JP2006122518A - Composition for forming bone or periodontium - Google Patents

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Minoru Ueda
実 上田
Yoichi Yamada
陽一 山田
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Nagoya University NUC
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a composition for use in establishing clinically applicable reconstruction (regeneration) of a bone or periodontium. <P>SOLUTION: This composition for forming the bone or periodontium is composed of a combination of platelet-rich plasma (PRP) of a predetermined concentration rate and cells with osteogenic ability. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、骨組織又は歯周組織の修復又は再生(再建)に利用できる組成物に関する。   The present invention relates to a composition that can be used for repair or regeneration (reconstruction) of bone tissue or periodontal tissue.

頭蓋顎顔面外科、形成外科、及び整形外科領域において、骨欠損の再建・修復を目的として数多くの研究が行われてきた。しかし、軟組織及び硬組織の両者に関して、生体適合性材料の使用及び調製には臨床上解決すべき問題が残っている。これまで、脂肪、筋膜、骨片を含む切除自己組織が頻用されてきた。しかしながら、これまでの治療法は個別の問題を抱えるものであった。適切な自己材料はその供給量が限られ、ドナーサイトの罹患性があり、時折、組織質が低いため又は移植片として成形することが困難なために目的の再建術に十分ではない。他家材料であってもドナー不足からその供給量が限られる。一方、人工修復物の使用は感染に対する感受性を増大させ、周囲への侵襲、及び宿主生理機能との長期的な相互作用が不明であるという問題も伴う。
器官臓器移植におけるこれらの問題を解決する手段として、Vacantiら(非特許文献1〜3)は、単離された細胞に生体適合性スキャフォールドと成長因子を組み合わせて形成される構築物を使用して新生組織の形態形成を伴う、“組織工学”と呼ばれる新規技術を提唱した。この技術では通常、細胞−スキャフォールド構築物の観血的移植を要する。この技術を骨芽細胞に適用し、細胞−スキャフォールド構築物を低侵襲性で移植することができるシステムが開発されれば、組織工学の適用範囲は、例えば頭蓋顎顔面再建、形成外科、及び整形外科領域など、多くの領域へと広がる。
Numerous studies have been conducted in the fields of craniofacial surgery, plastic surgery, and orthopedic surgery for the purpose of reconstruction and repair of bone defects. However, for both soft and hard tissues, the use and preparation of biocompatible materials remains a problem to be solved clinically. Until now, resected self-tissues including fat, fascia, and bone fragments have been frequently used. However, conventional treatment methods have individual problems. Appropriate self-materials are not sufficient for targeted reconstruction due to limited supply, susceptibility of donor sites, and sometimes poor tissue quality or difficult to mold as grafts. Even if it is other-family material, the supply amount is limited due to the shortage of donors. On the other hand, the use of artificial restorations increases the susceptibility to infection and is associated with the problem of unknown invasion to the surroundings and long-term interaction with host physiology.
As a means to solve these problems in organ-organ transplantation, Vacanti et al. (1-3) use a construct formed by combining biocompatible scaffolds and growth factors on isolated cells. He proposed a new technique called “tissue engineering” with morphogenesis of new tissue. This technique usually requires open transplantation of cell-scaffold constructs. If this technology is applied to osteoblasts and a system is developed that can be transplanted with minimally invasive cell-scaffold constructs, then the tissue engineering applicability will include, for example, craniofacial reconstruction, plastic surgery, and orthopedics. It spreads to many areas such as the surgical field.

間葉系幹細胞(MSCs)は未分化の細胞として複製することができ、且つ骨、軟骨、脂肪、腱、筋、骨髄間質を含む間葉系組織系列への分化能を有する多能性細胞と考えられており(非特許文献4、5)、組織工学分野における潜在的有用性の高さから広く注目を集めている。
これまでに、MSCsの単独の使用によって骨組織が修復され得ることが示されている(非特許文献5、6)。しかし、欠損部をMSCsのみで充たそうとすれば、非常に多くのMSCsを必要とし、また、骨欠損部にMSCsを維持することは難しい。このような理由から、最近では多くの研究者がスキャフォールドとしてのセラミックスの使用を試みている(非特許文献7)
先行する研究において我々は、MSCsと組み合わせた新規な生体吸収性β三リン酸(β-TCP)のスキャフォールドとしての骨形成能を検討し、ヒドロキシアパタイト(HA)と比較した(非特許文献8)。この研究の結果、このスキャフォールドは骨形成能を有するものの脆弱であり、また、貫通孔の不足、セラミックスの低吸収性、及び骨誘導特性の不在のために新生骨が骨欠損部へ進入することが妨げられてしまうことが判明した。次に我々は、骨粗鬆症、歯周炎、腫瘍切除による骨欠損を治療又は再建するために自己骨を送達することに使用可能な、低侵襲性で且つゼリー状の柔軟性材料を用いた手法を試みた。まず、注入可能なスキャフォールドとしてフィブリン糊を使用した。注入可能なMSCs/β-TCP−フィブリン糊混合物によって、骨芽細胞の良好な移植及び生着に必要な三次元的スキャフォールドを形成することが可能であった(非特許文献9)。骨誘導材料、移植片の凝集剤、及び移植材料としてフィブリンを使用した例が報告されている(非特許文献10、11)。また、自己フィブリン粘着剤内に見出される成長因子の重要性が指摘されている(非特許文献12〜14)。そこで我々は、成長因子と修正自己フィブリン糊の混合物からなる、多血小板血漿(PRP)ゲルを使用することを考えた。PRPゲルは、自己全血を複数の異なる条件で遠心処理して得られる、多血小板血漿とトロンビン及び塩化カルシウムを混合することによって得られる。PRPゲルがフィブリン糊と決定的に相違する点は、血小板が高濃度で存在すること、及び本来のフィブリノーゲン濃度があることである。血小板は、トロンビンの存在下でひとたび活性化されれば、無数の因子を放出し、フィブリン塊を形成することによってスキャフォールドを形成し機能するのである。PRPを使用することには、骨再生の増強及び促進、より迅速で且つ予測可能な軟組織治癒等、いくつかの利点がある。モノクローナル技術の使用によって、トランスフォーミング成長因子β1(TGF-β1)、トランスフォーミング成長因子β2(TGF-β2)及び血小板由来成長因子(PDGF)の受容体が髄様骨内に見つかっている(非特許文献12〜14)。モノクローナル抗体を使用した研究によって、高濃度のPDGF及びTGF-βが血漿中に存在することが示され、これによってこれらの因子が、自己フィブリンを得ることに使用した元の血漿中に存在することが証明された。
尚、本出願に関連する技術が国際公開第02/17983号パンフレット及び国際公開第02/40071号パンフレットに開示される(特許文献1、2)。
Mesenchymal stem cells (MSCs) can be replicated as undifferentiated cells and have the ability to differentiate into mesenchymal tissue lineages including bone, cartilage, fat, tendon, muscle, and bone marrow stroma (Non-Patent Documents 4 and 5), and has attracted widespread attention because of its high potential utility in the field of tissue engineering.
So far, it has been shown that bone tissue can be repaired by using MSCs alone (Non-Patent Documents 5 and 6). However, if an attempt is made to fill the defect with only MSCs, a very large number of MSCs are required, and it is difficult to maintain MSCs in the bone defect. For these reasons, many researchers have recently attempted to use ceramics as a scaffold (Non-patent Document 7).
In the previous study, we investigated the bone-forming ability of a new bioresorbable β-triphosphate (β-TCP) combined with MSCs as a scaffold and compared it with hydroxyapatite (HA) (Non-patent Document 8). ). As a result of this study, this scaffold has the ability to form bone, but is fragile, and new bone enters bone defects due to lack of through-holes, low absorbency of ceramics, and absence of osteoinductive properties It turned out that things were disturbed. Next, we use a minimally invasive and jelly-like flexible material that can be used to deliver autologous bone to treat or reconstruct bone defects due to osteoporosis, periodontitis, and tumor resection. Tried. First, fibrin glue was used as an injectable scaffold. With the injectable MSCs / β-TCP-fibrin glue mixture, it was possible to form a three-dimensional scaffold necessary for good transplantation and engraftment of osteoblasts (Non-patent Document 9). Examples using osteoinductive materials, graft flocculants, and fibrin as a graft material have been reported (Non-Patent Documents 10 and 11). In addition, the importance of growth factors found in self-fibrin adhesives has been pointed out (Non-Patent Documents 12 to 14). We therefore considered using a platelet rich plasma (PRP) gel consisting of a mixture of growth factors and modified self-fibrin glue. PRP gels are obtained by mixing platelet-rich plasma with thrombin and calcium chloride, obtained by centrifuging autologous whole blood under a number of different conditions. The critical difference between PRP gels and fibrin glue is that platelets are present at high concentrations and that there is an original fibrinogen concentration. Platelets, once activated in the presence of thrombin, form a scaffold by releasing a myriad of factors and forming a fibrin clot. Using PRP has several advantages, such as enhanced and accelerated bone regeneration, faster and predictable soft tissue healing. Receptors for transforming growth factor β1 (TGF-β1), transforming growth factor β2 (TGF-β2), and platelet-derived growth factor (PDGF) have been found in medullary bone through the use of monoclonal technology (non-patented) References 12-14). Studies using monoclonal antibodies show that high concentrations of PDGF and TGF-β are present in the plasma, so that these factors are present in the original plasma used to obtain self-fibrin. Proved.
In addition, the technique relevant to this application is disclosed by the international publication 02/17983 pamphlet and the international publication 02/40071 pamphlet (patent documents 1, 2).

国際公開第02/17983号パンフレットInternational Publication No. 02/17983 Pamphlet 国際公開第02/40071号パンフレットInternational Publication No. 02/40071 pamphlet Langer, R., and Vacanti, J.P. Tissue engineering. Science 260, 920, 1993.Langer, R., and Vacanti, J.P.Tissue engineering.Science 260, 920, 1993. Vacanti, J.P., Morse, M.A., Saltzman, W.M., Domb, A.J., Perez-Atayde, A., and Langer, R. Selective cell transplantation using bioabsorbable artificial polymers as matrices. J Pediatr Surg 23, 3, 1988.Vacanti, J.P., Morse, M.A., Saltzman, W.M., Domb, A.J., Perez-Atayde, A., and Langer, R. Selective cell transplantation using bioabsorbable artificial polymers as matrices.J Pediatr Surg 23, 3, 1988. Vacanti, J.P. Beyond transplantation. Arch. Surg 123, 545, 1998.Vacanti, J.P. Beyond transplantation. Arch. Surg 123, 545, 1998. Pittenger, M.F., Mackay, A.M., Beck, C.B., Jaiswal, R.K., Douglas, R., Mosca, J.D., Moorman, M.A., Simonetti, D.W., Craig, S., and Marshak, D.R. 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以上の背景の下で本発明は、臨床応用可能な骨又は歯周組織の再建(再生)術を確立すべく、それに使用される組成物、及び当該組成物の利用形態(再建方法等)を提供することを目的とする。   In view of the above background, the present invention provides a composition used for establishing a bone or periodontal tissue reconstruction (regeneration) technique that can be applied clinically, and a use form (such as a reconstruction method) of the composition. The purpose is to provide.

上記目的に鑑み本発明者らは、多血小板血漿(PRP:Platelet-rich Plasma)が新生骨形成を促す可能性を有し、無害性であり、免疫拒絶を受けないのであり、更には創傷治癒を活性化することに注目した。そこで我々は、自己スキャフォルド(足場)としてのPRPに、インビトロで調製した間葉系幹細胞(MSCs)を組み合わせたものを用いて骨形成の促進を図った。尚、骨形成促進効果を、比較対照としてのスキャフォールド単独で使用した場合(PRP群)、自己砕片状海綿骨及び骨髄(PCBM)を使用した場合(PCBM群)と比較した。新生骨の評価には、放射線額的、組織学的解析、及び組織形態計測学的解析を用いた。組織学的観察の結果、移植2週後及び4週後において、コントロール群(欠損のみ)、PRP群、及びPCBM群と比較して、イヌMSCsとPRPの組み合わせを用いた群(dMSCs/PRP群)では良好な成熟骨の形成及び血管新生を認めた。組織形態計測的評価の結果、処置8週後において各群の新生骨の面積は、18.3±4.84%(コントロール群)、29.2±5.47%(PRP群)、61.4±3.38%(PCBM群)、及び67.3±2.06%(dMSCs/PRP群)であり、PCBM群、dMSCs/PRP群、及びコントロール群の間に有意差が認められた。
これらの結果から、間葉系幹細胞とPRPの混合物が骨再生(再建)用の材料として極めて有用であることが示された。一方で、使用するPRPの血小板濃縮率(血小板濃度)に注目し、これを検討したところ、骨再生効果が血小板濃縮率(血小板濃度)に依存することが判明した。即ち、所定の血小板濃縮率(血小板濃度)を有するPRPを使用することが、高い骨再生効果を得るために重要であるとの知見が得られた。
本発明は以上の知見を基に完成されたものであって、以下の構成を提供する。
即ち本発明は、血小板濃縮率が約150%〜約1500%範囲にある、多血小板血漿(PRP)と、骨形成能を有する細胞と、を含んでなる骨又は歯周組織形成用の組成物である。骨形成能を有する細胞としては、好ましくは、骨系細胞へと分化誘導された間葉系幹細胞が使用される。
本発明の他の一態様では、血小板濃縮率が約300%〜約600%の範囲にある、多血小板血漿を用いて組成物が構成される。
また、本発明の一態様では、組成物の血小板濃度が約200,000個/μL〜約6,150,000個/μLの範囲にある。
本発明の更なる一態様では、多血小板血漿(PRP)と、骨形成能を有する細胞とからのみ実質的に構成された骨又は歯周組織形成用の組成物が提供される。
本発明の一態様では、明の骨又は歯周組織形成用組成物は、ゲル化材料をさらに含む、骨又は歯周組織形成用の組成物が提供される。ゲル化材料としては、トロンビン及び塩化カルシウムを用いることができる。
本発明の組成物は、使用時において注入容器を用いて注入可能な流動性を有することが好ましい。また、本発明の組成物は、一旦凍結状態にした後、使用時に凍結状態から解凍して使用することができる。
歯科インプラント、歯周病、嚢胞、抜歯窩、骨延長部、又は顎裂部骨移植部位等用として、本発明の組成物を提供することができる。
本発明は他の形態として、上記組成物を注入容器に封入してなる骨又は歯周組織形成用注射剤を提供する。
In view of the above object, the present inventors have found that platelet rich plasma (PRP) has the potential to promote new bone formation, is harmless, does not undergo immune rejection, and further wound healing. Focused on activating. Therefore, we promoted bone formation using PRP as a self-scaffold (scaffold) combined with mesenchymal stem cells (MSCs) prepared in vitro. In addition, the osteogenesis promoting effect was compared with the case where the scaffold alone was used as a comparative control (PRP group), and the case where autoclastic cancellous bone and bone marrow (PCBM) were used (PCBM group). Radiation amount, histological analysis, and histomorphometric analysis were used for evaluation of new bone. As a result of histological observation, the group using a combination of canine MSCs and PRP (dMSCs / PRP group) compared with the control group (deletion only), PRP group, and PCBM group at 2 weeks and 4 weeks after transplantation ) Showed good mature bone formation and angiogenesis. As a result of histomorphometric evaluation, the area of new bone in each group after 8 weeks of treatment was 18.3 ± 4.84% (control group), 29.2 ± 5.47% (PRP group), 61.4 ± 3.38% (PCBM group), and It was 67.3 ± 2.06% (dMSCs / PRP group), and a significant difference was recognized among the PCBM group, the dMSCs / PRP group, and the control group.
From these results, it was shown that a mixture of mesenchymal stem cells and PRP is extremely useful as a material for bone regeneration (reconstruction). On the other hand, focusing on the platelet concentration rate (platelet concentration) of the PRP used, and examining this, it was found that the bone regeneration effect depends on the platelet concentration rate (platelet concentration). That is, it was found that the use of PRP having a predetermined platelet concentration rate (platelet concentration) is important for obtaining a high bone regeneration effect.
The present invention has been completed based on the above findings, and provides the following configurations.
That is, the present invention provides a composition for forming bone or periodontal tissue, comprising platelet-rich plasma (PRP) having a platelet concentration rate in the range of about 150% to about 1500% and cells having osteogenic potential. It is. As the cells having bone forming ability, mesenchymal stem cells induced to differentiate into bone cells are preferably used.
In another aspect of the invention, the composition is composed of platelet rich plasma having a platelet concentration in the range of about 300% to about 600%.
In one embodiment of the present invention, the platelet concentration of the composition is in the range of about 200,000 / μL to about 6,150,000 / μL.
In a further aspect of the present invention, there is provided a composition for forming bone or periodontal tissue substantially composed only of platelet-rich plasma (PRP) and cells capable of osteogenesis.
In one aspect of the present invention, a composition for forming a bone or periodontal tissue is provided, which further comprises a gelling material. As the gelling material, thrombin and calcium chloride can be used.
The composition of the present invention preferably has fluidity that can be injected using an injection container at the time of use. The composition of the present invention can be used after being frozen once and then thawed from the frozen state at the time of use.
The composition of the present invention can be provided for use in dental implants, periodontal diseases, cysts, extraction sockets, bone extensions, or cleft bone graft sites.
As another form of the present invention, there is provided an injection for forming bone or periodontal tissue, wherein the composition is sealed in an injection container.

本発明の組成物を適用すれば、骨(又は歯周組織)欠損部において良好な骨再生(再建)が促される。具体的には、骨系細胞の増殖、分化促進効果を有する成長因子を豊富に含むPRPを含有することによって、これらの成長因子により、適用部位(移植部)において効果的な骨組織(又は歯周組織)の再生が期待できる。また、本発明の組成物では、骨形成能を有する細胞を含有することによって、当該細胞による積極的な骨組織(又は歯周組織)の再生を期待できる。
さらに以上の構成によれば、使用時において流動性を有する状態に移植材料を調製することが可能であるから、骨(又は歯周組織)欠損部の形状に合わせて予め成型する必要がなく汎用的であり、その取り扱いも容易である。
加えて本発明によれば、自家骨を採取することなく骨(又は歯周組織)欠損部の修復、再建を行うことができることから、施術に伴う患者への負担を軽減できる。
このように、本発明の組成物は骨(又は歯周組織)再生用の材料として極めて有用である。
By applying the composition of the present invention, good bone regeneration (reconstruction) is promoted in a bone (or periodontal tissue) defect portion. Specifically, by containing PRP containing abundant growth factors that have bone cell proliferation and differentiation promoting effects, these growth factors enable effective bone tissue (or teeth) at the application site (transplant). Regeneration of the surrounding organization can be expected. Moreover, in the composition of this invention, the reproduction | regeneration of the positive bone tissue (or periodontal tissue) by the said cell can be anticipated by containing the cell which has bone formation ability.
Furthermore, according to the above configuration, since it is possible to prepare the transplant material in a fluid state at the time of use, there is no need to mold it in advance according to the shape of the bone (or periodontal tissue) defect part. It is easy to handle.
In addition, according to the present invention, since a bone (or periodontal tissue) defect can be repaired and reconstructed without collecting autologous bone, the burden on the patient associated with the treatment can be reduced.
Thus, the composition of the present invention is extremely useful as a material for bone (or periodontal tissue) regeneration.

本発明では、多血小板血漿(PRP)と、骨形成能を有する細胞とを組み合わせて骨又は歯周組織形成用の組成物が構築される。
ここで「多血小板血漿」とは、PRP(Platelet-rich Plasma)であって、即ち血小板を豊富に含む血漿である。換言すれば、血小板が濃縮された血漿のことをいう。PRPは、例えば、Whitmanらの方法(Dean H. Whitman et al.:J Oral Maxillofac Surg,55,1294-1299 (1997))に準じて、採取した血液を遠心分離処理に供することにより調製することができる。PRPは、Platelet-derived Growth Factor(PDGF)、Transforming growth factor β1(TGF−β1)、Transforming growth factor β2(TGF−β2)等の成長因子を豊富に含むことが知られている(Jarry J. Peterson:Oral surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,85,638-646(1998))。
In the present invention, a composition for forming bone or periodontal tissue is constructed by combining platelet-rich plasma (PRP) and cells having osteogenic ability.
Here, “platelet-rich plasma” is PRP (Platelet-rich Plasma), that is, plasma rich in platelets. In other words, it refers to plasma in which platelets are concentrated. PRP is prepared, for example, by subjecting the collected blood to centrifugation according to the method of Whitman et al. (Dean H. Whitman et al .: J Oral Maxillofac Surg, 55, 1294-1299 (1997)). Can do. PRP is known to contain abundant growth factors such as Platelet-derived Growth Factor (PDGF), Transforming growth factor β1 (TGF-β1), Transforming growth factor β2 (TGF-β2) (Jarry J. Peterson : Oral surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 85, 638-646 (1998)).

ここで、PRPの調製方法の一例を示せば、まず、採取した血液にクエン酸ナトリウム等の凝固防止剤を添加し、室温で所定時間放置する。その後、血球及び軟膜が分離する条件(例えば約5,4000rpm)で遠心処理する。これにより、2層(上層はPlatelet-poor Plasmaと呼ばれる。下層には、血球及び軟膜が含まれる)に分離される。上層を取り除いた後、更に、赤血球が分離される条件(例えば、約2,400rpm)で遠心処理する。その結果得られた赤血球を実質的に含まない画分(Platelet-rich Plasma:PRP)を採取する。PRPの調製方法は当該方法に限定されるものではなく、必要に応じて修正を加えた方法により調製することができる。
好ましくは自己血のPRPを用いる。これにより、毒性ないし免疫拒絶反応の恐れがなくなる。
Here, if an example of the preparation method of PRP is shown, first, anticoagulants such as sodium citrate will be added to the collected blood and left at room temperature for a predetermined time. Thereafter, centrifugation is carried out under conditions that separate blood cells and buffy coat (for example, about 54,000 rpm). Thereby, it is separated into two layers (the upper layer is called Platelet-poor Plasma. The lower layer includes blood cells and buffy coat). After removing the upper layer, it is further centrifuged under conditions that separate red blood cells (for example, about 2,400 rpm). The fraction (Platelet-rich Plasma: PRP) substantially free of erythrocytes obtained as a result is collected. The preparation method of PRP is not limited to the said method, It can prepare by the method which added correction as needed.
Preferably, autologous PRP is used. This eliminates the risk of toxicity or immune rejection.

PRPに含まれる血小板の数(血小板濃縮率)についての一般的な定義はないが、採取した血液に比較して約150倍〜約1500倍の血小板を含有する血漿を本発明におけるPRPとして用いることができる。
本発明においてPRPの「血小板濃縮率」は、次の式で表される。
血小板濃縮率(%)=(PRP中の平均血小板数/出発材料である全血中の平均血小板数)×100
従って、例えばPRP中の平均血小板数が1,000,000であって、全血中の平均血小板数が300,000であるときの血小板濃縮率は約333%となる。以下の実施例に示すように、本発明者らの検討の結果、PRPの血小板濃縮率が骨(又は歯周)組織の再生効果と関連性を有することが明らかとなった。そこで、一層高い再生効果を得るべく、血小板濃縮率が約150%〜約1500%(平均血小板数に換算した場合には通常、約240,000個/μL〜約6,150,000個/μLに相当する)の範囲にあるPRPを用いることが好ましく。更に好ましくは血小板濃縮率が約300%〜約600%(平均血小板数に換算した場合には通常、約480,000個/μL〜約2,460,000個/μLに相当する)の範囲にあるPRPを用いる。
PRPを調製する際の遠心処理の条件を適宜調節することによって、所望の血小板濃縮率のPRPを得ることができる。例えば、上記の如き二段階の遠心処理を実施することとし、最初の遠心処理を約500rpm〜約1500rpm(例えば1,100rpm)、約5分間〜約15分間(例えば約5分)の条件で実施し、2段階目の遠心処理を約2000rpm〜約5000rpm(例えば約2,500rpm)、約5分間〜約15分間(例えば約5分)の条件で実施することで、血小板濃縮率が約300%〜約600%の範囲にあるPRPを得ることができる。出発材料である血液や使用する器具の相違によって、同条件で処理したとしても最終的に得られるPRPの血小板濃縮率が変動することが予想されるが、当業者であれば通常、上記条件を考慮しつつ、得られたPRPの血小板濃縮率に基づいて条件の修正を施すことによって、所望の血小板濃縮率のPRPを調製する条件を見出すことができる。
尚、PRPの血小板濃縮率の計測は常法(例えば、実施例に示すように市販のSysmex XE-2100(Sysmex、東京、日本)を使用)を利用して行うことができる。
Although there is no general definition for the number of platelets contained in PRP (platelet concentration rate), plasma containing about 150 to about 1500 times platelets compared to the collected blood is used as PRP in the present invention. Can do.
In the present invention, the “platelet concentration rate” of PRP is represented by the following formula.
Platelet concentration rate (%) = (average platelet count in PRP / average platelet count in whole blood as starting material) x 100
Therefore, for example, when the average platelet count in PRP is 1,000,000 and the average platelet count in whole blood is 300,000, the platelet concentration rate is about 3333%. As shown in the following examples, as a result of the study by the present inventors, it has been clarified that the platelet concentration rate of PRP is related to the bone (or periodontal) tissue regeneration effect. Therefore, in order to obtain a higher regenerative effect, the platelet concentration rate ranges from about 150% to about 1500% (usually equivalent to about 240,000 / μL to about 6,150,000 / μL when converted to the average platelet count). It is preferable to use the PRP. More preferably, PRP having a platelet concentration rate in the range of about 300% to about 600% (usually corresponding to about 480,000 / μL to about 2,460,000 / μL in terms of average platelet count) is used.
A PRP having a desired platelet concentration can be obtained by appropriately adjusting the conditions of the centrifugal treatment in preparing the PRP. For example, the above-described two-stage centrifugation is performed, and the first centrifugation is performed under conditions of about 500 rpm to about 1500 rpm (for example, 1,100 rpm) for about 5 minutes to about 15 minutes (for example, about 5 minutes). By performing the second stage centrifugation under the conditions of about 2000 rpm to about 5000 rpm (eg, about 2,500 rpm) for about 5 minutes to about 15 minutes (eg, about 5 minutes), the platelet concentration rate is about 300% to about A PRP in the 600% range can be obtained. Although it is expected that the platelet concentration rate of the finally obtained PRP will fluctuate even if it is processed under the same conditions due to the difference in the starting material blood and the equipment used, those skilled in the art usually change the above conditions. The conditions for preparing PRP having a desired platelet concentration rate can be found by taking into account the correction of the conditions based on the platelet concentration rate of the obtained PRP.
The platelet concentration rate of PRP can be measured using a conventional method (for example, using commercially available Sysmex XE-2100 (Sysmex, Tokyo, Japan) as shown in the Examples).

本発明の組成物を構築するために使用するPRPの血小板濃縮率は上記の通りであるが、一方で最終的な組成物(本発明の組成物)の血小板濃度は、PRPの血小板濃縮率、PRPとそれに組み合わせる他の成分(即ち、骨形成能を有する細胞等)の使用比率等によって変動するが、例えば約200,000個/μL〜約6,150,000個/μL、好ましくは約480,000個/μL〜約2,460,000個/μLである。このような濃度で血小板を含有することによって、良好な骨(又は歯周組織)再生効果が得られる。尚、例えば血小板濃縮率が約300%〜約600%の範囲にあるPRPを使用すれば、最終的な組成物の血小板濃度を約480,000個/μL〜約2,460,000個/μLの範囲に調整することが可能である。   The platelet concentration rate of PRP used to construct the composition of the present invention is as described above, while the platelet concentration of the final composition (the composition of the present invention) is the platelet concentration rate of PRP, It varies depending on the use ratio of PRP and other components to be combined with it (that is, cells having osteogenic ability, etc.), for example, about 200,000 cells / μL to about 6,150,000 cells / μL, preferably about 480,000 cells / μL to about 2,460,000. Pieces / μL. By containing platelets at such a concentration, a good bone (or periodontal tissue) regeneration effect can be obtained. For example, if PRP with a platelet concentration rate in the range of about 300% to about 600% is used, the platelet concentration of the final composition should be adjusted to a range of about 480,000 / μL to about 2,460,000 / μL. Is possible.

ここで、使用時における本発明の組成物の流動性の程度は特に限定されず、ゲル状、スラリー状、ペースト状、粘土状、高粘度流動体状等とすることができる。好ましくは、ゲル状又はペースト状である。ゲル状又はペースト状とすることにより、可塑性に優れた骨又は歯周組織形成用組成物となる。したがって、予め適用部の形状に成型することなく適用できる。即ち、適用部への適用が容易に行える。また、適用部において定着性の良い骨又は歯周組織形成用組成物となる。
また、使用時において、注入容器を用いて注入可能な程度の流動性であることが好ましい。かかる流動性とすることにより、適用部への適用が一層容易となる。
尚、適用部に応じて所望の流動性とすることができる。例えば、骨膜下に注入する場合には、より流動性を有する状態(粘度の低い状態)にすることが好ましい。
本発明の組成物は、少なくとも使用時において流動性を有しておればよく、使用前においては、粉状ないし固形状であっても良い。したがって、凍結した状態をもって本発明の組成物とすることができる。また、凍結乾燥した状態をもって本発明の組成物とすることもできる。使用前において凍結状態又は凍結乾燥状態とすることにより、長期の保存が可能となり、また、使用前の取り扱いも容易となる。さらには、凍結処理又は凍結乾燥処理により抗原性の低下が期待できるため、自家のPRPではなく同種の他家のPRPを用いた場合の安全性が向上される。
Here, the degree of fluidity of the composition of the present invention at the time of use is not particularly limited, and may be a gel, slurry, paste, clay, high viscosity fluid, or the like. Preferably, it is a gel or paste. By setting it as a gel or paste, the composition for bone or periodontal tissue formation is excellent in plasticity. Therefore, it can be applied without previously forming the shape of the application portion. That is, application to the application unit can be easily performed. Moreover, it becomes the composition for bone or periodontal tissue formation with good fixing property in an application part.
In use, it is preferable that the fluidity is such that it can be injected using an injection container. By setting it as such fluidity | liquidity, the application to an application part becomes still easier.
In addition, it can be set as desired fluidity | liquidity according to an application part. For example, when injecting under the periosteum, it is preferable to have a more fluid state (low viscosity state).
The composition of the present invention only needs to have fluidity at least at the time of use, and may be powdery or solid before use. Therefore, it can be set as the composition of this invention with the frozen state. Moreover, it can also be set as the composition of this invention in the lyophilized | freeze-dried state. By making it frozen or lyophilized before use, long-term storage is possible, and handling before use is also facilitated. Furthermore, since a decrease in antigenicity can be expected by freezing treatment or freeze-drying treatment, safety is improved when using PRP of the same type other than PRP of the home.

本発明において「骨形成能を有する細胞」とは骨組織を形成し得る細胞をいい、骨芽細胞、前骨芽細胞、骨系細胞への分化能を獲得した間葉系幹細胞等が含まる。これらの細胞を任意に組み合わせて用いてもよい。好ましくは、骨形成能を有する細胞として、骨系細胞への分化能を獲得した細胞を用いる。ここで、「骨系細胞への分化能を獲得した」とは、未分化の状態であったものが骨系細胞へ分化すべく方向づけられた状態をいう。
骨系細胞への分化能を獲得した間葉系幹細胞として、自家細胞に限らず、同種由来の他家細胞を用いることができる。特に、人の間葉系幹細胞を用いることができる。
骨系細胞への分化能を獲得した間葉系幹細胞(以下、「骨系分化能獲得細胞」という)は、未分化の間葉系幹細胞を骨系細胞への分化を誘導する条件下で培養することにより調製することができる。例えば、β-グリセロリン酸(β-glycerophosphate)、デキサメタゾン(Dexamethason)、L-アスコルビン酸(L-ascorbic acid)を含む培地で未分化の間葉系細胞を培養することにより、骨系細胞への分化を誘導することができる。もちろん、培養条件はこれに限定されるものではなく、骨系細胞への分化を誘導する条件として公知のものを採用することができる。
In the present invention, “cells having the ability to form bone” refer to cells that can form bone tissue, and include osteoblasts, preosteoblasts, mesenchymal stem cells that have acquired the ability to differentiate into bone cells, and the like. . These cells may be used in any combination. Preferably, cells that have acquired the ability to differentiate into bone cells are used as the cells having the ability to form bone. Here, “obtained the ability to differentiate into bone cells” means a state in which an undifferentiated state is oriented to differentiate into bone cells.
As a mesenchymal stem cell that has acquired differentiation ability into bone cells, not only autologous cells but also allogeneic cells derived from the same species can be used. In particular, human mesenchymal stem cells can be used.
Mesenchymal stem cells that have acquired differentiation ability into bone cells (hereinafter referred to as “bone differentiation ability acquisition cells”) are cultured under conditions that induce differentiation of undifferentiated mesenchymal stem cells into bone cells. Can be prepared. For example, by differentiation of undifferentiated mesenchymal cells in a medium containing β-glycerophosphate, dexamethason, L-ascorbic acid, differentiation into bone cells Can be induced. Of course, culture conditions are not limited to this, and well-known conditions can be adopted as conditions for inducing differentiation into bone cells.

未分化の間葉系幹細胞源としては、骨髄、骨膜、歯髄、さい帯血を挙げることができる。これらを常法に従い採取した後、未分化の間葉系細胞を接着性の有無により選択する。即ち、骨髄等に含まれる細胞の中で接着性を有するものを選択することにより、未分化の間葉系幹細胞が得られる。   Examples of undifferentiated mesenchymal stem cell sources include bone marrow, periosteum, dental pulp, and umbilical cord blood. These are collected according to a conventional method, and then undifferentiated mesenchymal cells are selected based on the presence or absence of adhesion. That is, undifferentiated mesenchymal stem cells can be obtained by selecting cells having adhesiveness among cells contained in bone marrow or the like.

骨系分化能獲得細胞とともに、該細胞の細胞外基質をも加えて本発明の組成物とすることができる。本発明の組成物を適用した部位において、細胞外基質が骨分化能獲得細胞の足場となることが期待され、適用部位において骨分化能獲得細胞が定着し易くなると考えられるからである。また、適用部位周囲に存在する骨系細胞の足場ともなり、高い骨誘導能が期待できるからである。さらに、細胞外基質に含まれるBMP等の因子が、本発明の組成物に含有される骨系分化能獲得細胞自体、及び適用部周囲の骨系細胞ないしは骨系細胞への分化能を備えた幹細胞の成長、増殖、分化を促進することが期待できるからである。ここでの細胞外基質とは、骨系分化能獲得細胞を取り巻いて存在する基質(マトリックス)である。   The composition of the present invention can be prepared by adding the extracellular matrix of the cells together with the bone system differentiation ability cells. This is because the extracellular matrix is expected to be a scaffold for bone differentiation-capable cells at the site to which the composition of the present invention is applied, and it is considered that the bone differentiation-capacity acquired cells are easily established at the application site. It is also a scaffold for bone cells existing around the application site, and high osteoinductive ability can be expected. Furthermore, factors such as BMP contained in the extracellular matrix have the ability to differentiate into bone system cells or bone cells around the application site, as well as the bone system differentiation ability acquiring cells themselves contained in the composition of the present invention. This is because it can be expected to promote the growth, proliferation and differentiation of stem cells. The extracellular matrix here is a matrix (matrix) that exists around cells that acquire bone differentiation ability.

自家細胞の細胞外基質に限らず、同種の他家細胞の細胞外基質を用いることもできる。かかる細胞外基質に含まれるBMP等が同種であるため、他家細胞を用いた場合においても同様の効果が期待できるからである。このように、自家細胞の細胞外基質のみならず、同種細胞の細胞外基質をも用いることができることは、骨系分化能獲得細胞の細胞外基質の調製を容易とするものである。
細胞外基質を加える場合には、同時に加えられる骨系分化能獲得細胞は生細胞でなくても良い。このことは、骨系分化能獲得細胞を生細胞の状態で取り扱わなくても良いことを意味し、取り扱いの観点から望ましいものといえる。例えば、骨系分化能獲得細胞を得た後、凍結乾燥処理等をしたものを用意し、これを骨系分化能獲得細胞及びその細胞外基質として用いることができる。
Not only the extracellular matrix of autologous cells, but also the extracellular matrix of other types of autologous cells can be used. This is because BMP and the like contained in such an extracellular matrix are of the same type, and the same effect can be expected even when other cells are used. Thus, the ability to use not only the extracellular matrix of autologous cells but also the extracellular matrix of allogeneic cells facilitates the preparation of the extracellular matrix of bone system differentiation-acquiring cells.
When an extracellular matrix is added, the bone system differentiation ability-added cells added at the same time may not be living cells. This means that it is not necessary to handle the bone system differentiation ability cells in the state of living cells, which can be said to be desirable from the viewpoint of handling. For example, after obtaining a bone system differentiation ability cell, a cell that has been lyophilized or the like can be prepared and used as the bone system differentiation capacity acquisition cell and its extracellular matrix.

本発明の組成物における骨系分化能獲得細胞の含有量は、組成物1ml中に1×10個以上の細胞が存在することが好ましく、さらに好ましくは1×10〜1×10個の細胞が存在することが好ましい。かかる細胞含有量とすることにより、効果的に骨形成を誘導できるからである。 In the composition of the present invention, the content of bone system differentiation-capable cells is preferably 1 × 10 5 or more, more preferably 1 × 10 6 to 1 × 10 8 cells in 1 ml of the composition. Preferably, there are cells. This is because the bone formation can be effectively induced by setting the cell content.

本発明の組成物は、上記の各成分を混合することにより調製される。調製方法の一例として、PRPと骨形成能を有する細胞とを組合せ、トロンビン及び塩化カルシウム(ゲル化材料)の作用によってゲル状にする場合の手順を簡単に説明する。まず、PRPと骨形成能を有する細胞をそれぞれ調製し、一つの注入容器内に入れる。このとき少量の空気も一緒に入れる。一方で別の注入容器を用意し、この中に塩化カルシウム溶液とトロンビンとの混合液を入れる。次に、これら二つの注入容器をT型連結具で連結した後、両注入容器のプランジャーを交互に押し込む(引き出す)ことで、二つの注入容器内の成分を混合する。所望の流動性(粘度)が得られるまで混合操作を繰り返す。   The composition of this invention is prepared by mixing said each component. As an example of the preparation method, a procedure for combining PRP and cells having osteogenic ability and forming a gel by the action of thrombin and calcium chloride (gelling material) will be briefly described. First, PRP and osteogenic cells are prepared and placed in one injection container. At this time, add a small amount of air. On the other hand, another injection container is prepared, and a mixed solution of calcium chloride solution and thrombin is put therein. Next, after these two injection containers are connected with a T-shaped connector, the plungers of both injection containers are alternately pushed (drawn) to mix the components in the two injection containers. The mixing operation is repeated until the desired fluidity (viscosity) is obtained.

本発明の組成物を、凍結した状態又は凍結乾燥した状態として調製した場合には、使用時に所望の流動性を有する状態にする。凍結状態の場合には、解凍することにより凍結前の状態に戻される。このとき、生理食塩水等を加えて所望の流動性に調整することもできる。他方、凍結乾燥状態の場合には、生理食塩水等の溶媒を加えることにより、凍結乾燥処理前の流動性又は所望の流動性を有する状態にする。   When the composition of the present invention is prepared in a frozen state or a lyophilized state, it is brought into a state having a desired fluidity at the time of use. In the case of a frozen state, the state before freezing is restored by thawing. At this time, physiological fluid etc. can be added and it can also adjust to desired fluidity | liquidity. On the other hand, in the lyophilized state, a solvent such as physiological saline is added to obtain a fluidity before lyophilization treatment or a desired fluidity.

本発明の組成物を注入容器に封入することにより、骨又は歯周組織形成用注射剤(以下、「本発明の注射剤」ともいう)とすることができる。例えば、流動性を有する状態で調製した本発明の組成物を注入容器に封入し、その後凍結又は凍結乾燥させて本発明の注射剤とする。このような注射剤とすることにより、取り扱いが一層容易となる。すなわち、適用時に従来のごとく皮膚又は粘膜に切開を加えることなく経皮的又は経粘膜的に本発明の注射剤を注入することで所望の効果を期待できる。このような注射剤は、その中に封入される骨又は歯周組織形成用組成物を上記同様に所望の流動性を有する状態にした後、使用されるものである。注入容器の種類は特に限定されず、例えば、市販の注射器を用いることができる。   By encapsulating the composition of the present invention in an injection container, an injection for forming bone or periodontal tissue (hereinafter also referred to as “injection of the present invention”) can be obtained. For example, the composition of the present invention prepared in a fluid state is sealed in an injection container and then frozen or lyophilized to obtain the injection of the present invention. By using such an injection, handling becomes easier. That is, the desired effect can be expected by injecting the injection of the present invention transcutaneously or transmucosally without making an incision in the skin or mucous membrane as in the past. Such an injection is used after the bone or periodontal tissue-forming composition enclosed therein is made into a state having a desired fluidity as described above. The kind of injection container is not specifically limited, For example, a commercially available syringe can be used.

以上説明したように、本発明の組成物は多血小板血漿(PRP)と、骨形成能を有する細胞とを組み合わせた点に特徴を有するが、その骨(又は歯周組織)再生効果が保持されることを条件として、他の成分を含有することを妨げない。但し、本発明の好ましい態様では実質的に、多血小板血漿(PRP)と、骨形成能を有する細胞のみ(使用時にはゲル化を促す成分が含有される)から組成物が構成される。
以下に、本発明の組成物において、追加的に組み合わせることが想定され得る成分を列挙する。
As described above, the composition of the present invention is characterized by the combination of platelet-rich plasma (PRP) and cells having bone forming ability, but the bone (or periodontal tissue) regeneration effect is retained. However, it does not prevent other components from being contained. However, in a preferred embodiment of the present invention, the composition is substantially composed of platelet-rich plasma (PRP) and only cells having bone forming ability (containing a component that promotes gelation when used).
The components that can be assumed to be additionally combined in the composition of the present invention are listed below.

(無機系生体吸収性材料)
無機系生体吸収性材料の種類は特に限定されないが、β―リン酸三カルシウム(「β―TCP)、α−リン酸三カルシウム(α−TCP)、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム、及び非結晶質リン酸カルシウムからなる群から選択される材料を用いることができる。これらの材料は単独で用いることができることはもちろんのこと、任意に選択した2種以上を組み合わせて用いても良い。好ましくは、β−TCP又はα−TCPのいずれか、又はこれらを任意の割合で組み合わせて用いる。さらに好ましくはβ−TCPを無機系生体吸収性材料として用いる。
無機系生体吸収性材料は公知の方法により得ることができる。また、市販される無機系生体吸収性材料を用いることもできる。β―TCPとしては、例えば、オリンパス光学工業株式会社製のものを利用できる。
(Inorganic bioabsorbable material)
The type of inorganic bioabsorbable material is not particularly limited, but β-tricalcium phosphate (“β-TCP), α-tricalcium phosphate (α-TCP), tetracalcium phosphate, octacalcium phosphate, and A material selected from the group consisting of amorphous calcium phosphate can be used, and these materials can be used alone or in combination of two or more selected arbitrarily. , Β-TCP, α-TCP, or a combination thereof in any proportion, more preferably β-TCP is used as the inorganic bioabsorbable material.
The inorganic bioabsorbable material can be obtained by a known method. Moreover, a commercially available inorganic bioabsorbable material can also be used. As β-TCP, for example, those manufactured by Olympus Optical Co., Ltd. can be used.

無機系生体吸収性材料は、本発明の組成物が使用時において流動性となるような粒子径を有する粉末状であることが好ましい。
粉末状の無機系生体吸収性材料は、適当な大きさに加工された無機系生体吸収性材料を、所望の粒子径となるまで破砕、粉砕することにより調製することができる。無機系生体吸収性材料の平均粒子径を、0.5μm〜50μmとすることが好ましい。さらに好ましくは、平均粒子径0.5μm〜10μmの無機系生体吸収性材料を用いる。さらにさらに好ましくは、平均粒子径1μm〜5μmの無機系生体吸収性材料を用いる。粒子径の異なる複数種類の無機系生体吸収性材料を組み合わせて用いることも可能である。
無機系生体吸収性材料は本発明の組成物全体に対して30重量%〜75重量%含有することが好ましい。
尚、本発明の組成物の流動性は、無機系生体吸収性材料の粒子径、及び含有率で調製することができ、両者を適宜調整することにより所望の流動性を得ることができる。また、後述の増粘剤を添加する場合には、増粘剤の添加量によっても流動性の調整を行うことができる。
The inorganic bioabsorbable material is preferably in the form of a powder having a particle diameter such that the composition of the present invention becomes fluid when used.
The powdered inorganic bioabsorbable material can be prepared by crushing and pulverizing the inorganic bioabsorbable material processed to an appropriate size until a desired particle diameter is obtained. The average particle diameter of the inorganic bioabsorbable material is preferably 0.5 μm to 50 μm. More preferably, an inorganic bioabsorbable material having an average particle size of 0.5 μm to 10 μm is used. Even more preferably, an inorganic bioabsorbable material having an average particle diameter of 1 μm to 5 μm is used. It is also possible to use a combination of a plurality of types of inorganic bioabsorbable materials having different particle diameters.
The inorganic bioabsorbable material is preferably contained in an amount of 30% to 75% by weight based on the entire composition of the present invention.
In addition, the fluidity | liquidity of the composition of this invention can be adjusted with the particle diameter and content rate of an inorganic type bioabsorbable material, and desired fluidity | liquidity can be obtained by adjusting both suitably. Moreover, when adding the below-mentioned thickener, fluidity | liquidity can be adjusted also with the addition amount of a thickener.

(ゲル化材料)
例えば、トロンビンと塩化カルシウムを添加して本発明の組成物を構成することができる。これらを添加することにより、トロンビンがPRP中のフィブリノーゲンに作用しフィブリンが生ずる。そして、フィブリンの凝集作用により粘性が増加する。ゲル化剤の種類は特に限定されず、上記のようにPRP中の成分に作用して粘性を増加させるもの、又はそれ自身により増粘効果を奏するものを適宜選択して用いることができる。
また、上記のゲル化材料に加えて、適用後(移植後)に作用して本発明の組成物の流動性(粘度)を変化させる第2のゲル化材料を併用することもできる。このような構成とすれば、使用時には適度な流動性を有するために移植が容易であり、かつ、適用後にはより粘度が増すことにより適用部位における定着性が向上し、骨又は歯周組織の修復又は再生を効果的に行うことができる。また、予め適用部位の形状に成型する必要がなく、汎用性が高い。
ゲル化材料は、生体親和性が高いものを用いることが好ましく、上記の例の他、コラーゲン又はフィブリン糊等を用いることができる。コラーゲンとしては種々のものを選択して用いることができるが、本発明の組成物の適用目的(適用組織)に適したものを採用することが好ましい。骨組織の再生を目的とする場合には、例えば、I型コラーゲンを用いることができる。用いるコラーゲンは可溶性(酸可溶性コラーゲン、アルカリ可溶性コラーゲン、酵素可溶性コラーゲン等)であることが好ましい。
(Gelling material)
For example, thrombin and calcium chloride can be added to form the composition of the present invention. By adding these, thrombin acts on fibrinogen in PRP to produce fibrin. And viscosity increases by the aggregation action of fibrin. The type of the gelling agent is not particularly limited, and those that act on the components in PRP to increase the viscosity as described above or those that exhibit a thickening effect by themselves can be appropriately selected and used.
In addition to the gelling material described above, a second gelling material that acts after application (after transplantation) to change the fluidity (viscosity) of the composition of the present invention can also be used in combination. With such a configuration, since it has appropriate fluidity at the time of use, it is easy to transplant, and after application, the viscosity increases to improve the fixability at the application site, and the bone or periodontal tissue Repair or regeneration can be performed effectively. Moreover, it is not necessary to mold into the shape of the application site in advance, and versatility is high.
As the gelling material, a material having high biocompatibility is preferably used, and collagen or fibrin glue or the like can be used in addition to the above examples. Various types of collagen can be selected and used, but it is preferable to employ one suitable for the application purpose (application tissue) of the composition of the present invention. For the purpose of regenerating bone tissue, for example, type I collagen can be used. The collagen used is preferably soluble (acid-soluble collagen, alkali-soluble collagen, enzyme-soluble collagen, etc.).

(増粘剤)
増粘剤を添加することにより、本発明の組成物の流動性を調整することもできる。増粘剤としては、アルギン酸ナトリウム等の増粘多糖類、グリセリン、ワセリン等を用いることができるが、安全性及び/又は骨形成能の観点から、生体親和性が高く、かつ生体吸収性又は生体分解性のものを用いることが好ましい。グリセリン等を添加することにより、凍害防止の効果も得られる。
(Thickener)
The fluidity of the composition of the present invention can be adjusted by adding a thickener. As the thickener, thickening polysaccharides such as sodium alginate, glycerin, petrolatum and the like can be used, but from the viewpoint of safety and / or bone forming ability, the biocompatibility is high and the bioabsorbable or biocompatible It is preferable to use a decomposable one. By adding glycerin or the like, the effect of preventing frost damage can be obtained.

(溶媒)
本発明の組成物は、水系の溶媒を含むものであってもよい。水系の溶媒としては、滅菌水、生理食塩水、リン酸塩溶液等の緩衝液等を用いることができる。
(solvent)
The composition of the present invention may contain an aqueous solvent. As the aqueous solvent, sterilized water, physiological saline, a buffer solution such as a phosphate solution, or the like can be used.

(その他)
本発明の組成物は、上記の成分の他、安定化剤、保存剤、pH調整剤等を含んでいても良い。また、成長因子、特に骨誘導因子(BMP)を含ませることもできる。
(Other)
The composition of the present invention may contain a stabilizer, a preservative, a pH adjuster and the like in addition to the above components. Growth factors, particularly osteoinductive factors (BMP) can also be included.

<材料と方法>
1.イヌ動物モデル
本研究における全ての動物実験は、動物実験委員会によって承認されたプロトコールに厳密に従って実施した。所定飼育後、4匹の成体雑種犬(平均2歳)に全身麻酔下で施術した。下顎第一小臼歯、大臼歯、及び第二、第三小臼歯を抜歯し、治癒期間を二月とした。直径10mmのトレフィンバーを用いて下顎の両側に、外側皮質に垂直になるように骨欠損を形成した。このように形成した骨欠損部に、以下の移植材料、即ちPRP、PRPとイヌMSCs(dMSCs)、PCBM、及びコントロール(欠損のみ)を移植し、骨形成を観察した。骨再生において三カ所の骨欠損を作製し、部位的差異がないように、これら4種類の材料を3移植部にランダムに移植した。また、PCBMは腸骨稜より採取した。
<Materials and methods>
1. Dog Animal Model All animal experiments in this study were performed in strict accordance with protocols approved by the Animal Experiment Committee. After predetermined breeding, 4 adult hybrid dogs (average 2 years old) were treated under general anesthesia. The mandibular first premolar, premolar, and second and third premolars were extracted, and the healing period was set to February. A bone defect was formed on both sides of the lower jaw using a trephine bar with a diameter of 10 mm so as to be perpendicular to the lateral cortex. The following transplant materials, ie, PRP, PRP and canine MSCs (dMSCs), PCBM, and control (defects only) were transplanted into the bone defect thus formed, and bone formation was observed. Three bone defects were created in bone regeneration, and these four kinds of materials were randomly transplanted into three transplants so that there was no regional difference. PCBM was collected from the iliac crest.

2.MSCの単離及び培養
dMSCs(イヌ間葉系幹細胞)は、イヌ腸骨稜骨髄より穿刺し、既報の方法に従って単離した(非特許文献6)。簡単に説明すると、基本培地、低グルコースDMEM及び成長補助剤(間葉系細胞成長添加剤を50mL、200mMのL-グルタミンを10mL、及び2.5ユニットのペニシリン及び25μgのストレプトマイシンを含有するペニシリン−ストレプトマイシン混合物を0.5mL)をBioWhittaker(Walkersvill、MD、USA)より購入した。骨形成を誘導するための3種類の添加剤、即ち、デキサメタゾン(Dex)、β−グリセロリン酸ナトリウム(β−GP)、及びL−アスコルビン酸二リン酸塩(AsAP)をSigma(St. Louis、MO、USA)より購入した。95%空気及び5%CO2の湿潤雰囲気中、37℃で細胞を培養した。3.1×103細胞/cm2の濃度でdMSCsをコントロール培地に接種した。基質としてp−ニトロフェニルホスファターゼを用いたアルカリフォスファターゼによるアルカリフォスファターゼ(ALP)染色法によって、分化したdMSCsを確認した。コントロール培地で培養したdMSCsはALP活性が低く、骨形成用添加物を含む培地で培養した場合の処置6日後の結果によれば、経時的にALP活性の劇的な上昇を示した。培養後、dMSCsをトリプシン処理し、移植に使用した。
2. MSC isolation and culture
dMSCs (canine mesenchymal stem cells) were punctured from canine iliac crest bone marrow and isolated according to a previously reported method (Non-patent Document 6). Briefly, basal medium, low glucose DMEM and growth supplement (50 mL of mesenchymal cell growth additive, 10 mL of 200 mM L-glutamine, and penicillin-streptomycin mixture containing 2.5 units of penicillin and 25 μg streptomycin (0.5 mL) was purchased from BioWhittaker (Walkersvill, MD, USA). Three additives for inducing osteogenesis, namely dexamethasone (Dex), β-glycerophosphate sodium (β-GP), and L-ascorbic acid diphosphate (AsAP) were added to Sigma (St. Louis, (MO, USA). Cells were cultured at 37 ° C. in a humidified atmosphere of 95% air and 5% CO 2 . Control medium was inoculated with dMSCs at a concentration of 3.1 × 10 3 cells / cm 2 . Differentiated dMSCs were confirmed by alkaline phosphatase (ALP) staining with alkaline phosphatase using p-nitrophenyl phosphatase as a substrate. The dMSCs cultured in the control medium had low ALP activity, and according to the results after 6 days of treatment when cultured in a medium containing an osteogenic additive, the ALP activity increased dramatically over time. After culturing, dMSCs were trypsinized and used for transplantation.

3.PRP、PRPゲルの調製、及びMSCs/PRP混合物の注入
約50mLの全血をイヌから採血し、保存剤非含有のヘパリン(250U/mL)とともに10mLの培養液を含む遠心チューブに入れた。血液は最初に標準的な実験室用遠心機(Himac CT、日立社、東京、日本)を用いて1100rpm、5分間の条件で遠心処理した。続いて、黄色の血漿(血小板と白血球を含んだ軟膜を含む)をカニューレで単層中間層を採取した。血小板をペレットにするために、2500rpm、5分の条件で2回目の遠心処理を行った。そして、乏血小板血漿(PPP)であって、細胞含有量の比較的少ない血漿上清を除去した。得られた血小板ペレット、即ち軟膜/血漿フラクション(PRP)を、残りの血漿5mLに懸濁し、血小板ゲルに使用した。PRPとPPP内の血小板数はSysmex XE-2100(Sysmex、東京、日本)で測定した。その結果、全血小板数は平均値295,000(224,000〜333,000の範囲)であった。一方、PRPの血小板数は平均値1,293,400(935,000〜1,840,000の範囲)であった。これらの測定結果によって、血小板が分離できていることが確認できるとともに、PRPにおける濃縮の度合いは438%(対全血血小板数(100%))であることが判明した。PRPは、使用時まで一般的な振盪機内において室温で保存した。粉状ウシトロンビン(10,000ユニット)を別の滅菌容器内で10%塩化カルシウム溶液10mLに溶解した。次に、3.5mLのPRP、dMSCs(1.0×107cells/mL)、及び0.5mLの空気を5mL注射器内に吸引し、また第2注射器(2.5mL)内には500μLのトロンビン−塩化カルシウム混合物を吸引した。ここで細胞を直接PRP内に再懸濁した。上記二つの注射器を三方活栓で連結し、両注射器内で交互に混合し、これによって二つの注射器間を空気のバブルが行き来するようにした。フィブリンに作用し不溶性ゲルを形成させるという、トロンビンの効果によって、5〜30秒内で内容物がゲル状の粘度を呈したようであった。得られたゲルを、5mL注射器に取り付けた16ゲージの針を使用して骨欠損部に注入した。各検体を、注入2週後(n=6)、4週後(n=6)、8週後(n=6)に分析した。放射線学的評価のために、全身麻酔下で横面のX線写真を撮影した。
3. Preparation of PRP, PRP gel, and injection of MSCs / PRP mixture Approximately 50 mL of whole blood was collected from the dog and placed in a centrifuge tube containing 10 mL of culture medium along with preservative-free heparin (250 U / mL). The blood was first centrifuged at 1100 rpm for 5 minutes using a standard laboratory centrifuge (Himac CT, Hitachi, Tokyo, Japan). Subsequently, yellow plasma (including buffy coat containing platelets and leukocytes) was cannulated to collect a monolayer intermediate layer. In order to pellet the platelets, a second centrifugation was performed at 2500 rpm for 5 minutes. And the plasma supernatant which is platelet poor plasma (PPP) and has a relatively small cell content was removed. The resulting platelet pellet, ie the buffy coat / plasma fraction (PRP), was suspended in the remaining 5 mL of plasma and used for platelet gel. Platelet counts in PRP and PPP were measured with Sysmex XE-2100 (Sysmex, Tokyo, Japan). As a result, the total platelet count was an average value of 295,000 (range 224,000 to 333,000). On the other hand, the platelet count of PRP averaged 1,293,400 (range 935,000 to 1,840,000). From these measurement results, it was confirmed that platelets could be separated, and the degree of concentration in PRP was found to be 438% (vs. whole blood platelet count (100%)). PRP was stored at room temperature in a conventional shaker until use. Powdered bovine thrombin (10,000 units) was dissolved in 10 mL of 10% calcium chloride solution in a separate sterile container. Next, 3.5 mL of PRP, dMSCs (1.0 × 10 7 cells / mL), and 0.5 mL of air are aspirated into a 5 mL syringe, and 500 μL of thrombin-calcium chloride mixture is added into the second syringe (2.5 mL). Was aspirated. Here the cells were directly resuspended in PRP. The two syringes were connected by a three-way stopcock and mixed alternately in both syringes, so that air bubbles would flow between the two syringes. Due to the effect of thrombin, which acts on fibrin to form an insoluble gel, the contents appeared to exhibit a gel-like viscosity within 5-30 seconds. The resulting gel was injected into the bone defect using a 16 gauge needle attached to a 5 mL syringe. Each specimen was analyzed 2 weeks after injection (n = 6), 4 weeks (n = 6), and 8 weeks (n = 6). Lateral radiographs were taken under general anesthesia for radiological evaluation.

4.組織学的及び組織形態計測学的分析
移植2週後、4週後、及び8週後に、トレフィンバーを用いて各移植部を切り出し(直径2mm)、組織学的及び組織形態計測学的分析に供した。標本は10%フォルマリン緩衝液で固定し、脱灰し(K-CX; Falma、東京、日本)、そしてヘマトキシリン・エオジン染色に供した。これらの標本を光学顕微鏡下で観察し、また骨形成の有無を著者を含め、病理学者にも盲検で分析させた。
組織形態計測学的分析のデータはマイクロコンピュータでイメージ解析した。トレフィンバーで切り出した移植部(直径2mm)における、上記標本の各イメージをカラーリバーサルフィルムにコピーし、8ビット密度値の256×256アレイとしてデジタル化した後、マイクロコンピュータに移して解析した(NIH-Image、バージョン1.61;National Institutes of Health)(非特許文献15)。再生された領域は、トレフィンバー(直径10mm)で切り出した下顎骨内に含まれている領域と定義された。再生された領域における新生骨の量は、このコンピュータベースのイメージ分析システムで測定した。存在する骨のパーセンテージとして計算し、測定領域から正常骨部位を差し引いた。
4). Histological and histomorphometric analysis After 2 weeks, 4 weeks and 8 weeks after transplantation, each transplanted part was cut out using a trephine bar (diameter 2 mm) for histological and histomorphometric analysis Provided. Specimens were fixed with 10% formalin buffer, decalcified (K-CX; Falma, Tokyo, Japan), and subjected to hematoxylin and eosin staining. These specimens were observed under an optical microscope, and the presence or absence of bone formation, including the author, was also analyzed blindly by pathologists.
The data of histomorphometric analysis was imaged with a microcomputer. Each image of the specimen in the transplanted part (diameter 2 mm) cut out with trephin bar was copied to a color reversal film, digitized as a 256 x 256 array of 8-bit density values, and transferred to a microcomputer for analysis (NIH -Image, version 1.61; National Institutes of Health) (Non-Patent Document 15). The regenerated area was defined as the area contained in the mandible cut with a trephine bar (diameter 10 mm). The amount of new bone in the regenerated area was measured with this computer-based image analysis system. It was calculated as the percentage of bone present and the normal bone site was subtracted from the measurement area.

5.統計学的解析
各群の平均値及び標準偏差を各測定パラーメータについて計算した。コントロール群、PRP群、dMSCs/PRP群、及びPCBM群間の新生骨における相違は、分散の分析(ANOVA)で解析した。Mann-Whitneyで、各治療期間での新生骨の相違を評価した。p値<0.05のときに統計的に有意とした。
5. Statistical analysis The mean value and standard deviation of each group were calculated for each measurement parameter. Differences in new bone among the control group, PRP group, dMSCs / PRP group, and PCBM group were analyzed by analysis of variance (ANOVA). Mann-Whitney evaluated the difference in new bone during each treatment period. Statistically significant when p value <0.05.

6.PRPの血小板濃縮率と骨再生効果との関係
遠心処理の条件を変えることによって、血小板濃縮率の異なるPRPを調製した(血小板濃縮率:100〜1500%)。各PRPについて、dMSCと組み合わせたときの骨再生効果を上記同様の方法で評価・比較した。
6). Relationship between platelet concentration rate of PRP and bone regeneration effect PRPs with different platelet concentration rates were prepared by changing the conditions of centrifugation (platelet concentration rate: 100-1500%). For each PRP, the bone regeneration effect when combined with dMSC was evaluated and compared by the same method as described above.

<結果>
1.イヌ下顎における骨欠損モデルの形成
図1に、自然には骨が再生しない環境を得るために、イヌの下顎内に10mm長の欠損を形成する実験手法を示す。移植物(インプラント)の骨再生能は放射線的、組織学的検討、及び組織形態学的解析で評価した。
<Result>
1. Formation of Bone Defect Model in Canine Mandible FIG. 1 shows an experimental method for forming a 10 mm long defect in a dog's mandible in order to obtain an environment where bone does not regenerate naturally. The bone regeneration ability of the implant (implant) was evaluated by radiological, histological examination, and histomorphological analysis.

2.PRP、dMSCs/PRP、及びPCBMのコントロールに比較した、In vivo肉眼的所見、X線的評価、及び組織学的評価
PRP、dMSCs/PRP、及びPCBMをイヌ下顎内の10mm欠損部に移植した。肉眼的所見において、dMSCs/PRP群とPCBM群では本来の骨レベルであったが、PRPによる再生及びコントロール群では完全には復元再生されていなかった。dMSCs/PRPスキャフォールドは、移植後感染なく、ほとんど完全に消失していた(図2A、パネルa−c)。
X線撮影及び組織学的評価を2週毎に実施することで骨再生とインプラントを評価した。PRP群とコントロール群では、骨再生が欠損部底部からゆっくりと拡がっていた。PCBMを充填した欠損部は移植8週後においてX線透過性であった。このことは、PCBMが吸収されたことを示す。これに対して、dMSCs/PRPを充填した欠損部では良好な骨形成が認められ、移植物の吸収とほぼ同じ速度で骨形成が起きていることが示唆された(図2B)。移植部及びコントロール群(移植なし)の各領域を2週後、4週後、及び8週後に採取し、所定の処理及び脱灰して組織学的解析に供した。X線学的評価は組織学的解析の結果を裏づけるものであった。コントロール群及びPRP群では皮質辺縁骨の連続性は回復せず、欠損部に血管性及び線維性組織が侵入し、新生骨形成はほとんど見られなかった(図3及び4、パネルA−C及びD−F)。一方、dMSCs/PRP群では2週後においても新生骨形成が見られ、8週後には層板構造が認められており、豊富な血管形成も確認された(図3及び4、パネルG−I)。このパターンは正常な骨マクロ構造を反映しており、PCBMの吸収による空洞を示したPCBM群に比較して、良好に分化した骨髄腔及び皮質骨を有していた(図3及び4、パネルH及びK)。
2. In vivo macroscopic, X-ray, and histological evaluation compared to PRP, dMSCs / PRP, and PCBM controls
PRP, dMSCs / PRP, and PCBM were transplanted into a 10 mm defect in the canine mandible. Macroscopically, it was at the original bone level in the dMSCs / PRP group and the PCBM group, but was not completely restored and regenerated in the PRP regeneration and control groups. The dMSCs / PRP scaffold disappeared almost completely without post-transplant infection (FIG. 2A, panels ac).
Bone regeneration and implants were evaluated by performing radiography and histological evaluation every two weeks. In the PRP group and the control group, bone regeneration slowly spread from the bottom of the defect. The defect filled with PCBM was radiolucent at 8 weeks after transplantation. This indicates that PCBM has been absorbed. On the other hand, good bone formation was observed in the defect filled with dMSCs / PRP, suggesting that bone formation occurred at almost the same rate as the resorption of the implant (FIG. 2B). Each region of the transplanted part and the control group (without transplantation) was collected after 2 weeks, 4 weeks, and 8 weeks, subjected to predetermined treatment and decalcification, and subjected to histological analysis. X-ray evaluation supported the results of histological analysis. In the control group and the PRP group, the continuity of the cortical marginal bone did not recover, the vascular and fibrous tissues invaded the defect, and almost no new bone formation was observed (FIGS. 3 and 4, panels AC). And DF). On the other hand, in the dMSCs / PRP group, new bone formation was observed after 2 weeks, and a lamellar structure was observed after 8 weeks, and abundant blood vessel formation was also confirmed (FIGS. 3 and 4, panel GI). ). This pattern reflects normal bone macrostructures, with well-differentiated bone marrow cavities and cortical bone compared to the PCBM group that showed cavities due to PCBM absorption (Figures 3 and 4, panel H and K).

3.組織形態計測学的解析
全てのインプラントの骨再生能を、皮質骨及び骨髄骨表面をイメージ解析で測定することによって評価した(表1)。PRPを欠損部に加えた場合には、コントロール群に比較して、皮質及び骨髄骨表面の有意な増加を認めなかった。これに対してdMSCs/PRP群及びPCBM群では、コントロール群(2週後及び8週後p<0.001、4週後p<0.005、ANOVA)およびPRP群(2週後及び4週後p<0.05、8週後p<0.001、ANOVA)に比較して、全ての測定時点で皮質及び骨髄骨表面の有意な増加を認め、X線学的実験結果、及び組織学的実験結果が確証された。しかしながら、dMSCs/PRP群とPCBM群の間では、長期的には新生骨に有意差は認められなかった。
3. Histomorphometric analysis The bone regeneration ability of all implants was evaluated by measuring the cortical bone and bone marrow bone surfaces by image analysis (Table 1). When PRP was added to the defect, no significant increase in the cortex and bone marrow bone surface was observed compared to the control group. In contrast, in the dMSCs / PRP group and PCBM group, the control group (p <0.001 after 2 weeks and 8 weeks, p <0.005 after 4 weeks, ANOVA) and the PRP group (after 2 weeks and 4 weeks p <0.05). , 8 weeks later (p <0.001, ANOVA), a significant increase in cortical and bone marrow bone surfaces was observed at all measurement points, confirming the results of X-ray and histological experiments. However, there was no significant difference in the new bone in the long term between the dMSCs / PRP group and the PCBM group.

4.PRPの血小板濃縮率と骨再生効果との関係
血小板濃縮率の異なる複数のPRPを調製した。各PRPについて、dMSCと組み合わせたときの骨再生効果を評価・比較した。その結果、PRPの血小板濃縮率が150%〜1500%の範囲において良好に骨再生が認められた。特に、血小板濃縮率が300%〜600%の範囲では、骨再生効果が非常に高い。
4). Relationship between platelet concentration rate of PRP and bone regeneration effect Several PRPs with different platelet concentration rate were prepared. For each PRP, the bone regeneration effect when combined with dMSC was evaluated and compared. As a result, good bone regeneration was observed when the platelet concentration rate of PRP was in the range of 150% to 1500%. In particular, when the platelet concentration rate is in the range of 300% to 600%, the bone regeneration effect is very high.

<考察>
組織工学的アプローチでは、多孔質セラミックス製スキャフォールド上に播種されたMSCsを利用した新生骨形成が試みられてきた(非特許文献7、16、17)。これらの試みによって、ハイドロキシアパタイトベースのセラミックスが有する、吸収速度が遅いという性質による次善の結果がもたらされた。我々の以前の研究では、生体分解性材料であるβ-TCPブロックにMSCsを保持させたものを使用し、その結果、優れた骨形成能を認めた(非特許文献8)。しかし、これらの送達用物質は良好な可塑性を有さず、移植手順は複雑であって移植手段に問題があった。最適には、これらの物質には適切な生体内分解速度と各細胞の増殖を許容する能力が要求される。本研究において我々はPRPとMSCsの組合せを用い、それがスキャフォールドの進行性かつ完全吸収をもたらし、比較的成熟した再生骨を形成させることを見出した。我々の知見によれば、MSCsとの組合せで用いた場合には、その生体材料(PRP)はほとんど完全に消失し、適切な構造を備える成熟骨に早い段階で置き換わっており、これによって本当の骨再生を示した。この結果は今回初めて得られたものである。コントロール群では欠損部が軟組織に取り囲まれており、治癒しなかった。これによって、設定した欠損の大きさが、実験の効果を評価する上で適切であることが確認された。我々はまた、細胞源によって治癒の程度が有意に異なることを見出した。PRPのみで欠損部を満たした場合には十分な骨形成は生じなかった。骨髄からの多能性MSCsの培養法が向上したこと(非特許文献18)、及び骨芽細胞系列へMSCsの分化を方向付けることが可能であることが示されたことによって、骨再生へのMSCsの使用が可能であることが示唆されている。確かにMSCsは、骨形成能を失うことなく細胞分裂を多く繰り返すことができる(非特許文献19)。MSCsの増殖的培養によって、臨床での骨形成及び修復に使用できるであろう、骨形成能を有する細胞を数多く作り出すことができる(非特許文献7)。一方、dMSCs/PRPによる組織工学的再生骨では良好な結果が得られ、PRPがMSCsに対してプラスの影響を与えたことが示唆された。PRPスキャフォールドはMSCsの接着、増殖及び分化を促し、骨形成能を発揮させるものと考えられる。骨形成には、十分に発達した血管の供給が必要であることから(非特許文献20)、移植されたスキャフォールドでは血管形成が生ずると考えられる。我々は、dMSCs/PRP群では良好に血管形成が生ずることを見出した。理想的には、新生骨形成と釣り合いのとれた速度(2,3週)でスキャフォールドが吸収される必要がある。ほとんどのハイドロキシアパタイト、β-TCPセラミックス、または珊瑚のスキャフォールド(非特許文献17)では、移植後の数週間では実質的な分解が生じない。これに対して本研究の実験系では、おそらく、dMSCs/PRPの消退に応じて骨組織形成が誘導され、周囲環境に応じた自己細胞による骨形成が行われたと考えられる。
ウサギ耳房での血管形成の平均速度は0.09〜0.25mm/日と推定されている(非特許文献21)。イヌにおいても同等の速度であると仮定すれば、少なくとの20日以内に移植物中心に血管が到達するはずである。血管形成の不足に起因して移植物中心で多くの細胞死が生ずる可能性があるものの、本研究における組織工学的再生骨で得られた結果は、良好な細胞生存率と骨新生におけるMSCsの直接的関与が示唆される。従って、PRPが血管形成を促したものと考えられる。
<Discussion>
In the tissue engineering approach, attempts have been made to form new bone using MSCs seeded on a porous ceramic scaffold (Non-Patent Documents 7, 16, and 17). These attempts have led to suboptimal results due to the slow absorption rate of hydroxyapatite-based ceramics. In our previous study, we used a β-TCP block, which is a biodegradable material, with MSCs retained, and as a result, we found excellent bone-forming ability (Non-patent Document 8). However, these delivery materials do not have good plasticity, the implantation procedure is complicated and there are problems with the means of implantation. Optimally, these materials are required to have an appropriate rate of biodegradation and the ability to allow the growth of each cell. In this study, we used a combination of PRP and MSCs and found that it resulted in a progressive and complete resorption of the scaffold and formed relatively mature regenerated bone. According to our knowledge, when used in combination with MSCs, the biomaterial (PRP) has almost completely disappeared and replaced early with mature bone with the appropriate structure, which Bone regeneration was demonstrated. This result was obtained for the first time. In the control group, the defect was surrounded by soft tissue and did not heal. This confirmed that the size of the set defect is appropriate for evaluating the effect of the experiment. We have also found that the degree of healing varies significantly depending on the cell source. When the defect was filled with PRP alone, sufficient bone formation did not occur. By improving the culture method of pluripotent MSCs from bone marrow (Non-patent Document 18) and showing that it is possible to direct the differentiation of MSCs to the osteoblast lineage, It has been suggested that MSCs can be used. Certainly, MSCs can repeat cell division many times without losing bone forming ability (Non-patent Document 19). By proliferating culture of MSCs, it is possible to create a large number of cells capable of osteogenesis that could be used for clinical bone formation and repair (Non-patent Document 7). On the other hand, good results were obtained in tissue-engineered regenerative bone with dMSCs / PRP, suggesting that PRP had a positive effect on MSCs. The PRP scaffold is thought to promote the adhesion, proliferation and differentiation of MSCs and to exert bone forming ability. Since bone formation requires the supply of fully developed blood vessels (Non-Patent Document 20), it is considered that angiogenesis occurs in the transplanted scaffold. We have found that angiogenesis occurs well in the dMSCs / PRP group. Ideally, the scaffold needs to be absorbed at a rate that is balanced with new bone formation (a few weeks). Most hydroxyapatite, β-TCP ceramics, or sputum scaffolds (Non-patent Document 17) do not cause substantial degradation within a few weeks after implantation. On the other hand, in the experimental system of this study, it is probable that bone tissue formation was induced in response to dMSCs / PRP disappearance, and bone formation by autologous cells according to the surrounding environment was performed.
The average rate of angiogenesis in the rabbit ear is estimated to be 0.09 to 0.25 mm / day (Non-patent Document 21). Assuming comparable rates in dogs, blood vessels should reach the center of the implant within at least 20 days. Although many cell deaths may occur at the implant center due to lack of angiogenesis, the results obtained with tissue-engineered regenerative bone in this study show good cell viability and MSCs in osteogenesis. Direct involvement is suggested. Therefore, it is considered that PRP promoted angiogenesis.

未分化間葉系幹細胞の増殖、骨芽前駆細胞(骨前駆細胞(osteoprogenitor)、前駆骨芽細胞(preosteoblast))への分化、骨芽細胞の成熟化、マトリックス(I型コラーゲン)形成、及び最終的な石灰化を伴う複雑なカスケード事象の結果として骨形成が起きる(非特許文献22、23)。最初の事象は骨芽細胞の走化性誘導であろう。OwenとFriedensteinは、骨髄由来及び末梢由来前駆細胞が骨及び軟骨を産生することを、数多くのin vivo及びin vitroでの研究で示すとともに、分化過程が多くのサイトカインの影響を強く受けることを示した(非特許文献5)。本研究の系では、dMSCs/PRPの使用によって、より迅速且つ効果的な骨再生を達成できる条件となった。PRPは、自己の血小板由来成長因子(PDGF)源であり、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)等を含む。また、凝集塊であるPRPゲルは操作性がよい。しかし、成長因子の活性の維持を考慮すれば迅速に適用する必要がある。創傷部における血小板の生存期間およびその成長因子による直接的効果が得られる期間は5日以内である(非特許文献24)。これらの成長因子に加えて、血小板内の他のタンパク質(非特許文献25)が、他の細胞源から放出されるサイトカインとともに作用して止血現象を調節するのであろう。本研究の結果は、創傷部におけるPRPの適用による増強された成長因子濃度が軟組織の修復及び骨再生を向上させたことを示唆する。
Khouriらは、組織変換(ティッシュ・トランスフォーメーション)によって、様々な所望形状の、自己の且つ良好に血管形成された骨を実験的にin vivoで形成することに成功している。この組織変換は筋、軟骨、及び骨などの間葉系組織の変換であって、BMP-3と同一である骨誘導因子オステオゲニン(osteogenin)及びその親物質であるDMP(demineralized bone matrix)によって誘導される(非特許文献26)。コンセプトがしっかりしていること、及び実験データの有効性にもかかわらず、この手法は広く使用されるに至っていない。その理由は、臨床使用が許諾されたDBMを定常的に供給することが困難であり、DMBは死体の骨から調製しなければならず、さらには日本では承認されていないからである。さらに重要なことには、使用するDBMによって誘導性が様々であることから、遠位筋弁移植及び組織成形であっても、ほとんどの外科医はこれの使用を試みられない(非特許文献27)。また、この方法は他の部位への侵襲を伴う。さらに、オステオゲニンを容易に且つ毒性又は免疫源性の問題なく精製することは難しい。一方、我々の方法では組織工学による自己骨再生を伴い、それは無毒性であり、非免疫源性であり、さらいは最低限の侵襲性で実施できるとともに優れた可塑性が得られる。
Proliferation of undifferentiated mesenchymal stem cells, differentiation into osteoprogenitor cells (osteoprogenitor, preosteoblast), maturation of osteoblasts, matrix (type I collagen) formation, and final Osteogenesis occurs as a result of a complex cascade event with typical calcification (22, 23). The first event would be the induction of osteoblast chemotaxis. Owen and Friedenstein show that bone marrow and peripheral progenitor cells produce bone and cartilage in numerous in vivo and in vitro studies and show that the differentiation process is strongly influenced by many cytokines. (Non-Patent Document 5). In the system of this study, the use of dMSCs / PRP has become a condition for achieving faster and more effective bone regeneration. PRP is an autologous platelet-derived growth factor (PDGF) source, and includes transforming growth factor β (TGF-β) and the like. In addition, the PRP gel that is an agglomerate has good operability. However, it is necessary to apply it quickly considering the maintenance of growth factor activity. The survival time of platelets in the wound and the period during which the direct effect of the growth factor is obtained is within 5 days (Non-patent Document 24). In addition to these growth factors, other proteins in platelets (Non-Patent Document 25) will work with cytokines released from other cell sources to regulate hemostasis. The results of this study suggest that enhanced growth factor concentrations by application of PRP in wounds improved soft tissue repair and bone regeneration.
Khouri et al. Have succeeded in experimentally forming in vivo various self-shaped and well-vascularized bones of various desired shapes by tissue transformation (tissue transformation). This tissue transformation is a transformation of mesenchymal tissues such as muscle, cartilage, and bone, and is induced by the osteoinductive factor osteogenin, which is the same as BMP-3, and its parent substance, DMP (demineralized bone matrix). It is induced (Non-patent Document 26). Despite the solid concept and the validity of experimental data, this approach has not been widely used. The reason is that it is difficult to steadily supply DBM that is licensed for clinical use, and DMB must be prepared from cadaveric bone, and is not approved in Japan. More importantly, since the inductivity varies depending on the DBM used, most surgeons cannot attempt to use it even for distal muscle flap implantation and tissue shaping (27). . This method also involves invasion of other sites. Furthermore, it is difficult to purify osteogenin easily and without toxicity or immunogenicity problems. On the other hand, our method involves autologous bone regeneration by tissue engineering, which is non-toxic, non-immunogenic, can be performed with minimal invasiveness and provides excellent plasticity.

以上をまとめると、我々の研究によって、dMSCs/PRP移植物は、自己骨移植と同様に、本当の骨再生を誘導でき、それは臨床的に意義のある容積の骨欠損部における完全な生体材料の消失、及びPRPによる骨・軟骨組織の形成を伴うことが示された。また、PRPは自己調製物であり、施術時に調製することができることから、他家又は異種調製物を使用する際に伴う感染及び免疫反応のおそれがなく、実験室での間違えによるサンプルの取り違えのおそれもない。さらに、dMSCs/PRP混合物は注入によって適用でき、ホスト内で凝固し、時間をかけて骨に置換されることから、口腔顎顔面領域及び再建術において将来的に極めて有望な方法である。
本研究において示した方法は、カスタマイズされた自己骨移植に向けた重要な一歩となる。理論的には、最低侵襲性での生検によって自己のMSCsを得ることができ、続いてMSCsをin vitroで骨芽細胞として分化する細胞へと誘導し、その後制御された状態で再移植し、直接的な輪郭造成、再建、及び歯周病、歯科インプラントのために骨再生させることができる。dMSCs/PRP混合物について得られた実験データによって、MSCsが効率的にPRP内へ又それを通って移動することが示された。PRPは、細胞構造を変形させることなくMSCの増殖を促し、適切な送達物質として作用する。PRPは、注入による細胞の送達のための極めて好適な媒体として、臨床の場で骨欠損を修復又は再建するために有用であろう。
In summary, our study shows that dMSCs / PRP implants, like autologous bone grafts, can induce true bone regeneration, which is a complete biomaterial in bone defects of clinically significant volume. It was shown to be accompanied by loss and formation of bone / cartilage tissue by PRP. In addition, since PRP is a self-preparation and can be prepared at the time of surgery, there is no risk of infection and immune reaction associated with the use of other homes or heterogeneous preparations. There is no fear. In addition, the dMSCs / PRP mixture can be applied by injection, coagulating in the host and being replaced with bone over time, making it a very promising method in the future for orofo-maxillofacial area and reconstruction.
The method presented in this study is an important step towards customized autologous bone grafting. Theoretically, autologous MSCs can be obtained by minimally invasive biopsy, followed by inducing MSCs into cells that differentiate in vitro as osteoblasts and then re-implanted in a controlled manner. Direct contouring, reconstruction, and bone regeneration for periodontal disease, dental implants. Experimental data obtained for dMSCs / PRP mixtures showed that MSCs migrate efficiently into and through PRP. PRP promotes the growth of MSCs without deforming the cell structure and acts as a suitable delivery agent. PRP would be useful for repairing or reconstructing bone defects in the clinical field as a highly suitable vehicle for delivery of cells by injection.

本発明の骨又は歯周組織形成用の組成物は、骨組織又は歯周組織の修復、再生が必要とされる各種の分野に適用することができるものである。例えば、高度な骨吸収が認められる顎堤に人工歯根の植立を行う場合の骨増生に適用することができる。また、外傷、各種骨疾患により生ずる骨欠損部における骨組織の再生、骨の補強又は補填に適用することができる。また、歯周病等による歯槽骨の欠損部における歯槽骨、歯周組織の再生に適用することができるものである。適用方法としては、ゲル状、ペースト状等の組成物を適用部位に填入、注入、又は塗布等する。   The composition for forming bone or periodontal tissue of the present invention can be applied to various fields in which repair or regeneration of bone tissue or periodontal tissue is required. For example, the present invention can be applied to bone augmentation in the case where an artificial tooth root is planted on a jaw crest where a high degree of bone resorption is recognized. In addition, the present invention can be applied to bone tissue regeneration in bone defects caused by trauma and various bone diseases, and bone reinforcement or supplementation. Further, the present invention can be applied to the regeneration of alveolar bone and periodontal tissue in the alveolar bone defect due to periodontal disease and the like. As an application method, a gel-like or paste-like composition is filled into the application site, injected, or applied.

本発明の骨又は歯周組織形成用組成物には、骨形成系の細胞の増殖或いは分化を促進させる能力をもつ成長因子が数多く含まれる。従って、適用部(移植部)において、骨形成系の細胞を効率的に増殖或いは分化させ、骨組織又は歯周組織の形成を促進することができる。自家のPRPを用いることにより、毒性がなく、しかも免疫非活性である上記の成長因子により、骨組織又は歯周組織の再生は、質、量ともに向上するものと考えられる。また、ゲル状等の流動性であるため、注射針等を用いて適用部に容易に填入でき(創部を開放することなく適用することも可能である)、また、骨欠損部の形状に合わせて予め成型することを要せず、その汎用性が高い。このように、本発明の骨又は歯周組織形成用組成物を用いることにより、自家骨を採取して移植に供する必要がなくなり、容易に骨又は歯周組織の増生を図ることが可能となる。   The composition for forming bone or periodontal tissue of the present invention contains a number of growth factors having the ability to promote the proliferation or differentiation of cells of the osteogenic system. Therefore, in an application part (transplantation part), the cell of a bone formation type | system | group can be efficiently proliferated or differentiated, and formation of a bone tissue or periodontal tissue can be accelerated | stimulated. By using autologous PRP, it is considered that the regeneration of bone tissue or periodontal tissue is improved in both quality and quantity by the above-mentioned growth factor which is non-toxic and immune inactive. In addition, since it is fluid, such as a gel, it can be easily inserted into the application part using an injection needle or the like (it can also be applied without opening the wound), and the shape of the bone defect part It does not require pre-molding together, and its versatility is high. Thus, by using the composition for forming bone or periodontal tissue of the present invention, it is not necessary to collect autologous bone and use it for transplantation, and it is possible to easily increase the growth of bone or periodontal tissue. .

この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
The present invention is not limited to the description of the embodiments and examples of the invention described above. Various modifications may be included in the present invention as long as those skilled in the art can easily conceive without departing from the description of the scope of claims.
The contents of papers, published patent gazettes, patent gazettes, and the like specified in this specification are incorporated by reference in their entirety.

実験プロトコールを示す。An experimental protocol is shown. (A)骨再生の肉眼的所見:(a)イヌ下顎における実験デザイン、トレフィンバーで直径10mmにて作製。(b)骨欠損部内の移植材料。(c) dMSCs/PRP群、PCBM群及びコントロール群の骨再生(移植8週後)。dMSCs/PRP群及びPCBM群では本来の骨レベルであったが、PRP又はコントロール群では完全には再生されなかった。(B)X線による評価:(a)移植後のX線像。(b)移植2週後のX線像。コントロール群の欠損部において骨形成がないことに注目。PCBM群において移植したPCBMを認め、またdMSCs/PRP群で骨形成を認める。(c)移植4週後のX線像。dMSCs/PRP群及びPCBM群では、コントロール群と異なり、欠損部内に骨形成を認める。(d)移植8週後のX線像。PCBMで欠損部を埋めたものは8週後で放射線透過性であり、PCBMの吸収を示す。対照的に、dMSCs/PRPのインプラントで欠損部を埋めたものでは良好な骨形成を示した。(A) Macroscopic findings of bone regeneration: (a) Experimental design in the mandible of the dog, produced with a trephine bar with a diameter of 10 mm. (b) Transplant material in the bone defect. (c) Bone regeneration in dMSCs / PRP group, PCBM group and control group (8 weeks after transplantation). The dMSCs / PRP group and PCBM group were at the original bone level but were not completely regenerated in the PRP or control group. (B) Evaluation by X-ray: (a) X-ray image after transplantation. (b) X-ray image 2 weeks after transplantation. Note that there is no bone formation in the defect of the control group. Transplanted PCBM is observed in the PCBM group, and bone formation is observed in the dMSCs / PRP group. (c) X-ray image 4 weeks after transplantation. In the dMSCs / PRP group and PCBM group, unlike the control group, bone formation is observed in the defect. (d) X-ray image 8 weeks after transplantation. The defect filled with PCBM is radiolucent after 8 weeks and shows PCBM absorption. In contrast, implants with dMSCs / PRP implants showed good bone formation. (A-L)コントロール群、PRP群、PCBM群、dMSCs/PRP群の2、4、8週後の組織学的評価:低倍率。各群について代表的な移植物の切断面。ヘマトキシリン・エオジンで染色した。オリジナル倍率:(A-L)×40。(A)コントロール群の2週後;(B)コントロール群の4週後;(C)コントロール群の8週後;(D)PRP群の2週後;(E) PRP群の4週後;(F)PRP群の8週後;(G) dMSCs/PRP群の2週後;(H)dMSCs/PRP群の4週後;(I)dMSCs/PRP群の8週後;(J)PCBM群の2週後;(K)PCBM群の4週後;(L)PCBM群の8週後。 (A-L)コントロール群、PRP群、PCBM群、dMSCs/PRP群の2、4、8週後の組織学的評価:低倍率。各群について代表的なインプラントの切断面。ヘマトキシリン・エオジンで染色した。オリジナル倍率:(A-L)×40。(A)コントロール群の2週後;(B)コントロール群の4週後;(C)コントロール群の8週後;(D)PRP群の2週後;(E) PRP群の4週後;(F)PRP群の8週後;(G) dMSCs/PRP群の2週後;(H)dMSCs/PRP群の4週後;(I)dMSCs/PRP群の8週後;(J)PCBM群の2週後;(K)PCBM群の4週後;(L)PCBM群の8週後。(A-L) Histological evaluation after 2, 4, and 8 weeks of control group, PRP group, PCBM group, and dMSCs / PRP group: low magnification. Representative implant cuts for each group. Stained with hematoxylin and eosin. Original magnification: (A-L) x 40. (A) 2 weeks after control group; (B) 4 weeks after control group; (C) 8 weeks after control group; (D) 2 weeks after PRP group; (E) 4 weeks after PRP group; (F) 8 weeks after PRP group; (G) 2 weeks after dMSCs / PRP group; (H) 4 weeks after dMSCs / PRP group; (I) 8 weeks after dMSCs / PRP group; (J) PCBM 2 weeks after group; (K) 4 weeks after PCBM group; (L) 8 weeks after PCBM group. (A-L) Histological evaluation after 2, 4, and 8 weeks of control group, PRP group, PCBM group, and dMSCs / PRP group: low magnification. Representative implant cuts for each group. Stained with hematoxylin and eosin. Original magnification: (A-L) x 40. (A) 2 weeks after control group; (B) 4 weeks after control group; (C) 8 weeks after control group; (D) 2 weeks after PRP group; (E) 4 weeks after PRP group; (F) 8 weeks after PRP group; (G) 2 weeks after dMSCs / PRP group; (H) 4 weeks after dMSCs / PRP group; (I) 8 weeks after dMSCs / PRP group; (J) PCBM 2 weeks after group; (K) 4 weeks after PCBM group; (L) 8 weeks after PCBM group. コントロール群、PRP群、PCBM群、dMSCs/PRP群の2、4、8週後の組織学的評価:高倍率。各群について代表的な移植物の切断面。ヘマトキシリン・エオジンで染色した。オリジナル倍率:(A-L)×200。(A)コントロール群の2週後;(B)コントロール群の4週後;(C)コントロール群の8週後;(D)PRP群の2週後;(E) PRP群の4週後;(F)PRP群の8週後;(G) dMSCs/PRP群の2週後;(H)dMSCs/PRP群の4週後(活性血管形成が見られる);(I)dMSCs/PRP群の8週後(層状骨が観察される);(J)PCBM群の2週後(矢印、移植PCBM);(K)PCBM群の4週後(空洞が見られる、移植PCBMの吸収に起因);(L)PCBM群の8週後。Histological evaluation after 2, 4, and 8 weeks of the control group, PRP group, PCBM group, and dMSCs / PRP group: high magnification. Representative implant cuts for each group. Stained with hematoxylin and eosin. Original magnification: (A-L) × 200. (A) 2 weeks after control group; (B) 4 weeks after control group; (C) 8 weeks after control group; (D) 2 weeks after PRP group; (E) 4 weeks after PRP group; (F) 8 weeks after PRP group; (G) 2 weeks after dMSCs / PRP group; (H) 4 weeks after dMSCs / PRP group (active angiogenesis is observed); (I) dMSCs / PRP group 8 weeks later (stratified bone is observed); (J) 2 weeks after the PCBM group (arrow, transplanted PCBM); (K) 4 weeks after the PCBM group (cavity is seen, due to resorption of transplanted PCBM) ; (L) 8 weeks after PCBM group. 組織形態学的解析結果をまとめた表である。全てのインプラントの骨再生能を、皮質及び髄質骨表面をイメージ解析で測定することによって評価した。有意性:*p<0.005、**p<0.001It is the table | surface which put together the histological analysis result. The bone regeneration ability of all implants was evaluated by measuring the cortical and medullary bone surfaces with image analysis. Significance: * p <0.005, ** p <0.001

Claims (8)

血小板濃縮率が約150%〜約1500%の範囲にある、多血小板血漿(PRP)と、骨形成能を有する細胞と、を含んでなる骨又は歯周組織形成用の組成物。   A composition for forming bone or periodontal tissue, comprising platelet-rich plasma (PRP) having a platelet concentration rate in the range of about 150% to about 1500% and cells having osteogenic potential. 前記血小板濃縮率が約300%〜約600%の範囲にある、請求項1に記載の組成物。   2. The composition of claim 1, wherein the platelet concentration is in the range of about 300% to about 600%. 多血小板血漿(PRP)と、骨形成能を有する細胞とを含んでなり、血小板濃度が約200,000個/μL〜約6,150,000個/μLの範囲にある、骨又は歯周組織形成用の組成物。   A composition for bone or periodontal tissue formation comprising platelet rich plasma (PRP) and cells capable of osteogenesis, wherein the platelet concentration is in the range of about 200,000 / μL to about 6,150,000 / μL. 多血小板血漿(PRP)と、骨形成能を有する細胞とからなる、骨又は歯周組織形成用の組成物。   A composition for forming bone or periodontal tissue, comprising platelet-rich plasma (PRP) and cells capable of forming bone. 使用時において注入容器を用いて注入可能な流動性を有する、ことを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の組成物。   It has the fluidity | liquidity which can be inject | poured using an injection | pouring container at the time of use, The composition in any one of Claims 1-4 characterized by the above-mentioned. 前記細胞が、骨系細胞へと分化誘導された間葉系幹細胞である、請求項1〜5のいずれかに記載の組成物。   The composition according to any one of claims 1 to 5, wherein the cells are mesenchymal stem cells that have been induced to differentiate into bone cells. 歯科インプラント、歯周病、嚢胞、抜歯窩、骨延長部、又は顎裂部骨移植部位等に適用される組成物である、請求項1〜6のいずれかに記載の組成物。 The composition according to any one of claims 1 to 6, which is a composition applied to a dental implant, periodontal disease, cyst, tooth extraction socket, bone extension, or cleft bone graft site. 請求項1〜7のいずれかに記載の組成物を注入容器に封入してなる骨又は歯周組織形成用注射剤。   The injection for bone or periodontal tissue formation formed by enclosing the composition in any one of Claims 1-7 in an injection | pouring container.
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