JP2017536134A - 重鎖抗体の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物 - Google Patents

重鎖抗体の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物 Download PDF

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Abstract

本発明は、トランスジェニック植物または植物組織に関する。特に、本発明は、菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合する、重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）をコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞に関する。好都合に、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部におけるポリヌクレオチドの発現が、（ｉ）植物病原性菌類による感染からトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護する、（ｉｉ）トランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原性菌類の増殖を阻害する、または（ｉｉｉ）植物病原性菌類に対するトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の抵抗性を増加させる。本発明はまた、植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原体の増殖を阻害するための、または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための方法であって、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において病原体に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法にも関する。

Description

本発明は、トランスジェニック植物の分野に関する。特に、本発明は、菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合する、重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）をコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞に関する。本発明は、植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原体の増殖を阻害するための、または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための方法であって、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において病原体に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法にさらに関する。
効率的な農業に必要とされる作物の保護は、殺虫剤の使用に強く依存しており、これらは、作物にそれらをスプレーすることによって、作物の灌水の間に適用することによって、または土の中にそれらを組み込むことによって、作物に適用される。殺虫剤は、多くの場合、有機化学分子であり、作物へのそれらの繰り返しの適用は、スプレードリフト、土中の残留、または地表水もしくは地下水の中に流れ落ちるために、取り扱いの間に農業労働者も環境も毒性の脅威にさらしてしまう。ヒトおよび環境にそれほど毒性ではないが、同時に植物有害生物の効率的なコントロールをもたらす、代替の化合物を使用することができることは有利であろう。ある植物有害生物標的に対して特異性を有するタンパク質性殺虫剤は、それらが環境において短命であり、それほど毒性ではない非特異的な効果を有することが期待されるので、この点で非常に有利であるかもしれない。しかしながら、知られているタンパク質性またはペプチド性殺虫剤はほんの少数である。いくつかの例は、Ｂｔ毒素、レクチン、デフェンシン、ファバチン、タキプレシン、マガイニン、ハーピン（国際公開第２０１００１９４４２号パンフレットを参照）、エンドウマメアルブミン１−サブユニットｂ（ＰＡ１ｂ）である。しかしながら、これらのタンパク質性殺虫剤は、いくつかのジスルフィド架橋によって安定化された、コンパクトな構造を有する小さなペプチドであるまたは結晶形態で存在する、より大きなタンパク質（＞３００アミノ酸）である（ｃｒｙ毒素）。生物製剤、特にタンパク質は、それらが、一般に、農薬製剤中で、特に田畑での適用のために殺虫性機能を維持するための安定性が低すぎるので、殺虫剤の開発には難しい構造をしていることが農業の分野において実際に知られている。
国際公開第２０１０／０１９４４２号
本発明者らは、植物または作物有害生物、特に、植物病原性菌類などのような植物病原体の標的に対して、驚くほど高度な特異性、親和性、および効力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物の開発に成功した。さらに、これらのポリペプチドが、ｉｎ ｐｌａｎｔａ発現の際にそれらの完全性、安定性、および活性を保持することがならびに効果的な有害生物または病原体のコントロールを驚くほど達成することができることが示される。
本発明者らは、トランスジェニック植物の少なくとも一部におけるポリヌクレオチドの発現（つまりポリヌクレオチドのｉｎ ｐｌａｎｔａ発現）が、植物病原性菌類による感染または他の生物学的相互作用からトランスジェニック植物の少なくとも一部を保護する、ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物を実現した。
よって、本発明の第１の態様は、菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合する、重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）をコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞に関する。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、本明細書において教示されるＶＨＨが、菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合する。ある実施形態では、本明細書において教示されるＶＨＨが、菌類のセラミドに特異的に結合する。ある実施形態では、本明細書において教示されるＶＨＨが、菌類のスフィンゴ糖脂質に特異的に結合する。ある実施形態では、本明細書において教示されるＶＨＨが、菌類のセレブロシドに特異的に結合する。ある好ましい実施形態では、本明細書において教示されるＶＨＨが、菌類のグルコセレブロシドに特異的に結合する。
本発明者らは、本明細書において教示されるＶＨＨが、菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合し、かつ植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に結合することを見出した。
よって、ある実施形態では、本発明が、菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは菌類のセラミドに、好ましくは菌類のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは菌類のグルコセレブロシドに特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞であって、ＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原性菌類のセラミドに、好ましくは植物病原性菌類のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原性菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原性菌類のグルコセレブロシドに結合する、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞に関する。
ある実施形態では、本発明が、菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞であって、ＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原性菌類のセラミドに、好ましくは植物病原性菌類のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原性菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原性菌類のグルコセレブロシドに結合する、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞に関する。
ある実施形態では、本発明が、菌類のセラミドに特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞であって、ＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原性菌類のセラミドに、好ましくは植物病原性菌類のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原性菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原性菌類のグルコセレブロシドに結合する、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞に関する。
ある実施形態では、本発明が、菌類のスフィンゴ糖脂質に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞であって、ＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原性菌類のセラミドに、好ましくは植物病原性菌類のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原性菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原性菌類のグルコセレブロシドに結合する、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞に関する。
ある実施形態では、本発明が、菌類のセレブロシドに特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞であって、ＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原性菌類のセラミドに、好ましくは植物病原性菌類のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原性菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原性菌類のグルコセレブロシドに結合する、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞に関する。
ある実施形態では、本発明が、菌類のグルコセレブロシドに特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞であって、ＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原性菌類のセラミドに、好ましくは植物病原性菌類のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原性菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原性菌類のグルコセレブロシドに結合する、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞に関する。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、本明細書において教示されるＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に結合する。ある実施形態では、本明細書において教示されるＶＨＨが、植物病原性菌類のセラミドに結合する。ある実施形態では、本明細書において教示されるＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ糖脂質に特異的に結合する。ある実施形態では、本明細書において教示されるＶＨＨが、植物病原性菌類のセレブロシドに特異的に結合する。ある好ましい実施形態では、本明細書において教示されるＶＨＨが、植物病原性菌類のグルコセレブロシドに特異的に結合する。
ある実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、非修飾（すなわち、野生型などのように形質転換されていないまたは非形質転換）植物または植物組織に比べて（すなわち比較して）、本明細書において教示されるＶＨＨのレベルが増加または増強していてもよい。
ある実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞において、特にトランスジェニック植物または植物組織の抽出物において、全可溶性タンパク質の量の少なくとも０，００１％の、本明細書において教示されるＶＨＨのレベルを有していてもよい。たとえば、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞において、特にトランスジェニック植物または植物組織の抽出物において、全可溶性タンパク質の量の少なくとも０，００５％、少なくとも０，０１％、少なくとも０，０５％、少なくとも０，１％、少なくとも０，２％、少なくとも０，３％、少なくとも０，４％、または少なくとも０，５％の、本明細書において教示されるＶＨＨのレベルを有していてもよい。
ある実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部におけるポリヌクレオチドの発現が、植物病原性菌類による感染からトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部を保護してもよい。たとえば、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部におけるポリヌクレオチドの発現が、非修飾（すなわち、野生型などのように形質転換されていないまたは非形質転換）植物または植物組織に比べて（すなわち比較して）、植物病原性菌類による感染からトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部を保護してもよい。
ある実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部におけるポリヌクレオチドの発現が、トランスジェニック植物または植物組織の少なくとも一部での植物病原性菌類の増殖を阻害してもよい。たとえば、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部におけるポリヌクレオチドの発現が、非修飾（すなわち、野生型などのように形質転換されていないまたは非形質転換）植物または植物組織での植物病原性菌類の増殖に比べて（すなわち比較して）、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部での植物病原性菌類の増殖を阻害してもよい。
ある実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部におけるポリヌクレオチドの発現が、植物病原性菌類に対するトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部の抵抗性を増加させる。たとえば、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部におけるポリヌクレオチドの発現が、植物病原性菌類に対する、非修飾（すなわち、野生型などのように形質転換されていないまたは非形質転換）植物または植物組織または植物細胞の抵抗性に比べて（すなわち比較して）、植物病原性菌類に対するトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部の抵抗性を増加させる。
ある実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部におけるポリヌクレオチドの発現が、植物病原性菌類による感染からトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護してもよい、トランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原性菌類の増殖を阻害してもよい、および／または植物病原性菌類に対するトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の抵抗性を増加させてもよい。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーター、植物組織もしくは植物細胞に特異的なプロモーター、または誘導性のプロモーターなどのような、植物における発現に適したプロモーターを含んでいてもよい。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、分泌のための、細胞質への配置のための、またはＥＲ内腔、アポプラスト、液胞、または内膜および／もしくは外膜などのような細胞コンパートメントまたは細胞小器官への配置のための、標的シグナルをコードする少なくとも１つの配列を含んでいてもよい。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、タグ、好ましくはＨｉｓ６、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｃ−ｔａｇ、３×ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ５、Ｈｉｓ１０、ＨＡ、Ｔ７、ｓｔｒｅｐ、ＨＳＶ、および／またはＥ−ｔａｇをコードする少なくとも１つの配列を含んでいてもよい。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、ＶＨＨそれ自体を、１つもしくは複数の同一のもしくは異なるＶＨＨとの組み合わせとしてまたは抗体の結晶化可能領域（Ｆｃ領域）との１つもしくは複数の同一のもしくは異なるＶＨＨの組み合わせとして、任意選択によりスペーサーと共にコードしてもよい。
ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、ＶＨＨそれ自体を、任意選択によりスペーサーと共にコードしてもよい。ある他の実施形態では、ポリヌクレオチドが、２またはそれ以上などのような１つまたは複数の同一のまたは異なるＶＨＨの組み合わせとして、任意選択によりスペーサーと共にＶＨＨをコードしてもよい。ある他の実施形態では、ポリヌクレオチドが、抗体の結晶化可能領域（Ｆｃ領域）との２またはそれ以上などのような１つまたは複数の同一のまたは異なるＶＨＨの組み合わせとして、任意選択によりスペーサーと共にＶＨＨをコードしてもよい。そのようなスペーサーは、２つのＶＨＨに両者の間で好都合に空間的に広がりをもたせ、それによって、互いにＶＨＨの可動性を増強するならびに／またはそれぞれのＶＨＨおよびその抗原の間の最適な相互作用を保証する。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、植物は、コーン、イネ、コムギ、オオムギ、ソルガム、キビ、カラスムギ、ライムギ、ライコムギ、または他の穀類、ダイズ、アルファルファ、または他のマメ科作物、サトウダイコン、飼料ビート、パパイア、バナナ、およびオプランテン（ｐｌａｎｔａｉｎ）、または他の果実、ブドウ、ナッツ、ナタネ、ヒマワリ、または他の油料作物、カボチャ、キュウリ、メロン、または他のウリ科の植物、ワタまたは他の繊維植物、サトウキビ、ヤシ、ジャトロファ、または他の燃料作物、キャベツ、トマト、コショウ、または他の植物、観賞植物、シラブ、ポプラ、ユーカリ、または他の木、常緑樹、草、コーヒーノキ、チャノキ、タバコ、ホップ、ゴムの木、ならびにラテックス植物からなる群から選択される植物であってもよい。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、
（ｉ）任意の１つもしくは複数の配列番号１〜８４、好ましくは配列番号１、２、および／もしくは７０、より好ましくは配列番号１および／もしくは２、ならびに／または
（ｉｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域、ここで、（ｉ）ＣＤＲ１領域が、配列番号８５〜１６８の群から選択されるおよび／または（ｉｉ）ＣＤＲ２領域が、配列番号１６９〜２５２の群から選択されるおよび／または（ｉｉｉ）ＣＤＲ３領域が、配列番号２５３〜３３５の群から選択されるもしくはＣＤＲ３領域が、アミノ酸配列ＮＲＹを有する、を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよい。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、任意の１つまたは複数の配列番号１〜８４、好ましくは配列番号１および／または２を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよい。ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号７０を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよい。ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１および／または配列番号２を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよい。ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよい。ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号２を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよい。ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号７０を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよい。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよく、ここで、（ｉ）ＣＤＲ１領域が、配列番号８５〜１６８の群から選択されるおよび／または（ｉｉ）ＣＤＲ２領域が、配列番号１６９〜２５２の群から選択されるおよび／または（ｉｉｉ）ＣＤＲ３領域が、配列番号２５３〜３３５の群から選択されるもしくはＣＤＲ３領域が、アミノ酸配列ＮＲＹを有する。
ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよく、ここで、（ｉ）ＣＤＲ１領域が、配列番号８５および／もしくは８６から選択されるならびに／または（ｉｉ）ＣＤＲ２領域が、配列番号１６９および／もしくは１７０から選択されるならびに／または（ｉｉｉ）ＣＤＲ３領域が、配列番号２５３および／もしくは２５４から選択される。ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよく、ここで、（ｉ）ＣＤＲ１領域が、配列番号８５であるおよび／または（ｉｉ）ＣＤＲ２領域が、配列番号１６９であるおよび／または（ｉｉｉ）ＣＤＲ３領域が、配列番号２５３である。ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよく、ここで、（ｉ）ＣＤＲ１領域が、配列番号８６であるおよび／または（ｉｉ）ＣＤＲ２領域が、配列番号１７０であるおよび／または（ｉｉｉ）ＣＤＲ３領域が、配列番号２５４である。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）ならびに３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含む、からなる、またはから本質的になるＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよく、ここで、（ｉ）ＣＤＲ１領域が、配列番号８５〜１６８の群から選択されるおよび／または（ｉｉ）ＣＤＲ２領域が、配列番号１６９〜２５２の群から選択されるおよび／または（ｉｉｉ）ＣＤＲ３領域が、配列番号２５３〜３３５の群から選択されるもしくはＣＤＲ３領域が、アミノ酸配列ＮＲＹを有する。
ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、４つのフレームワーク領域ならびに３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよく、ここで、（ｉ）ＣＤＲ１領域が、配列番号８５および／もしくは８６から選択されるならびに／または（ｉｉ）ＣＤＲ２領域が、配列番号１６９および／もしくは１７０から選択されるならびに／または（ｉｉｉ）ＣＤＲ３領域が、配列番号２５３および／もしくは２５４から選択される。ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、４つのフレームワーク領域ならびに３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよく、ここで、（ｉ）ＣＤＲ１領域が、配列番号８５であるおよび／または（ｉｉ）ＣＤＲ２領域が、配列番号１６９であるおよび／または（ｉｉｉ）ＣＤＲ３領域が、配列番号２５３である。ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、４つのフレームワーク領域ならびに３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよく、ここで、（ｉ）ＣＤＲ１領域が、配列番号８６であるおよび／または（ｉｉ）ＣＤＲ２領域が、配列番号１７０であるおよび／または（ｉｉｉ）ＣＤＲ３領域が、配列番号２５４である。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、
配列番号８５を有するＣＤＲ１領域、配列番号１６９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号８６を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号８７を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号８８を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号８９を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９０を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９１を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９２を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９３を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９４を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９５を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９６を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９７を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９８を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９９を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１００を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０１を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０２を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０３を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０４を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０５を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０６を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０７を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０８を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０９を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１０を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１１を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１２を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１３を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１４を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１５を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１６を有するＣＤＲ１領域、配列番号２００を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１７を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１８を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１９を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２０を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２１を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２２を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２３を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２４を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２５を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２６を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２７を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２８を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２９を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３０を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３１を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３２を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３００を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３３を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３４を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３５を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３６を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３７を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３８を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３９を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２３を有するＣＤＲ２領域、およびアミノ酸配列ＮＲＹを有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４０を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４１を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４２を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４３を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４４を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４５を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４６を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４７を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４８を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４９を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５０を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５１を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５２を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５３を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５４を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５５を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５６を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５７を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５８を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５９を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６０を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６１を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６２を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６３を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３３０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６４を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３３１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６５を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３３２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６６を有するＣＤＲ１領域、配列番号２５０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３３３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６７を有するＣＤＲ１領域、配列番号２５１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３３４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６８を有するＣＤＲ１領域、配列番号２５２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３３５を有するＣＤＲ３領域
を含むリストから選ばれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよい。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、
配列番号８５を有するＣＤＲ１領域、配列番号１６９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号８６を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５４を有するＣＤＲ３領域
を含むリストから選ばれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよい。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号８５を有するＣＤＲ１領域、配列番号１６９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５３を有するＣＤＲ３領域を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよい。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号８６を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５４を有するＣＤＲ３領域を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよい。
さらなる態様は、本明細書において定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、本明細書において定義されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の収穫部分および繁殖材料に関する。したがって、さらなる態様は、菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは菌類のセラミドに、好ましくは菌類のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは菌類のグルコセレブロシドに特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、本明細書において定義されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の収穫部分および繁殖材料を提供する。ある実施形態では、ＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原性菌類のセラミドに、好ましくは植物病原性菌類のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原性菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原性菌類のグルコセレブロシドに結合する。
ある実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の収穫部分および繁殖材料が、種子、果実、穀粒、鱗茎、朔果（ｂｏｌｌ）、塊茎、子孫、およびハイブリッドからなる群から選択される。
さらなる態様は、本明細書において定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、本明細書において定義されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の抽出物に関し、前記抽出物が、前記ＶＨＨを含む。したがって、さらなる態様は、菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは菌類のセラミドに、好ましくは菌類のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは菌類のグルコセレブロシドに特異的に結合する少なくとも１つのＶＨＨを含む、本明細書において定義されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の抽出物を提供する。ある実施形態では、ＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原性菌類のセラミドに、好ましくは植物病原性菌類のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原性菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原性菌類のグルコセレブロシドに結合する。
さらなる態様は、本明細書において定義されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の抽出物を含む組成物に関する。したがって、さらなる態様は、菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは菌類のセラミドに、好ましくは菌類のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは菌類のグルコセレブロシドに特異的に結合する少なくとも１つのＶＨＨを含む、本明細書において定義されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の抽出物を含む組成物を提供する。ある実施形態では、ＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原性菌類のセラミドに、好ましくは植物病原性菌類のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原性菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原性菌類のグルコセレブロシドに結合する。
さらなる態様は、植物または植物組織のゲノムの中への本明細書において定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドの導入を含む、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の産生のための方法に関する。よって、さらなる態様は、植物または植物組織のゲノムの中への菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドの導入を含む、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の産生のための方法を提供する。ある実施形態では、本発明が、植物または植物組織のゲノムの中への菌類のセラミドに特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドの導入を含む、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の産生のための方法に関する。ある実施形態では、本発明が、植物または植物組織のゲノムの中への菌類のスフィンゴ糖脂質に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドの導入を含む、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の産生のための方法に関する。ある実施形態では、本発明が、植物または植物組織のゲノムの中への菌類のセレブロシドに特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドの導入を含む、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の産生のための方法に関する。ある実施形態では、本発明が、植物または植物組織のゲノムの中への菌類のグルコセレブロシドに特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドの導入を含む、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の産生のための方法に関する。ある実施形態では、ＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原性菌類のセラミドに、好ましくは植物病原性菌類のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原性菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原性菌類のグルコセレブロシドに結合する。
さらなる態様は、トランスジェニック植物または植物組織の産生のための、本明細書において定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用に関する。さらなる態様は、したがって、トランスジェニック植物または植物組織の産生のための、菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用を提供する。ある実施形態では、本発明が、トランスジェニック植物または植物組織の産生のための、菌類のセラミドに特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用に関する。ある実施形態では、本発明が、トランスジェニック植物または植物組織の産生のための、菌類のスフィンゴ糖脂質に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用に関する。ある実施形態では、本発明が、トランスジェニック植物または植物組織の産生のための、菌類のセレブロシドに特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用に関する。ある実施形態では、本発明が、トランスジェニック植物または植物組織の産生のための、菌類のグルコセレブロシドに特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用に関する。ある実施形態では、ＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原性菌類のセラミドに、好ましくは植物病原性菌類のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原性菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原性菌類のグルコセレブロシドに結合する。
本発明者らは、トランスジェニック植物の少なくとも一部において産生される（たとえば、病原体に特異的に結合するＶＨＨをコードするポリヌクレオチドのｉｎ ｐｌａｎｔａ発現）、病原体に特異的に結合する（および植物病原体に結合する）ＶＨＨが、植物病原体に対する、本質的に抗菌効果、特に、静菌効果を有することを見出した。本発明者らは、本明細書において教示されるＶＨＨが、植物病原体に対する抗菌物質または抗菌組成物の「標的作用物質」として作用しないが、植物病原体に対して、本質的に抗菌剤として、特に、本質的に静菌剤として作用することを見出した。
したがって、本発明のさらなる態様は、植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原体の増殖を阻害するための、および／または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための方法であって、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において病原体に特異的に結合する重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法に関する。ある実施形態では、ＶＨＨが、病原体のスフィンゴ脂質に、好ましくは病原体のセラミドに、好ましくは病原体のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは病原体のセレブロシドに、さらにより好ましくは病原体のグルコセレブロシドに特異的に結合してもよい。
ある実施形態では、本発明が、植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原体の増殖を阻害するための、および／または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための方法であって、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において病原体に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含み、ＶＨＨが、植物病原体に、好ましくは植物病原体のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原体のセラミドに、好ましくは植物病原体のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原体のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原体のグルコセレブロシドに結合する方法に関する。
本発明のさらなる態様は、植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原体の増殖を阻害するための、および／または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための方法であって、植物または植物組織または植物細胞の前記少なくとも一部を、本明細書において定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、本明細書において定義されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の抽出物により処置するステップを含み、前記抽出物が、前記ＶＨＨを含む方法に関する。
本発明のさらなる態様は、植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原体の増殖を阻害するための、および／または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための方法であって、植物または植物組織または植物細胞の前記少なくとも一部を、本明細書において定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、本明細書において定義されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の抽出物を含む組成物により処置するステップを含み、前記抽出物が、前記ＶＨＨを含む方法に関する。
さらなる態様は、植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原体の増殖を阻害するための、および／または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための、本明細書において定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、本明細書において定義されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の抽出物の使用に関し、前記抽出物が、前記ＶＨＨを含む。
さらなる態様は、植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原体の増殖を阻害するための、および／または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための、本明細書において定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、本明細書において定義されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の抽出物を含む組成物の使用に関し、前記抽出物が、前記ＶＨＨを含む。
本明細書において教示される方法または使用のある実施形態では、ＶＨＨが、病原体に特異的に結合してもよく、ＶＨＨが、植物病原体に、好ましくは植物病原体のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原体のセラミドに、好ましくは植物病原体のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原体のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原体のグルコセレブロシドに結合してもよい。
本明細書において教示される方法または使用のある実施形態では、ＶＨＨが、病原体のスフィンゴ脂質に特異的に結合してもよく、ＶＨＨが、植物病原体に、好ましくは植物病原体のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原体のセラミドに、好ましくは植物病原体のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原体のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原体のグルコセレブロシドに結合してもよい。
本明細書において教示される方法または使用のある実施形態では、ＶＨＨが、病原体のセラミドに特異的に結合してもよく、ＶＨＨが、植物病原体に、好ましくは植物病原体のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原体のセラミドに、好ましくは植物病原体のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原体のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原体のグルコセレブロシドに結合してもよい。
本明細書において教示される方法または使用のある実施形態では、ＶＨＨが、病原体のスフィンゴ糖脂質に特異的に結合してもよく、ＶＨＨが、植物病原体に、好ましくは植物病原体のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原体のセラミドに、好ましくは植物病原体のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原体のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原体のグルコセレブロシドに結合してもよい。
本明細書において教示される方法または使用のある実施形態では、ＶＨＨが、病原体のセレブロシドに特異的に結合してもよく、ＶＨＨが、植物病原体に、好ましくは植物病原体のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原体のセラミドに、好ましくは植物病原体のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原体のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原体のグルコセレブロシドに結合してもよい。
本明細書において教示される方法または使用のある実施形態では、ＶＨＨが、病原体のグルコセレブロシドに特異的に結合してもよく、ＶＨＨが、植物病原体に、好ましくは植物病原体のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原体のセラミドに、好ましくは植物病原体のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原体のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原体のグルコセレブロシドに結合してもよい。
ある実施形態では、本発明が、植物病原体による感染または他の生物学的相互作用から植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部を保護するための方法であって、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において病原体に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法に関する。
ある実施形態では、本発明が、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部での植物病原体の増殖を阻害するための方法であって、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において病原体に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法に関する。
ある実施形態では、本発明が、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための方法であって、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において病原体に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法に関する。ある実施形態では、本発明が、植物病原体に対する植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部の抵抗性を増加させるための方法であって、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において病原体に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法に関する。
ある実施形態では、本発明が、植物病原性菌類による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原性菌類の増殖を阻害するための、および／または植物病原性菌類に対する植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の抵抗性を増加させるための本明細書において教示される方法であって、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において本明細書において定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法に関する。よって、ある実施形態では、本発明が、植物病原性菌類による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原性菌類の増殖を阻害するための、および／または植物病原性菌類に対する植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の抵抗性を増加させるための本明細書において教示される方法であって、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法に関する。ある実施形態では、本発明が、植物病原性菌類による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原性菌類の増殖を阻害するための、および／または植物病原性菌類に対する植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の抵抗性を増加させるための本明細書において教示される方法であって、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において菌類のセラミドに特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法に関する。ある実施形態では、本発明が、植物病原性菌類による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原性菌類の増殖を阻害するための、および／または植物病原性菌類に対する植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の抵抗性を増加させるための本明細書において教示される方法であって、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において菌類のスフィンゴ糖脂質に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法に関する。ある実施形態では、本発明が、植物病原性菌類による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原性菌類の増殖を阻害するための、および／または植物病原性菌類に対する植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の抵抗性を増加させるための本明細書において教示される方法であって、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において菌類のセレブロシドに特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法に関する。ある実施形態では、本発明が、植物病原性菌類による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原性菌類の増殖を阻害するための、および／または植物病原性菌類に対する植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の抵抗性を増加させるための本明細書において教示される方法であって、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において菌類のグルコセレブロシドに特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法に関する。ある実施形態では、ＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原性菌類のセラミドに、好ましくは植物病原性菌類のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原性菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原性菌類のグルコセレブロシドに結合する。
さらなる態様は、植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原体の増殖を阻害するための、および／または植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための、病原体に特異的に結合する重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用であって、ポリヌクレオチドが、植物または植物組織の少なくとも一部において発現される使用に関する。ある実施形態では、ＶＨＨが、病原体のスフィンゴ脂質に、好ましくは病原体のセラミドに、好ましくは病原体のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは病原体のセレブロシドに、さらにより好ましくは病原体のグルコセレブロシドに特異的に結合してもよい。
ある実施形態では、本発明が、植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原体の増殖を阻害するための、および／または植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための、病原体に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用であって、ポリヌクレオチドが、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において発現され、ＶＨＨが、植物病原体に、好ましくは植物病原体のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原体のセラミドに、好ましくは植物病原体のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原体のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原体のグルコセレブロシドに結合する使用に関する。
ある実施形態では、本発明が、植物病原体による感染または他の生物学的相互作用から植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部を保護するための、病原体に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用であって、ポリヌクレオチドが、植物または植物組織の少なくとも一部において発現される使用に関する。
ある実施形態では、本発明が、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部での植物病原体の増殖を阻害するための、病原体に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用であって、ポリヌクレオチドが、植物または植物組織の少なくとも一部において発現される使用に関する。
ある実施形態では、本発明が、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための、病原体に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用であって、ポリヌクレオチドが、植物または植物組織の少なくとも一部において発現される使用に関する。ある実施形態では、本発明が、植物病原体に対する植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部の抵抗性を増加させるための、病原体に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用であって、ポリヌクレオチドが、植物または植物組織の少なくとも一部において発現される使用に関する。
ある実施形態では、本発明が、植物病原性菌類による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原性菌類の増殖を阻害するための、および／または植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための、本明細書において教示される使用であって、ポリヌクレオチドが、本明細書において定義されるとおりのものである使用に関する。ある実施形態では、本発明が、植物病原性菌類による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原性菌類の増殖を阻害するための、および／または植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための、本明細書において教示される使用であって、ポリヌクレオチドが、菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む使用に関する。ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、菌類のセラミドに特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含んでいてもよい。ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、菌類のスフィンゴ糖脂質に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含んでいてもよい。ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、菌類のセレブロシドに特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含んでいてもよい。ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、菌類のグルコセレブロシドに特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含んでいてもよい。ある実施形態では、ＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは植物病原性菌類のセラミドに、好ましくは植物病原性菌類のスフィンゴ糖脂質に、より好ましくは植物病原性菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは植物病原性菌類のグルコセレブロシドに結合する。
本発明の原理を具現する方法および使用は、病原体に特異的に結合するＶＨＨをコードするポリヌクレオチドのｉｎ ｐｌａｎｔａ発現によって、植物病原体による感染もしくは他の相互作用から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞を保護する、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原体の増殖を阻害する、または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させることを好都合に可能にする。
本明細書において教示される方法または使用のある実施形態では、本明細書において教示されるＶＨＨが、抗菌剤として作用してもよい。本明細書において教示される方法または使用のある実施形態では、本明細書において教示されるＶＨＨが、静菌剤として作用してもよい。
本発明者らは、菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは菌類のセラミドに、より好ましくは菌類のスフィンゴ糖脂質に、さらにより好ましくは菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは菌類のグルコセレブロシドに特異的に結合するＶＨＨをコードするポリヌクレオチドを見出した。したがって、本発明のさらなる態様は、配列番号３３６および／または配列番号３３７から選択される少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞に関する。本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号３３６の核酸配列を含んでいてもよい。本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号３３７の核酸配列を含んでいてもよい。
本発明の上記のおよびさらなる態様および好ましい実施形態は、以下の節および添付の請求項において記載される。添付の請求項の主題は、本明細書においてこれによって明確に組み込まれる。
図１は、タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）由来のコーティング菌類ＧｌｃＣｅｒへの粗ＶＨＨ含有周辺質抽出物としてのＶＨＨの結合を示す図である。抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨは、菌類ＧｌｃＣｅｒに結合し、無関係なＶＨＨに対する結合は観察されない。 図２は、ＶＨＨ ４１Ｄ０１の結合特異性を示す図である。フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）またはタモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）由来のコーティング菌類ＧｌｃＣｅｒおよび植物（大豆）または哺乳動物（豚肉）由来の非菌類ＧｌｃＣｅｒに対する０．１μｇ／ｍｌの精製ＶＨＨ ４１Ｄ０１の結合。バーは、平均ＯＤ４０５ｎｍの値を示し、エラーバーは、ｎ＝６の平均値の標準誤差を示す。抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ ４１Ｄ０１は、植物または哺乳動物ＧｌｃＣｅｒではなく菌類ＧｌｃＣｅｒに特異的に結合する。 図３は、ＶＨＨの結合特異性を示す図である。フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）またはタモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）由来のコーティング菌類ＧｌｃＣｅｒ、植物（大豆）由来の非菌類ＧｌｃＣｅｒ、および非菌類哺乳動物ＧｌｃＣｅｒ（ブタ）に対する１μｇ／ｍｌの精製ＶＨＨの結合。様々な抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨは、様々な菌類ＧｌｃＣｅｒに特異的に結合するが、植物ＧｌｃＣｅｒにも哺乳動物ＧｌｃＣｅｒにも結合しない。 図３は、ＶＨＨの結合特異性を示す図である。フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）またはタモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）由来のコーティング菌類ＧｌｃＣｅｒ、植物（大豆）由来の非菌類ＧｌｃＣｅｒ、および非菌類哺乳動物ＧｌｃＣｅｒ（ブタ）に対する１μｇ／ｍｌの精製ＶＨＨの結合。様々な抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨは、様々な菌類ＧｌｃＣｅｒに特異的に結合するが、植物ＧｌｃＣｅｒにも哺乳動物ＧｌｃＣｅｒにも結合しない。 図３は、ＶＨＨの結合特異性を示す図である。フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）またはタモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）由来のコーティング菌類ＧｌｃＣｅｒ、植物（大豆）由来の非菌類ＧｌｃＣｅｒ、および非菌類哺乳動物ＧｌｃＣｅｒ（ブタ）に対する１μｇ／ｍｌの精製ＶＨＨの結合。様々な抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨは、様々な菌類ＧｌｃＣｅｒに特異的に結合するが、植物ＧｌｃＣｅｒにも哺乳動物ＧｌｃＣｅｒにも結合しない。 図４は、ＶＨＨ ４１Ｄ０１および菌類ＧｌｃＣｅｒの間の抗体−抗原相互作用のリアルタイム測定を示す図である。ＶＨＨ ４１Ｄ０１は、菌類ＧｌｃＣｅｒに結合する。ＶＨＨ ４１Ｄ０１からのＧｌｃＣｅｒのゆっくりとした解離が観察される。無関係なＶＨＨ＿Ａは、菌類ＧｌｃＣｅｒに結合しない。 図５は、ＶＨＨ ４１Ｄ０１およびＶＨＨ ５６Ｆ１１の交差反応性および特異性を示す図である。コーティング菌類脂質抽出物、タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）由来のＧｌｃＣｅｒ、および無関係な化合物：リンゴペクチン、柑橘類のペクチン、またはジャガイモレクチンに対する０．１μｇ／ｍｌの精製ＶＨＨ ４１Ｄ０１および１μｇ／ｍｌのＶＨＨ ５６Ｆ１１の結合。バーは、平均ＯＤ４０５ｎｍの値を示し、エラーバーは、ｎ＝２の平均値の標準誤差を示す。抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ ４１Ｄ０１およびＶＨＨ ５６Ｆ１１は、試験した菌類脂質抽出物のそれぞれに特異的に結合する。抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ ４１Ｄ０１およびＶＨＨ ５６Ｆ１１は、無関係なコーティング化合物または非コーティングウェルへの結合を示さない。 図６は、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来の菌類ＧｌｃＣｅｒに対する様々な組成物におけるＶＨＨ ４１Ｄ０１の結合を示す図である。０．１μｇ／ｍｌの抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ ４１Ｄ０１およびプロテアーゼ阻害剤および／または非イオン性界面活性剤および／または保存剤を含有する水性組成物を、菌類ＧｌｃＣｅｒへの結合について試験した。ＧｌｃＣｅｒに特異的なＶＨＨ ４１Ｄ０１は、添加剤のいずれの副作用もなく、試験したすべての組成物において菌類ＧｌｃＣｅｒに結合する。 本明細書において教示されるＶＨＨ構築物の局在化およびタンパク質発現を示す図である。ＶＨＨ：重鎖抗体の可変ドメイン；Ｈｉｓ：Ｈｉｓ６タグは、６つのＨｉｓリピート（配列番号３４８）からなる；ＫＤＥＬ：ＥＲ保留シグナル（配列番号３４９）；２Ｓ２：種子貯蔵タンパク質遺伝子シグナルペプチド（配列番号３５０）；Ｆｃ：マウスＩｇＧ３由来のＦｃ（配列番号３５１）；リンカー：９ＧＳスペーサー（配列番号３５２）；ＣＷ：細胞壁；ＰＭ：形質膜；ＥＲ：小胞体；ＴＧＮ：トランスゴルジネットワーク；ＣＣＶ：クラスリン被覆小胞。 図８は、コーティング菌類ＧｌｃＣｅｒに対するｓｅｃ＿５６Ｆ１１＿ヒンジ＿Ｆｃ＿ＨＩＳの結合を示す図である。非コーティングウェルではなくコーティングウェルに対する特異的な結合が、過剰発現植物の葉抽出物におけるｓｅｃ＿５６Ｆ１１＿ヒンジ＿Ｆｃ＿ＨＩＳについて観察された。 図９は、菌類ＧｌｃＣｅｒに特異的に結合するＶＨＨを発現する植物の灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）に対する抵抗性の増加を示す図である。灰色かび病菌（Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ）の胞子を接種したＶＨＨ過剰発現植物の葉の上で観察された損傷は、より小さかった。 図９は、菌類ＧｌｃＣｅｒに特異的に結合するＶＨＨを発現する植物の灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）に対する抵抗性の増加を示す図である。灰色かび病菌（Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ）の胞子を接種したＶＨＨ過剰発現植物の葉の上で観察された損傷は、より小さかった。
本発明は、特定の実施形態に関して記載されるが、本発明はそれに限定されない。
本明細書において開示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用の説明（特徴）および実施形態は、本明細書で下記に記される。そのように定義される本発明の説明および実施形態のそれぞれは、明らかにそれと反対に示されない限り、任意の他の説明および／または実施形態と組み合わせられてもよい。特に、好ましいまたは有利であるとして示される任意の１つもしくは複数の特徴または説明は、好ましいまたは有利であるとして示される任意の他の１つもしくは複数の特徴または説明と組み合わせられてもよい。この点に関して、本発明は、特に、任意の他の説明および／または実施形態と共に、下記の番号付きの態様および実施形態１〜９１の１つまたは複数のいずれか１つまたは任意の組み合わせによって、よくとらえられる。
本出願において開示される、番号付きの説明は次のとおりである。
１．菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合する、重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）をコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
２．スフィンゴ脂質がセラミドである、説明１に記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
３．スフィンゴ脂質がスフィンゴ糖脂質である、説明１または２に記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
４．スフィンゴ脂質がセレブロシドである、説明１〜３のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
５．スフィンゴ脂質がＣ−９メチル基および２つの二重結合（Δ４、Δ８）を有するＣ１９スフィンゴイド塩基を含む、説明１〜４のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
６．スフィンゴ脂質が以下の構造を有する、含む、からなる、またはそれによって示される、説明１〜５のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
Figure 2017536134
 ７．スフィンゴ脂質が以下の構造のうちのいずれかを有する、含む、からなる、またはそれによって示される、説明１〜６のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
Figure 2017536134
 ８．スフィンゴ脂質がグルコセレブロシドである、説明１〜７のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
９．スフィンゴ脂質が以下の構造
Figure 2017536134
 Ｎ−２’−ヒドロキシヘキサデカノイル−１−β−Ｄ−グルコピラノシル−９−メチル−４，８−スフィンガジエニンを有する、含む、からなる、またはそれによって示される、説明１〜８のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
１０．トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部におけるポリヌクレオチドの発現が、（ｉ）植物病原性菌類による感染からトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護する、（ｉｉ）トランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原性菌類の増殖を阻害する、および／または（ｉｉｉ）植物病原性菌類に対するトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の抵抗性を増加させる、説明１〜９のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
１１．トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部におけるポリヌクレオチドの発現が、植物病原性菌類による感染からトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部を保護する、説明１〜１０のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
１２．トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部におけるポリヌクレオチドの発現が、植物病原性菌類による感染または他の生物学的相互作用からトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部を保護する、説明１〜１１のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
１３．トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部におけるポリヌクレオチドの発現が、トランスジェニック植物または植物組織の少なくとも一部での植物病原性菌類の増殖を阻害する、説明１〜１２のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
１４．トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部におけるポリヌクレオチドの発現が、植物病原性菌類に対するトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部の抵抗性を増加させる、説明１〜１３のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
１５．トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部におけるポリヌクレオチドの発現が、（ｉ）植物病原性菌類による感染からトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部を保護する、（ｉｉ）トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部での植物病原性菌類の増殖を阻害する、および（ｉｉｉ）植物病原性菌類に対するトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部の抵抗性を増加させる、説明１〜１４のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
１６．ポリヌクレオチドが、植物における発現に適したプロモーター、植物組織もしくは植物細胞に特異的なプロモーター、または誘導性のプロモーターを含む、説明１〜１５のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
１７．ポリヌクレオチドが、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーターなどのような植物における発現のための適したプロモーターを含む、説明１〜１６のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
１８．ポリヌクレオチドが、分泌のための、細胞質への配置のための、または小胞体（ＥＲ）内腔、アポプラスト、液胞、または内膜および／もしくは外膜などのような細胞コンパートメントまたは細胞小器官への配置のための、標的シグナルをコードする少なくとも１つの配列を含む、説明１〜１７のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
１９．ポリヌクレオチドが、タグ、好ましくはＨｉｓ６、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｃ−ｔａｇ、３ｘＦＬＡＧ、Ｈｉｓ５、ＨＡ、Ｔ７、ｓｔｒｅｐ、ＨＳＶ、および／またはＥ−ｔａｇをコードする少なくとも１つの配列を含む、説明１〜１８のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
２０．ポリヌクレオチドが、ＶＨＨそれ自体を、１つもしくは複数の同一のもしくは異なるＶＨＨとの組み合わせとしてまたは結晶化可能領域（Ｆｃ領域）との１つもしくは複数の同一のもしくは異なるＶＨＨの組み合わせとして、任意選択によりスペーサーと共にコードする、説明１〜１９のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
２１．ポリヌクレオチドが、ＶＨＨそれ自体を、任意選択によりスペーサーと共にコードする、説明１〜２０のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
２２．ポリヌクレオチドが、１つまたは複数の同一のまたは異なるＶＨＨの組み合わせとして、任意選択によりスペーサーと共にＶＨＨをコードする、説明１〜２１のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
２３．ポリヌクレオチドが、結晶化可能領域（Ｆｃ領域）との１つまたは複数の同一のまたは異なるＶＨＨの組み合わせとして、任意選択によりスペーサーと共にＶＨＨをコードする、説明１〜２２のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
２４．植物が、コーン、イネ、コムギ、オオムギ、ソルガム、キビ、カラスムギ、ライムギ、ライコムギ、または他の穀類、ダイズ、アルファルファ、または他のマメ科作物、サトウダイコン、飼料ビート、パパイア、バナナ、およびプランテン、または他の果実、ブドウ、ナッツ、ナタネ、ヒマワリ、または他の油料作物、カボチャ、キュウリ、メロン、または他のウリ科の植物、ワタまたは他の繊維植物、サトウキビ、ヤシ、ジャトロファ、または他の燃料作物、キャベツ、トマト、コショウ、または他の植物、観賞植物、シラブ、ポプラ、ユーカリ、または他の木、常緑樹、草、コーヒーノキ、チャノキ、タバコ、ホップ、ゴムの木、ならびにラテックス植物から選択される植物である、説明１〜２３のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
２５．植物が、バナナ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キャノーラ、コーン、ワタ、ジャガイモ、イネ、ダイズ、タバコ、およびコムギからなる群から選択され、好ましくはコムギ、ライコムギである、説明１〜２４のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
２６．植物が、キャノーラ、コーン、イネ、ダイズ、およびコムギからなる群から選択される、説明１〜２５のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
２７．植物が、イネ、ダイズ、およびコムギからなる群から選択される、説明１〜２６のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
２８．ポリヌクレオチドが、任意の１つまたは複数の配列番号１〜８４を含むＶＨＨをコードする配列を含む、説明１〜２７のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
２９．ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号７０を含むＶＨＨをコードする配列を含む、説明１〜２８のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
３０．ポリヌクレオチドが、配列番号１および／または配列番号２を含むＶＨＨをコードする配列を含む、説明１〜２９のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
３１．ポリヌクレオチドが、配列番号１を含むＶＨＨをコードする配列を含む、説明１〜３０のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
３２．ポリヌクレオチドが、配列番号２を含むＶＨＨをコードする配列を含む、説明１〜３１のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
３３．ポリヌクレオチドが、配列番号７０を含むＶＨＨをコードする配列を含む、説明１〜３２のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
３４．ポリヌクレオチドが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含むＶＨＨをコードする配列を含み、（ｉ）ＣＤＲ１領域が、配列番号８５〜１６８の群から選択されるおよび／または（ｉｉ）ＣＤＲ２領域が、配列番号１６９〜２５２の群から選択されるおよび／または（ｉｉｉ）ＣＤＲ３領域が、配列番号２５３〜３３５の群から選択されるもしくはＣＤＲ３領域が、アミノ酸配列ＮＲＹを有する、説明１〜３３のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
３５．ポリヌクレオチドが、
配列番号８５を有するＣＤＲ１領域、配列番号１６９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号８６を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号８７を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号８８を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号８９を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９０を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９１を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９２を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９３を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９４を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９５を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９６を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９７を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９８を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９９を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１００を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０１を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０２を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０３を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０４を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０５を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０６を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０７を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０８を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０９を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１０を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１１を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１２を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１３を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１４を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１５を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１６を有するＣＤＲ１領域、配列番号２００を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１７を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１８を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１９を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２０を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２１を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２２を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２３を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２４を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２５を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２６を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２７を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２８を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２９を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３０を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３１を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３２を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３００を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３３を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３４を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３５を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３６を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３７を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３８を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３９を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２３を有するＣＤＲ２領域、およびアミノ酸配列ＮＲＹを有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４０を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４１を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４２を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４３を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４４を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４５を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４６を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４７を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４８を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４９を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５０を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５１を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５２を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５３を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５４を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５５を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５６を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５７を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５８を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５９を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６０を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６１を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６２を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６３を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３３０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６４を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３３１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６５を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３３２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６６を有するＣＤＲ１領域、配列番号２５０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３３３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６７を有するＣＤＲ１領域、配列番号２５１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３３４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６８を有するＣＤＲ１領域、配列番号２５２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３３５を有するＣＤＲ３領域
を含むリストから選ばれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含むＶＨＨをコードする配列を含む、説明１〜３４のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
３６．ポリヌクレオチドが、配列番号８５を有するＣＤＲ１領域、配列番号１６９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５３を有するＣＤＲ３領域を含むＶＨＨをコードする配列を含む、説明１〜３５のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
３７．ポリヌクレオチドが、配列番号８６を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５４を有するＣＤＲ３領域を含むＶＨＨをコードする配列を含む、説明１〜３５のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
３８．説明１〜３７のいずれか１つに定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、説明１〜３７のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の収穫部分および繁殖材料。
３９．トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の収穫部分および繁殖材料が、種子、果実、穀粒、鱗茎、朔果、塊茎、子孫、およびハイブリッドからなる群から選択される、説明３８に記載の収穫部分および繁殖材料。
４０．植物または植物組織のゲノムの中への説明１〜３７のいずれか１つにおいて定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドの導入を含む、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の産生のための方法。
４１．トランスジェニック植物または植物組織の産生のための、説明１〜３７のいずれか１つにおいて定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用。
４２．植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原体の増殖を阻害するための、および／または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための方法であって、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において病原体に特異的に結合する重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法。
４３．植物病原性菌類による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原性菌類の増殖を阻害するための、および／または植物病原性菌類に対する植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の抵抗性を増加させるための説明４２に記載の方法であって、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において説明１〜３７のいずれか１つにおいて定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法。
４４．ＶＨＨが、病原体のスフィンゴ脂質に特異的に結合する、説明４２または４３に記載の方法。
４５．ＶＨＨが、病原体のセラミドに特異的に結合する、説明４２〜４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．ＶＨＨが、病原体のスフィンゴ糖脂質に特異的に結合する、説明４４〜４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．ＶＨＨが、病原体のセレブロシドに特異的に結合する、説明４４〜４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．ＶＨＨが、病原体のグルコセレブロシドに特異的に結合する、説明４４〜４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．ＶＨＨが、植物病原体に結合する、説明４４〜４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．ＶＨＨが、植物病原体のスフィンゴ脂質に結合する、説明４４〜４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．ＶＨＨが、植物病原体のセラミドに結合する、説明４４〜５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．ＶＨＨが、植物病原体のスフィンゴ糖脂質に結合する、説明４４〜５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．ＶＨＨが、植物病原体のセレブロシドに結合する、説明４４〜５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．ＶＨＨが、植物病原性菌類のグルコセレブロシドに結合する、説明４４〜５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．ＶＨＨが、菌類に特異的に結合する、説明４４〜５４に記載の方法。
５６．ＶＨＨが、菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合する、説明４４〜５５に記載の方法。
５７．ＶＨＨが、菌類のセラミドに特異的に結合する、説明４４〜５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．ＶＨＨが、菌類のスフィンゴ糖脂質に特異的に結合する、説明４４〜５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．ＶＨＨが、菌類のセレブロシドに特異的に結合する、説明４４〜５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．ＶＨＨが、菌類のグルコセレブロシドに特異的に結合する、説明４４〜５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．ＶＨＨが、植物病原性菌類に結合する、説明４４〜６０のいずれか１つに記載の方法。
６２．ＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に結合する、説明４４〜６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．ＶＨＨが、植物病原性菌類のセラミドに結合する、説明４４〜６２のいずれか１つに記載の方法。
６４．ＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ糖脂質に結合する、説明４４〜６３のいずれか１つに記載の方法。
６５．ＶＨＨが、植物病原性菌類のセレブロシドに結合する、説明４４〜６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．ＶＨＨが、植物病原性菌類のグルコセレブロシドに結合する、説明４４〜６５のいずれか１つに記載の方法。
６７．植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原体の増殖を阻害するための、および／または植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための、病原体に特異的に結合する重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用であって、ポリヌクレオチドが、植物または植物組織の少なくとも一部において発現される使用。
６８．植物病原性菌類による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原性菌類の増殖を阻害するための、および／または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための、説明６７に記載の使用であって、ポリヌクレオチドが、説明１〜３７のいずれか１つにおいて定義される使用。
６９．ＶＨＨが、病原体のスフィンゴ脂質に特異的に結合する、説明６７または６４に記載の使用。
７０．ＶＨＨが、病原体のセラミドに特異的に結合する、説明６７〜６９のいずれか１つに記載の使用。
７１．ＶＨＨが、病原体のスフィンゴ糖脂質に特異的に結合する、説明６７〜７０のいずれか１つに記載の使用。
７２．ＶＨＨが、病原体のセレブロシドに特異的に結合する、説明６７〜７１のいずれか１つに記載の使用。
７３．ＶＨＨが、病原体のグルコセレブロシドに特異的に結合する、説明６７〜７２のいずれか１つに記載の使用。
７４．ＶＨＨが、植物病原体に結合する、説明６７〜７３のいずれか１つに記載の使用。
７５．ＶＨＨが、植物病原体のスフィンゴ脂質に結合する、説明６７〜７４のいずれか１つに記載の使用。
７６．ＶＨＨが、植物病原体のセラミドに結合する、説明６７〜７５のいずれか１つに記載の使用。
７７．ＶＨＨが、植物病原体のスフィンゴ糖脂質に結合する、説明６７〜７６のいずれか１つに記載の使用。
７８．ＶＨＨが、植物病原体のセレブロシドに結合する、説明６７〜７７のいずれか１つに記載の使用。
７９．ＶＨＨが、植物病原性菌類のグルコセレブロシドに結合する、説明６７〜７８のいずれか１つに記載の使用。
８０．ＶＨＨが、菌類に特異的に結合する、説明６７〜７９に記載の使用。
８１．ＶＨＨが、菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合する、説明６７〜８０に記載の使用。
８２．ＶＨＨが、菌類のセラミドに特異的に結合する、説明６７〜８１のいずれか１つに記載の使用。
８３．ＶＨＨが、菌類のスフィンゴ糖脂質に特異的に結合する、説明６７〜８２のいずれか１つに記載の使用。
８４．ＶＨＨが、菌類のセレブロシドに特異的に結合する、説明６７〜８３のいずれか１つに記載の使用。
８５．ＶＨＨが、菌類のグルコセレブロシドに特異的に結合する、説明６７〜８４のいずれか１つに記載の使用。
８６．ＶＨＨが、植物病原性菌類に結合する、説明６７〜８５のいずれか１つに記載の使用。
８７．ＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に結合する、説明６７〜８６のいずれか１つに記載の使用。
８８．ＶＨＨが、植物病原性菌類のセラミドに結合する、説明６７〜８７のいずれか１つに記載の使用。
８９．ＶＨＨが、植物病原性菌類のスフィンゴ糖脂質に結合する、説明６７〜８８のいずれか１つに記載の使用。
９０．ＶＨＨが、植物病原性菌類のセレブロシドに結合する、説明６７〜８９のいずれか１つに記載の使用。
９１．ＶＨＨが、植物病原性菌類のグルコセレブロシドに結合する、説明６７〜９０のいずれか１つに記載の使用。
９２．前記ＶＨＨを含む、説明１〜３７のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の抽出物。
９３．説明９２の抽出物を含む組成物。
９４．植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原体の増殖を阻害するための、および／または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための方法であって、説明９２の抽出物または説明９３の組成物により植物または植物組織または植物細胞の前記少なくとも一部を処置するステップを含む方法。
９５．植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原体の増殖を阻害するための、および／または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための、説明９２の抽出物または請求項９３の組成物の使用。
定義
本発明は、特定の実施形態に関して記載されるが、本発明はそれに限定されず、請求項によってのみ限定される。請求項におけるいかなる参照記号も、範囲を限定するとして解釈されないものとする。
用語「〜を含む」が本発明の説明および請求項において使用される場合、それは他のエレメントまたはステップを除外しない。
不定冠詞または定冠詞が使用される場合、単数名詞に関して、たとえば「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」、「その」が使用される場合、これは、特に何か他に明記されない限り、その名詞の複数形を含む。
本明細書において使用される用語「約」は、パラメーター、量、一時的な期間、およびその他同種のものなどのような測定可能な値に関する場合、特定の値のおよび特定の値から＋／−１０％またはそれ以下、好ましくは＋／−５％またはそれ以下、より好ましくは＋／−１％またはそれ以下、およびさらにより好ましくは＋／−０．１％またはそれ以下の変動を、そのような変動が、開示される本発明において機能するのに適切である限り包含することを意味する。修飾語「約」が指す値は、それ自体、さらに詳細に、好ましくは開示されることが理解されたい。
以下の用語または定義は、本発明の理解をもっぱら助けるために提供される。本明細書において明確に定義されない限り、本明細書において使用される用語はすべて、当業者にとっての意味と同じ意味を有する。技術者らは、当技術分野の定義および用語について、特にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４７），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）に導かれる。本明細書において提供される定義は、当業者によって理解される範囲に届かないと解釈されるべきでない。
その他に示されない限り、詳細に明確に記載されていないすべての方法、ステップ、技術、および操作は、当業者に明らかなものとして、実行することができ、それ自体知られている方法で実行された。たとえば標準的な手引き、上記に言及される一般的な背景技術、およびその中に引用されるさらなる参考文献もまた参照される。
本明細書において使用されるように、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、「ペプチド」、および「アミノ酸配列」は、区別なく使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これは、コードおよび非コードアミノ酸、化学的にまたは生化学的に修飾されたアミノ酸または誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。
本明細書において使用されるように、アミノ酸残基は、それらのフルネームによってまたは標準的な３文字もしくは１文字アミノ酸コードによって示す。
本明細書において使用されるように、用語「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」、「核酸」は、区別なく使用され、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそのアナログのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有していてもよく、既知のまたは未知の任意の機能を実行してもよい。ポリヌクレオチドの非限定的な例は遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、コントロール領域、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーを含む。核酸分子は、直鎖または環状であってもよい。
本明細書において使用されるように、用語「相同性」は、同じまたは異なる分類群の２つの高分子の間の、特に、２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドの間の、少なくとも二次構造の類似性を表わし、前記類似性は、祖先が共通していることによる。よって、用語「ホモログ」は、前記二次および任意選択により三次構造の類似性を有するそのように関係する高分子を表わす。
２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列を比較するために、第１のポリヌクレオチド配列および第２のポリヌクレオチド配列の間の「配列同一性（のパーセンテージ）」は、当業者に知られている方法を使用して、たとえば、ポリヌクレオチド配列を最適にアライメントし、必要であればギャップを導入し、続いて、比較ウィンドウにおける、第２のポリヌクレオチド配列の対応するポジションのヌクレオチドと同一である第１のポリヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの数を、比較ウィンドウにおけるポジションの数（ウィンドウサイズ）で割り、１００％を掛けることによって計算されてもよい。比較ウィンドウにわたる２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列の最適な配列アラインメントは、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０ Ｏｃｔ．５；２１５（３）：４０３−４１０）などのような配列アラインメントのための既知のコンピューターアルゴリズムを使用することによって得ることができる。ポリヌクレオチド配列アラインメントに適したアルゴリズムの別の例は、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４ Ｎｏｖ．１１；２２（２２）：４６７３−４６８０）である。ＣＬＵＳＴＡＬＷは、グループの配列の間で複数のペアワイズ比較を実行し、それらを集めて、相同性に基づいてマルチプルアライメントする。２つまたはそれ以上のポリペプチド配列を比較するために、第１のポリペプチド配列および第２のポリペプチド配列の間の「配列同一性（のパーセンテージ）」は、当業者に知られている方法を使用して、たとえば、ポリペプチド配列を最適にアライメントし、必要であればギャップを導入し、続いて、比較ウィンドウにおける、第２のポリペプチド配列の対応するポジションのアミノ酸と同一である第１のポリペプチド配列におけるアミノ酸の数を、比較ウィンドウにおけるポジションの数（ウィンドウサイズ）で割り、１００％を掛けることによって計算されてもよい。比較ウィンドウにわたる２つまたはそれ以上のポリペプチド配列の最適な配列アラインメントは、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０ Ｏｃｔ．５；２１５（３）：４０３−４１０）などのような配列アラインメントのための既知のコンピューターアルゴリズムを使用することによって得ることができる。ポリペプチド配列アラインメントに適したアルゴリズムの別の例は、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４ Ｎｏｖ．１１；２２（２２）：４６７３−４６８０）である。ＣＬＵＳＴＡＬＷは、グループの配列の間で複数のペアワイズ比較を実行し、それらを集めて、相同性に基づいてマルチプルアライメントする。アミノ酸アライメントについては、ＢＬＯＳＵＭアルゴリズムをタンパク質ウエイトマトリックスとして使用することができる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＰＮＡＳ ＵＳＡ １９９２ Ｎｏｖ．１５；８９（２２）：１０９１５−１０９１９）。２つのアミノ酸配列の間の配列相同性の程度を決定する際に、当業者は、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れてもよい。これは、アミノ酸残基が類似する化学構造の別のアミノ酸残基と交換され、ポリペプチドの機能、活性、または他の生物学的特性に対してほとんど影響がないはまた本質的に全く影響がないアミノ酸置換として一般に説明することができる。保存的アミノ酸置換は、２つのポリペプチド配列の間の相同性パーセンテージを計算するために同一であるとして数えられる。考え得る保存的アミノ酸置換は、当業者に明らかであろう。
本明細書において使用されるように、「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の最適なアライメントの連続する特定のセグメントのことを言い、比較ウィンドウ中の配列は、２つの配列の最適なアライメントのためにギャップを含んでいてもよい。配列同一性または相同性を決定するための比較ウィンドウは、最も長いアライメント配列と同じ長さまたは最も短いアライメント配列と同じ長さまたはアライメントを最適化するために導入された配列のいずれかにギャップを含むアライメントと同じ長さであってもよい。比較ウィンドウは、約５０００ポジションの長さまたは約２０００ポジションまたは約１０００ポジションまたは約８００ポジションまたは約６００ポジションの長さまたは約５００ポジションの長さまたは約４００ポジションの長さまたは約３００ポジションの長さまたは約２００ポジションの長さまたは約１００ポジションの長さまたは約５０ポジションの長さまたは約４０ポジションの長さまたは約３０ポジションの長さまたは約２０ポジションの長さまたは約１０ポジションの長さであってもよい。アミノ酸配列および核酸配列は、それらの全長にわたって１００％の配列同一性を有する場合、「全く同じ」であると言われる。
本明細書において使用されるように、抗体に関しての用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、Ｈ（重）またはＬ（軽）鎖の可変領域（それぞれＶＨおよびＶＬとも省略される）を指し、抗原性の標的に特異的に結合することができるアミノ酸配列を含有する。これらのＣＤＲ領域は、特定の抗原決定基構造に対する抗体の基本的な特異性を説明する。そのような領域はまた、「超可変領域」とも呼ばれる。ＣＤＲは、可変領域内のアミノ酸の隣接しないストレッチを示すが、種にかかわらず、可変重鎖領域および可変軽鎖領域内のこれらの決定的なアミノ酸配列の位置的な配置が、可変鎖のアミノ酸配列内で類似する配置を有することが見出された。すべての標準的な抗体の可変重鎖および可変軽鎖は、それぞれ、それぞれの軽（Ｌ）および重（Ｈ）鎖について、それぞれ他と隣接しない３つのＣＤＲ領域を有する（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３と称される）。
本明細書において使用される用語「親和性」は、ポリペプチド、特に、抗体などのような免疫グロブリンまたはＶＨＨなどのような免疫グロブリン断片が、抗原に結合し、それらの結合によって形成される複合体の存在の方に抗原およびポリペプチドの平衡状態を移す程度を指す。したがって、たとえば、抗原および抗体（断片）が比較的等しい濃度で組み合わせられる場合、親和性が高い抗体（断片）は利用可能な抗原に結合し、結果として生じる複合体の濃度が高くなる方に平衡状態を移すであろう。解離定数は、タンパク質結合ドメインおよび抗原性の標的の間の親和性を説明するために一般に使用される。典型的に、解離定数は、１０−５Ｍよりも低い。好ましくは、解離定数は、１０−６Ｍよりも低く、より好ましくは１０−７Ｍよりも低い。最も好ましくは、解離定数は、１０−８Ｍよりも低い。
本明細書において使用される用語「特異的に結合する」および「特異的な結合」は、様々な抗原の均質の混合物中に存在する特定の抗原に優先的に結合するポリペプチド、特に抗体などのような免疫グロブリンまたはＶＨＨなどのような免疫グロブリン断片の能力を一般に指す。ある実施形態では、特異的な結合性相互作用が、サンプル虫の望ましい抗原および望ましくない抗原を区別するであろう。いくつかの実施形態では約１０〜１００倍を超えるまたはそれ以上である（たとえば約１０００または１０，０００倍を超える）。
したがって、本明細書において開示されるアミノ酸配列は、そのアミノ酸配列がその標的（またはその少なくとも一部もしくは断片）に対して親和性、特異性を有する、および／または特異的に向けられる場合、特定の標的に「特異的に結合する」と言われる。
本明細書において開示されるアミノ酸配列の「特異性」は、親和性および／または結合活性に基づいて決定することができる。
本明細書において開示されるアミノ酸配列は、本明細書において開示されるそのアミノ酸配列が関心のある第２の標的抗原に結合する親和性の少なくとも１０倍などのように、少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍などのように、少なくとも５倍高い親和性で関心のある第１の標的抗原に結合する場合、「関心のある第２の標的抗原に対立するものとして、関心のある第１の標的抗原に対して特異的である」と言われる。したがって、ある実施形態では、本明細書において開示されるアミノ酸配列が、関心のある第２の標的抗原に対立するものとして、関心のある第１の標的抗原「に対して特異的である」と言われる場合、それは、関心のある第２の標的抗原にではなく、関心のある第１の標的抗原に特異的に結合してもよい（本明細書において定義されるように）。
本明細書において使用されるように、用語「阻害する」、「低下させる」、および／または「妨げる」は、関心のある標的抗原に特異的に結合し、関心のあるその標的抗原およびその天然の結合パートナーの間の相互作用を阻害する、低下させる、および／または妨げる、本明細書において開示されるアミノ酸配列（の使用）を指してもよい。用語「阻害する」、「低下させる」、および／または「妨げる」はまた、適したインビトロ、細胞、またはインビボアッセイを使用して測定されるように、関心のある標的抗原に特異的に結合し、関心のあるその標的抗原の生物学的活性を阻害する、低下させる、および／または妨げる本明細書において開示されるアミノ酸配列（の使用）を指してもよい。したがって、用語「阻害する」、「低下させる」、および／または「妨げる」はまた、関心のある標的抗原に特異的に結合し、関心のある標的抗原が関与する１つまたは複数の生物学的または生理学的メカニズム、効果、応答、機能、経路、または活性を阻害する、低下させる、および／または妨げる本明細書において開示されるアミノ酸配列（の使用）を指してもよい。アンタゴニストとして本明細書において開示されるアミノ酸配列のそのような作用は、関心のある標的抗原に依存して、任意の適した方法でおよび／または当技術分野において知られている任意の適した（インビトロ、通常細胞もしくはインビボ）アッセイを使用して決定されてもよい。
したがって、より詳細には、本明細書において開示されるアミノ酸配列を使用して「阻害する」、「低下させる」、および／または「妨げる」ことは、同じ条件下の同じアッセイであるが本明細書において開示されるアミノ酸配列を使用しない関心のある標的抗原の活性と比較して、適したインビトロ、細胞、またはインビボアッセイを使用して測定されるように、少なくとも１０％であるが好ましくは少なくとも２０％、たとえば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上、関心のある標的抗原およびその天然の結合パートナーの間の相互作用を阻害する、低下させる、および／もしくは妨げることまたは関心のある標的抗原の活性を阻害する、低下させる、および／もしくは妨げることまたは関心のある標的抗原が関与する１つもしくは複数の生物学的もしくは生理学的メカニズム、効果、応答、機能、経路、もしくは活性を阻害する、低下させる、および／もしくは妨げることを意味してもよい。そのうえ、「阻害する」、「低下させる」、および／または「妨げる」ことはまた、同じ条件下であるが本明細書において開示されるアミノ酸配列が存在しないものと比較して、１つもしくは複数のその天然の結合パートナーに対する、関心のある標的抗原の親和性、結合活性、特異性、および／もしくは選択性の減少を誘発することならびに／または関心のある標的抗原が存在する培地もしくは環境における１つもしくは複数の条件（ｐＨ、イオン強度、補助因子の存在など）に対する、関心のある標的抗原の感受性の減少を誘発することを意味してもよい。本発明に関して、「阻害する」、「低下させる」、および／または「妨げる」ことはまた、関心のある標的抗原の活性のアロステリック阻害、低下、および／または妨害を含んでいてもよい。
本明細書において開示されるアミノ酸配列の活性を阻害するもしくはアンタゴナイズするまたは活性を増強するもしくは刺激することは可逆的であっても不可逆的であってもよい。
本明細書において開示されるアミノ酸配列に関して、本明細書において開示されるアミノ酸配列上に存在する「結合領域」、「結合部位」、または「相互作用部位」という用語は、標的分子上に存在する特定の部位、領域、遺伝子座、一部、またはドメインの意味を本明細書において有するものとし、この特定の部位、領域、遺伝子座、一部、またはドメインは、その標的分子への結合を担う。そのような結合領域は、したがって、標的分子のその特定の部位、領域、遺伝子座、一部、またはドメインから本質的になり、その標的分子に結合する場合、そのアミノ酸配列と接している。
本明細書において使用される「植物」は、新鮮な果実、植物、および種子を含む生きている植物および生きている植物の一部を意味する。また、本明細書において使用される用語「植物」は、植物全体、植物の祖先および子孫、ならびに種子、新芽、茎、葉、根（塊茎を含む）、花、ならびに組織および器官を含む植物の一部を包含し、前述のもののそれぞれが、関心のある遺伝子／核酸を含む。
用語「植物」はまた、植物細胞、浮遊培養物、カルス組織、胚、分裂組織部位、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子を包含し、なおまた、前述のもののそれぞれが、関心のある遺伝子／核酸を含む。
適したコントロール植物の選択は、実験の設定のルーチン的な部分であり、対応する野生型植物または関心のある遺伝子を有していない対応する植物を含んでいてもよい。コントロール植物は、典型的に、判断される植物と同じ植物種またはさらに同じ品種のものである。コントロール植物はまた、判断される植物のヌル欠損であってもよい。ヌル欠損は、分離によって導入遺伝子を失っている個体である。本明細書において使用される「コントロール植物」は、植物全体だけではなく種子および種子の一部を含む植物の一部をも指す。
本明細書において使用される用語「植物組織」は、一緒に特異的な機能を実行する同じ起源由来の類似する植物細胞の群を指す。植物組織の例は、分裂組織、保護組織、柔組織、厚膜組織、厚角組織、木部、および師部を含む。
本明細書において使用される「作物」は、食物、家畜飼料、燃料原料として収穫するためにまたは任意の他の経済的な目的のために成長させる植物種または品種を意味する。非限定的な例として、前記作物は、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、およびカラスムギなどのような穀類、ソルガム、イネ、サトウダイコンおよび飼料ビート、ナシ状果（たとえばリンゴおよびセイヨウナシ）、柑橘類（たとえばオレンジ、レモン、ライム、グレープフルーツ、もしくはマンダリンミカン）、核果（たとえばモモ、ネクタリン、もしくはプラム）などのような果実、ナッツ（たとえばアーモンドもしくはクルミ）、小果樹（たとえばサクランボ、イチゴ、ブラックベリー、もしくはラズベリー）、オオバコ科（ｐｌａｎｔａｉｎ ｆａｍｉｌｙ）もしくはブドウ、インゲン、レンズマメ、エンドウマメ、および大豆などのようなマメ科作物、ヒマワリ、ベニバナ、ナタネ、キャノーラ、ヒマシ、もしくはオリーブなどのような油料作物、キュウリ、メロン、もしくはパンプキンなどのようなウリ科の植物、ワタ、アマ、もしくはアサなどのような繊維植物、サトウキビ、ススキ、もしくはスイッチグラスなどのような燃料作物、ジャガイモ、トマト、コショウ、レタス、ホウレンソウ、タマネギ、ニンジン、ナス、アスパラガス、もしくはキャベツなどのような植物、花（たとえばツクバネアサガオ、テンジクアオイ、バラ、チューリップ、ユリ、もしくはキク）などのような観賞植物、シラブ、広葉樹（たとえばポプラもしくはヤナギ）および常緑樹（たとえば針葉樹）、芝地、芝生、もしくは飼料用の草などのような草、またはコーヒー、茶、タバコ、ホップ、コショウ、ゴム、もしくはラテックス植物などのような他の有用な植物とすることができる。
本明細書において区別なく使用される「植物有害生物」、「植物病原体」、または「作物有害生物」は、特に、植物、植物の一部、または植物産物、特に、農業において使用される植物、植物の一部、または植物産物に対して損害を引き起こす生物体を指す。用語「植物有害生物」または「作物有害生物」は、有害生物が植物を標的にし、害するという意味で使用されることに注意されたい。関連する作物有害生物の例は、病原性菌類（子嚢菌（フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、ティエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）種、バーティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）種など）を含む）、担子菌（リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）種、ファコスポラ（Ｐｈａｋｏｓｐｏｒａ）種、プクキニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）種など）、ならびに菌類様の卵菌（フハイカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）種およびフィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）種など）、アブラムシ、イモムシ、ハエ、スズメバチ、およびその他同種のもの、線虫（土中で自由に生活しているものまたは特に、根瘤線虫ならびにダイズ嚢胞線虫およびジャガイモ嚢胞線虫などのような嚢胞線虫などのような植物の根に寄生する種）、ダニ（ハダニ、ホコリダニ、およびフシダニなど）、ならびに腹足類動物（デロセラス（Ｄｅｒｏｃｅｒａｓ）種、ミラックス（Ｍｉｌａｘ）種、タンドニア（Ｔａｎｄｏｎｉａ）種、リマックス（Ｌｉｍａｘ）種、アリオン（Ａｒｉｏｎ）種、およびベロニカ（Ｖｅｒｏｎｉｃｅｌｌａ）種などのようなナメクジならびにヘリックス（Ｈｅｌｉｘ）種、セルヌエラ（Ｃｅｒｎｕｅｌｌａ）種、テバ（Ｔｈｅｂａ）種、コチリセラ（Ｃｏｃｈｌｉｃｅｌｌａ）種、アカチナ（Ａｃｈａｔｉｎａ）種、スクシネア（Ｓｕｃｃｉｎｅａ）種、オバクラミス（Ｏｖａｃｈｌａｍｙｓ）種、アンフィブリマ（Ａｍｐｈｉｂｕｌｉｍａ）種、ザクリシア（Ｚａｃｈｒｙｓｉａ）種、ブラディバエナ（Ｂｒａｄｙｂａｅｎａ）種、およびポマセア（Ｐｏｍａｃｅａ）種などのようなカタツムリを含む）、細菌（バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種ならびにキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）種およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種などのようなプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）など）、フィトプラズマ（Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ）、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）、ウイルス（タバコモザイクウイルスおよびカリフラワーモザイクウイルスなど）、ならびに原生動物を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「病原菌」は、菌類、酵母、細菌、ウイルス、およびその他同種のものを意味し、「病原菌の」は、病原菌に由来することを意味する。
本明細書において使用される「菌類」は、真菌植物門のグループに属する真核生物を意味する。本発明における菌類という用語はまた、卵菌類などのような菌類様の生物体をも含む。卵菌類（または卵菌）は、菌類様の真核微生物の別個の系統学的系列を形成する。このグループは、もともと菌類に分類されていたが、現代の見識は、不等毛藻（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｓ）のグループ内の褐藻および珪藻などのような光合成生物との比較的密接な関係を支持している。
本明細書において区別なく使用される用語「植物病原性菌類」または「菌類植物病原体」は、植物に対して感染または他の生体反応を引き起こし得る、本明細書において定義される任意の菌類を指す。
本明細書において使用される用語「感染」は、植物病原体によって引き起こされる植物における任意の炎症状態、病気、または障害を指す。
本明細書において使用される「菌類感染」または「菌類病」は、菌類によって引き起こされる植物、動物、またはヒトなどのような生物における任意の炎症状態、病気、または障害を指す。
本明細書において使用される用語「抗菌剤」は、微生物を死滅させるまたは微生物の増殖を阻害する薬剤を指す。抗菌剤は、抗菌薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、または抗寄生虫薬を包含する。
本明細書において使用される用語「殺菌剤」は、微生物を死滅させる薬剤を指す。
本明細書において使用される用語「静菌剤」は、微生物の増殖を阻害する薬剤を指す。
本明細書において使用される用語「殺真菌剤」は、菌類を死滅させる薬剤を指す。
本明細書において使用される用語「静真菌剤」は、菌類の増殖を阻害する薬剤を指す。
本明細書において使用される「抗菌（効果）」または「抗菌の使用」は、植物、植物の一部においてまたはたとえば土においてなどのように農業に関係する他の状況において、植物病原体を死滅させること、植物病原体の増殖または活性を阻害すること、植物病原体の活動を変化させること、および植物病原体を撃退するまたは誘引することを含めて、植物病原体の有害な活性をコントロールする、調整する、またはそれに干渉するための、薬剤、特にＶＨＨの任意の効果または使用を含む。
本明細書において使用される「殺菌（効果）」または「殺菌の使用」は、植物病原体を死滅させることを含めて、植物病原体の有害な活性をコントロールする、調整する、またはそれに干渉するための、薬剤、特にＶＨＨの任意の効果または使用を含む。
本明細書において使用される「静菌（効果）」または「静菌の使用」は、植物、植物の一部においてまたはたとえば土においてなどのように農業に関係する他の状況において、植物病原体の増殖または活性を阻害すること、植物病原体の活動を変化させること、および植物病原体を撃退するまたは誘引することを含めて、植物病原体の有害な活性をコントロールする、調整する、またはそれに干渉するための、薬剤、特にＶＨＨの任意の効果または使用を含む。
本明細書において使用される「抗真菌（効果）」または「抗真菌の使用」は、植物、植物の一部においてまたは土においてなどのように農業に関係する他の状況において、菌類の増殖または活性を阻害すること、菌類の活動を変化させること、および菌類を撃退するまたは誘引することを含めて、菌類の有害な活性をコントロールする、調整する、またはそれに干渉するための、薬剤、特にＶＨＨの任意の効果または使用を含む。
本明細書において使用される「殺真菌（効果）」または「殺真菌の使用」は、菌類を死滅させることを含めて、菌類の有害な活性をコントロールする、調整する、またはそれに干渉するための、薬剤、特にＶＨＨの任意の効果または使用を含む。
本明細書において使用される「静真菌（効果）」または「静真菌の使用」は、植物、植物の一部においてまたはたとえば土においてなどのように農業に関係する他の状況において、菌類の増殖または活性を阻害すること、菌類の活動を変化させること、および菌類を撃退するまたは誘引することを含めて、菌類の有害な活性をコントロールする、調整する、またはそれに干渉するための、薬剤、特にＶＨＨの任意の効果または使用を含む。
本明細書において区別なく使用される「殺虫性の活性」または「生物致死性の活性」は、植物病原体を死滅させること、植物病原体の増殖または活性を阻害すること、植物病原体の活動を変化させること、植物病原体を撃退するまたは誘引することを含むが、これらに限定されない、植物病原体の有害な活性に干渉することを意味する。
本明細書において使用される「生体静力学的活性」は、植物病原体の増殖または活性を阻害すること、植物病原体の活動を変化させること、植物病原体を撃退するまたは誘引することを含むが、これらに限定されない、植物病原体の有害な活性に干渉することを意味する。
殺虫性、生物致死性、または生物静力学的活性成分、物質、または成分を含む活性成分、物質、もしくは成分または組成物または薬剤の殺虫性、生物致死性、または生物静力学的活性は、薬剤の最低の阻害活性（ＭＩＣ）として表現することができる（たとえばｍｇ／ｍＬなどのような濃度の単位で表現することができる）が、それに制限されない。
本明細書において使用される「殺真菌活性」は、菌類を死滅させること、菌類の増殖または活性を阻害すること、菌類の活動を変化させること、および菌類を撃退するまたは誘引することを含むが、これらに限定されない、菌類の有害な活性に干渉することを意味する。
本明細書において使用される「静真菌活性」は、菌類の増殖または活性を阻害すること、菌類の活動を変化させること、および菌類を撃退するまたは誘引することを含むが、これらに限定されない、菌類の有害な活性に干渉することを意味する。
殺虫性、生物致死性、または生物静力学的活性成分、物質、または成分を含む活性成分、物質、もしくは成分または組成物もしくは薬剤の殺真菌または静真菌活性は、薬剤の最低の阻害活性（ＭＩＣ）として表現することができる。（たとえばｍｇ／ｍＬなどのような濃度の単位で表現することができる）が、しかしながらそれに制限されない。
本明細書において使用されるように、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、ならびに親抗体の抗原結合機能を保持するＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、および他の断片などのようなその断片を指す。そのため、抗体は、免疫グロブリンもしくは糖タンパク質またはその断片もしくは一部分または修飾免疫グロブリン様フレームワーク内に構成される抗原結合部分を含む構築物または非免疫グロブリン様フレームワークもしくは骨格を含む構築物内に構成される抗原結合部分を指してもよい。
本明細書において使用されるように、用語「モノクローナル抗体」は、均質の抗体集団を有する抗体組成物を指す。この用語は、抗体の種類または供給源に関して限定されず、抗体が作製される方法によって限定されることも意図されない。この用語は、免疫グロブリン全体ならびに抗体の抗原結合機能を保持するＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、および他などのような断片を包含する。任意の哺乳動物種のモノクローナル抗体は、本発明において使用することができる。しかしながら、実際には、抗体は、モノクローナル抗体を産生するために必要とされるハイブリッド細胞株またはハイブリドーマを作製する際に使用するためのラットまたはマウス細胞株の有用性のために、典型的にラットまたはマウス起源のものとなるであろう。
本明細書において使用されるように、用語「ポリクローナル抗体」は、不均質な抗体集団を有する抗体組成物を指す。ポリクローナル抗体は、多くの場合、免疫化された動物由来のまたは選択されたヒト由来のプール血清に由来する。
本明細書において区別なく使用される用語「重鎖抗体の可変ドメイン」または「ＶＨＨ」または「抗体の重鎖可変ドメイン」は、重鎖抗体の重鎖可変ドメインを指し、これは、軽鎖が当然欠けており、ラクダ科の動物またはサメの重鎖抗体の重鎖の可変ドメインを含むが、これらに限定されない。
当業者は、ＶＨＨの機能的変異体が、任意の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むと理解してもよい。免疫グロブリン単一可変ドメインの例は、重鎖抗体に由来する免疫グロブリン単一可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン配列に由来する免疫グロブリン単一可変ドメイン、重鎖可変ドメイン配列に由来する免疫グロブリン単一可変ドメイン、従来の四鎖抗体、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」（Ｄｏｍａｎｔｉｓ／ＧＳＫ）、ＶＨＨ、またはＮａｎｏｂｏｄｙ（Ａｂｌｙｎｘ）に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインからなる群から選択される免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。
本明細書においてさらに記載されるように、重鎖抗体の可変ドメインのアミノ酸配列および構造は、しかしながらそれに限定されないが、当技術分野および本明細書においてそれぞれ「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」；および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と呼ばれる４つのフレームワーク領域または「ＦＲ」から構成されると考えられ、これらのフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域または「ＣＤＲ」によって遮られており、これらは、当技術分野においてそれぞれ「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」；「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と呼ばれる。
本明細書においてさらに記載されるように、重鎖抗体またはＶＨＨの可変ドメイン中のアミノ酸残基の総数は、１１０〜１３０の範囲とすることができ、好ましくは１１２〜１１５、最も好ましくは１１３である。しかしながら、重鎖抗体の可変ドメインの一部、断片、またはアナログは、そのような一部、断片、もしくはアナログが、殺虫性、生物致死性、生物静力学的活性、殺真菌、もしくは静真菌活性（本明細書において定義される）などのような機能的な活性（の少なくとも一部）を保持するおよび／またはこれらの一部、断片、もしくはアナログが由来する重鎖抗体の可変ドメイン本来の結合特異性（の少なくとも一部）を保持する限り、それらの長さおよび／またはサイズに関して特に限定されないことに注意されたい。殺虫性、生物致死性、生物静力学的活性、殺真菌、もしくは静真菌活性（本明細書において定義される）などのような機能的な活性（の少なくとも一部）を保持するおよび／またはこれらの一部、断片、もしくはアナログが由来する重鎖抗体の本来の可変ドメイン結合特異性（の少なくとも一部）を保持する一部、断片、またはアナログはまた、重鎖抗体の可変ドメインの「機能的断片」と本明細書においてさらに呼ばれる。
重鎖抗体の可変ドメインのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１）によって示される可変ドメインについての一般的な番号付けに従って、上記で引用されるＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓの論文において（たとえば前記参考文献の図２を参照）ラクダ科の動物由来のＶＨＨドメインに適用されるように、番号を付けられる。この番号付けに従って、重鎖抗体の可変ドメインのＦＲ１は、ポジション１〜３０のアミノ酸残基を含み、重鎖抗体の可変ドメインのＣＤＲ１は、ポジション３１〜３６のアミノ酸残基を含み、重鎖抗体の可変ドメインのＦＲ２は、ポジション３６〜４９のアミノ酸を含み、重鎖抗体の可変ドメインのＣＤＲ２は、ポジション５０〜６５のアミノ酸残基を含み、重鎖抗体の可変ドメインのＦＲ３は、ポジション６６〜９４のアミノ酸残基を含み、重鎖抗体の可変ドメインのＣＤＲ３は、ポジション９５〜１０２のアミノ酸残基を含み、かつ重鎖抗体の可変ドメインのＦＲ４は、ポジション１０３〜１１３のアミノ酸残基を含む。この点で、ＶＨＨドメインについて当技術分野においてよく知られているが、ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸残基の総数は、変動してもよく、Ｋａｂａｔの番号付けによって示されるアミノ酸残基の総数と一致しなくてもよい（すなわち、Ｋａｂａｔの番号付けによる１つまたは複数のポジションが実際の配列において占められていなくてもよいまたは実際の配列が、Ｋａｂａｔの番号付けによって考慮される数よりも多くのアミノ酸残基を含有していてもよい）。これは、一般に、Ｋａｂａｔに従う番号付けが、実際の配列中のアミノ酸残基の実際の番号付けと一致してもよいし、一致しなくてもよいことを意味する。しかしながら、一般に、Ｋａｂａｔの番号付けに従って、またＣＤＲにおけるアミノ酸残基の数に関係なく、Ｋａｂａｔの番号付けに従うポジション１は、ＦＲ１の最初の部分と一致しかつ逆もまた同じであり、Ｋａｂａｔの番号付けに従うポジション３６は、ＦＲ２の最初の部分と一致しかつ逆もまた同じであり、Ｋａｂａｔの番号付けに従うポジション６６は、ＦＲ３の最初の部分と一致しかつ逆もまた同じであり、Ｋａｂａｔの番号付けに従うポジション１０３は、ＦＲ４の最初の部分と一致しかつ逆もまた同じであるということができる。
重鎖抗体の可変ドメインのアミノ酸残基に番号を付けるための代替の方法は、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８７７−８８３（１９８９））によって記載される方法、いわゆる「ＡｂＭ定義」およびいわゆる「コンタクト定義（ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）」である。しかしながら、本発明の説明、請求項、および図面において、その他に示されない限り、ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによってＶＨＨドメインに適用されるＫａｂａｔに従う番号付けに従うであろう。
重鎖抗体およびその可変ドメインの一般的な説明については、一般的な背景技術として挙げられる以下の参考文献を特に参照されたい。Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌの国際公開第９４／０４６７８号パンフレット、国際公開第９５／０４０７９号パンフレット、および国際公開第９６／３４１０３号パンフレット；Ｕｎｉｌｅｖｅｒの国際公開第９４／２５５９１号パンフレット、国際公開第９９／３７６８１号パンフレット、国際公開第００／４０９６８号パンフレット、国際公開第００／４３５０７号パンフレット、国際公開第００／６５０５７号パンフレット、国際公開第０１／４０３１０号パンフレット、国際公開第０１／４４３０１号パンフレット、欧州特許第１１３４２３１号明細書、および国際公開第０２／４８１９３号パンフレット；Ｖｌａａｍｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｕｔ ｖｏｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（ＶＩＢ）の国際公開第９７／４９８０５号パンフレット、国際公開第０１／２１８１７号パンフレット、国際公開第０３／０３５６９４号パンフレット、国際公開第０３／０５４０１６号パンフレット、および国際公開第０３／０５５５２７号パンフレット；Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓ Ｎ．Ｖ．ａｎｄ Ａｂｌｙｎｘ ＮＶの国際公開第０３／０５０５３１号パンフレット；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｃａｎａｄａによる国際公開第０１／９０１９０号パンフレット；Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓによる国際公開第０３／０２５０２０号パンフレット（＝欧州特許第１４３３７９３号明細書）；ならびにＡｂｌｙｎｘ ＮＶによる国際公開第０４／０４１８６７号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６２号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６５号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６３号パンフレット、国際公開第０４／０６２５５１号パンフレット、およびＡｂｌｙｎｘ ＮＶによるさらに公開される特許出願；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９３ Ｊｕｎ．３；３６３（６４２８）：４４６−８；Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９４ Ｆｅｂ．２１；３３９（３）：２８５−９０；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９４ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；７（９）：１１２９−３；Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１９９５ Ｍａｙ；１３（５）：４７５−９；Ｇｈａｒｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ．，９ｔｈ Ｆｏｒｕｍ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｄ．Ｆａｃ．Ｌａｎｄｂｏｕｗ Ｕｎｉｖ．Ｇｅｎｔ．１９９５；６０／４ａ ｐａｒｔ Ｉ：２０９７−２１００；Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９６ Ｊｕｎｅ；９（６）：５３１−７；Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．１９９６ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；３（９）：８０３−１１；Ｓｈｅｒｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．１９９６ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；３（９）：７３３−６；Ｓｐｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．１９９６ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；３（９）：７５２−７；Ａｒｂａｂｉ Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９７ Ｓｅｐ．１５；４１４（３）：５２１−６；Ｖｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ−Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；３４（１６−１７）：１１２１−３１；Ａｔａｒｈｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｎｅｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９７；４：１７７−１８２；Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９８ Ｊａｎ．２３；２７５（３）：４１３−８；Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９８ Ｊｕｌ．１；１７（１３）：３５１２−２０；Ｆｒｅｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８ Ｊｕｌｙ−Ａｕｇｕｓｔ；１４９（６）：５８９−９９；Ｔｒａｎｓｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９９８ Ｓｅｐ．１；３２（４）：５１５−２２；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ａｎｄ Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１９９９ Ｍａｒｃｈ−Ａｐｒｉｌ；１２（２）：１３１−４０；ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９９９ Ａｐｒ．１２；１４３１（１）：３７−４６；Ｄｅｃａｎｎｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｏｌｄ．Ｄｅｓ．１９９９ Ａｐｒ．１５；７（４）：３６１−７０；Ｎｇｙｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９ Ｊｕｎｅ；３６（８）：５１５−２４；Ｗｏｏｌｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９９ Ｏｃｔｏｂｅｒ；５０（１−２）：９８−１０１；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９９ Ｄｅｃ．１０；２３１（１−２）：２５−３８；Ｓｐｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０００ Ｆｅｂ．１５；３９（６）：１２１７−２２；Ｆｒｅｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００ Ｆｅｂ．２８；７８（１）：１１−２１；Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２０００ Ｍａｒ．１；１９（５）：９２１−３０；ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０００ Ｊｕｎ．２３；２４０（１−２）：１８５−９５；Ｄｅｃａｎｎｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０００ Ｊｕｎ．３０；３００（１）：８３−９１；ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００ Ｊｕｌ．１４；８０（３）：２６１−７０；Ｈａｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ａｕｇｕｓｔ；３７（１０）：５７９−９０；Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１ Ｊａｎ．９；４０（１）：７４−８３；Ｃｏｎｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１ Ｍａｒ．９；２７６（１０）：７３４６−５０；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２００１ Ａｐｒｉｌ；２６（４）：２３０−５；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１ Ｊｕｎｅ；７４（４）：２７７−３０２；Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１ Ｊｕｌ．１３；２７６（２８）：２６２８５−９０；Ｓｐｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００１ Ａｕｇ．３；３１１（１）：１２３−９；Ｃｏｎｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００１ Ｏｃｔｏｂｅｒ；４５（１０）：２８０７−１２；Ｄｅｃａｎｎｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００１ Ｏｃｔ．２６；３１３（３）：４７３−８；Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；７９：２６１−９６；Ｍｕｒｕｇａｎａｎｄａｍ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；１６（２）：２４０−２；Ｅｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００２ Ｍａｒ．１９；４１（１１）：３６２８−３６；Ｄｕｍｏｕｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２００２ Ｍａｒｃｈ；１１（３）：５００−１５；Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００２ Ｍａｒ．２０；９８（３）：４５６−６２；Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２００２ Ｍａｒｃｈ；１９（３）：２０５−１５；ｖａｎ ｄｅｒ Ｖａａｒｔ Ｊ Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００２；１７８：３５９−６６；Ｖｒａｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００２ Ｊｕｌ．９；４１（２７）：８５７０−９；Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２００２ Ａｐｒｉｌ；５４（１）：３９−４７；Ｒｅｎｉｓｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２００２ Ｊｕｎ．１；４７（４）：５４６−５５；Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２ Ｊｕｎ．２８；２７７（２６）：２３６４５−５０；Ｌｅｄｅｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．２００２ Ｊｕｎｅ；８５（６）：１３７６−８２；Ｄｅ Ｇｅｎｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２ Ａｕｇ．１６；２７７（３３）：２９８９７−９０７；Ｆｅｒｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００２ Ｓｅｐ．１；３６６（Ｐｔ ２）：４１５−２２；Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；３０：２７３−８；Ｈａｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；６０（４）：４４９−５４；Ｊｏｂｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３ Ｊａｎｕａｒｙ；２１（１）：７７−８０；Ｃｏｎｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；２７（２）：８７−１０３；Ｐｌｅｓｃｈｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２００３ Ｍａｒｃｈ−Ａｐｒｉｌ；１４（２）：４４０−８；Ｌａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３ Ａｐｒ．１８；２７８（１６）：１４１０１−１１；Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００３ Ｍａｙ；１０９（１）：９３−１０１；Ｊｏｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．２００３ Ｊａｎ．３０；２（１）：１；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２００３ Ｊｕｌ．１；５２（１）：４７−５０；Ｌｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３ Ｊｕｌ．２５；２７８（３０）：２８２５２−７；ｖａｎ Ｋｏｎｉｎｇｓｂｒｕｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３ Ａｕｇｕｓｔ；２７９（１−２）：１４９−６１；Ｄｕｍｏｕｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００３ Ａｕｇ．１４；４２４（６９５０）：７８３−８；Ｂｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３ Ｓｅｐ．１９；３３２（３）：６４３−５５；Ｙａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３ Ｏｃｔ．１；２８１（１−２）：１６１−７５；Ｄｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；７７（２２）：１２１３２−９；Ｍｅｄｄｅｂ−Ｍｏｕｅｌｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ．２００３ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；４２（７）：７８５−９１；Ｖｅｒｈｅｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２００３ Ｄｅｃ．５；１６２４（１−３）：２１−８；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００４ Ｊａｎ．２；３３５（１）：４９−５６；Ｓｔｉｊｌｅｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４ Ｊａｎ．９；２７９（２）：１２５６−６１；Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４ Ａｐｒ．１５；６４（８）：２８５３−７；Ｓｐｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００４ Ａｐｒ．２３；５６４（１−２）：３５−４０；Ｐｌｅｓｃｈｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２００４ Ｍａｙ−Ｊｕｎｅ；１５（３）：６６４−７１；Ｎｉｃａｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２００４ Ｊｕｌｙ；１３（７）：１８８２−９１；Ｏｍｉｄｆａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．２００４ Ｊｕｌｙ−Ａｕｇｕｓｔ；２５（４）：１７９−８７；Ｏｍｉｄｆａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．２００４ Ｓｅｐ
ｔｅｍｂｅｒ−Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；２５（５−６）：２９６−３０５；Ｓｚｙｎｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００４ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；４８（９）：３３９０−５；Ｓａｅｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４ Ｄｅｃ．１０；２７９（５０）：５１９６５−７２；Ｄｅ Ｇｅｎｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４ Ｄｅｃ．１７；２７９（５１）：５３５９３−６０１；Ｄｏｌｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５ Ｊａｎｕａｒｙ；７１（１）：４４２−５０；Ｊｏｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ Ｊａｎｕａｒｙ；６６（４）：３８４−９２；Ｄｕｍｏｕｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５ Ｆｅｂ．２５；３４６（３）：７７３−８８；Ｙａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；２９７（１−２）：２１３−２４；Ｄｅ Ｇｅｎｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００５ Ａｐｒ．８；２８０（１４）：１４１１４−２１；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００５ Ａｐｒ．１３；Ｄｏｌｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．２００５ Ｍａｙ １５；５９（３）：５５５−６４；Ｂｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５ Ｍａｙ ６；３４８（３）：６９９−７０９；Ｚａｒｅｂｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５ Ａｐｒ．２１；［印刷前の電子刊行物］。
全般的に、その最も広い意味で本明細書において使用される用語「重鎖抗体の可変ドメイン」、「可変ドメイン」、または「重鎖可変ドメイン」は、特定の生物学的供給源または調製の特定の方法に限定されないことに注意されたい。たとえば、下記により詳細に議論されるように、本明細書において教示されるＶＨＨは、天然に存在するＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列の発現によってまたは核酸合成のための技術を使用してＶＨＨをコードする核酸を調製し、その後、それにより得られた核酸を発現させることによってまたは前述のものの任意の組み合わせによって得ることができる。前述のものを実行するのに適した方法および技術は、本明細書における開示に基づいて当業者に明らかになるであろう、また、たとえば、本明細書においてより詳細に記載される方法および技術を含む。
しかしながら、特定の実施形態に従って、本明細書において開示される重鎖抗体の可変ドメインは、ラクダ科の動物またはサメ由来の天然に存在するＶＨＨドメインのアミノ酸配列などのような、天然に存在するＶＨＨドメインのアミノ酸配列と全く同じである（すなわち、それと配列同一性の程度が１００％の）アミノ酸配列を有していない。
本明細書において使用されるように、用語「決定する」、「測定する」、「判断する」、「モニターする」、および「アッセイする」は、区別なく使用され、定量的および定性的決定を含む。
本明細書に引用される文書はすべて、それらの全体が参照によってこれによって組み込まれる。特に定義されない限り、技術用語および科学用語を含む本発明の開示において使用される用語はすべて、本発明が属する当技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。さらなる手引きによって、よりよく本発明の教示を認識するために用語の定義を含む。
トランスジェニック植物
本発明は、菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞に関する。
本明細書において使用されるように、「ＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド」および「ＶＨＨをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド」という言い回しは、区別なく使用されてもよい。
用語「トランスジェニック植物または植物組織」は、一般に、新たな特徴を有する植物を作るために遺伝子操作された植物または植物組織または植物細胞を指す。トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞はまた、遺伝子修飾生物体（ＧＭＯ）として同定することもできる。
用語「トランスジェニック植物」はまた、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞に由来する商品をも包含し、商品は、検出可能な量のトランスジェニックまたは組換えポリヌクレオチドを含み、商品は、植物バイオマス、油、食事、食品、動物飼料、小麦粉、フレーク、ふすま、リント、繊維、紙、タンパク質、デンプン、サイレージ、殻、および加工された種子からなる群から選択され、任意選択により、商品は、再生不可能である。
ある実施形態では、植物が、トウモロコシ、ダイズ、アルファルファ、ワタ、ヒマワリ、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）（たとえばキャノーラ、ナタネ）、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）（たとえばカラシ（菜の花））、およびブラッシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）などのようなアブラナ属油料種子、ヤシ科の種（たとえばギネアアブラヤシ、ココナッツ）、イネ、コムギ、サトウダイコン、サトウキビ、カラスムギ、ライムギ、オオムギ、キビおよびソルガム、ライコムギ、アマ、ナッツ、ブドウおよびブドウの木、ならびに様々な植物学的分類群由来の様々な果実および植物、たとえばバラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）の種（たとえば、リンゴおよびセイヨウナシなどのようなナシ状果、だけではなく、アプリコット、サクランボ、アーモンド、プラム、およびモモなどのような核果ならびにイチゴ、ラズベリー、アカおよびクロフサスグリ、ならびにグズベリーなどのような食用小果実）、リベシオイダエ科（Ｒｉｂｅｓｉｏｉｄａｅ）の種、クルミ科（Ｊｕｇｌａｎｄａｃｅａｅ）の種、カバノキ科（Ｂｅｔｕｌａｃｅａｅ）の種、ウルシ科（Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ）の種、ブナ科（Ｆａｇａｃｅａｅ）の種、クワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）の種、モクセイ科（Ｏｌｅａｃｅａｅ）の種（たとえばオリーブ）、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄａｃｅａｅ）の種、クスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）の種（たとえばアボカド、シナモン、カンフル）、バショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）の種（たとえばバナナ木およびプランテーション）、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）の種（たとえばコーヒー）、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）の種（たとえば茶）、アオギリ科（Ｓｔｅｒｃｕｌｉａｃｅａｅ）の種、ミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）の種（たとえばレモン、オレンジ、マンダリンミカン、およびグレープフルーツ）；ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）の種（たとえばトマト、ジャガイモ、コショウ、トウガラシ、ナス、タバコ）、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）の種、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）の種（たとえば、レタス、アーティチョーク、およびルートチコリー、エンダイブ、または一般的なチコリーを含むチコリー）、セリ科（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ）の種（たとえばニンジン、パセリ、セロリ、およびセルリアック）、ウリ科（Ｃｕ−ｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）の種（たとえば、ガーキンを含むキュウリ、パンプキン、スイカ、ヒョウタン、およびメロン）、ネギ科（Ａｌｌｉａｃｅａｅ）の種（たとえばニラおよびタマネギ）、十字花科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）の種（たとえば白キャベツ、赤キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、メキャベツ、パクチョイ、コールラビ、ラディッシュ、ホースラディッシュ、クレソン、およびハクサイ）、マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）の種（たとえばピーナッツ、エンドウマメ、レンズマメ、およびインゲン、たとえば一般的なインゲンおよびソラマメ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）の種（たとえばフダンソウ、飼料ビート、ホウレンソウ、ビートルート）、アマ科（Ｌｉｎａｃｅａｅ）の種（たとえばアサ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）の種（たとえばインドアサ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）の種（たとえばオクラ、ココア）、ケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）（たとえばポピー）、キジカクシ科（Ａｓｐａｒａｇａｃｅａｅ）（たとえばアスパラガス）；芝生、芝地、草、およびステビア（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）を含む庭および森において有用な植物および観賞植物、ならびに遺伝子修飾型のこれらの植物からなる群から選択されてもよい。
ある実施形態では、植物が、農作物、草、果実、野菜、芝地、木、および観賞植物からなる群から選択される作物であってもよい。
ある実施形態では、植物が、果実、花、ナッツ、野菜からなる群から選択される植物の収穫部分であってもよく、好ましくはアボカド、バナナ、プランテン、レモン、グレープフルーツ、メロン、オレンジ、パイナップル、キーウィフルーツ、グアバ、マンダリンミカン、マンゴー、およびパンプキンから選択される食用に適さない皮を有する果実または野菜が好ましく、より好ましくは、バナナ、オレンジ、レモン、およびモモ、特にバナナである。ある実施形態では、植物が、観賞植物の切り花であってもよく、好ましくは、ユリズイセン、カーネーション、キク、フリージア、センボンヤリ、グラジオラス、コゴメナデシコ（ジプソフィラ属の種）、ヒマワリ、アジサイ、ユリ、リシアンサス、バラ、および夏の花から選択される。ある実施形態では、植物が、カットされた草または木であってもよい。
ある実施形態では、植物が、シロイヌナズナ、コーン、タバコ、またはポプラなどのような、調査目的に使用される植物であってもよい。
ある実施形態では、植物が、コーン、イネ、コムギ、オオムギ、ソルガム、キビ、カラスムギ、ライムギ、ライコムギ、または他の穀類、ダイズ、アルファルファ、または他のマメ科作物、サトウダイコン、飼料ビート、パパイア、バナナ、およびプランテン、または他の果実、ブドウ、ナッツ、ナタネ、ヒマワリ、または他の油料作物、カボチャ、キュウリ、メロン、または他のウリ科の植物、ワタまたは他の繊維植物、サトウキビ、ヤシ、ジャトロファ、または他の燃料作物、キャベツ、トマト、コショウ、または他の植物、観賞植物、シラブ、ポプラ、ユーカリ、または他の木、常緑樹、草、コーヒーノキ、チャノキ、タバコ、ホップ、ゴムの木、ならびにラテックス植物からなる群から選択される植物であってもよい。
ある好ましい実施形態では、植物が、バナナ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キャノーラ、コーン、ワタ、ジャガイモ、イネ、ダイズ、タバコ、およびコムギからなる群から選択されてもよい。
あるより好ましい実施形態では、植物が、キャノーラ、コーン、イネ、ダイズ、およびコムギからなる群から選択されてもよい。
あるより好ましい実施形態では、植物が、イネ、ダイズ、およびコムギからなる群から選択されてもよい。
組換えＤＮＡ技術を含むトランスジェニック植物の生成のための方法は、当技術分野においてよく知られている。
特異的組換え手法は、一般に、ＤＮＡ分子が非相同である（すなわち宿主中に通常存在しない）発現系の中に、関心のあるアミノ酸配列、タンパク質、またはポリペプチドを発現するＤＮＡ分子を挿入することを含む。非相同ＤＮＡ分子は、適したセンス方向および正確なリーディングフレームにおいて発現系またはベクターに挿入される。ベクターは、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有する。ＤＮＡの転写は、プロモーターの存在に依存性である。同様に、原核生物におけるｍＲＮＡの翻訳は、真核生物と異なる適した原核生物シグナルの存在に依存する。遺伝子発現を最大限にすることについての概説については、Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｌａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８：４７３（１９７９を参照されたい。用いられる特異的な調節配列にかかわらず、ＤＮＡ分子は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）によって記載されるように、当技術分野における標準的なクローニング手順を使用してベクターの中にクローニングされる。一旦タンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子が発現系の中にクローニングされたら、それは宿主細胞の中に組み込まれる準備ができている。そのような組み込みは、ベクター／宿主細胞系に依存して、形質転換の様々な形態によって実行することができる。
ある実施形態では、本発明が、本明細書において定義されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞においてＶＨＨをコードすることができる核酸配列を提供する。これらの核酸配列はまた、ベクターまたは遺伝的構築物またはポリヌクレオチドの形態をとることができる。本明細書において使用されるように、用語「遺伝的構築物」および「核酸構築物」は、区別なく使用される。本明細書において開示される核酸配列は、合成もしくは半合成配列、ライブラリー（特に発現ライブラリー）から単離されたヌクレオチド配列、オーバーラップするプライマーを使用してＰＣＲによって調製されたヌクレオチド配列、またはそれ自体知られているＤＮＡ合成のための技術を使用して調製されたヌクレオチド配列であってもよい。ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号３３６および／または配列番号３３７の核酸配列を含んでいてもよい。
本明細書において開示される遺伝的構築物は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。本発明の遺伝的構築物はまた、意図される宿主細胞もしくは宿主生物体の形質転換に適した形態、意図される宿主細胞のゲノムＤＮＡの中への統合に適した形態、または意図される宿主生物体における独立した複製、維持、および／もしくは遺伝に適した形態をしていてもよい。たとえば、本発明の遺伝的構築物は、たとえばプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター、またはトランスポゾンなどのような、ベクターの形態をしていてもよい。特に、ベクターは、発現ベクター、すなわち、インビトロおよび／またはインビボにおける発現のために提供することができるベクターであってもよい（たとえば適した宿主細胞、宿主生物体、および／または発現系において）。
したがって、別のさらなる態様では、本発明がまた、本発明の１つまたは複数の核酸配列を含むベクターをも提供する。
以下の作動可能に連結されたＤＮＡエレメントを含むキメラ遺伝子もまた、開示される：ａ）植物で発現できるプロモーター、ｂ）転写された場合に、ポリペプチドに翻訳することができるｍＲＮＡ分子を産出するＤＮＡ領域、ならびにｃ）前記植物の細胞において機能する転写終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを含む３’末端領域。
「キメラ遺伝子」または「キメラ構築物」は、調節核酸配列が、植物細胞などのような細胞の中に導入された場合に、関連する核酸コード配列の転写または発現を調節することができるように、プロモーター（たとえば植物で発現できるプロモーター）または調節核酸配列が、ｍＲＮＡをコードする核酸配列に適切に作用するように連結されるまたは関連する組換え核酸配列である。キメラ遺伝子の調節核酸配列は、自然界に見つけられるように関連する核酸配列に適切に作用するようには通常連結されていない。
ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、植物における発現に適したプロモーター、植物組織もしくは植物細胞に特異的なプロモーター、または誘導性のプロモーターを含んでいてもよい。
本明細書において使用される用語「植物プロモーター」または「植物における発現に適したプロモーター」は、調節エレメントを含む核酸配列を指し、これは、植物細胞におけるコード配列の発現を媒介する。植物における発現のために、核酸分子は、正しい時点でかつ必要とされる空間的な発現パターンで遺伝子を発現する適したプロモーターに作動可能に連結されなければならないまたはそれを含まなければならない。
本明細書において使用される用語「作動可能に連結される」は、プロモーター配列が関心のある遺伝子の転写を開始することができるような、プロモーター配列および関心のある遺伝子の間の機能的な連結を指す。
植物で発現できるプロモーターは、植物における導入遺伝子の発現を指示することができる核酸配列を含む。植物で発現できるプロモーターの例は、少なくとも１つの細胞、組織、または器官において、必ずしもすべてではないが、ほとんどの増殖および発生の段階でかつほとんどの環境条件下で、転写的に活性である恒常的なプロモーターであり、他のプロモーターは、誘導性のプロモーターであり、他の例は、組織特異的プロモーターであり、さらに他の例は、環境ストレス誘導性のプロモーターである。
用語「植物組織または植物細胞に特異的なプロモーター」は、特定のタイプの植物細胞または植物組織において転写的に活性なプロモーターを指す。
用語「誘導性のプロモーター」は、植物発生、特に関心のある組織の特定のステージで遺伝子発現レベルを調節することを可能にするプロモーターを指す。誘導性の系の例は、ＡｌｃＲ／ＡｌｃＡ（エタノール誘発性）；ＧＲ融合物、ＧＶＧ、およびｐＯｐ／ＬｈＧＲ（デキサメタゾン誘発性）；ＸＶＥ／ＯｌｅｘＡ（ベータ−エストラジオール誘発性）；ならびに熱ショック誘発を含む。
植物において形質転換された場合のキメラ遺伝子（または発現カセット）は、タンパク質の発現をもたらす核酸を発現する。
本明細書において先に記載される発現カセット（またはキメラ遺伝子）を含む組換えベクターもまた、開示される。
用語「ターミネーター」は、一次転写物の３’プロセシングおよびポリアデニル化ならびに転写の終結のシグナルを送る転写ユニットの末端のＤＮＡ配列であるコントロール配列を包含する。ターミネーターは、天然の遺伝子に、様々な他の植物遺伝子に、またはＴ−ＤＮＡに由来することができる。追加されるターミネーターは、たとえばノパリンシンターゼ遺伝子もしくはオクトピンシンターゼ遺伝子に、その代わりに別の植物遺伝子に、またはそれほど好ましくないが任意の他の真核生物の遺伝子に由来してもよい。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）からなる抗体断片をコードする少なくとも１つの配列を含んでいてもよい。ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）からなる抗体断片をコードしてもよい。
ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、免疫グロブリン軽鎖などのような抗体の軽鎖をコードする配列を含まなくてもよい。ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、免疫グロブリンをコードしなくてもよい。
ある実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、免疫グロブリン軽鎖などのような抗体の軽鎖をコードする（少なくとも１つの配列を含む）いかなるポリヌクレオチドも含まなくてもよい。ある実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、免疫グロブリンをコードする（少なくとも１つの配列を含む）いかなるポリヌクレオチドも含まなくてもよい。
ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、分泌のための、細胞質への配置のための、またはＥＲ内腔、アポプラスト、液胞、または内膜および／もしくは外膜などのような細胞コンパートメントまたは細胞小器官への配置のための、標的シグナルをコードする少なくとも１つの配列を含んでいてもよい。
分泌のための標的シグナルの例は、２Ｓ２シグナルペプチドを含む。ＥＲ内腔などのような細胞コンパートメントまたは細胞小器官への配置のための標的シグナルの例は、ＥＲ保留シグナル（ＫＤＥＬ）を含む。
ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、細胞質への配置のためのＡＴＧ開始コドンを含んでいてもよい。
ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、ＶＨＨそれ自体を、１つもしくは複数の同一のもしくは異なるＶＨＨとの組み合わせとしてまたは結晶化可能領域（Ｆｃ領域）との１つもしくは複数の同一のもしくは異なるＶＨＨの組み合わせとして、任意選択によりスペーサーと共にコードしてもよい。
用語「結晶化可能領域」または「Ｆｃ領域」は、抗体のテイル領域を指す。Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体および補体系のいくつかのタンパク質と相互作用し得る。ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ抗体アイソタイプのＦｃ領域は、抗体の２つの重鎖の第２および第３の定常ドメインに由来する２つの同一のタンパク質断片から構成される。ＩｇＭおよびＩｇＥのＦｃ領域は、それぞれのポリペプチド鎖に３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨドメイン２〜４）を含有する。
そのようなＦｃ領域は、ＶＨＨの安定性を好都合に増強してもよいおよび／またはＶＨＨの発現を増加させてもよい。
ある実施形態では、Ｆｃ領域が、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＭ抗体、またはＩｇＥ抗体のＦｃ領域であってもよい。ある好ましい実施形態では、Ｆｃ領域が、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、またはＩｇＤ抗体のＦｃ領域であってもよい。あるより好ましい実施形態では、Ｆｃ領域が、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域であってもよい。
ある実施形態では、Ｆｃ領域が、マウス抗体のＦｃ領域（すなわちマウスＦｃ領域）であってもよい。ある好ましい実施形態では、Ｆｃ領域が、ヒト抗体のＦｃ領域（すなわちヒトＦｃ領域）であってもよい。
ある好ましい実施形態では、Ｆｃ領域が、マウスＩｇＧ３抗体のＦｃ領域であってもよい。ある好ましい実施形態では、Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域であってもよい（ｈＧＦｃ；Ｖａｎ Ｄｒｏｏｇｅｎｂｒｏｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１０４（４）：１４３０−５）。
本明細書において使用される用語「一価」は、１つの結合部位を含む抗体または抗体断片を指す。
本明細書において使用される用語「二価」は、２つ以上の結合部位を含む抗体または抗体断片を指す。
本明細書において区別なく使用される用語「スペーサー」または「リンカー」は、少なくとも２つのＶＨＨを空間的に分離する少なくとも１つのアミノ酸を指す。例示的なスペーサーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３５２）からなる９ＧＳスペーサーを含む。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、本明細書において開示されるＶＨＨが、１つまたは複数のリンカーを介して１つまたは複数のさらなる基、成分、または残基に任意選択により連結されてもよい。これらの１つまたは複数のさらなる基、成分、または残基は、関心のある他の標的への結合に役立つことができる。そのようなさらなる基、残基、成分、および／または結合部位が、本明細書において開示されるＶＨＨにさらなる機能性をもたらしても、もたらさなくてもよく、また本明細書において開示されるＶＨＨの特性を修飾しても、修飾しなくてもよいことは明らかであるべきである。そのような基、残基、成分、または結合ユニットはまた、たとえば、生物学的に活性になることができる化学基である。
これらの基、成分、または残基は、特定の実施形態において、本明細書において開示されるＶＨＨにＮまたはＣ末端で連結される。
たとえば、可変ドメイン重鎖抗体へのそのような官能基の導入または連結は、可変ドメイン重鎖抗体の可溶性および／もしくは安定性の増加、可変ドメイン重鎖抗体の毒性の低下、または可変ドメイン重鎖抗体の任意の望ましくない副作用の排除もしくは減弱、ならびに／または他の有利な特性をもたらすことができる。
特定の実施形態では、１つまたは複数のグループ、残基、成分が、１つまたは複数の適したリンカーまたはスペーサーを介して可変ドメイン重鎖抗体に連結される。
さらに特定の実施形態では、本明細書において開示される２つまたはそれ以上の標的特異的可変ドメイン重鎖抗体が、互いに連結されてもよいまたは相互に連結されてもよい。特定の実施形態では、２つまたはそれ以上の可変ドメイン重鎖抗体が、１つまたは複数の適したリンカーまたはスペーサーを介して互いに連結されてもよい。本明細書において開示される様々な可変ドメイン重鎖抗体のカップリングで使用される適したスペーサーまたはリンカーは、当業者に明らかであろう、また、通常、ペプチドおよび／またはタンパク質を連結するために当技術分野において使用される任意のリンカーまたはスペーサーであってもよい。
いくつかの特に適したリンカーまたはスペーサーは、たとえば、グリシンリンカー、セリンリンカー、混合グリシン／セリンリンカー、グリシンおよびセリンリッチリンカーなどのようなポリペプチドリンカーまたは主として極性のポリペプチド断片またはグルタルアルデヒドまたは任意選択によりＰＥＧにより間隔をあけられたマレイミドもしくはＮＨＳエステルなどのようなホモまたはヘテロ二機能性化学架橋化合物から構成されるリンカーを含むが、これらに限定されない。
たとえば、ポリペプチドリンカーまたはスペーサーは、１〜３０、特に１〜１０のアミノ酸残基などのような、１〜５０のアミノ酸の長さを有する適したアミノ酸配列であってもよい。リンカーの長さ、柔軟性の程度、および／または他の特性は、菌類標的に対する親和性、特異性、または結合活性を含むが、これらに限定されないＶＨＨの特性に対していくらかの影響を有し得ることが明らかであるべきである。２つまたはそれ以上のリンカーが使用される場合、これらのリンカーは、同じであってもよいまたは異なっていてもよいことが明らかであるべきである。本発明の関連および開示において、当業者は、いかなる過度の実験的な負担を伴うことなく、本明細書において開示されるＶＨＨをカップリングする目的で最適なリンカーを決定することができるであろう。
「選択可能マーカー」、「選択可能マーカー遺伝子」、または「レポーター遺伝子」は、本発明の核酸構築物によりトランスフェクトされるまたは形質転換される細胞の同定および／または選択を容易にするためにそれが発現される細胞に表現型を付与する任意の遺伝子を含む。これらのマーカー遺伝子は、一連の様々な成分を介して核酸分子の移入の成功の同定を可能にする。適したマーカーは、新たな代謝の形質を導入するまたは視覚的な選択を可能にする、抗生物質または除草剤抵抗性を付与するマーカーから選択されてもよい。選択可能マーカー遺伝子の例は、抗生物質（ネオマイシンおよびカナマイシンをリン酸化するｎｐｔｌｌまたはハイグロマイシンをリン酸化するｈｐｔまたはたとえばブレオマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、ジェネテシン（Ｇ４１８）、スペクチノマイシン、もしくはブラストサイジンに対する抵抗性を付与する遺伝子など）、除草剤（たとえば、Ｂａｓｔａ（登録商標）に対する抵抗性をもたらすｂａｒ；グリフォセートに対する抵抗性をもたらすａｒｏＡもしくはｇｏｘ、またはたとえばイミダゾリノン、ホスフィノトリシン、もしくはスルホニル尿素に対する抵抗性を付与する遺伝子）に対する抵抗性を付与する遺伝子または代謝の形質をもたらす遺伝子（植物が唯一の炭素供給源としてマンノースを使用することを可能にするｍａｎＡもしくはキシロースの利用のためのキシロースイソメラーゼもしくは２−デオキシグルコースに対する抵抗性などのようなアンチニュートリエントマーカーなど）を含む。視覚的なマーカー遺伝子の発現は、色（たとえばβ−グルクロニダーゼ、ＧＵＳ、もしくはβ−ガラクトシダーゼとその有色基質、たとえばＸ−Ｇａｌ）、発光（ルシフェリン／ルシフェラーゼ系など）、または蛍光（緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ、およびその誘導体）の形成をもたらす。このリストは、考え得るマーカーのうちのわずかしか示していない。当業者は、そのようなマーカーに精通している。
植物細胞の中への核酸の永続性のもしくは一過性の統合に際して、わずかな細胞しか外来性ＤＮＡを取込まず、所望される場合、使用される発現ベクターおよび使用されるトランスフェクション技術に依存してそのゲノムの中にそれを統合することが知られている。これらの組み込み体を同定し、選択するために、選択可能マーカーをコードする遺伝子（上記に記載されるものなど）は、普通、関心のある遺伝子と一緒に宿主細胞の中に導入される。これらのマーカーは、たとえば、これらの遺伝子がたとえば従来の方法による欠失によって機能的ではなくなっている突然変異体において使用することができる。さらに、選択可能マーカーをコードする核酸分子は、本発明のポリペプチドをコードする配列を含むもしくは本発明の方法において使用される同じベクターでまたはそうでなければ別々のベクターで宿主細胞の中に導入することができる。導入された核酸により永続的にトランスフェクトされた細胞は、たとえば選択によって同定することができる（たとえば、選択可能マーカーを統合した細胞は生存するのに対して別の細胞は死亡する）。
マーカー遺伝子、特に抗生物質および除草剤に対する抵抗性のための遺伝子は、一旦核酸が導入に成功したら、トランスジェニック宿主細胞においてもはや必要とされないまたは望まれないので、核酸の導入のために本発明に従うプロセスは、これらのマーカー遺伝子の除去または切り出しを可能にする技術を好都合に用いる。１つのそのような方法は、同時形質転換として知られているものである。同時形質転換方法は、形質転換に２つのベクターを同時に用い、一方のベクターは、本発明に従う核酸を運び、第２のベクターはマーカー遺伝子を運ぶ。多くの形質転換体は、両方のベクターを受け入れるまたは植物の場合には含む（形質転換体の４０％またはそれ以上まで）。アグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）による形質転換の場合には、形質転換体は、普通、ベクターの一部のみ、すなわち、普通は発現カセットに相当する、Ｔ−ＤＮＡが側面に位置する配列を受け入れる。マーカー遺伝子は、交差を実行することによって形質転換された植物から続いて除去することができる。別の方法では、トランスポゾンの中に統合されたマーカー遺伝子は、所望の核酸と一緒に形質転換のために使用される（Ａｃ／Ｄ技術として知られている）。形質転換体は、トランスポザーゼ供給源と交差することができるまたは形質転換体は、トランスポザーゼの発現を付与する核酸構築物により一時的にもしくは永続性に形質転換される。ある場合（およそ１０％）には、トランスポゾンは、一旦形質転換の実行に成功したら、宿主細胞のゲノムから飛び出し、失われる。さらに多くの場合には、トランスポゾンは、異なる場所に飛ぶ。これらの場合には、交差を実行することによってマーカー遺伝子を排除しなければならない。微生物学では、そのようなイベントの検出を可能にするまたは容易にする技術が開発された。さらに有利な方法は、組換え系として知られているものに依存し、この利点は、交差による排除を省くことができることである。このタイプの最もよく知られている系は、Ｃｒｅ／ｌｏｘ系として知られているものである。Ｃｒｅ１は、ｌｏｘＰ配列の間に位置する配列を除去するレコンビナーゼである。マーカー遺伝子がｌｏｘＰ配列の間に統合される場合、マーカー遺伝子は、一旦形質転換の実行に成功したら、レコンビナーゼの発現によって除去される。さらなる組換え系は、ＨＩＮ／ＨＩＸ、ＦＬＰ／ＦＲＴ、およびＲＥＰ／ＳＴＢ系である（Ｔｒｉｂｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，２０００：２２２５５−２２２６７；Ｖｅｌｍｕｒｕｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１４９，２０００：５５３−５６６）。本発明による核酸配列の植物ゲノムの中への部位特異的な統合が、可能である。
本発明の目的のためのトランスジェニック植物は、したがって、上記のように、本発明の方法において使用される核酸が前記植物のゲノム中に存在せずもしくはそれに起源を持たずまたは前記植物のゲノム中に存在するが、前記植物のゲノム中のそれらの天然の遺伝子座になく、核酸が相同的にまたは非相同的に発現することができることを意味するとして理解される。しかしながら、述べられるように、トランスジェニックはまた、本発明によるもしくは本発明の方法において使用される核酸が植物のゲノム中のそれらの天然の位置にあるが、配列が天然の配列に関して修飾されているおよび／または天然の配列の調節配列が修飾されていることをも意味する。トランスジェニックは、ゲノム中の非天然の遺伝子座での本発明による核酸の発現、すなわち、核酸の相同または非相同発現が実行されることを意味するとして好ましくは理解される。好ましいトランスジェニック植物が、本明細書において述べられる。
用語「発現」または「遺伝子発現」は、特異的な遺伝子または特異的な遺伝的構築物の転写を意味する。本明細書において使用される用語「発現」または「遺伝子発現」は、ポリヌクレオチドまたは遺伝子または遺伝的構築物の構造ＲＮＡ（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＲＮＡ）（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）またはｍＲＮＡへの転写を指し、後者のタンパク質への続く翻訳を伴うまたは伴わない。このプロセスは、ＤＮＡの転写および結果として生じるｍＲＮＡ産物のプロセシングを含む。
本明細書において使用される用語「発現の増加」または「過剰発現」は、本来の野生型発現レベルに対して付加的な発現の任意の形態を意味する。本発明の目的のために、本来の野生型発現レベルはまた、ゼロであってもよい、すなわち発現がなくてもよいまたは発現が測ることのできないものであってもよい。
遺伝子または遺伝子産物の発現を増加させるための方法は、当技術分野において十分に立証されており、たとえば、適切なプロモーター（本明細書において先に記載される）、転写エンハンサーまたは翻訳エンハンサーの使用によって駆動される過剰発現を含む。プロモーターまたはエンハンサーエレメントとして役立つ単離核酸は、関心のあるポリペプチドをコードする核酸の発現をアップレギュレートするために、ポリヌクレオチドの非非相同（ｎｏｎ−ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）形態の適切な位置（典型的に上流）に導入されてもよい。ポリペプチド発現が所望される場合、ポリヌクレオチドコード領域の３’末端にポリアデニル化領域を含むことは一般に望ましい。ポリアデニル化領域は、天然の遺伝子、様々な他の植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡに由来することができる。追加される３’末端配列は、たとえばノパリンシンターゼ遺伝子もしくはオクトピンシンターゼ遺伝子に、その代わりに別の植物遺伝子に、またはそれほど好ましくないが任意の他の真核生物の遺伝子に由来してもよい。
イントロン配列もまた、細胞質ゾル中に蓄積する成熟メッセージの量を増加させるために、部分的コード配列の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）またはコード配列に追加されてもよい。植物および動物発現構築物の両方の転写単位における、スプライスすることができるイントロンの組み入れは、１０００倍までｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方で遺伝子発現を増加させることが示された（Ｂｕｃｈｍａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌ．８：４３９５−４４０５；Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，１：１，１８３−１２００）。遺伝子発現のそのようなイントロン増強は、転写単位の５’末端の近くに置かれた場合に、典型的に最も大きい。トウモロコシイントロンＡｄｈ１−Ｓイントロン１、２、および６、Ｂｒｏｎｚｅ−１イントロンの使用は、当技術分野において知られている。一般的な情報については、Ｔｈｅ Ｍａｉｚｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｃｈａｐｔｅｒ １ １６，Ｆｒｅｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｗａｌｂｏｔ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照されたい。
本明細書において使用される用語「コード」は、ポリヌクレオチドまたは遺伝子または遺伝的構築物の構造ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）またはｍＲＮＡへの転写を指し、タンパク質への後者の続く翻訳を伴う。
本明細書において言及される用語「導入」または「形質転換」は、移入のために使用される方法に関係なく、宿主細胞の中への外因性のポリヌクレオチドまたはキメラ遺伝子（または発現カセット）の移入を包含する。器官形成か胚形成かに関わらず、続いて栄養系繁殖ができる植物組織または植物細胞は、本発明の遺伝的構築物により形質転換されてもよく、植物全体がそれから再生される。選ばれる特定の組織は、形質転換されている特定の種に利用可能で、かつそれに最もよく適した栄養系繁殖系に依存して変わるであろう。例示的な組織標的は、円板状の葉（ｌｅａｆ ｄｉｓｋ）、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、既存の分裂組織（たとえば頂端分裂組織、腋芽、および根分裂組織）、ならびに誘導性の分裂組織（たとえば子葉分裂組織および胚軸分裂組織）を含む。ポリヌクレオチドは、宿主細胞の中に一時的にまたは永続的に導入されてもよく、たとえばプラスミドとして、統合されずに維持されてもよい。その代わりに、ポリヌクレオチドは、宿主ゲノムの中に統合されてもよい。結果として生じる形質転換された植物細胞は、次いで、当業者らに知られている方法で、形質転換された植物を再生するために使用されてもよい。
植物のゲノムの中への外来遺伝子の移入は、形質転換と呼ばれる。植物種の形質転換は、今や、かなりルーチン的な技術となっている。好都合に、いくつかの形質転換方法のいずれも、適した祖先細胞の中に関心のある遺伝子を導入するために使用されてもよい。植物組織または植物細胞からの植物の形質転換および再生について記載される方法は、一過性のまたは永続性の形質転換のために利用されてもよい。形質転換方法は、リポソームの使用、エレクトロポレーション、遊離ＤＮＡ取込みを増加させる化学物質、植物の中に直接ＤＮＡを注射、パーティクルガン衝撃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、ウイルスまたは花粉を使用する形質転換、およびマイクロプロジェクション（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）を含む。方法は、プロトプラストについてのカルシウム／ポリエチレングリコール方法（Ｋｒｅｎｓ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９６，７２−７４；Ｎｅｇｒｕｔｉｕ Ｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ８：３６３− ３７３）；プロトプラストのエレクトロポレーション（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ Ｒ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ ３，１０９９−１ １０２）；植物材料の中へのマイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ Ａ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２０２：１７９−１８５）；ＤＮＡまたはＲＮＡコーティング微粒子銃（Ｋｌｅｉｎ ＴＭ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０）、（非統合的）ウイルスによる感染、およびにその他同種のものから選択されてもよい。
トランスジェニック作物植物を含むトランスジェニック植物は、アグロバクテリウム媒介性の形質転換を介して好ましくは産生される。有利な形質転換方法は、植物体における形質転換である。この目的のために、たとえば、アグロバクテリアを植物種子に作用させるまたはアグロバクテリアを植物分裂組織に接種することができる。本発明に従って、形質転換されたアグロバクテリアの懸濁液をインタクトな植物または少なくとも花原基に作用させることが特に好都合であることが分かった。処置された植物の種子が得られるまで、植物を続いて成長させる（Ｃｌｏｕｇｈ ａｎｄ Ｂｅｎｔ，Ｐｌａｎｔ Ｊ．（１９９８）１６，７３５−７４３）。イネのアグロバクテリウム媒介性の形質転換についての方法は、以下のもののいずれかにおいて記載されるものなどのようなイネ形質転換についてよく知られている方法を含む：開示が、あたかも全部記載されるかのように、本明細書において参照によって組み込まれる欧州特許出願ＥＰ１１９８９８５、Ａｌｄｅｍｉｔａ ａｎｄ Ｈｏｄｇｅｓ（Ｐｌａｎｔａ １９９：６１２−６１７，１９９６）；Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２（３）：４９１−５０６，１９９３）、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｊ ６（２）：２７１−２８２，１９９４）。コーン形質転換の場合には、好ましい方法は、あたかも全部記載されるかのように、本明細書において参照によって組み込まれるＩｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４（６）：７４５−５０，１９９６）またはＦｒａｍｅ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２９（１）：１３−２２，２００２）において記載されるとおりである。前記方法は、Ｂ．Ｊｅｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．１，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ｓ．Ｄ．Ｋｕｎｇ ａｎｄ Ｒ．Ｗｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）１２８−１４３、およびＰｏｔｒｙｋｕｓ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４２（１９９１）２０５−２２５）において例としてさらに記載される。発現される核酸または構築物は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を形質転換するのに適しているベクター、たとえばｐＢｉｎ１９（Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２−８７１１）またはｐＭＰ９０（Ｋｏｎｃｚ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌ（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４，３８３−３９６）の中に好ましくはクローニングされる。次いで、そのようなベクターによって形質転換されたアグロバクテリアは、シロイヌナズナのようにモデルとして使用される植物（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））は、本発明の範囲内で、作物植物と見なされない）または例としてタバコ植物などのような作物植物などのような植物の形質転換のための既知の方法において、たとえば、アグロバクテリアの溶液中に、傷をつけた葉または刻んだ葉を浸漬し、次いで適した培地中でそれらを培養することによって使用することができる。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による植物の形質転換は、たとえばＨｏｆｇｅｎ ａｎｄ Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ ｉｎ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（１９８８）１６，９８７７によって記載されるまたは特にＴｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．１，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ｓ．Ｄ．Ｋｕｎｇ ａｎｄ Ｒ．Ｗｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３，ｐｐ．１５−３８のＦ．Ｆ．Ｗｈｉｔｅ，Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｈｉｇｈｅｒ Ｐｌａｎｔｓから知られている。
インタクトな植物に次いで再生しなければならない体細胞の形質転換に加えて、植物分裂組織の細胞、特に、配偶子に発生する細胞を形質転換することもまた可能である。この場合、形質転換された配偶子は、自然の植物の発生に従い、トランスジェニック植物をもたらす。したがって、たとえば、シロイヌナズナの種子は、アグロバクテリアにより処置され、一定の割合が形質転換されており、したがってトランスジェニックである発生中の植物から種子が得られる［Ｆｅｌｄｍａｎ，ＫＡ ａｎｄ Ｍａｒｋｓ ＭＤ（１９８７）．Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２０８：１−９；Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｋ（１９９２）．Ｉｎ：Ｃ Ｋｏｎｃｚ，Ｎ−Ｈ Ｃｈｕａ ａｎｄ Ｊ Ｓｈｅｌｌ，ｅｄｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｗｏｒｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，ｐｐ．２７４−２８９］。代替の方法は、花序の除去の繰り返しおよび形質転換されたアグロバクテリアとの、ロゼットの中心の切除部位のインキュベーションに基づき、それによって、形質転換された種子は、後期の時点で同様に得ることができる（Ｃｈａｎｇ（１９９４）．Ｐｌａｎｔ Ｊ．５：５５１−５５８；Ｋａｔａｖｉｃ（１９９４）．Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，２４５：３６３−３７０）。しかしながら、とりわけ効率的な方法は、真空浸透方法と「フローラルディップ（ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ）」法などのようなその改良版である。シロイヌナズナの真空浸透の場合には、減圧下のインタクトな植物がアグロバクテリアの懸濁液により処置されるが［Ｂｅｃｈｔｈｏｌｄ，Ｎ（１９９３）．ＣＲ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｐａｒｉｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，３１６：１ １９４−１ １９９］、「フローラルディップ」法の場合、発生中の花の組織が、界面活性剤で処置したアグロバクテリアの懸濁液と共に短い間インキュベートされる［Ｃｌｏｕｇｈ，ＳＪ ａｎｄ Ｂｅｎｔ ＡＦ（１９９８）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ．１６，７３５−７４３］。一定の割合のトランスジェニック種子が両方の場合において収穫され、これらの種子は、上記の選択的な条件下で成長させることによって非トランスジェニック種子と区別することができる。そのうえ、プラスチドが母系遺伝するので、プラスチドの永続性の形質転換は有利であり、ほとんどの作物について、花粉を通しての導入遺伝子の流出の危険性を低下させるまたは排除する。葉緑体ゲノムの形質転換は、Ｋｌａｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００４ ［Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（２），２２５−２２９］において概略的に表されたプロセスによって一般に達成される。手短かに言えば、形質転換される配列は、葉緑体ゲノムに相同なフランキング配列の間で選択可能マーカー遺伝子と一緒にクローニングされる。これらの相同なフランキング配列は、プラストームの中への部位特異的な統合を指示する。プラスチドの形質転換は、様々な植物種について記載されており、概要は、Ｂｏｃｋ（２００１）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｓｔｉｄｓ ｉｎ ｂａｓｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｓｅｐ ２１；３１２（３）：４２５−３８またはＭａｌｉｇａ，Ｐ（２００３）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｔｉｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，２０−２８において示される。さらに生物工学的な進歩が、マーカーなしのプラスチド形質転換体の形態で最近報告されており、これは、一過性同時統合標識遺伝子によって産生することができる（Ｋｌａｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（２），２２５−２２９）。
遺伝子修飾植物細胞は、当業者が精通しているすべての方法を介して再生することができる。適した方法は、Ｓ．Ｄ．Ｋｕｎｇ ａｎｄ Ｒ．Ｗｕ，ＰｏｔｒｙｋｕｓまたはＨｏｆｇｅｎ ａｎｄ Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒによる上述の刊行物において見出すことができる。
一般に、形質転換の後、植物細胞または細胞群は、関心のある遺伝子と共に同時に移入された、植物が発現できる遺伝子によってコードされる１つまたは複数のマーカーの存在について選択され、その後、形質転換された材料は、植物全体に再生される。形質転換された植物を選択するために、形質転換において得られた植物材料は、通常、形質転換された植物が非形質転換植物と区別することができるように、選択的な条件にさらされる。たとえば、上記方法において得られた種子は、植えられ、初期の成長期の後に、スプレーによって適した選択にかけられる。形質転換された種子のみが植物に成長することができるように、適した選択薬剤を使用する寒天プレート上で適切であれば滅菌の後に種子を成長させることもさらにあり得る。その代わりに、形質転換された植物は、上記に記載されるものなどのような選択可能マーカーの存在についてスクリーニングされる。
ＤＮＡ移入および再生の後に、推定上形質転換された植物はまた、関心のある遺伝子の存在、コピー数、および／またはゲノムの構成について、たとえばサザン分析を使用して評価されてもよい。その代わりにまたはそのうえ、新しく導入されたＤＮＡの発現レベルは、ノーザンおよび／またはウエスタン分析を使用してモニターされてもよく、両方の技術は、当業者らによく知られている。
生成された形質転換植物は、栄養系繁殖または古典的繁殖技術によってなどのように様々な手段によって繁殖させてもよい。たとえば、第一世代（またはＴ１）形質転換植物は、自家受粉させてもよく、ホモ接合性第２世代（またはＴ２）形質転換体は、選択されてもよく、次いで、Ｔ２植物は、古典的な繁殖技術を通してさらに繁殖させてもよい。生成された形質転換された生物体は、様々な形態を取ってもよい。たとえば、それらは、形質転換細胞および形質転換されていない細胞のキメラ；クローン形質転換体（たとえば、すべての細胞が発現カセットを含有するように形質転換されている）；形質転換された組織および非形質転換組織の接木（たとえば植物では、形質転換された台木が非形質転換接ぎ穂に接ぎ木される）であってもよい。
ある実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、非修飾（すなわち、野生型などのように形質転換されていないまたは非形質転換）植物または植物組織に比べて（すなわち比較して）、本明細書において教示されるように、ＶＨＨのレベルが増加していてもよいまたは増強されていてもよい。
本明細書において教示されるＶＨＨのレベルは、タンパク質の濃度を測定するための当技術分野において知られている任意の方法によって決定することができる。たとえば、本明細書において教示されるＶＨＨのレベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定することができる。ＶＨＨのレベルは、総タンパク質量に比べたＶＨＨの量のパーセンテージとして表現することができる。
用語「数量」、「量」、および「レベル」は、同義であり、一般に、当技術分野において十分に理解される。タンパク質に関して、この用語は、特に、サンプル中のタンパク質の絶対的な定量化またはサンプル中のタンパク質の相対的な定量化、すなわち参照値（たとえば総タンパク質含有量）に比べてなどのように別の値と比べた定量化を指してもよい。
ある実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞において、特にトランスジェニック植物または植物組織の抽出物において、全可溶性タンパク質の量の少なくとも０，００１％の、本明細書において教示されるＶＨＨのレベルを有していてもよい。たとえば、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞において、特にトランスジェニック植物または植物組織の抽出物において、全可溶性タンパク質の量の少なくとも０，００５％、少なくとも０，０１％、少なくとも０，０５％、少なくとも０，１％、少なくとも０，２％、少なくとも０，３％、少なくとも０，４％、または少なくとも０，５％の、本明細書において教示されるＶＨＨのレベルを有していてもよい。
植物または植物組織または植物細胞の全可溶性タンパク質を抽出することができる。ルーチン的な手順は、植物または植物組織の抽出物中の全可溶性タンパク質の量を決定するために使用することができる。好ましくは、タンパク濃度は、当技術分野において知られているＢｒａｄｆｏｒｄ分析などのような比色法によって決定される。抗ＶＨＨ抗体の断片抗体を使用するウエスタンブロットは、ＶＨＨ抗体断片がトランスジェニック植物において発現されることを確認するために使用することができる。好ましくは、抗ヒスチジン抗体は、ヘキサヒスチジンタグを持つＶＨＨを検出するために使用される。好ましくは、抗Ｆｃ抗体は、抗体Ｆｃ断片に融合されたＶＨＨを検出するために使用される。サンプル中のＶＨＨの濃度は、既知量の標準的な一連のＶＨＨとサンプルを比較して計算することができる。ＶＨＨ発現のレベルは、ＶＨＨおよび全可溶性タンパク質の濃度から計算することができる。
一態様では、本発明者らは、特異的に、菌類のスフィンゴ脂質に結合することができ、かつ植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に結合することができる少なくとも１つのＶＨＨを含むトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞を同定した。重要なことには、植物病原性菌類の特異的な分子構造とのこの相互作用を通して、本明細書において開示されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞は、植物病原体の増殖がコントロールされる、調整される、阻害される、妨げられる、または低下するように、植物病原体の１つまたは複数の生物学的活性をコントロールする、調整する、阻害する、妨げる、または低下させることができる。ある実施形態では、本明細書において教示されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合することができ、かつ植物または植物組織において発現される少なくとも１つのＶＨＨの特異的な相互作用を通して植物病原性菌類を死滅させることができる。
したがって、本明細書において開示されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞は、その植物病原性菌類のスフィンゴ脂質標的上に存在する結合部位に結合することによって、植物病原性菌類の生物学的機能を変化させる、減少させる、または阻害するためなどのように、調整するために使用し、それによって、植物病原性菌類の天然の生物学的活性（これに限定されないが増殖など）および／またはその植物病原性菌類の構造的な標的が関与する１つもしくは複数の生物学的経路に影響を与えることができる。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、本明細書において教示されるＶＨＨが、植物病原体標的または植物病原体抗原に特異的な結合（本明細書において定義される）ができてもよく、より好ましくは、本明細書において定義される親和性で植物病原体標的または植物有害生物抗原または植物病原体抗原に結合することができる（本明細書においてさらに記載されるように、ＫＤ値（実際のもしくは見かけ上の）、ＫＡ値（実際のもしくは見かけ上の）、ｋｏｎ速度および／もしくはｋｏｆｆ速度としてまたはその代わりにＩＣ５０値として適切に測定されるおよび／または表現される）。
特定の実施形態では、本発明が、活性物質として８０〜２００アミノ酸の少なくとも１つのポリペプチドまたはアミノ酸配列を含む、植物有害生物、より詳細には植物菌類を根絶するためのトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞を提供する。
ある実施形態では、本発明が、活性物質として８０〜２００アミノ酸の少なくとも２つのポリペプチドまたは少なくとも２つのアミノ酸配列を含む、植物有害生物を根絶するためのトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞を提供する。
ある実施形態では、本発明が、活性物質として８０〜２００アミノ酸の少なくとも３つのポリペプチドまたは少なくとも３つのアミノ酸配列を含む、植物有害生物を根絶するためのトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞を提供する。
先に定義される、植物有害生物を根絶するための本発明に従うトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞は、先に定義されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞、より詳細には、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞においてコードされるＶＨＨが、１つまたは複数の植物、好ましくは作物に対する１つまたは複数の植物有害生物の有害な影響に干渉する、好ましくは低下させるまたは阻止することができることを意味する。
したがって、一実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、活性物質として８０〜２００アミノ酸のポリペプチドを含む。
より特定の実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、８０〜１００アミノ酸、８００〜１２０アミノ酸、８０〜１４０アミノ酸、８０〜１６０アミノ酸、または８０〜１８０アミノ酸のポリペプチドを含む。
さらに別の実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、１００〜２００アミノ酸、１００〜１８０アミノ酸、１００〜１６０アミノ酸、１００〜１５０アミノ酸、１００〜１４０アミノ酸、または１００〜１２０アミノ酸のポリペプチドを含む。
さらに別の実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、１１０〜２００アミノ酸、１１０〜１８０アミノ酸、１１０〜１６０アミノ酸、１１０〜１４０アミノ酸、または１１０〜１３０アミノ酸のポリペプチドを含む。
さらに別の実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、１２０〜２００アミノ酸、１２０〜１８０アミノ酸、１２０〜１６０アミノ酸、または１２０〜１４０アミノ酸のポリペプチドを含む。
さらに別の実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、１４０〜２００アミノ酸、１４０〜１８０アミノ酸、または１４０〜１６０アミノ酸のポリペプチドを含む。
さらに別の実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、１６０〜２００アミノ酸または１６０〜１８０アミノ酸のポリペプチドを含む。
本明細書において開示されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞中に含まれる重鎖抗体（ＶＨＨ）の少なくとも１つの可変ドメインは、天然に存在するポリペプチドとすることができるまたはその代わりに完全に人工的に設計することができる。そのような天然に存在するポリペプチドの非限定的な例は、重鎖抗体（ｈｃＡｂ）を含む。
特定の実施形態によれば、本発明が、これらに限定されないが、菌類スフィンゴ脂質抗原または菌類スフィンゴ脂質標的などのようなスフィンゴ脂質抗原またはスフィンゴ脂質標的に結合するのに特に適しているアミノ酸残基（すなわち小さなペプチド）の多くのストレッチを提供する。
アミノ酸残基のこれらのストレッチは、特に、それらがそのＶＨＨの抗原結合部位（の一部）を形成するように、本明細書において開示されるＶＨＨ中に存在してもよいおよび／またはその中に組み込まれてもよい。アミノ酸残基のこれらのストレッチが、スフィンゴ脂質標的に対して産生された重鎖抗体またはＶＨもしくはＶＨＨ配列などのように、抗体のＣＤＲ配列として最初に生成されたので（または本明細書においてさらに記載されるように、そのようなＣＤＲ配列に基づくものであってもよいおよび／または由来してもよい）、それらはまた、「ＣＤＲ配列」と（すなわち、それぞれＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列と）、本明細書において全般的に呼ばれるであろう。しかしながら、本明細書において開示されるＶＨＨがスフィンゴ脂質標的に特異的に結合するのをアミノ酸残基のこれらのストレッチが可能にする限り、本発明は、その最も広い意味において、アミノ酸残基のこれらのストレッチが本明細書において開示されるＶＨＨにおいて有し得る特定の構造的な役割または機能に限定されないことに注意されたい。したがって、一般に、本発明は、その最も広い意味において、スフィンゴ脂質標的に結合することができ、かつ本明細書において記載されるＣＤＲ配列の組み合わせを含む重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞に関する。
したがって、ある実施形態では、本明細書において開示されるＶＨＨが、本明細書において記載されるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列を含む可変ドメインであってもよい。特に、本明細書において開示される重鎖可変ドメインは、少なくとも１つの抗原結合部位を含んでいてもよく、前記抗原結合部位が、本明細書において記載されるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列の少なくとも１つの組み合わせを含む。
本明細書において教示され、かつこれらのＣＤＲ配列の組み合わせの１つを有する重鎖抗体の任意の可変ドメインは、好ましくは、スフィンゴ脂質標的またはスフィンゴ脂質抗原にそれが特異的に結合することができる（本明細書において定義される）ようなものであり、より詳細には、特に、溶液中の前記可変ドメインの１０−８モル／リットルまたはそれ以下の解離定数（Ｋｄ）で、植物病原体のスフィンゴ脂質にそれが特異的に結合するようなものである。
スフィンゴ脂質標的に対する重鎖抗体の可変ドメインの特異的な結合は、たとえばバイオパニング、スキャッチャード分析、ならびに／またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、およびサンドイッチ競合アッセイなどのような競合結合アッセイならびに当技術分野において知られているその様々な変形物を含む、それ自体知られている任意の適した方法において決定することができる。
好ましい実施形態では、８０〜２００アミノ酸のポリペプチドが、特定の有害生物標的分子に対する親和性選択によって得られ、前記ポリペプチドが、前記有害生物標的分子に対して高度な親和性を有し、典型的に、ポリペプチドおよびその有害生物標的分子の間の結合の解離定数が、１０−５Ｍよりも低い、より好ましくは、解離定数が、１０−６Ｍよりも低い、さらにより好ましくは、解離定数が、１０−７Ｍよりも低い、最も好ましくは、解離定数が、１０−８Ｍよりも低い。
特定の実施形態では、本明細書において教示される重鎖抗体の少なくとも１つの可変ドメインが、溶液中の１．０μｇ／ｍＬまたはそれ以下の前記可変ドメインの、前記植物病原性菌類に対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）値を有する。
特異的な植物有害生物標的に対する親和性選択によって得られる８０〜２００アミノ酸または本明細書において先に開示される部分範囲のポリペプチドもまた、本明細書において開示され、これは、約０．００００１〜１μＭの最小発育阻止濃度で作物有害生物の成長および／または活性を阻害することができる。特定の実施形態では、最小発育阻止濃度が、０．０００１〜１μＭ、０．００１〜１μＭ、０．０１〜１μＭ、０．１〜１μＭ、０．０００１〜０．１μＭ、０．００１〜０．１μＭ、０．０１〜０．１μＭ、０．００００１〜０．０１μＭ、０．０００１〜０．０１μＭ、０．００１〜０．０１μＭである。
最小発育阻止濃度またはＭＩＣ値は、インキュベーションの後に作物または植物有害生物の目に見える成長を阻害するポリペプチドなどのような薬剤の最も低い濃度である。たとえば、最小殺真菌濃度（ＭＦＣ）は、成長を妨げ、２４時間以内に９９．９０％、菌類接種物を低下させるポリペプチドの最も低い濃度と考えられる。ＭＦＣ（最小菌類濃度）は、寒天プレート上で決定することができるが、菌類のタイプおよびアッセイ条件に依存して流体中で（たとえばマイクロウェルプレート中で）好都合に決定することができる。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、
配列番号８５を有するＣＤＲ１領域、配列番号１６９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号８６を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号８７を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号８８を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号８９を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９０を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９１を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９２を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９３を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９４を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９５を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９６を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９７を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９８を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号９９を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１００を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０１を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２６９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０２を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０３を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０４を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０５を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０６を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０７を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０８を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１０９を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１０を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１１を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２７９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１２を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１３を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１４を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１５を有するＣＤＲ１領域、配列番号１９９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１６を有するＣＤＲ１領域、配列番号２００を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１７を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１８を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１１９を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２０を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２１を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２８９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２２を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２３を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２４を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２５を有するＣＤＲ１領域、配列番号２０９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２６を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２７を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２８を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１２９を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３０を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３１を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２９９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３２を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３００を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３３を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３４を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３５を有するＣＤＲ１領域、配列番号２１９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３６を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３７を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３８を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１３９を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２３を有するＣＤＲ２領域、およびアミノ酸配列ＮＲＹを有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４０を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４１を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４２を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３０９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４３を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４４を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４５を有するＣＤＲ１領域、配列番号２２９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４６を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４７を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４８を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１４９を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５０を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５１を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５２を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３１９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５３を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５４を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５５を有するＣＤＲ１領域、配列番号２３９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５６を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５７を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５８を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２５を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１５９を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４３を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２６を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６０を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４４を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２７を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６１を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４５を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２８を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６２を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４６を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３２９を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６３を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４７を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３３０を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６４を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４８を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３３１を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６５を有するＣＤＲ１領域、配列番号２４９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３３２を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６６を有するＣＤＲ１領域、配列番号２５０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３３３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６７を有するＣＤＲ１領域、配列番号２５１を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３３４を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号１６８を有するＣＤＲ１領域、配列番号２５２を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３３５を有するＣＤＲ３領域を含むリストから選ばれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含む、からなる、またはから本質的になるＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよい。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、
配列番号８５を有するＣＤＲ１領域、配列番号１６９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５３を有するＣＤＲ３領域ならびに／または
配列番号８６を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５４を有するＣＤＲ３領域
を含むリストから選ばれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよい。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号８５を有するＣＤＲ１領域、配列番号１６９を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５３を有するＣＤＲ３領域を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよい。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号８６を有するＣＤＲ１領域、配列番号１７０を有するＣＤＲ２領域、および配列番号２５４を有するＣＤＲ３領域を含むＶＨＨをコードする配列を含んでいてもよい。
特定の実施形態では、本明細書において教示されるＶＨＨが、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる重鎖可変ドメインまたはそのような重鎖可変ドメインの任意の適した断片である（これは、そのうえ、普通は、本明細書においてさらに記載されるＣＤＲの少なくとも１つを形成するアミノ酸残基のいくつかを少なくとも含有するであろう）。
本明細書において教示されるＶＨＨの機能的変異体は、特に、ドメイン抗体（もしくはドメイン抗体としての使用に適した重鎖可変ドメイン）、単一ドメイン抗体（もしくは単一ドメイン抗体としての使用に適した重鎖可変ドメイン）、または「ｄＡｂ」（もしくはｄＡｂとしての使用に適した重鎖可変ドメイン）；他の単一可変ドメイン、またはそのいずれか１つの任意の適した断片であってもよい。（単一）ドメイン抗体の一般的な説明のために、上記に引用される先行技術および欧州特許第０３６８６８４号明細書もまた参照される。用語「ｄＡｂ」については、たとえばＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ １９８９ Ｏｃｔ １２；３４１（６２４２）：５４４−６）、Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３，２１（１１）：４８４−４９０、ならびにたとえば国際公開第０６／０３０２２０号パンフレット、国際公開第０６／００３３８８号パンフレット、およびＤｏｍａｎｔｉｓ Ｌｔｄ．の他の公開特許出願が参照される。
したがって、特定の実施形態では、本発明が、（一般的な）構造
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
を有する重鎖抗体の可変ドメインを提供し、
ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４をそれぞれ指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３が、相補性決定領域１〜３をそれぞれ指し、本明細書においてさらに定義される。
配列番号１〜８４（表１を参照）は、スフィンゴ脂質標的に対して、特にグルコシルセラミドに対して産生された重鎖抗体の多くの可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
Figure 2017536134
Figure 2017536134
Figure 2017536134
Figure 2017536134
特に、いくつかの特定の実施形態における本発明は、スフィンゴ脂質標的に向けられ、かつ配列番号１〜８４（表１を参照）の重鎖可変ドメインの少なくとも１つと９０％または９５％またはそれ以上などのように少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１つのＶＨＨをコードするポリヌクレオチドおよびそのような重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含むトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞を提供する。
本明細書において開示されるいくつかの特に好ましいＶＨＨは、植物病原体のスフィンゴ脂質に結合することができおよび／またはそれに向けられ、かつ配列番号１〜８４（表１を参照）のＶＨＨの少なくとも１つと少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有し、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基が無視されるものである。
これらの重鎖可変ドメインでは、ＣＤＲ配列（表２を参照）は、全般的に、本明細書においてさらに定義されるとおりである。
Figure 2017536134
Figure 2017536134
さらに、そのようなＶＨＨは、任意の適した方法で、任意の適した供給源から誘導されてもよく、たとえば、天然に存在するＶＨＨ配列（すなわち、ラクダ科の動物の適した種由来の）、「ラクダ化」免疫グロブリン配列（および特に、ラクダ化重鎖可変ドメイン配列）を含むが、これらに限定されない合成または半合成重鎖可変ドメイン、ならびに親和性成熟（たとえば、合成の、無作為の、もしくは天然に存在する免疫グロブリン配列から出発して）、ＣＤＲグラフティング、様々な免疫グロブリン配列に由来する断片を組み合わせるベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）、オーバーラップするプライマーを使用するＰＣＲアセンブリー、および当業者によく知られている免疫グロブリン配列を操作するための類似する技術；または本明細書においてさらに記載される前述のもののいずれかの任意の適した組み合わせなどのような技術によって得られるものであってもよい。
本発明はまた、本明細書において開示されるＶＨＨの一部、断片、アナログ、突然変異体、変異体、および／もしくは誘導体ならびに／または１つもしくは複数のそのような一部、断片、アナログ、突然変異体、変異体、および／もしくは誘導体を含むもしくはそれから本質的になるポリペプチドを、これらの一部、断片、アナログ、突然変異体、変異体、および／または誘導体が本明細書において想定される目的に適している限り、包含する。本発明に記載のそのような一部、断片、アナログ、突然変異体、変異体、および／または誘導体は、スフィンゴ脂質標的になお特異的に結合することができる。
標的
ある実施形態では、本明細書において教示されるＶＨＨが、特定の有害生物標的に対する親和性選択によって得られる。特定の有害生物標的に対する親和性選択によって適したポリペプチドを得ることは、たとえば、当技術分野において殺虫剤の標的であることが知られている有害生物標的分子に対する結合について、それらの表面上にポリペプチドを発現する細胞（たとえばバクテリオファージ）のセット、収集物、またはライブラリーをスクリーニングすることによって実行されてもよく、これらはすべて、以下の非限定的なステップを本質的に含む、それ自体知られている方法で実行されてもよい：ａ）殺虫剤の標的であることが知られている有害生物標的分子の単離溶液または懸濁液を得るステップ；ｂ）前記標的分子に対してポリペプチドライブラリー由来のファージまたは他の細胞をバイオパニングするステップ；ｃ）標的分子に結合しているファージまたは他の細胞を単離するステップ；ｄ）個々の結合しているファージまたは他の細胞からポリペプチド挿入物をコードするヌクレオチド配列を決定するステップ；ｅ）組換えタンパク質発現を使用してこの配列のポリペプチドのある量を産生するステップ、およびｆ）前記有害生物標的に対する前記ポリペプチドの親和性を決定するステップ、ならびに任意選択によりｇ）前記有害生物についてのバイオアッセイにおいて前記ポリペプチドの殺虫性の活性を試験するステップ。様々な方法が、ポリペプチドおよび有害生物標的分子の間の親和性を決定するために使用されてもよく、たとえば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）アッセイを含み、これらは、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹにおいて記載される、当技術分野における一般的な方法である。解離定数は、ポリペプチドおよびその有害生物標的分子の間の親和性を説明するために一般に使用される。典型的に、ポリペプチドおよびその有害生物標的分子の間の結合の解離定数が、１０−５Ｍよりも低い、より好ましくは、解離定数が、１０−６Ｍよりも低い、さらにより好ましくは、解離定数が、１０−７Ｍよりも低い、最も好ましくは、解離定数が、１０−８Ｍよりも低い。
本明細書において開示される有害生物標的分子は、有害生物生物体中にまたはその上に存在する分子であり、これは、結合したおよび／または阻害した場合、前記有害生物生物体の成長または殺虫性の活性を死滅させるもしくは阻止する、阻害する、または低下させる。そのような適した標的分子は、当業者とって、既存の文献または特許データベースから容易に入手可能であり、限定を伴うことなく、根瘤線虫に対する適した有害生物標的分子として１６Ｄ１０などのような、分泌された寄生タンパク質（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ（２００６）ＰＮＡＳ １０３：１４３０２−１４３０６）、甲虫類、半翅類、双翅類の昆虫の種および線虫に対する適した有害生物標的分子としてのＶ−ＡＴＰアーゼプロトンポンプ（Ｋｎｉｇｈｔ ＡＪ ａｎｄ Ｂｅｈｍ ＣＡ（２０１１）Ｅｘ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ｓｅｐｔ １９）、灰色かび病菌（Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ）およびイネいもち病菌（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）に対する適した菌類有害生物標的分子としてのテトラスパニンＰＬＳ１（Ｇｏｕｒｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９７：１１９７）、または抗真菌標的としてのプロトンポンプＡＴＰアーゼ（Ｍａｎａｖａｔｈｕ ＥＫ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｄｅｃ ｐ．２９５０）を含む。好ましい有害生物標的分子が細胞外の空間（細胞内有害生物標的とは対照的に）において入手可能であることが理解される。
より詳細には、本明細書において開示されるＶＨＨが結合するスフィンゴ脂質標的は、長鎖（一価不飽和）ジヒドロキシアミン構造（スフィンゴシン）によって特徴付けられる膜脂質の特有な基を構成する。スフィンゴ脂質は、それらが外葉において典型的に見つけられる細胞の形質膜の本質的な構成成分である。それらは、いくつかの細菌グループ、特に嫌気性菌の膜構成要素である。これらのグループは、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、フゾバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デロビブリオ（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ）、キストバクター（Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フレクトバシラス（Ｆｌｅｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、および場合によりアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）を含む。スフィンゴ脂質が見つかった菌類は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、フシコッカム（Ｆｕｓｉｃｏｃｃｕｍ）、シゾフィラム（Ｓｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、テングダケ（Ａｍａｎｉｔａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、チチタケ（Ｌａｃｔａｒｉｕｓ）、レンチヌス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、カヤタケ（Ｃｌｉｔｏｃｙｂｅ）、パラコクシジオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、スポロトリクス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）、および卵菌植物病原体を含む。
菌類スフィンゴ脂質の基本構成要素は、スフィンガニンであり、これは、セラミドに、そして最終的にセラミドモノヘキソシド（ＣＭＨ；セレブロシド）にまたはフィトセラミドに、そして最終的にセラミドジヘキソシド（ＣＤＨ）にまたはグリコイノシトールホスホリルセラミド（ＧＩＰＣ）に変換され得る。本明細書において開示されるＶＨＨが向けられるスフィンゴ脂質の非限定的な例は、たとえば、９−メチル４，８−スフィンガジエニン、グリコシルセラミド、グルコシルセラミド、モノグルコシルセラミド、オリゴグルコシルセラミド、ガングリオシド、スルファチド、セラミド、スフィンゴシン−１−ホスフェート、セラミド−１−ホスフェート、ガラクトシルセラミド、イノシトール−ホスホリルセラミド（ＩＰＣ）、マンノシル−イノシトール−ホスホリルセラミド（ＭＩＰＣ）、ガラクトシル−イノシトール−ホスホリルセラミド、マンノシル−（イノシトール−ホスホリル）２−セラミド（Ｍ（ＩＰ）２Ｃ）、ジマンノシル−イノシトール−ホスホリルセラミド（Ｍ２ＩＰＣ）、ガラクトシル−ジマンノシル−イノシトール−ホスホリルセラミド（ＧａｌＭ２ＩＰＣ）、マンノシル−ジ−イノシトール−ジホスホリルセラミド、ジ−イノシトール−ジホスホリルセラミド、トリガラクトシル−グリコシルセラミドを含む。
本明細書において開示されるＶＨＨが向けられるスフィンゴ脂質の非限定的な例は、たとえばグリコシルセラミド、グルコシルセラミド、スフィンゴミエリン、モノグリコシルセラミド、オリゴグリコシルセラミド、ガングリオシド、スルファチド、セラミド、スフィンゴシン−１−ホスフェート、およびセラミド−１−ホスフェートを含む。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある好ましい実施形態では、スフィンゴ脂質が、セラミドである。さらに好ましい実施形態では、スフィンゴ脂質が、スフィンゴ糖脂質である。さらに好ましい実施形態では、スフィンゴ脂質が、セレブロシド（すなわちモノグリコシルセラミド）である。さらに好ましい実施形態では、スフィンゴ脂質が、グルコセレブロシド（すなわちグルコシルセラミド）である。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある好ましい実施形態では、菌類スフィンゴ脂質が、菌類セラミドである。さらに好ましい実施形態では、菌類スフィンゴ脂質が、菌類スフィンゴ糖脂質である。さらに好ましい実施形態では、菌類スフィンゴ脂質が、菌類セレブロシド（すなわちモノグリコシルセラミド）である。さらに好ましい実施形態では、菌類スフィンゴ脂質が、菌類グルコセレブロシド（すなわちグルコシルセラミド）である。
ある実施形態では、本明細書において記載されるスフィンゴ脂質が、タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）由来のグルコシルセラミド（グルコセレブロシド）である。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、スフィンゴ脂質が、Ｃ−９メチル基および２つの二重結合（Δ４、Δ８）を有するＣ１９スフィンゴイド塩基を含んでいてもよい。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、スフィンゴ脂質が、以下の構造のいずれかを含んでいてもよい、からなってもよい、またはそれによって示されてもよい。
Figure 2017536134
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、本明細書において記載されるスフィンゴ脂質が、以下の構造のいずれかを有してもよいまたは含んでいてもよい。
Figure 2017536134
ある実施形態では、植物病原体が、先に定義される植物病原性菌類などのような菌類である。菌類は、植物にとって非常に不利益になり得、作物における実質的な収穫の損失を引き起こし得る。植物病原性菌類は、屍体栄養菌類および生体栄養菌類を含み、子嚢菌、担子菌、および卵菌を含む。
植物病原性菌類の例は、当技術分野において知られており、属：アルタナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）；アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）；ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）；セルコスポラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）；コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）；ディプロディア（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）；エリシフェ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）；フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）；レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）；ゲウマノマイセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）；ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）；マクロフォミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）；ネクトリア（Ｎｅｃｔｒｉａ）；ペロノスポラ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）；フォーマ（Ｐｈｏｍａ）；フィマトトリキュム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）；フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）；プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）；ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）；プクキニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）；プチウム（Ｐｕｔｈｉｕｍ）；ピレノホラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）；ピリカラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）；フハイカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）；リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）；スセロチウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）；スクレロティニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）；セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）；ティエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）；アンシヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）；ベンチュリア（Ｖｅｎｔｕｒｉａ）；およびバーティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）からなる群から選択されるが、これらに限定されない。本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用によって根絶されてもよい植物病原性菌類の特定の例は、穀類におけるエリシフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ウリ科の植物におけるエリシフェ・シコラセアラム（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ）およびスファエロセカ・フリジネア（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）、リンゴにおけるポドスファエラ・レウコトリカ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ）、ブドウの木におけるアンシヌラ・ネカタ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒ）、穀類におけるプクキニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）種、ワタ、ジャガイモ、イネ、および芝地におけるリゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）種、穀類およびサトウキビにおけるウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）種、リンゴにおけるベンチュリア・イナエクアリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）（腐敗病）、穀類におけるヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、コムギにおけるセプトリア・ノドラム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ）、コムギにおけるセプトリア・トリチシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ）、オオムギに対するルヒンコスポリウム・セカリス（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｅｃａｌｉｓ）、イチゴ、トマト、およびブドウにおける灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）（灰色かび）、ピーナッツにおけるセルコスポラ・アラキジコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ａｒａｃｈｉｄｉｃｏｌａ）、タバコにおけるペロノスポラ・タバシナ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｔａｂａｃｉｎａ）または様々な作物における他のペロノスポラ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）、コムギおよびオオムギにおけるシュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）、オオムギにおけるピレノフェラ・テレス（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｅｒａ ｔｅｒｅｓ）、イネにおけるピリキュラリア・オリゼ（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）、ジャガイモおよびトマトにおけるフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、様々な植物におけるフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種（フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）など）およびバーティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、ブドウにおけるプラスモパラ・ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ）、果実および植物におけるアルタナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）種、キュウリにおけるキュウリベと病菌（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ）、バナナにおけるマイコスファエレラ・フィジエンシス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）、ヒヨコマメにおけるアスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）種、キャノーラに対するレプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）種、ならびに様々な作物におけるコレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）種を含む。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞によって根絶されてもよい植物病原性菌類が、表３において定義される植物病原性菌類を含む。
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞によって根絶されてもよい植物病原性菌類が、表３において定義されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞と組み合わせた表３において定義される植物病原性菌類を含む。
Figure 2017536134
Figure 2017536134
Figure 2017536134
本明細書において教示されるトランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞、方法、または使用のある実施形態では、植物病原性菌類が、アルタナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスコキタ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、セルコスポラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ディプロディア（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、エリシフェ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）、ゲウマノマイセス（Ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、マクロフォミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）、ネクトリア（Ｎｅｃｔｒｉａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ペロノスポラ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）、フォーマ（Ｐｈｏｍａ）、フィマトトリキュム（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）、プクキニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）、ピレノホラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）、ピリカラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）、フィチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）、スセロチウム（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ）、スクレロティニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）、ティエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）、アンシヌラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）、ベンチュリア（Ｖｅｎｔｕｒｉａ）、バーティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ブルメリア（Ｂｌｕｍｅｒｉａ）、マイコスファエレラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）、ウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）、メランプソラ（Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａ）、ファコスポラ（Ｐｈａｋｏｓｐｏｒａ）、モニリニア（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からなる群から選ばれる属由来の植物病原性菌類であってもよい。
ある実施形態では、本明細書において教示されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、菌類種ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来の菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでいてもよい。さらに特定の実施形態では、菌類スフィンゴ脂質が、特にグルコシルセラミドなどのようなセラミドである。
特定の実施形態では、本発明が、菌類の構造的な分子構成成分、すなわち菌類スフィンゴ脂質に特異的に向けられるＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでいてもよい、本明細書において教示されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞を提供する。非タンパク質分子構造と特有で特異的な相互作用を有するタンパク質またはアミノ酸配列を生成することが（技術的に）困難であることが当技術分野において一般に記載されているが、発明者らは、驚いたことに、そのようなＶＨＨの同定に成功した。
本発明の教示に基づいて、適した菌類有害生物標的分子のさらなる非限定的な例は、当業者によって想定することができ、たとえばキチンシンターゼ、β−１，３−グルカンシンターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、菌類グリコシルセラミド、またはテトラスパニンＰＬＳ１を含む。
アシドボラックス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ）亜種アベナエ（ａｖｅｎａｅ）（イネの褐条病を引き起こす）、アシドボラックス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ）亜種カタレヤエ（ｃａｔｔｌｅｙａｅ）（カトレアの褐斑細菌病を引き起こす）、アシドボラックス・コンジャシ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｋｏｎｊａｃｉ）コンニャク（Ｋｏｎｎｙａｋｕ）（白葉枯病を引き起こす）、アグロバクテリウム・リゾジェネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（メロンの毛根病を引き起こす）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（根頭がんしゅ病を引き起こす）、バークホルデリア・アンドロポゴニス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｉｓ）（カーネーションの斑点細菌病を引き起こす）、バークホルデリア・カリオフィリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ）（カーネーションの青枯病を引き起こす）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）（シンビジウムの褐斑細菌病を引き起こす）、バークホルデリア・グラジオラス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌａｄｉｏｌｉ）病原型グラジオラス（ｇｌａｄｉｏｌｉ）（グラジオラスの菌核病を引き起こす）、バークホルデリア・グルマエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ）（イネのもみ枯細菌病を引き起こす）、バークホルデリア・プランタリー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｌａｎｔａｒｉｉ）（イネの苗立枯細菌病を引き起こす）、クラビバクテル・ミキガネンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）亜種ミキガネンシス（ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）（トマトのかいよう病を引き起こす）、クラビバクテル・ミキガネンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）亜種セペドニカス（ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｓ）（ジャガイモの輪腐病を引き起こす）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種（ジャガイモの粘性腐敗病を引き起こす）、カルトバクテリウム・フラクムファシエンス（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ）（タマネギのかいよう病を引き起こす）、エルウィニア・アミロボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）（西洋ナシの火傷病を引き起こす）、エルウィニア・アナナス（イネの内穎褐変病を引き起こす）、エルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）亜種アトロセプティカ（ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）（ジャガイモの根朽病を引き起こす）、エルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）亜種カロトボラ（ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）（野菜の軟腐病を引き起こす）、エルウィニア・クリサンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）（タロイモの苗立枯細菌病を引き起こす）、エルウィニア・クリサンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）病原型ゼアエ（ｚｅａｅ）（イネの株腐細菌病を引き起こす）、エルウイニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）病原型ミレチアエ（ｍｉｌｌｅｔｔｉａｅ）（フジのこぶ病を引き起こす）、シュードモナス・キコリー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ）（キクの斑点細菌病を引き起こす）、シュードモナス・コルゲート（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔｅ）ピス（Ｐｉｔｈ）（トマトのネクローシスを引き起こす）、シュードモナス・フスコバジナエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｕｓｃｏｖａｇｉｎａｅ）（イネの葉しょう褐変病を引き起こす）、シュードモナス・マルギナリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ）病原型マルギナリス（ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ）（キャベツの腐敗病を引き起こす）、シュードモナス・ルブリスバルビカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｕｂｒｉｓｕｂａｌｂｉｃａｎｓ）（サトウキビの疑似赤すじ病を引き起こす）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型アプタタ（ａｐｔａｔａ）（サトウダイコンの細菌胴枯れ病を引き起こす）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型アトロプルプレア（ａｔｒｏｐｕｒｐｕｒｅａ）（ライグラスのかさ枯病を引き起こす）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型カスタネアエ（ｃａｓｔａｎｅａｅ）（クリのかいよう病を引き起こす）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型グリシネア（ｇｌｙｃｉｎｅａ）（ダイズの細菌胴枯れ病を引き起こす）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型ラクリマンス（ｌａｃｈｒｙｍａｎｓ）（キュウリの斑点細菌病を引き起こす）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型マキュリコラ（ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ）（キャベツの黒斑細菌病を引き起こす）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型モリ（ｍｏｒｉ）（クワの細菌胴枯れ病を引き起こす）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型モルスプルノラム（ｍｏｒｓｐｒｕｎｏｒｕｍ）（プラムのかいよう病を引き起こす）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型オリザエ（ｏｒｙｚａｅ）（イネのかさ枯病を引き起こす）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型ファセオリコラ（ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ）（インゲンマメのかさ枯病を引き起こす）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型ピシ（ｐｉｓｉ）（エンドウの引き起こす細菌胴枯れ病）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型セサミ（ｓｅｓａｍｅ）（ごまの斑点細菌病を引き起こす）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型ストリアファシエンス（ｓｔｒｉａｆａｃｉｅｎｓ）（カラスムギの黒節病を引き起こす）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型シリンガエ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）（あずきの褐斑細菌病を引き起こす）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型タバシ（ｔａｂａｃｉ）（タバコの野火病を引き起こす）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型テアエ（ｔｈｅａｅ）（茶の赤焼病を引き起こす）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型トマト（ｔｏｍａｔｏ）（トマトの斑点細菌病を引き起こす）、シュードモナス・ビリディフラバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ）（インゲンマメの褐斑細菌病を引き起こす）、ラルストニア・ソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）（青枯病を引き起こす）、ラタイバクテル・ラタイ（Ｒａｔｈａｙｉｂａｃｔｅｒ ｒａｔｈａｙｉ）（カモガヤの萎縮性細菌病を引き起こす）、ストレプトマイセス・スカビエス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｓ）（ジャガイモのそうか病を引き起こす）、ストレプトマイセス・イポメア（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｉｐｏｍｏｅａ）（サツマイモの立枯病を引き起こす）、キサントモナス・アルビリネアンス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｌｂｉｌｉｎｅａｎｓ）（サトウキビの白すじ病を引き起こす）、ザントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型セレアリス（ｃｅｒｅａｌｉｓ）（ライムギの褐点病を引き起こす）、ザントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型カンペストリス（ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）（黒斑病を引き起こす）、ザントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型シトリ（ｃｉｔｒｉ）（柑橘類の腐らん病を引き起こす）、ザントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型クカルビタエ（ｃｕｃｕｒｂｉｔａｅ）（キュウリの褐斑細菌病を引き起こす）、ザントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型グリシネス（ｇｌｙｃｉｎｅｓ）（ダイズの葉焼病を引き起こす）、ザントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型インカナエ（ｉｎｃａｎａｅ）（茎の黒腐病を引き起こす）、ザントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型（ワタ マルバセアラム（ｍａｌｖａｃｅａｒｕｍ）の角点病を引き起こす）、ザントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型（マンゴーのかいよう病を引き起こす）、マンギフェラエインディカエ（Ｍａｎｇｉｆｅｒａｅｉｎｄｉｃａｅ）、ザントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型メレア（ｍｅｌｌｅａ）（タバコの黄がさ細菌病を引き起こす）、ザントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型（グレートナイグロマキュランスゴボウ（ｇｒｅａｔ ｎｉｇｒｏｍａｃｕｌａｎｓ ｂｕｒｄｏｃｋ）の斑点細菌病を引き起こす）、ザントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型ファセオリ（ｐｈａｓｅｏｌｉ）（インゲンマメの葉焼病を引き起こす）、ザントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型ピシ（ｐｉｓｉ）（インゲンマメの茎腐細菌病を引き起こす）、ザントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型プルニ（ｐｒｕｎｉ）（モモのせん孔細菌病を引き起こす）、ザントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型ラファニ（ｒａｐｈａｎｉ）（ダイコンの斑点細菌病を引き起こす）、ザントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型リシニ（ｒｉｃｉｎｉ）（トウゴマの斑点細菌病を引き起こす）、ザントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型テイコラ（ｔｈｅｉｃｏｌａ）（茶の腐らん病を引き起こす）、ザントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型トランスルセンス（ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ）（カモガヤの斑点細菌病を引き起こす）、ザントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型ベシカトリア（ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）（トマトの斑点細菌病を引き起こす）、キサントモナス・オリザエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ）病原型オリザエ（ｏｒｙｚａｅ）（イネの白葉枯病を引き起こす）を含むが、これらに限定されない植物病原細菌もまた、本明細書において開示される。
農業、園芸、森林、庭、およびレジャー施設で遭遇する昆虫、蛛形類、蠕虫、ウイルス、線虫、および軟体動物などのような植物有害生物もまた、本明細書において開示される。本明細書において教示されるトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞は、通常感受性で抵抗性の種に対しておよび発生のすべてのまたはいくつかのステージに対して活性である。これらの植物有害生物は、特にクモ形綱由来の節足動物門、たとえばマダニ（Ａｃａｒｕｓ）種、アセリア・シェルドニ（Ａｃｅｒｉａ ｓｈｅｌｄｏｎｉ）、アクロプス（Ａｃｕｌｏｐｓ）種、アクラス（Ａｃｕｌｕｓ）種、アンブリオーマ（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ）種、アンフィテトラニカス・ヴィエネンシス（Ａｍｐｈｉｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｖｉｅｎｎｅｎｓｉｓ）、アルガス（Ａｒｇａｓ）種、ボフィラス（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ）種、ブレヴィパルパス（Ｂｒｅｖｉｐａｌｐｕｓ）種、ブリオビア・プラエチオサ（Ｂｒｙｏｂｉａ ｐｒａｅｔｉｏｓａ）、セントルロイデス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ）種、コリオプテス（Ｃｈｏｒｉｏｐｔｅｓ）種、デルマニサス・ガリナエ（Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｕｓ ｇａｌｌｉｎａｅ）、デルマトファゴイデス・プテロニシアス（（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓ）、デルマトファゴイデス・ファリナエ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）、デルマセントール（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ）種、エオテトラニカス（Ｅｏｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ）種、エピトリメラス・ピリ（Ｅｐｉｔｒｉｍｅｒｕｓ ｐｙｒｉ）、エウトトラニカス（Ｅｕｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ）種、エリオフィエス（Ｅｒｉｏｐｈｙｅｓ ）種、ハロチデス・デストラクター（Ｈａｌｏｔｙｄｅｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、ヘミタソネマス（Ｈｅｍｉｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ）種、ヒアローマ（Ｈｙａｌｏｍｍａ）種、イクソデス（Ｉｘｏｄｅｓ）種、ラトロデクタス（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ）種、ロキソスセレス（Ｌｏｘｏｓｃｅｌｅｓ）種、メタテトラニカス（Ｍｅｔａｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ）種、ヌフェルサ（Ｎｕｐｈｅｒｓａ）種、オリゴニカス（Ｏｌｉｇｏｎｙｃｈｕｓ）種、オルニソドラス（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｕｓ）種、オルニソニサス（Ｏｒｎｉｔｈｏｎｙｓｓｕｓ）種、パノニカス（Ｐａｎｏｎｙｃｈｕｓ）種、フィロコプトルタ・オケイヴォラ（Ｐｈｙｌｌｏｃｏｐｔｒｕｔａ ｏｌｅｉｖｏｒａ）、ポリファゴタルソネマス・ラタス（Ｐｏｌｙｐｈａｇｏｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ ｌａｔｕｓ）、プソロプテス（Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ）種、リピセファラス（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ）種。リゾグリファス（Ｒｈｉｚｏｇｌｙｐｈｕｓ）種、サルコプテス（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ）種、スコルピオ・マウラス（Ｓｃｏｒｐｉｏ ｍａｕｒｕｓ）、ステノタルソネマス（Ｓｔｅｎｏｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ）種、タルソネマス（Ｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ）種、テトラニカス（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ）種、バエヨビス（Ｖａｅｊｏｖｉｓ）種、バサテス・リコペルシシ（Ｖａｓａｔｅｓ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）由来の有害生物を含む。
さらに他の例は、シラミ目（フィチラプテラ（Ｐｈｔｈｉｒａｐｔｅｒａ））、たとえばダマリニア（Ｄａｍａｌｉｎｉａ）種、ハエマトピナス（Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ）種、リノグナサス（Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ）種、ペディクラス（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ）種、プトリラス・パビス（Ｐｔｉｒｕｓ ｐｕｂｉｓ）、トリコデクテス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｃｔｅｓ）種由来のものである。
さらに他の例は、唇脚目、たとえばゲオフィラス（Ｇｅｏｐｈｉｌｕｓ）種、スクチゲラ（Ｓｃｕｔｉｇｅｒａ）種由来のものである。
さらに他の例は、甲虫目、たとえばアカリマ・ボタタム（Ａｃａｌｙｍｍａ ｖｉｔｔａｔｕｍ）、アカンソスセリデス・オブテクタス（Ａｃａｎｔｈｏｓｃｅｌｉｄｅｓ ｏｂｔｅｃｔｕｓ）、アドレタス（Ａｄｏｒｅｔｕｓ）種、アゲラスチカ・アルニ（Ａｇｅｌａｓｔｉｃａ ａｌｎｉ）、アグリオテス（Ａｇｒｉｏｔｅｓ）種、アルフィトビウス・ジアペリナス（Ａｌｐｈｉｔｏｂｉｕｓ ｄｉａｐｅｒｉｎｕｓ）、アンフィマロン・ソルスチチアリス（Ａｍｐｈｉｍａｌｌｏｎ ｓｏｌｓｔｉｔｉａｌｉｓ）、アノビウム・パンクタタム（Ａｎｏｂｉｕｍ ｐｕｎｃｔａｔｕｍ）、アノプロフォラ（Ａｎｏｐｌｏｐｈｏｒａ）種、アンソノマス（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ）種、アンスレナス（Ａｎｔｈｒｅｎｕｓ）種、アピオン（Ａｐｉｏｎ）種、アポゴニア（Ａｐｏｇｏｎｉａ）種、アトマリア（Ａｔｏｍａｒｉａ）種、アタゲナス（Ａｔｔａｇｅｎｕｓ）種、ブルキジス・オブテクタス（Ｂｒｕｃｈｉｄｉｕｓ ｏｂｔｅｃｔｕｓ）、ブルカス（Ｂｒｕｃｈｕｓ）種、カシダ（Ｃａｓｓｉｄａ）種、セロトマ・トリフルカタ（Ｃｅｒｏｔｏｍａ ｔｒｉｆｕｒｃａｔａ）、セウトロリンカス（Ｃｅｕｔｏｒｒｈｙｎｃｈｕｓ）種、カエトクネマ（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ）種、クレナス・メンディカス（Ｃｌｅｏｎｕｓ ｍｅｎｄｉｃｕｓ）、コノデラス（Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ）種、コスモポリテス（Ｃｏｓｍｏｐｏｌｉｔｅｓ ）種、コステリトラ・ゼアカンディカ（Ｃｏｓｔｅｌｙｔｒａ ｚｅａｌａｎｄｉｃａ）、クテニセラ（Ｃｔｅｎｉｃｅｒａ）種、シギゾウムシ（Ｃｕｒｃｕｌｉｏ）種、クリプトリンカス・ラパティ（Ｃｒｙｐｔｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｌａｐａｔｈｉ）、クリンドロコプタラス（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｏｐｔｕｒｕｓ）種、デルメステス（Ｄｅｒｍｅｓｔｅｓ）種、ディアブロティカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）種、ディコクロシス（Ｄｉｃｈｏｃｒｏｃｉｓ）種、ディロボデラス（Ｄｉｌｏｂｏｄｅｒｕｓ）種、エピラクナ（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ）種、エピトリックス（Ｅｐｉｔｒｉｘ）種、ファウスチナス（Ｆａｕｓｔｉｎｕｓ）種、ギビウム・プシロイデス（Ｇｉｂｂｉｕｍ ｐｓｙｌｌｏｉｄｅｓ）、ヘルラ・アンダリス（Ｈｅｌｌｕｌａ ｕｎｄａｌｉｓ）、ヘテロニカス・アラター（Ｈｅｔｅｒｏｎｙｃｈｕｓ ａｒａｔｏｒ）、ヘテロニックス（Ｈｅｔｅｒｏｎｙｘ）種、ヒラモルファ・エレガンス（Ｈｙｌａｍｏｒｐｈａ ｅｌｅｇａｎｓ）、ヒロトラペス・バジュラス（Ｈｙｌｏｔｒｕｐｅｓ ｂａｊｕｌｕｓ）、ヒペラ・ポスティカ（Ｈｙｐｅｒａ ｐｏｓｔｉｃａ）、ヒポセネマス（Ｈｙｐｏｔｈｅｎｅｍｕｓ）種、ラクノステルナ・コンサングイネア（Ｌａｃｈｎｏｓｔｅｒｎａ ｃｏｎｓａｎｇｕｉｎｅａ）、レマ（Ｌｅｍａ）種、レプチノタルサ・デセンリネアタ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）、ロウコプテラ（Ｌｅｕｃｏｐｔｅｒａ）種、リソルホプトラス・オリゾフィラス（Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ）、リクサス（Ｌｉｘｕｓ）種、ルペロデス（Ｌｕｐｅｒｏｄｅｓ）種、リクタス（Ｌｙｃｔｕｓ）種、メガセリス（Ｍｅｇａｓｃｅｌｉｓ）種、メラノタス（Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ）種、メリゲテス・アエネアス（Ｍｅｌｉｇｅｔｈｅｓ ａｅｎｅｕｓ）、メロロンタ（Ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ）種、ミグドラス（Ｍｉｇｄｏｌｕｓ）種、モノカマス（Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓ）種、ナウパクタス・キサンソグラファス（Ｎａｕｐａｃｔｕｓ ｘａｎｔｈｏｇｒａｐｈｕｓ）、ニプタス・ホロレウカス（Ｎｉｐｔｕｓ ｈｏｌｏｌｅｕｃｕｓ）、オリクテス・リノセロス（Ｏｒｙｃｔｅｓ ｒｈｉｎｏｃｅｒｏｓ）、オリザエフィラス・スリナメンシス（Ｏｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ ｓｕｒｉｎａｍｅｎｓｉｓ）、オリザファガス・オリザエ（Ｏｒｙｚａｐｈａｇｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、オチオリンカス（Ｏｔｉｏｒｒｈｙｎｃｈｕｓ）種、オキセトニア・ユカンダ（Ｏｘｙｃｅｔｏｎｉａ ｊｕｃｕｎｄａ）、ファエドン・コクレアリアエ（Ｐｈａｅｄｏｎ ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ）、フィロファガ（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ）種、フィロトレタ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ）種、ポピリア・ジャポニカ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、プレモトリペス（Ｐｒｅｍｎｏｔｒｙｐｅｓ）種、プロステファナス・トランカタス（Ｐｒｏｓｔｅｐｈａｎｕｓ ｔｒｕｎｃａｔｕｓ）、フィリオデス（Ｐｓｙｌｌｉｏｄｅｓ）種、プチナス（Ｐｔｉｎｕｓ）種、リゾビウス・ベントラリス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｓ ｖｅｎｔｒａｌｉｓ）、リゾペルタ・ドミニカ（Ｒｈｉｚｏｐｅｒｔｈａ ｄｏｍｉｎｉｃａ）、シトフィラス（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ）種、スフェノフォラス（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ）種、ステゴビウム・パニセウム（Ｓｔｅｇｏｂｉｕｍ ｐａｎｉｃｅｕｍ）、ステルネカス（Ｓｔｅｒｎｅｃｈｕｓ）種、シンフィレテス（Ｓｙｍｐｈｙｌｅｔｅｓ）種、タニメカス（Ｔａｎｙｍｅｃｕｓ）種、テネブリオ・モリトール（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ）、トリボリウム（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ）種、トロゴデルマ（Ｔｒｏｇｏｄｅｒｍａ）種、チキアス（Ｔｙｃｈｉｕｓ）種、キシロトレカス（Ｘｙｌｏｔｒｅｃｈｕｓ）種、ザブラス（Ｚａｂｒｕｓ）種由来のものである。
さらに他の例は、トビムシ目、たとえばオニキウラス・アルマタス（Ｏｎｙｃｈｉｕｒｕｓ ａｒｍａｔｕｓ）由来のものである。
さらに他の例は、倍脚目、たとえばブラニウラス・グツラタス（Ｂｌａｎｉｕｌｕｓ ｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ）由来のものである。
さらに他の例は、双翅目、たとえばアエデス（Ａｅｄｅｓ）種、アグロミザ（Ａｇｒｏｍｙｚａ）種、アナストレファ（Ａｎａｓｔｒｅｐｈａ）種、アノフェレス（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）種、アスフォンディリア（Ａｓｐｈｏｎｄｙｌｉａ）種、バクトロセラ（Ｂａｃｔｒｏｃｅｒａ）、ビビオ・ホルタラナス（Ｂｉｂｉｏ ｈｏｒｔｕｌａｎｕｓ）、カリフォラ・エリスロセファラ（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ ｅｒｙｔｈｒｏｃｅｐｈａｌａ）、セラティティス・カピタータ（Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ ｃａｐｉｔａｔａ）、キロノマス（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ）種、キリソミア（Ｃｈｒｙｓｏｍｙｉａ）種、クリソプス（Ｃｈｒｙｓｏｐｓ）種、コクリミア（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ）種、コンタリニア（Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ）種、コルディロビア・アンソロポファガ（Ｃｏｒｄｙｌｏｂｉａ ａｎｔｈｒｏｐｏｐｈａｇａ）、クレクス（Ｃｕｌｅｘ）種、カリコイデス（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ）種、カリセタ（Ｃｕｌｉｓｅｔａ）種、クテレブラ（Ｃｕｔｅｒｅｂｒａ）種、ダカス・オレアエ（Ｄａｃｕｓ ｏｌｅａｅ）、ダシネウラ（Ｄａｓｙｎｅｕｒａ）種、デリア（Ｄｅｌｉａ）種、デアルマトビア・ホミニス（Ｄｅｒｍａｔｏｂｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）種、エキノクネマス（Ｅｃｈｉｎｏｃｎｅｍｕｓ）種、ファニア（Ｆａｎｎｉａ）種、ガステロフィラス（Ｇａｓｔｅｒｏｐｈｉｌｕｓ）種、グロシナ種、ハエマトポタ（Ｈａｅｍａｔｏｐｏｔａ）種、ヒドレリア（Ｈｙｄｒｅｌｌｉａ）種、ヒレミア（Ｈｙｌｅｍｙｉａ）種、ヒポボスカ（Ｈｙｐｐｏｂｏｓｃａ）種、ヒポデルマ（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ ）種、リリオミザ（Ｌｉｒｉｏｍｙｚａ）種、ルシリア（Ｌｕｃｉｌｉａ）種、ルトゾミア（Ｌｕｔｚｏｍｉａ）種、マンソニア（Ｍａｎｓｏｎｉａ）種、ムスカ（Ｍｕｓｃａ）種、ネザラ（Ｎｅｚａｒａ）種、オエストラス（Ｏｅｓｔｒｕｓ）種、オスシネラ・フリット（Ｏｓｃｉｎｅｌｌａ ｆｒｉｔ）、ペゴミア（Ｐｅｇｏｍｙｉａ）種、フェレボトマス（Ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｕｓ）種、フォルビア（Ｐｈｏｒｂｉａ）種、フォルミア（Ｐｈｏｒｍｉａ）種、プロディプロシス（Ｐｒｏｄｉｐｌｏｓｉｓ）種、プシラ・ロサエ（Ｐｓｉｌａ ｒｏｓａｅ）、ラゴレティス（Ｒｈａｇｏｌｅｔｉｓ）種、サルコファガ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ）種、シマリウム（Ｓｉｍｕｌｉｕｍ）種、ストモキシス（Ｓｔｏｍｏｘｙｓ）種、タババス（Ｔａｂａｎｕｓ）種、タニア（Ｔａｎｎｉａ）種、テタノプス（Ｔｅｔａｎｏｐｓ）種、チプラ（Ｔｉｐｕｌａ）種由来のものである。
さらに他の例は、異翅目、たとえばアナサ・トリスティス（Ａｎａｓａ ｔｒｉｓｔｉｓ）、アンテスティオプシス（Ａｎｔｅｓｔｉｏｐｓｉｓ）種、ボイセア（Ｂｏｉｓｅａ）種、ブリサス（Ｂｌｉｓｓｕｓ）種、カロコリス（Ｃａｌｏｃｏｒｉｓ）種、カンピローマ・リビダ（Ｃａｍｐｙｌｏｍｍａ ｌｉｖｉｄａ）、カベレリアス（Ｃａｖｅｌｅｒｉｕｓ）種、キメクス（Ｃｉｍｅｘ）種、コラリア（Ｃｏｌｌａｒｉａ）種、クレオンティアデス・ディラタス（Ｃｒｅｏｎｔｉａｄｅｓ ｄｉｌｕｔｕｓ）、ダシナス・ピペリス（Ｄａｓｙｎｕｓ ｐｉｐｅｒｉｓ）、ディケロプス・フルカタス（Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｆｕｒｃａｔｕｓ）、ディコノコリス・ヘウェッティ（Ｄｉｃｏｎｏｃｏｒｉｓ ｈｅｗｅｔｔｉ）、ディスデルカス（Ｄｙｓｄｅｒｃｕｓ）種、エウスキスタス（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ）種、エウイリガステル（Ｅｕｒｙｇａｓｔｅｒ）種、ヘリッペルティス（Ｈｅｌｉｏｐｅｌｔｉｓ）種、ホルシアス・ノビレラス（Ｈｏｒｃｉａｓ ｎｏｂｉｌｅｌｌｕｓ）、レプトコリサ（Ｌｅｐｔｏｃｏｒｉｓａ）種、レプトグロサス・フィロパス（Ｌｅｐｔｏｇｌｏｓｓｕｓ ｐｈｙｌｌｏｐｕｓ）、リガス（Ｌｙｇｕｓ）種、マクロペス・エクスカバタス（Ｍａｃｒｏｐｅｓ ｅｘｃａｖａｔｕｓ）、ミリダエ（Ｍｉｒｉｄａｅ）、モナロニオン・アトラタム（Ｍｏｎａｌｏｎｉｏｎ ａｔｒａｔｕｍ）、ネザラ（Ｎｅｚａｒａ）種、オエバラス（Ｏｅｂａｌｕｓ）種、ペントミダエ（Ｐｅｎｔｏｍｉｄａｅ）、ピエスマ・クアドラタ（Ｐｉｅｓｍａ ｑｕａｄｒａｔａ）、ピエゾドラス（Ｐｉｅｚｏｄｏｒｕｓ）種、プサラス（Ｐｓａｌｌｕｓ）種、プセイダシスタ・ペルセア（Ｐｓｅｕｄａｃｙｓｔａ ｐｅｒｓｅａ）、ロドニアス（Ｒｈｏｄｎｉｕｓ）種、サルベルゲラ シングラリス（Ｓａｈｌｂｅｒｇｅｌｌａ ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）、スカプトコリス・カスタネア（Ｓｃａｐｔｏｃｏｒｉｓ ｃａｓｔａｎｅａ）、スコティノフォラ（Ｓｃｏｔｉｎｏｐｈｏｒａ）種、ステファニティス・ナシ（Ｓｔｅｐｈａｎｉｔｉｓ ｎａｓｈｉ）、ティブラカ（Ｔｉｂｒａｃａ）種、トリアトマ（Ｔｒｉａｔｏｍａ）種由来のものである。
さらに他の例は、ホモプテラ目、たとえばアシルソシポン（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｏｎ）種、アクロゴニア（Ａｃｒｏｇｏｎｉａ）種、アエネオラミア（Ａｅｎｅｏｌａｍｉａ）種、アゴノスセナ（Ａｇｏｎｏｓｃｅｎａ）種、アレウロデス（Ａｌｅｕｒｏｄｅｓ）種、アレウロロバス・バロデンシス（Ａｌｅｕｒｏｌｏｂｕｓ ｂａｒｏｄｅｎｓｉｓ）、アレウロスリキサス（Ａｌｅｕｒｏｔｈｒｉｘｕｓ）種、アムラスカ（Ａｍｒａｓｃａ）種、アナラフィス・カーデュイ（Ａｎｕｒａｐｈｉｓ ｃａｒｄｕｉ）、アオニディエラ（Ａｏｎｉｄｉｅｌｌａ）種、アファノスティグマ・ピン（Ａｐｈａｎｏｓｔｉｇｍａ ｐｉｎ）、アフィス（Ａｐｈｉｓ）種、アルボリディア・アピカリス（Ａｒｂｏｒｉｄｉａ ａｐｉｃａｌｉｓ）、アスピディエラ（Ａｓｐｉｄｉｅｌｌａ）種、アスピディオス（Ａｓｐｉｄｉｏｔｕｓ）種、アタナス（Ａｔａｎｕｓ）種、アウラコルサム・ソラニ（Ａｕｌａｃｏｒｔｈｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、ベミシア（Ｂｅｍｉｓｉａ）種、ブラキカウダス・ヘリキリシー（Ｂｒａｃｈｙｃａｕｄｕｓ ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｉｉ）、ブラキコラス（Ｂｒａｃｈｙｃｏｌｕｓ）種、ブレビコリネ・ブラシカエ（Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、カリジポナ・マルギナタ（Ｃａｌｌｉｇｙｐｏｎａ ｍａｒｇｉｎａｔａ）、カルネオセファラ・フルギダ（Ｃａｒｎｅｏｃｅｐｈａｌａ ｆｕｌｇｉｄａ）、セラトバクナ・ラニゲラ（Ｃｅｒａｔｏｖａｃｕｎａ ｌａｎｉｇｅｒａ）、セルコピダエ（Ｃｅｒｃｏｐｉｄａｅ）、セロプラステス（Ｃｅｒｏｐｌａｓｔｅｓ）種、カエトシホン・フラガエホリイ（Ｃｈａｅｔｏｓｉｐｈｏｎ ｆｒａｇａｅｆｏｌｉｉ）、キオナスピス・テガレンシス（Ｃｈｉｏｎａｓｐｉｓ ｔｅｇａｌｅｎｓｉｓ）、クロリタ・オヌキイ（Ｃｈｌｏｒｉｔａ ｏｎｕｋｉｉ）、クロマフィス・ジュグランジコラ（Ｃｈｒｏｍａｐｈｉｓ ｊｕｇｌａｎｄｉｃｏｌａ）、クリソムファルス・フィクス（Ｃｈｒｙｓｏｍｐｈａｌｕｓ ｆｉｃｕｓ）、シカズリナ・ムビラ（Ｃｉｃａｄｕｌｉｎａ ｍｂｉｌａ）、コッコミチルス・ハリイ（Ｃｏｃｃｏｍｙｔｉｌｕｓ ｈａｌｌｉ）、コックス（Ｃｏｃｃｕｓ）種、クリプトミズス・リビス（Ｃｒｙｐｔｏｍｙｚｕｓ ｒｉｂｉｓ）、ダルブルス（Ｄａｌｂｕｌｕｓ）種、ジアレウロデス（Ｄｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ）種、ジアホリナ（Ｄｉａｐｈｏｒｉｎａ）種、ジアスピス（Ｄｉａｓｐｉｓ）種、ドロシカ（Ｄｒｏｓｉｃｈａ）種、ジサフィス（Ｄｙｓａｐｈｉｓ）種、ジスミコックス（Ｄｙｓｍｉｃｏｃｃｕｓ）種、エンポアスカ（Ｅｍｐｏａｓｃａ）種、エリオソマ（Ｅｒｉｏｓｏｍａ）種、エリトロネウラ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｅｕｒａ）種、エウセリス・ビロバツス（Ｅｕｓｃｅｌｉｓ ｂｉｌｏｂａｔｕｓ）、フェリシア（Ｆｅｒｒｉｓｉａ）種、ゲオコックス・コフェアエ（Ｇｅｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｆｆｅａｅ）、ヒエログィファス（Ｈｉｅｒｏｇｌｙｐｈｕｓ）種、ホマロディスカ・コアグラータ（Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ ｃｏａｇｕｌａｔａ）、ヒアロプテラス・アランディニス（Ｈｙａｌｏｐｔｅｒｕｓ ａｒｕｎｄｉｎｉｓ）、イセリヤ（Ｉｃｅｒｙａ）種、イディオセラス（Ｉｄｉｏｃｅｒｕｓ）種、イディオスコパス（Ｉｄｉｏｓｃｏｐｕｓ）種、ラオデルファックス・ストリアテラス（Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ）、レカニウム（Ｌｅｃａｎｉｕｍ種）、レピドサフェス（Ｌｅｐｉｄｏｓａｐｈｅｓ）種、リパフィス・エリシミ（Ｌｉｐａｐｈｉｓ ｅｒｙｓｉｍｉ）、マクロシファム（Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ）種、マハナルバ（Ｍａｈａｎａｒｖａ）種、メラナフィス・サッカリ（Ｍｅｌａｎａｐｈｉｓ ｓａｃｃｈａｒｉ）、メトファルフィエラ（Ｍｅｔｃａｌｆｉｅｌｌａ）種、メトポロフィウム・ディロダム（Ｍｅｔｏｐｏｌｏｐｈｉｕｍ ｄｉｒｈｏｄｕｍ）、モネリア・コスタリス（Ｍｏｎｅｌｌｉａ ｃｏｓｔａｌｉｓ）、モネリオプシス・ペカニス（Ｍｏｎｅｌｌｉｏｐｓｉｓ ｐｅｃａｎｉｓ）、マイザス（Ｍｙｚｕｓ）種、ナソノビア・リビスニグリ（Ｎａｓｏｎｏｖｉａ ｒｉｂｉｓｎｉｇｒｉ）、ネフォテティックス（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ）種、ニラパルバタ・ルゲンス（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ）、オンコメトピア（Ｏｎｃｏｍｅｔｏｐｉａ）種、オルセジア・プラロンガ（Ｏｒｔｈｅｚｉａ ｐｒａｅｌｏｎｇａ）、パラベミシア・ミリカエ（Ｐａｒａｂｅｍｉｓｉａ ｍｙｒｉｃａｅ）、パラトリゾア（Ｐａｒａｔｒｉｏｚａ）種、パルラトリア（Ｐａｒｌａｔｏｒｉａ）種、ペンフィガス（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ）種、ペレグリナス・マイディス（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ ｍａｉｄｉｓ）、フェナコッカス（Ｐｈｅｎａｃｏｃｃｕｓ）種、フレオマイザス・パセリニー（Ｐｈｌｏｅｏｍｙｚｕｓ ｐａｓｓｅｒｉｎｉｉ）、ホロドン・フムリ（Ｐｈｏｒｏｄｏｎ ｈｕｍｕｌｉ）、フィロキセラ（Ｐｈｙｌｌｏｘｅｒａ）種、ピナスピス・アスピディストラエ（Ｐｉｎｎａｓｐｉｓ ａｓｐｉｄｉｓｔｒａｅ）、プラノコッカス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ）種、プロトプルビナリア・ピリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｐｕｌｖｉｎａｒｉａ ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ）、プセウダウラカスピス・ペンタゴナ（Ｐｓｅｕｄａｕｌａｃａｓｐｉｓ ｐｅｎｔａｇｏｎａ）、プセウドコッカス（Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｕｓ）種、プシラ（Ｐｓｙｌｌａ ）種、プテロマラス（Ｐｔｅｒｏｍａｌｕｓ）種、ピリラ（Ｐｙｒｉｌｌａ）種、クアドラスピディオタス（Ｑｕａｄｒａｓｐｉｄｉｏｔｕｓ）種、ケサダ・ギガス（Ｑｕｅｓａｄａ ｇｉｇａｓ）、ラストラコッカス（Ｒａｓｔｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、ロパロシファム（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ）種、サイセチア（Ｓａｉｓｓｅｔｉａ）種、スカホイデス・ティタナス（Ｓｃａｐｈｏｉｄｅｓ ｔｉｔａｎｕｓ）、スキザフィス・グラミナム（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、セレナスピダス・アルティカラタス（Ｓｅｌｅｎａｓｐｉｄｕｓ ａｒｔｉｃｕｌａｔｕｓ）、ソガタ（Ｓｏｇａｔａ）種、ソガテラ・フルシフェラ（Ｓｏｇａｔｅｌｌａ ｆｕｒｃｉｆｅｒａ）、ソガトデス（Ｓｏｇａｔｏｄｅｓ）種、スティクトセファラ・フェスティナ（Ｓｔｉｃｔｏｃｅｐｈａｌａ ｆｅｓｔｉｎａ）、テナラファラ・マレイエンシス（Ｔｅｎａｌａｐｈａｒａ ｍａｌａｙｅｎｓｉｓ）、チノカリス・カリアエフォリアエ（Ｔｉｎｏｃａｌｌｉｓ ｃａｒｙａｅｆｏｌｉａｅ）、トマスピス（Ｔｏｍａｓｐｉｓ）種、トキソプテラ（Ｔｏｘｏｐｔｅｒａ）種、トリアレウロデス（Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ）種、トリオザ（Ｔｒｉｏｚａ）種、ティフィロシバ（Ｔｙｐｈｌｏｃｙｂａ）種、ウナスピス（Ｕｎａｓｐｉｓ）種、ビテアス・ビチフォリー（Ｖｉｔｅｕｓ ｖｉｔｉｆｏｌｉｉ）、ジアギナ（Ｚｙｇｉｎａ）種由来のものである。
さらに他の例は、膜翅目、たとえばアクロミルメックス（Ａｃｒｏｍｙｒｍｅｘ）種、アサリア（Ａｔｈａｌｉａ）種、アッタ（Ａｔｔａ）種、ディプリオン（Ｄｉｐｒｉｏｎ）種、ホプロカンパ（Ｈｏｐｌｏｃａｍｐａ）種、ラシウス（Ｌａｓｉｕｓ）種、モノモリウム・ファラオニス（Ｍｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ）、ソレノプシス・インビクタ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ）、タピノマ（ＴａｐｉｎｏｍａＯ種、ベスパ（Ｖｅｓｐａ）種由来のものである。
さらに他の例は、等脚目、たとえばアルマジリジウム・バルガエ（Ａｒｍａｄｉｌｌｉｄｉｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、オニスカス・アセラス（Ｏｎｉｓｃｕｓ ａｓｅｌｌｕｓ）、ポルセリオ・スカベル（Ｐｏｒｃｅｌｌｉｏ ｓｃａｂｅｒ）由来のものである。
さらに他の例は、等翅目、たとえばコプトテルメス（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ）種、コルニテルメス・クムランス（Ｃｏｒｎｉｔｅｒｍｅｓ ｃｕｍｕｌａｎｓ）、クリプトテルメス（Ｃｒｙｐｔｏｔｅｒｍｅｓ）種、インシシテルメス（Ｉｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ）種、ミクロテルメス・オベシ（Ｍｉｃｒｏｔｅｒｍｅｓ ｏｂｅｓｉ）、オドントテルメス（Ｏｄｏｎｔｏｔｅｒｍｅｓ）種、レチクリテルメス（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ）種由来のものである。
さらなる他の例は、鱗翅目、たとえばアクロニクタ・メジャー（Ａｃｒｏｎｉｃｔａ ｍａｊｏｒ）、アドキソフィエス（Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ）種、アエディア・ラウコメラス（Ａｅｄｉａ ｌｅｕｃｏｍｅｌａｓ）、アグロティス（Ａｇｒｏｔｉｓ）種、Ａｌａｂａｍａ（アラバマ）種、アミエロイス・トランシテラ（Ａｍｙｅｌｏｉｓ ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ）、アナルシア（Ａｎａｒｓｉａ）種、アンチカルシア（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ）種、アルギロプロセ（Ａｒｇｙｒｏｐｌｏｃｅ）種、バラセラ・ブラシカエ（Ｂａｒａｔｈｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ボルボ・シナラ（Ｂｏｒｂｏ ｃｉｎｎａｒａ）、ブカラトリックス・スルベリエラ（Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ ｔｈｕｒｂｅｒｉｅｌｌａ）、ブパラス・ピニアリウス（Ｂｕｐａｌｕｓ ｐｉｎｉａｒｉｕｓ）、ブセオラ（Ｂｕｓｓｅｏｌａ）種、カコエシア（Ｃａｃｏｅｃｉａ）種、カロプティリア・セイボラ（Ｃａｌｏｐｔｉｌｉａ ｔｈｅｉｖｏｒａ）、カプア・レチクラナ（Ｃａｐｕａ ｒｅｔｉｃｕｌａｎａ）、カルオイカプサ・ポモネラ（Ｃａｒｐｏｃａｐｓａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）、カルポシナ・ニポネンシス（Ｃａｒｐｏｓｉｎａ ｎｉｐｏｎｅｎｓｉｓ）、ケマトビア・ブルマタ（Ｃｈｅｍａｔｏｂｉａ ｂｒｕｍａｔａ）、チロ（Ｃｈｉｌｏ）種、コリストネウラ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ）種、クリシア・アンビグエラ（Ｃｌｙｓｉａ ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ）、クナファロセラス（Ｃｎａｐｈａｌｏｃｅｒｕｓ）種、クネファシア（Ｃｎｅｐｈａｓｉａ）種、コノポモルファ（Ｃｏｎｏｐｏｍｏｒｐｈａ）種、コノトラケラス（Ｃｏｎｏｔｒａｃｈｅｌｕｓ）種、コピタルシア（Ｃｏｐｉｔａｒｓｉａ）種、シディア（Ｃｙｄｉａ）種、ダラカ・ノクツイデス（Ｄａｌａｃａ ｎｏｃｔｕｉｄｅｓ）、ディアファニア（Ｄｉａｐｈａｎｉａ）種、ディアトラエア・サッカラリス（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、エアリアス（Ｅａｒｉａｓ）種、エクディトロファ・アウランチウム（Ｅｃｄｙｔｏｌｏｐｈａ ａｕｒａｎｔｉｕｍ）、エラスモパルパス・リグノセラス（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）、エルダナ・サッカリナ（Ｅｌｄａｎａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）、エフェスチア（Ｅｐｈｅｓｔｉａ）種、エピノチア（Ｅｐｉｎｏｔｉａ）種、エピフィアス・ポストビッターナ（Ｅｐｉｐｈｙａｓ ｐｏｓｔｖｉｔｔａｎａ）、エチエラ（Ｅｔｉｅｌｌａ）種、エウリア（Ｅｕｌｉａ）種、エウポシリア・アンビグエラ（Ｅｕｐｏｅｃｉｌｉａ ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ）、エウプロクチス（Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ）種、エウクソア（Ｅｕｘｏａ）種、フェルチア（Ｆｅｌｔｉａ）種、ガレリア・メロネラ（Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）、グラシラリア（Ｇｒａｃｉｌｌａｒｉａ）種、グラフォリサ（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔｈａ）種、ヘティレプタ（Ｈｅｄｙｌｅｐｔａ）種、ヘリコベルパ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ）種、ヘリオシス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ）種、ホフマノフィラ・プセウドスプレテラ（Ｈｏｆｍａｎｎｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｓｐｒｅｔｅｌｌａ）、ホモエオソマ（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ）種、ホモナ（Ｈｏｍｏｎａ）種、ヒポノメウタ・パデラ（Ｈｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ ｐａｄｅｌｌａ）、カキボリア・フラボファスシアタ（Ｋａｋｉｖｏｒｉａ ｆｌａｖｏｆａｓｃｉａｔａ）、ラフィグマ（Ｌａｐｈｙｇｍａ）種、ラスペイレシア・モレスタ（Ｌａｓｐｅｙｒｅｓｉａ ｍｏｌｅｓｔａ）、ロイシノデス・オルボナリス（Ｌｅｕｃｉｎｏｄｅｓ ｏｒｂｏｎａｌｉｓ）、ロウコプテラ（Ｌｅｕｃｏｐｔｅｒａ）種、リソコレティス（Ｌｉｔｈｏｃｏｌｌｅｔｉｓ）種、リソファネ・アンテナータ（Ｌｉｔｈｏｐｈａｎｅ ａｎｔｅｎｎａｔａ）、ロベシア（Ｌｏｂｅｓｉａ）種、ロキサグロティス・アルビコスタ（Ｌｏｘａｇｒｏｔｉｓ ａｌｂｉｃｏｓｔａ）、リマントリア（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ）種、リオネティカ（Ｌｙｏｎｅｔｉａ）種、マラコソマ・ネウストリア（Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ ｎｅｕｓｔｒｉａ）、マルカ・テスタラリス（Ｍａｒｕｃａ ｔｅｓｔｕｌａｌｉｓ）、マメストラ・ブラシカエ（Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、モシス（Ｍｏｃｉｓ）種、ミシナ・セパラタ（Ｍｙｔｈｉｍｎａ ｓｅｐａｒａｔａ）、ニンフラ（Ｎｙｍｐｈｕｌａ）種、オイケティカス（Ｏｉｋｅｔｉｃｕｓ）種、オリア（Ｏｒｉａ）種、オルサガ（Ｏｒｔｈａｇａ）種、オストリニア（Ｏｓｔｒｉｎｉａ）種、オウレマ・オリザエ（Ｏｕｌｅｍａ ｏｒｙｚａｅ）、パノリス・フラメア（Ｐａｎｏｌｉｓ ｆｌａｍｍｅａ）、パルナラ（Ｐａｒｎａｒａ）種、ペクティノフォラ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ）種、ペリロウコプテラ（Ｐｅｒｉｌｅｕｃｏｐｔｅｒａ）種、フソリマエア（Ｐｈｔｈｏｒｉｍａｅａ）種、フィロクニスティス・シトレラ（Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ ｃｉｔｒｅｌｌａ）、フィロノリクテル（Ｐｈｙｌｌｏｎｏｒｙｃｔｅｒ）種、ピエリス（Ｐｉｅｒｉｓ）種、プラティノタ・スタルタナ（Ｐｌａｔｙｎｏｔａ ｓｔｕｌｔａｎａ）、プロディア・インテルパンクテラ（Ｐｌｏｄｉａ ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ）、プラシア（Ｐｌｕｓｉａ）種、プルテラ・キシロステラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、プレイス（Ｐｒａｙｓ）種、プロデニア（Ｐｒｏｄｅｎｉａ）種、プロトパルセ（Ｐｒｏｔｏｐａｒｃｅ）種、プセウダレティア（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ）種、プセウドプラシア・インクラデンス（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、ピラウスタ・ヌビラリス（Ｐｙｒａｕｓｔａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ラキプラシア・ヌ（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｎｕ）、スコエノビウス（Ｓｃｈｏｅｎｏｂｉｕｓ）種、スシルポファガ（Ｓｃｉｒｐｏｐｈａｇａ）種、スコティア・セゲタム（Ｓｃｏｔｉａ ｓｅｇｅｔｕｍ）、セサミア（Ｓｅｓａｍｉａ）種、スパルガノティス（Ｓｐａｒｇａｎｏｔｈｉｓ）種、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）種、スタスモポダ（Ｓｔａｔｈｍｏｐｏｄａ）種、ストモプテリクス・サブセシベラ（Ｓｔｏｍｏｐｔｅｒｙｘ ｓｕｂｓｅｃｉｖｅｌｌａ）、シナンセドン（Ｓｙｎａｎｔｈｅｄｏｎ）種、テシア・ソラニボラ（Ｔｅｃｉａ ｓｏｌａｎｉｖｏｒａ）、セルメシア・ゲマタリス（Ｔｈｅｒｍｅｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、ティネア・ペリオネラ（Ｔｉｎｅａ ｐｅｌｌｉｏｎｅｌｌａ）、ティネオラ・ビセリエラ（Ｔｉｎｅｏｌａ ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ）、トルトリックス（Ｔｏｒｔｒｉｘ ）種、トリコファガ・タペトゼラ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｇａ ｔａｐｅｔｚｅｌｌａ）、トリコプラシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）種、ツタ・アブソルタ（Ｔｕｔａ ａｂｓｏｌｕｔａ）、ビラコラ（Ｖｉｒａｃｈｏｌａ）種由来のものである。
さらに他の例は、直翅目、たとえばアケタ・ドメスティカス（Ａｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）、ブラッタ・オリエンタリス（Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、ブラテラ・ゲルマニカ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）、ディクロプラス（Ｄｉｃｈｒｏｐｌｕｓ）種、グリロタルパ（Ｇｒｙｌｌｏｔａｌｐａ）種、ロウコフェアエア・マデラエ（Ｌｅｕｃｏｐｈａｅａ ｍａｄｅｒａｅ）、トノサマバッタ種、メラノプラス（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ）種、ペリプラネタ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ）種、プレックス・イリタンス（Ｐｕｌｅｘ ｉｒｒｉｔａｎｓ）、スキストセルカ・グラガリア（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ ｇｒｅｇａｒｉａ）、スペラ・ロンギパルパ（Ｓｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ）由来のものである。
さらなる他の例は、ノミ目、たとえばセラトフィラス（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｓ）種、クテノセファリデス（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ）種、タンガ・ペネトランス（Ｔｕｎｇａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、キセノプシラ・ケオピス（Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ ｃｈｅｏｐｉｓ）由来のものである。
さらに他の例は、結合目、たとえばスクティゲレラ（Ｓｃｕｔｉｇｅｒｅｌｌａ）種由来のものである。
さらなる他の例は、総翅目、たとえばアナフォスリプ・オブスカラス（Ａｎａｐｈｏｔｈｒｉｐｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ）、バリオスリプ・ビフォルミス（Ｂａｌｉｏｔｈｒｉｐｓ ｂｉｆｏｒｍｉｓ）、ドレパノスリス・レウテリ（Ｄｒｅｐａｎｏｔｈｒｉｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、エネスリプ・フラベンス（Ｅｎｎｅｏｔｈｒｉｐｓ ｆｌａｖｅｎｓ）、フランクリニエラ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ）種、ヘリオスリプ（Ｈｅｌｉｏｔｈｒｉｐｓ）種、ヘルシノスリプス・フェモラリス（Ｈｅｒｃｉｎｏｔｈｒｉｐｓ ｆｅｍｏｒａｌｉｓ）、リピフォロスリプス・クルエンタタス（Ｒｈｉｐｉｐｈｏｒｏｔｈｒｉｐｓ ｃｒｕｅｎｔａｔｕｓ）、スシルトシプス（Ｓｃｉｒｔｏｔｈｒｉｐｓ）種、タエニオスリプス・カルダモニ（Ｔａｅｎｉｏｔｈｒｉｐｓ ｃａｒｄａｍｏｎｉ）、アザミウマ種由来のものである。
さらなる他の例は、シミ目（＝総尾目）、たとえばレピスマ・サッカリナ（Ｌｅｐｉｓｍａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）、セルモビア・ドメスティカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）由来のものである。たとえばレピスマ・サッカリナ（Ｌｅｐｉｓｍａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）、セルモビア・ドメスティカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）。
別の実施形態では、特に双殻綱由来の軟体動物門の有害生物、たとえばゼブラガイ（Ｄｒｅｉｓｓｅｎａ）種もまた、重要な植物有害生物である。
別の実施形態では、腹足綱の有害生物が、重要な植物有害生物、たとえばアニオン（Ａｎｉｏｎ）種、ビオンファラリア（Ｂｉｏｍｐｈａｌａｒｉａ）種、ブリヌス（Ｂｕｌｉｎｕｓ）種、デロセラス（Ｄｅｒｏｃｅｒａｓ）種、ガルバ（Ｇａｌｂａ）種、モノアラガイ（Ｌｙｍｎａｅａ）種、カタヤマガイ（Ｏｎｃｏｍｅｌａｎｉａ）種、ポマセア（Ｐｏｍａｃｅａ）種、スクシネア（Ｓｕｃｃｉｎｅａ）種である。
さらに別の実施形態では、植物有害生物が、線形動物門由来のものであり、重要な植物有害生物、すなわち植物寄生性の線虫であり、したがって、植物に損害を引き起こす植物寄生虫の線虫を意味する。植物線虫は、植物寄生虫の線虫および土中で生きている線虫を包含する。植物寄生虫の線虫は、キシフィネマ（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ）種、ロンギドラス（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ）種、およびトリコドラス（Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ）種などのような外部寄生虫；チレンチュラス（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ）種などのような半寄生生物；プラチレンカス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）種、ラドフォラス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ）種、およびスクテロネルナ（Ｓｃｕｔｅｌｌｏｎｅｒｎａ）種などのような移動性の内部寄生虫；ヘテロデラ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）種、グロボデラ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）種、およびメロイドギネ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）種などのような定住性の寄生虫、ならびにディチレンカス（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）種、アフェレンコイデス（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ）種、およびヒルシュマニエラ（Ｈｉｒｓｈｍａｎｉｅｌｌａ）種などのような茎および葉の内部寄生虫を含むが、これらに限定されない。そのうえ、有害な根寄生性土壌線虫は、ヘテロデラ属（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）もしくはグロボデラ属（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）の嚢胞形成線虫および／またはメロイドギネ属（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）の根瘤線虫である。これらの属の有害な類は、たとえばメロイドギネ・インコグナタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎａｔａ）、ヘテロデラ・グリシネ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ）（ダイズ嚢胞線虫）、グロボデラ・パリダ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ）、およびグロボデラ・ロストキエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）（ジャガイモ嚢胞線虫）である。植物有害生物として重要なさらに別の重要な属は、ロチレンカラス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ）種、パラトリクロドラス（Ｐａｒａｔｒｉｃｌｏｄｏｒｕｓ）種、パラチレンカス・ペネトランス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、ラドロファス・シムリ（Ｒａｄｏｌｏｐｈｕｓ ｓｉｍｕｌｉ）、ディチレンカス・ディスパシ（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｉｓｐａｃｉ）、チレンカラス・セミペネトランス（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｓｅｍｉｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、キシフィネマ（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ）種、バルサフェレンカス（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ）種、およびその他同種のものを含む。特に、アフェレンコイデス（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ）種、バルサフェレンカス（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ）種、ディチレンカス（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）種、グロボデラ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）種、ヘテロデラ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）種、ロンギドラス（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ）種、メロイドギネ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）種、パラチレンカス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）種、ラドフォラス・シミリス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ）、トリコドラス（Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ）種、チレンカラス・セミペネトランス（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｓｅｍｉｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、キシフィネマ（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ）種を含む。
アルファモウイルス、アレクシウイルス、アルファクリプトウイルス、アヌラウイルス、アプスカウイロイド、オーレウスウイルス、アベナウイルス、アイサンウイロイド、バドナウイルス、ベゴモウイルス、ベニウイルス、ベタクリプトウイルス、ベタフレキシウイリダエ、ブロモウイルス、ビモウイルス、カピロウイルス、カルラウイルス、カルモウイルス、カウリモウイルス、カベモウイルス、チェラウイルス、クロステロウイルス、コカドウイロイド、コレウイロイド、コモウイルス、クリニウイルス、ククモウイルス、クルトウイルス、シトルハブドウイルス、ジアントウイルス、エナモウイルス、ウムブラウイルス＆Ｂ型サテライトウイルス、ファバウイルス、フィジウイルス、フロウイルス、ホルデイウイルス、ホスツウイロイド、イダエオウイルス、イラルウイルス、イポモウイルス、ルテオウイルス、マクロモウイルス、マクルラウイルス、マラフィウイルス、マストレウイルス、ナノウイルス、ネクロウイルス、ネポウイルス、ヌクレオルハブドウイルス、オレアウイルス、オフィノウイルス、オリザウイルス、パニコウイルス、ペクルウイルス、ペツウイルス、フィトレオウイルス、ポレロウイルス、ポモウイルス、ポスピウイロイド、ポテックスウイルス、ポチウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、リモウイルス、サドワウイルス、ＳｂＣＭＶ様ウイルス、セクイウイルス、ソベモウイルス、テヌイウイルス、ＴＮｓａｔＶ様サテライトウイルス、トバモウイルス、トポクウイルス、トスポウイルス、トリコウイルス、トリチモウイルス、ツングロウイルス、チモウイルス、ウムブラウイルス、バリコサウイルス、ビチウイルス、またはワイカウイルスから選択される植物ウイルスもまた、植物有害生物であるとして本明細書において開示される。
ある実施形態では、本発明が、植物病原性菌類に抵抗性のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞を提供し、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
ある実施形態では、本発明が、植物病原性菌類による感染または他の生物学的相互作用に抵抗性のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞を提供し、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞が、菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
方法および使用
さらなる態様は、植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部での植物病原体の増殖を阻害するための、および／または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための方法であって、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において病原体に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法を提供する。
ある実施形態では、本発明が、植物病原体による感染または他の生物学的相互作用から植物または植物の一部を保護するまたは処置するための方法であって、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞においてまたは植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部において（すなわちｉｎ ｐｌａｎｔａにおいて）、病原体に、特に菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つの配列を含むポリヌクレオチドを発現させるステップを少なくとも含む方法を提供する。ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、植物病原体、特に植物病原性菌類によるその感染または生物学的相互作用に対して植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部を保護するまたは処置するのに効率的な条件下で、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞においてまたは植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部において（すなわちｉｎ ｐｌａｎｔａにおいて）発現されてもよい。
ある特定の実施形態では、本発明が、植物病原体、特に植物病原性菌類の成長を阻害する、妨げる、低下させる、またはコントロールするための方法であって、病原体、特に菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において発現させるステップを少なくとも含む方法を提供する。
ある他の実施形態では、本発明が、植物病原体、特に植物病原性菌類を死滅させるための方法であって、病原体、特に菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合するＶＨＨをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において発現させるステップを少なくとも含む方法を提供する。
ある実施形態では、本発明が、抗菌剤としての、好ましくは静菌剤としての、病原体に特異的に結合する重鎖抗体（ＶＨＨ）の少なくとも１つの可変ドメインの使用であって、ＶＨＨが、植物または植物組織の少なくとも一部において発現されるポリヌクレオチドによってコードされる使用を提供する。
ある実施形態では、本発明が、植物病原体、好ましくは植物病原性菌類に対してトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞を保護するための、配列番号３３６および／または配列番号３３７のポリヌクレオチドの使用を提供する。
ある実施形態では、本発明が、トランスジェニック植物または植物組織の収率を改善するための、配列番号３３６および／または配列番号３３７のポリヌクレオチドの使用を提供する。
本発明は、本明細書において教示されるＶＨＨを調製するまたは生成するための方法およびこれらをコードするポリヌクレオチドを産生するための方法をさらに提供する。そのような方法のいくつかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書におけるさらなる説明から明らかになるであろう。
当業者に明らかであるように、本明細書において開示されるＶＨＨ配列を調製するための特に有用な方法は、
ａ）本明細書において開示される重鎖可変ドメイン配列をコードするヌクレオチド配列またはその重鎖可変ドメイン配列をコードするヌクレオチド配列のベクターもしくは遺伝的構築物を発現させるステップおよび
ｂ）任意選択によりＶＨＨ配列を精製するおよび／または単離するステップを一般に含む。
本明細書において想定される特定の実施形態では、有害生物に特異的なＶＨＨ配列が、アミノ酸配列の無作為のライブラリーを生成し、スフィンゴ脂質標的に特異的に結合することができるアミノ酸配列についてこのライブラリーをスクリーニングすることを含む方法によって得ることができる。
したがって、特定の実施形態では、本明細書において開示される重鎖可変ドメイン配列を調製するための方法が、
ａ）重鎖可変ドメイン配列のアミノ酸配列のセット、収集物、またはライブラリーを提供するステップ
ｂ）スフィンゴ脂質標的に結合することができるおよび／またはそれに対する親和性を有するアミノ酸配列についてアミノ酸配列の前記セット、収集物、またはライブラリーをスクリーニングするステップ、ならびに
ｃ）スフィンゴ脂質標的に結合することができるおよび／またはそれに対する親和性を有するアミノ酸配列を単離するステップを含む。
そのような方法において、アミノ酸配列のセット、収集物、またはライブラリーは、アミノ酸配列の任意の適したセット、収集物、またはライブラリーであってもよい。たとえば、アミノ酸配列のセット、収集物、またはライブラリーは、免疫グロブリン断片配列の未処理のセット、収集物、もしくはライブラリー、免疫グロブリン断片配列の合成もしくは半合成セット、収集物、もしくはライブラリー；および／または親和性成熟にかけられた免疫グロブリン断片配列のセット、収集物、もしくはライブラリーなどのような免疫グロブリン断片配列（本明細書において記載される）のセット、収集物、またはライブラリーであってもよい。
この方法の特定の実施形態では、アミノ酸配列のセット、収集物、またはライブラリーが、たとえば、スフィンゴ脂質標的によりもしくはそれに基づく適した抗原決定基により適切に免疫化された哺乳動物に由来するまたはその抗原性の一部、断片、領域、ドメイン、ループ、もしくは他のエピトープなどのようにそれに由来する免疫グロブリン断片配列の免疫セット、収集物、またはライブラリーであってもよい。ある特定の態様では、前記抗原決定基が、細胞外の一部、領域、ドメイン、ループ、または他の細胞外エピトープであってもよい。
上記の方法では、アミノ酸配列のセット、収集物、またはライブラリーは、スクリーニングを容易にするなどのために、ファージ、ファージミド、リボソーム、または適した微生物（酵母など）上に表されてもよい。アミノ酸配列（のセット、収集物、またはライブラリー）を表し、スクリーニングするための適した方法、技術、および宿主生物体は、たとえば本明細書におけるさらなる開示に基づいて当業者に明らかになるであろう。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，９，１１０５−１１１６（２００５）による概説もまた参照される。
他の実施形態では、本明細書において開示されるＶＨＨ配列を生成するための方法が、
ａ）重鎖可変ドメインアミノ酸配列を発現する細胞の収集物またはサンプルを提供するステップ、
ｂ）スフィンゴ脂質標的に結合することができるおよび／またはそれに対する親和性を有するアミノ酸配列を発現する細胞について細胞の前記収集物またはサンプルをスクリーニングするステップ、ならびに
ｃ）（ｉ）前記アミノ酸配列を単離するステップまたは（ｉｉ）前記アミノ酸配列をコードする核酸配列を前記細胞から単離し、その後、前記アミノ酸配列を発現させるステップを少なくとも含む。
細胞の収集物またはサンプルは、たとえばＢ細胞の収集物またはサンプルであってもよい。また、この方法において、細胞のサンプルは、菌類標的によりもしくはそれに基づく適した抗原決定基により適切に免疫化された哺乳動物に由来するまたはその抗原性の一部、断片、領域、ドメイン、ループ、もしくは他のエピトープなどのようにそれに由来してもよい。ある特定の実施形態では、抗原決定基が、細胞外の一部、領域、ドメイン、ループ、または他の細胞外エピトープであってもよい。
他の実施形態では、スフィンゴ脂質標的に向けられる重鎖可変ドメイン配列を生成するための方法が、
ａ）重鎖可変ドメインアミノ酸配列をコードする核酸配列のセット、収集物、またはライブラリーを提供するステップ、
ｂ）スフィンゴ脂質標的に結合することができるおよび／またはそれに対する親和性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列について核酸配列の前記セット、収集物、またはライブラリーをスクリーニングするステップならびに
ｃ）前記核酸配列を単離し、その後、前記アミノ酸配列を発現させるステップを少なくとも含んでいてもよい。
アミノ酸配列をコードする核酸配列の上記の方法、セット、収集物、またはライブラリーは、たとえば、免疫グロブリン断片配列の未処理のセット、収集物、もしくはライブラリーをコードする核酸配列のセット、収集物、もしくはライブラリー；免疫グロブリン断片配列の合成もしくは半合成セット、収集物、もしくはライブラリーをコードする核酸配列のセット、収集物、もしくはライブラリー；ならびに／または親和性成熟にかけられた免疫グロブリン断片配列のセット、収集物、もしくはライブラリーをコードする核酸配列のセット、収集物、もしくはライブラリーであってもよい。
特に、そのような方法において、核酸配列のセット、収集物、またはライブラリーは、ＶＨＨのセット、収集物、またはライブラリーをコードする。たとえば、核酸配列のセット、収集物、またはライブラリーは、ドメイン抗体もしくは単一ドメイン抗体のセット、収集物、もしくはライブラリーまたはドメイン抗体もしくは単一ドメイン抗体として機能することができるアミノ酸配列のセット、収集物、もしくはライブラリーをコードしてもよい。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列のセット、収集物、またはライブラリーが、ＶＨＨ配列のセット、収集物、またはライブラリーをコードする。
上記の方法では、ヌクレオチド配列のセット、収集物、またはライブラリーは、スクリーニングを容易にするなどのために、ファージ、ファージミド、リボソーム、または適した微生物（酵母など）上に表されてもよい。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（のセット、収集物、またはライブラリー）を表し、スクリーニングするための適した方法、技術、および宿主生物体は、たとえば本明細書におけるさらなる開示に基づいて当業者に明らかになるであろう。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，９，１１０５−１１１６（２００５）による概説もまた参照される。
本発明はまた、上記の方法によってまたはその代わりに上記の方法のうちの１つならびにそのうえ、少なくとも、前記免疫グロブリン配列のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列を決定するステップおよび適した宿主細胞もしくは宿主生物体における発現または化学合成によってなどのように、それ自体知られている方法で前記アミノ酸配列を発現させるまたは合成するステップを含む方法によって入手可能なまたは得られるアミノ酸配列にも関する。
ある場合には、本明細書において想定される菌類標的に特異的に結合するアミノ酸配列を産生するための方法は、スフィンゴ脂質標的に対する検出可能な結合親和性またはスフィンゴ脂質標的に対する検出可能なインビトロにおける効果を有する少なくとも１つの重鎖可変ドメインをアミノ酸配列ライブラリーから単離するステップをさらに含んでいてもよい。
これらの方法は、スフィンゴ脂質標的に対する検出可能な結合親和性またはスフィンゴ脂質標的の活性に対する検出可能なインビトロにおける効果を有する少なくとも１つの重鎖可変ドメインをコードする配列を増幅するステップをさらに含む。たとえば、本明細書において記載される方法の選択ステップから得られる特定のアミノ酸配列を表すファージクローンは、宿主細菌の再感染および成長培地におけるインキュベーションによって増幅されてもよい。
特定の実施形態では、これらの方法が、スフィンゴ脂質標的に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸配列の配列を決定するステップを包含してもよい。
アミノ酸配列のセット、収集物、またはライブラリーに含まれる重鎖可変ドメイン配列が、適した細胞またはファージまたは粒子上に表される場合、前記細胞またはファージまたは粒子からそのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を単離することができる。このように、選択されるアミノ酸配列ライブラリーメンバーのヌクレオチド配列は、ルーチン的な配列決定法によって決定することができる。
さらに特定の実施形態では、本明細書において想定される重鎖可変ドメインを産生するための方法が、実際の所望されるアミノ酸配列を得るために、適した条件下で宿主生物体において前記ヌクレオチド配列を発現させるステップを含む。このステップは、当業者に知られている方法によって実行することができる。
そのうえ、スフィンゴ脂質標的に対する検出可能な結合親和性またはスフィンゴ脂質標的の活性に対する検出可能なインビトロにおける効果を有する得られた重鎖可変ドメイン配列は、任意選択によりそれらの配列が同定された後に、可溶性タンパク質構築物として合成されてもよい。
たとえば、上記の方法によって得られる、入手可能な、または選択される重鎖可変ドメイン配列は、当技術分野において知られている組換え方法または化学合成方法を使用して合成することができる。また、上記の方法によって得られる、入手可能な、または選択されるアミノ酸配列は、遺伝子工学技術によって産生することができる。したがって、上記の方法によって得られる、入手可能な、または選択される重鎖可変ドメイン配列を合成するための方法は、スフィンゴ脂質標的に対する検出可能な結合親和性またはスフィンゴ脂質標的の活性に対する検出可能なインビトロにおける効果を有するアミノ酸配列をコードする核酸またはベクターにより宿主細胞を形質転換するまたは感染させるステップを含んでいてもよい。したがって、スフィンゴ脂質標的に対する検出可能な結合親和性またはスフィンゴ脂質標的の活性に対する検出可能なインビトロにおける効果を有するアミノ酸配列は、組換えＤＮＡ方法によって作製することができる。アミノ酸配列をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して、容易に合成することができる。一旦調製されたら、ＤＮＡは、発現ベクターの中に導入することができ、次いで、組換え宿主細胞および／またはこれらの組換え宿主細胞が存在する培地においてアミノ酸配列の発現を得るために、これを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または任意の適した発現系などのような宿主細胞の中に形質転換するまたはトランスフェクトすることができる。
タンパク質発現および精製について当業者によって知られているように、適した発現系を使用して発現ベクターから産生される本明細書において教示されるＶＨＨは、精製を容易にするためにたとえばＨｉｓタグまたは他の配列タグによりタグをつけられてもよい（典型的にアミノ酸配列のＮ−末端またはＣ−末端で）ことが理解されたい。
宿主細胞への核酸またはベクターの形質転換またはトランスフェクションは、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性のトランスフェクション、ポリブレン媒介性のトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、および遺伝子銃を含む、当業者に知られている様々な手段によって達成されてもよい。
所望の重鎖可変ドメイン配列の発現のための適した宿主細胞は、インビトロに位置するか、インビボに位置するかに関わらず、任意の真核または原核細胞（たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのような細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥の細胞、両生動物の細胞、植物細胞、魚の細胞、および昆虫細胞）であってもよい。たとえば、宿主細胞は、トランスジェニック植物中に位置してもよい。
したがって、本出願はまた、スフィンゴ脂質標的に対する検出可能な結合親和性またはスフィンゴ脂質標的の活性に対する検出可能なインビトロにおける効果を有する重鎖可変ドメイン配列の産生のための方法であって、そのようなアミノ酸配列をコードし、核酸配列またはベクターにより宿主細胞を形質転換し、トランスフェクトし、または感染させ、適した条件下でアミノ酸配列を発現させるステップを含む方法をも提供する。
これらの方法の他の特定の実施形態では、植物病原体のスフィンゴ脂質に特異的に結合する少なくとも１つの重鎖可変ドメインまたはその機能的断片を得るステップが、
ａ）ＶＨＨまたはその機能的変異体のセット、収集物、またはライブラリーを提供するステップ、
ｂ）植物病原体のスフィンゴ脂質に特異的に結合するおよび／またはそれに対する親和性を有する配列についてＶＨＨまたはその機能的変異体の前記セット、収集物、またはライブラリーをスクリーニングするステップ、ならびに任意選択により
ｃ）植物病原体のスフィンゴ脂質に特異的に結合するおよび／またはそれに対する親和性を有するＶＨＨまたはその機能的変異体を単離するステップを含む。
以下の非限定的な実施例は、本発明に従う方法および手段を記載する。実施例において特に指定のない限り、技術はすべて、当技術分野において標準的なプロトコールに従って実行される。以下の例は、本発明の実施形態を示すために含まれる。当業者らは、本開示を考慮して、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、多くの変更が、開示される特定の実施形態においてなされ、同様のまたは類似する結果をなお得ることができることを十分に理解するはずである。より詳細には、化学的および生理学的の両方で関連するある作用物質が、本明細書において記載される作用物質と置換されてもよく、同じまたは同様の結果が、実現されるであろうということは明らかであろう。当業者らに明らかなすべてのそのような同様の置換および修飾は、添付の請求項によって定義されるように、本発明の精神、範囲、および概念の範囲内にあると考えられる。
したがって、図、配列表、および実験の部／実施例は、本発明をさらに例証するためにのみ示され、本明細書においてその他に明示的に示されない限り、本発明および／または添付の請求項の範囲を限定するようには決して判断されるべきではないまたは解釈されるべきではない。
上記の開示を、以下の非限定的な実施例によってここでさらに記載する。
実施例１
菌類グルコシルセラミドに対して親和性を有するペプチドをコードする核酸配列の単離
動物の免疫：ＶＨＨは、菌類グルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）で免疫化したラマから生成した。ラマは、タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）精製（９９％）グルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）の６回の追加免疫（ｂｏｏｓｔ）により標準的なプロトコールに従って免疫化した（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）。精製ＧｌｃＣｅｒは、水：メタノール：クロロホルム混合物中で溶解し、ＴＬＣシリカガラスプレート上にスポットした。ＧｌｃＣｅｒを吸着したシリカをプレートから削り取り、リン酸バッファー中で懸濁した。懸濁液を超音波処理し、フロインド不完全フジュバントと混合し、皮下注射に使用した。ＶＨＨはまた、天然の発芽した菌類または卵菌の胞子により免疫化したラマからも生成した。ラマは、皮下注射によって、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）またはフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）の天然の発芽胞子の６回の追加免疫により標準的なプロトコールに従って免疫化した。ラマはすべて、免疫プロセスの全体にわたって健康なままであり、血液サンプルは免疫の前および後に得た。
ライブラリー構築：抗体のファージライブラリーは、それぞれの個々のファージがキメラｐＩＩＩタンパク質の一部としてその表面上に特有の抗原結合抗体ドメインを現すファージ集団である。末梢血単核細胞は、メーカーの説明書に従ってＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを使用し、免疫化したラマの血液サンプルから調製した。全ＲＮＡは、これらの細胞から抽出し、ＶＨＨコード遺伝子断片を増幅するためにＲＴ−ＰＣＲの出発物質として使用した。これらの断片は、ファージミドベクターｐＡＳＦ２０の中にクローニングした。ｐＡＳＦ２０は、単鎖産生のための、ｌａｃＺプロモーター、合成リーダー配列、マルチプルクローニングサイト、大腸菌ファージｐＩＩＩタンパク質コード配列、アンピシリンに対する抵抗性遺伝子、およびＭ１３ファージ開始点を含有するｐＵＣ１１９に由来する発現ベクターである。ＶＨＨコード配列とインフレームで、ベクターは、Ｃ−末端（Ｈｉｓ）６ペプチドタグおよびｃ−ｍｙｃペプチドタグをコードする。ファージは、標準的な方法に従って調製した（Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｂｒｉａｎ Ｋ．Ｋａｙ，Ｊｉｌｌ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｄｒ．Ｊｏｈｎ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）。それぞれ１Ｅ＋０８以上のクローン多様性を有する４つのライブラリーを得、ファージを産生し、抗体多様性の現れを確かめた。
ファージディスプレーによるＶＨＨ選択：特定の抗原に対して特異的な抗原結合抗体ドメインを発現するファージを、抗原への結合についてライブラリー中のファージを選択することによって単離した。菌類ＧｌｃＣｅｒは、様々な濃度で水：メタノール：クロロホルム混合物またはメタノール中に菌類ＧｌｃＣｅｒを溶解し、マルチウェルプレートのウェルに、溶解した菌類ＧｌｃＣｅｒを追加し、室温で一晩乾燥させることによって、ポリスチレンＭａｘｉｓｏｒｐマルチウェルプレート上に固定した。ファージディスプレーによるＶＨＨ選択の調製において、コーティング菌類ＧｌｃＣｅｒを有するウェルを洗浄し、１％魚ゼラチンにより遮断した。ＶＨＨライブラリーファージは、菌類ＧｌｃＣｅｒによりコーティングした９６ウェルプレートのウェルに室温で２時間結合させた。菌類ＧｌｃＣｅｒへのファージ結合を特異的に選択するために、ファージは、１％魚ゼラチンおよび／またはＢＳＡおよび／またはスキムミルクおよび／または植物ＧｌｃＣｅｒおよび／または哺乳動物ＧｌｃＣｅｒと共にあらかじめインキュベートした。結合していないファージは、徹底的な洗浄によって除去し、結合したファージは、ＲｓＡＦＰ２による（Ｏｓｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）またはトリプシンによる競合的な溶出によって溶出した。１〜３回の選択を連続して実行し、菌類ＧｌｃＣｅｒコーティングウェル由来のファージの力価を、それぞれ集積および特異性について、ブランクウェルおよび非標的病原体スフィンゴ脂質由来のファージの力価と比較した。集積は、最初のおよび続く回の選択で観察され、１回または複数回の選択の後のファージ集団は、ＥＬＩＳＡにおいて菌類ＧｌｃＣｅｒに対する特異性を既に示した（図示せず）。個々のクローンは、配列分析および主要な結合アッセイによるさらなる特徴付けのために、第１、第２、および／または第３回の選択から採集した。
配列アッセイおよび結合アッセイによるＶＨＨ特徴付け：得られた抗体または抗体ドメイン集団の多様性は、ハイスループットＤＮＡシークエンシングを使用して速やかに決定することができ、クローン多様性の正確な定量化を可能にする。抗体または抗体ドメインの結合および抗原に結合する特異性は、その抗原への結合についてのアッセイにおいて分析することができ、関係するおよび無関係なコントロールと比較することができる。それぞれの抗体または抗体ドメインは、特異的な抗原および場合によりその抗原の抗原性の変異体に結合することができる。特異性は、抗体または抗体ドメインの結合が抗原性の変異体を区別する程度である。第１、第２、または第３回のファージディスプレー選択から採集された個々のＶＨＨクローンから、ＤＮＡをコロニーＰＣＲにおいて増幅し、ＰＣＲ産物をサンガーシークエンシングによってシークエンシングした。配列分析の後に、また配列多様性に基づいて、ＶＨＨをさらなる特徴付けのために選択した。種特異性をチェックするために、標的種および非標的種由来の菌類および非菌類ＧｌｃＣｅｒを結合アッセイにおいて使用した。どのクローンがライブラリーから機能的に選択されるかを同定する主要な結合アッセイを、ＴＬＣ精製（９９％）ＧｌｃＣｅｒまたはＡ．ブラシシコラ（Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ）、灰色かび病菌（Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ）、Ｃ．ベティコラ（Ｃ．ｂｅｔｉｃｏｌａ）、Ｆ．カルモラム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、Ｆ．グラミネラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、Ｆ．オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、Ｐ．シトリノピレアタス（Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）、Ｐ．ディジタタム（Ｐ．ｄｉｇｉｔａｔｕｍ）、Ｐ．エクスパンサム（Ｐ．ｅｘｐａｎｓｕｍ）、もしくはＶ．ダリア（Ｖ．ｄａｈｌｉａ）由来のＧｌｃＣｅｒが豊富なスフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）画分により実行した。（Ｔｅｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１ ＪＢＣ ２８６：１１４０１−１４において記載されるように調製した）。ダイズ由来のＧｌｃＣｅｒおよびブタＧｌｃＣｅｒは、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから購入した。ＶＨＨを９６ウェルディープウェルプレート中で生成し、希釈粗ＶＨＨ含有周辺質抽出物の結合プロファイルをＥＬＩＳＡ方式で判断した。同じ方法で、結合アッセイを精製ＶＨＨにより実行した。
主要な結合アッセイから、１３０ ＶＨＨ含有周辺質抽出物は、無関係なＶＨＨ＿Ａ、無関係なＶＨＨ＿Ｂ、およびブランクよりも高度なＯＤ４０５ｎｍ値で菌類ＧｌｃＣｅｒに結合することを示した。これらの菌類ＧｌｃＣｅｒ結合ＶＨＨのいくつかの特異的な結合を実証するＯＤ４０５ｎｍ値を図１に示す。配列分析は、抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨの同定されたセットから８４の特有の配列を明らかにした。
示差的な結合スクリーニングによるさらなる特徴付け：さらなる特徴付けのために、上述のリードパネルに属するＶＨＨを、標準的な手順に従って培養フラスコ中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において産生した。ヘキサヒスチジンのタグをつけたＶＨＨは、メーカーの説明書に従って、ＴＡＬＯＮ金属親和性樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により周辺質抽出物から精製した。精製したＶＨＨを濃縮し、ＰＢＳに対して透析した。ＶＨＨはまた、固定ニッケルＩＭＡＣおよび脱塩カラムの組み合わせを使用し、自動化精製システムを使用して精製した。主要な結合アッセイにおいて陽性と記録されたリードパネルのＶＨＨは、様々な菌類植物病原性物質由来のＧｌｃＣｅｒまたは細胞壁画分に対するそれらの特異性について続いて試験した。
図２、３Ａ、３Ｂ、および３Ｃにおいて実証されるように、ＧｌｃＣｅｒ特異的ＶＨＨは、菌類ＧｌｃＣｅｒ（タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ））に対して特異的な結合を示したが、他の非菌類ＧｌｃＣｅｒにもブランク非コーティングウェルにも特異的な結合を示さなかった。
表面プラズモン共鳴法：菌類ＧｌｃＣｅｒへのＶＨＨの結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００機器において表面プラズモン共鳴法によって特徴づけた。抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ ４１Ｄ０１または無関係なＶＨＨ＿Ａは、１０００応答単位の増加に到達するまで、アミンカップリングを介してＣＭ５センサーチップ表面に共有結合させた。残りの反応基は、不活性化した。Ｓａｌｉｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３ ＰＮＡＳ １１０，Ｅ４７５３−Ｅ４７６１に従って調製した溶液中の一連の濃度のフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＧｌｃＣｅｒを、３０μｌ／分の流速で２分間注射し、チップに結合したＶＨＨに結合させた。ＧｌｃＣｅｒなしのランニングバッファーを同じ流速でチップ上に注射し、１０分間、結合した菌類ＧｌｃＣｅｒを自然に解離させた。Ｋｏｆｆ値は、１：１ラングミュア解離グローバルフィッティングモデルにより、様々な菌類ＧｌｃＣｅｒ濃度について得たセンサーグラムから計算した。
抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨについては、４．８６＊１Ｅ−４／秒の遅いｏｆｆ速度が計算された。図４に示されるように、無関係なＶＨＨは、菌類ＧｌｃＣｅｒに結合しなかった。
溶液中の植物（大豆）、哺乳動物（豚肉）、および菌類（フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ））ＧｌｃＣｅｒを、３０μｌ／分の流速で２分間連続して注射し、チップに結合したＶＨＨ（抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ ４１Ｄ０１または無関係なＶＨＨ＿Ａ）に結合させた。ＧｌｃＣｅｒなしのランニングバッファーを各注射の間に同じ流速でチップ上に注射し、結合したＧｌｃＣｅｒを自然に解離させた。
抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ ４１Ｄ０１または無関係なＶＨＨ＿Ａへの植物または哺乳動物ＧｌｃＣｅｒ結合は観察されなかった。菌類ＧｌｃＣｅｒの特異的な結合は、抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ ４１Ｄ０１について観察されたが、無関係なＶＨＨ＿Ａについては観察されなかった。
様々な菌類脂質抽出物への示差的な結合：無関係な化合物と比較した様々な菌類脂質抽出物への抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ組成物の結合。
菌類抽出物は、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６８（１２）：７０４９−６０に従って調製した。手短かに言えば、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）Ｂ０５−１０、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）ＭＵＣＬ４０１、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）Ｒ１６、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）（所有する西洋ナシ分離株）、フザリウム・カルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）ＭＵＣＬ５５５、フザリウム・グラミネラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）ＭＵＣＬ５３４５１、ミドリカビ病菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｉｇｉｔａｔｕｍ）ＭＵＣＬ４３−４１０、ミドリカビ病菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｉｇｉｔａｔｕｍ）（所有するレモン分離株）、またはペニシリウム・エクスパンサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｅｘｐａｎｓｕｍ）ＣＢＳ １４６．４５由来の菌糸体を、菌類から収穫し、寒天プレートにおいて増殖させ、脂質を、クロロホルム／メタノール２：１（体積／体積）および１：２（体積／体積）により抽出し、粗脂質抽出物をＦｏｌｃｈ ｅｔ ａｌ．１９５７．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２６（１）：４９７−５０９に従って分配した。菌類脂質抽出物はフォルチの下層から回収した。抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ ４１Ｄ０１（０．１μｇ／ｍｌ）および抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ ５６Ｆ１１（１μｇ／ｍｌ）の結合は、抽出菌類脂質（それぞれ１／２０希釈液中）、精製フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＧｌｃＣｅｒ、精製タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）ＧｌｃＣｅｒ、および無関係な化合物：リンゴペクチン（高エステル化リンゴペクチン７０〜７５％、Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃：７６２８２）、柑橘類のペクチン（低エステル化柑橘類ペクチン２０〜３４％、Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃Ｐ９３１１）、もしくはジャガイモレクチン（ソラヌム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ Ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）レクチン、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ、ｃａｔ＃：Ｌ−１１６０）またはブランク非コーティングウェルによりコーティングしたウェルに対して評価した。結合は、酵素コンジュゲート検出抗体との連続するインキュベーション、基質の追加、および４０５ｎｍでの吸光度の測定の後に測定した。バーは、平均ＯＤ ４０５ｎｍの値を示し、エラーバーは、ｎ＝２の平均値の標準誤差を示す。
図５中に示されるように、抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ ４１Ｄ０１および５６Ｆ１１は、試験した菌類脂質抽出物をすべて特異的に認識した。抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ ４１Ｄ０１および５６Ｆ１１は、無関係なコーティング化合物または非コーティングウェルへの結合を示さなかった。多くの菌類脂質抽出物への抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ組成物の結合は、様々な菌類に対する本明細書において開示される抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ組成物についての様々な適用を有力にする。
様々な水性組成物中の菌類ＧｌｃＣｅｒへの抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨの結合：
抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ ４１Ｄ０１および／またはプロテアーゼ阻害剤および／または非イオン性界面活性剤および／または保存剤を含有する水性組成物を調製した。組成物Ａ１（プロテアーゼ阻害剤：０．０６μｇ／ｍｌアプロチニン（Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ＃：１０２３６６２４００１）、０．５μｇ／ｍｌロイペプチン（Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ＃：１１０１７１０１００１）、２４μｇ／ｍｌ ４−ベンゼンスルホニルフルオリドヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ、Ａ８４５６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｃａｒｌ−Ｒｏｔｈ、ｃａｔ＃８０４０．１）、および非イオン性界面活性剤：０．００００１％ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃Ｐ２２８７）；組成物Ａ２（プロテアーゼ阻害剤：１μｇ／ｍｌアプロチニン、２．５μｇ／ｍｌロイペプチン、１００μｇ／ｍｌ ４−ベンゼンスルホニルフルオリドヒドロクロリド、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および非イオン性界面活性剤：０．０５％ポリソルベート２０）；組成物Ａ３（プロテアーゼ阻害剤：２μｇ／ｍｌアプロチニン、５μｇ／ｍｌロイペプチン、２４０μｇ／ｍｌ ４−ベンゼンスルホニルフルオリドヒドロクロリド、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および非イオン性界面活性剤：５％ポリソルベート２０）、組成物Ｂ１（非イオン性界面活性剤：０．０００１％％ポリソルベート２０）、組成物Ｂ２（非イオン性界面活性剤：０．０５％ポリソルベート２０）、組成物Ｂ３（非イオン性界面活性剤：５％ポリソルベート２０）、および組成物Ｃ１（保存剤：０．０５％安息香酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃ Ｂ３４２０））。様々な水性組成物中の菌類ＧｌｃＣｅｒへの抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ（０．１μｇ／ｍｌ）の結合を、Ｆ．オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来のコーティングＧｌｃＣｅｒでＥＬＩＳＡにおいて試験し、ブランク非コーティングウェルと比較した。結合は、酵素コンジュゲート検出抗体との連続するインキュベーション、基質の追加、および４０５ｎｍでの吸光度の測定の後に測定した。
図６において、様々な組成物中のＧｌｃＣｅｒ特異的ＶＨＨ ４１Ｄ０１の値を、他の添加剤がない溶液中の４１Ｄ０１と比較した。ＧｌｃＣｅｒ特異的ＶＨＨ ４１Ｄ０１がすべての試験した組成物中の菌類ＧｌｃＣｅｒに特異的に結合することができたことが図６において示される。
実施例２
本発明の実施形態に従うトランスジェニック植物の生成
シロイヌナズナは、植物病原性菌類のスフィンゴ脂質に特異的に結合するＶＨＨをコードするポリヌクレオチドの発現のために様々なベクターにより形質転換した。ポリヌクレオチドは、図７に概略的に示されるように、分泌のための（たとえば２Ｓ２）、細胞質への局在化のための（たとえば開始コドン）、または小胞体への配置のための（たとえばＫＤＥＬ）標的シグナルをコードする少なくとも１つの配列を含む。トランスジェニックシロイヌナズナ植物は、様々な植物病原性菌類でバイオアッセイにおいて分析する。
ＶＨＨ ４１Ｄ０１をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物を作製した。さらに、ＶＨＨ ５６Ｆ１１をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物を作製した。ＶＨＨ ４１Ｄ０１およびＶＨＨ ５６Ｆ１１をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３３６および配列番号３３７によってそれぞれ示される。
ＶＨＨ ４１Ｄ０１および５６Ｆ１１をコードするポリヌクレオチドのそれぞれならびに様々なタグ配列、シグナル配列、スペーサー配列、ヒンジ配列、および／またはＦｃ配列をコードするポリヌクレオチドを含む様々なキメラ構築物を作製した。これらの様々なキメラ構築物を表４に列挙する。
Figure 2017536134
表５は、様々なキメラ構築物を生成するために使用される様々なタグ、シグナル配列、スペーサー、ヒンジ領域、またはＦｃのタンパク質配列を列挙する。
Figure 2017536134
表４のキメラ構築物は、ｐＫ７ＷＧ２デスティネーションベクター中の３５Ｓ ＣａＭＶプロモーター（配列番号３５４）の転写コントロール下に置いた（さらに下記を参照）。
エントリーベクターの生成
表６に列挙されるベクターは、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）遺伝子合成（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に注文した。
Figure 2017536134
これらの配列のＰＣＲ増幅は、制限部位（ＥｃｏＲＩ＋ＢａｍＨＩ）を導入するために特異的なプライマー（ｐＭＡ＿ＦＷおよびｐＭＡ＿ＲＥＶ）を使用して行った。プライマーの第２のセット（ｐＣＹＴＯ＿ＦＷおよびｐＭＡ＿ＲＥＶ）は、細胞質内標的シグナルを導入するために使用した。このために、配列４および８を鋳型として使用した。ｐＭＡ＿ＦＷ、ｐＭＡ＿ＲＥＶ、およびｐＣＹＴＯ＿ＦＷの配列を表７に列挙する。
Figure 2017536134
制限消化を、増幅した断片およびエントリーベクターＥ−ＩｇＧ３−ＧｍＲの両方に対して実行した。このベクターは、さらに下流のＧａｔｅｗａｙに適合するクローニングのためにＡｔｔＬ１部位およびＡｔｔＬ２部位を導入する。消化配列断片およびベクター断片を精製した（配列断片には精製キットおよびベクター断片にはインゲル精製を使用して）。
消化配列断片を、消化Ｅ−ＩｇＧ３−ＧｍＲベクターの中にライゲーションした。
次に、得られたエントリークローン（合計１０：２×ＶＨＨ−ＫＤＥＬ、２×ｓｅｃ−ＶＨＨ、２×ｓｅｃ−ｂｉＶＨＨ、２×ｓｅｃ−ＶＨＨ−Ｆｃ、および２×ｃｙｔｏ−ＶＨＨ）をＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の形質転換のために使用した。
エントリークローンごとに、１０のコロニーをコロニーＰＣＲを介してチェックした。各構築物のうち、４つまでのポジティブクローンを単一のコロニーについてスクリーニングするために再び平板培養し、次に、コロニーＰＣＲは、ハイフィデリティーポリメラーゼを使用して、生成された単一のコロニーに対して実行した（Ｐｈｕｓｉｏｎ ＰＣＲ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。
このＰｈｕｓｉｏｎ ＰＣＲから結果として生じるＰＣＲ産物（合計３５）を、配列分析のためにＬＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓに送った。
発現ベクターの生成
シークエンシングのために送ったすべての３５のエントリーベクター（合計１０の異なるエントリーベクター構築物に相当）について最初に続きを行った。ＤＮＡをそれぞれの構築物から精製し、ｐＫ７ＷＧ２デスティネーションベクターへのＬＲ反応（Ｇａｔｅｗａｙクローニング）のために使用した（Ｐｌａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｋａｒｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｇａｔｅｗａｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ”．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．２００２ Ｍａｙ；７（５）：１９３−１９５）；配列番号３５８。
得られた発現クローンは、ＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の形質転換のために使用した。
３５のエントリークローンから得られたシークエンシング結果に基づいて、１０の様々なエントリーベクター構築物のそれぞれのポジティブな候補を選択した。
発現クローンごとに、２つのコロニーをコロニーＰＣＲを介してチェックした。発現クローン当たり１つのポジティブなクローンから、プラスミドを調製し、配列分析のために送った（ＶＩＢ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｅｒｖｉｃｅ ｆａｃｉｌｉｔｙ）。
１０のエントリークローンのそれぞれおよび１０の発現クローンのそれぞれを含有するＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のグリセロールバンク（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｂａｎｋ）を確立した（合計２０のエントリー）。１０の発現ベクターを表８に列挙する。
Figure 2017536134
アグロバクテリウムおよびシロイヌナズナ形質転換に向けた発現ベクターの形質転換
１０の発現構築物のそれぞれ（配列番号３５９〜３６８）を、アグロバクテリウム株Ｃ５８Ｃ１ ＲｉｆＲ（ｐＭＰ９０）に形質転換した；（Ｋｏｎｃｚ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌ（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４，３８３−３９６）。コロニーは、コロニーＰＣＲを介して発現ベクターの存在についてチェックした。１０の発現構築物のそれぞれについて、ポジティブな株を同定した。
これらのポジティブな株から、グリセロールバンクを確立した。
同じポジティブな株を、フローラルディッピングを使用するシロイヌナズナＣｏｌ−０ ＷＴ植物の形質転換のために使用した。構築物当たり５つの植物をディップした。フローラルディップ形質転換プロトコールは、Ｃｌｏｕｇｈ ＳＪ，Ｂｅｎｔ ＡＦ（１９９８）Ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ：ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ．Ｐｌａｎｔ Ｊ １６：７３５−７４３において記載される。
シロイヌナズナのフローラルディップ形質転換により６週間後にＴ１種子が生成された。構築物当たり、３００〜４００ｍｇのＴ１種子を得た。
Ｔ１種子は、漂白剤およびエタノールによって滅菌し、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）、ナイスタチン（５０ｍｇ／Ｌ）、およびバンコマイシン（７５０ｍｇ／Ｌ）を補ったＫ１培地に播いた。７ｍｌの０．１％アガロースと共に播いた後、プレートは、４℃で４晩、最初にインキュベートし、次いで、グロースチャンバーに移した。それぞれの構築物について、３０のカナマイシン抵抗性のＴ１植物を土に移し、さらに種子を付けさせた。
ＶＨＨ発現分析
Ｔ１植物−ＶＨＨ発現の確認：
ウェスタンブロッティングによるＴ１植物から単離された葉におけるＶＨＨ発現分析（タンパク質レベル）
それぞれの構築物について（合計１０）、ＶＨＨタンパク質発現分析を３０のＴ１植物に対して実行した。それぞれのＴ１植物から、２枚の葉をカットし、２ｍｌエッペンドルフ中に収穫し、液体窒素中で冷却し、２つのスチール４ｍｍボールにより２０Ｈｚで２分間砕いた。粉末は、１００μｌ抽出バッファー（２０ｍＭ Ｐｉ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．８、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤）中で溶解し、遠心分離して（１０分間、最高速度、４℃）、細胞片を遠心沈殿させた。上清は、新たなエッペンドルフに移し、再び遠心分離した（１０分間、最高速度、４℃）。９０μｌの最終的な上清を取っておき、２２．５μｌのグリセロールを追加し、抽出物を−２０℃で保存した。それぞれの抽出物の総タンパク質含有量をＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって決定した。総タンパク質濃度は、０．５〜４ｍｇ／ｍｌの範囲にわたった。
タンパク質抽出物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％ＴＧＸゲル；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、その後ウェスタンブロッティング（ＷＢ）によって分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために、それぞれの抽出物の総タンパク質含有量の１０μｇに相当する容量をゲルにロードした。ＷＢ検出は、２ステップで実行した：一次抗体は、マウス抗Ｈｉｓ（Ｓｅｒｏｔｅｃ；１／１０００希釈）とした。二次抗体は、２つの抗体の混合物を含んだ：ヒツジ抗−ｍＩｇＧ−ＨＲＰ（ＧＥ；１／５０００希釈）および抗ＩｇＧ１ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ；１／１０００希釈）。Ｆｃ断片を含有する構築物については、検出は、ヤギ抗マウスＩｇＧ３−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ；１／５０００希釈）を使用して、シングルステップで実行した。ＶＨＨ構築物の適切なサイズに一致したバンドが現われたすべてのイベントは、ＶＨＨ構築物が発現されたイベントと考えられた。
ＷＢ分析から、発現がＦｃ断片に融合されたＶＨＨについて最も高度であったことが明らかになった。構築物ｓｅｃ＿４１Ｄ０１＿ヒンジ＿Ｆｃ＿ＨＩＳおよびｓｅｃ＿５６Ｆ１１＿ヒンジ＿Ｆｃ＿ＨＩＳによる分析を継続することを決定した。
ＷＢでＶＨＨの発現を示したＴ１植物は、さらに種子を付けさせ、Ｔ２種子を分離比分析のために収穫した。
Ｔ２植物−分離比分析
Ｔ２種子は、漂白剤およびエタノールによって滅菌し、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）、ナイスタチン（５０ｍｇ／Ｌ）、およびバンコマイシン（７５０ｍｇ／Ｌ）を補ったＫ１培地に播いた。７ｍｌの０．１％アガロースと共に播いた後、プレートは、４℃で４晩、最初にインキュベートし、次いで、グロースチャンバーに移した。ゲノム中の単一の遺伝子座に発現構築物を含有する系統を同定するために、プレートを、カナマイシン感受性対抵抗性の実生の数の比について記録し、この比が１：３から逸脱したプレートは、廃棄した。最も高度なＶＨＨ発現を示した単一コピー系統について、１０の植物を土に移し、さらに種子を付けさせた。Ｔ３種子は、接合性分析のために収穫した。
Ｔ３植物−接合性分析
Ｔ３種子は、漂白剤およびエタノールによって滅菌し、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）、ナイスタチン（５０ｍｇ／Ｌ）、およびバンコマイシン（７５０ｍｇ／Ｌ）を補ったＫ１培地に播いた。７ｍｌの０．１％アガロースと共に播いた後、プレートは、４℃で４晩、最初にインキュベートし、次いで、グロースチャンバーに移した。プレートを、カナマイシン抵抗性の実生の数について記録し、すべての実生が抵抗性だとは限らなかったプレートは、廃棄した。残りのホモ接合性の系統については、植物を種子繁殖のために土に移した。
実施例３
機能的アッセイ
グルコシルセラミド結合アッセイ
ｓｅｃ＿５６Ｆ１１＿ヒンジ＿Ｆｃ＿ＨＩＳを過剰発現するシロイヌナズナのホモ接合性単一コピーイベント由来の葉抽出物を、グルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）の結合についてＥＬＩＳＡにおいて試験した。このために、マルチウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ、μＣｌｅａｒ、ｂｌａｃｋ、ｈａｌｆ ａｒｅａ、ｈｉｇｈ ｂｉｎｄ）のウェルを、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から精製した２５０ｎｇのＧｌｃＣｅｒ（５０μｌの５μｇ／ｍｌ溶液）によりコーティングした。コーティングの後、プレートは１時間ＰＢＳ中で１％ゼラチンにより遮断した。遮断剤を除去し、プレートを１時間、５０μｌの（希釈）葉抽出物と共にインキュベートした。次に、プレートをＰＢＳで３回洗浄する。プレートを１時間、マウス抗Ｈｉｓ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）と共にインキュベートする。プレートをＰＢＳで３回洗浄した後に、プレートを１時間、抗マウスＩｇＧ／アルカリホスファターゼ抗体（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。ＰＢＳで３回を洗浄した後に、プレートは、各ウェル中にＥＬＩＳＡバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１００ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＭｇＣｌ；ｐＨ９，５；２ｍｇ／ｍｌ ＰＮＰＰ ＥＬＩＳＡ基質（Ｓｉｇｍａ）を含有する）を追加することによって現像した。５分後、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。コントロールとして、非コーティングウェルを使用した。図８は、菌類ＧｌｃＣｅｒへの葉抽出物中のｓｅｃ＿５６Ｆ１１＿ヒンジ＿Ｆｃ＿ＨＩＳの特異的な結合を示す。
灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）感染アッセイ
シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）野生型（Ｃｏｌ−０）ならびにｓｅｃ＿４１Ｄ０１＿ヒンジ＿Ｆｃ＿ＨＩＳおよびｓｅｃ＿５６Ｆ１１＿ヒンジ＿Ｆｃ＿ＨＩＳを過剰発現する植物は、２１℃、湿度７５％、およびおよそ１２０μｍｏｌ／ｍ２ｓの光度での１２時間の明暗サイクルのグロースチャンバーにおいて、土（「ＤＣＭ ｐｏｔｇｒｏｎｄ ｖｏｏｒ Ｚａａｉｅｎ ｅｎ Ｓｔｅｋｋｅｎ」、ＤＣＭ、Ｓｉｎｔ−Ｋａｔｅｌｉｊｎｅ−Ｗａｖｅｒ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）中で５週間成長させた。灰色かび病菌（Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ）胞子懸濁液（Ｂ０５．１０、１／２ＰＤＢ中５×１０４／ｍＬ）の５μＬの液滴を植物当たり３枚の葉の上に接種した。植物は、接種後、ほぼ１００％の湿度を保持するために、透明な密封ボックス中で保った。病気の症状は、接種の３、４、および７日後（ｄｐｉ）にネクローシスの損傷の直径を測定することによって記録した。５つのボックスに分けた系統および条件当たり２０の植物を分析した。
図９Ａは、野生型植物と比較して、菌類ＧｌｃＣｅｒに対するＶＨＨを発現する植物において灰色かび病菌（Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ）に対する抵抗性が増加したことを示す。
さらなる感染アッセイは、６つのボックスに分けた系統および条件当たり２４の植物を使用して同一の条件下で実行した。ｓｅｃ＿４１Ｄ０１＿ヒンジ＿Ｆｃ＿ＨＩＳを過剰発現する、第１のバイオアッセイと異なる系統の植物を使用した。図９Ｂは、野生型植物と比較して、菌類ＧｌｃＣｅｒに対するＶＨＨを発現する植物において灰色かび病菌（Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ）に対する抵抗性が増加したことが確認される。
実施例４
抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ含有葉抽出物の抗真菌活性のインビトロにおける評価
抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨを過剰発現するシロイヌナズナのホモ接合性単一コピーイベントから、２枚の葉をカットし、２ｍｌエッペンドルフ中に収穫し、液体窒素中で冷却し、２つのスチール４ｍｍボールにより２０Ｈｚで２分間砕いた。粉末は、１００μｌ抽出バッファー（２０ｍＭ Ｐｉ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．８、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤）中で溶解し、遠心分離して（１０分間、最高速度、４℃）、細胞片を遠心沈殿させる。上清は、新たなエッペンドルフに移し、再び遠心分離する（１０分間、最高速度、４℃）。この最終的な上清を抗真菌バイオアッセイにおいて使用する。
抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ含有葉抽出物の抗真菌活性は、Ｔｈｅｖｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２１（１２）：３６８６−９２；Ｆｒａｎｃｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（４７）：３２６８０−５；Ａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８３（１５）：２５１４３−６において記載されるように、液体培地においておよび寒天プレート上で抗真菌薬アッセイを使用して試験する。阻害作用は、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）およびフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）のインビトロにおける増殖に対して抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ含有葉抽出物について決定する。
水中抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ含有葉抽出物の２倍の希釈液を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で調製する。２０μｌのこれらの希釈液およびコントロールとしての２０μｌの水に、８０μｌの菌類胞子懸濁液（半分の濃度のポテトデキストロースブロス（ＰＤＢ）中１Ｅ＋０５胞子／ｍｌ）を追加する。菌類試験株は、アルタナリア．ブラシシコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ）ＭＵＣＬ２０２９７、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）Ｒ１６、セルコスポラ・ベティコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｂｅｔｉｃｏｌａ）（所有するサトウダイコン分離株）、フザリウム・カルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）ＭＵＣＬ５５５、およびバーティシリウム・ダリアエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）ＭＵＣＬ６９６３とする。試験プレートは、暗中室温で７２時間インキュベートし、試験化合物の抗真菌活性は顕微鏡で記録し、基準の写真に基づいて定量化し、それによって、０または１００のスコアは、それぞれ、菌類増殖なしまたは最大の増殖を指す。全ての試験が、少なくとも１つの複製で行われた。
抗真菌活性アッセイの結果は、抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ含有葉抽出物の希釈の関数で菌類増殖％として表現される増殖阻害パターンの間で明らかな差異を示す。この差異は、試験菌類の種に関係なく明らかである。
結果は、抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ含有葉抽出物の抗真菌効力を示す。さらに、結果は、少なくとも５つの異なる菌類植物病原体への抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ含有葉抽出物の抗真菌活性の広域スペクトルを明らかにし、選択された抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ含有葉抽出物の抗真菌活性のスペクトルが他の植物病原性菌類に広げることができることを示す。
実施例５
菌類感染に対して作物を保護するための抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨを含有する葉抽出物の抗真菌活性の植物体評価
灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）を接種したトマトの葉に対する抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨを含有する葉抽出物の効能：予防的処置。
抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨを過剰発現するシロイヌナズナのホモ接合性単一コピーイベント由来の葉抽出物を、トマトに対する灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）感染アッセイにおいて試験する。灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）Ｂ０５−１０を接種したトマト葉についての病気の重症度に対する抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨを含有する植物抽出物による予防的処置の効果を評価し、水の効果と比較する。
温室で成長させたトマト植物由来の葉を、１０μｌのＶＨＨ含有葉抽出物および水により処置する。適用した組成物の乾燥と同時に、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）胞子懸濁液の１０μｌの液滴（４倍希釈のＰＤＢ中６Ｅ＋０６胞子／ｍｌ）を処置した表面に適用する。処置し、接種した葉は、小植物用プロパゲーターにおいて高度な相対湿度および室温でインキュベートする。病気の重症度は、接種の６日後（ｄｐｉ）に二方向の直径を測定して記録する。
抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ組成物による予防的処置は、水による処置よりも小さな平均損傷直径をもたらす。水による処置と比較して、抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ含有葉抽出物の適用によるトマト葉の予防的処置は、病気の重症度の低下を明らかにもたらす。そのため、抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ含有葉抽出物は、農業の適用において菌類病原体に対して作物を保護するための抗真菌薬化合物として使用される効力を示す。
灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）を接種したトマト葉に対する抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ組成物の効能：治療的処置
灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）Ｂ０５−１０を接種したトマト葉についての病気の重症度に対する抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ含有葉抽出物による治療的処置の効果を評価し、水の効果と比較する。
温室で成長させたトマト植物由来の葉に、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）胞子懸濁液（４倍希釈のＰＤＢ中（６Ｅ＋０６胞子／ｍｌ））の１０μｌの液滴を接種する。接種の１時間後、葉の接種したスポットを、１０μｌのＶＨＨ含有葉抽出物および水により処置する。接種し、処置した葉は、小植物用プロパゲーターにおいて高度な相対湿度および室温でインキュベートする。病気の重症度は、５ｄｐｉに二方向の直径を測定して記録する。
抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ含有葉抽出物による治療的処置は、水による処置よりも小さな平均損傷直径をもたらす。水による処置と比較して、抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ含有葉抽出物の適用によるトマト葉の治療的処置は、病気の重症度の低下を明らかにもたらす。そのため、抗ＧｌｃＣｅｒ ＶＨＨ含有葉抽出物は、農業の適用において菌類病原体に対して作物を保護するための抗真菌薬化合物として使用される効力を示す。

Claims (18)

  1. 菌類のスフィンゴ脂質に、好ましくは菌類のセラミドに、より好ましくは菌類のスフィンゴ糖脂質に、さらにより好ましくは菌類のセレブロシドに、さらにより好ましくは菌類のグルコセレブロシドに特異的に結合する重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）をコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
  2. 前記トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部における前記ポリヌクレオチドの発現が、（ｉ）植物病原性菌類による感染から前記トランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護する、（ｉｉ）前記トランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部における植物病原性菌類の増殖を阻害する、および／または（ｉｉｉ）植物病原性菌類に対する前記トランスジェニック植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の抵抗性を増加させる、請求項１に記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
  3. 前記ポリヌクレオチドが、植物における発現に適したプロモーター、植物組織もしくは植物細胞に特異的なプロモーター、または誘導性のプロモーターを含む、請求項１または２に記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
  4. 前記ポリヌクレオチドが、分泌のための、細胞質への配置のための、または小胞体（ＥＲ）内腔、アポプラスト、液胞、または内膜および／もしくは外膜などのような細胞コンパートメントまたは細胞小器官への配置のための、標的シグナルをコードする少なくとも１つの配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
  5. 前記ポリヌクレオチドが、前記ＶＨＨそれ自体を、１つもしくは複数の同一のもしくは異なるＶＨＨとの組み合わせとして、または結晶化可能領域（Ｆｃ領域）との１つもしくは複数の同一のもしくは異なるＶＨＨの組み合わせとして、任意選択によりスペーサーと共にコードする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
  6. 前記植物が、コーン、イネ、コムギ、オオムギ、ソルガム、キビ、カラスムギ、ライムギ、ライコムギ、または他の穀類、ダイズ、アルファルファ、または他のマメ科作物、サトウダイコン、飼料ビート、パパイア、バナナ、およびプランテン、または他の果実、ブドウ、ナッツ、ナタネ、ヒマワリ、または他の油料作物、カボチャ、キュウリ、メロン、または他のウリ科の植物、ワタまたは他の繊維植物、サトウキビ、ヤシ、ジャトロファ、または他の燃料作物、キャベツ、トマト、コショウ、または他の植物、観賞植物、シラブ、ポプラ、ユーカリ、または他の木、常緑樹、草、コーヒーノキ、チャノキ、タバコ、ホップ、ゴムの木、ならびにラテックス植物から選択される植物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
  7. 前記ポリヌクレオチドが、
    （ｉ）配列番号１〜８４の１つもしくは複数、好ましくは配列番号１、２、および／もしくは７０、より好ましくは配列番号１および／もしくは２、ならびに／または
    （ｉｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域、ここで、（ｉ）前記ＣＤＲ１領域が、配列番号８５〜１６８の群から選択される、および／または、（ｉｉ）前記ＣＤＲ２領域が、配列番号１６９〜２５２の群から選択される、および／または、（ｉｉｉ）前記ＣＤＲ３領域が、配列番号２５３〜３３５の群から選択される、もしくはＣＤＲ３領域が、アミノ酸配列ＮＲＹを有する
    を含むＶＨＨをコードする配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞。
  8. 請求項１〜７のいずれか１つに定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の収穫部分および繁殖材料。
  9. トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の前記収穫部分および繁殖材料が、種子、果実、穀粒、鱗茎、朔果、塊茎、子孫、およびハイブリッドからなる群から選択される、請求項８に記載の収穫部分および繁殖材料。
  10. 植物または植物組織のゲノムの中への請求項１〜７のいずれか１つにおいて定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドの導入を含む、トランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の産生のための方法。
  11. 植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部における植物病原体の増殖を阻害するための、および／または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための方法であって、前記植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において病原体に特異的に結合する重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法。
  12. 植物病原性菌類による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部における植物病原性菌類の増殖を阻害するための、および／または前記植物病原性菌類に対する植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の抵抗性を増加させるための請求項１１に記載の方法であって、植物または植物組織または植物細胞の少なくとも一部において請求項１〜７のいずれか１つにおいて定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法。
  13. 植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部における植物病原体の増殖を阻害するための、および／または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための、病原体に特異的に結合する重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの使用であって、前記ポリヌクレオチドが、前記植物または植物組織の少なくとも一部において発現される使用。
  14. 植物病原性菌類による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部における植物病原性菌類の増殖を阻害するための、および／または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための請求項１３に記載の使用であって、前記ポリヌクレオチドが、請求項１〜７のいずれか１つにおいて定義される使用。
  15. 前記ＶＨＨを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物または植物組織または植物細胞の抽出物。
  16. 請求項１５に記載の抽出物を含む組成物。
  17. 植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部における植物病原体の増殖を阻害するための、および／または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための方法であって、請求項１５の抽出物または請求項１６の組成物により植物または植物組織または植物細胞の前記少なくとも一部を処置するステップを含む方法。
  18. 植物病原体による感染から植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部を保護するための、植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部における植物病原体の増殖を阻害するための、および／または植物もしくは植物組織もしくは植物細胞の少なくとも一部の病原体抵抗性を増加させるための、請求項１５に記載の抽出物または請求項１６に記載の組成物の使用。
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