のドメインは、ヒトＣＤ３イプシロン及び／又はマカクＣＤ３イプシロンに結合する。好ましい実施形態において、第２のドメインは、マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ Ｏｅｄｉｐｕｓ）又はリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）ＣＤ３イプシロンにさらに結合する。マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）及びワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ ｏｅｄｉｐｕｓ）は、両方ともマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｒｉｃｈｉｄａｅ）科に属する新世界霊長類であるが、リスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）は、オマキザル（Ｃｅｂｉｄａｅ）科に属する新世界霊長類である。
本発明の抗体コンストラクトに関して、ヒト及び／又はマカクＣＤ３イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合する第２の結合ドメインは、
（ａ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号２７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号２８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号２９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
（ｂ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１１７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１１８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１１９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；及び
（ｃ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３
から選択されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含むことが好ましい。
本発明の抗体コンストラクトのさらに好ましい実施形態において、ヒト及び／又はマカクＣＤ３イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合する第２のドメインは、
（ａ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｂ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号３０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号３１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号３２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｃ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号４８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号４９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号５０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号６６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号６７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号６８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｅ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号８４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号８５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号８６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｆ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１０２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１０３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１０４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｇ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｈ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１３８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１３９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１４０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；及び
（ｊ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３
から選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を含む。
本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態において、第２の結合ドメイン内でＶＬ ＣＤＲの上記３群をＶＨ ＣＤＲの上記１０群と組み合わせて、それぞれＣＤＲ−Ｌ１〜３及びＣＤＲ−Ｈ１〜３を含む（３０）群を形成する。
本発明の抗体コンストラクトに関して、ＣＤ３に結合する第２のドメインは、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７、２１、３５、３９、５３、５７、７１、７５、８９、９３、１０７、１１１、１２５、１２９、１４３、１４７、１６１、１６５、１７９若しくは１８３で示されるか又は本発明による配列番号１３に示されるものからなる群から選択されるＶＬ領域を含むことが好ましい。
ＣＤ３に結合する第２のドメインは、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５、１９、３３、３７、５１、５５、６９、７３、８７、９１、１０５、１０９、１２３、１２７、１４１、１４５、１５９、１６３、１７７若しくは１８１で示されるか又は配列番号１４に示されるものからなる群から選択されるＶＨ領域を含むことも好ましい。
より好ましくは、本発明の抗体コンストラクトは、
（ａ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７又は２１に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５又は１９に示されるＶＨ領域；
（ｂ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号３５又は３９に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号３３又は３７に示されるＶＨ領域；
（ｃ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号５３又は５７に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号５１又は５５に示されるＶＨ領域；
（ｄ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号７１又は７５に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号６９又は７３に示されるＶＨ領域；
（ｅ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号８９又は９３に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号８７又は９１に示されるＶＨ領域；
（ｆ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１０７又は１１１に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１０５又は１０９に示されるＶＨ領域；
（ｇ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２５又は１２９に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２３又は１２７に示されるＶＨ領域；
（ｈ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１４３又は１４７に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１４１又は１４５に示されるＶＨ領域；
（ｉ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１６１又は１６５に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５９又は１６３に示されるＶＨ領域；及び
（ｊ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７９又は１８３に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７７又は１８１に示されるＶＨ領域
からなる群から選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含むＤＣ３に結合する第２のドメインによって特徴付けられる。
また、本発明の抗体コンストラクトとの関係で好ましいのは、配列番号１３に示されるＶＬ領域及び配列番号１４に示されるＶＨ領域を含むＣＤ３に結合する第２のドメインである。
本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態によれば、第１の及び／又は第２のドメインは、以下の形式を有する：ＶＨ領域とＶＬ領域との対は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の形式である。ＶＨ及びＶＬ領域は、ＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＨの順に配置される。ＶＨ領域がリンカー配列のＮ末端に配置され、且つＶＬ領域がリンカー配列のＣ末端に配置されることが好ましい。
本発明の上記の抗体コンストラクトの好ましい実施形態は、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５若しくは１８７からなる群から選択されるアミノ酸配列又は配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤ３に結合する第２のドメインによって特徴付けられる。
本発明の抗体コンストラクトの第１の結合ドメインは、
（ａ）配列番号３６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号３３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｂ）配列番号４７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号４４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｃ）配列番号５８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号６０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号５７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号６９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号７０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号７１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号６６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号６８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｅ）配列番号８０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号８２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号７７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号７９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｆ）配列番号９１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号９３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号８８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号９０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｇ）配列番号１０２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１０３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１０４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号９９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１００に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１０１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｈ）配列番号１１３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１１５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号１１０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１１１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１１２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉ）配列番号１２４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１２６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号１２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１２３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｊ）配列番号１３５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１３７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号１３２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１３４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｋ）配列番号１４６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１４７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１４８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号１４３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１４４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１４５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｌ）配列番号１５７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１５９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号１５４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｍ）配列番号１６８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１７０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号１６５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１６７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｎ）配列番号１７９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１８０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１８１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号１７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１７８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｏ）配列番号１９０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１９１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１９２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号１８７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１８８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１８９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｐ）配列番号２０１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２０２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２０３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号１９８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１９９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２００に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｑ）配列番号２１２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２１３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２１４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号２０９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２１０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２１１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｒ）配列番号２２３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２２４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２２５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号２２０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｓ）配列番号２３４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２３５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２３６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号２３１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２３２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２３３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｔ）配列番号２４５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２４６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２４７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号２４２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２４３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２４４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｕ）配列番号２５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２５７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２５８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号２５３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２５４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｖ）配列番号２６７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２６８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２６９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号２６４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２６５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２６６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｗ）配列番号２７８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２７９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２８０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号２７５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｘ）配列番号２８９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２９０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２９１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号２８６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２８７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２８８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｙ）配列番号３００に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３０１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３０２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号２９７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２９８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２９９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｚ）配列番号３１１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３１２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３１３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号３０８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３０９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３１０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａａ）配列番号３２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３２３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３２４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号３１９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３２０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｂ）配列番号３３３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３３５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号３３０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３３１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３３２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｃ）配列番号３４４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３４５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３４６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号３４１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３４２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３４３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｄ）配列番号３５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３５７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号３５２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３５３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３５４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｅ）配列番号３６６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３６７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３６８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号３６３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３６４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３６５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｆ）配列番号３７７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３７８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３７９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号３７４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３７５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｇ）配列番号３８８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３９０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号３８５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３８６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｈ）配列番号３９９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４００に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４０１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号３９６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３９７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３９８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｉ）配列番号４１０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４１１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４１２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号４０７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４０８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４０９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｊ）配列番号４２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４２３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号４１８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４１９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４２０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｋ）配列番号４３２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４３３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４３４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号４２９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４３０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４３１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｌ）配列番号４４３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４４４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４４５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号４４０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４４２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｍ）配列番号４５４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号４５１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４５２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４５３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｎ）配列番号４６５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４６７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号４６２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４６３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４６４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｏ）配列番号４７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４７７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４７８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号４７３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４７４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４７５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｐ）配列番号４８７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４８８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４８９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号４８４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４８５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４８６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｑ）配列番号４９８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４９９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号５００に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号４９５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４９６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４９７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｒ）配列番号５０９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５１０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号５１１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号５０６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５０７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号５０８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；及び
（ａｓ）配列番号５２０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号５２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号５１７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５１８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号５１９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３
からなる群から選択されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域並びにＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を含み；例えば、
（ｃ）配列番号５８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号６０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号５７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ｎ）配列番号１７９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１８０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１８１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号１７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１７８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
（ａｃ）配列番号３４４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３４５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３４６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号３４１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３４２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３４３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；及び
（ａｊ）配列番号４２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４２３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３並びに配列番号４１８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４１９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４２０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３
が好ましいことも想定される。
本発明の抗体コンストラクトの第１の結合ドメインは、
（ａ）配列番号４０に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３９に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｂ）配列番号５１に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号５０に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｃ）配列番号６２に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号６１に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｄ）配列番号７３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号７２に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｅ）配列番号８４に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号８３に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｆ）配列番号９５に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号９４に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｇ）配列番号１０６に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１０５に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｈ）配列番号１１７に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１１６に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｉ）配列番号１２８に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１２７に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｊ）配列番号１３９に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１３８に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｋ）配列番号１５０に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１４９に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｌ）配列番号１６１に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１６０に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｍ）配列番号１７２に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１７１に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｎ）配列番号１８３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１８２に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｏ）配列番号１９４に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１９３に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｐ）配列番号２０５に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２０４に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｑ）配列番号２１６に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２１５に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｒ）配列番号２２７に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２２６に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｓ）配列番号２３８に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２３７に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｔ）配列番号２４９に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２４８に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｕ）配列番号２６０に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２５９に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｖ）配列番号２７１に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２７０に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｗ）配列番号２８２に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２８１に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｘ）配列番号２９３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２９２に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｙ）配列番号３０４に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３０３に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｚ）配列番号３１５に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３１４に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａａ）配列番号３２６に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３２５に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｂ）配列番号３３７に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３３６に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｃ）配列番号３４８に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３４７に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｄ）配列番号３５９に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３５８に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｅ）配列番号３７０に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３６９に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｆ）配列番号３８１に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３８０に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｇ）配列番号３９２に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３９１に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｈ）配列番号４０３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４０２に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｉ）配列番号４１４に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４１３に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｊ）配列番号４２５に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４２４に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｋ）配列番号４３６に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４３５に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｌ）配列番号４４７に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４４６に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｍ）配列番号４５８に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４５７に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｎ）配列番号４６９に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４６８に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｏ）配列番号４８０に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４７９に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｐ）配列番号４９１に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４９０に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｑ）配列番号５０２に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号５０１に示されるとおりのＶＨ領域；
（ａｒ）配列番号５１３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号５１２に示されるとおりのＶＨ領域；及び
（ａｓ）配列番号５２４に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号５２３に示されるとおりのＶＨ領域
からなる群から選択されるＶＨ領域及びＶＬ領域を含むことがさらに想定される。
本発明の抗体コンストラクトの第１の結合ドメインは、配列番号４１、５２、６３、７４、８５、９６、１０７、１１８、１２９、１４０、１５１、１６２、１７３、１８４、１９５、２０６、２１７、２２８、２３９、２５０、２６１、２７２、２８３、２９４、３０５、３１６、３２７、３３８、３４９、３６０、３７１、３８２、３９３、４０４、４１５、４２６、４３７、４４８、４５９、４７０、４８１、４９２、５０３、５１４及び５２５に示されるものからなる群から選択されるか又は前記配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含むことがさらに想定される。
本発明は、配列番号４２、４３、５３、５４、６４、６５、７５、７６、８６、８７、９７、９８、１０８、１０９、１１９、１２０、１３０、１３１、１４１、１４２、１５２、１５３、１６３、１６４、１７４、１７５、１８５、１８６、１９６、１９７、２０７、２０８、２１８、２１９、２２９、２３０、２４０、２４１、２５１、２５２、２６２、２６３、２７３、２７４、２８４、２８５、２９５、２９６、３０６、３０７、３１７、３１８、３２８、３２９、３３９、３４０、３５０、３５１、３６１、３６２、３７２、３７３、３８３、３８４、３９４、３９５、４０５、４０６、４１６、４１７、４２７、４２８、４３８、４３９、４４９、４５０、４６０、４６１、４７１、４７２、４８２、４８３、４９３、４９４、５０４、５０５、５１５、５１６、５２６及び５２７からなる群から選択されるか又は前記配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するアミノ酸配列（完全二重特異性抗体コンストラクト）を含むか又は有する抗体コンストラクトをさらに提供する。
抗体コンストラクトの共有結合的修飾も本発明の範囲内に含まれ、これは、常にではないものの通常、翻訳後に行われる。例えば、抗体コンストラクトのいくつかの種類の共有結合的修飾は、抗体コンストラクトの特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖又はＮ末端若しくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって分子内に導入される。
システイニル残基は、最も一般的には、α−ハロアセテート（及び対応するアミン）、例えばクロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応して、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化され、なぜなら、この薬剤は、ヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるためである。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり、この反応は、好ましくは、ｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。リシニル及びアミノ末端残基は、コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応する。これらの薬剤による誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬としては、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル；リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。
アルギニル残基は、１つ又は複数の従来型の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンとの反応により修飾される。グアニジン官能基のｐＫａが高いため、アルギニン残基の誘導体化は、反応をアルカリ条件下で実施する必要がある。さらに、これらの試薬は、リジンの基及びアルギニンイプシロン−アミノ基と反応し得る。
チロシル残基の特異的修飾は、特に芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の導入を目的として行われる場合がある。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成する。１２５Ｉ又は１３１Ｉを用いてチロシル残基をヨウ素化して、ラジオイムノアッセイに使用される標識タンパク質を調製する、上記のクロラミンＴ法が好適である。
カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾され、ここで、Ｒ及びＲ’は、任意選択的に異なるアルキル基、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらに、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換される。
二官能性物質による誘導体化は、本発明の抗体コンストラクトを、様々な方法に使用するための非水溶性の支持マトリックス又は支持表面に架橋するのに有用である。一般的に使用される架橋剤として、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、例えば４−アジドサリチル酸とのエステルなどのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤により、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化され得る中間体が得られる。代わりに、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性非水溶性マトリックス並びに米国特許第３，９６９，２８７号明細書；同第３，６９１，０１６号明細書；同第４，１９５，１２８号明細書；同第４，２４７，６４２号明細書；同第４，２２９，５３７号明細書；及び同第４，３３０，４４０号明細書に記載されている反応性基材がタンパク質の固定化に使用される。
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、多くの場合、脱アミド化されて、それぞれ対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基になる。代わりに、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に含まれる。
他の修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３，ｐｐ．７９−８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化並びに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
本発明の範囲内に含まれる抗体コンストラクトの別の種類の共有結合的修飾は、タンパク質のグリコシル化パターンの変更を含む。当技術分野で知られるとおり、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下で論じる特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在又は非存在）又はそのタンパク質を産生する宿主細胞若しくは生物体の両方に依存し得る。個々の発現系について以下で論じる。
ポリペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ結合又はＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、糖鎖のアスパラギン残基側鎖への結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖鎖の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生成する。Ｏ結合型グリコシル化は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの１つの糖のヒドロキシアミノ酸への付加を指し、最も一般的にはセリン又はスレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンが使用される場合もある。
抗体コンストラクトへのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ結合型グリコシル化部位のための）上記のトリペプチド配列の１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することにより行うと好都合である。改変は、１つ以上のセリン若しくはトレオニン残基の開始配列への付加又はそれによる置換によってもなされ得る（Ｏ結合グリコシル化部位の場合）。簡潔には、抗体コンストラクトのアミノ酸配列を、ＤＮＡレベルでの変更、特に所望のアミノ酸に翻訳されることになるコドンが生じるようにポリペプチドをコードするＤＮＡを、事前に選択した塩基で変異させることによって改変することが好ましい。
抗体コンストラクト上の糖鎖の数を増加させる別の手段は、そのタンパク質へのグリコシドの化学的又は酵素的結合による。これらの手順は、Ｎ結合型及びＯ結合型グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としない点で有利である。使用される結合様式に応じて、糖は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン若しくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン若しくはトリプトファンのものなどの芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に付加され得る。これらの方法は、国際公開第８７／０５３３０号パンフレット及びＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６に記載されている。
出発抗体コンストラクト上に存在する糖鎖の除去は、化学的又は酵素的に行われ得る。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸又は均等な化合物へのタンパク質の曝露が必要となる。この処理により、ポリペプチドは無傷な状態のままで、結合している糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんど又は全ての糖が切断される。化学的脱グリコシル化については、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２及びＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によって記載される。ポリペプチド上の糖鎖の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって記載されるとおりの様々なエンド−及びエキソ−グリコシダーゼの使用によって達成され得る。潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５によって記載されるとおりの化合物ツニカマイシンの使用により妨げられ得る。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を阻止する。
本明細書では、抗体コンストラクトの他の修飾も企図される。例えば、抗体コンストラクトの別の種類の共有結合的修飾は、様々な非タンパク質性ポリマーへの抗体コンストラクトの連結を含み、ポリマーとしては、米国特許第４，６４０，８３５号明細書；同第４，４９６，６８９号明細書；同第４，３０１，１４４号明細書；同第４，６７０，４１７号明細書；同第４，７９１，１９２号明細書又は同第４，１７９，３３７号明細書に示される様式の様々なポリオール、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むが、これらに限定されない。加えて、当技術分野で知られるとおり、例えば、ＰＥＧなどのポリマーの付加を容易にするために抗体コンストラクト内の様々な位置でアミノ酸置換がなされ得る。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体コンストラクトの共有結合的修飾は、１つ以上の標識の付加を含む。潜在的な立体障害を低減するために、様々な長さのスペーサーアームを介して標識基が抗体コンストラクトに結合され得る。タンパク質を標識するための様々な方法が当技術分野で知られており、本発明を実施する際に使用することができる。用語「標識」又は「標識基」は、任意の検出可能な標識を指す。一般に、標識は、標識を検出しようとするアッセイに応じて様々なクラスに分類され、以下の例が挙げられるが、これらに限定されない：
ａ）放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）などの放射性同位体又は重同位体であり得る同位体標識
ｂ）磁気標識（例えば、磁気粒子）
ｃ）酸化還元活性部分
ｄ）蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、化学発光基及び「低分子」蛍光体又はタンパク質性蛍光体のいずれかであり得るフルオロフォアなどの光学色素（発色団、蛍光体及びフルオロフォアを含むが、これらに限定されない）
ｅ）酵素群（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）
ｆ）ビオチン化基
ｇ）二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）。
「蛍光標識」は、その固有の蛍光特性によって検出され得る任意の分子を意味する。好適な蛍光標識としては、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０）、カスケードブルー、カスケードイエロー及びＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ＦＩＴＣ、ローダミン及びテキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。フルオロフォアを含む好適な光学色素は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄに記載されている。
好適なタンパク質性蛍光標識としては、Ｒｅｎｉｌｌａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ又はＡｅｑｕｏｒｅａ種のＧＦＰ（Ｃｈａｌｆｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２−８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ５５７６２）を含む緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ，Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．１８０１ ｄｅ Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ Ｂｌｖｄ．Ｗｅｓｔ，８ｔｈ Ｆｌｏｏｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ Ｈ３Ｈ １Ｊ９；Ｓｔａｕｂｅｒ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：４６２−４７１；Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８−５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３−２６０７）及びＲｅｎｉｌｌａ（国際公開第９２／１５６７３号パンフレット、国際公開第９５／０７４６３号パンフレット、国際公開第９８／１４６０５号パンフレット、国際公開第９８／２６２７７号パンフレット、国際公開第９９／４９０１９号パンフレット、米国特許第５，２９２，６５８号明細書；同第５，４１８，１５５号明細書；同第５，６８３，８８８号明細書；同第５，７４１，６６８号明細書；同第５，７７７，０７９号明細書；同第５，８０４，３８７号明細書；同第５，８７４，３０４号明細書；同第５，８７６，９９５号明細書；同第５，９２５，５５８号明細書）も挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の抗体コンストラクトは、例えば、その分子の単離に役立つか又はその分子の薬物動態プロファイルの適合に関連する追加ドメインも含み得る。抗体コンストラクトの単離に役立つドメインは、単離方法、例えば単離用カラムで捕捉できるペプチドモチーフ又は二次的に導入される部分から選択され得る。このような追加ドメインの非限定的な実施形態は、Ｍｙｃタグ、ＨＡＴタグ、ＨＡタグ、ＴＡＰタグ、ＧＳＴタグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰタグ）、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ及びその変種（例えば、ＳｔｒｅｐＩＩタグ）並びにＨｉｓタグとして知られるペプチドモチーフを含む。本明細書で開示される抗体コンストラクトの全ては、分子のアミノ酸配列中の連続するＨｉｓ残基、好ましくは５つ、より好ましくは６つのＨｉｓ残基（ヘキサヒスチジン）のリピートとして一般に知られるＨｉｓタグドメインを含み得る。Ｈｉｓタグは、例えば、抗体コンストラクトのＮ末端にもＣ末端にも配置され得るが、Ｃ末端に配置されることが好ましい。最も好ましくは、ヘキサヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１６）を、ペプチド結合を介して本発明による抗体コンストラクトのＣ末端に結合する。加えて、持続放出用途及び薬物動態プロファイルの向上のために、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡのコンジュゲート系をポリヒスチジンタグと組み合わせ得る。
本明細書に記載される抗体コンストラクトのアミノ酸配列改変も企図される。例えば、抗体コンストラクトの結合親和性及び／又は他の生物学的特性の向上が望ましい場合がある。抗体コンストラクトのアミノ酸配列バリアントは、抗体コンストラクトの核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって又はペプチド合成によって作製される。以下に記載されるアミノ酸配列改変の全ては、未改変の親分子の所望の生物活性（ＭＵＣ１７及びＣＤ３への結合）を引き続き保持する抗体コンストラクトをもたらすはずである。
用語「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」は、通常、その技術分野で認められている定義を有するアミノ酸、例えばアラニン（Ａｌａ又はＡ）；アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）；アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）；システイン（Ｃｙｓ又はＣ）；グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）；グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）；イソロイシン（Ｈｅ又はＩ）；ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）；リジン（Ｌｙｓ又はＫ）；メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）；プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）；セリン（Ｓｅｒ又はＳ）；スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）；トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）；チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）；及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）からなる群から選択されるアミノ酸を指すが、必要に応じて修飾アミノ酸、合成アミノ酸又は希少アミノ酸を使用し得る。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）；負電荷側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；正電荷側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；又は無電荷極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ及びＴｙｒ）の存在によって分類することができる。
アミノ酸改変は、例えば、抗体コンストラクトのアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は残基への挿入、及び／又は残基の置換を含む。欠失、挿入及び置換のいずれかの組合せは、最終コンストラクトが所望の特徴を有するなら、その最終コンストラクトに到達するようになされる。アミノ酸の変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化などの抗体コンストラクトの翻訳後プロセスも変え得る。
例えば、１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸がＣＤＲの各々において（当然のことながら、それらの長さに依存する）挿入、置換又は欠失され得る一方、ＦＲの各々において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２５個のアミノ酸が挿入、置換又は欠失され得る。好ましくは、抗体コンストラクトへのアミノ酸配列の挿入は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０残基から、１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端融合及び／又はカルボキシル末端融合並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。対応する改変を本発明の抗体コンストラクトの第３のドメイン内で実施し得る。本発明の抗体コンストラクトの挿入バリアントは、抗体コンストラクトのＮ末端若しくはＣ末端への酵素の融合又はポリペプチドへの融合を含む。
置換変異誘発にとって最も重要な部位としては、重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ、特に超可変領域が挙げられるが（これらに限定されるものではない）、重鎖及び／又は軽鎖におけるＦＲの改変も企図される。置換は、本明細書に記載される保存的置換であることが好ましい。好ましくは、ＣＤＲ又はＦＲの長さに応じて、ＣＤＲでは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸を置換し得る一方、フレームワーク領域（ＦＲ）では１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２５個のアミノ酸を置換し得る。例えば、ＣＤＲ配列が６個のアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸の１、２又は３個が置換されることが想定される。同様に、ＣＤＲ配列が１５個のアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸の１、２、３、４、５又は６個が置換されることが想定される。
変異誘発について好ましい位置である抗体コンストラクトの特定の残基又は領域を同定する有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）に記載されるとおり「アラニンスキャニング変異導入法」と呼ばれる。この方法では、抗体コンストラクト内の残基又は標的残基群を同定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）、アミノ酸とエピトープとの相互作用に影響を与える中性又は負電荷アミノ酸（最も好ましくは、アラニン又はポリアラニン）で置き換えられる。
次に、さらなるバリアント又は他のバリアントを置換部位に、すなわち置換部位の代わりに導入することにより、置換に対して機能的感受性を示すそれらのアミノ酸位置を厳選する。このように、アミノ酸配列変種を導入する部位又は領域は、予め決定されるが、変異の性質自体を予め決定する必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を分析又は最適化するために、アラニンスキャニング又はランダム変異誘発が標的コドン又は標的領域で実施される場合があり、発現される抗体コンストラクトのバリアントは、所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングされる。既知の配列を有するＤＮＡ内の所定部位に置換変異を行う技術は、よく知られており、例えばＭ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発がある。変異体のスクリーニングは、ＭＵＣ１７又はＣＤ３結合などの抗原結合活性のアッセイを使用して行われる。
一般に、重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲの１つ以上又は全てにおいてアミノ酸が置換される場合、それによって得られる「置換された」配列は、「当初の」ＣＤＲ配列と少なくとも６０％又は６５％、より好ましくは７０％又は７５％、さらにより好ましくは８０％又は８５％及び特に好ましくは９０％又は９５％同一であることが好ましい。これは、それが「置換された」配列とどの程度同一であるかがＣＤＲの長さに依存することを意味する。例えば、５個のアミノ酸を有するＣＤＲは、少なくとも１個の置換されたアミノ酸を有するために、その置換された配列と８０％同一であることが好ましい。したがって、抗体コンストラクトのＣＤＲは、それらの置換配列に対して異なる程度の同一性を有する場合があり、例えばＣＤＲＬ１が８０％を有する場合がある一方、ＣＤＲＬ３が９０％を有する場合がある。
好ましい置換（又は置き換え）は、保存的置換である。しかしながら、抗体コンストラクトが、第１の結合ドメインを介してＭＵＣ１７に結合し、第２の結合ドメインを介してＣＤ３イプシロンに結合する能力を保持する限り、且つ／又はそのＣＤＲが置換後の配列に対して同一性を有している（「当初の」ＣＤＲ配列に対して少なくとも６０％又は６５％、より好ましくは７０％又は７５％、さらにより好ましくは８０％又は８５％及び特に好ましくは９０％又は９５％同一である）限り、（非保存的置換又は以下の表３に列挙される「例示的な置換」の１つ以上を含む）任意の置換が想定される。
保存的置換を表３の「好ましい置換」の見出しの下に示す。このような置換が生物活性を変化させる場合、表３において「例示的な置換」と称されるか、又はアミノ酸クラスに関連して以下でさらに記載する、より実質的な変更を導入し、所望の特徴について産物をスクリーニングし得る。
本発明の抗体コンストラクトの生物学的特性における実質的な改変は、（ａ）例えばシート状若しくはらせん状の立体構造としての置換領域のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩高さの維持に対する影響が著しく異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下の群に分類される：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性；ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖の配向性に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うことになる。抗体コンストラクトの適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基を一般的にはセリンで置換することで分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を回避し得る。逆に、抗体にシステイン結合を付加することで、（特に抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）その安定性を向上させ得る。
アミノ酸配列に関して、配列同一性及び／又は類似性は、当技術分野で知られる標準的な技術、例えば、限定されないが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の部分配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｉｓのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５により記載されている、好ましくはデフォルト設定を用いたＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムを使用することにより又は目視により決定される。好ましくは、同一性パーセントは、以下のパラメータに基づいてＦａｓｔＤＢによって算出される：ミスマッチペナルティが１；ギャップペナルティが１；ギャップサイズペナルティが０．３３；及び結合ペナルティが３０、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ １２７−１４９（１９８８），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ。
有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ法によるペアワイズアラインメントを使用して関連配列群から多重配列アラインメントを生成する。これにより、アラインメントの生成に使用されたクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０のプログレッシブアラインメント法の簡易版を使用する。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３により記載されたものと同様である。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、３．００のデフォルトのギャップ加重、０．１０のデフォルトのギャップ長加重及び加重エンドギャップを含む。
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；及びＫａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５７８７において記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０から入手したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメータを使用しており、その大部分がデフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは、以下の値に設定する：重複範囲＝１、重複割合＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝ＩＩ。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメータは、動的な値であり、個々の配列の構成及び目的配列が検索されている特定のデータベースの構成に応じてプログラム自体によって設定されるが、感度を上げるために値を調整し得る。
他の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に報告されるとおりのギャップありＢＬＡＳＴである。ギャップありＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコアを使用し、閾値Ｔパラメータは、９に設定され、ギャップなし伸長をもたらすｔｗｏ−ｈｉｔ法は、ギャップ長ｋのコストを１０＋ｋとし、Ｘｕは、１６に設定され、Ｘｇは、データベース検索段階では４０に、アルゴリズムの出力段階では６７に設定される。ギャップありアラインメントは、約２２ビットに対応するスコアによってもたらされる。
一般に、個々のバリアントＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬ配列間のアミノ酸相同性、類似性又は同一性は、本明細書に示される配列に対して少なくとも６０％であり、より典型的には相同性又は同一性が少なくとも６５％又は７０％、より好ましくは少なくとも７５％又は８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及びほぼ１００％に増加することが好ましい。同様に、本明細書で特定される結合タンパク質の核酸配列に関する「核酸配列同一性パーセント（％）」は、抗体コンストラクトのコード配列内のヌクレオチド残基と同一である候補配列内のヌクレオチド残基の割合と定義される。具体的な方法では、重複範囲及び重複割合がそれぞれ１及び０．１２５を有するデフォルトパラメータに設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。
一般に、個々のバリアントＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬ配列をコードするヌクレオチド配列と本明細書に示されるヌクレオチド配列との間の核酸配列相同性、類似性又は同一性は、少なくとも６０％であり、より典型的には相同性又は同一性が少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％及びほぼ１００％に増加することが好ましい。したがって、「バリアントＣＤＲ」又は「バリアントＶＨ／ＶＬ領域」は、本発明の親ＣＤＲ／ＶＨ／ＶＬに対して特定の相同性、類似性又は同一性を有するものであり、且つ親ＣＤＲ若しくはＶＨ／ＶＬの特異性及び／又は活性の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を含むが、これらに限定されない生物学的機能を共有している。
一実施形態では、本発明による抗体コンストラクトのヒト生殖細胞系列に対する同一性の割合は、≧７０％又は≧７５％、より好ましくは≧８０％又は≧８５％、さらにより好ましくは≧９０％及び最も好ましくは≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％又はさらに≧９６％である。ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子産物に対する同一性は、治療用タンパク質が治療中の患者の薬物に対する免疫反応を誘発するリスクを低減するための重要な特徴であると考えられる。Ｈｗａｎｇ＆Ｆｏｏｔｅ（「Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」；Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）３−１０）は、薬物抗体コンストラクトの非ヒト部分の減少が治療中の患者における抗薬物抗体の誘発リスクの低減をもたらすことを実証している。膨大な数の臨床評価済み抗体薬物及び対応する免疫原性データを比較することにより、抗体のＶ領域のヒト化は、未改変の非ヒトＶ領域を保有する抗体（患者の平均２３．５９％）よりもタンパク質の免疫原性が少ない（患者の平均５．１％）という傾向を示している。したがって、Ｖ領域をベースにした抗体コンストラクトの形態でのタンパク質治療薬に関して、ヒト配列に対する同一性が高いことが望ましい。この生殖細胞系列同一性の決定のために、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェアを用いて、ＶＬのＶ領域をヒト生殖細胞系列Ｖセグメント及びＪセグメントのアミノ酸配列（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）とアラインメントし、同一のアミノ酸残基数をＶＬの総アミノ酸残基数で割ることによりアミノ酸配列をパーセントで算出することができる。ＶＨセグメント（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）についても同様の方法が可能であるが、例外として、ＶＨ ＣＤＲ３は、多様性が高く、既存のヒト生殖細胞系列ＶＨ ＣＤＲ３のアラインメントパートナーを欠くために除外され得る。続いて、組換え技術を使用して、ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子に対する配列同一性を増大させることができる。
さらなる実施形態では、本発明の二重特異性抗体コンストラクトは、標準的な研究規模の条件下において、例えば標準的な二段階精製プロセスで高い単量体収量を示す。好ましくは、本発明による抗体コンストラクトの単量体収量は、≧０．２５ｍｇ／Ｌ上清、より好ましくは≧０．５ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは≧１ｍｇ／Ｌ及び最も好ましくは≧３ｍｇ／Ｌ上清である。
同様に、抗体コンストラクトの二量体抗体コンストラクトアイソフォームの収量及びそのため単量体の割合（すなわち単量体：（単量体＋二量体））が決定され得る。単量体及び二量体抗体コンストラクトの生産性並びに算出される単量体の割合は、例えば、ローラーボトル中における標準化された研究規模の製造に由来する培養上清のＳＥＣ精製工程で取得することができる。一実施形態では、抗体コンストラクトの単量体の割合は、≧８０％、より好ましくは≧８５％、さらにより好ましくは≧９０％及び最も好ましくは≧９５％である。
一実施形態では、抗体コンストラクトは、好ましくは、≦５又は≦４、より好ましくは≦３．５又は≦３、さらにより好ましくは≦２．５又は≦２及び最も好ましくは≦１．５又は≦１の血漿安定性（血漿非存在下でのＥＣ５０に対する血漿存在下でのＥＣ５０の比率）を有する。抗体コンストラクトの血漿安定性は、コンストラクトをヒト血漿中、３７℃で２４時間インキュベートし、続いて５１クロム放出細胞傷害性アッセイにおいてＥＣ５０を決定することにより試験することができる。細胞傷害性アッセイにおけるエフェクター細胞は、刺激された濃縮ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞であり得る。標的細胞は、例えば、ヒトＭＵＣ１７でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞であり得る。エフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、１０：１又は５：１として選択され得る。この目的で使用されるヒト血漿プールは、ＥＤＴＡコーティングされたシリンジによって回収された健常ドナーの血液に由来する。細胞成分を遠心分離により除去して、上部血漿相を回収し、その後、プールする。対照として、抗体コンストラクトを細胞傷害性アッセイの直前にＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈する。血漿安定性は、ＥＣ５０（対照）に対するＥＣ５０（血漿インキュベーション後）の比率として算出される。
本発明の抗体コンストラクトの単量体から二量体への変換率は、低いことがさらに好ましい。変換率は、異なる条件下で測定し、高速サイズ排除クロマトグラフィーによって分析することができる。例えば、抗体コンストラクトの単量体アイソフォームのインキュベーションは、インキュベーター内で例えば１００μｇ／ｍｌ又は２５０μｇ／ｍｌの濃度において３７℃で７日間行われ得る。これらの条件下において、本発明の抗体コンストラクトは、≦５％、より好ましくは≦４％、さらにより好ましくは≦３％、さらにより好ましくは≦２．５％、さらにより好ましくは≦２％、さらにより好ましくは≦１．５％及び最も好ましくは≦１％又は≦０．５％又はさらに０％の二量体の割合を示すことが好ましい。
本発明の二重特異性抗体コンストラクトは、数回の凍結／解凍サイクル後、非常に低い二量体変換率を示すことも好ましい。例えば、抗体コンストラクトの単量体を例えば汎用の製剤緩衝液中、２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、３回の凍結／解凍サイクル（−８０℃で３０分間の凍結後、室温で３０分間の解凍）にかけた後、高速ＳＥＣを行い、二量体抗体コンストラクトに変換された初期単量体抗体コンストラクトの割合を決定する。好ましくは、二重特異性抗体コンストラクトの二量体の割合は、例えば、３回の凍結／解凍サイクル後に≦５％、より好ましくは≦４％、さらにより好ましくは≦３％、さらにより好ましくは≦２．５％、さらにより好ましくは≦２％、さらにより好ましくは≦１．５％及び最も好ましくは≦１％又はさらに≦０．５％である。
本発明の二重特異性抗体コンストラクトは、好ましくは、≧４５℃又は≧５０℃、より好ましくは≧５２℃又は≧５４℃、さらにより好ましくは≧５６℃又は≧５７℃及び最も好ましくは≧５８℃又は≧５９℃の凝集温度で良好な熱安定性を示す。抗体の凝集温度の観点から熱安定性パラメータを以下のように決定することができる：濃度２５０μｇ／ｍｌの抗体溶液を単回使用のキュベットに移し、動的光散乱（ＤＬＳ）装置内に置く。測定半径を常時取得しながら、０．５℃／分の加熱速度で４０℃から７０℃まで試料を加熱する。タンパク質の融解及び凝集を示す半径の増大を使用して、抗体の凝集温度を算出する。
代わりに、融解温度曲線を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により決定して、抗体コンストラクトの固有の生物物理学的タンパク質安定性を決定することができる。これらの実験を、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＬＬＣ（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ）ＶＰ−ＤＳＣ装置を使用して実施する。抗体コンストラクトを含有する試料のエネルギー取り込みを２０℃から９０℃まで記録して、製剤緩衝液のみを含有する試料と比較する。抗体コンストラクトを例えばＳＥＣランニング緩衝液中において最終濃度２５０μｇ／ｍｌに調整する。それぞれの融解曲線を記録するために試料の全体温度を段階的に上昇させる。各温度Ｔでの試料及び製剤緩衝液標準物質のエネルギー取り込みを記録する。試料から標準物質を差し引いたエネルギー取り込みＣｐ（ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ／℃）の差をそれぞれの温度に対してプロットする。融解温度は、エネルギー取り込みが最初に最大となる温度と定義される。
本発明のＭＵＣ１７×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトは、≦０．２、好ましくは≦０．１５、より好ましくは≦０．１２、さらにより好ましくは≦０．１及び最も好ましくは≦０．０８の混濁度（精製された単量体抗体コンストラクトを２．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、一晩インキュベートした後、ＯＤ３４０により測定される）を有するとも想定される。
さらなる実施形態では、本発明による抗体コンストラクトは、生理的なｐＨ又はそれよりわずかに低いｐＨ、すなわち約ｐＨ７．４〜６．０で安定である。非生理的ｐＨ、例えば約ｐＨ６．０で抗体コンストラクトが示す耐性が高いほど、充填されたタンパク質の総量に対するイオン交換カラムから溶出される抗体コンストラクトの回収率が高くなる。約ｐＨ６．０でのイオン（例えば、陽イオン）交換カラムからの抗体コンストラクトの回収率は、好ましくは、≧３０％、より好ましくは≧４０％、より好ましくは≧５０％、さらにより好ましくは≧６０％、さらにより好ましくは≧７０％、さらにより好ましくは≧８０％、さらにより好ましくは≧９０％、さらにより好ましくは≧９５％及び最も好ましくは≧９９％である。
本発明の二重特異性抗体コンストラクトは、治療有効性又は抗腫瘍活性を示すことがさらに想定される。これは、例えば、以下の進行期のヒト腫瘍異種移植モデルの一般化された実施例に開示される試験において評価することができる。
試験の１日目に、５×１０６個の細胞のヒト標的細胞抗原（本明細書ではＭＵＣ１７）陽性癌細胞株が雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右背側側腹部に皮下注射される。平均腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達するとき、インビトロで増殖されたヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞が動物の腹膜腔への約２×１０７個の細胞の注射によってマウスに移植される。溶媒対照群１のマウスは、エフェクター細胞を受容せず、且つ溶媒対照群２（エフェクター細胞を受容する）との比較のための非移植対照として使用されて、腫瘍増殖に対するＴ細胞単独の影響がモニターされる。平均腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達するときに抗体治療が始まる。治療開始日の各治療群の平均腫瘍サイズは、いずれの他の群とも統計的に異なるべきではない（分散分析）。マウスは、静脈内ボーラス注射によって約１５〜２０日間、０．５ｍｇ／ｋｇ／日のＭＵＣ１７×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトで治療される。腫瘍は、試験中にキャリパーによって測定され、進行は、腫瘍体積（ＴＶ）の群間比較によって評価される。腫瘍増殖阻害Ｔ／Ｃ［％］は、Ｔ／Ｃ％＝１００×（分析群の中央値ＴＶ）／（対照群２の中央値ＴＶ）としてＴＶを計算することによって決定される。
当業者は、この試験の特定のパラメータ、例えば注射する腫瘍細胞の数、注射部位、移植するヒトＴ細胞の数、投与する二重特異性抗体コンストラクトの量及び予定表を変更又は適合させながらも、有意義で再現性のある結果を得る方法を知っている。好ましくは、腫瘍増殖抑制Ｔ／Ｃ［％］は、≦７０若しくは≦６０、より好ましくは≦５０若しくは≦４０、さらにより好ましくは≦３０若しくは≦２０及び最も好ましくは≦１０若しくは≦５又はさらに≦２．５である。腫瘍増殖阻害は、１００％に近いことが好ましい。
本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態では、抗体コンストラクトは、一本鎖抗体コンストラクトである。
また、本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態では、前記第３のドメインは、アミノからカルボキシルの順に、
ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３
を含む。
本発明の一実施形態では、第３のドメインの前記ポリペプチド単量体の各々は、配列番号１７〜２４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態又は本発明では、前記ポリペプチド単量体の各々は、配列番号１７〜２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
また、本発明の一実施形態では、第３のドメインの１つ又は好ましくは各々（両方）のポリペプチド単量体のＣＨ２ドメインは、ドメイン内システインジスルフィド架橋を含む。当技術分野で知られるとおり、用語「システインジスルフィド架橋」は、一般構造Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒを有する官能基を指す。この連結は、ＳＳ結合又はジスルフィド架橋とも呼ばれ、システイン残基の２つのチオール基のカップリングによって得られる。本発明の抗体コンストラクトに関して、成熟抗体コンストラクト内でシステインジスルフィド架橋を形成するシステインは、３０９及び３２１（Ｋａｂａｔ付番）に対応するＣＨ２ドメインのアミノ酸配列に導入されることが特に好ましい。
本発明の一実施形態では、ＣＨ２ドメインのＫａｂａｔ位置３１４のグリコシル化部位が除去される。このグリコシル化部位の除去は、Ｎ３１４Ｘ置換によって達成されることが好ましく、ここで、Ｘは、Ｑではない任意のアミノ酸である。前記置換は、好ましくは、Ｎ３１４Ｇである。より好ましい実施形態では、前記ＣＨ２ドメインは、以下の置換（位置は、Ｋａｂａｔに従う）Ｖ３２１Ｃ及びＲ３０９Ｃ（これらの置換は、Ｋａｂａｔ位置３０９及び３２１でドメイン内システインジスルフィド架橋を導入する）をさらに含む。
例えば、当技術分野で知られる二重特異性ヘテロＦｃ抗体コンストラクト（図１ｂ）と比較した本発明の抗体コンストラクトの好ましい特徴は、とりわけ、ＣＨ２ドメインにおける上記の改変の導入に関連し得ると考えられる。したがって、本発明のコンストラクトに関して、本発明の抗体コンストラクトの第３のドメイン内のＣＨ２ドメインがＫａｂａｔ位置３０９及び３２１にドメイン内システインジスルフィド架橋を含み、且つ／又はＫａｂａｔ位置３１４のグリコシル化部位が好ましくはＮ３１４Ｇ置換により除去されることが好ましい。
本発明のさらに好ましい実施形態では、本発明の抗体コンストラクトの第３のドメイン内のＣＨ２ドメインは、Ｋａｂａｔ位置３０９及び３２１にドメイン内システインジスルフィド架橋を含み、且つＫａｂａｔ位３１４のグリコシル化部位がＮ３１４Ｇ置換によって除去される。最も好ましくは、本発明の抗体コンストラクトの第３のドメインのポリペプチド単量体は、配列番号１７及び１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明は、抗体コンストラクトであって、
（ｉ）第１のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含むか；
（ｉｉ）第１のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含むか；
（ｉｉｉ）第１のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含むか；又は
（ｉｖ）第１のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含む、抗体コンストラクトを提供する。
したがって、第１及び第２のドメインは、ＶＨ及びＶＬドメインなどのそれぞれ２つの抗体可変ドメインを含む結合ドメインであり得る。本明細書で上記される２つの抗体可変ドメインを含むこのような結合ドメインの例は、例えば、本明細書で上記されるＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント又はＦａｂフラグメントを含む。代わりに、それらの結合ドメインのいずれか一方又は両方は、単一の可変ドメインのみを含み得る。本明細書で上記されるこのような単一ドメイン結合ドメインの例は、例えば、他のＶ領域又はドメインに非依存的に抗原又はエピトープに特異的に結合するＶＨＨ、ＶＨ又はＶＬであり得る１つのみの可変ドメインを含むナノボディ又は単一可変ドメイン抗体を含む。
本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態では、第１及び第２のドメインは、ペプチドリンカーを介して第３のドメインに融合される。好ましいペプチドリンカーは、本明細書で上記されており、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１）又はそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘによって特徴付けられ、ここで、ｘは、１又はそれより大きい整数（例えば、２又は３）である。第３のドメインに対する第１のドメイン及び第２のドメインの融合において特に好ましいリンカーは、配列番号１に示される。
好ましい実施形態では、本発明の抗体コンストラクトは、アミノからカルボキシルの順に、
（ａ）第１のドメイン；
（ｂ）配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｃ）第２のドメイン；
（ｄ）配列番号１、２、３、９、１０、１１及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｅ）第３のドメインの第１のポリペプチド単量体；
（ｆ）配列番号５、６、７及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；及び
（ｇ）第３のドメインの第２のポリペプチド単量体
を含むことで特徴付けられる。
本発明の抗体コンストラクトは、ＭＵＣ１７、好ましくはＭＵＣ１７の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合する第１のドメインを含む。本発明に関連して、用語「ＭＵＣ１７の細胞外ドメインに結合する」は、結合ドメインが、標的細胞の表面で発現されるＭＵＣ１７に結合することを意味することが理解される。したがって、本発明による第１のドメインは、ＭＵＣ１７が、自然に発現する細胞若しくは細胞株により、且つ／又はＭＵＣ１７で形質転換若しくは（安定的に又は一過的に）トランスフェクトされた細胞若しくは細胞株によって発現されるとき、ＭＵＣ１７に結合することが好ましい。好ましい実施形態では、第１の結合ドメインは、ＭＵＣ１７がＢＩＡｃｏｒｅ又はスキャッチャードなどのインビトロ結合アッセイにおける「標的」又は「リガンド」分子として使用されるとき、ＭＵＣ１７にも結合する。「標的細胞」は、その表面でＭＵＣ１７を発現する任意の原核細胞又は真核細胞であり得；好ましくは、標的細胞は、特定のＭＵＣ１７発現癌又は腫瘍細胞などのヒト又は動物の体の一部である細胞である。
好ましくは、第１の結合ドメインは、ヒトＭＵＣ１７／ＭＵＣ１７ ＥＣＤに結合する。さらに好ましい実施形態では、それは、マカクＭＵＣ１７／ＭＵＣ１７ ＥＣＤに結合する。最も好ましい実施形態によれば、それは、ヒト及びマカクＭＵＣ１７／ＭＵＣ１７ ＥＣＤの両方に結合する。「ＭＵＣ１７細胞外ドメイン」又は「ＭＵＣ１７ ＥＣＤ」は、ＭＵＣ１７の膜貫通及び細胞質内ドメインを本質的に含まないＭＵＣ１７領域又は配列を指す。本発明のＭＵＣ１７ポリペプチドに関して同定される膜貫通ドメインは、その型の疎水性ドメインを同定するための当技術分野で慣用的に用いられる基準に従って同定されることが当業者に理解されるであろう。膜貫通ドメインの正確な境界が異なる場合があるが、本明細書で具体的に言及されるドメインのいずれかの末端の約５アミノ酸以下である可能性が非常に高い。
ＭＵＣ１７に結合する好ましい結合ドメインは、国際公開第２０１０／０３７８３６号パンフレット及び国際公開第２０１１／１２１１１０号パンフレットに開示される。これらの適用において記載されるＭＵＣ１７に関する任意の結合ドメインは、本発明に関連して使用され得る。
本発明の一態様では、抗体コンストラクトは、アミノからカルボキシルの順に、
（ａ）配列番号５０、５６、６８、７４、８６、９２、１０４、１１０、１２２、１２８、１４０、１４６、１５８、１６４、１７６、１８２、１９４、２００、２１２、２１８、２３０、２３６、２４８、２５４、２６６、２７２、２８４、２９０、３０２、３０８、３２０、３３５、３５０、３６５、３８０、３９５、４１０、４２５、４４０、４５５、４７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第１のドメイン；
（ｂ）配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｃ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５若しくは１８７からなる群から選択される又は配列番号１５に示されるとおりのアミノ酸配列を有する第２のドメイン；
（ｄ）配列番号１、２、３、９、１０、１１及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｅ）配列番号１７〜２４からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する第３のドメインの第１のポリペプチド単量体；
（ｆ）配列番号５、６、７及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；及び
（ｇ）配列番号１７〜２４からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する第３のドメインの第２のポリペプチド単量体
を含む。
この好ましい実施形態に一致して、ペプチドリンカーを介して一本鎖ポリペプチドに融合される第１のドメイン及び第２のドメインは、配列番号５１、５７、６９、７５、８７、９３、１０５、１１１、１２３、１２９、１４１、１４７、１５９、１６５、１７７、１８３、１９５、２０１、２１３、２１９、２３１、２３７、２４９、２５５、２６７、２７３、２８５、２９１、３０３、３０９、３２１、３２４、３３６、３３９、３５１、３５４、３６６、３６９、３８１、３８４、３９６、３９９、４１１、４１４、４２６、４２９、４４１、４４４、４５６、４５９、４７１及び４７４からなる群から選択される配列を含む。
一態様では、本発明の抗体コンストラクトは、配列番号５２、５３、５８、５９、７０、７１、７６、７７、８８、８９、９４、９５、１０６、１０７、１１２、１１３、１２４、１２５、１３０、１３１、１４２、１４３、１４８、１４９、１６０、１６１、１６６、１６７、１７８、１７９、１８４、１８５、１９６、１９７、２０２、２０３、２１４、２１５、２２０、２２１、２３２、２３３、２３８、２３９、２５０、２５１、２５６、２５７、２６８、２６９、２７４、２７５、２８６、２８７、２９２、２９３、３０４、３０５、３１０、３１１、３２２、３２３、３２５、３２６、３３７、３３８、３４０、３４１、３５２、３５３、３５５、３５６、３６７、３６８、３７０、３７１、３８２、３８３、３８５、３８６、３９７、３９８、４００、４０１、４１２、４１３、４１５、４１６、４２７、４２８、４３０、４３１、４４２、４４３、４４５、４４６、４５７、４５８、４６０、４６１、４７２、４７３、４７５及び４７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することによって特徴付けられる。
本発明は、本発明の抗体コンストラクトをコードするポリヌクレオチド／核酸分子をさらに提供する。ポリヌクレオチドは、鎖内で共有結合された１３個以上のヌクレオチド単量体で構成される生体高分子である。ＤＮＡ（ｃＤＮＡなど）及びＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）は、異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。ヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのような核酸分子の単量体又はサブユニットとして機能する有機分子である。核酸分子又はポリヌクレオチドは、二本鎖及び一本鎖、線状及び環状であり得る。好ましくは宿主細胞内に含まれるベクター内にそれが含まれることが好ましい。前記宿主細胞は、例えば、本発明のベクター又はポリヌクレオチドを用いた形質転換又はトランスフェクション後、抗体コンストラクトを発現することができる。それを目的として、ポリヌクレオチド又は核酸分子は、制御配列に作動可能に連結される。
遺伝暗号は、遺伝子材料（核酸）内にコードされた情報をタンパク質に翻訳するルールのセットである。生細胞中での生物学的解読は、アミノ酸を運搬し、ｍＲＮＡ中の３つのヌクレオチドを一度に読み取るｔＲＮＡ分子を使用して、ｍＲＮＡによって指定された順にアミノ酸を結合するリボソームによって行われる。この暗号は、コドンと呼ばれる三つ組のヌクレオチド配列が、タンパク質の合成時に次に付加されることになるアミノ酸をどのように指定するかを定義する。いくつかの例外があるが、核酸配列中の３ヌクレオチドのコドンは、１つのアミノ酸を指定する。大部分の遺伝子は、厳密に同じ暗号で暗号化されているため、この特定の暗号を基準遺伝暗号又は標準遺伝暗号と称する場合が多い。遺伝暗号は、所与のコード領域のタンパク質配列を決定するが、他のゲノム領域がこれらのタンパク質が産生される時期及び場所に影響を及ぼし得る。
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターは、（外来）遺伝子材料を細胞内に移すための媒体として使用される核酸分子である。用語「ベクター」は、プラスミド、ウイルス、コスミド及び人工染色体を包含するが、これらに限定されない。一般に、遺伝子操作されたベクターは、複製起点、マルチクローニング部位及び選択マーカーを含む。ベクター自体は、一般に、インサート（導入遺伝子）及びベクターの「骨格」の役割をするより大きい配列を含むヌクレオチド配列、一般にＤＮＡ配列である。最近のベクターは、導入遺伝子インサート及び骨格に加えて、プロモーター、遺伝子マーカー、抗生物質耐性、レポーター遺伝子、標的化配列、タンパク質精製タグといった追加の特徴を包含する場合がある。発現ベクター（発現コンストラクト）と呼ばれるベクターは、特に標的細胞における導入遺伝子の発現のためのものであり、一般に制御配列を有する。
用語「制御配列」は、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適な制御配列は、例えば、プロモーター、任意選択的にオペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係にある場合、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列若しくは分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現する場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されているか；プロモーター若しくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合、コード配列に作動可能に連結されているか；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結」は、連結されているＤＮＡ配列が連続していること及び分泌リーダーの場合には連続し且つ読み取り枠内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによってなされる。このような部位が存在しない場合、従来の慣例に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使用する。
「トランスフェクション」は、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）を意図的に標的細胞に導入する方法である。本用語は、ほとんどの場合、真核細胞における非ウイルス的方法に使用される。形質導入は、核酸分子又はポリヌクレオチドのウイルス媒介性の移入を表すために使用される場合が多い。動物細胞のトランスフェクションは、通常、細胞膜に一過性の細孔、すなわち「穴」を開けて、物質の取り込みを可能にすることを伴う。トランスフェクションは、リン酸カルシウムを用いて、エレクトロポレーションにより、細胞の圧迫により、又は陽イオン性脂質とリポソームを生成する物質とを混合し、細胞膜と融合させ、内部のカーゴを蓄積することにより行うことができる。
用語「形質転換」は、細菌への及び植物細胞を含む非動物真核細胞への核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）の非ウイルス的移入を表すために使用される。したがって、形質転換は、細胞膜を通じたその周辺からの直接的取り込み及びそれに続く外来性遺伝子材料（核酸分子）の組み込みから生じる、細菌又は非動物真核細胞の遺伝的改変である。形質転換は、人為的手段によって生じさせることができる。形質転換を生じさせるには、細胞又は細菌は、飢餓及び細胞密度などの環境条件に対する時限応答として形質転換が起こり得るコンピテントな状態でなければならない。
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」又は「レシピエント細胞」は、本発明の抗体コンストラクトをコードするベクター、外来性核酸分子及びポリヌクレオチドのレシピエント；並びに／又はその抗体コンストラクト自体のレシピエントであり得るか、又はそうであった任意の個々の細胞又は細胞培養物を含むことが意図される。細胞へのそれぞれの物質の導入は、形質転換、トランスフェクションなどによって実施される。用語「宿主細胞」は、単一細胞の子孫又は潜在的子孫を含むことも意図する。後継世代において、自然発生的、偶発的若しくは意図的な変異のいずれかに起因して、又は環境的影響に起因して一定の改変が生じる場合があるため、そのような子孫は、実際には、（形態学的に又はゲノム若しくは全ＤＮＡの組に関して）親細胞と完全に同一でない場合もあるが、なおも本明細書で使用される本用語の範囲内に含まれる。好適な宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞を含み、また細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞及び動物細胞、例えば昆虫細胞及び哺乳動物細胞、例えばマウス、ラット、マカク又はヒトを含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体コンストラクトは、細菌内で産生することができる。発現後、本発明の抗体コンストラクトを可溶性画分中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ペーストから単離し、例えば親和性クロマトグラフィー及び／又はサイズ排除によって精製することができる。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞において発現された抗体の精製方法と同様に実施することができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物が本発明の抗体コンストラクトのための好適なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかしながら、多くの他の属、種及び系統が一般に利用可能であり、且つ本発明において有用であり、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６０４５）、Ｋ．ウィッカラミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４１７８）、Ｋ．ワルチイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びＫ．マルキサヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）などのクリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主；ヤロウイア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（欧州特許第４０２２２６号明細書）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（欧州特許第１８３０７０号明細書）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・レシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（欧州特許第２４４２３４号明細書）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのシュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；並びに糸状菌、例えばニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）が挙げられる。
本発明のグリコシル化抗体コンストラクトの発現のための好適な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株及びバリアント並びにヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主由来の対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えばオートグラファカリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１バリアント及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、そのようなウイルスを、本発明による本明細書のウイルスとして、特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用し得る。
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナ及びタバコの植物細胞培養物も宿主として使用することができる。植物細胞培養物におけるタンパク質の産生に有用なクローニング及び発現ベクターは、当業者に知られている。例えば、Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４２：７６−７８、Ｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７９０−７９４、Ａｒｔｓａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ ８：７４５−７５０及びＦｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２：９７９−９８６を参照されたい。
しかしながら、脊椎動物細胞に対する関心が最も高く、培養（組織培養）下での脊椎動物細胞の増殖は、通例の手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞又は懸濁培養物中で増殖のためにサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、１４１３ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５ １）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８２）３８３：４４−６８）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒトヘパトーマ株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の抗体コンストラクトの作製のための方法であって、本発明の抗体コンストラクトの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養することと、産生された抗体コンストラクトを培養物から回収することとを含む方法を提供する。
本明細書で使用する場合、用語「培養」は、培地中の好適な条件下におけるインビトロでの細胞の維持、分化、成長、増殖及び／又は伝播を指す。用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌を含むが、これらに限定されない、本発明の抗体コンストラクトの作製に関与するいずれの工程も含む。
組換え技術を使用する場合、抗体コンストラクトは、細胞膜周辺腔において細胞内で産生され得るか、又は培地中に直接分泌され得る。抗体コンストラクトが細胞内で産生される場合、第１段階として、例えば遠心分離又は限外濾過により、宿主細胞又は溶解したフラグメントの粒子状の細片を除去する。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離する手順を記載している。簡潔には、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間かけて解凍する。細胞片は、遠心分離により除去することができる。抗体が培地に分泌される場合、一般にそのような発現系からの上清を、最初に市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮する。タンパク質分解を阻害するために、前述の段階のいずれかにおいてＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が含まれ得、また外来性の汚染菌の増殖を防止するために抗生物質が含まれ得る。
宿主細胞から調製された本発明の抗体コンストラクトは、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及び親和性クロマトグラフィーを用いて回収又は精製することができる。回収される抗体に応じて、他のタンパク質精製技術、例えばイオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿法も利用可能である。本発明の抗体コンストラクトがＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）が精製に有用である。
親和性クロマトグラフィーは、好ましい精製技術である。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えばコントロールドポアガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースを用いて達成できるものよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。
さらに、本発明は、本発明の抗体コンストラクト又は本発明の方法に従って作製される抗体コンストラクトを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物において、抗体コンストラクトの均質性は、≧８０％であることが好ましく、より好ましくは≧８１％、≧８２％、≧８３％、≧８４％又は≧８５％、さらに好ましくは≧８６％、≧８７％、≧８８％、≧８９％又は≧９０％、なおさらに好ましくは≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％又は≧９５％及び最も好ましくは≧９６％、≧９７％、≧９８％又は≧９９％である。
本明細書で使用する場合、用語「医薬組成物」は、患者、好ましくはヒト患者への投与に好適な組成物に関する。本発明の特に好ましい医薬組成物は、１つ又は複数の本発明の抗体コンストラクトを好ましくは治療有効量で含む。好ましくは、医薬組成物は、１つ以上の（薬学的に有効な）担体、安定剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤、保存剤及び／又はアジュバントの好適な製剤をさらに含む。許容される組成物の成分は、採用される投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であることが好ましい。本発明の医薬組成物には、液体、凍結及び凍結乾燥組成物が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。一般に、本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与、特に非経口投与に適合するあらゆる水性及び非水性溶液、滅菌溶液、溶媒、緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、懸濁液、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々な種類の湿潤剤、リポソーム、分散媒体及びコーティングを意味する。医薬組成物におけるそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野でよく知られており、そのような担体を含む組成物は、よく知られる従来法によって製剤化することができる。
ある種の実施形態は、本発明の抗体コンストラクト及びさらに１つ以上の賦形剤、例えば本節及び本明細書の他の箇所に例示的に記載されているものを含む医薬組成物を提供する。賦形剤は、粘度の調整などの製剤の物理的、化学的又は生物学的特性の調整及び／又は有効性を向上させ、且つ／若しくはこのような製剤を安定化するための本発明の方法並びに例えば製造、輸送、保管、使用前の調製、投与中及びこれらの後に生じるストレスに起因する劣化及び損傷に対する方法など、広範囲の目的を考慮して本発明で使用することができる。
ある種の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解若しくは放出速度、吸着又は浸透を変更、持続又は保護することを目的とする製剤材料を含有し得る（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８”Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい）。このような実施形態では、好適な製剤材料は、以下を含み得るが、これらに限定されない：
・荷電アミノ酸、好ましくはリジン、酢酸リジン、アルギニン、グルタミン酸塩及び／又はヒスチジンを含むアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、スレオニン、プロリン、２−フェニルアラニン
・抗菌剤及び抗真菌剤などの抗菌薬
・アスコルビン酸、メチオニン、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；
・生理的なｐＨ又はそれよりわずかに低いｐＨ、好ましくはより低い４．０〜６．５のｐＨで組成物を維持するのに使用される緩衝液、緩衝液系及び緩衝化剤；緩衝液の例は、ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩又は他の有機酸、コハク酸塩、リン酸塩及びヒスチジンである；例えば、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液；
・非水性溶媒、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル；
・生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョン又は懸濁液を含む水性担体；
・ポリエステルなどの生分解性ポリマー；
・マンニトール又はグリシンなどの充填剤；
・エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；
・等張剤及び吸収遅延剤；
・錯化剤、例えばカフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）
・注入剤；
・単糖類；二糖類；及び他の糖質（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）；糖質は非還元糖、好ましくはトレハロース、スクロース、オクタスルファート、ソルビトール又はキシリトールであり得る；
・（低分子量）タンパク質、ポリペプチド又はタンパク質性担体、例えばヒト若しくはウシ血清アルブミン、ゼラチン又は好ましくはヒト起源の免疫グロブリン；
・着色及び着香剤；
・硫黄含有還元剤、例えばグルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［α］−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム
・希釈剤；
・乳化剤；
・ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー）
・ナトリウムなどの塩形成対イオン；
・抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの保存剤；例は、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素である）；
・Ｚｎ−タンパク質錯体などの金属錯体；
・溶媒及び共溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）；
・糖及び糖アルコール、例えばトレハロース、スクロース、オクタスルファート、マンニトール、ソルビトール又はキシリトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；及び多価糖アルコール；
・懸濁化剤；
・界面活性剤又は湿潤剤、例えばプルロニック（登録商標）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート２０、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）；界面活性剤は、好ましくは、＞１．２ＫＤの分子量を有する洗剤及び／又は好ましくは＞３ＫＤの分子量を有するポリエーテルであり得；好ましい洗剤の非限定的な例は、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０及びＴｗｅｅｎ ８５であり；好ましいポリエーテルの非限定的な例は、ＰＥＧ ３０００、ＰＥＧ ３３５０、ＰＥＧ ４０００及びＰＥＧ ５０００である；
・スクロース又はソルビトールなどの安定性増強剤；
・等張性増強剤、例えばアルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトール、ソルビトール；
・塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液又は固定油を含む非経口送達ビヒクル；
・体液及び栄養補充液、電解質補充液（リンゲルデキストロースをベースにしたものなど）を含む静脈内送達ビヒクル。
本発明に関連して、好ましくは液体組成物であるか、凍結乾燥によって得られる固体組成物であり得るか、又は再構成された液体組成物であり得る医薬組成物は、
（ａ）少なくとも３つのドメインを含む抗体コンストラクトであって、
・第１のドメインは、標的細胞の表面抗原に結合し、且つ４〜９．５の範囲の等電点（ｐＩ）を有し；
・第２のドメインは、第２の抗原に結合し、且つ８〜１０、好ましくは８．５〜９．０の範囲のｐＩを有し；且つ
・任意選択的に、第３のドメインは、２つのポリペプチド単量体であって、それぞれヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド単量体を含み、前記２つのポリペプチド単量体は、ペプチドリンカーを介して互いに融合される、抗体コンストラクト；
（ｂ）少なくとも１種の緩衝剤；
（ｃ）少なくとも１種の糖類；及び
（ｄ）少なくとも１種の界面活性剤
を含み、医薬組成物のｐＨは、３．５〜６の範囲である。
本発明に関連して、少なくとも１種の緩衝剤は、５〜２００ｍＭの濃度範囲、より好ましくは１０〜５０ｍＭの濃度範囲で存在することがさらに想定される。少なくとも１種の糖類は、単糖類、二糖類、環状多糖類、糖アルコール、直鎖状分岐状デキストラン又は直鎖状非分岐状デキストランからなる群から選択されることが本発明に関連して想定される。本発明に関連して、二糖類は、スクロース、トレハロース及びマンニトール、ソルビトール並びにこれらの組合せからなる群から選択されることも想定される。糖アルコールは、ソルビトールであることが本発明に関連してさらに想定される。少なくとも１種の糖類は、１〜１５％（ｍ／Ｖ）の範囲の濃度、好ましくは９〜１２％（ｍ／Ｖ）の濃度範囲で存在することが本発明に関連して想定される。
少なくとも１種の界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、プルロニック（登録商標）Ｆ６８、トリトンＸ−１００、ポリオキシエチレン、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００及びこれらの組合せからなる群から選択されることも本発明に関連して想定される。少なくとも１種の界面活性剤は、０．００４〜０．５％（ｍ／Ｖ）の範囲、好ましくは０．００１〜０．０１％（ｍ／Ｖ）の範囲の濃度で存在することが本発明に関連してさらに想定される。組成物のｐＨは、４．０〜５．０の範囲、好ましくは４．２であることが本発明に関連して想定される。医薬組成物は、１５０〜５００ｍＯｓｍの範囲のモル浸透圧濃度を有することも本発明に関連して想定される。医薬組成物は、１種以上のポリオール及び１種以上のアミノ酸からなる群から選択される賦形剤をさらに含むことが本発明に関連してさらに想定される。前記１種以上の賦形剤は、０．１〜１５％（ｗ／Ｖ）の濃度範囲で存在することが本発明に関連して想定される。
医薬組成物は、
（ａ）上記のとおりの抗体コンストラクト、
（ｂ）１０ｍＭのグルタミン酸塩又は酢酸塩、
（ｃ）９％（ｍ／Ｖ）のスクロース又は６％（ｍ／Ｖ）のスクロース及び６％（ｍ／Ｖ）のヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、
（ｄ）０．０１％（ｍ／Ｖ）のポリソルベート８０
を含み、液体医薬組成物のｐＨは、４．２であることも本発明に関連して想定される。
抗体コンストラクトは、０．１〜８ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２〜２．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２５〜１．０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で存在することが本発明に関連してさらに想定される。
医薬組成物の異なる成分（例えば、上記に列挙したもの）が異なる効果を有し得ることは、当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸は、緩衝液、安定化剤及び／又は抗酸化剤として作用することができ；マンニトールは、充填剤及び／又は等張性増強剤として作用することができ；塩化ナトリウムは、送達ビヒクル及び／又は等張性増強剤として作用することができるなどである。
本発明の組成物は、本明細書で定義される本発明のポリペプチドに加えて、組成物の使用目的に応じてさらなる生物学的に活性な薬剤を含む場合があることが想定される。このような薬剤は、当技術分野で知られる胃腸系に対して作用する薬物、細胞増殖抑制剤として作用する薬物、高尿酸血症（ｈｙｐｅｒｕｒｉｋｅｍｉａ）を防ぐ薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えば、コルチコステロイド）、炎症反応を調節する薬物、循環系に対して作用する薬物及び／又はサイトカインなどの薬剤であり得る。また、本発明の抗体コンストラクトは、併用療法で、すなわち別の抗癌薬と併用して適用されることも想定される。
ある種の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式及び所望の投与量に応じて、当業者により決定されることになる。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（前掲）を参照されたい。ある種の実施形態では、このような組成物は、本発明の抗体コンストラクトの物理的状態、安定性、インビボ放出速度及びインビトロクリアランス速度に影響し得る。ある種の実施形態では、医薬組成物中の主な媒体又は担体は、本質的に水性であっても非水性であり得る。例えば、好適なビヒクル又は担体は、注射用水、生理食塩水溶液又は人工脳脊髄液であり得、場合により非経口投与用組成物で一般的な他の材料が補充される。中性緩衝生理食塩水又は血清アルブミンを混合した生理食塩水もさらなる例示的なビヒクルである。ある種の実施形態では、本発明の組成物の抗体コンストラクトは、凍結乾燥ケーク又は水性溶液の形態において、所望の度合いの純度を有する選択された組成物を任意選択的に配合剤（前掲のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）と混合することによって保管のために調製され得る。さらに、ある種の実施形態では、本発明の抗体コンストラクトは、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として製剤化され得る。
非経口投与が企図される場合、本発明における使用のための治療用組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に本発明の所望の抗体コンストラクトを含む、パイロジェンフリーの非経口的に許容される水溶液の形態で提供され得る。非経口注射に特に好適なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、本発明の抗体コンストラクトは、その中で適切に保存された滅菌等張溶液として製剤化される。ある種の実施形態では、製剤は、デポ注射を介して送達できる産物の制御放出又は持続放出を提供し得る薬剤、例えば注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー性化合物（ポリ乳酸若しくはポリグリコール酸など）、ビーズ又はリポソームと所望の分子との製剤を含み得る。ある種の実施形態では、循環中の持続期間を増進する効果を有するヒアルロン酸も使用され得る。ある種の実施形態では、移植可能な薬物送達デバイスを使用して、所望の抗体コンストラクトを導入し得る。
さらなる医薬組成物が当業者に明らかであり、これには、持続性又は制御性の送達／放出製剤中に本発明の抗体コンストラクトを含む製剤が含まれる。様々な他の持続性又は制御性の送達手段、例えばリポソーム担体、生体内分解性マイクロ粒子又は多孔ビーズ及びデポ注射を製剤化する技術も当業者に知られている。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマーマイクロ粒子の制御放出について記載する国際特許出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第９３／００８２９号明細書を参照されたい。持続放出性製剤は、成形物品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出性マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書、欧州特許出願公開第０５８４８１号明細書に開示される）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１、前掲）又はポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号明細書）を含み得る。持続放出組成物は、当技術分野において知られるいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームも含み得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−３６９２；欧州特許出願公開第０３６，６７６号明細書；同第０８８，０４６号明細書及び同第１４３，９４９号明細書を参照されたい。
抗体コンストラクトは、例えば、コアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンにも封入され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
インビボ投与に使用される医薬組成物は、典型的には、無菌製剤として提供される。無菌化は、無菌濾過膜を介する濾過によって達成することができる。組成物を凍結乾燥する場合、この方法を使用した無菌化は、凍結乾燥及び再構成の前後いずれに実施され得る。非経口投与用組成物は、凍結乾燥形態において又は溶液中に保存することができる。非経口組成物は、一般に、無菌のアクセスポートを有する容器に充填され、こうした容器は、例えば、静脈注射用溶液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルである。
本発明の別の態様は、国際特許出願国際公開第０６１３８１８１Ａ２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００６／０２２５９９号明細書）に記載される、医薬組成物として使用することができる本発明の製剤の自己緩衝性抗体コンストラクトを含む。タンパク質の安定化並びにこれに関して有用な製剤材料及び方法に対して様々な説明が利用可能であり、例えばＡｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｏｌｖｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．８（３）：２８５−９１（１９９１）；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」 ｉｎ：ＲＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＳＩＧＮ ＯＦ ＳＴＡＢＬＥ ＰＲＯＴＥＩＮ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ：ＴＨＥＯＲＹ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１−８４（２００２）及びＲａｎｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１５９−７５（２００２）、特に獣医学的及び／又はヒト医療用途のタンパク質医薬品及びプロセスに関して、特に本発明による自己緩衝性タンパク質製剤と同じ賦形剤及びプロセスに関する部分を参照されたい。
塩は、本発明のある種の実施形態に従って、例えば製剤のイオン強度及び／若しくは等張性を調整するため、且つ／又は本発明による組成物のタンパク質若しくは他の成分の溶解度及び／若しくは物理的安定性を向上させるために使用され得る。よく知られているとおり、イオンは、タンパク質の表面上の荷電残基に結合することにより、且つタンパク質中の荷電基及び極性基を遮蔽し、その静電気相互作用、引力及び反発相互作用の強度を低減することにより、天然状態のタンパク質を安定化することができる。イオンは、特にタンパク質の変性ペプチド結合（−−ＣＯＮＨ）に結合することによって変性状態のタンパク質を安定化することもできる。さらに、タンパク質中の荷電基及び極性基とのイオン相互作用は、分子間静電相互作用を低減し、それによりタンパク質の凝集及び不溶化を防止又は低減することもできる。
イオン種によってタンパク質に及ぼすそれらの効果は、著しく異なる。イオン及びタンパク質に対するその効果の分類上の順位付けがいくつか立案されており、これを本発明による医薬組成物の製剤化に使用することができる。一例は、イオン性溶質及び極性非イオン性溶質を溶液中のタンパク質の立体構造安定性に対する効果によって順位付けするホフマイスター系列である。安定化する溶質は、「コスモトロピック」と称される。不安定化する溶質は、「カオトロピック」と称される。コスモトロープは、一般に、溶液からタンパク質を沈殿（「塩析」）させるために高濃度（例えば、＞１モル硫酸アンモニウム）で使用される。カオトロープは、一般に、タンパク質を変性及び／又は可溶化（「塩溶」）させるために使用される。「塩溶」及び「塩析」に対するイオンの相対的な効果により、ホフマイスター系列でのイオンの位置が定義される。
遊離アミノ酸は、充填剤、安定化剤及び抗酸化剤として、且つ他の標準的用途として、本発明の様々な実施形態による本発明の製剤の抗体コンストラクトに使用することができる。リジン、プロリン、セリン及びアラニンは、製剤中のタンパク質を安定化するために使用することができる。グリシンは、凍結乾燥において適切なケークの構造及び特性を確保するのに有用である。アルギニンは、液体及び凍結乾燥のいずれの製剤でもタンパク質の凝集を阻害するのに有用であり得る。メチオニンは、抗酸化剤として有用である。
ポリオールは、糖、例えばマンニトール、スクロース及びソルビトール並びに多価アルコール、例えばグリセロール及びプロピレングリコール並びに本明細書での議論を目的としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連物質を含む。ポリオールは、コスモトロピックである。それらは、液体及び凍結乾燥のいずれの製剤でもタンパク質を物理的及び化学的劣化過程から保護するのに有用な安定化剤である。ポリオールは、製剤の等張性を調整するのにも有用である。ポリオールの中で本発明の選択された実施形態において有用なのは、マンニトールであり、これは、凍結乾燥製剤においてケークの構造安定性を確保するために一般に使用される。マンニトールは、ケークの構造安定性を確保する。一般に、これは、凍結乾燥保護剤、例えばスクロースとともに使用される。ソルビトール及びスクロースは、等張性を調整するための薬剤及び輸送中又は製造工程でのバルク調製時の凍結解凍ストレスから保護するための安定化剤として好ましいものの中に含まれる。還元糖（遊離アルデヒド基又はケトン基を含有する）、例えばグルコース及びラクトースは、表面のリジン及びアルギニン残基を糖化することができる。したがって、それらは、一般に、本発明による使用のための好ましいポリオールの中に含まれない。加えて、そのような反応種を形成する糖、例えばスクロースも、酸性条件下でフルクトース及びグルコースに加水分解され、その結果糖化を生じさせる点で本発明の好ましいポリオールの中に含まれない。ＰＥＧは、タンパク質を安定化すること及び凍結保護物質として有用であり、この点に関して本発明に使用することができる。
本発明の製剤の抗体コンストラクトの実施形態は、界面活性剤をさらに含む。タンパク質分子は、表面への吸着並びに気体−液体界面、固体−液体界面及び液体−液体界面での変性及びその結果としての凝集を引き起こしやすいことがある。これらの効果は、一般にタンパク質濃度に反比例する。これらの有害な相互作用は、一般に、タンパク質濃度と反比例し、通常、例えば製品の輸送及び取り扱い時に生じる物理的撹拌によって悪化する。界面活性剤は、慣例的に、表面吸着を防止するか、最小化するか、又は低減するために使用される。この点に関して本発明において有用な界面活性剤としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートの他の脂肪酸エステル及びポロキサマー１８８が挙げられる。界面活性剤は、タンパク質の立体構造安定性を制御するためにも一般に使用される。任意の所与の界面活性剤は、通常、一部のタンパク質を安定化し、他を不安定化するため、この点において、界面活性剤の使用は、タンパク質特異的である。
ポリソルベートは、酸化劣化を起こしやすく、多くの場合、供給されるとき、タンパク質残基の側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすほど十分な過酸化物量を含有している。したがって、ポリソルベートは、慎重に使用すべきであり、使用時には最小影響濃度で用いなければならない。この点で、ポリソルベートは、賦形剤を最小影響濃度で用いるべきとする一般通則を例示している。
本発明の製剤の抗体コンストラクトの実施形態は、１種以上の抗酸化剤をさらに含む。適切なレベルの周囲酸素及び周囲温度を維持することにより、且つ光への暴露を回避することにより、医薬製剤中でのタンパク質の有害な酸化をある程度まで防止することができる。抗酸化賦形剤を、タンパク質の酸化劣化を防止するためにも同様に使用することができる。この点で特に有用な抗酸化剤には、還元剤、酸素／フリーラジカル捕捉剤及びキレート剤が含まれる。本発明による治療用タンパク質製剤に使用するための抗酸化剤は、好ましくは、水溶性であり、製品の有効期間にわたって活性を維持する。この点で、ＥＤＴＡが本発明による好ましい抗酸化剤である。抗酸化剤は、タンパク質を損傷することがある。例えば、還元剤、例えばグルタチオンは、特に分子内ジスルフィド結合を破壊し得る。したがって、本発明に使用するための抗酸化剤は、とりわけ、それ自体が製剤中のタンパク質に損傷を与える可能性を排除するか又はその可能性を十分に低減するように選択される。
本発明による製剤は、タンパク質の補因子であり、タンパク質配位化合物を形成するのに必要とされる金属イオン、例えば特定のインスリン懸濁液を形成するのに必要とされる亜鉛を含み得る。金属イオンは、タンパク質を分解するいくつかの過程も阻害することができる。しかしながら、金属イオンは、タンパク質を分解する物理的及び化学的過程も触媒する。マグネシウムイオン（１０〜１２０ｍＭ）は、アスパラギン酸からイソアスパラギン酸への異性化を阻害するために使用され得る。Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を増大させ得る。しかしながら、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化し得る。同様に、Ｃａ＋２及びＳｒ＋２は、第ＶＩＩＩ因子を安定化することができ、これは、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２及びＦｅ＋２によって不安定化されることがあり、その凝集は、Ａｌ＋３イオンによって増大し得る。
本発明の製剤の抗体コンストラクトの実施形態は、１種以上の保存剤をさらに含む。保存剤は、同じコンテナからの２回以上の取り出しを伴う複数回用量の非経口製剤を開発する際に必要となる。その主な機能は、製剤の貯蔵寿命又は使用期間にわたって微生物の増殖を阻害し、製品の無菌性を確保することである。一般に使用される防腐剤としては、ベンジルアルコール、フェノール及びｍ−クレゾールが挙げられる。保存剤は、低分子の非経口薬との使用において長い歴史を有するが、保存剤を含むタンパク質製剤の開発は、困難であり得る。保存剤は、ほぼ常にタンパク質に対して不安定化効果（凝集）を有しており、これが複数回用量のタンパク質製剤における使用を制限する主要な要因となっている。現在に至るまで、ほとんどのタンパク質薬は、単回使用用としてのみ製剤化されている。しかしながら、複数回用量配合物が可能である場合、患者の利便性及び高い市場性を実現するという利点が加わる。防腐処理された配合物の開発により、より便利な複数回使用の注射ペンの開発が製品化に至ったヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、その良い例である。ｈＧＨの保存処理された製剤を含有するそのようなペンデバイスは、少なくとも４つが現在市場で入手可能である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥−デュアルチャンバーカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）は、フェノールを含有する一方、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）は、ｍ−クレゾールにより製剤化されている。保存処理された剤形の製剤化及び開発中、いくつかの態様を考慮する必要がある。製剤中の効果的な防腐剤濃度を最適化しなければならない。これには、剤形中の所与の防腐剤を、タンパク質の安定性を損なうことなく抗微生物効果を付与する濃度範囲で試験することが必要となる。
予想されるとおり、保存剤を含有する液体製剤の開発は、凍結乾燥製剤よりも困難である。フリーズドライ生成物は、防腐剤なしで凍結乾燥され、使用時に希釈剤を含有する防腐剤で再構成することができる。これにより保存剤がタンパク質と接触する時間が短縮され、付随する安定性のリスクが大幅に最小化される。液体製剤の場合、保存剤の有効性及び安定性は、製品有効期間全体（約１８〜２４か月）にわたって維持されるべきである。注意すべき重要な点として、保存剤の有効性は、活性薬物及び全ての賦形剤成分を含有する最終製剤において実証される必要がある。
本明細書で開示される抗体コンストラクトは、免疫リポソームとしても製剤化され得る。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物送達に有用である様々な種類の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤から構成される小さい小胞である。リポソームの成分は、一般に、生体膜の脂質の配置と同様に二層構造で配置される。抗体コンストラクトを含有するリポソームは、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号明細書及び同第４，５４４，５４５号明細書；並びに国際公開第９７／３８７３１号パンフレットに記載される、当技術分野で知られる方法によって調製される。循環時間が長くなったリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号明細書に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法によって作製することができる。所望の直径を有するリポソームを得るために、リポソームを、所定の孔径のフィルターを通して押し出す。本発明の抗体コンストラクトのＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応により、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されるとおりに、リポソームにコンジュゲートすることができる。任意選択的に、化学療法剤がリポソーム内に含有される。Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照されたい。
医薬組成物を製剤化した後、それを溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶として又は脱水粉末若しくは凍結乾燥粉末として無菌バイアル中に保存し得る。そのような製剤は、即時使用が可能な形態又は投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥品）のいずれかで保存され得る。
本明細書で定義される医薬組成物の生物活性は、例えば、以下の実施例、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット又はＳｃｈｌｅｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１−１２）において記載されるとおりの細胞傷害アッセイによって決定され得る。本明細書で使用する場合、「有効性」又は「インビボ有効性」は、例えば、標準化されたＮＣＩの反応基準を用いた、本発明の医薬組成物による療法に対する反応を指す。本発明の医薬組成物を用いる療法の成功又はインビボ有効性は、その意図された目的、すなわち組成物がその所望の効果、すなわち病的細胞、例えば腫瘍細胞の激減を引き起こす能力に関する組成物の有効性を指す。インビボ有効性は、白血球の計数、差異、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺を含むが、これらに限定されない、それぞれの疾患実体についての確立された標準的方法によって観測され得る。加えて、様々な疾患特異的臨床化学パラメータ及び他の確立された標準的方法が使用され得る。さらに、コンピュータ断層撮影法、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影法（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの基準に基づく反応評価［Ｃｈｅｓｏｎ ＢＤ，Ｈｏｒｎｉｎｇ ＳＪ，Ｃｏｉｆｆｉｅｒ Ｂ，Ｓｈｉｐｐ ＭＡ，Ｆｉｓｈｅｒ ＲＩ，Ｃｏｎｎｏｒｓ ＪＭ，Ｌｉｓｔｅｒ ＴＡ，Ｖｏｓｅ Ｊ，Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ Ａ，Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ Ａ，Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ Ｆ，Ｋｌｉｐｐｅｎｓｔｅｎ Ｄ，Ｈｉｄｄｅｍａｎｎ Ｗ，Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ Ｒ，Ｈａｒｒｉｓ ＮＬ，Ａｒｍｉｔａｇｅ ＪＯ，Ｃａｒｔｅｒ Ｗ，Ｈｏｐｐｅ Ｒ，Ｃａｎｅｌｌｏｓ ＧＰ．Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｔｏ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．ＮＣＩ Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１９９９ Ａｐｒ；１７（４）：１２４４］）、ポジトロン放出断層走査、白血球の計数、差異、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺、リンパ節生検／組織学及び様々なリンパ腫に特異的な臨床化学パラメータ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ）並びに他の確立された標準的方法が使用され得る。
本発明の医薬組成物などの薬物の開発におけるもう１つの主な課題は、薬物動態特性の予測可能な調節である。この目的のために、候補薬物の薬物動態プロファイル、すなわち特定の薬物が所与の病態を治療する能力に影響する薬物動態パラメータのプロファイルが確立され得る。薬物が特定の疾患実体を治療する能力に影響する薬物の薬物動態パラメータとしては、半減期、分布容積、肝臓の初回通過代謝及び血清結合の程度が挙げられるが、これらに限定されない。所与の薬物の有効性は、上記のパラメータの各々によって影響を受ける可能性がある。特定のＦＣ様式により提供される本発明の抗体コンストラクトの想定される特徴は、それらが例えば薬物動態挙動において相違を含むことである。本発明による半減期が延長した標的化抗体コンストラクトは、好ましくは、前記抗体コンストラクトの「カノニカル」な非ＨＬＥバージョンと比較して、インビボで驚くほど増加した滞留時間を示す。
「半減期」は、投与された薬物の５０％が生物学的過程、例えば代謝、排泄などを通じて排出される時間を意味する。「肝臓の初回通過代謝」は、肝臓との初回接触時、すなわち肝臓を最初に通過する間に代謝される薬物の傾向を意味する。「分布容積」は、例えば、細胞内及び細胞外空間、組織及び臓器などのような、身体の様々な区画にわたる薬物の保持度並びにこれらの区画内での薬物の分布を意味する。「血清結合の程度」は、薬物がアルブミンなどの血清タンパク質と相互作用して結合し、薬物の生物活性の低減又は消失をもたらす傾向を意味する。
薬物動態パラメータは、投与される所与量の薬物についてのバイオアベイラビリティ、ラグタイム（Ｔｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度、より多くの作用発現及び／又はＣｍａｘも含む。「バイオアベイラビリティ」は、血液コンパートメント中の薬物の量を意味する。「ラグタイム」は、薬物の投与から、血液又は血漿中での薬物の検出及び測定が可能になるまでの遅延時間を意味する。「Ｔｍａｘ」は、その後に薬物の最高血中濃度に到達する時間であり、「Ｃｍａｘ」は、所与の薬物によって得られる最高血中濃度である。薬物が生物学的効果に必要とされる血中濃度又は組織濃度に達するまでの時間は、全てのパラメータに影響される。先に概説したチンパンジーではない霊長類における前臨床動物試験において決定され得る種間特異性を示す二重特異性抗体コンストラクトの薬物動態パラメータは、例えば、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈら（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１−１２）による刊行物にも規定されている。
本発明の好ましい態様では、医薬組成物は、約−２０℃で少なくとも４週間安定である。付属の実施例から明らかなように、対応する最先端の抗体コンストラクトの質に対する本発明の抗体コンストラクトの質は、異なる系を使用して試験され得る。それらの試験は、「ＩＣＨ Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｑ５Ｃ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｔｅｓｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｑ６Ｂ」に準拠するものであることが理解され、それにより、その産物の同一性、純度及び能力の変化の確実な検出をもたらす安定性指標プロファイルを提供するように選択される。純度という用語は、相対的な用語であることが十分に受け入れられている。グリコシル化、脱アミド又は他の異種性の影響に起因して、生物工学的／生物学的産物の絶対的な純度は、通常、２つ以上の方法によって評価されるべきであり、得られる純度の値は、方法依存的である。安定性試験の目的のために、純度の試験は、分解産物の決定方法に合わせるべきである。
本発明の抗体コンストラクトを含む医薬組成物の質の評価のために、例えば溶液中の可溶性凝集物の含有量（サイズ排除によるＨＭＷＳ）を分析することによって分析され得る。約−２０℃での少なくとも４週間の安定性は、１．５％ＨＭＷＳ未満、好ましくは１％ＨＭＷＳ未満の含有量によって特徴付けられる。
医薬組成物としての抗体コンストラクトのための好ましい製剤は、例えば、下記のとおりの製剤の成分を含み得る。
・製剤：
ｐＨ６．０のリン酸カリウム、Ｌ−アルギニン塩酸塩、トレハロース二水和物、ポリソルベート８０
医薬組成物の形態の本発明の抗体コンストラクトの安定性の評価の他の例は、付属の実施例４〜１２に提供される。それらの実施例において、本発明の抗体コンストラクトの実施形態は、異なる医薬製剤において異なるストレス条件に関して試験され、その結果が、当技術分野で知られる他の半減期延長（ＨＬＥ）形式の二重特異性Ｔ細胞エンゲージ抗体コンストラクトと比較される。一般に、本発明による特定のＦＣ様式で提供される抗体コンストラクトは、通常、異なるＨＬＥ形式とともに提供される抗体コンストラクト及びいかなるＨＬＥ形式も有しない抗体コンストラクト（例えば、「カノニカル」な抗体コンストラクト）の両方と比較して、温度及び光ストレスなどの広範囲のストレス条件に対してより安定であることが想定される。前述の温度安定性は、低温（凍結温度を含む室温未満）及び高温（体温までの又は体温を超える温度を含む室温超）の両方に関連し得る。当業者が認めるとおり、診療において避けるのが困難なストレスに対するそのような安定性の向上により、診療において分解産物がより少なくなるため、抗体コンストラクトがより安全になる。結果として、前述の安定性の向上は、安全性の向上を意味する。
一実施形態は、前立腺癌などのＭＵＣ１７の発現又はＭＵＣ１７の過剰発現と関連する癌の予防、治療又は改善に使用するための本発明の抗体コンストラクト又は本発明の方法に従って作製される抗体コンストラクトを提供する。
本明細書に記載される製剤は、それを必要とする患者において、本明細書に記載される病的な医学的状態を治療、改善及び／又は予防する医薬組成物として有用である。用語「治療」は、治療的治療及び予防的又は抑止的手段の両方を指す。治療は、疾患、疾患の症状又は疾患素因を治癒する、治す、軽減する、緩和する、変化させる、矯正する、改善する、好転させる又は影響を与えることを目的とした、疾患／障害、疾患／障害の症状又は疾患／障害の素因を有する患者の身体、単離された組織又は細胞に対する製剤の適用又は投与を含む。
本明細書で使用する場合、用語「改善」は、本発明による抗体コンストラクトのそれを必要とする対象への投与による、本明細書の以下に示す疾患を有する患者の疾患状態のあらゆる好転を指す。そのような好転は、患者の疾患の進行の緩徐化又は停止として見られる場合もある。本明細書で使用する場合、用語「予防」は、本発明による抗体コンストラクトのそれを必要とする対象への投与による、本明細書の以下に示す腫瘍又は癌若しくは転移性癌を有する患者の発症又は再発の回避を意味する。
用語「疾患」は、本明細書に記載される抗体コンストラクト又は医薬組成物を用いた治療から恩恵を被ることになる任意の病態を指す。これは、哺乳動物を対象の疾患に罹患させやすくする病的状況を含む、慢性及び急性の障害又は疾患を含む。
「新生物」は、組織の異常な増殖であり、必ずしもそうとは限らないが、通常、腫瘤を形成する。また、腫瘤を形成する場合、それは、一般に「腫瘍」と呼ばれる。新生物又は腫瘍は、良性、潜在性悪性（前癌性）又は悪性であり得る。悪性新生物は、一般に癌と呼ばれる。それらは、通常、周囲の組織に侵入してそれを破壊し、転移を形成し得、すなわち、それらは、身体の他の部分、組織又は臓器に広がる。したがって、用語「転移性癌」は、原発腫瘍のもの以外の他の組織又は臓器への転移を包含する。リンパ腫及び白血病は、リンパ系新生物である。本発明の目的において、それらは、用語「腫瘍」又は「癌」にも包含される。
用語「ウイルス性疾患」は、対象のウイルス感染の結果である疾患を表す。
本明細書で使用する場合、用語「免疫障害」は、この用語の一般的な定義に沿って自己免疫疾患、過敏症、免疫不全などの免疫障害を表す。
一実施形態では、本発明は、ＭＵＣ１７の発現又はＭＵＣ１７の過剰発現と関連する癌の治療又は改善のための方法であって、それを必要とする対象に、本発明の抗体コンストラクト又は本発明の方法に従って作製される抗体コンストラクトを投与する工程を含む方法を提供する。ＭＵＣ１７×ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体は、癌、好ましくは固形腫瘍、より好ましくは癌腫及び前立腺癌の治療に関して特に有利である。
用語「必要とする対象」又は「治療を必要とする」対象は、すでにその障害を有する対象及びその障害を予防しようとする対象を含む。必要とする対象又は「患者」は、予防的治療又は治療的治療のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳動物対象を含む。
本発明の抗体コンストラクトは、一般に、とりわけバイオアベイラビリティ及び持続性の範囲において、特定の投与経路及び投与方法、特定の投与量及び投与頻度、特定の疾患の特定の治療に合わせて設計されることになる。組成物の材料は、好ましくは、投与部位に許容される濃度で製剤化される。
したがって、製剤及び組成物は、本発明に従って任意の好適な投与経路による送達に合わせて設計され得る。本発明に関連して、投与経路は、
・局所経路（例えば、皮膚上、吸入、鼻、眼、耳介／耳、膣、粘膜）；
・腸経路（例えば、経口、胃腸、舌下、唇下、頬側、直腸）；及び
・非経口経路（例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、脳内、脳室内、硬膜外、髄腔内、皮下、腹腔内、羊膜外、関節内、心臓内、皮内、病巣内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、鼻腔内、経粘膜、滑液嚢内、管腔内）
を含むが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物及び抗体コンストラクトは、例えば、ボーラス注射などの注射による又は持続注入などの注入による非経口投与、例えば皮下又は静脈内送達に特に有用である。医薬組成物は、医療デバイスを用いて投与され得る。医薬組成物を投与するための医療デバイスの例は、米国特許第４，４７５，１９６号明細書；同第４，４３９，１９６号明細書；同第４，４４７，２２４号明細書；同第４，４４７，２３３号明細書；同第４，４８６，１９４号明細書；同第４，４８７，６０３号明細書；同第４，５９６，５５６号明細書；同第４，７９０，８２４号明細書；同第４，９４１，８８０号明細書；同第５，０６４，４１３号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３８３，８５１号明細書；及び同第５，３９９，１６３号明細書に記載されている。
特に、本発明は、好適な組成物の中断のない投与を実現する。非限定的な例として、中断のない又は実質的に中断のない、すなわち連続的な投与は、患者体内への治療薬の流入を調整するための、患者が装着した小型ポンプシステムによって実現され得る。本発明の抗体コンストラクトを含む医薬組成物は、前記ポンプシステムを使用することによって投与することができる。そのようなポンプシステムは、一般に当技術分野で知られており、通常、注入する治療薬を含有するカートリッジの定期交換に依拠する。そのようなポンプシステムでカートリッジを交換する際、交換時以外には中断しない患者体内への治療薬の流入に一時的な中断が結果として生じる場合がある。そのような場合でも、カートリッジ交換前の投与段階及びカートリッジ交換後の投与段階は、依然として、ともにこのような治療薬の「中断のない投与」を構成する本発明の医薬的手段及び方法の意味の範囲内と見なされるであろう。
本発明の抗体コンストラクトの連続投与又は中断のない投与は、流体をレザバーから送り出すための流体送出機構及び送出機構を駆動するための駆動機構を含む、流体送達デバイス又は小型ポンプシステムによる静脈内又は皮下投与であり得る。皮下投与のためのポンプシステムは、患者の皮膚に穿通し、好適な組成物を患者体内に送達するための針又はカニューレを含み得る。前記ポンプシステムを、静脈、動脈又は血管を問わず、患者の皮膚に直接固定又は装着することでポンプシステムと患者の皮膚とを直接接触させることが可能になる。このポンプシステムは、患者の皮膚に２４時間〜数日間装着することができる。レザバーの容積が小さい小型のポンプシステムの場合もある。非限定的な例として、投与される好適な医薬組成物のためのレザバーの容積は、０．１〜５０ｍｌであり得る。
連続投与は、皮膚に装着され時折交換されるパッチによって経皮的でもあり得る。当業者は、この目的に好適な薬物送達のためのパッチシステムを認識している。経皮投与は、例えば、第１の使用済みパッチの直接隣の皮膚表面に、第１の使用済みパッチを除去する直前に、新しい第２のパッチを装着すると同時に第１の使用済みパッチの交換を完了できる有利さがあることから、中断のない投与に特に適していることに注目されたい。流入の中断又は電池故障の問題は生じない。
医薬組成物が凍結乾燥されている場合、まず凍結乾燥材料を投与前に適切な液体で再構成する。凍結乾燥材料を、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は凍結乾燥前にタンパク質が存在した同じ製剤で再構成し得る。
本発明の組成物は、例えば、本明細書に記載される種間特異性を示す本発明の抗体コンストラクトをチンパンジーではない霊長類、例えばマカクに用量を増加させながら投与することによる用量漸増試験によって決定できる好適な用量で対象に投与することができる。上述のとおり、本明細書に記載される種間特異性を示す本発明の抗体コンストラクトは、チンパンジーではない霊長類の前臨床試験において同一の形態で使用でき、且つヒトにおける薬物として使用できるという利点がある。投与計画は、主治医が臨床的要因によって決定することになる。医学分野でよく知られるとおり、ある１人の患者に対する投与量は、その患者の体格、体表面積、年齢、投与される個々の化合物、性別、投与時間及び投与経路、全身健康状態並びに同時に投与されている他の薬物を含む多くの要因に依存する。
用語「有効用量」又は「有効投与量」は、所望の効果を達成するか又は少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。用語「治療有効用量」は、疾患にすでに罹患している患者の疾患及びその合併症を治癒するか又は少なくとも部分的に抑止するのに十分な量と定義される。この用途に効果的な量又は用量は、治療される病態（適応症）、送達される抗体コンストラクト、治療の内容及び目的、疾患の重症度、前治療、患者の病歴及び治療薬に対する反応性、投与経路、体格（体重、体表面積又は臓器サイズ）及び／又は患者の状態（年齢及び全身健康状態）並びに患者自身の免疫系の全身状態に依存することになる。適当な用量は、１回の投与又は複数回にわたる投与で患者に投与できるように、また最適な治療効果を得るために主治医の判断に従って調整することができる。
典型的な投与量は、上記の要因に応じて約０．１μｇ／ｋｇ〜最大約３０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。特定の実施形態では、投与量は、１．０μｇ／ｋｇ〜最大約２０ｍｇ／ｋｇ、任意選択的に１０μｇ／ｋｇ〜最大約１０ｍｇ／ｋｇ又は１００μｇ／ｋｇ〜最大約５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
治療有効量の本発明の抗体コンストラクトは、好ましくは、疾患症状の重症度を低下させるか、疾患症状がない期間の頻度若しくは期間を増加させるか、又は疾患の苦痛に起因する機能障害若しくは能力障害を防止する。本明細書において上記のとおりのＭＵＣ１７発現と関連する疾患の治療に関して、治療有効量の本発明の抗体コンストラクト、本明細書の抗ＭＵＣ１７／抗ＣＤ３抗体コンストラクトは、好ましくは、細胞増殖又は腫瘍増殖を未治療の患者と比較して少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％阻害する。腫瘍増殖を阻害する化合物の能力は、有効性を予測する動物モデルにおいて評価され得る。
医薬組成物は、１回の治療で投与するか、又は必要に応じて抗癌療法などの追加治療、例えば他のタンパク質性及び非タンパク質性薬物と併用して投与することができる。これらの薬物は、本明細書で定義される本発明の抗体コンストラクトを含む組成物と同時に投与され得るか、又は前記抗体コンストラクトの投与前若しくは投与後に既定の時間間隔及び用量で別々に投与され得る。
本明細書で使用する場合、用語「有効且つ非毒性用量」は、重大な毒性作用を生じさせずに又は本質的に生じさせずに、病的細胞の激減、腫瘍の除去、腫瘍の縮退又は疾患の安定化をもたらすのに十分である、本発明の抗体コンストラクトの許容用量を指す。そのような有効且つ非毒性用量は、例えば、当技術分野で記載されている用量漸増試験によって決定され得、その用量は、重篤な有害副事象を誘発する用量未満であるべきである（用量制限毒性、ＤＬＴ）。
本明細書で使用する場合、用語「毒性」は、有害事象又は重篤な有害事象として現れる薬物の毒性作用を指す。これらの副事象は、全身的な薬物忍容性の欠如及び／又は投与後の局所的な忍容性の欠如を指す場合がある。毒性は、その薬物によって引き起こされる催奇性作用又は発癌性作用も含み得る。
本明細書で使用する場合、用語「安全性」、「インビボ安全性」又は「忍容性」は、投与直後に（局所忍容性）及びより長期の薬物適用期間中に重篤な有害事象を誘発しない薬物の投与と定義される。「安全性」、「インビボ安全性」又は「忍容性」は、例えば、治療中及び経過観察期間中に定期的に評価することができる。測定値は、臨床評価、例えば臓器の所見及び臨床検査値異常のスクリーニングを含む。臨床評価が実施され、ＮＣＩ−ＣＴＣ及び／又はＭｅｄＤＲＡ標準に従って正常所見からの逸脱が記録／コード化され得る。臓器の所見は、例えば、Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ ｖ３．０（ＣＴＣＡＥ）に示される、アレルギー／免疫学、血液／骨髄、心不整脈、凝固などの基準を含み得る。試験され得る検査パラメータは、例えば、血液学、臨床化学、凝固プロファイル及び尿検査並びに他の体液、例えば血清、血漿、リンパ液又は脊髄液、髄液などの検査を含む。したがって、安全性は、例えば、身体検査、画像化技術（すなわち超音波、ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、技術的デバイスを用いた他の計測（すなわち心電図）、バイタルサインにより、検査パラメータを測定し、有害事象を記録することにより評価することができる。例えば、本発明による使用及び方法において、チンパンジーではない霊長類における有害事象は、組織病理学的方法及び／又は組織化学的方法により試験され得る。
上記の用語は、例えば、１９９７年７月１６日のＰｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｆｅｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓ６；ＩＣＨ Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ；ＩＣＨ Ｓｔｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｍｅｅｔｉｎｇでも参照されている。
最後に、本発明は、本発明の抗体コンストラクト、本発明の方法に従って作製される抗体コンストラクト、本発明の医薬組成物、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター及び／又は本発明の宿主細胞を含むキットを提供する。
本発明に関連して、用語「キット」は、２つ以上の構成要素がコンテナ、容器又は他にまとめて梱包されており、構成要素の１つが本発明の抗体コンストラクト、医薬組成物、ベクター又は宿主細胞に対応するものを意味する。したがって、キットは、単品として販売することができる特定の目的を達成するのに十分な製品及び／又は用具の一式であると説明することができる。
キットは、投与に適した投与量（上記を参照されたい）の本発明の抗体コンストラクト又は医薬組成物を含有する任意の適切な形状、サイズ及び材質（好ましくは防水性、例えばプラスチック又はガラス）の１つ以上の容器（例えば、バイアル、アンプル、コンテナ、シリンジ、ボトル、バッグ）を含み得る。キットは、（例えば、リーフレット又は取扱説明書の形態の）使用のための指示書、本発明の抗体コンストラクトを投与するための手段、例えばシリンジ、ポンプ、インフューザーなど、本発明の抗体コンストラクトを再構成するための手段及び／又は本発明の抗体コンストラクトを希釈するための手段をさらに含み得る。
本発明は、単回用量投与単位のためのキットも提供する。本発明のキットは、乾燥／凍結乾燥された抗体コンストラクトを含む第１の容器及び水性製剤を含む第２の容器も含み得る。本発明のある種の実施形態では、単一チャンバー及び多チャンバー式充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジ及び溶解シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが提供される。
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「試薬」に対する参照は、１つ以上のこのような種々の試薬を含み、「方法」に対する参照は、本明細書に記載される方法のために改変され得るか又は本明細書に記載される方法と置換され得る、当業者に知られる均等な工程及び方法に対する参照を含む。
別段の指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連のあらゆる要素を指すと理解すべきである。当業者であれば、単なる日常的な実験により、本明細に記載した本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識又は確認することができるであろう。このような均等物は、本発明に包含されるものとする。
用語「及び／又は」は、本明細書のいずれの場所で使用される場合でも、「及び」、「又は」及び「前記用語によって接続される要素の全て又は任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
本明細書で使用する場合、用語「約」又は「およそ」は、所与の値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内及びより好ましくは５％以内を意味する。ただし、この用語は、具体的な数字も含み、例えば、約２０は、２０を含む。
用語「〜未満」又は「〜より大きい」は、具体的な数字を含む。例えば、２０未満は、それ未満又はそれに等しいことを意味する。同様に、〜を超える又は〜より大きいは、それぞれ〜を超える若しくはそれに等しい、又は〜より大きい若しくはそれに等しいことを意味する。
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲の全体において、文脈上他の意味が要求されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる」などのバリエーションは、述べられる整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を含むことを意味するが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外することを意味するものではないことを理解されたい。本明細書で使用する場合、用語「含む」は、用語「含有する」若しくは「包含する」又は本明細書で使用する場合にはときに用語「有する」とも置き換えることができる。
本明細書で使用する場合、「〜からなる」は、請求項の要素で特定されていない任意の要素、工程又は成分を除外する。本明細書で使用する場合、「〜から本質的になる」は、請求項の基本的及び新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を除外しない。
本明細書では、各場合において、「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という用語のいずれかを他の２つの用語のいずれかに置き換え得る。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、材料、試薬及び物質などに限定されず、そのようなものとして変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定するように意図されておらず、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ定義される。
本明細書の本文全体において引用されている全ての刊行物及び特許（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、上記であっても下記であっても、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先発明によってこのような開示に先行する権利を有しないことを承認するものとして解釈すべきではない。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾又は一致しない限り、本明細書は、いかなるこのような資料よりも優先される。
本発明及びその利点のより適切な理解が以下の実施例から得られることになるが、本実施例は、例示目的で提供されるにすぎない。本実施例は、決して本発明の範囲を限定するように意図されていない。
実施例１：ＭＵＣ１７の細胞表面発現の評価
ＭＵＣ１７の細胞表面レベルは、ＱＩＦＩｋｉｔ（Ｄａｋｏ）を使用してフローサイトメトリーによって決定された。接着細胞は、非酵素的な細胞解離緩衝液（Ｃｅｌｌｓｔｒｉｐｐｅｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて取り除かれ、続いて抗ＭＵＣ１７抗体４Ｃ１１で染色された。４Ｃ１１抗体は、ＭＵＣ１７のＥＧＦ−ＳＥＡ−ＥＧＦ領域（ａａ ４１３１〜４４９３）を包含するＤＮＡコンストラクトによるＢ６マウスの免疫化から作製されたモノクローナル抗体である。ＭＵＣ１７は、ＦＩＴＣにコンジュゲートされた二次抗体とのインキュベーションにより検出され、フローサイトメトリーにより分析された。相対的な抗体結合能は、標準物質としてキットにおいて提供されたビーズ試料を使用してＱＩＦＩｋｉｔ（Ｄａｋｏ）によって決定された。結果は、図３（Ａ）において示される。癌細胞株中のＭＵＣ１７遺伝子の発現レベルは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒからの方法及びプローブを使用する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって決定された。ＲＮＡが癌細胞株から単離され、続いてｃＤＮＡに転写された。ＭＵＣ１７のｃＤＮＡは、ｑＰＣＲを使用して、ＭＵＣ１７に特異的なプローブで増幅された。ＭＵＣ１７の遺伝子発現レベルは、そのような構成的に発現される遺伝子のレベルに正規化され、図３（Ｂ）に示された。
実施例２：ＭＵＣ１７二重特異性抗体コンストラクトのインビトロ有効性の評価
ＭＵＣ１７ ＨＬＥ抗体コンストラクトの細胞活性は、Ｔ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）アッセイにおいて評価された。エフェクター細胞は、ＡｌｌＣｅｌｌｓ又はＣｅｐｈｅｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．などの商用の供給源から得られた。ヒト汎Ｔ細胞、ヒトＰＢＭＣ又はカニクイザル由来のＰＢＭＣは、ある用量範囲の抗体コンストラクトの存在下でヒト又はカニクイザルのＭＵＣ１７を発現する標的細胞と１０：１又は５：１でインキュベートされた。インキュベーションの４８時間後、細胞傷害性は、発光アッセイ（Ｃｅｌｌ Ｔ−ｇｌｏ又はＳｔｅａｄｙ−ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ））又は細胞傷害性の読み出し情報としてのハイコンテントイメージング（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ）を使用して評価された。結果は、図４及び５において示される。
実施例３：ＭＵＣ１７二重特異性抗体コンストラクトのインビボ有効性を評価する異種移植試験
異種移植試験の目的は、雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるヒト胃癌の進行期皮下ＧＳＵ−ｌｕｃ異種移植モデルの静脈内投与後の半減期延長ＭＵＣ１７／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの抗腫瘍活性を評価することであった。
播種のための標的細胞及びエフェクター細胞の作製
標的細胞：
ホタルルシフェラーゼ（ＧＳＵ−ｌｕｃ）を安定的に発現するためのベクターＬＶ４１７−Ｌｕｃでレンチウイルスにより形質導入されたヒト胃癌腫細胞ＧＳＵは、収集され、遠心分離され、冷ＤＰＢＳで洗浄され、計数され、５×１０７細胞／ｍＬの濃度に調整された。合計５×１０６細胞／マウスは、雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（供給業者：Ｅｎｖｉｇｏ）の右背側側腹部に１００μＬの最終体積で皮下（ＳＣ）注射された。
エフェクター細胞：
ヒトＴ細胞は、健常ドナー（＃０８０１）の新鮮な血液から単離され、汎Ｔ細胞単離キット（＃１３０−０９６−５３５）を使用してＣＤ３＋Ｔ細胞について濃縮され、ヒトＴ細胞活性化／増殖キット（＃１３０−０９１−４４１、両方ともにＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、製造業者の指示書に従って活性化され、増殖された。
注射の日にＴ細胞が計数され、ビーズから単離され、冷ＤＰＢＳで２回洗浄された。細胞数は、１×１０８細胞／ｍＬに調整され、注射まで氷上で保管された。合計２×１０７細胞／マウスが２００μＬの最終体積で腹膜腔（ＩＰ）に注射された。細胞は、注射前に氷上で保管された。実験設計
動物は、ＭＵＣ１７二重特異性抗体コンストラクト又は対照物品を静脈内（ＩＶ）ボーラス注射（尾静脈への）により受容した。マウスは、表４に従って治療された。
試験の順序：
１日目：雌ＮＯＤ／Ｓｃｉｄマウスの右背側側腹部への腫瘍細胞（ＧＳＵ−ｌｕｃ）の皮下注射（上記を参照されたい）。動物は、試験開始時に６週齢であった。
７日目：抗アシアロ処理。
残存するＮＫ細胞／ＮＫ細胞活性を枯渇させるために、マウスをポリクローナル（ウサギ抗マウス）抗アシアロＧＭ１抗体の単回投与により処理した。抗アシアロＧＭ１抗体が製造業者の指示書に従って再構成され、Ｈ２Ｏによる５０μｌの１：２．５希釈物が側方の尾静脈にＩＶ注射される。
８日目：マウスの腹膜腔へのＣＤ３＋Ｔ細胞の注射（上記を参照されたい）。
１１、１８及び２５日目：ＦｃＲ遮断。
試験物品のＦｃ領域を変異させて、Ｆｃγ受容体への結合を妨げた。しかしながら、ＮＯＤ／ＳｃｉｄマウスはＢ細胞を欠いて、低い免疫グロブリンレベルをもたらすため、ＦｃＲ遮断を実施して、抗体依存性細胞性細胞傷害によるＣＤ３＋エフェクター細胞の潜在的な減少を回避した。１１、１８及び２５日目に、マウスは、２．４Ｇ２抗ＦｃγＲ抗体（８ｍｇ／ｋｇ）及びＫｉｏｖｉｇ（４００ｍｇ／ｋｇ）の混合物を、１回の注射につき１マウス当たり２００μｌの最終体積で腹腔内ボーラス注射により受容した。
１２、１９及び２６日目：試験物品又は対照物品による治療（表４を参照されたい）。
動物は、試験物品（ＭＵＣ１７／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクト）又は対照物品（溶媒）を表４に従って１２、１９及び２６日目に側方の尾静脈への静脈内（ＩＶ）ボーラス注射によって受容した。用量体積は、１回の注射につき１マウス当たり合計１００μｌとなるように一定に保たれた。試験される物品は、１０ｍＭのＬ−グルタミン酸、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０中において、ｐＨ４．２、１．０４ｍｇ／ｍｌの原液濃度で製剤化され、溶媒（０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中の２５ｍＭ Ｌ−リジン一塩酸塩、０．００２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０）中において、決定された直近の群平均体重（ＢＷ）に従って希釈された。用量濃度（ｃ）は、次の式を使用して計算された。
３３日目：試験終了
実験的調査及び計算。
試験経過中、全ての動物は、全身の外見、活性、挙動及び生存に関して毎日観察された。全ての発見及び所見は、試験ファイル中の適切なシートに記述された。体重は、試験の経過全体にわたって１週間当たり３回測定された。腫瘍増殖の進行は、外側キャリパーを使用して腫瘍の高さ及び幅の測定によって決定された。腫瘍増殖は、１週間当たり３回測定され、腫瘍体積（ＴＶ）は、式：ＴＶ＝
を使用して計算され、式中、幅は、２つの測定値のうちのより小さいものとして定義され、高さは、より高いものとして定義される。全ての測定された未加工のデータがコンピュータにダウンロードされ、さらなるデータ管理のためにＶＩＶＯ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアに自動的にインポートされた。ＶＩＶＯ計算プログラムによって計算されない値は、ＭＳ Ｅｘｃｅｌスプレッドシートプログラム又はＷｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して計算された。図表の結果は、群平均±平均値の標準誤差として図６において表される。データは、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析され、腫瘍増殖に関する実験結果の相違は、対照群２に対する比較についてダネットの事後検定によって評価された。相対的な腫瘍体積（ＲＴＶ）は、ｎ日目の群平均腫瘍体積を治療開始前日（１１日目）の群平均腫瘍体積で除算することによって計算された。腫瘍増殖の阻害は、対照群における全ての動物が生きていた最後の日である２０日目に関して、次の式に従って定量化された。
結果
ＭＵＣ１７／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクト（試験物品、配列番号１８６）によるＧＳＵ−ｌｕｃ担腫瘍マウスの静脈内治療は、対照群における溶媒治療マウスと比較して、統計学的に有意且つ用量依存的な腫瘍増殖の阻害をもたらした。１２日目の治療開始後、ｐ＜０．０１（０．２５ｍｇ／ｋｇ）又はＰ＜０．００１（２．５ｍｇ／ｋｇ）の値は、１８日目及び２０日目に達成された。対照群における大多数の動物（６／１０）が終了されなければならなかったため、２０日目以降の統計分析は、実施されなかった。２０日目に観察された腫瘍増殖の阻害は、２４％（０．０２５ｍｇ／ｋｇ）、５８％（０．２５ｍｇ／ｋｇ）及び７７％（２．５ｍｇ／ｋｇ）であった。２０日目の相対的な腫瘍体積（ＲＴＶ）の比較は、溶媒治療マウスにおける腫瘍増殖が治療開始前日に対して平均４．２倍大きい体積を有した一方、試験物品で治療された群におけるＲＴＶは、３．４（０．０２５ｍｇ／ｋｇ）、２．４（０．２５ｍｇ／ｋｇ）及び１．０（２．５ｍｇ／ｋｇ）であったことを示す。２．５ｍｇ／ｋｇでの治療後、２９日目までＲＴＶは、＜２．０であった。２つの溶媒治療対照群の比較は、Ｔ細胞が試験物品の非存在下でＧＳＵ−ｌｕｃ細胞の増殖に影響を及ぼさないことを明らかにした。マウスが非該当種であるため、試験物品は、十分に耐容性を示し、薬物に関連する有害事象は、予測も観察もされなかった。要約すると、２．５又は０．２５ｍｇ／ｋｇでの本発明による二重特異性抗体コンストラクト（試験物品、配列番号１８６）の静脈内投与は、雌ＮＯＤ／Ｓｃｉｄマウスにおいて統計学的に有意且つ用量依存的な皮下ＧＳＵ−ｌｕｃ腫瘍の増殖の阻害をもたらした。
実施例４：カニクイザルにおける探索性の毒性試験
ＭＵＣ１７ ＨＬＥ ＢｉＴＥ抗体コンストラクト（配列番号１８６、コンストラクト８−Ｂ７）は、カニクイザルにおける探索性の毒性試験において評価された。３頭のサルに、試験の１日目及び８日目の静脈内注射により、１００μｇ／ｋｇ又は１０００μｇ／ｋｇのいずれかのＭＵＣ１７ ｓｃＦｃ二重特異性抗体コンストラクトを投与した。ＭＵＣ１７ ｓｃＦｃ二重特異性抗体コンストラクト（配列番号１８６）は、両方の用量で十分に耐容性を示し、関連する臨床徴候又は体重の変化を伴わなかった。体温の一過的な上昇が１００μｇ／ｋｇ及び１０００μｇ／ｋｇで記録された。ＭＵＣ１７ ｓｃＦｃ二重特異性抗体コンストラクト活性のいくつかの特徴（リンパ球再分布、好中球及び単球の増加、Ｃ反応性タンパク質の増加、サイトカインの若干の増加）が、ＭＵＣ１７ ｓｃＦｃ二重特異性抗体コンストラクトで治療されたサルの血液試料において観察された。免疫組織化学により、検討中の探索性の毒性学試験において評価されたサルから採取された小腸の粘膜表面上でＭＵＣ１７発現が確認されたが、ＭＵＣ１７を発現する組織における病理組織学的変化はなかった。
カニクイザルにおけるＭＵＣ１７ ｓｃＦｃ二重特異性抗体コンストラクトの毒物動態学的パラメータ
ＭＵＣ１７ ｓｃＦｃ二重特異性抗体コンストラクト（配列番号１８６）の毒物動態学的パラメータは、探索性の毒性試験において評価されたサルから採取された血液試料において評価された。血液試料は、投与前及び各投与の０．０８３、４、８、２４、４８、９６及び１６８時間後に回収された。ＭＵＣ１７ ｓｃＦｃ二重特異性抗体コンストラクトの血清濃度は、その抗体コンストラクトを捕捉するためのＭＵＣ１７に対して向けられるルテニウム化マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ １．３５．１ ｍＡｂ及びそのコンストラクトを検出するためのＦｃ部分に対して向けられる抗体を使用するイムノアッセイによって決定された。ＭＵＣ１７ ｓｃＦｃ二重特異性抗体コンストラクトの血清レベルは、最初の投与後に分析された全ての時点で検出された。データを２コンパートメントモデルにフィットさせた。図８（Ｂ）は、個々のデータ（点）及び平均値（線）を示す。全身クリアランス（ＣＬ）、コンパートメント間クリアランス（Ｑ）、血清体積／中心コンパートメントの体積（Ｖｐ）、組織体積／組織コンパートメントの体積（Ｖｔ）、終末半減期（ｔ１／２）並びに第２の用量１０００ｍｃｇ／ｋｇ用量に関して、平均最大濃度（Ｃｍａｘ）及び血清濃度−時間下面積（ＡＵＣｉｎｆ）を含むいくつかの薬物動態パラメータが評価された。
実施例５：正常腸管細胞におけるＴ細胞依存性細胞傷害アッセイ
ヒト及びカニクイザルの正常腸管細胞の粘膜表面へのＭＵＣ１７の局在化が、ＭＵＣ１７ ｓｃＦｃ二重特異性抗体コンストラクト（配列番号１８６）の細胞傷害活性と隔絶されているという考えをさらに試験するために、ＭＵＣ１７の発現及びＭＵＣ１７ ｓｃＦｃ二重特異性抗体コンストラクトの活性がインビトロの正常細胞において評価される。ＭＵＣ１７の細胞表面発現は、蛍光標識細胞分取によって評価される。ＭＵＣ１７ ｓｃＦｃ二重特異性抗体コンストラクトの細胞傷害活性は、Ｔ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）アッセイにおいて評価され、ここで、ＭＵＣ１７ ｓｃＦｃ二重特異性抗体コンストラクトは、ＭＵＣ１７陽性標的細胞及びヒト又はサルのエフェクター細胞（すなわちＴ細胞又は末梢血単核球）とインキュベートされ、続いて細胞の生存率が評価される。これらの実験は、標準的な二次元細胞培養を使用して最初に試験される。しかしながら、粘膜表面へのＭＵＣ１７の局在化をより良好に観察するために、正常細胞は、細胞外マトリックス上又はオルガノイド培養中での増殖などの上皮細胞の極性を維持する方法で培養される。ＭＵＣ１７ ｓｃＦｃ二重特異性抗体コンストラクトは、正常、すなわち非癌腸管細胞に関してＴＤＣＣの有意な増加を示さなかった。

Claims (40)

  1. 二重特異性抗体コンストラクトであって、
    ・ＭＵＣ１７に結合する第１のドメイン、及び
    ・ヒト及びマカクＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープに結合する第２のドメイン
    を含む二重特異性抗体コンストラクト。
  2. ２つのポリペプチド単量体であって、それぞれヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド単量体を含む第３のドメインであって、前記２つのポリペプチド単量体は、ペプチドリンカーを介して互いに融合される、第３のドメインをさらに含む、請求項１に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  3. 一本鎖抗体コンストラクトである、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  4. 前記第３のドメインは、アミノからカルボキシルの順に、
    ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３
    を含む、請求項２又は３に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  5. 前記第３のドメインにおける前記ポリペプチド単量体の各々は、配列番号１７〜２４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  6. 前記ポリペプチド単量体の各々は、配列番号１７〜２４から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  7. 前記ＣＨ２ドメインは、ドメイン内システインジスルフィド架橋を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  8. （ｉ）前記第１のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含み、且つ前記第２のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含むか；
    （ｉｉ）前記第１のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含み、且つ前記第２のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含むか；
    （ｉｉｉ）前記第１のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含み、且つ前記第２のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含むか；又は
    （ｉｖ）前記第１のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含み、且つ前記第２のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  9. 前記第１のドメイン及び第２のドメインは、ペプチドリンカーを介して前記第３のドメインに融合される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  10. アミノからカルボキシルの順に、
    （ａ）前記第１のドメイン；
    （ｂ）好ましくは配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
    （ｃ）前記第２のドメイン
    を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  11. アミノからカルボキシルの順に、
    （ｄ）配列番号１、２、３、９、１０、１１及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
    （ｅ）前記第３のドメインの第１のポリペプチド単量体；
    （ｆ）配列番号５、６、７及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；及び
    （ｇ）前記第３のドメインの第２のポリペプチド単量体
    をさらに含む、請求項１０に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  12. 前記抗体コンストラクトの前記第１のドメインは、配列番号５２８（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４１７１〜４２９６）に対応するＭＵＣ１７内のエピトープに結合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  13. 前記抗体コンストラクトの前記第１のドメインは、配列番号５２９（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４１８９〜４２９１）に対応するＭＵＣ１７内のエピトープに結合する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  14. 前記抗体コンストラクトの前記第１のドメインは、配列番号５３０（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４１３１〜４２４３）に対応するＭＵＣ１７内のエピトープに結合する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  15. 前記抗体コンストラクトの前記第１のドメインは、配列番号５３１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４２４４〜４３８９）に対応するＭＵＣ１７内のエピトープに結合する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  16. 前記抗体コンストラクトの前記第１のドメインは、配列番号５３０（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４１３１〜４２４３）に対応するＭＵＣ１７内のエピトープに結合するが、配列番号５３１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４２４４〜４３８９）に対応するＭＵＣ１７内のエピトープに結合しない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  17. 前記抗体コンストラクトの前記第１のドメインは、配列番号５３２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４１７１〜４３９０）又は配列番号５３３（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４１８４〜４３９０）に対応するＭＵＣ１７内のエピトープに結合するが、配列番号５３４（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４２９１〜４３９０）に対応するＭＵＣ１７内のエピトープ又は配列番号５３５（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６８５Ｊ３付番に従うａａ ４３４１〜４３９０）に対応するＭＵＣ１７内のエピトープに結合しない、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  18. 細胞傷害性と結合親和性との間の比率（ＥＣ５０／ＫＤ）＊１０００は、２５０未満であり、前記細胞傷害性は、標的細胞としてのＮＵＧＣ−４細胞及びエフェクター細胞としてのｈｕＰＢＭＣにおいて決定され、前記結合親和性は、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイによって決定される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  19. 細胞傷害性と結合親和性との間の比率（ＥＣ５０／ＫＤ）＊１０００は、１２５未満であり、前記細胞傷害性は、標的細胞としてのＮＵＧＣ−４細胞及びエフェクター細胞としてのｈｕＰＢＭＣにおいて決定され、前記結合親和性は、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイによって決定される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  20. 細胞傷害性と結合親和性との間の比率（ＥＣ５０／ＫＤ）＊１０００は、２１未満であり、前記細胞傷害性は、標的細胞としてのＮＵＧＣ−４細胞及びエフェクター細胞としてのｈｕＰＢＭＣにおいて決定され、前記結合親和性は、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイによって決定される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  21. 前記第１の結合ドメインは、
    （ａ）配列番号３３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｂ）配列番号４４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｃ）配列番号５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号５７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｄ）配列番号６６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号６８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｅ）配列番号７７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号７９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｆ）配列番号８８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号９０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｇ）配列番号９９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１００に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１０１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｈ）配列番号１１０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１１１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１１２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｉ）配列番号１２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１２３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｊ）配列番号１３２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１３４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｋ）配列番号１４３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１４４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１４５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｌ）配列番号１５４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｍ）配列番号１６５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１６７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｎ）配列番号１７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１７８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｏ）配列番号１８７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１８８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１８９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｐ）配列番号１９８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１９９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２００に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｑ）配列番号２０９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２１０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２１１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｒ）配列番号２２０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｓ）配列番号２３１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２３２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２３３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｔ）配列番号２４２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２４３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２４４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｕ）配列番号２５３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２５４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｖ）配列番号２６４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２６５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２６６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｗ）配列番号２７５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｘ）配列番号２８６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２８７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２８８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｙ）配列番号２９７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２９８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号２９９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｚ）配列番号３０８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３０９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３１０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａａ）配列番号３１９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３２０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａｂ）配列番号３３０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３３１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３３２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａｃ）配列番号３４１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３４２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３４３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａｄ）配列番号３５２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３５３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３５４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａｅ）配列番号３６３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３６４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３６５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａｆ）配列番号３７４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３７５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａｇ）配列番号３８５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３８６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａｈ）配列番号３９６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３９７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３９８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａｉ）配列番号４０７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４０８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４０９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａｊ）配列番号４１８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４１９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４２０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａｋ）配列番号４２９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４３０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４３１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａｌ）配列番号４４０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４４２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａｍ）配列番号４５１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４５２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４５３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａｎ）配列番号４６２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４６３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４６４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａｏ）配列番号４７３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４７４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４７５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａｐ）配列番号４８４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４８５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４８６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａｑ）配列番号４９５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４９６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４９７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａｒ）配列番号５０６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５０７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号５０８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；及び
    （ａｓ）配列番号５１７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５１８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号５１９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３
    から選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ領域を含み；
    （ｃ）配列番号５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号５７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ｎ）配列番号１７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１７８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；
    （ａｃ）配列番号３４１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３４２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号３４３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３；及び
    （ａｊ）配列番号４１８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４１９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号４２０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｈ３
    が好ましい、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  22. 前記第１の結合ドメインは、
    （ａ）配列番号３６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｂ）配列番号４７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｃ）配列番号５８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号６０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｄ）配列番号６９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号７０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号７１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｅ）配列番号８０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号８２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｆ）配列番号９１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号９３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｇ）配列番号１０２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１０３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１０４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｈ）配列番号１１３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１１５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｉ）配列番号１２４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１２６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｊ）配列番号１３５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１３７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｋ）配列番号１４６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１４７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１４８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｌ）配列番号１５７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１５９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｍ）配列番号１６８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１７０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｎ）配列番号１７９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１８０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１８１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｏ）配列番号１９０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１９１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１９２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｐ）配列番号２０１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２０２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２０３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｑ）配列番号２１２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２１３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２１４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｒ）配列番号２２３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２２４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２２５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｓ）配列番号２３４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２３５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２３６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｔ）配列番号２４５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２４６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２４７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｕ）配列番号２５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２５７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２５８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｖ）配列番号２６７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２６８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２６９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｗ）配列番号２７８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２７９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２８０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｘ）配列番号２８９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２９０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号２９１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｙ）配列番号３００に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３０１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３０２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｚ）配列番号３１１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３１２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３１３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａａ）配列番号３２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３２３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３２４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａｂ）配列番号３３３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３３５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａｃ）配列番号３４４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３４５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３４６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａｄ）配列番号３５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３５７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａｅ）配列番号３６６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３６７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３６８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａｆ）配列番号３７７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３７８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３７９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａｇ）配列番号３８８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３９０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａｈ）配列番号３９９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４００に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４０１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａｉ）配列番号４１０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４１１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４１２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａｊ）配列番号４２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４２３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａｋ）配列番号４３２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４３３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４３４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａｌ）配列番号４４３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４４４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４４５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａｍ）配列番号４５４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４５５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４５６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａｎ）配列番号４６５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４６７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａｏ）配列番号４７６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４７７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４７８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａｐ）配列番号４８７に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４８８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４８９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａｑ）配列番号４９８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４９９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号５００に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａｒ）配列番号５０９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５１０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号５１１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；及び
    （ａｓ）配列番号５２０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号５２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３
    から選択されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ領域を含み；
    （ｃ）配列番号５８に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号６０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ｎ）配列番号１７９に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１８０に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号１８１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；
    （ａｃ）配列番号３４４に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３４５に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号３４６に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３；及び
    （ａｊ）配列番号４２１に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４２２に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号４２３に示されるとおりのＣＤＲ−Ｌ３
    が好ましい、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  23. 前記第１の結合ドメインは、
    （ａ）配列番号４０に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３９に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｂ）配列番号５１に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号５０に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｃ）配列番号６２に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号６１に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｄ）配列番号７３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号７２に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｅ）配列番号８４に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号８３に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｆ）配列番号９５に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号９４に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｇ）配列番号１０６に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１０５に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｈ）配列番号１１７に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１１６に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｉ）配列番号１２８に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１２７に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｊ）配列番号１３９に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１３８に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｋ）配列番号１５０に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１４９に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｌ）配列番号１６１に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１６０に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｍ）配列番号１７２に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１７１に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｎ）配列番号１８３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１８２に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｏ）配列番号１９４に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１９３に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｐ）配列番号２０５に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２０４に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｑ）配列番号２１６に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２１５に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｒ）配列番号２２７に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２２６に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｓ）配列番号２３８に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２３７に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｔ）配列番号２４９に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２４８に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｕ）配列番号２６０に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２５９に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｖ）配列番号２７１に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２７０に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｗ）配列番号２８２に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２８１に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｘ）配列番号２９３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号２９２に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｙ）配列番号３０４に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３０３に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ｚ）配列番号３１５に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３１４に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ａａ）配列番号３２６に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３２５に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ａｂ）配列番号３３７に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３３６に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ａｃ）配列番号３４８に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３４７に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ａｄ）配列番号３５９に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３５８に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ａｅ）配列番号３７０に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３６９に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ａｆ）配列番号３８１に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３８０に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ａｇ）配列番号３９２に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３９１に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ａｈ）配列番号４０３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４０２に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ａｉ）配列番号４１４に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４１３に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ａｊ）配列番号４２５に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４２４に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ａｋ）配列番号４３６に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４３５に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ａｌ）配列番号４４７に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４４６に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ａｍ）配列番号４５８に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４５７に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ａｎ）配列番号４６９に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４６８に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ａｏ）配列番号４８０に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４７９に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ａｐ）配列番号４９１に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４９０に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ａｑ）配列番号５０２に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号５０１に示されるとおりのＶＨ領域；
    （ａｒ）配列番号５１３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号５１２に示されるとおりのＶＨ領域；及び
    （ａｓ）配列番号５２４に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号５２３に示されるとおりのＶＨ領域
    からなる群から選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  24. 配列番号４１、５２、６３、７４、８５、９６、１０７、１１８、１２９、１４０、１５１、１６２、１７３、１８４、１９５、２０６、２１７、２２８、２３９、２５０、２６１、２７２、２８３、２９４、３０５、３１６、３２７、３３８、３４９、３６０、３７１、３８２、３９３、４０４、４１５、４２６、４３７、４４８、４５９、４７０、４８１、４９２、５０３、５１４及び５２５のいずれかに示されるとおりのアミノ酸配列から選択される配列を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  25. アミノからカルボキシルの順に、
    （ａ）配列番号４１、５２、６３、７４、８５、９６、１０７、１１８、１２９、１４０、１５１、１６２、１７３、１８４、１９５、２０６、２１７、２２８、２３９、２５０、２６１、２７２、２８３、２９４、３０５、３１６、３２７、３３８、３４９、３６０、３７１、３８２、３９３、４０４、４１５、４２６、４３７、４４８、４５９、４７０、４８１、４９２、５０３、５１４及び５２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する前記第１のドメイン；
    （ｂ）配列番号１〜３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
    （ｃ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５若しくは１８７からなる群から選択されるか又は配列番号１５において示されるとおりのアミノ酸配列を有する前記第２のドメイン
    を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  26. アミノからカルボキシルの順に、
    （ｄ）配列番号１、２、３、９、１０、１１及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
    （ｅ）配列番号１７〜２４からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する前記第３のドメインの前記第１のポリペプチド単量体；
    （ｆ）配列番号５、６、７及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；及び
    （ｇ）配列番号１７〜２４からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する前記第３のドメインの前記第２のポリペプチド単量体
    をさらに含む、請求項２５に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  27. 配列番号４２、４３、５３、５４、６４、６５、７５、７６、８６、８７、９７、９８、１０８、１０９、１１９、１２０、１３０、１３１、１４１、１４２、１５２、１５３、１６３、１６４、１７４、１７５、１８５、１８６、１９６、１９７、２０７、２０８、２１８、２１９、２２９、２３０、２４０、２４１、２５１、２５２、２６２、２６３、２７３、２７４、２８４、２８５、２９５、２９６、３０６、３０７、３１７、３１８、３２８、３２９、３３９、３４０、３５０、３５１、３６１、３６２、３７２、３７３、３８３、３８４、３９４、３９５、４０５、４０６、４１６、４１７、４２７、４２８、４３８、４３９、４４９、４５０、４６０、４６１、４７１、４７２、４８２、４８３、４９３、４９４、５０４、５０５、５１５、５１６、５２６及び５２７からなる群から選択されるか又は前記配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト。
  28. 請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体コンストラクトをコードするポリヌクレオチド。
  29. 請求項２８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  30. 請求項２８に記載のポリヌクレオチド又は請求項２９に記載のベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞。
  31. 請求項１〜２７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクトの作製のための方法であって、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体コンストラクトの発現を可能にする条件下で請求項３０に記載の宿主細胞を培養することと、前記産生された抗体コンストラクトを培養物から回収することとを含む方法。
  32. 請求項１〜２７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト又は請求項３１に記載の方法に従って作製される二重特異性抗体コンストラクトを含む医薬組成物。
  33. 約−２０℃で少なくとも４週間にわたって安定である、請求項３２に記載の医薬組成物。
  34. 増殖性疾患、腫瘍性疾患、癌又は免疫障害から選択される疾患の予防、治療又は改善における使用のための、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト又は請求項３１の方法に従って作製される二重特異性抗体コンストラクト。
  35. 前記疾患は、胃腸癌又は膵臓癌である、請求項３４に記載の使用のための二重特異性抗体コンストラクト。
  36. 前記疾患は、胃癌である、請求項３４に記載の使用のための二重特異性抗体コンストラクト。
  37. 増殖性疾患、腫瘍性疾患、癌又は免疫障害の治療又は改善のための方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト又は請求項３１に記載の方法に従って作製される二重特異性抗体コンストラクトを投与する工程を含み、前記疾患は、好ましくは、胃腸癌又は膵臓癌、最も好ましくは胃癌である、方法。
  38. 請求項１〜２７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体コンストラクト若しくは請求項３１に記載の方法に従って作製される二重特異性抗体コンストラクト、請求項２８に記載のポリヌクレオチド、請求項２９に記載のベクター及び／又は請求項３０に記載の宿主細胞を含むキット
  39. 胃腸癌の治療又は改善のための方法であって、それを必要とする対象に、ＭＵＣ１７及びＣＤ３に対して向けられる二重特異性抗体コンストラクトを投与する工程を含む方法。
  40. 胃腸癌の治療又は改善における使用のための、ＭＵＣ１７及びＣＤ３に向けられる二重特異性抗体コンストラクト。
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