JP2012112785A - Evaluation method of dialysis membrane - Google Patents
Evaluation method of dialysis membrane Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012112785A JP2012112785A JP2010261678A JP2010261678A JP2012112785A JP 2012112785 A JP2012112785 A JP 2012112785A JP 2010261678 A JP2010261678 A JP 2010261678A JP 2010261678 A JP2010261678 A JP 2010261678A JP 2012112785 A JP2012112785 A JP 2012112785A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- acid
- substance
- substances
- renal failure
- dialysis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
本発明は、透析膜の評価方法、より詳しくは、腎不全物質の透析前後の挙動を解析することによる透析膜の評価方法に関する。 The present invention relates to a method for evaluating a dialysis membrane, and more particularly, to a method for evaluating a dialysis membrane by analyzing the behavior of a renal failure substance before and after dialysis.
腎不全患者等の腎疾患を有する患者、特に腎透析を受ける患者の数は年々増加の一途を辿り、現在２０万人の患者が維持透析療法を行っており、さらに毎年３万人以上が新たに透析導入に至っている。透析療法には、一人あたり年間約５００万円の費用がかかるため、２０万人に対して約１兆円の医療費が恒常的に必要となっている。また、近年、慢性腎臓病（Chronic Kidney Disease：ＣＫＤ）という疾患概念が提唱され、その予防・治療の重要性に対する認識が高まりを見せている。ＣＫＤはCommon Diseaseであり、糸球体濾過量（ＧＦＲ）６０未満の対象者が１９２６万人にも上ることから、ＣＫＤ対策が急務の課題となっている。以上のような状況下において、腎不全やＣＫＤ等の腎疾患の症状の予防法や、そのような症状を緩和し、透析導入を遅らせる治療法が開発されれば、患者のＱＯＬ（クオリティオブライフ）に資するだけでなく、医療費の大幅な削減が可能となり社会に大きく貢献することができる。 The number of patients with renal disease, such as patients with renal failure, especially those undergoing renal dialysis, has been increasing year by year. Currently, 200,000 patients are undergoing maintenance dialysis, and more than 30,000 new patients each year. Dialysis has been introduced. Since dialysis therapy costs about 5 million yen per person per year, medical expenses of about 1 trillion yen are constantly required for 200,000 people. In recent years, the concept of chronic kidney disease (CKD) has been proposed, and recognition of the importance of its prevention and treatment is increasing. Since CKD is a common disease and the number of subjects with glomerular filtration rate (GFR) less than 60 is as high as 1,926,000, countermeasures against CKD are an urgent issue. Under these circumstances, if a preventive method for symptoms of renal diseases such as renal failure and CKD, or a treatment that alleviates such symptoms and delays the introduction of dialysis, the patient's QOL (Quality of Life) will be developed. ) As well as a significant contribution to society.
腎不全に罹患すると、健常の場合では腎臓より排泄される様々な物質が体内に蓄積する。これらの物質は、腎不全の病態を診断するマーカー物質として利用されることもある。例えば、尿中に排泄されるアルブミン等の腎疾患マーカータンパク質の増加を指標として腎疾患の検出・診断する方法等が一般的に用いられている。その他の方法として、例えば、腎疾患患者の血液中でヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の濃度が上昇することを利用した腎疾患の検出方法（特許文献１参照）や、腎不全等の患者の血液中や尿中でＥＮＤＯ１８０受容体ポリペプチドの濃度が上昇することを利用した腎症の診断方法（特許文献２参照）が知られている。また、本発明者らは、キャピラリー電気泳動質量分析計（capillary electrophoresis mass spectrometry：ＣＥ−ＭＳ）を用いて腎機能低下時に蓄積し毒性を示す新規代謝性物質を網羅的に解析し、該物質を腎疾患マーカー物質として用いた腎疾患の判定方法を提唱している（特許文献３参照）。 When suffering from renal failure, various substances excreted from the kidney in normal cases accumulate in the body. These substances may be used as marker substances for diagnosing the pathology of renal failure. For example, a method for detecting and diagnosing renal disease using as an index the increase in renal disease marker protein such as albumin excreted in urine is generally used. As other methods, for example, a renal disease detection method (see Patent Document 1) using an increase in the concentration of human lipocalin-type prostaglandin D synthase in the blood of a renal disease patient, or a patient with renal failure or the like A method for diagnosing nephropathy using the increase in the concentration of the ENDO180 receptor polypeptide in blood or urine is known (see Patent Document 2). In addition, the present inventors comprehensively analyzed new metabolic substances that accumulate and show toxicity at the time of renal function decline using a capillary electrophoresis mass spectrometer (CE-MS). A method for determining renal disease used as a renal disease marker substance has been proposed (see Patent Document 3).
以上の通り、腎疾患の早期判定方法の開発は進んでいるものの、腎不全が進行した患者にとって、尿毒症を防止するための方法は人工透析のみである。透析評価に用いられてきた指標の代表的なものは、ＴＡＣＢＵＮである。これは、血液中の尿素を血中尿素窒素（ＢＵＮ）として測定し、１週間の透析中および非透析時のＢＵＮを時間的に平均した値であり、この値が６５ｍｇ／ｄｌ以下であれば透析が順調に行われていると考えられている。しかし、尿素は尿毒症物質ではないため、透析による尿毒症防止を直接的に評価する指標にはなり得ない。実際、人工透析を長期間にわたり行うことにより、尿毒症物質が徐々に蓄積されていき、動脈硬化、貧血、心不全、骨病変、アミロイドーシス等の合併症が顕れる。しかしながら、人工透析によって腎不全物質がどのように挙動するかは、これまで調べられておらず、長期透析患者における合併症発症のメカニズムや、透析膜の種類ごとの腎不全物質除去能には不明な点が多かった。 As described above, although development of a method for early determination of kidney disease is progressing, artificial dialysis is the only method for preventing uremia for patients with advanced renal failure. A representative index that has been used for dialysis evaluation is TACBUN. This is a value obtained by measuring urea in blood as blood urea nitrogen (BUN) and averaging BUN during dialysis for one week and during non-dialysis over time, and if this value is 65 mg / dl or less It is believed that dialysis is proceeding smoothly. However, since urea is not a uremic substance, it cannot be an index for directly evaluating prevention of uremia by dialysis. In fact, by performing artificial dialysis over a long period of time, uremic substances gradually accumulate, and complications such as arteriosclerosis, anemia, heart failure, bone lesions, and amyloidosis appear. However, how renal failure substances behave by artificial dialysis has not been investigated so far, and the mechanism of complications in long-term dialysis patients and the ability to remove renal failure substances for each type of dialysis membrane are unknown. There were many points.
なお、ＣＥ−ＭＳとは近年開発された、少量のサンプルから５００種類以上の物質を同時測定できる新たなシステムである。 CE-MS is a new system developed in recent years that can simultaneously measure 500 or more substances from a small amount of sample.
本発明の課題は、これまでＴＡＣＢＵＮを測定すること等により間接的に行われてきた透析膜の評価を、尿毒症物質、酸化ストレス惹起物質、染色体優性多発性嚢胞腎において蓄積する物質を含む腎不全物質の検出、定量によって行うための方法を提供することにある。 It is an object of the present invention to evaluate a dialysis membrane that has been indirectly performed by measuring TACBUN, etc. until now, including a uremic substance, an oxidative stress-inducing substance, and a substance that accumulates in a chromosome dominant polycystic kidney The object is to provide a method for detecting and quantifying defective substances.
本発明者らは、High performance biocompatible dialyzerを用い、４時間／回、週３回の標準的な血液透析を行っている慢性維持透析患者１１名の透析前後の血清に対し、ＣＥ−ＭＳにてメタボローム解析を行った。その結果、本発明者らがすでに報告した腎機能低下に伴い蓄積する腎不全物質に対し、透析前後の血清中濃度（μＭ）をもとに血液透析による除去率を算出した。さらに、本発明者らは、腎不全物質に含まれる尿毒症物質、酸化ストレス惹起物質、及び、染色体優性多発性嚢胞腎において蓄積する腎不全物質を同定し、それらの透析前後における挙動を解明した。さらに、本発明者らは、腎不全物質量をＣＫＤの各ステージの非透析患者と比較することにより、腎不全物質の量がどのＣＫＤステージに相当するかを評価した。その結果本発明者らは、予想に反して腎不全物質の中には従来の透析膜では十分に除去できないものが含まれていることを見い出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors used CE-MS on the serum before and after dialysis of 11 chronic maintenance dialysis patients who performed standard hemodialysis 4 hours / time, 3 times a week using High performance biocompatible dialyzer. Metabolomic analysis was performed. As a result, the removal rate by hemodialysis was calculated based on the serum concentration (μM) before and after dialysis for the renal failure substance accumulated with the decrease in renal function already reported by the present inventors. Furthermore, the present inventors have identified uremic substances, oxidative stress-inducing substances, and renal failure substances that accumulate in chromosomal dominant polycystic kidneys, and elucidated their behavior before and after dialysis. . Furthermore, the present inventors evaluated which CKD stage the amount of renal failure substance corresponds to by comparing the amount of renal failure substance with non-dialysis patients at each stage of CKD. As a result, the present inventors have found that some of the renal failure substances, contrary to expectation, cannot be sufficiently removed by conventional dialysis membranes, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は（１）血液透析後に、被検血液試料中に存在する以下のカチオン性物質及びアニオン性物質からなる群から選ばれる１種又は２種以上の腎不全物質を検出又は定量する工程、及び血液透析後の腎不全物質の検出結果又は定量結果に基づき透析膜の腎不全物質除去能を評価する工程を有することを特徴とする透析膜の評価方法に関する。
（カチオン性物質）：クレアチニン、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、グアニジノコハク酸、シトルリン、１−メチルアデノシン、Ｎ−アセチルグルコサミン、γ−ブチロベタイン、オフタルミン酸、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、アラントイン、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ−ε−アセチルリジン、キヌレニン、シトシン、インドール−３−酢酸、ヒポタウリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、７−メチルグアニン、メチオニンスルホキシド、アスパラギン
（アニオン性物質）：イセチオネート、グルコン酸、トランス−アコニット酸、ピメリン酸、３−インドキシル硫酸、イソクエン酸、Ｎ−アセチル−β−アラニン、Ｎ−アセチルグルタミン酸、セバシン酸、４−オキソペンタン酸、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸、アジピン酸、シトラリンゴ酸、２−イソプロピルリンゴ酸、トレオン酸、馬尿酸、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸、オキサミン酸、グルタル酸、アゼライン酸、フタル酸、クエン酸、マロン酸、シトラコン酸、キナ酸、コハク酸、システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸
That is, the present invention (1) detects or quantifies one or more renal failure substances selected from the group consisting of the following cationic substances and anionic substances present in a test blood sample after hemodialysis. The present invention relates to a method for evaluating a dialysis membrane, comprising a step and a step of evaluating the ability of the dialysis membrane to remove a renal failure substance based on a detection result or quantitative result of a renal failure substance after hemodialysis.
(Cationic substance): Creatinine, symmetric dimethylarginine (SDMA), guanidinosuccinic acid, citrulline, 1-methyladenosine, N-acetylglucosamine, γ-butyrobetaine, ophthalmic acid, 3-methylhistidine, hydroxyproline, trimethylamine-N -Oxide, allantoin, asymmetric dimethylarginine (ADMA), N-ε-acetyllysine, kynurenine, cytosine, indole-3-acetic acid, hypotaurine, N, N-dimethylglycine, 7-methylguanine, methionine sulfoxide, asparagine (anion) Active substance): isethionate, gluconic acid, trans-aconitic acid, pimelic acid, 3-indoxyl sulfate, isocitric acid, N-acetyl-β-alanine, N-acetylglutamic acid, sebacic acid, 4 Oxopentanoic acid, cis-aconitic acid, homovanillic acid, adipic acid, citralmalic acid, 2-isopropylmalic acid, threonic acid, hippuric acid, N-acetylaspartic acid, 4-hydroxy-3-methoxymandelic acid, oxamic acid, glutar Acid, azelaic acid, phthalic acid, citric acid, malonic acid, citraconic acid, quinic acid, succinic acid, cysteine-S-sulfuric acid, 4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid
また、本発明は、（２）血液透析後の腎不全物質の検出結果又は定量結果を、前記腎不全物質の血液透析前の検出結果又は定量結果と比較する工程をさらに有することを特徴とする上記（１）に記載の透析膜の評価方法や、（３）血液透析後の腎不全物質の検出結果又は定量結果を、正常被検体の血液試料中に存在する前記腎不全物質の検出結果又は定量結果と比較する工程をさらに有することを特徴とする上記（１）記載の透析膜の評価方法や、（４）血液透析後の腎不全物質の検出結果又は定量結果を、慢性腎臓病（ＣＫＤ）の各ステージの非透析患者の血液試料中に存在する前記腎不全物質の検出結果又は定量結果と比較する工程をさらに有することを特徴とする上記（１）記載の透析膜の評価方法に関する。 The present invention further includes (2) a step of comparing the detection result or quantitative result of the renal failure substance after hemodialysis with the detection result or quantitative result of the renal failure substance before hemodialysis. The evaluation method of the dialysis membrane according to (1) above, or (3) the detection result or quantitative result of the renal failure substance after hemodialysis, the detection result of the renal failure substance present in the blood sample of a normal subject or The method for evaluating a dialysis membrane according to the above (1), further comprising a step of comparing with a quantification result, and (4) a detection result or quantification result of a renal failure substance after hemodialysis as chronic kidney disease (CKD). The method for evaluating a dialysis membrane according to the above (1), further comprising a step of comparing the detection result or quantitative result of the renal failure substance present in the blood sample of a non-dialysis patient at each stage.
さらに、本発明は、（５）腎不全物質が、以下のカチオン性物質及びアニオン性物質からなる群から選ばれる１種又は２種以上の尿毒症物質であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の透析膜の評価方法に関する。
（カチオン性物質）：１−メチルアデノシン、インドール−３−酢酸
（アニオン性物質）：システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸、マロン酸、シトラコン酸、３−インドキシル硫酸
Further, according to the present invention, (5) wherein the renal failure substance is one or more uremic substances selected from the group consisting of the following cationic substances and anionic substances (1) It is related with the evaluation method of the dialysis membrane in any one of-(4).
(Cationic substance): 1-methyladenosine, indole-3-acetic acid (anionic substance): cysteine-S-sulfuric acid, 4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid, malonic acid, citraconic acid, 3-indoxyl sulfate
また、本発明は、（６）腎不全物質が、以下のカチオン性物質及びアニオン性物質からなる群から選ばれる１種又は２種以上の酸化ストレス惹起物質であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の透析膜の評価方法に関する。
（カチオン性物質）：１−メチルアデノシン、オフタルミン酸、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）
（アニオン性物質）：３−インドキシル硫酸、トランス−アコニット酸、シス−アコニット酸
The present invention is also characterized in that (6) the renal failure substance is one or more oxidative stress-inducing substances selected from the group consisting of the following cationic substances and anionic substances (1) ) To the dialysis membrane evaluation method according to any one of (4).
(Cationic substance): 1-methyladenosine, ophthalmic acid, asymmetric dimethylarginine (ADMA)
(Anionic substance): 3-indoxyl sulfate, trans-aconitic acid, cis-aconitic acid
さらに、本発明は、（７）腎不全物質が、以下のカチオン性物質及びアニオン性物質からなる群から選ばれる１種又は２種以上の染色体優性多発性嚢胞腎において蓄積する物質であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の透析膜の評価方法に関する。
（カチオン性物質）：クレアチニン、３−メチルヒスチジン、アラントイン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒドロキシプロリン、シトルリン、メチオニンスルホキシド、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、グアニジノコハク酸
（アニオン性物質）：クエン酸、シス−アコニット酸、イソクエン酸、３−インドキシル硫酸、トランス−アコニット酸、イセチオネート、ピメリン酸、馬尿酸
Furthermore, the present invention provides that (7) the renal failure substance is a substance that accumulates in one or more chromosomal dominant polycystic kidneys selected from the group consisting of the following cationic substances and anionic substances. It is related with the evaluation method of the dialysis membrane in any one of said (1)-(4) characterized.
(Cationic substance): Creatinine, 3-methylhistidine, allantoin, trimethylamine-N-oxide, hydroxyproline, citrulline, methionine sulfoxide, asymmetric dimethylarginine (ADMA), N, N-dimethylglycine, guanidinosuccinic acid (anionic) Substance): citric acid, cis-aconitic acid, isocitric acid, 3-indoxyl sulfate, trans-aconitic acid, isethionate, pimelic acid, hippuric acid
また、本発明は、（８）腎不全物質が、以下のカチオン性物質及びアニオン性物質からなる群から選ばれる１種又は２種以上の透析難除去性物質であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の透析膜の評価方法に関する。
（カチオン性物質）：非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、インドール−３−酢酸
（アニオン性物質）：ピメリン酸、アジピン酸、馬尿酸、グルタル酸、アゼライン酸、フタル酸、マロン酸
The present invention is also characterized in that (8) the renal insufficiency substance is one or more dialysis difficult removal substances selected from the group consisting of the following cationic substances and anionic substances ( The present invention relates to a method for evaluating a dialysis membrane according to any one of (1) to (4).
(Cationic substance): asymmetric dimethylarginine (ADMA), indole-3-acetic acid (anionic substance): pimelic acid, adipic acid, hippuric acid, glutaric acid, azelaic acid, phthalic acid, malonic acid
さらに、本発明は、（９）腎不全物質の検出又は定量が、キャピラリー電気泳動質量分析法で行われることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載の透析膜の評価方法に関する。 Further, the present invention provides (9) The method for evaluating a dialysis membrane according to any one of the above (1) to (8), wherein detection or quantification of a renal failure substance is performed by capillary electrophoresis mass spectrometry About.
本発明の透析膜の評価方法によると、透析前後における腎不全物質の挙動と性質を介した透析膜の評価が可能となり、これまでは直接的には尿毒症に関与しない物質に基づき透析膜の性能評価を行っていたのに対し、尿毒症物質、酸化ストレス惹起物質、染色体優性多発性嚢胞腎発症において蓄積する物質、及び透析難除去性物質等の腎不全物質の挙動に基づき透析膜の性能評価ができる。本発明の透析膜の評価方法は、透析膜における腎不全物質除去能の判定や、優れた透析膜のスクリーニングに適用することができ、その結果、より尿毒症発症を低減させることのできる高性能の透析膜を開発することが可能になる。 According to the dialysis membrane evaluation method of the present invention, it is possible to evaluate the dialysis membrane through the behavior and properties of renal failure substances before and after dialysis, and the dialysis membrane based on substances not directly related to uremia until now. The performance of the dialysis membrane was evaluated based on the behavior of renal failure substances such as uremic substances, substances that induce oxidative stress, substances that accumulate in chromosomal dominant polycystic kidney disease, and substances that are difficult to remove from dialysis. Can be evaluated. The method for evaluating a dialysis membrane of the present invention can be applied to the determination of the ability to remove a renal failure substance in a dialysis membrane and the screening of an excellent dialysis membrane. Dialysis membranes can be developed.
本発明の透析膜の評価方法としては、血液透析後に、被検血液試料中に存在する以下のカチオン性物質及びアニオン性物質からなる群から選ばれる１種又は２種以上の腎不全物質を検出又は定量する工程、及び血液透析後の腎不全物質の検出結果又は定量結果に基づき透析膜の腎不全物質除去能を評価する工程を有する方法であれば特に制限されない。
（カチオン性物質）：クレアチニン、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、グアニジノコハク酸、シトルリン、１−メチルアデノシン、Ｎ−アセチルグルコサミン、γ−ブチロベタイン、オフタルミン酸、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、アラントイン、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ−ε−アセチルリジン、キヌレニン、シトシン、インドール−３−酢酸、ヒポタウリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、７−メチルグアニン、メチオニンスルホキシド、アスパラギン
（アニオン性物質）：イセチオネート、グルコン酸、トランス−アコニット酸、ピメリン酸、３−インドキシル硫酸、イソクエン酸、Ｎ−アセチル−β−アラニン、Ｎ−アセチルグルタミン酸、セバシン酸、４−オキソペンタン酸、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸、アジピン酸、シトラリンゴ酸、２−イソプロピルリンゴ酸、トレオン酸、馬尿酸、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸、オキサミン酸、グルタル酸、アゼライン酸、フタル酸、クエン酸、マロン酸、シトラコン酸、キナ酸、コハク酸、システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸
As a method for evaluating a dialysis membrane of the present invention, after hemodialysis, one or more renal failure substances selected from the group consisting of the following cationic substances and anionic substances present in a test blood sample are detected. Alternatively, the method is not particularly limited as long as it includes a step of quantifying and a step of evaluating the ability of the dialysis membrane to remove the renal failure substance based on the detection result or quantitative result of the renal failure substance after hemodialysis.
(Cationic substance): Creatinine, symmetric dimethylarginine (SDMA), guanidinosuccinic acid, citrulline, 1-methyladenosine, N-acetylglucosamine, γ-butyrobetaine, ophthalmic acid, 3-methylhistidine, hydroxyproline, trimethylamine-N -Oxide, allantoin, asymmetric dimethylarginine (ADMA), N-ε-acetyllysine, kynurenine, cytosine, indole-3-acetic acid, hypotaurine, N, N-dimethylglycine, 7-methylguanine, methionine sulfoxide, asparagine (anion) Active substance): isethionate, gluconic acid, trans-aconitic acid, pimelic acid, 3-indoxyl sulfate, isocitric acid, N-acetyl-β-alanine, N-acetylglutamic acid, sebacic acid, 4 Oxopentanoic acid, cis-aconitic acid, homovanillic acid, adipic acid, citralmalic acid, 2-isopropylmalic acid, threonic acid, hippuric acid, N-acetylaspartic acid, 4-hydroxy-3-methoxymandelic acid, oxamic acid, glutar Acid, azelaic acid, phthalic acid, citric acid, malonic acid, citraconic acid, quinic acid, succinic acid, cysteine-S-sulfuric acid, 4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid
さらに、血液透析後の被検血液試料中に存在する腎不全物質の検出結果又は定量結果を、血液透析前の被検血液試料中に存在する腎不全物質の検出結果又は定量結果と比較することにより、透析によりどの程度腎不全物質が除去できるかを評価する工程を有することが好ましい。血液透析前の被検血液試料中に存在する腎不全物質量は患者ごとに異なるが、この工程により患者ごとの個人差を補正しうる腎不全物質の除去率に基づき、透析膜の評価を行うことが可能になる。 In addition, the detection result or quantitative result of renal failure substance present in the test blood sample after hemodialysis should be compared with the detection result or quantitative result of renal failure substance present in the test blood sample before hemodialysis. Thus, it is preferable to have a step of evaluating how much renal failure substance can be removed by dialysis. Although the amount of renal failure substance present in the test blood sample before hemodialysis varies from patient to patient, this process evaluates the dialysis membrane based on the removal rate of renal failure substance that can compensate for individual differences among patients. It becomes possible.
また、血液透析後の被検血液試料中に存在する腎不全物質の検出結果又は定量結果を、正常被検体の血液試料中に存在する腎不全物質の検出結果又は定量結果と比較する工程を含んでもよい。この工程により、透析後の腎不全物質量を、より健常者の血中腎不全物質量に近づけることのできる透析膜と評価することができる。 And a step of comparing the detection result or quantification result of the renal failure substance present in the test blood sample after hemodialysis with the detection result or quantification result of the renal failure substance present in the blood sample of a normal subject. But you can. By this step, the amount of renal failure substance after dialysis can be evaluated as a dialysis membrane that can more closely approximate the amount of blood renal failure substance of a healthy person.
また、血液透析後の腎不全物質の検出結果又は定量結果を、慢性腎臓病（ＣＫＤ）の各ステージの非透析患者の血液試料中に存在する前記腎不全物質の検出結果又は定量結果と比較する工程を含んでもよい。ＣＫＤの各ステージは、糸球体濾過量（ＧＦＲ）又は推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）によって定義されるＣＫＤ診療のための指標であり、ステージ１［ＧＦＲ（ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）≧９０］：腎障害は存在するが、ＧＦＲは正常又は亢進；ステージ２［ＧＦＲ（ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）６０〜８９］：腎障害が存在し、ＧＦＲ軽度低下；ステージ３［ＧＦＲ（ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）３０〜５９］：腎障害が存在し、ＧＦＲ中等度低下；ステージ４［ＧＦＲ（ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）１５〜２９］：腎障害が存在し、ＧＦＲ高度低下；ステージ５［ＧＦＲ（ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）＜１５］：腎不全・透析期；の５ステージに分類される。 Further, the detection result or quantification result of the renal failure substance after hemodialysis is compared with the detection result or quantification result of the renal failure substance present in the blood sample of the non-dialysis patient at each stage of chronic kidney disease (CKD). A process may be included. Each stage of CKD is an index for CKD practice defined by glomerular filtration rate (GFR) or estimated glomerular filtration rate (eGFR), and stage 1 [GFR (mL / min / 1.73 m 2 ) ≧ 90]: Renal disorder is present but GFR is normal or enhanced; Stage 2 [GFR (mL / min / 1.73 m 2 ) 60-89]: Renal disorder is present, GFR mildly decreased; Stage 3 [GFR ( mL / min / 1.73 m 2 ) 30-59]: renal disorder present, moderate reduction in GFR; stage 4 [GFR (mL / min / 1.73 m 2 ) 15-29]: renal disorder present, It is classified into five stages: GFR elevation lowering; stage 5 [GFR (mL / min / 1.73 m 2 ) <15]: renal failure / dialysis stage.
本発明者らは、４１名の非透析ＣＫＤ患者のＣＥ−ＭＳ解析により、各ステージの非透析ＣＫＤ患者について腎不全物質の血清中濃度を定量した（Hypertens Res in press）。非透析ＣＫＤ患者の腎不全物質の血清中濃度とｅＧＦＲから求められた、腎不全物質血清中濃度とｅＧＦＲとの換算式を用いて、血液透析後の各腎不全物質の血清中濃度が非透析患者ではどの程度のｅＧＦＲに相当するかを算出できる。さらに、得られた仮想のｅＧＦＲをもとに、腎不全物質濃度をＣＫＤステージに分類することができる。この工程を含むことより、透析膜を段階的に評価・判定することができる。 The present inventors quantified the serum concentration of renal failure substance in each stage of non-dialysis CKD patients by CE-MS analysis of 41 non-dialysis CKD patients (Hypertens Res in press). Using the conversion formula of renal failure substance serum concentration and eGFR obtained from the serum concentration of renal failure substance and eGFR in non-dialysis CKD patients, the serum concentration of each renal failure substance after hemodialysis is not dialyzed It can be calculated how much eGFR corresponds to the patient. Furthermore, based on the obtained virtual eGFR, the renal failure substance concentration can be classified into the CKD stage. By including this step, the dialysis membrane can be evaluated and determined step by step.
本発明において指標とされる前述の尿毒症物質は、公知の細胞毒性試験において細胞毒性が認められ、細胞毒性試験として具体的にはヒト胃癌（renal cell adenocarcinoma）由来ＡＣＨＮ細胞に腎不全物質が入った培地を添加し、生細胞数測定試薬 Cell Count Reagent SF試薬（ナカライテスク（株）製）を用いて５０％半数致死量（ＬＣ５０）を算出する方法を好適に例示することができる。尿毒症物質のＬＣ５０は、例えば１０ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは３．５ｍＭ以下である。尿毒症物質として、具体的には公知の尿毒症物質である３−インドキシル硫酸以下のＬＣ５０値（３．０５ｍＭ以下）を示す以下のカチオン性物質及びアニオン性物質を好適に例示することができる。
（カチオン性物質）：１−メチルアデノシン、インドール−３−酢酸
（アニオン性物質）：システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸、マロン酸、シトラコン酸、３−インドキシル硫酸
The aforementioned uremic substance used as an index in the present invention is cytotoxic in a known cytotoxicity test. Specifically, as a cytotoxicity test, a renal failure substance is contained in ACHN cells derived from human gastric cancer (renal cell adenocarcinoma). A method of calculating the 50% half-lethal dose (LC 50 ) using a cell count reagent SF Cell reagent (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.) can be suitably exemplified. The LC 50 of the uremic substance is, for example, 10 mM or less, preferably 5 mM or less, more preferably 3.5 mM or less. Specific examples of the uremic substance include the following cationic substances and anionic substances that exhibit an LC 50 value (3.05 mM or lower) of 3-indoxyl sulfate or lower, which is a known uremic substance. it can.
(Cationic substance): 1-methyladenosine, indole-3-acetic acid (anionic substance): cysteine-S-sulfuric acid, 4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid, malonic acid, citraconic acid, 3-indoxyl sulfate
本発明において指標とされる酸化ストレス惹起物質は、公知の酸化ストレスアッセイにおいて酸化ストレス惹起活性が認められ、酸化ストレスアッセイとして具体的にはOxiSelectTM ROS Assay Kit（Cell Biolab社製）を用いる方法を例示することができる。また、酸化ストレス惹起物質としては、１０ｍＭ以下、好ましくは３ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下、さらに好ましくは０．３ｍＭの濃度で酸化ストレスを惹起する物質を好適に例示することができ、具体的には以下のカチオン性物質及びアニオン性物質を特に好適に例示することができる。
（カチオン性物質）：１−メチルアデノシン、オフタルミン酸、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）
（アニオン性物質）：３−インドキシル硫酸、トランス−アコニット酸、シス−アコニット酸
The oxidative stress-inducing substance used as an index in the present invention has an oxidative stress-inducing activity in a known oxidative stress assay. Specifically, as an oxidative stress assay, a method using OxiSelect ™ ROS Assay Kit (manufactured by Cell Biolab) is used. It can be illustrated. Further, as the oxidative stress inducing substance, a substance that induces oxidative stress at a concentration of 10 mM or less, preferably 3 mM or less, more preferably 1 mM or less, and still more preferably 0.3 mM can be preferably exemplified. The following cationic substances and anionic substances can be particularly preferably exemplified.
(Cationic substance): 1-methyladenosine, ophthalmic acid, asymmetric dimethylarginine (ADMA)
(Anionic substance): 3-indoxyl sulfate, trans-aconitic acid, cis-aconitic acid
本発明において指標とされる染色体優性多発性嚢胞腎において蓄積する物質は、染色体優性多発性嚢胞腎に罹患したヒト又は非ヒト動物において蓄積する物質で、染色体優性多発性嚢胞腎に罹患した非ヒト動物として染色体優性多発性嚢胞腎モデルラットであるＨａｎ：ＳＰＲＤ Ｃｙ／＋ラットを例示することができる。染色体優性多発性嚢胞腎において蓄積する腎不全物質としては、具体的には以下のカチオン性物質及びアニオン性物質を特に好適に例示することができる。
（カチオン性物質）：クレアチニン、３−メチルヒスチジン、アラントイン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒドロキシプロリン、シトルリン、メチオニンスルホキシド、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、グアニジノコハク酸
（アニオン性物質）：クエン酸、シス−アコニット酸、イソクエン酸、３−インドキシル硫酸、トランス−アコニット酸、イセチオネート、ピメリン酸、馬尿酸
The substance accumulated in the chromosome dominant polycystic kidney, which is an index in the present invention, is a substance that accumulates in a human or non-human animal suffering from chromosome dominant polycystic kidney, and a non-human suffering from chromosome dominant polycystic kidney Examples of animals include Han: SPRD Cy / + rats, which are chromosomal dominant polycystic kidney model rats. Specific examples of the renal failure substance that accumulates in the chromosomal dominant polycystic kidney include the following cationic substances and anionic substances.
(Cationic substance): Creatinine, 3-methylhistidine, allantoin, trimethylamine-N-oxide, hydroxyproline, citrulline, methionine sulfoxide, asymmetric dimethylarginine (ADMA), N, N-dimethylglycine, guanidinosuccinic acid (anionic) Substance): citric acid, cis-aconitic acid, isocitric acid, 3-indoxyl sulfate, trans-aconitic acid, isethionate, pimelic acid, hippuric acid
本発明者において指標とされる透析難除去性物質は、公知のHigh Performance Biocompatible Dialyzer等の透析膜において除去されにくい物質で、具体的には以下のカチオン性物質及びアニオン性物質を例示することができる。
（カチオン性物質）：非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、インドール−３−酢酸
（アニオン性物質）：ピメリン酸、アジピン酸、馬尿酸、グルタル酸、アゼライン酸、フタル酸、マロン酸
The difficult-to-dialyze substance that can be removed by the present inventor is a substance that is difficult to remove by a known dialysis membrane such as High Performance Biocompatible Dialyzer, and specifically, the following cationic substances and anionic substances can be exemplified. it can.
(Cationic substance): asymmetric dimethylarginine (ADMA), indole-3-acetic acid (anionic substance): pimelic acid, adipic acid, hippuric acid, glutaric acid, azelaic acid, phthalic acid, malonic acid
また、上記の被検血液試料としては、被検者（被検血液試料の提供者）の血液に由来する試料である限り特に制限されず、血液試料そのものであってもよいし、その血液試料から得られた血清試料や血漿試料であってもよいが、検出や定量のより高い精度を得る観点から、血漿試料を好適に例示することができる。 The test blood sample is not particularly limited as long as it is a sample derived from the blood of the subject (provider of the test blood sample), and may be the blood sample itself or the blood sample. Serum samples and plasma samples obtained from the above may be used, but from the viewpoint of obtaining higher accuracy of detection and quantification, plasma samples can be preferably exemplified.
上記の本件腎疾患マーカー物質の検出又は定量方法としては、本件腎疾患マーカー物質を検出又は定量し得る限り、物理化学的方法であっても生物学的方法であってもよいが、検出感度の点で物理化学的方法を好適に例示することができ、中でも、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）やキャピラリー電気泳動質量分析計（ＣＥ−ＭＳ）等の質量分析計（ＭＳ）を用いた方法をより好適に例示することができ、少量のサンプルから数百種類以上の物質を同時測定できることから、ＣＥ−ＭＳを用いた方法を特に好適に例示することができる。 As a method for detecting or quantifying the above-mentioned renal disease marker substance, as long as the present renal disease marker substance can be detected or quantified, it may be a physicochemical method or a biological method. The physicochemical method can be preferably exemplified in terms of points, and among them, a liquid chromatograph mass spectrometer (LC / MS), a gas chromatograph mass spectrometer (GC / MS), and a capillary electrophoresis mass spectrometer (CE-MS). ) And the like using a mass spectrometer (MS) can be illustrated more suitably, and several hundreds or more kinds of substances can be simultaneously measured from a small amount of sample. Therefore, a method using CE-MS is particularly preferable. It can be illustrated.
以下実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により制限されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. However, the technical scope of the present invention is not limited by the examples.
透析患者の解析
High Performance Biocompatible Dialyserを用い、４時間／回、週３回の標準的な血液透析を行っている慢性維持透析患者１１名の透析前後の血清に対しＣＥ−ＭＳにてメタボローム解析を行った。患者の背景を表１に示す。なお、使用したHigh Performance Biocompatible Dialyserは、ＡＰＳ−１５ＳＡ（旭化成クラレメディカル社製：患者１、６、９、１１）、ＶＰＳ−１５ＨＡ（旭化成クラレメディカル社製：患者２、３、４）、ＡＰＳ−１８ＳＡ（旭化成クラレメディカル社製：患者５、７、８）、ＦＤＸ−１５０ＧＷ（日機装社製：患者１０）である。
Analysis of dialysis patients
Using a High Performance Biocompatible Dialyser, metabolomic analysis was performed by CE-MS on the serum before and after dialysis of 11 chronic maintenance dialysis patients undergoing standard hemodialysis 4 hours / time, 3 times a week. The patient background is shown in Table 1. The High Performance Biocompatible Dialyser used was APS-15SA (Asahi Kasei Kuraray Medical: patients 1, 6, 9, 11), VPS-15HA (Asahi Kasei Kuraray Medical: patients 2, 3, 4), APS- 18SA (Asahi Kasei Kuraray Medical Co., Ltd .: patients 5, 7, 8) and FDX-150GW (Nikkiso Co., Ltd .: patient 10).
患者から血漿サンプルを採取し、内標準物質を調整したメタノール溶液を添加して撹拌し、さらにクロロホルムを加えて撹拌し、４６００ｇで５分間遠心分離した後、上清を限外ろ過フィルター（分画分子量５０００）にとり、４℃、９１００ｇで２時間遠心分離した後、ろ液を遠心濃縮してＣＥ−ＴＯＦＭＳにて測定を行った。その際、３１２種類の陽イオンと１９３種類の陰イオンを網羅的に同時測定した。その結果から、腎不全物質を定量した（表２、表３）。 A plasma sample is collected from a patient, a methanol solution prepared with an internal standard substance is added and stirred, chloroform is further added and stirred, and the mixture is centrifuged at 4600 g for 5 minutes, and then the supernatant is filtered with an ultrafiltration filter (fractionation). The resultant was centrifuged at 4 ° C. and 9100 g for 2 hours, and then the filtrate was concentrated by centrifugation and measured by CE-TOFMS. At that time, 312 kinds of cations and 193 kinds of anions were comprehensively measured simultaneously. From the results, renal failure substances were quantified (Tables 2 and 3).
１．除去率
本発明者らがすでに報告した腎機能低下に伴い蓄積する腎不全物質（Hypertens Res in press）のうち４８物質（カチオン性物質２１、アニオン性物質２７）に対し、透析前後の血清中濃度（μＭ）をもとに血液透析による除去率を算出した。除去率は（透析前濃度−透析後濃度）／透析前濃度×１００（％）で算出した。また透析により除去が有意に行われているかをPaired-t testで検定した。
1. Removal rate For 48 substances (cationic substance 21 and anionic substance 27) among the renal failure substances (Hypertens Res in press) accumulated by the present inventors with the decrease in renal function, serum concentrations before and after dialysis The removal rate by hemodialysis was calculated based on (μM). The removal rate was calculated by (concentration before dialysis−concentration after dialysis) / concentration before dialysis × 100 (%). In addition, it was tested by the Paired-t test whether the removal was performed significantly by dialysis.
２．血清中濃度の非透析ＣＫＤ患者との比較
本発明者らは、４１名の非透析ＣＫＤ患者のＣＥ−ＭＳ解析により、各ステージの非透析ＣＫＤ患者について腎不全物質の血清中濃度を定量した（Hypertens Res in press）。その結果得られた非透析ＣＫＤ患者における腎不全物質の血清中濃度とｅＧＦＲの散布図から求められた近似式を用い、患者を非透析患者と仮定したときに、腎不全物質ごとに血清中濃度からｅＧＦＲ値を算出した（すなわち近似式のｙに血清中濃度の値を代入し方程式を解きｘを求めた）。さらに得られた仮想のｅＧＦＲをもとにＣＫＤステージ分類を示した。以下にＡＤＭＡ及びγ−ブチロベタインを例として示す。
2. Comparison of Serum Concentration with Nondialyzed CKD Patients The present inventors quantified the serum concentration of renal failure substances in each stage of nondialyzed CKD patients by CE-MS analysis of 41 nondialyzed CKD patients ( Hypertens Res in press). Using the approximate expression obtained from the serum concentration of renal failure substance and eGFR scatter diagram in the non-dialysis CKD patient obtained as a result, and assuming that the patient is a non-dialysis patient, the serum concentration for each renal failure substance The eGFR value was calculated from (ie, the value of serum concentration was substituted for y in the approximate expression and the equation was solved to obtain x). Furthermore, CKD stage classification was shown based on the virtual eGFR obtained. Examples of ADMA and γ-butyrobetaine are shown below.
例１）ＡＤＭＡ
透析前は平均２．８μＭ、透析後は平均１．５μＭとなっている（表２）。換算式（図１）ではｅＧＦＲを０としてもＡＤＭＡ濃度は０．６９５７μＭとなり、透析前後の濃度はいずれもｅＧＦＲ換算でマイナスの値となる。これは、透析患者におけるＡＤＭＡ濃度が、非透析ＣＫＤ患者でｅＧＦＲが０になったと仮定した場合よりも高値であることを意味する。このように血清中濃度が非透析ＣＫＤ患者でのｅＧＦＲ＝０換算値よりも高い場合、ＣＫＤステージは便宜上Ｈｉｇｈと示した。逆に、透析患者における腎不全物質濃度が非透析ＣＫＤ患者で想定される値より低い場合、ＣＫＤステージ分類では便宜上Ｌｏｗと示した。
Example 1) ADMA
The average was 2.8 μM before dialysis and 1.5 μM after dialysis (Table 2). In the conversion formula (FIG. 1), even if eGFR is set to 0, the ADMA concentration is 0.6957 μM, and the concentrations before and after dialysis are both negative values in terms of eGFR. This means that the ADMA concentration in dialysis patients is higher than that assumed when eGFR was zero in non-dialysis CKD patients. Thus, when the serum concentration is higher than the eGFR = 0 conversion value in the non-dialysis CKD patient, the CKD stage is indicated as High for convenience. Conversely, when the renal failure substance concentration in the dialysis patient is lower than the value expected in the non-dialysis CKD patient, the CKD stage classification indicates “Low” for convenience.
例２）γ−ブチロベタイン
透析前は平均４．９μＭ、透析後は平均１．９μＭとなっている（表２）。換算式（図２）より透析前後の血清中濃度のｅＧＦＲ換算は−６６．４→４０．４、ＣＫＤステージはＨｉｇｈ→３となる。
Example 2) γ-Butyrobetaine The average was 4.9 μM before dialysis and the average was 1.9 μM after dialysis (Table 2). From the conversion formula (FIG. 2), the eGFR conversion of the serum concentration before and after dialysis is −66.4 → 40.4, and the CKD stage is High → 3.
解析の結果、透析前後に関わらず常に非透析ＣＫＤ患者より高値である透析難除去性物質（透析前後に関わらずＣＫＤステージがＨｉｇｈ）である以下のカチオン性物質及びアニオン性物質が同定された。
（カチオン性物質）：非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、インドール−３−酢酸
（アニオン性物質）：ピメリン酸、アジピン酸、馬尿酸、グルタル酸、アゼライン酸、フタル酸、マロン酸
As a result of the analysis, the following cationic substances and anionic substances, which are difficult to dialyzate removal substances (CKD stage is high regardless of before and after dialysis), which are always higher than those of non-dialysis CKD patients, were identified.
(Cationic substance): asymmetric dimethylarginine (ADMA), indole-3-acetic acid (anionic substance): pimelic acid, adipic acid, hippuric acid, glutaric acid, azelaic acid, phthalic acid, malonic acid
細胞毒性試験
細胞毒性試験を、ヒト胃癌（renal cell adenocarcinoma）由来ＡＣＨＮ細胞を用いて行った。対数増殖期にある細胞を５０００細胞／ウェルの濃度になるように計数し、９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μＬずつ播き、炭酸ガスインキュベーター内で２４時間前培養した。その後、腎不全物質を各ウェルに目的の濃度になるように添加し、炭酸ガスインキュベーター内で４８時間培養した後の生細胞数を計数した。生細胞数の計数は、生細胞数測定試薬 Cell Count Reagent SF試薬（ナカライテスク（株）製）を各ウェルに１０μＬずつ添加し、炭酸ガスインキュベーター内で１−４時間呈色反応を行い、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍ（参照波長６００ｎｍ以上）の吸光度を測定することで行った。各腎不全物質に関して５０％半数致死量（ＬＣ５０）を算出した結果を図３に示す。
Cytotoxicity Test Cytotoxicity tests were performed using ACHN cells derived from human gastric cancer (renal cell adenocarcinoma). Cells in the logarithmic growth phase were counted to a concentration of 5000 cells / well, seeded at 100 μL in each well of a 96-well microtiter plate, and pre-cultured in a carbon dioxide incubator for 24 hours. Thereafter, a renal failure substance was added to each well to a target concentration, and the number of viable cells after culturing in a carbon dioxide incubator for 48 hours was counted. To count the number of viable cells, add 10 μL of Cell Count Reagent SF Reagent (manufactured by Nacalai Tesque) to each well and perform a color reaction in a carbon dioxide incubator for 1-4 hours. The measurement was performed by measuring the absorbance at 450 nm (reference wavelength: 600 nm or more) using a plate reader. FIG. 3 shows the results of calculating 50% half-lethal dose (LC 50 ) for each renal failure substance.
細胞毒性試験の結果、以下のカチオン性物質及びアニオン性物質が、公知の尿毒症物質である３−インドキシル硫酸以下のＬＣ５０値（３．０５ｍＭ以下）を示した。
（カチオン性物質）：１−メチルアデノシン、インドール−３−酢酸
（アニオン性物質）：システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸、マロン酸、シトラコン酸、３−インドキシル硫酸
As a result of the cytotoxicity test, the following cationic substances and anionic substances showed LC 50 values (3.05 mM or less) of 3-indoxyl sulfate or less, which is a known uremic substance.
(Cationic substance): 1-methyladenosine, indole-3-acetic acid (anionic substance): cysteine-S-sulfuric acid, 4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid, malonic acid, citraconic acid, 3-indoxyl sulfate
活性酸素種（ＲＯＳ）アッセイ
酸化ストレス惹起物質を同定するため、ＲＯＳアッセイを行った。ＲＯＳアッセイは、OxiSelectTM ROS Assay Kit（Cell Biolab社製）を用いて行った。１×１０４ｋ個のヒト腎癌由来ＡＣＨＮ細胞を９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに播き、炭酸ガスインキュベーター内で２４時間前培養した。翌日細胞をダルベッコＰＢＳで３回洗浄した後１ｍＭの２’，７’−Dichlorodihydrofluorescin diacetate（ＤＣＦＨ−ＤＡ）で１時間前処理を行った。さらにダルベッコＰＢＳで３回洗浄し、ＤＣＦＨ−ＤＡで負荷した細胞を各腎不全物質が入った培地で１時間培養した。１時間後、マイクロプレートリーダーを用い、励起波長４８０ｎｍ、放射［発光］波長５３０ｎｍの蛍光を測定した（図４、図５）。その結果、以下のカチオン性物質及びアニオン性物質が、コントロールと比較して有意に蛍光強度が高かった。
（カチオン性物質）：１−メチルアデノシン、オフタルミン酸、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）
（アニオン性物質）：３−インドキシル硫酸、トランス−アコニット酸、シス−アコニット酸
Reactive oxygen species (ROS) assay To identify oxidative stress inducers, a ROS assay was performed. The ROS assay was performed using OxiSelect ™ ROS Assay Kit (manufactured by Cell Biolab). 1 × 10 4 k human kidney cancer-derived ACHN cells were seeded in each well of a 96-well microtiter plate and pre-cultured in a carbon dioxide incubator for 24 hours. The next day, the cells were washed three times with Dulbecco's PBS and then pretreated with 1 mM 2 ', 7'-Dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCFH-DA) for 1 hour. Further, the cells washed with Dulbecco's PBS three times and loaded with DCFH-DA were cultured in a medium containing each renal failure substance for 1 hour. After 1 hour, fluorescence with an excitation wavelength of 480 nm and an emission [emission] wavelength of 530 nm was measured using a microplate reader (FIGS. 4 and 5). As a result, the following cationic substances and anionic substances had significantly higher fluorescence intensity than the control.
(Cationic substance): 1-methyladenosine, ophthalmic acid, asymmetric dimethylarginine (ADMA)
(Anionic substance): 3-indoxyl sulfate, trans-aconitic acid, cis-aconitic acid
染色体優性多発性嚢胞腎において蓄積する腎不全物質の同定
１４週齢の野生型ラット（ｎ＝５）、及び、藤田保健衛生大学から入手した１４週齢の染色体優性多発性嚢胞腎モデルラット（Ｈａｎ：ＳＰＲＤ Ｃｙ／＋ラット、ｎ＝５）から血漿サンプルを採取し、内標準物質を調整したメタノール溶液を添加して撹拌し、さらにクロロホルムを加えて撹拌し、４６００ｇで５分間遠心分離した後、上清を限外ろ過フィルター（分画分子量５０００）にとり、４℃、９１００ｇで２時間遠心分離した後、ろ液を遠心濃縮してＣＥ−ＴＯＦＭＳにて測定を行った。その際、６９種類の陽イオンと５９種類の陰イオンを網羅的に同時測定し、Ｃｙ／＋ラットにおいて野生型ラットと比較して有意に（Ｐ＜０．０５）蓄積する腎不全物質を同定した（表４）。
Identification of renal failure substance accumulated in chromosome dominant polycystic kidney 14-week-old wild type rat (n = 5) and 14-week-old chromosome dominant polycystic kidney model rat (Han) obtained from Fujita Health University : SPRD Cy / + rat, n = 5), a plasma sample was collected, a methanol solution prepared with an internal standard was added and stirred, chloroform was further added and stirred, and centrifuged at 4600 g for 5 minutes. The supernatant was placed in an ultrafiltration filter (fraction molecular weight 5000), centrifuged at 4 ° C. and 9100 g for 2 hours, the filtrate was concentrated by centrifugation, and measured by CE-TOFMS. At that time, 69 cations and 59 anions were comprehensively measured at the same time to identify renal failure substances that accumulate significantly (P <0.05) in Cy / + rats compared to wild-type rats. (Table 4).
その結果、以下のカチオン性物質及びアニオン性物質が、染色体優性多発性嚢胞腎において蓄積する腎不全物質であることが示された。
（カチオン性物質）：クレアチニン、３−メチルヒスチジン、アラントイン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒドロキシプロリン、シトルリン、メチオニンスルホキシド、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、グアニジノコハク酸
（アニオン性物質）：クエン酸、シス−アコニット酸、イソクエン酸、３−インドキシル硫酸、トランス−アコニット酸、イセチオネート、ピメリン酸、馬尿酸
As a result, the following cationic substances and anionic substances were shown to be renal failure substances that accumulate in chromosomal dominant polycystic kidneys.
(Cationic substance): Creatinine, 3-methylhistidine, allantoin, trimethylamine-N-oxide, hydroxyproline, citrulline, methionine sulfoxide, asymmetric dimethylarginine (ADMA), N, N-dimethylglycine, guanidinosuccinic acid (anionic) Substance): citric acid, cis-aconitic acid, isocitric acid, 3-indoxyl sulfate, trans-aconitic acid, isethionate, pimelic acid, hippuric acid
本発明により、尿毒症及び酸化ストレス惹起、並びに、染色体優性多発性嚢胞腎発症に関与する物質の挙動に基づき透析膜の性能評価ができる。その結果、より尿毒症発症を低減させることのできる高性能の透析膜を開発することが可能になり、長期透析患者のＱＯＬ向上につながる。 According to the present invention, it is possible to evaluate the performance of a dialysis membrane based on the behavior of substances involved in uremia, oxidative stress induction, and chromosome dominant polycystic kidney disease. As a result, it becomes possible to develop a high-performance dialysis membrane that can further reduce the onset of uremia, leading to improvement in QOL of long-term dialysis patients.
Claims (9)
（カチオン性物質）：クレアチニン、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、グアニジノコハク酸、シトルリン、１−メチルアデノシン、Ｎ−アセチルグルコサミン、γ−ブチロベタイン、オフタルミン酸、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、アラントイン、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ−ε−アセチルリジン、キヌレニン、シトシン、インドール−３−酢酸、ヒポタウリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、７−メチルグアニン、メチオニンスルホキシド、アスパラギン
（アニオン性物質）：イセチオネート、グルコン酸、トランス−アコニット酸、ピメリン酸、３−インドキシル硫酸、イソクエン酸、Ｎ−アセチル−β−アラニン、Ｎ−アセチルグルタミン酸、セバシン酸、４−オキソペンタン酸、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸、アジピン酸、シトラリンゴ酸、２−イソプロピルリンゴ酸、トレオン酸、馬尿酸、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸、オキサミン酸、グルタル酸、アゼライン酸、フタル酸、クエン酸、マロン酸、シトラコン酸、キナ酸、コハク酸、システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸 A step of detecting or quantifying one or more renal failure substances selected from the group consisting of the following cationic substances and anionic substances present in a test blood sample after hemodialysis, and kidney after hemodialysis; A method for evaluating a dialysis membrane, comprising a step of evaluating the ability of a dialysis membrane to remove a renal dysfunction material based on a detection result or a quantitative result of the dysfunction material.
(Cationic substance): Creatinine, symmetric dimethylarginine (SDMA), guanidinosuccinic acid, citrulline, 1-methyladenosine, N-acetylglucosamine, γ-butyrobetaine, ophthalmic acid, 3-methylhistidine, hydroxyproline, trimethylamine-N -Oxide, allantoin, asymmetric dimethylarginine (ADMA), N-ε-acetyllysine, kynurenine, cytosine, indole-3-acetic acid, hypotaurine, N, N-dimethylglycine, 7-methylguanine, methionine sulfoxide, asparagine (anion) Active substance): isethionate, gluconic acid, trans-aconitic acid, pimelic acid, 3-indoxyl sulfate, isocitric acid, N-acetyl-β-alanine, N-acetylglutamic acid, sebacic acid, 4 Oxopentanoic acid, cis-aconitic acid, homovanillic acid, adipic acid, citralmalic acid, 2-isopropylmalic acid, threonic acid, hippuric acid, N-acetylaspartic acid, 4-hydroxy-3-methoxymandelic acid, oxamic acid, glutar Acid, azelaic acid, phthalic acid, citric acid, malonic acid, citraconic acid, quinic acid, succinic acid, cysteine-S-sulfuric acid, 4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid
（カチオン性物質）：１−メチルアデノシン、インドール−３−酢酸
（アニオン性物質）：システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸、マロン酸、シトラコン酸、３−インドキシル硫酸 The dialysis membrane according to any one of claims 1 to 4, wherein the renal failure substance is one or more uremic substances selected from the group consisting of the following cationic substances and anionic substances. Evaluation methods.
(Cationic substance): 1-methyladenosine, indole-3-acetic acid (anionic substance): cysteine-S-sulfuric acid, 4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid, malonic acid, citraconic acid, 3-indoxyl sulfate
（カチオン性物質）：１−メチルアデノシン、オフタルミン酸、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）
（アニオン性物質）：３−インドキシル硫酸、トランス−アコニット酸、シス−アコニット酸 The dialysis membrane according to any one of claims 1 to 4, wherein the renal failure substance is one or more oxidative stress-inducing substances selected from the group consisting of the following cationic substances and anionic substances: Evaluation method.
(Cationic substance): 1-methyladenosine, ophthalmic acid, asymmetric dimethylarginine (ADMA)
(Anionic substance): 3-indoxyl sulfate, trans-aconitic acid, cis-aconitic acid
（カチオン性物質）：クレアチニン、３−メチルヒスチジン、アラントイン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒドロキシプロリン、シトルリン、メチオニンスルホキシド、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、グアニジノコハク酸
（アニオン性物質）：クエン酸、シス−アコニット酸、イソクエン酸、３−インドキシル硫酸、トランス−アコニット酸、イセチオネート、ピメリン酸、馬尿酸 The renal failure substance is a substance that accumulates in one or more chromosomal dominant polycystic kidneys selected from the group consisting of the following cationic substances and anionic substances: The evaluation method of the dialysis membrane in any one.
(Cationic substance): Creatinine, 3-methylhistidine, allantoin, trimethylamine-N-oxide, hydroxyproline, citrulline, methionine sulfoxide, asymmetric dimethylarginine (ADMA), N, N-dimethylglycine, guanidinosuccinic acid (anionic) Substance): citric acid, cis-aconitic acid, isocitric acid, 3-indoxyl sulfate, trans-aconitic acid, isethionate, pimelic acid, hippuric acid
（カチオン性物質）：非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、インドール−３−酢酸
（アニオン性物質）：ピメリン酸、アジピン酸、馬尿酸、グルタル酸、アゼライン酸、フタル酸、マロン酸 The dialysis according to any one of claims 1 to 4, wherein the renal insufficiency substance is one or two or more dialysis difficult removal substances selected from the group consisting of the following cationic substances and anionic substances. Evaluation method of membrane.
(Cationic substance): asymmetric dimethylarginine (ADMA), indole-3-acetic acid (anionic substance): pimelic acid, adipic acid, hippuric acid, glutaric acid, azelaic acid, phthalic acid, malonic acid
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010261678A JP2012112785A (en) | 2010-11-24 | 2010-11-24 | Evaluation method of dialysis membrane |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010261678A JP2012112785A (en) | 2010-11-24 | 2010-11-24 | Evaluation method of dialysis membrane |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2012112785A true JP2012112785A (en) | 2012-06-14 |
Family
ID=46497155
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010261678A Pending JP2012112785A (en) | 2010-11-24 | 2010-11-24 | Evaluation method of dialysis membrane |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2012112785A (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012189472A (en) * | 2011-03-11 | 2012-10-04 | Terumo Corp | Damage detection method of internal organ or tissue |
| CN108362752A (en) * | 2018-02-11 | 2018-08-03 | 河南工业大学 | A kind of whole-cell biological electrochemical sensor of detection trimethylamine oxide |
| JP2020073927A (en) * | 2013-09-05 | 2020-05-14 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッドＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． | Detection method for kidney disease |
| US11422136B2 (en) | 2017-10-19 | 2022-08-23 | Idexx Laboratories, Inc. | Detection of symmetrical dimethylarginine |
| US11913942B2 (en) | 2015-02-20 | 2024-02-27 | Idexx Laboratories, Inc. | Homogenous immunoassay with compensation for background signal |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009525276A (en) * | 2006-01-30 | 2009-07-09 | グロボアジア エルエルシー | Treatment of chronic kidney disease |
-
2010
- 2010-11-24 JP JP2010261678A patent/JP2012112785A/en active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009525276A (en) * | 2006-01-30 | 2009-07-09 | グロボアジア エルエルシー | Treatment of chronic kidney disease |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JPN6014030955; 佐中 孜， 川島 洋一郎， 田中 好子， 杉野 信博: '「長期血液透析中の慢性腎不全患者における蛋白結合性尿毒症毒素としてのインドキシルサルフェイトならびに' 日本透析療法学会雑誌 Ｖｏｌ． ２２， Ｎｏ． １, 1989, ｐ． ７１-７５ * |
| JPN6014030958; Ｔａｋａｆｕｍｉ Ｔｏｙｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．: '"Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｕｒｅｍｉｃ ｓｏｌｕｔｅｓ ｉｎ ＣＫＤ ｐａｔｉｅｎｔｓ"' Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ． ３３， Ｎｏ． ９, 201009, ｐ． ９４４-９５２, ｎａｔｕｒｅ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｇｒｏｕｐ * |
| JPN6015008943; 高橋 淳子: '「血液透析器の溶質除去特性と生体適合性 -透析器膜素材の影響について-」' 昭和医学会雑誌 Ｖｏｌ． ５３， Ｎｏ． ５, 199310, ｐ． ４６５-４７５ * |
| JPN6015008944; 中道 崇， 伊藤 貞嘉: '「慢性腎臓病」' 日本臨牀 Ｖｏｌ． ６７， Ｎｏ． ４, 20090401, ｐ． ７８３-７８７, 株式会社日本臨牀社 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012189472A (en) * | 2011-03-11 | 2012-10-04 | Terumo Corp | Damage detection method of internal organ or tissue |
| JP2020073927A (en) * | 2013-09-05 | 2020-05-14 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッドＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． | Detection method for kidney disease |
| US11035861B2 (en) | 2013-09-05 | 2021-06-15 | Idexx Laboratories, Inc. | Methods for detecting renal disease |
| US11913942B2 (en) | 2015-02-20 | 2024-02-27 | Idexx Laboratories, Inc. | Homogenous immunoassay with compensation for background signal |
| US11422136B2 (en) | 2017-10-19 | 2022-08-23 | Idexx Laboratories, Inc. | Detection of symmetrical dimethylarginine |
| CN108362752A (en) * | 2018-02-11 | 2018-08-03 | 河南工业大学 | A kind of whole-cell biological electrochemical sensor of detection trimethylamine oxide |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230243752A1 (en) | System and method for monitoring the health of dialysis patients | |
| TWI713488B (en) | Analytical method for the components of diluted living samples | |
| JP2012112785A (en) | Evaluation method of dialysis membrane | |
| JP5832425B2 (en) | Markers for kidney disease diagnosis and use thereof | |
| KR20140076571A (en) | Method for monitoring, diagnosis and/or prognosis of acute kidney injury in early stage | |
| Sato et al. | Shortened red blood cell lifespan is related to the dose of erythropoiesis‐stimulating agents requirement in patients on hemodialysis | |
| JP6762529B2 (en) | Pathophysiology biomarkers of kidney disease | |
| KR101848527B1 (en) | A method and device for determining content of the middle and protein bound uremic toxins in a biological fluid | |
| Lin et al. | Serum concentration of p-cresol and indoxyl sulfate in elderly hemodialysis patients | |
| CA2910773A1 (en) | Method for determining free copper | |
| Vanholder et al. | From uremic toxin retention to removal by convection: do we know enough? | |
| JP6779776B2 (en) | Oxidized HDL measurement method and oxidized HDL measurement kit | |
| JP5717128B2 (en) | Chromosomal dominant polycystic kidney determination method and prophylactic / therapeutic drug screening method | |
| JPWO2011027573A1 (en) | A new marker for renal disease in humans | |
| WO2007125338A1 (en) | Immunoglobulin free light chain assay | |
| Mortada et al. | Impact of dialyzer membrane flux on metal clearance in hemodialysis patients | |
| Hassan et al. | Serum level of zinc and copper as predictors of severity of depression in chronic hemodialysis patients | |
| LAURI | Elimination of Uremic Toxins during Dialysis assessed with the Optical and Analytical Methods | |
| Kalle et al. | Fluorescence of beta-2-microglobulin in the spent dialysate | |
| Tanaka | MO450 ANEMIC PATIENTS WITH ELEVATED RED CELL DISTRIBUTION WIDTH (RDW) ARE LIKELY TO HAVE FASTER FUTURE CKD PROGRESSION | |
| Niepolski et al. | Association of Circulating Endothelial Nitric Oxide Synthase Levels with Phosphataemia in Patients on Haemodialysis | |
| Borrego-Utiel et al. | MO449 VALIDATION OF MAYO CLINIC CLASSIFICATION AS A PREDICTOR OF FUTURE RENAL FUNCTION IMPAIRMENT IN PATIENTS WITH AUTOSOMAL POLYCYSTIC KIDNEY DISEASE (ADPKD) IN A POPULATION IN THE SOUTH OF SPAIN | |
| Schunk et al. | MO451 GUANIDINYLATED APOLIPOPROTEIN C3 (APOC3) A NOVEL PLAYER IN CKD AND CKD-ASSOCIATED CARDIOVASCULAR DISEASES | |
| Fanchini et al. | Uremic toxins, inflammation biomarkers and hepcidin in older CKD patients switched from high flux HD to OL-HDF | |
| Metzinger | MO448 MICRORNAS IMPLICATED IN CHRONIC KIDNEY DISEASE |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20131017 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20140625 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140724 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140922 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150305 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20150818 |