JP2005524624A - Multifunctional monoclonal antibody against peptidoglycan of gram-positive bacteria - Google Patents

Multifunctional monoclonal antibody against peptidoglycan of gram-positive bacteria Download PDF

Info

Publication number
JP2005524624A
JP2005524624A JP2003559424A JP2003559424A JP2005524624A JP 2005524624 A JP2005524624 A JP 2005524624A JP 2003559424 A JP2003559424 A JP 2003559424A JP 2003559424 A JP2003559424 A JP 2003559424A JP 2005524624 A JP2005524624 A JP 2005524624A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mab
pepg
antibody
antibodies
aureus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2003559424A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JP2005524624A5 (en
Inventor
シューマン,リチャード,エフ.
コカイ−クン,ジョン,エフ.
フォスター,サイモン
スティンソン,ジェフリー,アール.
フィシャー,ジェラルド,ダブリュー.
Original Assignee
バイオシネクサス インコーポレーテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by バイオシネクサス インコーポレーテッド filed Critical バイオシネクサス インコーポレーテッド
Publication of JP2005524624A publication Critical patent/JP2005524624A/en
Publication of JP2005524624A5 publication Critical patent/JP2005524624A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04Antibacterial agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1271Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1275Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Streptococcus (G)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1278Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Bacillus (G)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1296Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Listeria
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/30Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、グラム陽性細菌のペプチドグリカンに結合する防御性モノクローナル抗体を含む。この抗体はまた、細菌全体に結合し、in vitroで細菌に対する食作用および死滅作用を増強し、in vivoでグラム陽性細菌による鼻腔でのコロニー形成を阻止する。本発明はまた、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体も提供する。本発明はさらに、本発明の範囲内の抗体の重鎖および軽鎖可変領域も記載する。The present invention includes protective monoclonal antibodies that bind to peptidoglycans of Gram positive bacteria. This antibody also binds to whole bacteria, enhances phagocytosis and killing effects on bacteria in vitro, and prevents nasal colonization by gram-positive bacteria in vivo. The present invention also provides human antibodies, humanized antibodies, and chimeric antibodies. The present invention further describes heavy and light chain variable regions of antibodies within the scope of the present invention.

Description

関連出願のクロスリファレンス
本出願は、2001年12月21日出願の米国仮出願第60/343,444号(代理人整理番号07787.6004)に基づくものであり、またその利益を請求するものである。本出願はこの仮出願の全開示に依拠するが、この開示を本明細書に参考として取り込むものとする。本出願は、参考として本明細書に特に取り込まれる1998年6月15日出願の米国特許出願第09/097,055号と関連しており、また米国特許出願第60/341,806号であって「Methods for Blocking or Alleviating Staphylococcal Nasal Colonization by Intranasal Application of Monoclonal Antibodies」を発明の名称とする2001年12月21日に先に出願された出願、ならびに米国特許第5,571,511号および同第5,955,074号にも関連しており、これらの出願の開示のすべてを参考として本明細書に特に取り入れるものとする。
Related Cross-Reference This application application is based on December 21, 2001 U.S. Provisional Application No. 60 / 343,444, filed (Attorney Docket No. 07787.6004), also is intended to claim the benefit. This application relies on the entire disclosure of this provisional application, the disclosure of which is incorporated herein by reference. This application is related to U.S. Patent Application Serial No. 09 / 097,055 filed June 15, 1998, which is specifically incorporated herein by reference, and also is U.S. Patent Application No. 60 / 341,806, which is incorporated by reference to Methods for It is also related to the application filed earlier on December 21, 2001, entitled `` Blocking or Alleviating Staphylococcal Nasal Colonization by Intranasal Application of Monoclonal Antibodies '', and U.S. Patent Nos. 5,571,511 and 5,955,074. The entire disclosure of these applications is specifically incorporated herein by reference.

発明の説明
発明の分野
本発明は、免疫学および感染疾患の分野におけるものであり、グラム陽性細菌、特にペプチドグリカンが表面に露出している細菌に特異的な防御性抗体に関する。本発明は、モノクローナル抗体、ならびにその断片、領域および誘導体を含む。
Description of the invention
FIELD OF THE INVENTION This invention is in the field of immunology and infectious diseases, and relates to protective antibodies specific for Gram positive bacteria, particularly bacteria with peptidoglycan exposed on the surface. The present invention includes monoclonal antibodies and fragments, regions and derivatives thereof.


人類は、細菌、特にグラム陽性細菌によって引き起こされる感染と長い間闘ってきた。グラム陽性細菌の表面構造および細胞壁は、複雑なマトリックスを形成しており、それによって細菌と宿主との相互作用に必須の機能が実現される。細胞壁は、(N-アセチルグルコサミンとN-アセチルムラミン酸の単位が繰り返される)ペプチドグリカン巨大分子と、それに結合したテイコ酸、リポテイコ酸および炭水化物を含むアクセサリー分子とからなる(たとえば、(9)および(24)を参照のこと)。加えて、細菌の細胞壁に固定された多くの表面タンパク質が存在する (たとえば、(17)を参照のこと)。
Introductory humans have long struggled with infections caused by bacteria, especially gram-positive bacteria. The surface structure and cell walls of Gram-positive bacteria form a complex matrix, thereby realizing functions essential for the interaction between bacteria and the host. The cell wall consists of peptidoglycan macromolecules (repeated by units of N-acetylglucosamine and N-acetylmuramic acid) and accessory molecules including teichoic acid, lipoteichoic acid and carbohydrate attached to it (e.g. (9) and (See (24)). In addition, there are a number of surface proteins anchored to the bacterial cell wall (see, eg, (17)).

身体は、そのような細菌からの防御のため、様々な手段を利用する。皮膚や粘膜などの機械的なバリアは、身体の最初の防御線である。病原体がこれらのバリアをすり抜け、増殖し始めることができた場合には、多形核白血球すなわちPMNと呼ばれる白血球が、感染に応答するための身体が使用する次の機構である。最後に、獲得免疫の機構が介入し、そこで、循環する抗体および補体(外来の標的に非特異的に結合することができる可溶性血漿タンパク質)が、侵入する病原体に結合し、食細胞を引き寄せ、次に食細胞が病原体を飲み込み、消化する。この後者の機構は、食作用と呼ばれ、また病原体に結合し、食作用を促進する抗体および補体は、オプソニンと呼ばれる。オプソニンによる食作用の増強は、オプソニン化と呼ばれる。オプソニン化では、抗体と補体の組合せ(「古典的経路」)が利用されることもあるし、または補体のみ(「副経路」)が利用されることもある。ブドウ球菌(および他のグラム陽性細菌)に対する食作用および死滅作用が不完全であると、宿主への侵入、感染、時には死がもたらされるので、オプソニン化および食作用の系は重要である。   The body uses a variety of means to protect against such bacteria. Mechanical barriers such as skin and mucous membranes are the body's first line of defense. If pathogens can pass through these barriers and begin to proliferate, white blood cells called polymorphonuclear leukocytes, or PMNs, are the next mechanism used by the body to respond to infection. Finally, acquired immune mechanisms intervene, where circulating antibodies and complements (soluble plasma proteins that can bind non-specifically to foreign targets) bind to invading pathogens and attract phagocytic cells. Then, phagocytes swallow and digest the pathogen. This latter mechanism is called phagocytosis, and antibodies and complements that bind to and promote phagocytosis are called opsonins. The enhancement of phagocytosis by opsonin is called opsonization. Opsonization may utilize a combination of antibody and complement (the “classical pathway”) or only complement (the “alternate pathway”). The opsonization and phagocytic system is important because incomplete phagocytosis and killing of staphylococci (and other Gram-positive bacteria) leads to host entry, infection, and sometimes death.

この種の細菌は、皮膚および他の表面に蔓延するので、大部分の哺乳類は、グラム陽性細菌に曝されている。したがって、ヒトを含む哺乳動物からのポリクローナル血清は、グラム陽性細菌の数多くの異なる細胞壁および細胞表面成分に結合するIgGを含んでいるようである。そのようなIgGの集合物は、グラム陽性細菌に対する防御に役立つかもしれない。なぜなら、多くの、表面の抗原上のエピトープまたは(ペプチドグリカン、テイコ酸、リポテイコ酸、タンパク質、炭水化物などの)細胞壁分子に結合するポリクローナルIgGは、まとまってオプソニン性になり、グラム陽性細菌に対する食作用を促進し得るからである。したがって、ポリクローナル血清中の抗体の複合機能が、その血清の機能活性となっているかもしれない。しかし、この種の細菌による感染が絶えず存在することことによって証明されるように、このようなポリクローナルIgGが必ずしも防御性でないことは明らかである。臨床医は、グラム陽性細菌に対する抗体のレベルを高めるために、この種の細菌に基づくワクチンを投与する。しかし、免疫感作に使用される多くの細菌細胞抽出物は、1つのエピトープまたは抗原について純粋でないので、得られる抗体の活性が、数種の異なる細胞壁成分に対する活性を示すこともある。細胞壁を抗体の標的とし、かつ細胞壁調製物の純度を確認することができない場合、このことは特に問題となる。   Because this type of bacteria is prevalent on the skin and other surfaces, most mammals are exposed to gram-positive bacteria. Thus, polyclonal sera from mammals, including humans, appear to contain IgG that binds to many different cell wall and cell surface components of Gram positive bacteria. Such a collection of IgGs may help protect against gram positive bacteria. Because many polyclonal IgGs that bind to many epitopes on surface antigens or cell wall molecules (such as peptidoglycan, teichoic acid, lipoteichoic acid, protein, carbohydrate) become opsonized and phagocytose gram-positive bacteria. It can be promoted. Therefore, the combined function of antibodies in the polyclonal serum may be the functional activity of the serum. However, it is clear that such polyclonal IgGs are not necessarily protective as evidenced by the constant presence of infections of this kind. Clinicians administer vaccines based on this type of bacteria to increase the level of antibodies against Gram-positive bacteria. However, since many bacterial cell extracts used for immunization are not pure for one epitope or antigen, the activity of the resulting antibody may show activity against several different cell wall components. This is particularly problematic when the cell wall is targeted by the antibody and the purity of the cell wall preparation cannot be confirmed.

さらに、ポリクローナル血清は、ある個体では防御性であるかもしれないが、単一のエピトープに対する抗体の機能上の役割を解明するためには使用できない。なぜなら、ポリクローナル血清は、当然、多くの異なる抗体を含み、多数の抗原およびエピトープに結合するからである。それぞれの抗体が、複合機能の活性に寄与し得る。したがって、細胞壁上の特定のエピトープに対する抗体がグラム陽性細菌に対するオプソニン因子として働く能力は、明確に定まらない。   In addition, polyclonal sera may be protective in some individuals but cannot be used to elucidate the functional role of antibodies against a single epitope. This is because polyclonal sera naturally contain many different antibodies and bind to many antigens and epitopes. Each antibody can contribute to the activity of a complex function. Thus, the ability of an antibody against a specific epitope on the cell wall to act as an opsonin factor for Gram-positive bacteria is not clearly defined.

加えて、あるエピトープに対する抗体には、食作用を促進するものもあれば、細胞への細菌の付着を阻止するなど、別の機能を有するものもあると思われる。したがって、食作用の増強、細菌付着の阻止、毒性活性の中和など、特定の抗体の潜在的な機能を解明に導き、それによって、予想どおりの防御を行う治療の基盤を築くことができるのは、特定のエピトープに対するモノクローナル抗体しかない。   In addition, some antibodies to certain epitopes may promote phagocytosis, while others may have other functions, such as blocking bacterial attachment to cells. Therefore, the potential functions of specific antibodies, such as enhanced phagocytosis, prevention of bacterial adhesion, and neutralization of toxic activity, can be elucidated, thereby laying the foundation for treatment that provides the expected protection. Only have monoclonal antibodies against specific epitopes.

また、最近まで、ペプチドグリカンまたはペプチドグリカンに対する抗体の役割を決めることは、ペプチドグリカン調製物が不純であるために困難であった。テイコ酸およびリポテイコ酸は、細胞壁ペプチドグリカンと密接に関連している。さらに、表皮ブドウ球菌などのある種の細菌については、テイコ酸とリポテイコ酸は、同じグリセロールリン酸主鎖をもっている。このようなテイコ酸部分は、細胞壁抽出物から調製したペプチドグリカン調製物を容易に混入し得る。したがって、このような調製物に対する血清の活性は、ペプチドグリカンに対する抗体の活性でなく、汚染物質に対する抗体の活性によるものであるかもしれない(たとえば、(36)を参照のこと)。最近、我々は、グラム陽性細菌に対するオプソニン活性を含む複数の機能活性を有するLTAに対するモノクローナル抗体を開発した。このような抗体を使用すると、ペプチドグリカン調製物がLTA汚染物質を含まないことを確認することができる。   Until recently, it has been difficult to determine the role of peptidoglycans or antibodies to peptidoglycans due to the impure peptidoglycan preparations. Teichoic acid and lipoteichoic acid are closely related to cell wall peptidoglycans. Furthermore, for certain bacteria such as Staphylococcus epidermidis, teichoic acid and lipoteichoic acid have the same glycerol phosphate backbone. Such teichoic acid moieties can easily be incorporated into peptidoglycan preparations prepared from cell wall extracts. Thus, the activity of serum against such preparations may be due to the activity of antibodies against contaminants rather than the activity of antibodies against peptidoglycans (see, eg, (36)). Recently, we have developed monoclonal antibodies against LTA with multiple functional activities, including opsonin activity against gram positive bacteria. Using such antibodies, it can be confirmed that the peptidoglycan preparation is free of LTA contaminants.

さらに、ペプチドグリカンは、細菌界に遍在しているので、ペプチドグリカンに対する特異性の高いオプソニンまたは防御性抗体はありそうもない。加えて、防御性抗体の役割についても疑問が残る。Petersonと共同研究者らは、正常なヒト血清が、細胞壁抽出物およびペプチドグリカンをオプソニン化することを示している(20)。しかし、血清中に多くの異なるエピトープに対する多くの異なる抗体が存在していたことは明らかである。ペプチドグリカン・マトリックス上で少なくとも3つの異なる抗原部位が識別されている。Petersonと共同研究者らがペプチドグリカンをリソスタフィンで切断して小さな可溶性の断片にしたとき、その断片は、正常なヒト血清の存在下でもはやオプソニン化されなかった。小さな断片では十分な数の異なる抗体の結合を支えられなかった、またペプチドグリカン上の単一のエピトープに対する抗体がオプソニンでなかったという説明がつく。したがって、ペプチドグリカンは、黄色ブドウ球菌のオプソニン化および食作用を補体のみによって促進する副経路を活性化し得るものの、オプソニン化および食作用における抗体の役割および古典的経路については、未だ理解し難い。   Furthermore, since peptidoglycans are ubiquitous in the bacterial kingdom, there is unlikely to be highly specific opsonins or protective antibodies to peptidoglycans. In addition, questions remain about the role of protective antibodies. Peterson and coworkers have shown that normal human serum opsonizes cell wall extracts and peptidoglycans (20). However, it is clear that there were many different antibodies to many different epitopes in serum. At least three different antigenic sites have been identified on the peptidoglycan matrix. When Peterson and coworkers cut peptidoglycan with lysostaphin into small soluble fragments, the fragments were no longer opsonized in the presence of normal human serum. It can be explained that the small fragment failed to support the binding of a sufficient number of different antibodies and that the antibody against a single epitope on the peptidoglycan was not opsonin. Thus, although peptidoglycan can activate the alternative pathway that promotes S. aureus opsonization and phagocytosis only by complement, the role of antibodies and the classical pathway in opsonization and phagocytosis is still difficult to understand.

このような過程における抗体の役割は、同じグループによる研究で、IgG欠損血清が完全にオプソニン性であることが判明したとき、さらに不確かになった。この結果は、抗体が除去された血清で好中球のIgG Fcレセプターをブロックした後の該血清を使用して、PMNによる正常なレベルの死滅作用が示されたという他のグループによる研究と一致していた。多くの細胞壁エピトープが表面下深くにあり、生きた増殖する細菌においてはタンパク質および莢膜多糖体に覆われていることもあるという事実は、さらなる複雑さをはらんでいる(18、19)。   The role of antibodies in such processes became even more uncertain when studies by the same group revealed that IgG-deficient sera were completely opsonized. This result is consistent with studies by other groups that showed normal levels of killing by PMN using sera after blocking neutrophil IgG Fc receptors with sera from which antibodies were removed. I did it. The fact that many cell wall epitopes are deep below the surface and may be covered with proteins and capsular polysaccharides in living and growing bacteria is even more complicated (18, 19).

したがって、特定のエピトープに結合するペプチドグリカンに対するモノクローナル抗体が、他の抗原特異性もしくはエピトープ特異性を有する別の抗体と協調して働かずに機能活性をもち得るかどうかはわかっていなかった。単一の特異性を有する抗体が、宿主の免疫および防御にとって重要ないくつかの機能を実現することができるかどうかもわかっていなかった。そのようなモノクローナル抗体は、グラム陽性感染の予防または治療に有用となるはずであり、さらにこれらが結合するエピトープまたは抗原類は、宿主において防御免疫を誘発するワクチンとして有用となるはずである。   Therefore, it has not been known whether monoclonal antibodies against peptidoglycans that bind to a specific epitope can have functional activity without working in concert with another antibody having another antigen specificity or epitope specificity. It was also unknown whether antibodies with a single specificity could fulfill several functions important for host immunity and defense. Such monoclonal antibodies should be useful in the prevention or treatment of Gram positive infections, and the epitopes or antigens to which they bind should be useful as vaccines to elicit protective immunity in the host.

本発明は、食作用を増強し、コロニー形成を阻止し、および/またはペプチドグリカン(PepG)によって誘発または促進される毒性を抑制する、PepGに対する防御性モノクローナル抗体(MAb)を含む治療用組成物に関する。上述のとおり、食作用は、グラム陽性細菌に対する有効な免疫にとって重要である。本発明は、グラム陽性細菌に対する食作用およびその死滅作用を強化し、したがって、全身の感染を阻止または治療し得る、PepGに対する防御性オプソニンMAbを提供する。鼻腔でのコロニー形成は、ブドウ球菌の主たる貯蔵所であることがわかっており、ブドウ球菌の鼻腔でのコロニー形成とその後のブドウ球菌感染との強い相関が立証されている。本発明は、ブドウ球菌などのグラム陽性細菌による鼻腔でのコロニー形成を阻止および/または軽減し、それによってそれに伴う感染の発生率および/または重症度を低減する防御性抗PepG MAbを提供する。防御性抗PepG MAbは、静脈内、皮下、筋肉内、または他の投与経路によって投与されていれば、細胞壁成分の毒性作用を低減し得る。したがって、この種の治療用組成物は、グラム陽性細菌による感染を予防もし、治療もする。   The present invention relates to a therapeutic composition comprising a protective monoclonal antibody (MAb) against PepG that enhances phagocytosis, prevents colony formation and / or suppresses toxicity induced or promoted by peptidoglycan (PepG). . As mentioned above, phagocytosis is important for effective immunity against gram positive bacteria. The present invention provides a protective opsonin MAb against PepG that enhances phagocytosis and its killing effect on Gram-positive bacteria, and thus can prevent or treat systemic infection. Nasal colonization has been found to be the primary reservoir of staphylococci, and a strong correlation between staphylococcal nasal colonization and subsequent staphylococcal infection has been demonstrated. The present invention provides protective anti-PepG MAbs that block and / or reduce nasal colonization by gram positive bacteria such as staphylococci, thereby reducing the incidence and / or severity of infections associated therewith. Protective anti-PepG MAbs can reduce the toxic effects of cell wall components when administered intravenously, subcutaneously, intramuscularly, or by other routes of administration. Thus, this type of therapeutic composition prevents and treats infection by gram positive bacteria.

本発明の防御性モノクローナル抗体には、IgGとIgM両方のPepG特異的抗-PepG MAbが含まれ、またPepG特異的な、マウス、マウス/ヒトキメラ、ヒト化、または完全なヒトMAbが含まれる。本発明の防御性モノクローナル抗体は、PepG上のどの複数エピトープも対象とする。本発明の抗体は、複数の結合特性および機能活性を示す。   Protective monoclonal antibodies of the present invention include both IgG and IgM PepG-specific anti-PepG MAbs and also include PepG-specific mouse, mouse / human chimera, humanized, or fully human MAbs. The protective monoclonal antibodies of the invention are directed to any multiple epitope on PepG. The antibodies of the present invention exhibit multiple binding properties and functional activities.

これらの防御性モノクローナル抗体は、正常またはコロニー形成のあるヒト被験者または他の哺乳動物の鼻孔内に単一または併用で投与して、鼻粘膜での細菌のコロニー形成を阻止または軽減し、それによって全身の感染を防止し、またはグラム陽性細菌の広がりを縮小することができる。   These protective monoclonal antibodies are administered alone or in combination in the nostrils of normal or colonized human subjects or other mammals to prevent or reduce bacterial colonization in the nasal mucosa, thereby It can prevent systemic infection or reduce the spread of Gram-positive bacteria.

本発明は、食作用を増強し、鼻粘膜でのコロニー形成の結果として生じ得る細菌感染を阻止し、さらにPepGおよび他の細胞壁成分または毒素の毒性作用を低減するために、単一の防御性抗PepG MAbを使用する方法およびMAbを併用する方法も含む。   The present invention provides a single protective property to enhance phagocytosis, prevent bacterial infections that can occur as a result of colonization in the nasal mucosa, and further reduce the toxic effects of PepG and other cell wall components or toxins. Also included are methods of using anti-PepG MAbs and methods of combining MAbs.

さらに、PepGエピトープまたはPepG抗原や、そのようなエピトープおよび抗原を模倣するペプチドは、グラム陽性細菌に対するオプソニン抗体を誘い出すワクチンとして有用である。   Furthermore, PepG epitopes or PepG antigens and peptides that mimic such epitopes and antigens are useful as vaccines to elicit opsonin antibodies against gram positive bacteria.

発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用される用語「抗体」には、全長抗体およびその部分が含まれる。全長抗体は、1対、またはより一般には2対のポリペプチド鎖をもち、各対は、軽鎖と重鎖とを含む。それぞれの重鎖または軽鎖は、2つの領域、すなわち (抗原に対する認識および結合を付与する) 可変領域と(局在化および細胞間相互作用と関連のある)定常領域とに分けられる。したがって、全長抗体は、一般に、2つの重鎖定常領域(HCまたはCH)、2つの重鎖可変領域(HVもしくはVH)、2つの軽鎖定常領域(LCまたはCL)、および2つの軽鎖可変領域(LVまたはVL)を含む(図2)。1つまたは複数の軽鎖は、λ鎖でもκ鎖でもよい。したがって、本発明の実施形態では、抗体は、少なくとも1つの重鎖可変領域および1つの軽鎖可変領域を含み、抗体が抗原を結合するようになっている。
Detailed Description of the Invention
Definitions As used herein, the term “antibody” includes full-length antibodies and portions thereof. A full-length antibody has one pair, or more usually two pairs of polypeptide chains, each pair comprising a light chain and a heavy chain. Each heavy or light chain is divided into two regions: a variable region (providing recognition and binding to the antigen) and a constant region (associated with localization and cell-cell interactions). Thus, full-length antibodies generally have two heavy chain constant regions (HC or CH), two heavy chain variable regions (HV or VH), two light chain constant regions (LC or CL), and two light chain variable Includes regions (LV or VL) (Figure 2). The one or more light chains may be lambda chains or kappa chains. Thus, in an embodiment of the invention, the antibody comprises at least one heavy chain variable region and one light chain variable region, such that the antibody binds an antigen.

本発明の別の態様は、相補性決定領域すなわちCDRと、フレームワーク領域すなわちFRとを交互に含む可変領域を含む。CDRは、可変領域内の配列であり、一般に抗原特異性を付与する。   Another aspect of the invention includes variable regions comprising alternating complementarity determining regions or CDRs and framework regions or FRs. CDRs are sequences within the variable region and generally confer antigen specificity.

本発明は、抗原結合を付与するのに十分な可変領域配列を含む抗体部分も含む。抗体部分には、以下のものに限定されないが、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、SFv, scFv(1本鎖Fv)が含まれ、パパイン切断やペプシン切断など、完全抗体のタンパク分解切断によって生成されるものも、あるいは完全な重鎖および軽鎖のcDNAを操作して、重鎖および軽鎖の断片を別々に、または同じポリペプチドの部分として生成する組換え法によって生成されるものも含まれる。 The invention also includes antibody portions that include variable region sequences sufficient to confer antigen binding. Antibody portions include, but are not limited to, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, SFv, scFv (single chain Fv), and include complete antibody such as papain cleavage and pepsin cleavage. Produced by proteolytic cleavage or by recombinant methods that manipulate complete heavy and light chain cDNAs to produce heavy and light chain fragments separately or as part of the same polypeptide Is included.

本発明のMAbは、ヒト抗体、非ヒト動物の抗体、およびそのハイブリッドに対応する抗体配列を含む。本明細書で使用される用語「キメラ抗体」には、ラットやマウスの抗体など、動物の抗体由来のその可変領域が、別の分子、たとえばヒトIgG、IgA、もしくはIgM抗体由来の定常領域ドメインと融合している抗体が含まれる。   The MAbs of the present invention comprise antibody sequences corresponding to human antibodies, non-human animal antibodies, and hybrids thereof. As used herein, the term “chimeric antibody” includes a variable region derived from an animal antibody, such as a rat or mouse antibody, that is a constant region domain derived from another molecule, eg, a human IgG, IgA, or IgM antibody. And the antibody fused.

キメラ抗体の1種である「ヒト化抗体」は、既知のヒト可変領域配列と(できる限り)一致するように(突然変異誘発またはCDR移植によって)変更された可変領域を有する。CDR移植は、所望の特異性を備えた抗体からのCDRをヒト抗体のFR上に移植し、それによって大部分の非ヒト配列をヒト配列と交換するものである。したがって、ヒト化抗体は、(そのアミノ酸配列が)既知のヒト抗体の配列としっかりと一致する。マウスモノクローナル抗体のヒト化によって、ヒト抗マウス抗体、すなわちHAMAへの応答の程度が低減される。本発明はまた、HAMA応答を可能な限り回避する完全なヒト抗体も含む。   One type of chimeric antibody, a “humanized antibody”, has a variable region that has been altered (by mutagenesis or CDR grafting) to match (as much as possible) a known human variable region sequence. CDR grafting involves grafting CDRs from an antibody with the desired specificity onto the FRs of a human antibody, thereby exchanging most non-human sequences for human sequences. Thus, a humanized antibody closely matches the sequence of a known human antibody (its amino acid sequence). Humanization of mouse monoclonal antibodies reduces the degree of response to human anti-mouse antibodies, ie HAMA. The invention also includes fully human antibodies that avoid HAMA responses as much as possible.

本発明は、「改変抗体」も含むが、それには、たとえば、切断(truncated)または改変された抗体をコードする遺伝子によってコードされるタンパク質またはペプチドが含まれる。そのようなタンパク質またはペプチドは、本発明の抗体と同様に機能し得る。ブドウ球菌による鼻腔でのコロニー形成を阻止または軽減する能力を含むエフェクター機能を強化し得る、別の配列の付加などの他の改変も本発明の範囲内である。そのような改変には、たとえば、抗体のアミノ酸配列へのアミノ酸の付加、抗体のアミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、抗体アミノ酸配列中の1つまたは複数のアミノ酸の代替アミノ酸による置換、アイソタイプスイッチ、およびクラススイッチが含まれる。   The invention also includes “modified antibodies”, which include, for example, a protein or peptide encoded by a gene encoding a truncated or modified antibody. Such proteins or peptides can function similarly to the antibodies of the present invention. Other modifications, such as the addition of other sequences, that can enhance effector function, including the ability to block or reduce nasal colonization by staphylococci are within the scope of the invention. Such modifications include, for example, addition of amino acids to the amino acid sequence of the antibody, deletion of amino acids in the amino acid sequence of the antibody, substitution of one or more amino acids in the antibody amino acid sequence with alternative amino acids, isotype switching, and Class switch is included.

ある実施形態では、抗体のFc領域を、細菌タンパク質に結合しないように改変してもよい。Fc領域は通常、免疫系の補助細胞(accessory cells)に対する結合部位となる。抗体が細菌に結合し、細菌を覆うと、そのような補助細胞が、覆われた細菌を認識し、感染に応答する。細菌タンパク質が、補助細胞の結合位置の近くでFc領域に結合すると、補助細胞の正常な機能が阻害される。たとえば、黄色ブドウ球菌の細胞膜に見られる細菌タンパク質であるプロテインAは、補助細胞結合部位付近のIgGのFc領域に結合する。プロテインAは、そうする際に、こうした補助細胞の機能を阻害し、したがってこの細菌の一掃が妨害される。この抗細菌免疫応答の妨害を回避するために、補助細胞への結合を失うことなく、プロテインAの非特異的な結合を妨げるように本発明の抗体のFc部分を改変することができる(たとえば、(10)を参照のこと)。   In certain embodiments, the Fc region of an antibody may be modified so that it does not bind bacterial proteins. The Fc region is usually the binding site for accessory cells of the immune system. When the antibody binds to and covers the bacteria, such accessory cells recognize the covered bacteria and respond to the infection. When bacterial proteins bind to the Fc region near the attachment site of the auxiliary cell, the normal function of the auxiliary cell is inhibited. For example, protein A, a bacterial protein found in the cell membrane of S. aureus, binds to the Fc region of IgG near the auxiliary cell binding site. Protein A, in doing so, inhibits the function of these accessory cells, thus preventing the bacteria from being cleared. To avoid interference with this antibacterial immune response, the Fc portion of the antibodies of the invention can be modified to prevent non-specific binding of protein A without losing binding to accessory cells (e.g. (See (10)).

このような様々な形態に照らして、本発明の抗体には、全長抗体、抗体部分、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および改変抗体が含まれ、別段の指示がない限り、一まとめにして「MAb」と呼ぶ。   In light of these various forms, antibodies of the present invention include full-length antibodies, antibody portions, chimeric antibodies, humanized antibodies, fully human antibodies, and modified antibodies, and unless otherwise indicated, Call it “MAb”.

本明細書で使用される用語「エピトープ」とは、抗体がPepGに結合する、PepGの1つまたは複数の領域を指す。結合される領域は、その分子と連続する部分であってもよいし、そうでなくてもよい。   As used herein, the term “epitope” refers to one or more regions of PepG where an antibody binds to PepG. The region to be bound may or may not be a continuous part of the molecule.

本明細書で使用される用語「抗原」とは、ポリペプチド配列、非タンパク質性分子、または免疫系が認識することのできる任意の分子を指す。抗原は、完全な大きさのブドウ球菌タンパク質もしくはその分子でも、またはその断片でもよく、断片は全長に満たないタンパク質をコードしている組換えcDNAから、あるいは完全な大きさの分子もしくはタンパク質、またはその断片に由来する断片から生成される。そのような断片は、タンパク質分解によって生成することができる。抗原は、ブドウ球菌タンパク質のエピトープを含むポリペプチド配列でもよく、エピトープは、そのタンパク質の線状のポリペプチド配列と連続していなくてもよい。抗原をコードするDNA配列は、当業者によく知られている手順によって同定、単離、クローン化し、原核生物または真核生物細胞に形質移入して、発現させることができる(25)。抗原は、ブドウ球菌分子もしくはそのタンパク質のアミノ酸配列の領域と100%同一であってもよく、あるいは少なくとも95%同一、少なくとも90%同一、または少なくとも85%同一であってもよい。抗原は、ブドウ球菌分子もしくはそのタンパク質のアミノ酸配列との同一性が100%、95%、90%、または85%未満でもよいが、ただし、それでも天然のブドウ球菌分子もしくはそのタンパク質に結合する抗体を誘い出すことができるものとする。   The term “antigen” as used herein refers to a polypeptide sequence, a non-proteinaceous molecule, or any molecule that can be recognized by the immune system. The antigen may be a full size staphylococcal protein or molecule thereof, or a fragment thereof, the fragment being from a recombinant cDNA encoding a protein that is less than full length, or a full size molecule or protein, or It is generated from a fragment derived from that fragment. Such fragments can be generated by proteolysis. The antigen may be a polypeptide sequence that includes an epitope of a staphylococcal protein, and the epitope may not be contiguous with the linear polypeptide sequence of the protein. The DNA sequence encoding the antigen can be identified, isolated, cloned, transfected into prokaryotic or eukaryotic cells and expressed by procedures well known to those skilled in the art (25). The antigen may be 100% identical to a region of the amino acid sequence of the staphylococcal molecule or protein thereof, or may be at least 95% identical, at least 90% identical, or at least 85% identical. Antigens may be less than 100%, 95%, 90%, or 85% identical to the amino acid sequence of a staphylococcal molecule or its protein, provided that antibodies that still bind to the native staphylococcal molecule or its protein are used. Shall be able to lure out.

ペプチド抗原の%同一性は、たとえば、Devereuxら(Nucl. Acids Res. 12: 387、1984)による記載があり、University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG)から入手できるGAPコンピューター・プログラム、バージョン6.0を使用し、標的抗原もしくはエピトープの配列とブドウ球菌配列の類似部分を比較して決定することができる(40)。このGAPプログラムは、SmithおよびWaterman(Adv. Appl. Math 2: 482、1981)によって改定されたNeedlemanおよびWunsch(J. Mol. Biol. 48: 443、1970)のアラインメント法を利用するものであり、本明細書に載せたタンパク質もしくは核酸配列の%同一性の決定に応用できる(41,42)。GAPプログラム用の好ましいデフォルト・パラメーターは、以下のもの、すなわち、(1)SchwartzおよびDayhoff編、「Atlas of Protein Sequence and Structure」、National Biomedical Research Foundation、353〜358ページ、1979年に記載されているような、(同一について1の値、非同一について0の値を含む)ヌクレオチド用単項比較行列と、GribskovおよびBurgessのNucl. Acids Res. 14: 6745、1986の加重比較行列;(2)ギャップ毎の3.0のペナルティーおよび各ギャップ中の記号毎の追加の0.10ペナルティー;ならびに(3)末端のギャップについてはペナルティーなし、を含む(43、44)。   The% identity of peptide antigens is described, for example, by Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984) and uses the GAP computer program, version 6.0, available from the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) However, it can be determined by comparing the target antigen or epitope sequence with a similar portion of the staphylococcal sequence (40). This GAP program uses the alignment method of Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970), revised by Smith and Waterman (Adv. Appl. Math 2: 482, 1981), It can be applied to the determination of the percent identity of protein or nucleic acid sequences listed herein (41, 42). Preferred default parameters for the GAP program are described in the following: (1) edited by Schwartz and Dayhoff, “Atlas of Protein Sequence and Structure”, National Biomedical Research Foundation, pages 353-358, 1979. Unary comparison matrix for nucleotides (including 1 value for identical and 0 value for non-identical) and weighted comparison matrix of Gribskov and Burgess Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986; (2) per gap A penalty of 3.0 and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap; and (3) no penalty for the terminal gap (43, 44).

あるいは、最高で10もしくは20単位の短い領域、または、たとえば抗体配列間もしくはその相同的な部分間の比較的相同性の高い領域の簡単な比較では、ペプチドもしくはヌクレオチド配列の定められた領域についての%同一性は、一致するアミノ酸またはヌクレオチドの数を、並べ合わせた配列の全長で割り、100%を掛けて決定することができる。MAb鎖中、たとえばCDR内またはその隣に1個、2個、または3個のアミノ酸の挿入またはギャップが存在する場合では、その挿入またはギャップを単一のアミノ酸ミスマッチとしてカウントする。   Alternatively, a short region of up to 10 or 20 units, or a relatively high homology region, eg, between antibody sequences or homologous parts thereof, for a defined region of a peptide or nucleotide sequence Percent identity can be determined by dividing the number of matching amino acids or nucleotides by the total length of the aligned sequences and multiplying by 100%. If there is an insertion, or gap, of 1, 2 or 3 amino acids in or adjacent to the MAb chain, eg, in the CDR, the insertion or gap is counted as a single amino acid mismatch.

抗原は、細菌表面抗原および/または病原性抗原および/または付着性抗原であってよい。表面抗原は、抗原が無傷の全細菌(whole bacterium)の形態を取っている、すなわち抗原が細胞質の内側にないときに、抗体に接近できる抗原である。病原性抗原は、発病過程に関与し、宿主に疾患を引き起こす抗原である。病原性抗原には、たとえば、LTA、ペプチドグリカン、毒素、線毛、鞭毛、および付着性抗原が含まれる。付着性抗原は、ブドウ球菌細菌が鼻孔表面に付着する能力を媒介する。抗原は、炭水化物や脂質など、ブドウ球菌の非タンパク質成分でもよい。たとえば、ペプチドグリカンおよびリポテイコ酸は、ブドウ球菌の細胞壁に見られる2種の非タンパク質抗原である。抗原は、それが免疫応答を惹起する限り、非タンパク質分子の断片を含み、または包含していてよい。   The antigen may be a bacterial surface antigen and / or a pathogenic antigen and / or an adherent antigen. A surface antigen is an antigen that is accessible to an antibody when the antigen is in the form of an intact whole bacterium, ie, the antigen is not inside the cytoplasm. Pathogenic antigens are antigens that are involved in the pathogenesis process and cause disease in the host. Pathogenic antigens include, for example, LTA, peptidoglycan, toxin, pilus, flagella, and adherent antigen. Adhesive antigens mediate the ability of staphylococcal bacteria to attach to the nostril surface. Antigens may be non-protein components of staphylococci such as carbohydrates and lipids. For example, peptidoglycan and lipoteichoic acid are two non-protein antigens found in the cell wall of staphylococci. An antigen may comprise or include a fragment of a non-protein molecule as long as it elicits an immune response.

本明細書で使用される抗原には、PepGに対する抗体応答を惹起し得る分子が含まれる。抗原は、PepG分子でも、またはその断片でもよく、断片は、分子全体またはその断片から酵素によって、または別な方法で得ることができる。抗原は、PepGのエピトープを含むPepG断片でもよく、エピトープは、分子の高分子構造と連続していなくてもよい。抗原は、PepGの領域に対する同一性が100%でもよいし、その同一性が95%、90%、または85%でもよい。抗原のPepG分子との同一性は、それよりも低くてもよいが、ただし、PepGに結合する抗体を誘い出すことができるものとする。抗原は、若干の構造上の類似性によって、PepGに結合する抗体を誘い出すことのできる無関係な分子でもよい。本発明のある実施形態では、抗原は、細菌表面のPepGに結合する抗体を誘い出す。ある実施形態では、抗原は、PepGに結合する抗体を誘い出し、かつcDNAによってコード化することのできるペプチドである。諸手順は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第2版に一般に記載されており、いかなる目的にせよこの文献を参照により本明細書に援用する(25)。   Antigens used herein include molecules that can elicit an antibody response against PepG. The antigen can be a PepG molecule, or a fragment thereof, which can be obtained enzymatically or otherwise from the entire molecule or a fragment thereof. The antigen may be a PepG fragment containing an epitope of PepG, and the epitope may not be contiguous with the macromolecular structure of the molecule. The antigen may have 100% identity to the region of PepG, or 95%, 90%, or 85%. The identity of the antigen with the PepG molecule may be lower, provided that it can elicit antibodies that bind to PepG. An antigen may be an unrelated molecule that can elicit antibodies that bind to PepG with some structural similarity. In certain embodiments of the invention, the antigen elicits an antibody that binds to PepG on the bacterial surface. In certain embodiments, the antigen is a peptide that can elicit antibodies that bind to PepG and be encoded by cDNA. The procedures are generally described in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd edition, which is incorporated herein by reference for any purpose (25).

本発明の特定の抗原には、本明細書に記載のハイブリドーマ11-232.3、11-248.2、11-569.3、11-232.3 IE9、99-110FC12 IE4(MAb-11 232.3、MAb-11-248.2、MAb-11-569.3、MAb-11-232.3 IE9、およびMAb-99-110FC12 IE4とも呼ぶ)、A130、またはM130によって産生されたモノクローナル抗体のいずれかに結合する抗原が含まれる。   Specific antigens of the invention include the hybridomas 11-232.3, 11-248.2, 11-569.3, 11-232.3 IE9, 99-110FC12 IE4 (MAb-11 232.3, MAb-11-248.2, MAb described herein. -11-569.3, MAb-11-232.3 IE9, and MAb-99-110FC12 IE4), A130, or antigens that bind to any of the monoclonal antibodies produced by M130.

抗体は、タンパク質ELISAまたは他のアッセイによって、背景シグナルと比べて少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、さらに少なくとも10倍大きい、すなわち、非特異的結合に対して得られるシグナルの少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、または少なくとも10倍大きいシグナルが抗体から得られる場合、抗原、エピトープ、またはタンパク質に特異的に結合するとされる。抗体は、たとえばメタノール−固定化細菌ELISAまたは生細菌ELISAによって、背景シグナルと比べて少なくとも1.5倍、2倍、または3倍大きいシグナルが抗体から得られる場合、細菌に特異的に結合するとされる。   The antibody is at least 2-fold, at least 3-fold, at least 5-fold, and at least 10-fold greater than the background signal by a protein ELISA or other assay, i.e., at least twice the signal obtained for non-specific binding If an antibody obtains a signal that is at least 3-fold, at least 5-fold, or at least 10-fold greater, it is said to specifically bind an antigen, epitope, or protein. An antibody is said to specifically bind bacteria if, for example, a methanol-immobilized bacterial ELISA or a live bacterial ELISA results in a signal that is at least 1.5, 2, or 3 times greater than the background signal from the antibody.

「増強された食作用」とは、本明細書では、この適用例の方法または他の同等のアッセイによって分析したところの、背景レベルを上回る食作用の増大を意味する。価値があるとみなされるレベルは、細菌の種類や感染の重症度を含む特定の感染状況に応じてかなり様々であろう。たとえば、増強された食作用活性は、背景の食作用を75%、80%、85%、90%、95%、または100%と同程度またはそれ以上に上回るものとすることができる。増強された食作用は、背景の食作用を50%、55%、60%、65%、または70%と同程度またはそれ以上に上回るものとしてもよい。本明細書では、好中球を媒介とするオプソニン性貪食殺菌活性を測定するアッセイによって、オプソニン活性を評価してもよい。   By “enhanced phagocytosis” is meant herein an increase in phagocytosis over background levels as analyzed by the method of this application or other equivalent assay. The level considered valuable will vary considerably depending on the specific infection situation, including the type of bacteria and the severity of the infection. For example, the enhanced phagocytic activity can be as much as or more than 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 100% of the background phagocytosis. The enhanced phagocytosis may be as much as, or more than, 50%, 55%, 60%, 65%, or 70% of the background phagocytosis. As used herein, opsonin activity may be assessed by an assay that measures neutrophil-mediated opsonophagocytic bactericidal activity.

本発明のMAbは、全身および局所のブドウ球菌感染の予防および他の治療に有用である。この点で、意図的なブドウ球菌の点滴注入によって曝そうが、全身に曝そうが、ブドウ球菌に曝す前、それと同時、またはその後にMAbを投与するとき、哺乳動物の鼻孔中のコロニー数を減少させることができれば、本発明のMAbは、ブドウ球菌の鼻腔コロニー形成を「軽減」するという。たとえば、以下に記載の鼻腔コロニー形成動物モデルでは、MAbまたはMAb集合体は、コロニー形成の程度、または鼻腔組織のサンプルから成長し得る細菌コロニーの数が、MAbまたはMAb集合体の投与後に低減される場合、コロニー形成を軽減するとみなされる。MAbまたはMAb集合体は、本明細書に記載の鼻腔コロニー形成アッセイにおいて、コロニー数を少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも90%に減少させるとき、コロニー形成を軽減する。100%の軽減は、根絶と呼んでもよい。   The MAbs of the present invention are useful for the prevention and other treatments of systemic and local staphylococcal infections. In this regard, whether exposed by intentional staphylococcal instillation, whether exposed systemically, prior to, simultaneously with, or after exposure to staphylococci, the number of colonies in the nostril of the mammal If it can be reduced, the MAb of the present invention is said to “reduce” nasal colonization of staphylococci. For example, in the nasal colonization animal model described below, MAb or MAb aggregates have a reduced degree of colonization or the number of bacterial colonies that can grow from a sample of nasal tissue after administration of MAb or MAb aggregates. Are considered to reduce colony formation. MAb or MAb aggregate is used to reduce colony count to at least 25%, at least 50%, at least 60%, at least 75%, at least 80%, or at least 90% in the nasal colony formation assay described herein. , Reduce colony formation. A 100% reduction may be called eradication.

意図的な点滴注入によってであろうが、他の方法によってであろうが、ブドウ球菌に曝す前またはそれと同時に鼻孔に投与するとき、ヒトまたは非ヒト哺乳動物の鼻腔コロニー形成を妨げることができれば、MAbは、ブドウ球菌のコロニー形成を「阻止」するという。本明細書に記載の鼻腔コロニー形成アッセイでは、本発明のMAbで処置した哺乳動物から取った鼻腔組織サンプルからのブドウ球菌コロニーが、対照哺乳動物と比較して、12時間以上や24時間以上などの長期間にわたり増殖し得ない場合、MAbは、コロニー形成を阻止する。MAbは、本明細書に記載の鼻腔コロニー形成アッセイにおいて、コロニー形成のある動物の数が対照動物より減少する場合も、コロニー形成を阻止する。たとえば、物質およびグラム陽性細菌を投与した後、コロニー形成のある動物の数が対照動物の少なくとも25%、少なくとも50%、および少なくとも75%に減少する場合、あるいは処置した個体から取ったサンプルからのコロニーが、12時間以上や24時間以上などのより長い期間にわたり増殖しない場合、MAbは、コロニー形成を阻止するとみなされる。   If it can prevent nasal colonization of human or non-human mammals when administered to the nostrils before or simultaneously with exposure to staphylococci, whether by intentional instillation or by other methods, MAb is said to “block” staphylococcal colonization. In the nasal colony formation assay described herein, staphylococcal colonies from a nasal tissue sample taken from a mammal treated with a MAb of the present invention, such as 12 hours or more or 24 hours or more compared to a control mammal MAb prevents colony formation if it cannot grow over a long period of time. MAbs also block colonization in the nasal colony formation assay described herein when the number of colonized animals is reduced compared to control animals. For example, after administration of substances and Gram-positive bacteria, if the number of animals with colonization decreases to at least 25%, at least 50%, and at least 75% of control animals, or from samples taken from treated individuals If the colonies do not grow for longer periods, such as 12 hours or more or 24 hours or more, MAbs are considered to prevent colony formation.

臨床的には、鼻腔スワブ(nasal swab)を適切な細菌用培地で培養して、ヒトの患者における鼻腔コロニー形成の有無を判定する。これらの培養物に、ブドウ球菌コロニーの有無によって評点をつける。この種の定性アッセイ系では、ブドウ球菌コロニー形成の阻止と軽減とが区別し難いかもしれない。したがって、鼻腔スワブなどの定性アッセイの目的では、コロニー形成前の徴候を示さないヒト患者において、12時間以上または24時間以上などのより長い期間にわたりその後のコロニー形成を防止する場合、MAbはコロニー形成を「阻止」する。本発明のMAbの投与前にすでにブドウ球菌陽性であるヒト患者から取った陽性培養物の数が識別可能に減少する場合、MAbは、コロニー形成を「軽減」する。   Clinically, nasal swabs are cultured in an appropriate bacterial medium to determine the presence or absence of nasal colonization in human patients. These cultures are scored for the presence or absence of staphylococcal colonies. In this type of qualitative assay system, it may be difficult to distinguish between prevention and reduction of staphylococcal colonization. Thus, for the purpose of qualitative assays such as nasal swabs, MAbs can form colonies if they prevent subsequent colonization for longer periods, such as 12 hours or more or more than 24 hours, in human patients who do not show signs before colonization. "Block" A MAb “reduces” colony formation if the number of positive cultures taken from human patients who are already staphylococcal positive prior to administration of the MAb of the present invention is discernably reduced.

したがって、本発明のMAbの鼻腔内投与を行って、ブドウ球菌の鼻腔コロニー形成を阻止および/または軽減することができる。「有効量」のMAbを投与(点滴注入)すると、哺乳動物は、1)投与後少なくとも12時間ブドウ球菌による鼻腔コロニー形成がない、2)鼻孔中のグラム陽性菌数もしくはブドウ球菌コロニー数の、識別可能な、医学的に意味のある、または統計的に有意な減少、または3)鼻孔から取られた培養グラム陽性菌もしくはブドウ球菌の出現率(frequency)の、識別可能な、医学的に意味のある、または統計的に有意な減少、または4)グラム陽性菌もしくはブドウ球菌感染出現率の、識別可能な、医学的に意味のある、または統計的に有意な減少のいずれかを示す。   Accordingly, intranasal administration of MAbs of the present invention can be performed to prevent and / or reduce nasal colonization of staphylococci. Upon administration (instillation) of an `` effective amount '' of MAb, the mammal is: 1) no nasal colonization by staphylococci for at least 12 hours after administration, 2) the number of gram positive or staphylococcal colonies in the nostrils, Identifiable, medically meaningful or statistically significant reduction, or 3) Identifiable, medical significance of the frequency of cultured gram-positive or staphylococcal bacteria taken from the nostril 4) Either a distinct, medically meaningful or statistically significant decrease in 4 or gram positive or staphylococcal infection incidence.

「点滴注入」は、哺乳動物の鼻孔に有効量のMAbを供給することのできる任意の送達系を含む。   “Drip infusion” includes any delivery system capable of delivering an effective amount of MAb to the nostril of a mammal.

本発明の目的は、院内感染を含むブドウ球菌感染の出現率を低減することである。有効量の投与には、鼻孔以外の身体部位が関与するブドウ球菌感染、たとえば、全身感染や外傷部位もしくは手術部位感染の可能性が、識別可能に、医学的に意味のある、または統計的に有意に低減されることが十分に証明されたものが含まれる。そのような証明法は、たとえば、動物研究、または早産児、入院もしくは外来外科治療を受けている者、火傷被害者、留置カテーテル、ステント、関節置換などを受けている患者、老年患者、遺伝的に、化学物質によって、もしくはウイルスによって免疫系が抑制されている患者を含むがこれらに限定されないグラム陽性細菌感染の恐れのある患者の臨床治験を含む。   The object of the present invention is to reduce the incidence of staphylococcal infections, including nosocomial infections. Effective doses may include staphylococcal infections involving body parts other than the nostrils, such as systemic infections, trauma or surgical site infections, which are identifiable, medically meaningful, or statistically Those well-proven to be significantly reduced are included. Such proofs include, for example, animal studies or preterm infants, those undergoing hospitalization or outpatient surgery, burn victims, indwelling catheters, stents, patients undergoing joint replacement, elderly patients, genetics And clinical trials of patients at risk of Gram-positive bacterial infection, including but not limited to patients whose immune system is suppressed by chemicals or by viruses.

本明細書で使用される、患者の「治療」は、「治療上有益な結果」をもたらす本発明の組成物の投与を含み、これによって、1)存在するグラム陽性細菌感染もしくはコロニー形成の、識別可能な、医学的に意味のある、または統計的に有意な低減、寛解、または軽減、あるいは2)その後の細菌による攻撃、感染、またはコロニー形成に対する、識別可能な、医学的に意味のある、または統計的に有意な阻止作用または予防、あるいは3)院内感染の可能性の、識別可能な、医学的に意味のある、または統計的に有意な低減であると定義される。したがって、治療は、コロニー形成または感染のある患者におけるグラム陽性細菌数の、識別可能な、医学的に意味のある、または統計的に有意な減少、ならびにその後のコロニー形成または感染の可能性の低減を含む。本明細書で使用される「コロニー形成」とは、患者の、特に鼻孔における症状を伴わないグラム陽性細菌の存在を指し、「感染」とは、任意の身体部位における症状を伴う感染を指す。   As used herein, `` treatment '' of a patient includes administration of a composition of the invention that results in `` therapeutically beneficial outcome '', whereby 1) of existing Gram positive bacterial infection or colonization, Identifiable, medically meaningful or statistically significant reduction, remission, or reduction, or 2) identifiable, medically meaningful for subsequent bacterial attack, infection, or colonization Or a statistically significant inhibitory action or prevention, or 3) an identifiable, medically meaningful or statistically significant reduction in the likelihood of nosocomial infection. Thus, treatment is an identifiable, medically meaningful or statistically significant reduction in the number of Gram-positive bacteria in patients with colonization or infection, as well as a reduction in the likelihood of subsequent colonization or infection. including. As used herein, “colony formation” refers to the presence of gram positive bacteria in a patient, particularly without symptoms in the nostrils, and “infection” refers to an infection with symptoms in any body part.

本明細書で使用される「医学的に意味のある」とは、患者の状態を改善し、患者の予後を改善し、患者の罹患率または死亡率を低減し、または患者集団の中での、ここで取り組む細菌感染に起因する疾患発生率または死亡率を低減するどんな治療も含む。「統計的に有意」な結果であるかどうかは、用いられる厳密な統計検定に応じて特に判定または確認される。当業者ならば、用いたどの統計検定においても、その検定そのもののパラメーターによって判定して、統計的に有意な結果であるかどうかが容易にわかるであろう。そのような周知の統計検定の例には、X2検定(カイ二乗検定)、Studentのt検定、F検定、M検定、Fisherの精密検定、二項精密検定、Poissonの精密検定、反復測定一方向もしくは二方向分散分析、および相関係数の算出(PearsonおよびSpearman)が含まれるがこれらに限定されない。 As used herein, “medically meaningful” refers to improving patient status, improving patient prognosis, reducing patient morbidity or mortality, or within a patient population. Include any treatment that reduces disease incidence or mortality due to bacterial infections addressed here. Whether a result is “statistically significant” is specifically determined or confirmed depending on the exact statistical test used. Those skilled in the art will readily recognize whether any statistical test used is statistically significant, as determined by the parameters of the test itself. Examples of such well-known statistical tests include X 2 test (chi-square test), Student t test, F test, M test, Fisher exact test, binomial exact test, Poisson exact test, repeated measurement Includes but is not limited to directional or two-way analysis of variance and correlation coefficient calculation (Pearson and Spearman).

本発明のMAbは、「防御性MAb」を含む。防御性MAbは、1)PepGに対する強い結合を示し、2)グラム陽性細菌のオプソニン化および死滅作用(オプソニン食作用死滅)を強化し、さらに3)細菌のコロニー形成を弱める。このようなMAbは、PepGによって誘発または促進される毒性も抑制する。別の実施形態では、このような防御性MAbは、グラム陽性細菌感染を治療するための治療用組成物を含む。   The MAbs of the present invention include “protective MAbs”. Protective MAbs show 1) strong binding to PepG, 2) enhance opsonization and killing of gram-positive bacteria (opsonophagocytic killing), and 3) weaken bacterial colonization. Such MAbs also inhibit toxicity induced or promoted by PepG. In another embodiment, such protective MAbs comprise a therapeutic composition for treating Gram positive bacterial infection.

ワクチンは、グラム陽性細菌に対する防御性オプソニン抗体の産生を刺激する場合、防御免疫応答を付与すると考えられる。防御性オプソニン抗体の産生は、ワクチンを投与された被験者の血清中にそのような抗体が存在しているかどうかを、ワクチンを投与していない対照と比べることによって、測定することができる。血清中に防御性オプソニン抗体が存在するかどうかは、本明細書に記載の活性アッセイ、または他の同等のアッセイによって測ることができる。オプソニン食作用殺菌アッセイを使用する場合、試験血清によって対照血清より少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも100%多く細菌が死滅していれば、免疫が強化されたとみなす。   A vaccine is thought to confer a protective immune response if it stimulates the production of protective opsonin antibodies against gram positive bacteria. The production of protective opsonin antibodies can be measured by comparing the presence of such antibodies in the serum of subjects who have received the vaccine, compared to controls which have not been administered the vaccine. The presence of protective opsonin antibodies in serum can be measured by the activity assays described herein, or other equivalent assays. When using the opsonophagocytic bactericidal assay, immunity is considered enhanced if the test serum kills at least 50%, at least 75%, at least 100% more bacteria than the control serum.

本発明の実施形態
本発明の一態様は、全細菌(whole bacteria)に結合する防御性抗PepG MAbに関する。細菌には、すべてのグラム陽性細菌、特にブドウ球菌および連鎖球菌が含まれる。PepGエピトープの多くは、グラム陽性細菌の表面で利用されないことがあるので、本発明は、全細菌だけでなく単離されたPepGにも結合する防御性MAbを提供する。このような防御性MAbは、PepGを結合することによって、そうした分子の毒性作用を中和することができる。
Embodiments of the Invention One aspect of the present invention relates to protective anti-PepG MAbs that bind to whole bacteria. Bacteria include all gram positive bacteria, especially staphylococci and streptococci. Since many of the PepG epitopes may not be utilized on the surface of Gram positive bacteria, the present invention provides protective MAbs that bind not only to whole bacteria but also to isolated PepG. Such protective MAbs can neutralize the toxic effects of such molecules by binding PepG.

本発明のもう1つの態様は、食細胞との相互作用が可能になるような仕方で結合し、それによって食作用を促進する、オプソニンとして機能する防御性MAbに関する。そのような防御性MAbは、グラム陽性細菌感染を阻止または軽減するものでよい。そうした防御性抗PepG MAbを単独で使用しても、または特異性の異なるMAb、たとえばLTA特異的なMAbと併用してもよく、これによってグラム陽性細菌および/または他の生物によって引き起こされる疾患を治療することができる。本発明の別の態様は、細菌の鼻腔コロニー形成を阻止または軽減し得る防御性抗PepG MAbである。   Another aspect of the invention relates to protective MAbs that function as opsonins that bind in a manner that allows interaction with phagocytic cells, thereby promoting phagocytosis. Such protective MAbs may be those that prevent or reduce Gram positive bacterial infection. Such protective anti-PepG MAbs may be used alone or in combination with MAbs of different specificities, such as LTA-specific MAbs, to treat diseases caused by Gram-positive bacteria and / or other organisms. Can be treated. Another aspect of the invention is a protective anti-PepG MAb that can prevent or reduce bacterial nasal colonization.

本発明の特定の実施形態には、本明細書に記載のモノクローナル抗体MAb-11-232.3、MAb-11-248.2、MAb-11-569.3、MAb-11-232.3IE9、MAb-99-110FC12IE4、A130、またはM130の抗原結合ドメインを含む防御性MAbが含まれる。   Certain embodiments of the present invention include monoclonal antibodies MAb-11-232.3, MAb-11-248.2, MAb-11-569.3, MAb-11-232.3IE9, MAb-99-110FC12IE4, A130 described herein. Or a protective MAb comprising the antigen binding domain of M130.

本発明は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域をヒト定常領域に融合させた防御性キメラ抗PepG MAbも含み、このキメラ抗体は、哺乳動物細胞の培養中に産生される。   The present invention also includes a protective chimeric anti-PepG MAb in which a variable region derived from a mouse monoclonal antibody is fused to a human constant region, which is produced during mammalian cell culture.

たとえば、キメラ重鎖は、本発明の防御性マウス抗PepG MAbの重鎖可変領域の抗原結合領域を、ヒト重鎖定常領域の少なくとも一部分に連結したものを含むことができる。このキメラ重鎖は、防御性マウス抗PepG MAbの軽鎖可変領域の抗原結合領域をヒト軽鎖定常領域の少なくとも一部分に連結したものを含むキメラ軽鎖と組み合わせてもよい。   For example, a chimeric heavy chain can comprise a heavy chain variable region antigen binding region of a protective mouse anti-PepG MAb of the invention linked to at least a portion of a human heavy chain constant region. This chimeric heavy chain may be combined with a chimeric light chain comprising a protective murine anti-PepG MAb light chain variable region antigen binding region linked to at least a portion of a human light chain constant region.

本発明の特定の実施形態では、防御性キメラ抗体は、本明細書に記載のヒト/マウスキメラA130抗体である。別の実施形態では、防御性キメラ抗体は、本明細書に記載のモノクローナル抗体MAb-11-232.3、MAb-11 248.2、MAb-11-569.3、MAb-11-232.3IE9、MAb-99-110FC12IE4、A130、またはM130のいずれかの抗原結合ドメインを含む。   In certain embodiments of the invention, the protective chimeric antibody is a human / mouse chimeric A130 antibody as described herein. In another embodiment, the protective chimeric antibody is a monoclonal antibody MAb-11-232.3, MAb-11 248.2, MAb-11-569.3, MAb-11-232.3IE9, MAb-99-110FC12IE4, described herein, It contains the antigen binding domain of either A130 or M130.

防御性抗PepGモノクローナル抗体によって結合されるエピトープおよび抗原も、本発明の態様である。本発明の別の態様には、脊椎動物においてグラム陽性細菌のPepGに結合するオプソニン抗体を誘い出すエピトープおよび抗原が含まれる。このようなエピトープおよび抗原は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、またはニワトリに導入されたとき、防御性のオプソニン抗体を誘い出す。このようなエピトープおよび抗原を模倣し、かつグラム陽性細菌のPepGに対するオプソニン抗体を誘い出すことのできるペプチドも、本発明に含まれる。こうしたPepGのエピトープ、抗原、ペプチド、および断片をワクチンとして使用して、グラム陽性細菌によって引き起こされる感染を防御または軽減することもできる。   Epitopes and antigens bound by protective anti-PepG monoclonal antibodies are also embodiments of the invention. Another embodiment of the present invention includes epitopes and antigens that elicit opsonin antibodies that bind to the Gram positive bacterium PepG in vertebrates. Such epitopes and antigens elicit protective opsonin antibodies when introduced into humans, mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, sheep, pigs, goats, or chickens. Peptides that mimic such epitopes and antigens and can elicit opsonin antibodies against PepG of Gram positive bacteria are also included in the present invention. Such epitopes, antigens, peptides, and fragments of PepG can also be used as vaccines to protect or reduce infection caused by Gram-positive bacteria.

本発明は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全なヒト抗体である本発明の防御性抗PepG MAb、ならびにその断片、領域、および誘導体を含む治療用組成物も開示する。このような組成物は、医薬上許容可能な担体を含んでいてもよい。本発明の治療用組成物は、あるいは、単離された抗原、エピトープ、またはその一部を、医薬上許容可能な担体と共に含むことができる。   The present invention also discloses therapeutic compositions comprising the protective, anti-PepG MAbs of the present invention that are chimeric, humanized, or fully human antibodies, and fragments, regions, and derivatives thereof. Such compositions may include a pharmaceutically acceptable carrier. The therapeutic composition of the present invention can alternatively comprise an isolated antigen, epitope, or portion thereof, together with a pharmaceutically acceptable carrier.

特定の実施形態では、本発明の治療用組成物には、以下のものに限定されないが、本明細書に記載のモノクローナル抗体MAb-11-232.3、MAb-11-248.2、MAb-11-569.3、MAb-11-232.3IE9、MAb-99-110FC12IE4、A130、またはM130のいずれかの抗原結合ドメインを含む防御性抗体が含まれる。   In certain embodiments, therapeutic compositions of the present invention include, but are not limited to, monoclonal antibodies MAb-11-232.3, MAb-11-248.2, MAb-11-569.3, Protective antibodies comprising the antigen binding domain of either MAb-11-232.3IE9, MAb-99-110FC12IE4, A130, or M130 are included.

医薬上許容可能な担体には、水や、石油系の油、動物性の油、植物油、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含む油など、無菌の液体が含まれるがこれに限らない。生理食塩水、水性デキストロース、およびグリセロール溶液も、液体担体として使用することができる。適切な薬剤用担体は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第18版(8)に記載されており、この文献をいかなる目的でも参考として本明細書に取り入れるものとする。   Pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, sterile liquids such as water and oils, including petroleum oils, animal oils, vegetable oils, peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, and the like. . Saline, aqueous dextrose, and glycerol solutions can also be used as liquid carriers. Suitable pharmaceutical carriers are described in “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 18th Edition (8), which is incorporated herein by reference for any purpose.

さらに、本発明は、種々の送達用賦形剤および/もしくは担体を用いて実施してもよい。そのような賦形剤は、貯蔵中および、粘膜への適用を含むがこれに限定されない投与の際に、たとえば鼻孔への吸入もしくは点滴注入の際に、MAbの半減期を延長することができる。この種の担体は、天然の重合体、半合成重合体、合成重合体、リポソーム、および半固体剤形(8、16、22、26、29、30、37)を含む。天然の重合体には、たとえば、タンパク質および多糖体が含まれる。半合成重合体は、天然の多糖体であるキチンの脱アセチル型であるキトサンなど、天然重合体を改変したものである。合成重合体には、たとえば、ポリリン酸エステル、ポリエチレングリコール、ポリ(乳酸)、ポリスチレンスルホン酸塩、およびポリ(ラクチドコグリコリド)が含まれる。半固体剤形には、たとえば、デンドリマー、クリーム、軟膏、ゲル、およびローションが含まれる。このような担体を使用して、MAbをマイクロカプセル化することも、またはMAbに共有結合させることもできる。   Furthermore, the present invention may be practiced with various delivery excipients and / or carriers. Such excipients can extend the half-life of MAbs during storage and upon administration including but not limited to mucosal application, for example, inhalation or instillation into the nostril. . Such carriers include natural polymers, semi-synthetic polymers, synthetic polymers, liposomes, and semi-solid dosage forms (8, 16, 22, 26, 29, 30, 37). Natural polymers include, for example, proteins and polysaccharides. The semi-synthetic polymer is a modified natural polymer such as chitosan which is a deacetylated form of chitin which is a natural polysaccharide. Synthetic polymers include, for example, polyphosphate esters, polyethylene glycol, poly (lactic acid), polystyrene sulfonate, and poly (lactide coglycolide). Semi-solid dosage forms include, for example, dendrimers, creams, ointments, gels, and lotions. Such carriers can be used to microencapsulate the MAb or covalently bind to the MAb.

一実施形態では、本発明のMAbは、鼻孔または感染部位への適用向けに粉末、スプレー、エアロゾル、クリーム、ゲルなどとして処方することのできる担体粒子を含み、またはその担体粒子の外側に共有結合もしくは非共有結合している。一実施形態では、担体粒子コアに、粘膜付着性物質を含んでいてもよい溶解性フィルム状のMAbをコートする。担体粒子コアは、不活性でも溶解性でもよい。   In one embodiment, the MAbs of the present invention comprise carrier particles that can be formulated as powders, sprays, aerosols, creams, gels, etc. for application to the nostril or infection site, or are covalently bound to the outside of the carrier particles. Or it is non-covalent. In one embodiment, the carrier particle core is coated with a soluble film MAb that may contain a mucoadhesive substance. The carrier particle core may be inert or soluble.

本発明はさらに、哺乳動物の鼻孔または他の感染部位に有効量のMAbを供給することのできる送達系を含む。代表例となる非限定的な方式には、滴剤、スプレー、粉末、エアロゾル、ミスト、カテーテル、チューブ、シリンジ;微粒子、ペレット、クリーム用塗布具などが含まれる。本発明の範囲には、その組成物に適する送達デバイスまたは塗布具、たとえば、カテーテル、チューブ、スプレー、シリンジ、噴霧器、またはクリーム、微粒子、ペレット、粉末、液体、ゲル用の他の塗布具などと結合して、本発明の1つまたは複数のMAbを含有する組成物を含むキットも含まれる。   The present invention further includes a delivery system that can deliver an effective amount of MAb to the nostril or other site of infection in a mammal. Representative non-limiting methods include drops, sprays, powders, aerosols, mists, catheters, tubes, syringes; microparticles, pellets, cream applicators and the like. Within the scope of the invention are suitable delivery devices or applicators for the composition, such as catheters, tubes, sprays, syringes, nebulizers, or other applicators for creams, microparticles, pellets, powders, liquids, gels, etc. Also included are kits that include a composition that is combined and contains one or more MAbs of the present invention.

最後に、本発明は、グラム陽性細菌に感染し、またはその感染の疑いのある患者を治療する方法を提供する。この方法は、患者に、1つまたは複数の(モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全なヒト抗体、その断片、領域、および誘導体を含む)防御性抗PepG MAbと、医薬上許容可能な担体とを含む治療上有効量の治療用組成物を投与することを含む。患者は、予防または他の治療を必要とする任意のヒトまたは非ヒト動物でよい。代表例となる患者には、ヒト、ならびにマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、霊長類、肉牛、乳牛、水牛、ラクダを含む反芻動物、毛皮獣、群れをなす動物(herd animal)、実験室、動物園および農場の動物、犬小屋および畜舎の動物、家庭用愛玩動物、および家畜などの非ヒト動物を含む、黄色ブドウ球菌(S. aureus)、ブドウ球菌、またはグラム陽性細菌に感染しているか、またはその保菌者である哺乳動物対象が含まれる。   Finally, the present invention provides a method for treating a patient infected with or suspected of having a gram positive bacterium. This method provides a patient with one or more protective anti-PepG MAbs (including monoclonal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, fully human antibodies, fragments, regions, and derivatives thereof) and a pharmaceutically acceptable Administering a therapeutically effective amount of the therapeutic composition comprising a carrier. The patient can be any human or non-human animal in need of prophylaxis or other treatment. Representative patients include humans, ruminants, fur beasts, herds including mice, rats, rabbits, dogs, cats, pigs, sheep, goats, horses, primates, beef cattle, dairy cows, buffalo, camels S. aureus, staphylococci, or non-human animals such as herd animals, laboratory, zoo and farm animals, kennel and barn animals, domestic pets, and domestic animals Included are mammalian subjects who are infected with or are carriers of Gram positive bacteria.

治療上有効量とは、感染の治療において測定可能な軽減、補助、予防、もしくは防止効果をもたらすことが妥当に考えられる量である。上記または以下に記載の治療は、グラム陽性細菌感染、異なる病原体によって引き起こされる感染、または無関係の疾患のための抗生物質療法など、追加の治療に対し、主治療としても、捕捉治療としてもよい。他の抗体との併用療法は、特に本発明の範囲内に含まれる。   A therapeutically effective amount is an amount reasonably considered to provide a measurable reduction, support, prevention or prevention effect in the treatment of infection. The treatment described above or below may be a primary treatment or a capture treatment for additional treatments such as Gram positive bacterial infections, infections caused by different pathogens, or antibiotic therapy for unrelated diseases. Combination therapies with other antibodies are specifically included within the scope of the present invention.

本発明の別の実施形態は、そのような感染を阻止または軽減する方法であって、防御性抗PepG MAb(その断片、領域、および誘導体を含む、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全なヒト抗体)と、医薬上許容可能な担体とを含む有効量の治療用組成物の投与を含む方法である。   Another embodiment of the invention is a method of preventing or reducing such infection, comprising a protective anti-PepG MAb (including monoclonal, chimeric, humanized, or fragments, including fragments, regions, and derivatives thereof) A method comprising the administration of an effective amount of a therapeutic composition comprising a fully human antibody) and a pharmaceutically acceptable carrier.

有効量は、グラム陽性細菌による感染をある程度阻止または軽減することが妥当に考えられる量でよい。上記または以下に記載の治療は、ブドウ球菌感染、異なるグラム陽性細菌病原体によって引き起こされた感染、または無関係の疾患のための抗生物質療法など、追加の治療に対し、主治療としても、捕捉治療としてもよい。実際、他の抗体との併用療法は、特に本発明の範囲内に含まれる。   An effective amount may be an amount reasonably considered to prevent or reduce infection to some extent by gram positive bacteria. The treatment described above or below may be used as a primary treatment or as a capture treatment for additional treatments such as staphylococcal infection, infection caused by different Gram-positive bacterial pathogens, or antibiotic therapy for unrelated diseases. Also good. Indeed, combination therapies with other antibodies are specifically included within the scope of the present invention.

もう1つの実施形態では、いずれかのPepGエピトープを模倣するペプチドは、グラム陽性細菌が上皮細胞に結合するのを阻止し、それによってコロニー形成を抑制するのに有用である。たとえば、1つまたは複数のそのようなペプチドを含有する治療用組成物を鼻腔内投与して、コロニー形成を阻止または抑制し、したがって更なる感染を防止または軽減することができる。   In another embodiment, a peptide that mimics any PepG epitope is useful for preventing Gram positive bacteria from binding to epithelial cells, thereby inhibiting colony formation. For example, a therapeutic composition containing one or more such peptides can be administered intranasally to prevent or suppress colonization and thus prevent or reduce further infection.

本発明のさらに別の実施形態は、1つまたは複数のPepG抗原エピトープ、またはPepGエピトープを模倣する1つまたは複数のペプチドを、医薬上許容可能な担体中に含むワクチンである。ワクチンは、宿主に導入されると、グラム陽性細菌に対して広く防御性かつオプソニン性である抗体を誘い出す。ワクチンは、エピトープ、エピトープを模倣するペプチド、エピトープとエピトープを模倣するペプチドとの混合物、その抗原、別の抗原、またはエピトープ、エピトープを模倣するペプチド、および抗原の任意の組合せを含んでいてよい。免疫感作、およびその後の抗体応答の分析についての標準の技術は、「Antibodies: A Laboratory Manual」、(Harlow & Lane編、1988年)、Cold Spring Harbor Laboratory Press;「Conjugate Vaccines」、(J. M. Cruse、R. E. Lewis, Jr.編、1989年)、Karger、Basel;米国特許第5,955,079号および同第6,432,679号に出ており、これらをそれぞれ、参考として本明細書に取り入れる。   Yet another embodiment of the present invention is a vaccine comprising one or more PepG antigenic epitopes, or one or more peptides that mimic PepG epitopes, in a pharmaceutically acceptable carrier. When introduced into a host, the vaccine elicits antibodies that are broadly protective and opsonic against gram-positive bacteria. A vaccine may comprise an epitope, a peptide that mimics an epitope, a mixture of an epitope and a peptide that mimics an epitope, its antigen, another antigen, or an epitope, a peptide that mimics an epitope, and any combination of antigens. Standard techniques for immunization and subsequent analysis of antibody responses are described in `` Antibodies: A Laboratory Manual '' (Harlow & Lane, 1988), Cold Spring Harbor Laboratory Press; `` Conjugate Vaccines '', (JM Cruse RE Lewis, Jr., 1989), Karger, Basel; US Pat. Nos. 5,955,079 and 6,432,679, each of which is incorporated herein by reference.

本発明の防御性抗PepG MAbs、ワクチン、および治療用組成物は、乳幼児および高齢者の患者、免疫無防備状態の患者、侵襲性の処置を受けている患者、化学療法を受けている患者、放射線療法を受けている患者、保健医療従事者など、グラム陽性細菌による感染の恐れがあることが知られている、またはその疑いのある個体にとって、特に有益である。これには、免疫系が未成熟な乳幼児、弁などの生体移植片を受け入れている患者、留置カテーテルを有する患者、皮膚または粘膜組織の破損または損傷を伴う外科処置を控えた患者、ある種の保健医療従事者、および化学療法や放射線療法などのある形態の治療のために免疫系が害されると予想される患者が含まれる。ヒトでない患者の中で、その恐れのあるものには、動物園の動物、群れをなす動物、および狭苦しい所で管理される動物が含まれる。   The protective anti-PepG MAbs, vaccines and therapeutic compositions of the present invention are useful for infants and elderly patients, immunocompromised patients, patients undergoing invasive treatment, patients undergoing chemotherapy, radiation It is particularly beneficial for individuals who are known or suspected of being at risk of infection by Gram-positive bacteria, such as patients undergoing therapy and health care workers. This includes infants whose immune system is immature, patients who are receiving biografts such as valves, patients who have indwelling catheters, patients who are refraining from surgical procedures involving damage or damage to the skin or mucosal tissue, It includes health workers and patients who are expected to damage the immune system for some form of treatment, such as chemotherapy or radiation therapy. Among the non-human patients, those at risk include zoo animals, herds, and animals managed in cruel places.

本発明のMAbは、ムピロシンやバシトラシンのような抗生物質;リソスタフィン、リソザイム、ムタノリシン、セロジルムラミダーゼ(cellozyl muramidase)のような抗ブドウ球菌剤;ナイシン(nisin)のような抗菌ペプチド;およびランチビオティクス(lantibiotics)またはナイシンやスブチリンなどの他のランチオン含有分子を含む、他の抗ブドウ球菌抗生物質薬と共に投与してもよい。   The MAb of the present invention comprises antibiotics such as mupirocin and bacitracin; antistaphylococcal agents such as lysostaphin, lysozyme, mutanolysin, cellozyl muramidase; antibacterial peptides such as nisin; and lantiobio It may be administered with other anti-staphylococcal antibiotics, including lantibiotics or other lantion-containing molecules such as nisin and subtilin.

提供する開示から考えて、本発明のMAbの投与では、選択される特定の処方および送達方法は、当業者の実際的知識および経験の範囲内である。特に、必要なMAbの量、適切な担体との組合せ方、投与スケジュール、および投与量は、特許を請求するこの発明から逸脱することなく、この分野の標準の知識に基づき、広い範囲で様々であってよい。一実施形態では、本発明のMAbは、静脈内点滴によって投与しても、または数回分に分けて投与してもよく、回数は、1日1回〜4回以上の範囲とし、1回あたり0.1〜20mgを与えてよい。一実施形態では、投与するMAbの量は、動物モデルにおいて確実に100%コロニーが形成されることがわかっている細菌の量である108個の黄色ブドウ球菌からなる接種物で有効であることがわかっている用量である、1回0.1〜3mgで1日2〜4回であろう。このような投与計画は、外科的処置のために入院が認められた患者、ブドウ球菌感染の素因をつくる様々な条件下にある患者、回復期の患者、免疫系が未成熟な乳幼児に有効となり、または患者の退院前に有効となるはずである。 In view of the disclosure provided, for the administration of MAbs of the present invention, the particular formulation and delivery method chosen is within the knowledge and experience of one of ordinary skill in the art. In particular, the amount of MAb required, how to combine with an appropriate carrier, dosing schedule, and dosage will vary widely based on standard knowledge in the field without departing from the claimed invention. It may be. In one embodiment, the MAb of the present invention may be administered by intravenous infusion or divided into several doses, the number of times being in the range of 1 to 4 or more times per day, 0.1-20 mg may be given. In one embodiment, the amount of MAb administered is effective for an inoculum consisting of 10 8 S. aureus, the amount of bacteria known to ensure 100% colonization in animal models. Is a known dose, 0.1-3 mg at a time, 2-4 times a day. This regimen is effective for patients who are hospitalized for surgical procedures, patients under various conditions predisposing to staphylococcal infection, those in recovery, and infants with an immature immune system. Or should be effective prior to patient discharge.

本発明の防御性抗PepG抗体、ワクチン、および治療用組成物は、静脈内、腹腔内、体内注射、関節内、心室内、クモ膜下内、筋肉内、皮下、鼻腔内、経皮、皮内、膣内、経口、または他の有効な投与方法によって投与することができる。この組成物は、感染した特定の部位への筋肉内または皮下注射などによって、局所的に投与されてもよい。投与は、塗布、液浸、浸漬、拭取りによる、治療用組成物の患者への直接の投与を含み得る。この処置は、留置カテーテル、心臓弁、脳脊髄液シャント、人工関節、身体への他の移植物、グラム陽性細菌によって汚染される恐れがあるか、またはそのような汚染を患者に持ち込む恐れのある他の物体、機器、器具など、患者体内に入れる物体に適用することもできる。   Protective anti-PepG antibodies, vaccines, and therapeutic compositions of the present invention include intravenous, intraperitoneal, intracorporeal injection, intra-articular, intraventricular, intrathecal, intramuscular, subcutaneous, intranasal, transdermal, skin It can be administered internally, intravaginally, orally, or by other effective administration methods. The composition may be administered locally, such as by intramuscular or subcutaneous injection at a specific site of infection. Administration can include direct administration of the therapeutic composition to the patient by application, immersion, dipping, wiping. This procedure may be contaminated by indwelling catheters, heart valves, cerebrospinal fluid shunts, artificial joints, other implants on the body, gram positive bacteria, or may introduce such contamination to patients The present invention can also be applied to an object to be placed in a patient body such as another object, device, or instrument.

ここで、本発明の詳細な態様を、以下の「材料および方法」、ならびに特定の実施例の形で示す。当然、これらは単なる例示目的で含まれており、本発明を限定するものでない。   Detailed aspects of the invention will now be presented in the form of the following “Materials and Methods” and specific examples. Of course, these are included for illustrative purposes only and do not limit the invention.

材料および方法
細菌
5型黄色ブドウ球菌は、受託番号49521でATCCに寄託されている。
Materials and methods
Bacteria
Type 5 S. aureus has been deposited with the ATCC under accession number 49521.

8型黄色ブドウ球菌は、受託番号12605でATCCに寄託されている。   Type 8 S. aureus has been deposited with the ATCC under accession number 12605.

表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)株Hayは、1990年12月19日に受託番号55133でATCCに寄託されている。   The S. epidermidis strain Hay has been deposited with the ATCC under accession number 55133 on 19 December 1990.

溶血性連鎖球菌(S. hemolyticus)は、受託番号43252でATCCに寄託されている。   S. hemolyticus has been deposited with the ATCC under accession number 43252.

ハイブリドーマ
ハイブリドーマ96-105CE11 IF6(M110)は、1997年6月13日に受託番号HB-12368でATCCに寄託されている。
Hybridoma Hybridoma 96-105CE11 IF6 (M110) was deposited with the ATCC under accession number HB-12368 on June 13, 1997.

ハイブリドーマ99-110 FC12 IE4は、2000年9月21日に特許寄託PTA-2492でATCCに寄託されている。   Hybridoma 99-110 FC12 IE4 was deposited with the ATCC on September 21, 2000 with the Patent Deposit PTA-2492.

ハイブリドーマ11-232.3 IE9(M130)は、2001年8月21日にPTA-3659でATCCに寄託されている。   Hybridoma 11-232.3 IE9 (M130) was deposited with the ATCC at PTA-3659 on August 21, 2001.

アイソタイプ決定アッセイ
アイソタイプは、Zymed Laboratories(カタログ番号90-6550)から入手したマウス免疫グロブリンアイソタイプ・キットを使用して決定した。
Isotyping assay Isotypes were determined using a mouse immunoglobulin isotype kit obtained from Zymed Laboratories (Cat. No. 90-6550).

結合アッセイ
本発明の結合アッセイでは、免疫グロブリンは、ブドウ球菌全細胞(whole cell)調製物またはLTAやPepGなどの細菌細胞壁成分調製物と共にインキュベートされる。結合アッセイは、凝集アッセイ、凝固アッセイ、比色アッセイ、蛍光結合アッセイ、または当業者に知られている他の適切な結合アッセイでよい。特に適切なアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)またはラジオイムノアッセイ(RIA)である。結合は、直接的に検出されてもよいが、当業者に知られている競合もしくは非競合結合法を使用して間接的に検出することもできる。
Binding Assay In the binding assay of the present invention, immunoglobulin is incubated with a staphylococcal whole cell preparation or a bacterial cell wall component preparation such as LTA or PepG. The binding assay may be an agglutination assay, a coagulation assay, a colorimetric assay, a fluorescent binding assay, or other suitable binding assay known to those skilled in the art. Particularly suitable assays are enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) or radioimmunoassays (RIA). Binding may be detected directly, but can also be detected indirectly using competitive or non-competitive binding methods known to those skilled in the art.

ブドウ球菌全細胞調製物、LTA調製物、PepG調製物、またはこれら調製物の組合せは、標準の技術を使用して、プレート、ウェル、ビーズ、マイクロビーズ、パドル、プロペラ、または棒状物を含むがこれに限定されない適切な固体担体に固定することができる。固体担体は、たとえば、ガラスまたはプラスチックで構成されていてよい。本発明の特定の実施形態では、固体担体は、マイクロタイタープレートである。   While staphylococcal whole cell preparations, LTA preparations, PepG preparations, or combinations of these preparations include plates, wells, beads, microbeads, paddles, propellers, or rods using standard techniques It can be fixed to an appropriate solid support without being limited thereto. The solid support may be composed of, for example, glass or plastic. In certain embodiments of the invention, the solid support is a microtiter plate.

一般に、結合アッセイには、次の段階が必要である。まず、固定した調製物を免疫グロブリン供給源と共にインキュベートする。アッセイの一実施形態では、免疫グロブリン供給源は、たとえば、組織培養上清や、腹水、血漿、血清、全血、体組織などの生物学的サンプルである。別の実施形態では、当業者に知られている手段によって、その供給源から免疫グロブリンをさらに単離または精製してもよく、精製または単離した免疫グロブリンをその後のアッセイで使用する。結合の量は、試験サンプルで観察される結合を陰性対照の結合と比較して決定する。陰性対照は、抗原特異的な免疫グロブリンを含まない任意のサンプルであると定める。結合アッセイでは、試験サンプルで認められた結合の量が陰性対照の結合量を上回るとき、結果が陽性結合反応となる。陽性の結合であることは、単一の陽性/陰性の結合反応から判定してもよいし、一連の結合反応の平均から判定してもよい。一連の結合反応に、固定された抗原に特異的に結合する免疫グロブリンを測定量含有するサンプルを含め、それによって検量線を作成することができる。この検量線を使用して、未知のサンプル中の抗原特異的な免疫グロブリンの量を定量化することができる。   In general, a binding assay requires the following steps. First, the fixed preparation is incubated with an immunoglobulin source. In one embodiment of the assay, the immunoglobulin source is a biological sample such as, for example, tissue culture supernatant or ascites, plasma, serum, whole blood, body tissue. In another embodiment, the immunoglobulin may be further isolated or purified from its source by means known to those skilled in the art, and the purified or isolated immunoglobulin is used in subsequent assays. The amount of binding is determined by comparing the binding observed in the test sample to the binding of the negative control. A negative control is defined as any sample that does not contain antigen-specific immunoglobulin. In a binding assay, the result is a positive binding reaction when the amount of binding observed in the test sample exceeds the amount of binding in the negative control. Positive binding may be determined from a single positive / negative binding reaction or from an average of a series of binding reactions. A series of binding reactions can include a sample containing a measured amount of immunoglobulin that specifically binds to the immobilized antigen, thereby creating a calibration curve. This calibration curve can be used to quantify the amount of antigen-specific immunoglobulin in an unknown sample.

アッセイの代替実施形態では、抗体を固体担体に固定し、細菌調製物への結合能によって未知の免疫グロブリンサンプルの特徴付けを行う。上で論じたアッセイの別の態様を適宜利用する。   In an alternative embodiment of the assay, the antibody is immobilized on a solid support and an unknown immunoglobulin sample is characterized by its ability to bind to a bacterial preparation. Other embodiments of the assay discussed above are utilized as appropriate.

実施例で使用した特定の結合アッセイを以下で述べる。   The specific binding assay used in the examples is described below.

生細菌ELISA(LBE):抗体の生細菌への結合能を測定するために、LBEアッセイを実施した。黄色ブドウ球菌5型、5-USU型、8型、表皮ブドウ球菌株Hay、および溶血連鎖球菌を含む、様々な種類の細菌をアッセイに使用してよい。終夜培養したプレート培養物からの細菌を35mlのTryptic Soy Broth(TSB)に移し、穏やかに振盪させながら37℃で1.5〜2.0時間増殖させた。次いで、室温で15分間、1800〜2000×gの遠心分離にかけて、細菌をペレット状にした。上清を除去し、細菌を、0.1%のウシ血清アルブミンを含有する35〜45mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS/BSA)に再懸濁した。細菌を遠心分離によって再びペレット状にし、上清を破棄し、細菌をPBS/BSAに再懸濁して、透過率(%T)を650nmで65%〜70%とした。その懸濁液から、細菌を0.9%の無菌塩化ナトリウム(Sigmaカタログ番号S8776、または等価物)中にさらに15倍に希釈し、この懸濁液100μlを平底無菌96ウェルプレートの一連のウェルに加えた。 Live Bacteria ELISA (LBE) : An LBE assay was performed to measure the ability of antibodies to bind to live bacteria. Various types of bacteria may be used in the assay, including S. aureus type 5, 5-USU, type 8, Staphylococcus epidermidis strain Hay, and hemolytic streptococci. Bacteria from overnight plate cultures were transferred to 35 ml Tryptic Soy Broth (TSB) and grown at 37 ° C. for 1.5-2.0 hours with gentle shaking. The bacteria were then pelleted by centrifugation at 1800-2000 × g for 15 minutes at room temperature. The supernatant was removed and the bacteria were resuspended in 35-45 ml phosphate buffered saline (PBS / BSA) containing 0.1% bovine serum albumin. Bacteria were pelleted again by centrifugation, the supernatant was discarded, and the bacteria were resuspended in PBS / BSA to achieve a permeability (% T) of 65% to 70% at 650 nm. From that suspension, the bacteria are further diluted 15-fold in 0.9% sterile sodium chloride (Sigma catalog number S8776, or equivalent) and 100 μl of this suspension is added to a series of wells in a flat bottom sterile 96 well plate. It was.

試験する各抗体は、Tween-20を0.05%および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合プロテインA(プロテインA-HRP、Zymed Laboratories)を1:10000希釈で含有するPBS/BSA(PBS/BSA/Tween/Prot A-HRP)に加えて所望の濃度に希釈した。プロテインA-HRPを、使用前に室温で30〜60分間かけて抗体に結合させ、それによって抗体-プロテインA-HRP複合体を生成して、黄色ブドウ球菌の表面上に見られるプロテインAに抗体が非特異的に結合し得る可能性を最小限に抑えた。一般に、各アッセイにおいて数種類の希釈度の試験抗体を使用した。各抗体希釈度のものから、50μlの抗体-プロテインA-HRP複合体を一連のウェルに加え、細菌と抗体-プロテインA-HRP複合体の混合物を、回転式振盪機で穏やかに回転させながら(50〜75rpmで)37℃で30〜60分間インキュベートした。   Each antibody to be tested was PBS / BSA (PBS / BSA / Tween / Prot A-HRP) containing 0.05% Tween-20 and horseradish peroxidase-conjugated protein A (protein A-HRP, Zymed Laboratories) at a 1: 10000 dilution. ) And diluted to the desired concentration. Protein A-HRP is allowed to bind to the antibody for 30-60 minutes at room temperature prior to use, thereby producing an antibody-protein A-HRP complex that is antibody to protein A found on the surface of S. aureus The possibility of nonspecific binding could be minimized. In general, several dilutions of test antibody were used in each assay. From each antibody dilution, 50 μl of antibody-protein A-HRP complex is added to a series of wells, and the bacterial and antibody-protein A-HRP complex mixture is gently rotated on a rotary shaker ( Incubated at 37 ° C. for 30-60 minutes (at 50-75 rpm).

インキュベートした後、1800〜2000×gの遠心分離にかけて、細菌をプレート中でペレット状にした。ウェルの上清を慎重に除去し、0.05%のTween-20を含有するPBS/BSA(PBS/BSA/Tween)200μlをすべてのウェルに加えて、結合していない試薬を希釈した。遠心分離によって細菌を再びペレット状にし、上清を除去した。100マイクロリットルのTMB基質(BioFx, Inc.カタログ番号TMBW-0100-01)を各ウェルに加え、室温で15分間反応を進行させた。100μlのTMB停止試薬(450nm Stop Reagent、BioFx, Inc.カタログ番号STPR-0100-01)を加えて反応を停止させた。450nmフィルターを装着したマイクロプレートリーダーを使用して、各ウェルの吸光度を求めた。   After incubation, the bacteria were pelleted in the plate by centrifugation at 1800-2000 xg. The well supernatant was carefully removed and 200 μl of PBS / BSA containing 0.05% Tween-20 (PBS / BSA / Tween) was added to all wells to dilute unbound reagent. The bacteria were pelleted again by centrifugation and the supernatant was removed. 100 microliters of TMB substrate (BioFx, Inc. catalog number TMBW-0100-01) was added to each well and the reaction was allowed to proceed for 15 minutes at room temperature. 100 μl of TMB stop reagent (450 nm Stop Reagent, BioFx, Inc. catalog number STPR-0100-01) was added to stop the reaction. The absorbance of each well was determined using a microplate reader equipped with a 450 nm filter.

このアッセイでは、発色の強度が、抗体の細菌への結合に正比例した。対照ウェルは、細菌およびプロテインA-HRPを抗体なしで含んでいた。   In this assay, the intensity of color development was directly proportional to antibody binding to bacteria. Control wells contained bacteria and protein A-HRP without antibody.

メタノール-固定化細菌でのイムノアッセイ:熱で死滅させた細菌を、0.9%の無菌塩化ナトリウム(Sigmaカタログ番号S8776、または等価物)に、650nmでの透過率(%T)70〜75%で懸濁させた。10ミリリットルの細菌懸濁液を、0.9%の無菌塩化ナトリウム中に15倍希釈し、次いで10〜15℃で15分間、1800×gの遠心分離にかけてペレット状にした。上清を破棄し、ペレットを1500mlのメタノール(MeOH)に再懸濁した。100マイクロリットルの細菌-MeOH懸濁液を、Nunc Maxisorpストリップウェル(Nuncカタログ番号469949)の各ウェルに分注した。MeOHを蒸発させ、細菌をプラスチック製ウェルに固定した。細菌でコートされたストリップウェルをプラスチック製の袋に入れて室温の暗所で保管し、調製して2カ月以内に使用した。 Immunoassay with methanol-fixed bacteria : Suspend heat-killed bacteria in 0.9% sterile sodium chloride (Sigma catalog number S8776, or equivalent) at 70-75% permeability (% T) at 650 nm. Made cloudy. Ten milliliters of the bacterial suspension was diluted 15-fold in 0.9% sterile sodium chloride and then pelleted by centrifugation at 1800 xg for 15 minutes at 10-15 ° C. The supernatant was discarded and the pellet was resuspended in 1500 ml methanol (MeOH). 100 microliters of bacteria-MeOH suspension was dispensed into each well of a Nunc Maxisorp strip well (Nunc catalog number 469949). MeOH was evaporated and bacteria were fixed in plastic wells. Bacteria coated strip wells were placed in plastic bags and stored in the dark at room temperature and prepared and used within 2 months.

抗体を評価するため、細菌でコートされたプレートを、0.05%のTween20を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS-T)で4回、以下のように洗浄した。約250μlのPBS-Tを各ウェルに加えた。プレートの緩衝液を流しの上ではじいて除去し、残りの緩衝液を、プレートを逆さにし、吸収紙の上で叩いて除去した。抗体をPBS-T中に希釈し、次いでウェルに加えた。上清、腹水、または精製した抗体を、実施例で示す希釈物で試験した。対照ウェルにはPBS-Tのみを入れた。抗体を加えた後、ウェルを室温の無ドラフト環境で30〜60分間インキュベートした。ウェルを再度PBS-Tで4回洗浄した。次いで、95マイクロリットルの検出抗体を各ウェルに加えた。検出抗体は、次のもの、すなわち、どれも西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)に結合し、PBS-T中に6千倍に希釈されている、ウサギ抗マウスIgG3、ウサギ抗マウスIgM、またはヤギ抗ヒトIgG(γ特異的)(それぞれ、Zymedカタログ番号61-0420、61-6820、62-8420)のうちの1つである。 To evaluate the antibodies, bacteria-coated plates were washed four times with phosphate buffered saline (PBS-T) containing 0.05% Tween20 as follows. About 250 μl of PBS-T was added to each well. The plate buffer was removed by flipping over the sink, and the remaining buffer was removed by inverting the plate and tapping on absorbent paper. The antibody was diluted in PBS-T and then added to the wells. Supernatant, ascites, or purified antibody was tested at the dilution shown in the examples. Control wells received only PBS-T. After the antibody was added, the wells were incubated for 30-60 minutes in a draft-free environment at room temperature. The wells were again washed 4 times with PBS-T. 95 microliters of detection antibody was then added to each well. The detection antibodies are: rabbit anti-mouse IgG 3 , rabbit anti-mouse IgM, or goat anti-antigen, which binds to horseradish peroxidase (HRP) and is diluted 6000 times in PBS-T. One of human IgG (gamma specific) (Zymed catalog numbers 61-0420, 61-6820, 62-8420, respectively).

室温でさらに30〜60分間インキュベートした後、ウェルをPBS-Tで4回洗浄し、各ウェルに100μlのTMB基質溶液(BioFx#TMBW-0100-01)を入れた。プレートを室温の暗所で15分間インキュベートし、100μlのTMB停止溶液(BioFx #STPR-0100-01)を加えて反応を停止させた。Molecular Devices Vmaxプレートリーダーを使用して、各ウェルの吸光度を450nmで測定した。   After further incubation at room temperature for 30-60 minutes, the wells were washed 4 times with PBS-T and 100 μl of TMB substrate solution (BioFx # TMBW-0100-01) was placed in each well. The plate was incubated for 15 minutes in the dark at room temperature and the reaction was stopped by adding 100 μl of TMB stop solution (BioFx # STPR-0100-01). The absorbance of each well was measured at 450 nm using a Molecular Devices Vmax plate reader.

プロテインAを用いるイムノアッセイ:MAbの黄色ブドウ球菌への結合を評価するために、イムノアッセイ法を、上述のメタノール-固定化細菌用に改変した。黄色ブドウ球菌は、表面にプロテインAを発現しており、プロテインAは、γグロブリン重鎖の定常領域に強力に結合するので、抗体とプロテインAとの非特異的な結合が、偽陽性の結果を生じる可能性がある。イムノアッセイ用ウェルは、上述のように細菌でコートしたが、この難点を克服するために、細菌でコートしたウェルに抗体を加える前に、MAbを、HRPに結合させ組換え型プロテインAの溶液(Zymed Laboratoriesカタログ番号10-1123)と共にインキュベートし、PBS-T中に8千倍に希釈した。結合反応を室温で30分間進行させた。ウェルをPBS-Tで4回洗浄し、各プロテインA-HRP-MAb混合物の溶液100μ1をそのウェルに加えた。前処理によって得られるプロテインA-HRPの存在は、MAbが黄色ブドウ球菌上のプロテインAに結合するのを阻止した。さらに、プロテインA-HRPの重鎖定常領域への結合は、MAb上の抗体結合部位を妨害せず、それによって黄色ブドウ球菌または他の細菌についてMAbを評価することが可能になる。 Immunoassay using protein A : To assess the binding of MAb to S. aureus, the immunoassay was modified for the methanol-immobilized bacteria described above. Staphylococcus aureus expresses protein A on its surface, and protein A binds strongly to the constant region of the gamma globulin heavy chain, resulting in false positive results for nonspecific binding of antibody to protein A. May occur. Immunoassay wells were coated with bacteria as described above, but to overcome this difficulty, MAb was conjugated to HRP and a solution of recombinant protein A (before adding antibody to the bacteria-coated wells ( Zymed Laboratories catalog number 10-1123) and diluted 8000 times in PBS-T. The binding reaction was allowed to proceed for 30 minutes at room temperature. The wells were washed 4 times with PBS-T and 100 μl of each protein A-HRP-MAb mixture solution was added to the wells. The presence of protein A-HRP obtained by pretreatment prevented MAb from binding to protein A on S. aureus. Furthermore, the binding of protein A-HRP to the heavy chain constant region does not interfere with the antibody binding site on the MAb, thereby allowing the MAb to be evaluated for S. aureus or other bacteria.

プロテインA-HRP-MAbの溶液を、コートされたウェルの中で、室温で30〜60分間結合させた。次いで、上述のように、ウェルをPBS-Tで洗浄し、TMB基質溶液を加え、アッセイを完了した。   The protein A-HRP-MAb solution was allowed to bind for 30-60 minutes at room temperature in the coated wells. The wells were then washed with PBS-T and TMB substrate solution was added as described above to complete the assay.

LTAおよびPepGでのイムノアッセイ:MAbのLTAへの結合は、黄色ブドウ球菌LTA(Sigmaカタログ番号2515)でコートしたウェルを用いるイムノアッセイによって測定した。PBS中1μg/mlのLTA溶液100マイクロリットルを一連のNunc Maxisorpストリップウェルに分注し、室温で終夜インキュベートした。PBS-Tで4回洗浄して、結合していない物質をウェルから除去した。次いで、PBS-T中に希釈された抗体をウェルに加え、上のメタノール-固定化細菌でのイムノアッセイで述べたようにアッセイを続行した。 Immunoassay with LTA and PepG : Binding of MAb to LTA was measured by immunoassay using wells coated with S. aureus LTA (Sigma catalog number 2515). 100 microliters of a 1 μg / ml LTA solution in PBS was dispensed into a series of Nunc Maxisorp strip wells and incubated overnight at room temperature. Unbound material was removed from the wells by washing 4 times with PBS-T. The antibody diluted in PBS-T was then added to the wells and the assay continued as described in the immunoassay with methanol-immobilized bacteria above.

PepGについてのイムノアッセイでは、Nunc Maxisorpストリップウェルのプレートを、0.1Mの炭酸塩緩衝液(pH9.2〜9.6)中5μg/mlのPepG溶液(S. Foster、実施例2に記載の手順によっても調製できる)100μlを用い、室温で一晩かけてコートした。PBS-Tで4回洗浄して、結合していない抗原をプレートから除去した。PBS-T中に希釈されたサンプルの上清、腹水、または抗体をウェルに加えて一連のウェルを複製した。プレートをプレートシーラーで覆い、室温の無ドラフト環境で30〜60分間インキュベートした。プレートを再度PBS-Tで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)に結合させたγ特異的ウサギ抗マウスIgG(Zymed Laboratories)95μlをすべてのウェルに加えた。プレートに再び覆いをかけ、室温の無風環境で30〜60分間インキュベートした。プレートをPBS-Tで洗浄し、各ウェルに100μlのTMB基質溶液を加えた。室温、暗所で15分間インキュベートした後、すべてのウェルに100μlのTMB停止溶液を加え、450nmフィルターを装着したMolecular Devices Vmaxプレートリーダーを使用して、各ウェルの吸光度を測定した。 For immunoassay for PepG, Nunc Maxisorp strip well plates were also prepared by the procedure described in 5 μg / ml PepG solution (S. Foster, Example 2) in 0.1 M carbonate buffer (pH 9.2-9.6). 100 μl) and coated overnight at room temperature. Unbound antigen was removed from the plate by washing 4 times with PBS-T. A series of wells were replicated by adding sample supernatant, ascites, or antibody diluted in PBS-T to the wells. The plate was covered with a plate sealer and incubated for 30-60 minutes in a room temperature, no draft environment. Plates were washed again with PBS-T and 95 μl of γ-specific rabbit anti-mouse IgG (Zymed Laboratories) conjugated to horseradish peroxidase (HRP) was added to all wells. The plate was re-covered and incubated for 30-60 minutes in a windless environment at room temperature. The plate was washed with PBS-T and 100 μl of TMB substrate solution was added to each well. After incubation at room temperature in the dark for 15 minutes, 100 μl of TMB stop solution was added to all wells, and the absorbance of each well was measured using a Molecular Devices V max plate reader equipped with a 450 nm filter.

活性アッセイ
抗原に結合する抗体は、必ずしもオプソニン化を強化しまたは感染からの防御を増強するものではない。したがって、オプソニン化アッセイを使用して、抗体の機能活性を判定した。
Antibodies that bind to activity assay antigens do not necessarily enhance opsonization or enhance protection from infection. Therefore, an opsonization assay was used to determine the functional activity of the antibody.

オプソニン化アッセイは、比色アッセイ、化学発光アッセイ、蛍光もしくは同位元素標識取込みアッセイ、細胞性殺菌アッセイ、または物質の潜在的なオプソニン性を測定し、それによって反応性の免疫グロブリンを同定する、当業者に知られている他の適切なアッセイでよい。オプソニン化アッセイでは、感染性の病原および真核生物細胞と、試験しようとするオプソニン性物質、もしくはオプソニン性を増強するとされる物質を加えたオプソニン性物質とを共にインキュベートする。   Opsonization assays include colorimetric assays, chemiluminescent assays, fluorescent or isotope label incorporation assays, cellular bactericidal assays, or measuring the potential opsonization of a substance, thereby identifying reactive immunoglobulins. Other suitable assays known to those skilled in the art may be used. In an opsonization assay, infectious pathogenic and eukaryotic cells are incubated together with the opsonized substance to be tested or an opsonized substance plus a substance that is thought to enhance opsonization.

特定の実施形態では、オプソニン化アッセイは、細胞性殺菌アッセイである。このin vitroアッセイでは、細菌などの感染性病原、食細胞、および免疫グロブリンなどのオプソニン性物質を共にインキュベートする。貪食能または結合能を有する真核生物細胞を細胞性殺菌アッセイに使用してもよい。特定の実施形態では、食細胞は、マクロファージ、単球、好中球、またはこれらの細胞の組合せである。古典的経路と副経路の両方によるオプソニン化を促進するために補体タンパク質を含めてもよい。   In certain embodiments, the opsonization assay is a cellular bactericidal assay. In this in vitro assay, infectious pathogens such as bacteria, phagocytic cells, and opsonic substances such as immunoglobulins are incubated together. Eukaryotic cells with phagocytic or binding ability may be used for cellular bactericidal assays. In certain embodiments, the phagocytic cell is a macrophage, monocyte, neutrophil, or a combination of these cells. Complement proteins may be included to promote opsonization by both the classical and alternative pathways.

インキュベートした後に残る感染性病原体の量または数が、抗体のオプソニン化能力を決定する。インキュベートした後に残る感染性病原体の数が少ないほど、試験した抗体のオプソニン活性は大きい。細胞性殺菌アッセイでは、オプソニン活性は、試験される抗体をその一方のみが含む2つの類似アッセイの生存細菌数を比較することによって測定する。あるいは、オプソニン活性は、サンプル抗体と共にインキュベートする前後の生存生物体の数を測定して決定する。抗体存在下でインキュベートした後の細菌数の減少は、陽性のオプソニン化活性を示す。細胞性殺菌アッセイでは、適切な細菌増殖条件下でインキュベート混合物を培養して、オプソニン化が陽性であることを判定する。インキュベート前とインキュベート後のサンプル、または免疫グロブリンを含有するサンプルとそれを含まないサンプルとを比較して、生存細菌が減少していれば、陽性反応である。   The amount or number of infectious pathogens remaining after incubation determines the antibody's ability to opsonize. The fewer infectious pathogens that remain after incubation, the greater the opsonic activity of the tested antibody. In cellular bactericidal assays, opsonin activity is measured by comparing the number of viable bacteria in two similar assays, one of which contains the antibody being tested. Alternatively, opsonin activity is determined by measuring the number of living organisms before and after incubation with the sample antibody. A decrease in bacterial count after incubation in the presence of antibody indicates positive opsonization activity. In a cellular bactericidal assay, the incubation mixture is cultured under appropriate bacterial growth conditions to determine that opsonization is positive. If the number of surviving bacteria is reduced by comparing the sample before and after the incubation, or the sample containing the immunoglobulin and the sample not containing it, the reaction is positive.

好中球媒介オプソニン食作用殺菌アッセイ:このアッセイは、PMN分離培地(Robbins Scientificカタログ番号1068-00-0)を使用する沈降によって成体静脈血から単離した好中球を使用して実施した。40マイクロリットルの抗体、血清、または他の免疫グロブリン供給源を、様々な希釈度で加えて丸底マイクロタイタープレートのウェルを複製した。次いで、40マイクロリットルの好中球(ウェルあたり約106細胞)を各ウェルに加えた後、直ちに約3×104個の対数増殖中期の細菌(表皮ブドウ球菌株Hay、ATCC 55133、または5型黄色ブドウ球菌、ATCC 49521)の入った10μlのTryptic Soy Broth(Difcoカタログ番号906374、または等価物)を加えた。最後に、免疫グロブリンを除去したヒト血清10μlを活性補体の供給源として加えた。(免疫グロブリンは、アッセイに使用する前に、血清をプロテインGアガロースおよびプロテインLアガロースと共にプレインキュベートすることによって、ヒト血清補体から除去した。このように免疫グロブリンを除去すると、補体中の抗ブドウ球菌抗体の濃度が最小限に抑えられ、それによって補体溶液中にもともと存在する抗体によって引き起こされる細菌の死滅が低減される。)
プレートを一定に激しく振盪させながら37℃でインキュベートした。ゼロ時間目、すなわちサンプル抗体を最初に加えたとき、および2時間のインキュベーション後に、10μlのアリコートを各ウェルから採取した。各サンプル・ウェルから収集した各アリコート中の生存細菌数を決定するために、各アリコートを、0.1%のBSA水溶液に加えて20倍希釈し(PMNを溶解するため)、すばやいピペット操作によって激しく混合し、血液寒天プレート(Remel、カタログ番号01-202、または等価物)上で、37℃で終夜培養した。オプソニン活性は、2時間で採取したサンプルから観察された細菌コロニー数と、0時間で採取したサンプルから観察された細菌コロニー数とを比較して測定した。IPI ミニカウントコロニーカウンターを使用してコロニーを数えた。
Neutrophil-mediated opsonophagocytic bactericidal assay : This assay was performed using neutrophils isolated from adult venous blood by sedimentation using PMN separation medium (Robbins Scientific catalog number 1068-00-0). 40 microliters of antibody, serum, or other immunoglobulin source was added at various dilutions to replicate the wells of the round bottom microtiter plate. Then 40 microliters of neutrophils (about 10 6 cells per well) were added to each well, followed immediately by about 3 × 10 4 logarithmically growing bacteria (E. epidermidis strain Hay, ATCC 55133, or 5 10 μl Tryptic Soy Broth (Difco catalog number 906374, or equivalent) with type S. aureus, ATCC 49521) was added. Finally, 10 μl of human serum free of immunoglobulin was added as a source of active complement. (Immunoglobulin was removed from human serum complement by pre-incubating the serum with protein G agarose and protein L agarose prior to use in the assay. In this way, removal of the immunoglobulin removes the anti-antibody in the complement. (The concentration of staphylococcal antibodies is minimized, thereby reducing bacterial killing caused by antibodies originally present in the complement solution.)
Plates were incubated at 37 ° C with constant vigorous shaking. At zero time, ie when sample antibody was first added, and after 2 hours of incubation, 10 μl aliquots were taken from each well. To determine the number of viable bacteria in each aliquot collected from each sample well, each aliquot is diluted 20-fold with 0.1% aqueous BSA (to dissolve the PMN) and mixed vigorously by rapid pipetting. And incubated overnight at 37 ° C. on blood agar plates (Remel, catalog number 01-202, or equivalent). Opsonin activity was measured by comparing the number of bacterial colonies observed from the sample collected at 2 hours with the number of bacterial colonies observed from the sample collected at 0 hour. Colonies were counted using an IPI mini-count colony counter.

この細胞性殺菌アッセイは、米国特許第5,571,511号の実施例11および12で述べられているように、in vivoでの有効性との相関関係が明らかにされている。   This cellular bactericidal assay has been shown to correlate with in vivo efficacy, as described in Examples 11 and 12 of US Pat. No. 5,571,511.

鼻腔コロニー形成アッセイ:黄色ブドウ球菌のマウス鼻腔コロニー形成モデルは、Kiserらの研究に基づくものであった(11)。簡潔に述べれば、ストレプトマイシン耐性5型黄色ブドウ球菌を高塩分コロンビア寒天(Difco)上で増殖させて、莢膜の形成を促進する。細菌を無菌生理食塩水(0.9%のNaCl水溶液)で洗浄して培地成分を除去し、様々な濃度および組合せの抗ブドウ球菌MAbまたは無関係の対照MAbを含有する生理食塩水(0.9%のNaCl水溶液)に、約108細菌/動物投与量で再懸濁する。1時間プレインキュベートした後、細菌をペレット状にし、最終体積を動物投与量あたり10μlとして生理食塩水または抗体含有生理食塩水のどちらかに再懸濁する。ストレプトマイシン含有水で24時間飼育したマウスを麻酔によって鎮静する。鼻に接触させないピペット操作によって、ブドウ球菌をマウスの鼻孔に点滴注入する。 Nasal Colony Formation Assay : The mouse nasal colonization model of Staphylococcus aureus was based on the work of Kiser et al. (11). Briefly, streptomycin resistant type 5 Staphylococcus aureus is grown on high salinity Columbia agar (Difco) to promote capsule formation. Bacteria are washed with sterile saline (0.9% NaCl aqueous solution) to remove media components and saline (0.9% NaCl aqueous solution) containing various concentrations and combinations of anti-staphylococcal MAbs or irrelevant control MAbs. ) At about 10 8 bacterial / animal dose. After 1 hour preincubation, the bacteria are pelleted and resuspended in either saline or antibody-containing saline, with a final volume of 10 μl per animal dose. Mice raised for 24 hours in water containing streptomycin are sedated by anesthesia. The staphylococci are instilled into the nostril of the mouse by pipetting without touching the nose.

動物をストレプトマイシン含有水で飼育しながら4〜7日経過後、動物を犠牲にし、鼻を外科的に取り出し、解剖する。鼻腔組織を0.5%のTween-20を加えた食塩水(0.9%のNaCl水溶液)中で激しくボルテックスして、付着性細菌を遊離させ、この生理食塩水を、ストレプトマイシンを含有するコロンビア血液寒天(Remel)およびtryptic soy agar(Difco)上に播いて、コロニー形成があるかを判定する。   After 4-7 days while the animals are kept in streptomycin-containing water, the animals are sacrificed and the nose is surgically removed and dissected. The nasal tissue is vortexed vigorously in 0.5% Tween-20-added saline (0.9% NaCl aqueous solution) to release adherent bacteria, and this saline solution is added to Columbia blood agar containing streptomycin (Remel ) And tryptic soy agar (Difco) to determine if there is colony formation.

これまで述べてきた本発明は、実施例を参照することによってより深く理解されよう。以下の実施例は、単なる例示目的のためであり、いかようにも本発明の範囲を限定しないものと解釈されるべきである。   The invention described so far will be better understood by reference to the examples. The following examples are for illustrative purposes only and are not to be construed as limiting the scope of the invention in any way.

黄色ブドウ球菌PepGによるマウスの免疫感作に対するハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の産生
黄色ブドウ球菌PepGに対するモノクローナル抗体を産生させるために、Harlan Sprague Dawley(インディアナ州インディアナポリス)から入手した5〜6週齢のメスBALB/cマウスを使用して免疫感作を実施した。一次免疫感作の免疫原は、黄色ブドウ球菌PepG(Roman Dziarski氏より贈与されたもの;PepGは、実施例2に記載のとおりに調製することもできる)とした。5μlのPepG(7mg/ml懸濁液)を、345μlのPBSおよび350μlのRIBIアジュバント(RIBI Immunochemicals、ニューハンプシャー州ハミルトン)と混合した。得られる懸濁液は、50μg/mlのPepGを含んでいた。それぞれのマウスを、0.1ml(マウス1匹あたり5μg)の皮下(sc)投与によって免疫感作した。
Production of hybridomas and monoclonal antibodies against immunization of mice with S. aureus PepG 5-6 week old female BALB obtained from Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN) to produce monoclonal antibodies against S. aureus PepG Immunization was performed using / c mice. The immunogen for primary immunization was S. aureus PepG (a gift from Mr. Roman Dziarski; PepG can also be prepared as described in Example 2). 5 μl PepG (7 mg / ml suspension) was mixed with 345 μl PBS and 350 μl RIBI adjuvant (RIBI Immunochemicals, Hamilton, NH). The resulting suspension contained 50 μg / ml PepG. Each mouse was immunized by subcutaneous (sc) administration of 0.1 ml (5 μg per mouse).

最初の免疫感作から約4週間後に、追加免疫感作を施した。PBS(873μl)を7.1μlのPepG(7mg/ml懸濁液)および120μlのAlhydrogel(Accurate Chemical and Scientific, Co.、ニューヨーク州ウェストベリー)と混合した。それぞれのマウスに、0.1ml(マウス1匹あたり5μgのPepG)を皮下投与した。   A booster immunization was given approximately 4 weeks after the first immunization. PBS (873 μl) was mixed with 7.1 μl PepG (7 mg / ml suspension) and 120 μl Alhydrogel (Accurate Chemical and Scientific, Co., Westbury, NY). 0.1 ml (5 μg PepG per mouse) was administered subcutaneously to each mouse.

さらに8週間後、50%のAlumアジュバント(Pierceカタログ番号77161)を含有する50μg/mlのPBS溶液(0.2ml/マウス)を用いてマウスを免疫感作した。免疫感作したマウスの血清を上述のようにELISAによって試験した。表1に示すように、マウス8813の血清がPepGに最も強く結合した。ハイブリドーマを作製する3日前に、このマウスに、融合前の最後の追加免疫としてPBS中10μgのPepGを腹腔内投与した。

Figure 2005524624
After an additional 8 weeks, mice were immunized with a 50 μg / ml PBS solution (0.2 ml / mouse) containing 50% Alum adjuvant (Pierce cat # 77161). Sera from immunized mice were tested by ELISA as described above. As shown in Table 1, mouse 8813 serum bound most strongly to PepG. Three days before hybridoma generation, the mice received 10 μg PepG in PBS intraperitoneally as the last boost before fusion.
Figure 2005524624

ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマは、Shulman、Wilde、およびKohler、ならびにBartal, A. H.およびHirshautの一般法(2、28)によって調製した。マウス8813の脾臓細胞とSP2/0マウス骨髄腫細胞(ATCC番号CRL1581)を、SP2/0細胞1個あたり10個の脾臓細胞の比率で混合し、遠心分離(400×g、室温で10分間)によってペレット状にし、血清を含まないDMEM(Hycloneカタログ番号SH30081.01、または等価物)中で洗浄した。上清を除去し、無菌の50ml容遠心円錐容器において、ポリエチレングリコール(PEG、分子量1500、Boehringer Mannheimカタログ番号783641)の50%w/v溶液1mlを60〜90秒間かけて加えることによって、細胞混合物の融合を完結した。次いで、血清を含まない培地を、1、2、4、8、16、および19mlの体積で順次ゆっくりと加えた。ハイブリドーマ細胞の懸濁液を培地に穏やかに再懸濁し、遠心分離(500×g、室温で10分間)によって細胞をペレット状にした。上清を除去し、細胞は、10%の熱失活ウシ胎児血清、0.05mMのヒポキサンチン、および16μMのチミジンを補充したRPMI 1640(HT培地;Life Technologiesカタログ番号11067-030、または等価物)に再懸濁した。100μlの懸濁ハイブリドーマ細胞を、96穴組織培養プレートに播いた。8個のウェル(プレートAの列1)に、約2.5×104個のSP2/0細胞の入った液100μlを入れた。このSP2/0細胞は、24時間後に加える選択培地による死滅作用についての対照として利用した。
Hybridoma generation Hybridomas were prepared by the general method of Shulman, Wilde and Kohler, and Bartal, AH and Hirshaut (2, 28). Spleen cells of mouse 8813 and SP2 / 0 mouse myeloma cells (ATCC number CRL1581) were mixed at a ratio of 10 spleen cells per SP2 / 0 cell and centrifuged (400 × g, 10 minutes at room temperature) And washed in serum free DMEM (Hyclone catalog number SH30081.01, or equivalent). The cell mixture is removed by removing the supernatant and adding 1 ml of a 50% w / v solution of polyethylene glycol (PEG, molecular weight 1500, Boehringer Mannheim catalog number 783641) over a period of 60-90 seconds in a sterile 50 ml centrifuge cone. Completed the fusion. The serum-free medium was then slowly added sequentially in 1, 2, 4, 8, 16, and 19 ml volumes. The hybridoma cell suspension was gently resuspended in medium and the cells pelleted by centrifugation (500 × g, 10 minutes at room temperature). The supernatant was removed and the cells were RPMI 1640 supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum, 0.05 mM hypoxanthine, and 16 μM thymidine (HT medium; Life Technologies catalog number 11067-030, or equivalent) Resuspended. 100 μl of suspended hybridoma cells were seeded in 96-well tissue culture plates. In eight wells (row 1 of plate A), 100 μl of a solution containing about 2.5 × 10 4 SP2 / 0 cells was placed. The SP2 / 0 cells were used as a control for killing effect by selective medium added 24 hours later.

ハイブリドーマを調製してから24時間後に、10%の熱失活ウシ胎児血清、0.1mMのヒポキサンチン、0.8μMのアミノプテリン、および32μMのチミジンを補充したRPMI 1640(HAT培地、Life Technologiesカタログ番号11067-030、または等価物)100μlを各ウェルに加えた。   24 hours after preparing the hybridoma, RPMI 1640 supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum, 0.1 mM hypoxanthine, 0.8 μM aminopterin, and 32 μM thymidine (HAT medium, Life Technologies catalog number 11067). -030, or equivalent) 100 μl was added to each well.

ハイブリドーマを調製してから96時間後に、プレートA列1のSP2/0細胞が死滅し、HAT選択培地が、融合していないSP2/0細胞を首尾よく死滅させたことが示された。ハイブリドーマを調製してから12日後に、PepGに結合した抗体が存在するかどうか、すべてのウェルの上清をELISAによって試験した。   96 hours after preparing the hybridoma, SP2 / 0 cells in plate A row 1 were killed, indicating that the HAT selection medium successfully killed unfused SP2 / 0 cells. Twelve days after hybridoma preparation, supernatants from all wells were tested by ELISA for the presence of antibodies bound to PepG.

この予備アッセイの結果に基づき、もとの760ウェルのうち28ウェルからの細胞を24穴培養皿に移した。4日後、アイソタイプ特異的な試験試薬を使用して、PepGに結合した抗体が存在するかどうか、これら培養物の上清をELISAによって再試験した。簡潔に述べると、培養物の上清をPepGでコートした96穴プレートに加え、結合するようにした。抗体のPepGへの結合と抗体のアイソタイプを同時に検出するために、一連のウェルを、HRP結合ウサギ抗マウスIgA、HRP結合ウサギ抗マウスIgG、およびHRP結合ウサギ抗マウスIgMと共にインキュベートした。次いで、ウェルを洗浄し、標準の方法によって発色させた。表2に示すように、IgG抗体を産生した培養物の1つ(99-110CF10)をさらに継代した。また、IgM抗体を生じた他の15個の培養物もさらに継代した。

Figure 2005524624
Based on the results of this preliminary assay, cells from 28 of the original 760 wells were transferred to 24-well culture dishes. Four days later, the supernatants of these cultures were retested by ELISA for the presence of antibodies bound to PepG using isotype specific test reagents. Briefly, the culture supernatant was added to a 96-well plate coated with PepG to allow binding. A series of wells were incubated with HRP-conjugated rabbit anti-mouse IgA, HRP-conjugated rabbit anti-mouse IgG, and HRP-conjugated rabbit anti-mouse IgM to simultaneously detect antibody binding to PepG and antibody isotype. The wells were then washed and developed by standard methods. As shown in Table 2, one of the cultures that produced IgG antibodies (99-110CF10) was further passaged. The other 15 cultures that produced IgM antibodies were also further passaged.
Figure 2005524624

培養物99-110CF10および99-110FC12を、以下のように限界希釈によってサブクローニングした。血球計数器を使用してハイブリドーマを数え、225細胞/mlの濃度に調整した。次いで、1mlの細胞溶液を、RPMI 1640培地36ml、熱不活化ウシ胎児血清7.5ml、10mg/mlのカナマイシン溶液(GIBCO BRLカタログ番号15160-054)0.5ml、およびHybridoma Serum Free培地(Life Technologiesカタログ番号12045-084)5mlと混合した。得られる懸濁液は、4.5細胞/mlを含んでいた。次いで、この懸濁液200μlを、2枚の96穴培養皿の各ウェルに加えた。表2および表3に示すように、培養物99-110CF10は、PepGに結合した抗体を産生しなかった。培養物99-110CF10のその後のサブクローンも同様に、PepG特異的な抗体を誘発しなかった。

Figure 2005524624
Cultures 99-110CF10 and 99-110FC12 were subcloned by limiting dilution as follows. Hybridomas were counted using a hemocytometer and adjusted to a concentration of 225 cells / ml. The 1 ml cell solution was then added to 36 ml RPMI 1640 medium, 7.5 ml heat-inactivated fetal calf serum, 0.5 ml 10 mg / ml kanamycin solution (GIBCO BRL catalog number 15160-054), and Hybridoma Serum Free medium (Life Technologies catalog number). 12045-084) mixed with 5 ml. The resulting suspension contained 4.5 cells / ml. 200 μl of this suspension was then added to each well of two 96-well culture dishes. As shown in Tables 2 and 3, culture 99-110CF10 did not produce antibodies that bound to PepG. Subsequent subclones of culture 99-110CF10 likewise did not elicit PepG specific antibodies.
Figure 2005524624

表4に示す、培養物99-110FC12からのクローンは、PepGに結合したIgM抗体を産生し続けた。99-110FC12からの32種のクローンを、PepGでコートしたプレート上でのELISAによって試験した。そのうち、31種は、3.159以上の値の吸光度を生じ、強い陽性であった。99-110FC12 IE4、ID3、IIH5、およびIIC6と称した4種のクローンを増殖させ、凍結保存した。更なる分析のためにクローンIE4を選択した。

Figure 2005524624
The clones from culture 99-110FC12, shown in Table 4, continued to produce IgM antibodies bound to PepG. 32 clones from 99-110FC12 were tested by ELISA on PepG coated plates. Of these, 31 species were strongly positive with absorbances of 3.159 or higher. Four clones designated 99-110FC12 IE4, ID3, IIH5, and IIC6 were grown and stored frozen. Clone IE4 was selected for further analysis.
Figure 2005524624

培養上清中で大量の免疫グロブリンを産生するように設計したIntegra Biosystems培養系で、クローン99-110FC12 IE4を増殖させた。IE4クローンの上清を、メタノール-固定化表皮ブドウ球菌株Hay、PepG、およびLTAでコートされたウェル上でのELISAによって試験した。表5に示すように、この抗体は、黄色ブドウ球菌PepGには強く結合したものの、メタノール-固定化細菌または黄色ブドウ球菌LTAには結合しなかった。

Figure 2005524624
Clone 99-110FC12 IE4 was grown in an Integra Biosystems culture system designed to produce large amounts of immunoglobulin in the culture supernatant. The supernatants of IE4 clones were tested by ELISA on wells coated with methanol-immobilized Staphylococcus epidermidis strains Hay, PepG, and LTA. As shown in Table 5, this antibody bound strongly to S. aureus PepG but not to methanol-fixed bacteria or S. aureus LTA.
Figure 2005524624

枯草菌PepGに対するハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の調製
ペプチドグリカンの精製
枯草菌(B. subtilis)HR(英国University of KentのHoward Roger氏より贈与されたもの)の栄養細胞壁を、リポ多糖を含まない材料を使用し、ストリンジェントな条件下で、これまでに述べられているように作製した(6、38、これら文献をいかなる目的でも本明細書に取り入れる)。プロナーゼ処理によって、ペプチドグリカンからタンパク質を除去し、テイコ酸および他の付着した重合体を、4℃で24時間、HF(48%v/v)処理して除去した。遠心分離(13,000g、4℃で5分間)によって不溶性のペプチドグリカンをペレット状にし、蒸留水に再懸濁して、2mg/ml PepGとした。このステップを1回繰り返した。次いで、そのペプチドグリカンをペレット状にし、50mMのpH7.5トリスHClに再懸濁して、2mg/ml PepGとし、このステップを1回繰り返した。最後に、もう3回、そのペプチドグリカンをペレット状にし、蒸留水に再懸濁して、2mg/ml PepGとした。ペプチドグリカンを蒸留水に約10mg/mlで再懸濁し、-20℃で保管した。
Preparation of hybridoma and monoclonal antibodies against Bacillus subtilis PepG
Purified peptidoglycan B. subtilis HR (a gift from Howard Roger, University of Kent, UK) The vegetative cell wall has been used under stringent conditions using materials that do not contain lipopolysaccharide. (6, 38, which are incorporated herein for any purpose). Proteins were removed from the peptidoglycan by pronase treatment, and teichoic acid and other attached polymers were removed by HF (48% v / v) treatment at 4 ° C. for 24 hours. Insoluble peptidoglycan was pelleted by centrifugation (13,000 g, 5 min at 4 ° C.) and resuspended in distilled water to 2 mg / ml PepG. This step was repeated once. The peptidoglycan was then pelleted and resuspended in 50 mM pH 7.5 Tris HCl to 2 mg / ml PepG, and this step was repeated once. Finally, the peptidoglycan was pelleted three more times and resuspended in distilled water to 2 mg / ml PepG. Peptidoglycan was resuspended in distilled water at about 10 mg / ml and stored at -20 ° C.

ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって、これまでに述べられているようにPepG調製物を分析すると、汚染しているタンパク質の形跡がないことが明らかになった(39)。加水分解したPepGのアミノ酸分析で予想されたアミノ酸のみが得られたことよって、また酵素によって消化した材料を逆相クロマトグラフィーで分析することによって、ペプチドグリカンの純度をさらに確認したが、どちらのアッセイもこれまでに述べられているとおりに実施した(1)。抗ペプチドグリカン抗体を生成する際、このレベルの純度が確保されたことはこれまでになかった。   Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) revealed no evidence of contaminating proteins when analyzing PepG preparations as previously described (39) . The purity of peptidoglycan was further confirmed by obtaining only the predicted amino acid from the amino acid analysis of hydrolyzed PepG and by analyzing the enzyme digested material by reverse phase chromatography. It was carried out as previously described (1). This level of purity has never been ensured in the production of anti-peptidoglycan antibodies.

免疫感作のためのムロペプチド・コンジュゲートの調製
ペプチド用Imject SuperCarrier EDCシステム(Pierceカタログ番号77152)の製造者のプロトコルどおりに、ペプチドグリカン・コンジュゲートを作製した。
Preparation of Muropeptide Conjugates for Immunization Peptidoglycan conjugates were made according to the manufacturer's protocol for Imject SuperCarrier EDC system for peptides (Pierce Cat # 77152).

ムロペプチドは、セロシル(Cellosyl)消化によって生成した。セロシルは、PepGのグリカン主鎖のN-アセチルムラミン酸とN-アセチルグルコサミンの間の結合を切断するムラミダーゼである。PepGを完全にセロシル消化すると、小さい可溶性のムロペプチドが得られる。遠心分離(13,000g、5分間、4℃)によって、11.5mg/mlの精製ペプチドグリカン1mlを収集し、ペプチド用Imject SuperCarrier EDCシステム(Pierce、カタログ番号77152)を補充した1mlの結合緩衝液に再懸濁した。25μlのセロシル(2mg/ml、Hoechst)をこのPepG懸濁液に加え、回転混合しながら37℃で7時間インキュベートした。次いで、サンプルを10分間煮沸し、上述のような遠心分離によって不溶性の材料を除去した。セロシル消化したPepG 300μlを200μlの結合緩衝液に加えた。   Muropeptides were generated by Cellosyl digestion. Cellosyl is a muramidase that cleaves the bond between N-acetylmuramic acid and N-acetylglucosamine in the glycan backbone of PepG. Completely cellosyl digestion of PepG yields a small soluble muropeptide. Collect 1 ml of purified peptidoglycan at 11.5 mg / ml by centrifugation (13,000 g, 5 min, 4 ° C.) and resuspend in 1 ml binding buffer supplemented with Imject SuperCarrier EDC system for peptides (Pierce, catalog number 77152). It became cloudy. 25 μl of cellosyl (2 mg / ml, Hoechst) was added to the PepG suspension and incubated for 7 hours at 37 ° C. with rotary mixing. The sample was then boiled for 10 minutes and insoluble material was removed by centrifugation as described above. 300 μl of cellosyl digested PepG was added to 200 μl of binding buffer.

SuperCarrier(Pierce、カタログ番号77152)の調製、結合、およびコンジュゲートの精製を、製造者のプロトコルどおりに実施した。PepGコンジュゲートは、-20℃で保管した。   Preparation of SuperCarrier (Pierce, catalog number 77152), conjugation, and purification of the conjugate were performed according to the manufacturer's protocol. PepG conjugate was stored at -20 ° C.

マウスの免疫感作
枯草菌PepGに対するモノクローナル抗体を産生するために、Sheffield University Field Laboratoriesから入手した4匹の8〜12週齢BALB/Cマウスを使用して、免疫感作を実施した。一次免疫感作の免疫原は、ムロペプチド・コンジュゲート(上記)として調製した枯草菌PepGであった。各マウスについて、50μgのコンジュゲートの入った50μLのPBSを50μlのフロイント完全アジュバントと混合し、この混合物を皮下注射した。
Immunization of mice Four 8-12 week old BALB / C mice obtained from Sheffield University Field Laboratories were immunized to produce monoclonal antibodies against Bacillus subtilis PepG. The immunogen for primary immunization was Bacillus subtilis PepG prepared as a muropeptide conjugate (above). For each mouse, 50 μL of PBS containing 50 μg of conjugate was mixed with 50 μl of Freund's complete adjuvant and this mixture was injected subcutaneously.

一次免疫感作を行ってから約14日、29日、113日、および232日目に、それぞれのマウスに、50μgのコンジュゲートの入った50μLのPBSを50μlのフロイント不完全アジュバントと混合しておいたものを腹腔内注射した。ハイブリドーマは、PepGコンジュゲートの最後の追加免疫から4日後に作製した。   Approximately 14 days, 29 days, 113 days, and 232 days after the primary immunization, each mouse was mixed with 50 μl PBS containing 50 μg conjugate with 50 μl Freund's incomplete adjuvant. The placed one was injected intraperitoneally. Hybridomas were made 4 days after the last boost with PepG conjugate.

ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマは、Shulman、Wilde、およびKohler、ならびにBartalおよびHirshautの一般法(2、28)によって調製した。免疫感作したマウス1および2の脾臓細胞をプールし、SP2/0マウス骨髄腫細胞と、SP2/0細胞1個あたり5個の脾臓細胞の比率で混合し、遠心分離(770×g、30℃で5分間)によってペレット状にし、血清を含まないRPMI中で洗浄した。1mlのPEG 1500(75mMのHEPES中50%、Boehringerカタログ番号783641)を1分間かけて加えた後、1mlのRPMIを1分間かけて加え、次いで9mlのRPMIを2分間かけて加えた。次いで30℃で15分間、430×gの遠心分離にかけて、細胞をペレット状にした。細胞を、20%のFCSを含有するRPMI-1640/HAT(1mlの50xHAT濃縮物(Invitrogenカタログ番号21060-017)を50mlのRPMI-1640に入れたもの)に約1×106細胞/mlで再懸濁した。100mlの細胞懸濁液を10枚の96穴プレートの各ウェルに加え、37℃で増殖させた。融合していないSP2/0細胞を選択対照として使用したが、播いてから5日後に死滅した。
Hybridoma generation Hybridomas were prepared by the general method of Shulman, Wilde, and Kohler, and Bartal and Hirshaut (2, 28). Spleen cells from immunized mice 1 and 2 are pooled and mixed with SP2 / 0 mouse myeloma cells at a ratio of 5 spleen cells per SP2 / 0 cell and centrifuged (770 × g, 30 At 5 ° C.) and washed in serum-free RPMI. 1 ml of PEG 1500 (50% in 75 mM HEPES, Boehringer catalog number 783641) was added over 1 minute followed by 1 ml RPMI over 1 minute followed by 9 ml RPMI over 2 minutes. The cells were then pelleted by centrifugation at 430 xg for 15 minutes at 30 ° C. Cells at approximately 1 × 10 6 cells / ml in RPMI-1640 / HAT containing 20% FCS (1 ml of 50 × HAT concentrate (Invitrogen catalog number 21060-017) in 50 ml of RPMI-1640) Resuspended. 100 ml of cell suspension was added to each well of 10 96-well plates and grown at 37 ° C. Unfused SP2 / 0 cells were used as a selection control but died 5 days after seeding.

ハイブリドーマを調製してから13日後に、PepGを結合する抗体が存在するかどうか、すべてのウェルの上清をELISAによって検定した。試験した829ウェルのうち13ウェルが陽性であった。   Thirteen days after hybridoma preparation, supernatants from all wells were assayed by ELISA for the presence of antibodies that bind PepG. Of the 829 wells tested, 13 were positive.

ELISAの結果に基づき、陽性の細胞を24穴培養プレートで増殖させ、安定な抗体の分泌があるかどうかELISAによって再試験した。6系列がPepGに対する抗体を分泌することがわかった。系列BB4は、枯草菌細胞壁に対する親和性の最も高い抗体を産生することが判明した。約75%の集密さで、BB4を限界希釈によってクローン化し、サブクローンを、抗PepG抗体の分泌があるかどうか再試験した。2種のクローンBB4/A4およびBB4/A5は、枯草菌PepGに対する抗体を分泌することがわかった。Isotype Strips(Roche Diagnostics、カタログ番号1493027)を使用するアイソタイプ判定では、どちらの抗体もIgGであることが示された。   Based on ELISA results, positive cells were grown in 24-well culture plates and retested by ELISA for stable antibody secretion. Six series were found to secrete antibodies against PepG. Lineage BB4 was found to produce antibodies with the highest affinity for the Bacillus subtilis cell wall. At approximately 75% confluence, BB4 was cloned by limiting dilution and subclones were retested for anti-PepG antibody secretion. Two clones, BB4 / A4 and BB4 / A5, were found to secrete antibodies against Bacillus subtilis PepG. Isotype determination using Isotype Strips (Roche Diagnostics, catalog number 1493027) indicated that both antibodies were IgG.

PepG抗体の基質親和性
PepGのセロシル消化
Bacillus subtilis(枯草菌)、Staphylococcus aureus(黄色ブドウ球菌)、Streptococcus mutans(ストレプトコッカス・ミュータンス)、Bacillus megaterium(バチルス・メガテリウム)、Enterococcus faecalis(エンテロコッカス・ファエカリス)、Staphylococcus epidermidis(表皮ブドウ球菌)、およびListeria monocytogenes(リステリア・モノサイトゲネス)由来のPepGを実施例2に記載のとおりに精製した。1mlの各PepG(10mg/ml)を25mMのpH5.6リン酸ナトリウム緩衝液に入れ、37℃で15時間、250μg/mlのセロシル(Hoechst AG)で消化した。サンプルを3分間煮沸して、反応を停止させ、遠心分離(14,000×g、室温で8分間)によって不溶性材料を除去した。可溶性のセロシル消化PepGを-20℃で保管した。
Substrate affinity of PepG antibody
Cellosyl digestion of PepG
Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Bacillus megaterium, Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis and epidermidis PepG from monocytogenes (Listeria monocytogenes) was purified as described in Example 2. 1 ml of each PepG (10 mg / ml) was placed in 25 mM pH5.6 sodium phosphate buffer and digested with 250 μg / ml cellosyl (Hoechst AG) at 37 ° C. for 15 hours. Samples were boiled for 3 minutes to stop the reaction and insoluble material was removed by centrifugation (14,000 × g, 8 minutes at room temperature). Soluble cellosyl digested PepG was stored at -20 ° C.

ブドウ球菌PepGは、独特なペンタグリシン架橋をもっており、これは、グリシン-グリシン・エンドペプチダーゼであるリソスタフィンによって切断することができる。黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌PepGのセロシル消化物にリソスタフィン(25μg/ml、Sigmaカタログ番号L0761)を加えて、このペプチド架橋を切断した。黄色ブドウ球菌は、リソスタフィンなしでも消化した。   Staphylococcus PepG has a unique pentaglycine bridge that can be cleaved by lysostaphin, a glycine-glycine endopeptidase. Lysostaphin (25 μg / ml, Sigma catalog number L0761) was added to the cellosyl digest of S. aureus and S. epidermidis PepG to cleave this peptide bridge. S. aureus was digested without lysostaphin.

PepGおよびセロシル消化PepGに対する抗体の親和性を判定するためのELISA
UVで不活化した完全黄色ブドウ球菌でマウスに免疫感作することによって、11-232.3、11-248.2、および11569.3であると同定された3種のハイブリドーマ系列(QED Biosciences)を作製し、これら系列が産生するMAbが、その後PepGに結合することが示された。11-232.3(精製されたときには、このMAbを702PGと呼ぶ)、11-248.2、および11-569.3、BB4/A4およびBB4/A5によって産生されたMAbの、種々の細菌由来のPepGに対する親和性と、種々の細菌由来のセロシル消化PepGに対する親和性を、ELISAによって次のように比較した。96穴イムノアッセイ・プレート(NUNC Immunoplate Maxisorp)を、100μg/mlのポリ-L-リシン(Sigma Chemicals、カタログ番号P6407)の入った0.05MのpH9.6炭酸塩/重炭酸塩緩衝液(0.015MのNa2CO3、0.035MのNaHCO3、pH9.6、以下では炭酸塩緩衝液と呼ぶ)を用い、室温で1時間時間かけてコートした。炭酸塩緩衝液を除去し、ウェルを炭酸塩緩衝液で1回洗浄した。次いで、炭酸塩緩衝液中5μg/mlの精製したPepG基質またはセロシル消化PepG基質100μlを用い、4℃で一晩かけてウェルをコートした。基質溶液を除去し、ウェルをPBS-Tで2回洗浄した。次いで、0.2%w/vのウシゼラチンを含有するPBS-T(Sigmaカタログ番号A7030、ブロック用緩衝液)150μlで、37℃で2時間かけてウェルをブロックした。ブロック用緩衝液を除去し、ウェルをPBS-Tで4回洗浄した。
ELISA to determine the affinity of antibodies for PepG and cellosyl digested PepG
Three hybridoma lines (QED Biosciences) identified as 11-232.3, 11-248.2, and 11569.3 were generated by immunizing mice with UV-inactivated complete S. aureus, and these lines Was shown to bind to PepG. 11-232.3 (when purified, this MAb is referred to as 702PG), 11-248.2, and 11-569.3, BB4 / A4 and BB4 / A5 produced MAbs with different affinities for PepG from various bacteria The affinity for cellosyl digested PepG from various bacteria was compared by ELISA as follows. A 96-well immunoassay plate (NUNC Immunoplate Maxisorp) was added to 0.05 M pH 9.6 carbonate / bicarbonate buffer (0.015 M in 100 μg / ml poly-L-lysine (Sigma Chemicals, catalog number P6407). Na 2 CO 3, NaHCO of 0.035 M 3, pH 9.6, in the following reference is referred to as carbonate buffer) was coated over 1 hour time at room temperature. The carbonate buffer was removed and the wells were washed once with carbonate buffer. The wells were then coated overnight at 4 ° C. with 100 μl of purified PepG substrate or cellosyl digested PepG substrate in carbonate buffer at 5 μg / ml. The substrate solution was removed and the wells were washed twice with PBS-T. The wells were then blocked for 2 hours at 37 ° C. with 150 μl of PBS-T (Sigma catalog number A7030, blocking buffer) containing 0.2% w / v bovine gelatin. Blocking buffer was removed and the wells were washed 4 times with PBS-T.

上で挙げたMAbのうちの1種(ブロック用緩衝液に加えて適切に希釈したもの)を各ウェルに50μl加え、結合反応液を37℃で2時間インキュベートした。モノクローナル抗体を除去し、ウェルをPBS-T中で3回洗浄した。ブロック用緩衝液中に2万倍に希釈したHRP結合ヤギ抗マウスIgG(Biorad)50μlを各ウェルに加え、結合反応液を37℃で1時間インキュベートした。2次抗体を除去し、ウェルをPBS-Tで3回洗浄した。50μlのTMB酵素基質(Bioradカタログ番号172-1068)を各ウェルに加え、室温で15分間かけて発色させた。50μlの2M H2SO4を各ウェルに加えて反応を停止させ、VICTORプレートリーダー(Wallac)で450nmの吸光度を読み取った。このELISAの結果を表6に示す。 50 μl of one of the MAbs listed above (appropriately diluted in addition to blocking buffer) was added to each well and the binding reaction was incubated at 37 ° C. for 2 hours. The monoclonal antibody was removed and the wells were washed 3 times in PBS-T. 50 μl of HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (Biorad) diluted 20,000-fold in blocking buffer was added to each well and the binding reaction was incubated at 37 ° C. for 1 hour. The secondary antibody was removed and the wells were washed 3 times with PBS-T. 50 μl of TMB enzyme substrate (Biorad catalog number 172-1068) was added to each well and allowed to develop for 15 minutes at room temperature. The reaction was stopped by adding 50 μl of 2M H 2 SO 4 to each well, and the absorbance at 450 nm was read with a VICTOR plate reader (Wallac). The results of this ELISA are shown in Table 6.

表6では、記載のPepG抗体が種々のPepG基質に対して異なる範囲の特異性および親和性を示しているので、それぞれが同一でないことが実証される。詳細には、702PG、MAb-11-232.3、およびMAb-11-248.2は、黄色ブドウ球菌PepGに対する親和性が高く、枯草菌PepGに対する親和性が低いのに対し、BB4/A4およびBB4/A5(MAb-BB4/A4およびMAb-BB4/A5とも呼ぶ)によって産生された抗体は、逆の特異性を示す。MAb-BB4/A4およびMAb-BB4/A5はまた、表皮ブドウ球菌に対しても高い親和性を示したものの、他の細菌に対しては示さなかった。

Figure 2005524624
Table 6 demonstrates that the described PepG antibodies show different ranges of specificities and affinities for various PepG substrates, so that each is not identical. Specifically, 702PG, MAb-11-232.3, and MAb-11-248.2 have high affinity for S. aureus PepG and low affinity for Bacillus subtilis PepG, whereas BB4 / A4 and BB4 / A5 ( Antibodies produced by MAb-BB4 / A4 and MAb-BB4 / A5) show the opposite specificity. MAb-BB4 / A4 and MAb-BB4 / A5 also showed high affinity for Staphylococcus epidermidis but not for other bacteria.
Figure 2005524624

Bacillus subtilis 168 HRは、英国University of KentのHoward Roger氏より贈与を受けた。   Bacillus subtilis 168 HR was awarded by Howard Roger, University of Kent, UK.

Staphylococcus aureus 8325/4は、米国ニューヨーク州Skirball InstituteのRichard Novick氏より贈与を受けた。   Staphylococcus aureus 8325/4 was a gift from Richard Novick of the Skiball Institute, New York.

Streptococcus mutans LTIIは、英国University of NewcastleのRoy Russell氏より贈与を受けた。   Streptococcus mutans LTII was a gift from Roy Russell of the University of Newcastle.

Bacillus megaterium KMは、英国ケンブリッジ大学のKeith Johnstone氏から贈与を受けた。   Bacillus megaterium KM was awarded by Keith Johnstone of Cambridge University, UK.

Staphylococcus epidermidis 138は、英国University of NottinghamのPaul Williams氏より贈与を受けた。   Staphylococcus epidermidis 138 was a gift from Paul Williams of the University of Nottingham.

Listeria monocytogenes EGDは、ドイツUniversity of WurzburgのW. Goebel氏より贈与を受けた。   Listeria monocytogenes EGD was awarded by W. Goebel from the University of Wurzburg.

グリカン鎖を切断するセロシル消化にかけると、どんなPepG基質も、抗体702PG、MAb-11-232.3、MAb-11-248.2、MAb-BB4/A4、およびMAb-BB4/A5によって結合されにくくなる。したがって、これらの抗体は、完全グリカン鎖を要するエピトープと相互に作用するのかもしれない。一方、MAb-11-569.3の親和性は、セロシル消化による影響を受けず、切断される結合と関係のないエピトープと相互に作用し得ることが示唆される。セロシル/リソスタフィンの結果は、単一の消化の結果をさらに確実にするものである。   When subjected to cellosyl digestion that cleaves glycan chains, any PepG substrate is less likely to be bound by antibodies 702PG, MAb-11-232.3, MAb-11-248.2, MAb-BB4 / A4, and MAb-BB4 / A5. Thus, these antibodies may interact with epitopes that require complete glycan chains. On the other hand, the affinity of MAb-11-569.3 is unaffected by cellosyl digestion, suggesting that it can interact with epitopes unrelated to the cleaved bond. The results of cellosyl / lysostaphin further ensure the results of a single digestion.

最後に、黄色ブドウ球菌PepGは、そのグルコサミン残基でのO-アセチル化のレベルが枯草菌由来のPepGよりも高く、このO-アセチル化が、抗体702PG、MAb-11-232.3、およびMAb-11-248.2による結合にとって重要であり、MAbBB4/A4およびMAb-BB4/A5による結合にはマイナスの影響を及ぼし得ることが示唆される。   Finally, S. aureus PepG has a higher level of O-acetylation at its glucosamine residue than PepG from Bacillus subtilis, and this O-acetylation is due to antibodies 702PG, MAb-11-232.3, and MAb- It is important for binding by 11-248.2, suggesting that binding by MAbBB4 / A4 and MAb-BB4 / A5 can have a negative impact.

モノクローナル抗体のLTA、PepG、およびブドウ球菌への結合
MAb-11-232.3、MAb-11-248.2、MAb-11-569.3、およびMAb-99-110FC12 IE4が、黄色ブドウ球菌PepG、黄色ブドウ球菌LTA、メタノール-固定化黄色ブドウ球菌、およびメタノール-固定化表皮ブドウ球菌に結合するかどうかを検定した。これらのMAbに加えて、A110と称するヒト/マウスキメラ抗LTA抗体を、LTAおよび表皮ブドウ球菌の結合に対する陽性対照としてこのアッセイに含めた。A110の生成およびキメラ化についての記載は、1998年6月15日に出願の米国特許出願第09/097,055号中に見ることができる。
Binding of monoclonal antibodies to LTA, PepG, and staphylococci
MAb-11-232.3, MAb-11-248.2, MAb-11-569.3, and MAb-99-110FC12 IE4 are S. aureus PepG, S. aureus LTA, methanol-immobilized S. aureus, and methanol-immobilized Whether it binds to Staphylococcus epidermidis was tested. In addition to these MAbs, a human / mouse chimeric anti-LTA antibody designated A110 was included in this assay as a positive control for LTA and Staphylococcus epidermidis binding. A description of the generation and chimerization of A110 can be found in US patent application Ser. No. 09 / 097,055 filed Jun. 15, 1998.

表7に示すように、MAb-11-232.3、11-248.2腹水、および99-110FC12IE4上清はすべて、黄色ブドウ球菌PepGに強く結合した。予想どおり、抗LTA抗体であるA110は、PepGに結合していない。

Figure 2005524624
As shown in Table 7, MAb-11-232.3, 11-248.2 ascites, and 99-110FC12IE4 supernatant all bound strongly to S. aureus PepG. As expected, A110, an anti-LTA antibody, does not bind to PepG.
Figure 2005524624

LTAについて試験した際には、表8に示すように、A110のみが強い結合を示した。MAb-11-232.3、MAb-11-569.3、および99-110FC12IE上清では、結合が得られなかった。100倍希釈の11-248.2腹水では、若干の交差反応性が得られたが、これは、腹水中に非特異的免疫グロブリンが高濃度で存在するためであるかもしれない。

Figure 2005524624
When tested for LTA, only A110 showed strong binding, as shown in Table 8. No binding was obtained with MAb-11-232.3, MAb-11-569.3, and 99-110FC12IE supernatants. Some cross-reactivity was obtained with 100-fold diluted 11-248.2 ascites, which may be due to the presence of high concentrations of nonspecific immunoglobulins in the ascites.
Figure 2005524624

これらのデータは、UVで死滅させた完全黄色ブドウ球菌に対して産生されたMAb-11-232.3およびMAb-11-248.2が、細菌表面上のPepGに特異的であることを示した。同じくUVで死滅させた黄色ブドウ球菌に対して産生されたMAb-11-569.3は、PepGへの結合がはるかに弱い上、LTAにも結合しないので、PepGに特異的であるかもしれないが、別の表面抗原にも特異的であり、PepGと交差反応しているのかもしれないことが示された。予想どおり、精製した黄色ブドウ球菌PepGに対して産生されたMAb-99110FC12IE4は、LTAには結合せず、PepGにかなり強く結合する。   These data indicated that MAb-11-232.3 and MAb-11-248.2 produced against UV-killed S. aureus were specific for PepG on the bacterial surface. MAb-11-569.3, produced against S. aureus, also killed with UV, may be specific for PepG because it binds much less to PepG and does not bind to LTA, It was shown that it is also specific for another surface antigen and may cross-react with PepG. As expected, MAb-99110FC12IE4 produced against purified S. aureus PepG does not bind to LTA and binds PepG fairly strongly.

それぞれのMAbを、表9および10にそれぞれ示すように、メタノール-固定化表皮ブドウ球菌株Hayおよびメタノール-固定化黄色ブドウ球菌でコートしたプレートでも試験した。   Each MAb was also tested on plates coated with methanol-immobilized S. epidermidis strain Hay and methanol-immobilized S. aureus as shown in Tables 9 and 10, respectively.

MAb-99-110FC12IE4を除くすべての抗体が、表皮ブドウ球菌株Hayに結合した。興味深いことに、MAb-11-569.3は、表皮ブドウ球菌株HayにMAb-11-232.3よりも強く結合したが、MAb-11-569.3は、PepGおよび黄色ブドウ球菌にはMAb-11-232.3ほど強く結合しなかった。この結果は、MAb-11569.3の産生の対象となった黄色ブドウ球菌表面上の抗原が、PepGであろうがPepGでなかろうが、おそらくは黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌とに保存されているために、MAb-11569.3によって両方の細菌が強く結合されることを示唆している。IgM抗体(ハイブリドーマ11-248.2および99-110FC12IE4由来)については、黄色ブドウ球菌に対しての試験は行われなかった。なぜなら、黄色ブドウ球菌でコートしたプレート向けに使用されるイムノアッセイのプロテインA法が、タンパク質に結合しないIgM抗体では機能しないためである。

Figure 2005524624
Figure 2005524624
All antibodies except MAb-99-110FC12IE4 bound to S. epidermidis strain Hay. Interestingly, MAb-11-569.3 bound more strongly to Staphylococcus epidermidis strain Hay than MAb-11-232.3, but MAb-11-569.3 was as strong as MAb-11-232.3 to PepG and Staphylococcus aureus. Did not combine. This result is due to the fact that the antigen on the surface of S. aureus from which MAb-11569.3 was produced is conserved in S. aureus and S. epidermidis, whether PepG or PepG. MAb-11569.3 suggests that both bacteria are strongly bound. IgM antibodies (derived from hybridomas 11-248.2 and 99-110FC12IE4) were not tested against S. aureus. This is because the immunoassay Protein A method used for S. aureus coated plates does not work with IgM antibodies that do not bind to the protein.
Figure 2005524624
Figure 2005524624

上述のように、ペプチドグリカンは、グラム陽性細菌に見られる細胞壁成分である。これらのアッセイは、MAb-11-232.3、MAb-11-248.2、およびMAb-99-110FC12IE4がPepGを強く結合し、グラム陽性細菌に共通する別の細胞壁成分であるLTAに結合しないことを示している。ELISA(表7)でのMAb-11-569.3によるPepGの結合は、メタノール-固定化ELISA(表10)での5型黄色ブドウ球菌の結合ほど強くない。MAbによる結合の中で認められた差は、そのMAbによって結合される特定のエピトープがあり、タンパク質ELISAと完全細菌ELISAとにおいてその特定のエピトープが提示されるためであるかもしれない。あるいは、MAb-11-569.3は、異なる抗原に結合するものの、PepGと交差反応するのかもしれない。MAb-11-232.3、11-248.2腹水、およびMAb-11-569.3は、ELISAアッセイにおいて表皮ブドウ球菌株Hayにも結合する。さらに、MAb-11-232.3およびMAb-11-569.3は、ELISAアッセイにおいて黄色ブドウ球菌にも結合する(11-248.2のELISAにおける黄色ブドウ球菌への結合は測定できなかった)。ELISAにおいて99-110FC12IE4上清による表皮ブドウ球菌株Hayへの結合がなかったことは、この抗体が黄色ブドウ球菌PepG上に見られるエピトープには結合するが、表皮ブドウ球菌株Hayでは発現されないか、または結合に利用できないことを示唆している。   As mentioned above, peptidoglycan is a cell wall component found in gram positive bacteria. These assays show that MAb-11-232.3, MAb-11-248.2, and MAb-99-110FC12IE4 bind PepG strongly and not to LTA, another cell wall component common to Gram-positive bacteria. Yes. The binding of PepG by MAb-11-569.3 in the ELISA (Table 7) is not as strong as that of type 5 S. aureus in the methanol-immobilized ELISA (Table 10). The difference observed in binding by MAb may be because there is a specific epitope bound by the MAb and that specific epitope is presented in protein and complete bacterial ELISAs. Alternatively, MAb-11-569.3 may bind to a different antigen but cross-react with PepG. MAb-11-232.3, 11-248.2 ascites, and MAb-11-569.3 also bind to S. epidermidis strain Hay in an ELISA assay. Furthermore, MAb-11-232.3 and MAb-11-569.3 also bind to S. aureus in ELISA assays (binding to S. aureus in the 11-248.2 ELISA could not be measured). The absence of binding to the Staphylococcus epidermidis strain Hay by the 99-110FC12IE4 supernatant in ELISA indicates that this antibody binds to an epitope found on S. aureus PepG but is not expressed in S. epidermidis strain Hay, Or suggest that it is not available for binding.

モノクローナル抗体のオプソニン食作用活性
抗原に結合する抗体が、必ずしもオプソニン化を増強しまたは感染からの防御を強化するとは限らない。したがって、好中球を媒介とする殺菌アッセイを利用して、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌株Hayに対する抗PepG MAbの機能活性を判定した。好中球(PMN)分離培地(Robbins Scientificカタログ番号1068-00-0)を使用して、成体静脈血から好中球(PMN)を単離した。マイクロタイタープレートの丸底のウェルに、約3×104個の対数増殖中期の細菌と共に40μlのPMNを加えた(ウェルあたり約2×106細胞)。プロテインGおよびプロテインLで処理して、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌株Hayに結合する抗体を除去したヒト血清を活性補体源として使用した。40μlの抗体を様々な希釈度でウェルに加え、プレートを一定に激しく振盪させながら37℃でインキュベートした。ゼロ時間目および2時間のインキュベート後に各ウェルから10μlのサンプルを採取した。それぞれを希釈し、激しくボルテックスして細菌を分散させ、血液寒天プレートに載せ37℃で終夜培養して、生存細菌数を定量化した。
Antibodies that bind to the opsonic phagocytic active antigen of a monoclonal antibody do not necessarily enhance opsonization or enhance protection from infection. Therefore, the functional activity of anti-PepG MAbs against S. aureus and S. epidermidis strain Hay was determined using a neutrophil-mediated bactericidal assay. Neutrophils (PMN) were isolated from adult venous blood using neutrophil (PMN) separation medium (Robbins Scientific catalog number 1068-00-0). To the round bottom wells of the microtiter plate, 40 μl of PMN was added (approximately 2 × 10 6 cells per well) with approximately 3 × 10 4 logarithmically growing bacteria. Human serum treated with protein G and protein L to remove antibodies that bind to S. aureus and S. epidermidis strain Hay was used as the source of active complement. 40 μl of antibody was added to the wells at various dilutions and the plate was incubated at 37 ° C. with constant vigorous shaking. A 10 μl sample was taken from each well after zero and 2 hours of incubation. Each was diluted, vortexed vigorously to disperse the bacteria, placed on a blood agar plate and cultured overnight at 37 ° C. to quantify the number of viable bacteria.

結果は、観察された細菌コロニー数の減少を対照サンプルに対する百分率として示す。オプソニン食作用殺菌アッセイでは、表11に示すように、99-110FC12IE4上清は5型黄色ブドウ球菌に対して活性であったが、表皮ブドウ球菌株Hayに対しては活性でなかった。

Figure 2005524624
The results show the observed reduction in the number of bacterial colonies as a percentage of the control sample. In the opsonophagocytic bactericidal assay, as shown in Table 11, the 99-110FC12IE4 supernatant was active against type 5 S. aureus but not against S. epidermidis strain Hay.
Figure 2005524624

PepGでマウスを免疫感作して、ハイブリドーマ99-110FC12IE4を作製し、UVで不活化した完全黄色ブドウ球菌でマウスを免疫感作して、ハイブリドーマ11-232.3、11-248.2、および11-569.3を作製した。ハイブリドーマ系列由来のそれぞれの抗PepG MAbの活性を、オプソニン食作用殺菌アッセイで試験した。さらに、LTAを結合するA110もアッセイに含めた。11-232.3および11-569.3によって産生されたMAbは、マウスIgG3のκ軽鎖抗体であり、精製してから使用した。ヒトIgG1とκ軽鎖とのヒト/マウスキメラ抗体であるA110も、精製してから使用した。MAb-99-110FC12IE4およびMAb-11-248.2は、マウスIgM、κ軽鎖抗体であり、細胞培養上清(99-110FC12IE4)または腹水(11-248.2)として使用した。オプソニン研究を実施して、MAbが両方の群のブドウ球菌への食作用および死滅作用を増強するかどうか判定した。 Mice were immunized with PepG to produce hybridoma 99-110FC12IE4, and mice were immunized with UV inactivated complete S. aureus to produce hybridomas 11-232.3, 11-248.2, and 11-569.3. Produced. The activity of each anti-PepG MAb from the hybridoma line was tested in an opsonophagocytic bactericidal assay. In addition, A110 binding LTA was also included in the assay. MAb produced by 11-232.3 and 11-569.3 are κ light chain antibodies of murine IgG 3, were used after purification. Is a human / mouse chimeric antibody with human IgG 1 and κ light chain A110 were also used after purification. MAb-99-110FC12IE4 and MAb-11-248.2 are mouse IgM, kappa light chain antibodies and were used as cell culture supernatant (99-110FC12IE4) or ascites (11-248.2). Opsonin studies were performed to determine whether MAbs enhance phagocytosis and killing effects on both groups of staphylococci.

表12Aに示すように、抗PepG抗体はそれぞれ、黄色ブドウ球菌の死滅作用を増強したことを示した。PMNを抗体なしで補体と混合したとき、黄色ブドウ球菌の死滅は20%未満であった。しかし、MAb-11-232.3またはMAb-11-569.3を100μg/mlで加えると、それぞれ76%および82%が死滅した。11-248.2(マウスIgM)由来の未希釈の腹水を使用すると、89%が死滅し、99-110FC12IE4(これもマウスIgM)由来の未希釈の上清では、75%が死滅した。驚くべきことに、A110は、黄色ブドウ球菌LTA(表8)およびメタノール-固定化黄色ブドウ球菌(表10)に強く結合するものの、このアッセイで示される黄色ブドウ球菌のオプソニン化は、非常に弱い。

Figure 2005524624
これまでのアッセイでは、A110が由来するマウス・モノクローナル抗体M110によって黄色ブドウ球菌がより強力にオプソニン化されることが示されている(表12Bおよび米国特許出願第09/097,055号)。本発明者らは、A110とM110との間の活性における差が、キメラ抗体と非キメラ抗体間の活性の差というよりも、アッセイにおける用量の影響によるものであると考える。表13に示されるように、A110は、表皮ブドウ球菌に対する活性を失っていない。
Figure 2005524624
表皮ブドウ球菌株Hayを標的生物体として使用したとき、MAb-11-232.3、11-248.2腹水、およびMAb-11-569.3についての結果は、表13に示すように、5型黄色ブドウ球菌で得られた結果と同様であった。300μg/mlでは、MAb-11-232.3およびMAb-11-569.3でそれぞれ、66%および83%が死滅した。ハイブリドーマ11-248.2由来の未希釈の腹水では、95%が死滅した。しかし、99-110FC12 IE4由来の上清では死滅が起こらず、このことは、表9においてメタノール-固定化表皮ブドウ球菌への結合が非常に弱かったことと一致する。最後に、A110では、試験したすべての用量(11.1μg/ml〜300μg/ml)で強力な死滅(>98%)が起こり、抗体なしでPMNと補体を混合して得られた背景死滅は、22%であった。
Figure 2005524624
As shown in Table 12A, each of the anti-PepG antibodies showed enhanced killing action of S. aureus. When PMN was mixed with complement without antibodies, S. aureus killing was less than 20%. However, adding MAb-11-232.3 or MAb-11-569.3 at 100 μg / ml killed 76% and 82%, respectively. Using undiluted ascites from 11-248.2 (mouse IgM) killed 89% and undiluted supernatant from 99-110FC12IE4 (also mouse IgM) killed 75%. Surprisingly, although A110 binds strongly to S. aureus LTA (Table 8) and methanol-fixed S. aureus (Table 10), S. aureus opsonization shown in this assay is very weak .
Figure 2005524624
Previous assays have shown that S. aureus is more strongly opsonized by the mouse monoclonal antibody M110 from which A110 is derived (Table 12B and US Patent Application No. 09 / 097,055). We believe that the difference in activity between A110 and M110 is due to dose effects in the assay rather than the difference in activity between chimeric and non-chimeric antibodies. As shown in Table 13, A110 does not lose activity against S. epidermidis.
Figure 2005524624
When S. epidermidis strain Hay is used as the target organism, results for MAb-11-232.3, 11-248.2 ascites, and MAb-11-569.3 are obtained with type 5 S. aureus, as shown in Table 13. The results were similar. At 300 μg / ml, MAb-11-232.3 and MAb-11-569.3 killed 66% and 83%, respectively. In undiluted ascites from hybridoma 11-248.2, 95% died. However, the supernatant from 99-110FC12 IE4 did not die, which is consistent with the very weak binding to methanol-immobilized Staphylococcus epidermidis in Table 9. Finally, with A110, strong killing (> 98%) occurred at all doses tested (11.1 μg / ml to 300 μg / ml), and background killing obtained by mixing PMN and complement without antibodies is 22%.
Figure 2005524624

これらのデータは、MAb-11-232.3、11-248.2腹水、およびMAb-11-569.3が、5型黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌株Hayに対する食作用および死滅作用を増強し得ることを示している。このデータは、A110が、黄色ブドウ球菌に対してはMAb-11-232.3、11-248.2腹水、およびMAb-11-569.3ほど有効でないものの、表皮ブドウ球菌株Hayに対する活性が高いことも示している。99-110FC12IE4上清は、黄色ブドウ球菌に対しては活性であるが、表皮ブドウ球菌株Hayに対しては活性でない。メタノール-固定化黄色ブドウ球菌に強く結合するものの生きた黄色ブドウ球菌に対しては弱いオプソニン性しかもたないA110の留意すべき例外はあるが、これらのデータは、メタノール−固定化細菌への結合とそうした細菌へのオプソニン化を強化する能力との相関を実証するものである。   These data indicate that MAb-11-232.3, 11-248.2 ascites, and MAb-11-569.3 can enhance phagocytosis and killing effects on type 5 Staphylococcus aureus and S. epidermidis strain Hay . This data also shows that A110 is not as effective against S. aureus as MAb-11-232.3, 11-248.2 ascites, and MAb-11-569.3, but is more active against S. epidermidis strain Hay. . 99-110FC12IE4 supernatant is active against S. aureus but not against S. epidermidis strain Hay. Although there are some notable exceptions to A110 that bind strongly to methanol-immobilized S. aureus but are weakly opsonizable to live S. aureus, these data indicate binding to methanol-immobilized bacteria. And demonstrate the correlation between the ability to enhance opsonization of such bacteria.

鼻腔コロニー形成アッセイ
マウスのブドウ球菌鼻腔コロニー形成モデルを使用し、MAb-11-232.3の鼻腔内点滴注入が、鼻腔でのコロニー形成を有意に低減することを実証した。
Nasal Colonization Assay Using a mouse staphylococcal nasal colonization model, it was demonstrated that intranasal instillation of MAb-11-232.3 significantly reduced colonization in the nasal cavity.

試験MAbによって起こる鼻腔コロニー形成の阻止作用が抗ブドウ球菌抗体に特異的であることを保証するために、無関係の対照キメラIgGがブドウ球菌の鼻腔コロニー形成を阻止する能力を調べた。対照は、RSVに対するキメラIgG1 MAbであるMedi 493(Medimmune, Inc.)とした。同じ実験において、MAb-11-232.3がコロニー形成を阻止する能力も試験した。 To ensure that the inhibitory effect of nasal colonization caused by the test MAb was specific for anti-staphylococcal antibodies, the ability of an irrelevant control chimeric IgG to block nasal colonization of staphylococci was examined. The control was Medi 493 (Medimmune, Inc.), a chimeric IgG 1 MAb against RSV. In the same experiment, the ability of MAb-11-232.3 to block colony formation was also tested.

ストレプトマイシン耐性5型黄色ブドウ球菌(SA5、1〜3×108細菌/マウス)を、生理食塩水(0.9%のNaCl水溶液)、MAb-11-232.3含有生理食塩水(13×108細菌のマウス用量あたり2〜3mgの精製IgG)、またはMedi 493含有生理食塩水(2〜3mgの精製IgG/1〜3×108細菌のマウス用量)中で1時間プレインキュベートした。プレインキュベートした後、細菌をペレット状にし、生理食塩水(10μl/マウス用量)、MAb-11-232.3含有生理食塩水(10μl/マウス用量)、またはMedi 493含有生理食塩水(10μl/マウス用量)に再懸濁した。それぞれ8匹または9匹のマウスに生理食塩水中SA5、MAb-11-232.3中SA5、またはMedi 493中SA5を点滴注入した。7日後、マウスを犠牲にし、鼻腔組織を解剖し、ストレプトマイシンを含有するコロンビア血液寒天およびトリプシン処理ダイズ寒天上に播いて、コロニー形成があるかどうか判定した。表14は、MAb-11-232.3は、マウスにおいてブドウ球菌の鼻腔コロニー形成を低減したが、抗RSV MAbであるMedi 493は効果をもたなかったことを示している。

Figure 2005524624
Streptomycin-resistant type 5 Staphylococcus aureus (SA5, 1-3 × 10 8 bacteria / mouse), physiological saline (0.9% NaCl aqueous solution), MAb-11-232.3-containing physiological saline (13 × 10 8 bacterial mice) Pre-incubated for 1 hour in 2-3 mg purified IgG per dose), or saline containing Medi 493 (2-3 mg purified IgG / 1-3 × 10 8 bacterial mouse dose). After pre-incubation, the bacteria are pelleted and saline (10 μl / mouse dose), saline containing MAb-11-232.3 (10 μl / mouse dose), or saline containing Medi 493 (10 μl / mouse dose) Resuspended. Eight or nine mice were instilled with SA5 in saline, SA5 in MAb-11-232.3, or SA5 in Medi 493, respectively. Seven days later, the mice were sacrificed, the nasal tissue was dissected and seeded on Columbia blood agar containing tryptomycin and trypsinized soy agar to determine if there was colony formation. Table 14 shows that MAb-11-232.3 reduced staphylococcal nasal colonization in mice, whereas Medi 493, an anti-RSV MAb, had no effect.
Figure 2005524624

詳細には、表14は、コロニー形成のあったマウスの数およびコロニー数が共に、抗黄色ブドウ球菌表面抗原に特異的なMAb-11-232.3によって抗体特異的に減少することを示している。生理食塩水および無関係のキメラIgGの対照群では、すべてのマウスに黄色ブドウ球菌によるコロニー形成があったが、MAb-11-232.3の群では、8匹中3匹のマウスにしかコロニー形成がなかった。コロニー形成のあったマウス数のこの減少は、8匹のうち5匹のマウスが細菌のコロニー形成を免れているので、投与されたMAb-11-232.3が防御性であることを実証している。MAb-11-232.3の群では、マウス1匹あたりの回収されたコロニー数も他の2群と比べて劇的に減少した。生理食塩水対照群では、コロニー形成のあった9匹のマウスの平均コロニー数が70であり、無関係抗体の対照群では、コロニー形成のあったマウスの平均コロニー数がいっそう多い187であった。それとは対照的に、処置した群では、8匹のうち3匹の動物しかコロニー形成の徴証を示さず、コロニー形成のレベルは大きく低下し、マウス1匹の鼻腔あたり平均8コロニーであった。回収されたコロニーのこのような減少は、in vivoでも同じく予防に有益である。したがって、抗PepG MAbの投与は、黄色ブドウ球菌による鼻腔コロニー形成からの防御となる。これらのデータは、この効果が、抗ブドウ球菌表面抗原MAbに特異的であり、また抗体がそのFc部分を介してブドウ球菌上の表面プロテインAに結合するという単なる一般的な結果に陥っていないことも実証している。黄色ブドウ球菌ペプチドグリカンに対する追加のMAbであるMAb-11-248.2およびMAb-11-569.3も同じく、上述のような黄色ブドウ球菌によるコロニー形成に対する類似の抑制効果を示すであろう。上述のin vivoマウスモデルにおけるMAb-11-248.2およびMAb-11-569.3の有効性を断言するために、研究を進めている。   Specifically, Table 14 shows that both the number of colonized mice and the number of colonies are antibody-specifically reduced by MAb-11-232.3 specific for anti-S. Aureus surface antigens. In the saline and irrelevant chimeric IgG control groups, all mice had colonization with S. aureus, but in the MAb-11-232.3 group, only 3 out of 8 mice had colonies. It was. This reduction in the number of colonized mice demonstrates that MAb-11-232.3 administered is protective because 5 out of 8 mice escape bacterial colonization . In the MAb-11-232.3 group, the number of colonies recovered per mouse was also dramatically reduced compared to the other two groups. In the saline control group, the average number of colonies of nine mice with colony formation was 70, and in the control group with irrelevant antibody, the average number of colonies of mice with colony formation was 187. In contrast, in the treated group, only 3 out of 8 animals showed evidence of colonization, and the level of colonization was greatly reduced, averaging 8 colonies per mouse nasal cavity . Such a decrease in recovered colonies is also beneficial for prevention in vivo. Therefore, administration of anti-PepG MAb provides protection from nasal colonization by S. aureus. These data show that this effect is specific to the anti-staphylococcal surface antigen MAb and does not fall into the general result that the antibody binds to surface protein A on staphylococci through its Fc portion. It also proves that. Additional MAbs against S. aureus peptidoglycans, MAb-11-248.2 and MAb-11-569.3, will also show a similar inhibitory effect on colonization by S. aureus as described above. Research is underway to affirm the effectiveness of MAb-11-248.2 and MAb-11-569.3 in the in vivo mouse model described above.

ハイブリドーマ11-232.3 IE9を生成するためのハイブリドーマ11-232.3のサブクローニング
QED細胞培養物11-232.3を限界希釈によってクローン化した。簡潔に述べると、細胞を希釈して、濃度を1mlあたり生存細胞225個とした。この懸濁液1mlを36mlのRPMI 1640に加えた。FBS 7.5ml、10mg/mlのカナマイシン溶液(Gibco BRLカタログ番号15160-054)0.5ml、およびHybridoma SFM培地(Gibco BRLカタログ番号12045-084)5mlを加えて、細胞懸濁液をさらに希釈した。懸濁液の最終体積を50mlとし、細胞濃度は4.5細胞/mlとなった。2枚の96穴組織培養皿の各ウェルに200μlの細胞懸濁液を加えた。空気中C02 5%の加湿雰囲気中で、培養物を37℃で10日間インキュベートした。個々のウェルに入った細胞の一焦点(foci)を顕微鏡観察して、クローンの存在を確認した。全ウェルの約40%が、11-232.3の増殖性クローンを含んでいた。ELISAによって試験したとき、すべての上清がペプチドグリカンを結合した。4種の培養物11232.3-IG9、-IE9、-IH7、および-IB6を増殖させ、凍結保存した。これら4種のクローンの、ペプチドグリカンおよびLTAへの結合を表15に示す。ハイブリドーマ11-232.3IE9によって産生されたMAbをその後M130と称した。

Figure 2005524624
Hybridoma 11-232.3 Subcloning of hybridoma 11-232.3 to generate IE9
QED cell culture 11-232.3 was cloned by limiting dilution. Briefly, cells were diluted to a concentration of 225 viable cells per ml. 1 ml of this suspension was added to 36 ml RPMI 1640. The cell suspension was further diluted by adding 7.5 ml FBS, 0.5 ml 10 mg / ml kanamycin solution (Gibco BRL catalog number 15160-054) and 5 ml Hybridoma SFM medium (Gibco BRL catalog number 12045-084). The final volume of the suspension was 50 ml and the cell concentration was 4.5 cells / ml. 200 μl of cell suspension was added to each well of two 96-well tissue culture dishes. In C0 2 5% humidified atmosphere in air and the culture was incubated at 37 10 days. The presence of the clone was confirmed by microscopic observation of the foci of the cells that entered the individual wells. Approximately 40% of all wells contained 11-232.3 proliferating clones. All supernatants bound peptidoglycan when tested by ELISA. Four cultures 11232.3-IG9, -IE9, -IH7, and -IB6 were grown and stored frozen. The binding of these four clones to peptidoglycan and LTA is shown in Table 15. The MAb produced by the hybridoma 11-232.3IE9 was subsequently designated M130.
Figure 2005524624

表15に示すように、ハイブリドーマ11-232.3IE9によって産生されたモノクローナル抗体M130は、LBEアッセイにおいて黄色ブドウ球菌を結合した。驚くべきことに、M130は、表皮ブドウ球菌株Hayに対してオプソニン活性を示すのであるが(表7)、このアッセイでは表皮ブドウ球菌株Hayを結合しなかった。オプソニンアッセイでは最高で300μg/mlの濃度の抗体を使用するが、LBEアッセイでは最高で3μg/mlの濃度を用いるので、使用した濃度の差が大きいために、2種のアッセイにおいてM130の活性に差が生じるのかもしれない。

Figure 2005524624
As shown in Table 15, monoclonal antibody M130 produced by hybridoma 11-232.3IE9 bound S. aureus in the LBE assay. Surprisingly, M130 exhibits opsonic activity against S. epidermidis strain Hay (Table 7), but did not bind S. epidermidis strain Hay in this assay. The opsonin assay uses antibodies up to a concentration of 300 μg / ml, but the LBE assay uses up to a concentration of 3 μg / ml, so the difference in concentration used is significant, and therefore the M130 activity in the two assays There may be a difference.
Figure 2005524624

M130可変領域のクローン化および配列決定
Midi RNA単離キット(Qiagen)を使用し、製造者のプロトコルに従いながら、2×106個の凍結したIE9(232-3)ハイブリドーマ細胞から総RNAを単離した。0.25μg/glのPrime Rnase阻害剤(0.03U/μg、Sigma)を含む10mMのトリスおよび0.1mMのEDTA(pH8.4)にRNAを溶解させた。
Cloning and sequencing of the M130 variable region
Total RNA was isolated from 2 × 10 6 frozen IE9 (232-3) hybridoma cells using the Midi RNA isolation kit (Qiagen) and following the manufacturer's protocol. RNA was dissolved in 10 mM Tris and 0.1 mM EDTA (pH 8.4) containing 0.25 μg / gl Prime Rnase inhibitor (0.03 U / μg, Sigma).

図1は、可変領域の遺伝子をクローン化するための戦略を示す。表17は、その手順に使用したオリゴヌクレオチド・プライマーの配列(配列番号5〜12)を示す。Superscript II-MMLV逆転写酵素(Life Technologies)、マウスκ鎖特異的プライマー(JSBX-18、配列番号8、Sigma-Genosys)、およびマウス重鎖特異的プライマー(JSBX-25A、配列番号9、Sigma-Genosys)を使用し、製造者の手順に従いながら、総RNA(2μg)をcDNAに変換した(プライマーの配列については表12を参照のこと)。第1鎖のcDNA合成産物を、Centricon-30濃縮装置(Amicon)を使用して精製した。回収した40μlのcDNAのうち5μlをPCR用鋳型DNAとして使用した。PCR増幅反応液(50μl)は、鋳型DNA、30ピコモルの適切なプライマー(軽鎖用のJSBX-11 A、-12Aおよび-18、配列番号6〜8;重鎖用のJSBX-5および-25A、配列番号5および配列番号9)、2.5単位のExTaqポリメラーゼ(PanVera)、1xExTaq反応緩衝液、200μMの各dNTP、2mMのMgCl2を含んでいた。最初に96℃で3分間インキュベートして鋳型を変性させた。96℃で1分間、60℃で30秒間、72℃で30秒間からなる温度サイクルを30回繰り返して産物を増幅した。Nucleospin PCR精製系(Clontech)を製造者の手順どおりに使用して、成功裏に終わった反応からのPCR産物を精製した。

Figure 2005524624
FIG. 1 shows a strategy for cloning variable region genes. Table 17 shows the oligonucleotide primer sequences (SEQ ID NOs: 5-12) used in the procedure. Superscript II-MMLV reverse transcriptase (Life Technologies), mouse kappa chain specific primer (JSBX-18, SEQ ID NO: 8, Sigma-Genosys), and mouse heavy chain specific primer (JSBX-25A, SEQ ID NO: 9, Sigma- Total RNA (2 μg) was converted to cDNA using Genosys) according to the manufacturer's procedure (see Table 12 for primer sequences). The first strand cDNA synthesis product was purified using a Centricon-30 concentrator (Amicon). Of the 40 μl of the recovered cDNA, 5 μl was used as template DNA for PCR. PCR amplification reaction (50 μl) is template DNA, 30 pmoles of appropriate primers (JSBX-11 A, -12A and -18 for light chain, SEQ ID NOs: 6-8; JSBX-5 and -25A for heavy chain) , SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 9), 2.5 units of ExTaq polymerase (PanVera), 1 × ExTaq reaction buffer, 200 μM of each dNTP, 2 mM MgCl 2 . Initially, the template was denatured by incubation at 96 ° C. for 3 minutes. The product was amplified by repeating a temperature cycle consisting of 96 ° C for 1 minute, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 30 seconds 30 times. PCR products from successful reactions were purified using the Nucleospin PCR purification system (Clontech) according to the manufacturer's procedure.
Figure 2005524624

次いで、製造者の手順に従いながら、用いる挿入配列対ベクターのモル比を3:1として、PCR産物(約400塩基対)をT/A型のクローンニング・ベクターである細菌性ベクターpGEM T(Promega)にクローン化した。ライゲーション反応液の2分の1(5μl)を使用して、製造者の手順どおりにUltracompetent XL1 Blue細胞(Stratagene)を形質転換した。DraIIIおよびBsiWI(重鎖クローン用)またはDraIIIおよびEcoRV(軽鎖クローン用)(New England Biolabs)による診断向け制限酵素消化を利用して、DNA挿入物を有するプラスミドを含む細菌クローンを同定した。次いで、適切な大きさ(約400bp)の挿入配列を含むプラスミドの配列決定を行った。M130重鎖可変領域を含むPGEMベクターをpJSB18-6と称し、M130軽鎖可変領域を含むpGEMベクターをpJSB4-4と称する。軽鎖および重鎖可変領域の最終的な共通DNA配列を図2に示す(それぞれ、配列番号2および配列番号4)。   Then, following the manufacturer's procedure, using a 3: 1 molar ratio of the inserted sequence to the vector used, the PCR product (about 400 base pairs) was transformed into the bacterial vector pGEM T (Promega T ). One half (5 μl) of the ligation reaction was used to transform Ultracompetent XL1 Blue cells (Stratagene) according to the manufacturer's procedure. Diagnostic restriction enzyme digests with DraIII and BsiWI (for heavy chain clones) or DraIII and EcoRV (for light chain clones) (New England Biolabs) were used to identify bacterial clones containing plasmids with DNA inserts. The plasmid containing the appropriate size (approximately 400 bp) insert was then sequenced. The PGEM vector containing the M130 heavy chain variable region is called pJSB18-6, and the pGEM vector containing the M130 light chain variable region is called pJSB4-4. The final common DNA sequences for the light and heavy chain variable regions are shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4, respectively).

マウス/ヒトキメラ抗体A130のクローン化
次いで、M130の重鎖および軽鎖可変領域を哺乳動物性発現プラスミドベクターにサブクローニングして、CMV転写プロモーターの制御下で、組換え型マウス/ヒトキメラ抗体分子を生成した。M130の可変領域は、ヒトIgG1定常領域に直接に融合している。一方、M130の軽鎖は、可変領域コード配列の3'側にマウスκイントロンドメインを有する。スプライシングの後、この可変領域は、ヒトκ定常領域のエキソンに融合するようになる。哺乳動物細胞における両方のベクターのための選択可能マーカーは、ネオマイシン(G418)である。
Cloning of mouse / human chimeric antibody A130 The heavy and light chain variable regions of M130 were then subcloned into a mammalian expression plasmid vector to generate a recombinant mouse / human chimeric antibody molecule under the control of a CMV transcription promoter. . Variable region of the M130 is fused directly to the human IgG 1 constant region. On the other hand, the light chain of M130 has a mouse κ intron domain 3 ′ of the variable region coding sequence. After splicing, this variable region becomes fused to an exon of the human kappa constant region. A selectable marker for both vectors in mammalian cells is neomycin (G418).

発現ベクターへのクローン化向けに断片を適合させてあるプライマーを使用するPCRによって、可変領域の遺伝子断片を再増幅した。(図1、表17)。重鎖正方向プライマー(JSBX-44、配列番号11)は、重鎖リーダーのC末端をコードする5'尾部と、クローン化のためのBsiWI制限部位とを含み、重鎖逆方向プライマー(JSBX-45、配列番号12)には、クローン化のための3'側EcoRI制限部位が加わっている。これによって、重鎖可変領域とヒトIgG1定常領域の間にグルタミン(E)およびフェニルアラニン(F)の2個のアミノ酸が付加される。 The variable region gene fragments were reamplified by PCR using primers that had the fragments adapted for cloning into expression vectors. (Figure 1, Table 17). The heavy chain forward primer (JSBX-44, SEQ ID NO: 11) contains a 5 'tail encoding the C-terminus of the heavy chain leader and a BsiWI restriction site for cloning, and a heavy chain reverse primer (JSBX- 45, SEQ ID NO: 12) has a 3 ′ EcoRI restriction site for cloning. Thus, two amino acids glutamine (E) and phenylalanine (F) is added between the heavy chain variable region and a human IgG 1 constant region.

軽鎖正方向プライマー(JSBX-11A、配列番号6)には、軽鎖リーダーの2個のC末端アミノ酸をコードする5'尾部と、クローン化の目的のためのAgeI制限部位が付加される。軽鎖逆方向プライマー(JSBX-27、配列番号10)には、連結領域-κエキソンのスプライス接合部のための3'側DNA配列と、それに続く、クローン化のためのBstBI制限部位とが加わっている。pJSB18-6を重鎖の鋳型として、pJSB4-4を軽鎖の鋳型として使用して、PCRを上述のように実施した。PCRパラメーターは、96℃で3分間インキュベートした後、58℃で30秒間、70℃で30秒間、および96℃で1分間の温度サイクルを30回とした。   The light chain forward primer (JSBX-11A, SEQ ID NO: 6) is appended with a 5 ′ tail encoding the two C-terminal amino acids of the light chain leader and an AgeI restriction site for cloning purposes. The light chain reverse primer (JSBX-27, SEQ ID NO: 10) is added with a 3 ′ DNA sequence for the splice junction of the junction region-κ exon, followed by a BstBI restriction site for cloning. ing. PCR was performed as described above, using pJSB18-6 as the heavy chain template and pJSB4-4 as the light chain template. PCR parameters were incubated at 96 ° C. for 3 minutes, followed by 30 temperature cycles of 58 ° C. for 30 seconds, 70 ° C. for 30 seconds, and 96 ° C. for 1 minute.

重鎖PCR産物をBsiWIおよびEcoRI(New England Biolabs)で消化し、Nucleospin PCR精製カラム(Clontech)を使用して製造者の指示どおりに精製し、Takaraライゲーション・キット(Panvera)を使用して、製造者の手順どおりにBsiWI/EcoRI/PflMI消化およびゲル精製済みpJRS383に連結した。次いで、ライゲーション混合物をXL1 Blue細胞(Stratagene)に形質転換し、クローンを選択し、正しく挿入されているものをスクリーニングして、哺乳動物性ベクターpJSB22を得た(図3)。   The heavy chain PCR product is digested with BsiWI and EcoRI (New England Biolabs), purified using a Nucleospin PCR purification column (Clontech) as per manufacturer's instructions, and manufactured using the Takara ligation kit (Panvera) Ligated with BsiWI / EcoRI / PflMI digested and gel purified pJRS383 as per the procedure of the person. The ligation mixture was then transformed into XL1 Blue cells (Stratagene), clones were selected, and those that were correctly inserted were screened to yield the mammalian vector pJSB22 (FIG. 3).

軽鎖PCR産物(約350塩基対)をAgeIおよびBStBI(New England Biolabs)で消化し、Nucleospin PCR精製カラム(Clontech)を使用して製造者の記載どおりに精製した。次いで、Takaraライゲーション・キット(Panvera)を使用して、AgeI/BstBI/XcmIで消化しゲル精製しておいたpJRS384に、この断片を製造者の手順どおりに連結した。次いで、ライゲーション混合物をXL1 Blue細胞(Stratagene)に形質転換し、クローンを選択し、正確に挿入されているものをスクリーニングし、哺乳動物性発現プラスミドpJSB6.1(図4を参照のこと)を得た。   The light chain PCR product (approximately 350 base pairs) was digested with AgeI and BStBI (New England Biolabs) and purified using a Nucleospin PCR purification column (Clontech) as described by the manufacturer. This fragment was then ligated to pJRS384 that had been digested with GelI / BstBI / XcmI and gel purified using the Takara ligation kit (Panvera) according to the manufacturer's procedure. The ligation mixture is then transformed into XL1 Blue cells (Stratagene), clones selected and screened for correctly inserted to obtain the mammalian expression plasmid pJSB6.1 (see FIG. 4). It was.

次いで、2種の個々のプラスミドを合体させて、軽鎖および重鎖両方の発現カセットを含む単一の発現構築物を作製した。プラスミドpJSB6.1をBamHおよびNheI(New England Biolabs)で消化し、Nucleospin PCR精製カラム(Clontech)を使用して製造者の記載どおりに精製した。プラスミドpJSB22をBglIIおよびNheI(New England Biolabs)で消化し、アガロースゲル上で分離し、Nucleospin Gel Fragment DNA精製カラム(Clontech)を使用して、重鎖発現ドメインを含む断片を単離した。Takaraライゲーション・キット(Panvera)を使用し、製造者の手順に従って、これら断片を一緒に連結し、XL1 Blue細胞(Stratagene)に形質転換した。次いで、得られるジ-シストロン性発現ベクターpLG1-MEGAを、可変領域の配列を確認した後、A130キメラ抗体を産生させるための哺乳動物細胞に形質移入した(図5)。   The two individual plasmids were then combined to create a single expression construct containing both light and heavy chain expression cassettes. Plasmid pJSB6.1 was digested with BamH and NheI (New England Biolabs) and purified using a Nucleospin PCR purification column (Clontech) as described by the manufacturer. Plasmid pJSB22 was digested with BglII and NheI (New England Biolabs), separated on an agarose gel, and a fragment containing the heavy chain expression domain was isolated using a Nucleospin Gel Fragment DNA purification column (Clontech). These fragments were ligated together and transformed into XL1 Blue cells (Stratagene) using the Takara ligation kit (Panvera) according to the manufacturer's procedure. Subsequently, the obtained di-cistronic expression vector pLG1-MEGA was transfected into mammalian cells for producing the A130 chimeric antibody after confirming the sequence of the variable region (FIG. 5).

組換え型マウス/ヒトキメラA130抗体の一過性の生成
Superfect(Oiagen)を使用して、製造者が記載するとおりに、6穴組織培養皿において、プラスミドpLG1-MEGAをCOS-7(ATCC番号CRL 1651)細胞に形質移入した。2日後、キメラ抗体の産生、および発現された抗体の黄色ブドウ球菌ペプチドグリカン抗原への結合能について、上清を以下のように検定した。
Transient generation of recombinant mouse / human chimeric A130 antibody
Using Superfect (Oiagen), COS-7 (ATCC number CRL 1651) cells were transfected with plasmid pLG1-MEGA in 6-well tissue culture dishes as described by the manufacturer. Two days later, supernatants were assayed for production of chimeric antibody and the ability of the expressed antibody to bind to S. aureus peptidoglycan antigen as follows.

8穴ストリップ(Maxisorp F8、Nunc, Inc.)を、PBS中に5百倍に希釈したヤギ抗ヒトFc(Pierce)でコートした。次いで、プレートを感圧性フィルムで覆い、4℃で終夜インキュベートした。次いで、プレートを1xWash溶液(KPLカタログ番号50-63-01)で1回洗浄した。次いで、100μlの各培養上清希釈物を二重のウェルに添加し、プレート回転板に載せて室温で60分間インキュベートした。プレートをWash溶液で7回洗浄した。ヤギ抗ヒトκHRP(Zymed)コンジュゲートをサンプル/コンジュゲート希釈剤(0.02MのpH7.4トリス、0.25MのNaC12、2%のゼラチン、0.1%のTween-20)に加えて8百倍に希釈した。100μlをサンプルに加え、次いでプレート回転板に載せて室温で60分間インキュベートした。サンプルを上記のように7回洗浄し、次いで100μL/ウェルのTMB基質(BioFx、カタログ番号TMBW-0100-01)と共に室温で1分間未満インキュベートした。100μL/ウェルのTMB停止試薬(BioFx、カタログ番号STPR0100-01)で反応を停止させ、自動化されたマイクロタイタープレートELISAリーダー(Spetramax Plus、Molecular Devices, Inc.)を使用して、450nmの吸光度の値を決定した。図6は、マウス/ヒトキメラA130抗体が、ヤギ抗ヒトIgGκ抗体によって結合されることを示し、細胞へのpLG1-MEGAプラスミドの形質移入によって、ヒトIgGとκの両方のドメインを含む分子を産生する細胞が得られることを示している。 An 8-well strip (Maxisorp F8, Nunc, Inc.) was coated with goat anti-human Fc (Pierce) diluted 5x in PBS. The plate was then covered with a pressure sensitive film and incubated overnight at 4 ° C. The plates were then washed once with 1x Wash solution (KPL catalog number 50-63-01). 100 μl of each culture supernatant dilution was then added to duplicate wells and incubated for 60 minutes at room temperature on a plate rotating plate. The plate was washed 7 times with Wash solution. Diluted goat anti-human κHRP (Zymed) conjugate sample / conjugate diluent (0.02 M of pH7.4 Tris, NaC1 2, 2% gelatin in 0.25M, Tween-20 0.1%) to 8 million times in addition to did. 100 μl was added to the sample, then placed on a plate rotating plate and incubated for 60 minutes at room temperature. Samples were washed 7 times as above and then incubated with 100 μL / well TMB substrate (BioFx, catalog number TMBW-0100-01) at room temperature for less than 1 minute. Stop the reaction with 100 μL / well of TMB stop reagent (BioFx, catalog number STPR0100-01) and use an automated microtiter plate ELISA reader (Spetramax Plus, Molecular Devices, Inc.) for absorbance values at 450 nm. It was determined. FIG. 6 shows that mouse / human chimeric A130 antibody is bound by goat anti-human IgGκ antibody, and transfection of cells with pLG1-MEGA plasmid produces a molecule containing both human IgG and κ domains It shows that cells are obtained.

次いで、発現された抗体がペプチドグリカンに結合する能力について、上清を検定にかけた。(実施例2に記載の方法によって調製した)黄色ブドウ球菌ペプチドグリカンをpH9.5炭酸塩コーティング緩衝液(0.1Mの炭酸ナトリウム)に溶かした5μg/mlの溶液を用い、8穴ストリップ(Maxisorp F8、Nunc, Inc.)を4℃で一晩かけてコートした。プレートをPBSで1回洗浄した。100μlの各培養上清希釈物を二重ののウェルに添加し、プレート回転板に載せて室温で60分間インキュベートした。プレートをWash溶液で7回洗浄した。サンプル/コンジュゲート希釈剤に加えて4千倍に希釈したヤギ抗ヒトIgG H+L-HRP(Zymed)100μlをサンプルに加え、プレートをプレート回転板に載せて室温で60分間インキュベートした。サンプルをWash緩衝液で7回洗浄し、次いで、プレート回転板上で100μL/ウェルのTMB基質(BioFx)と共に室温で10〜15分間インキュベートした。反応を100μL/ウェルのTMB停止試薬(BioFx)で停止させ、自動化されたマイクロタイタープレートELISAリーダー(Spectramax Plus、Molecular Devices)を使用して、450nmの吸光度の値を決定した。   The supernatant was then assayed for the ability of the expressed antibody to bind to peptidoglycan. Using a 5 μg / ml solution of S. aureus peptidoglycan (prepared by the method described in Example 2) in pH 9.5 carbonate coating buffer (0.1 M sodium carbonate), an 8-well strip (Maxisorp F8, Nunc, Inc.) was coated overnight at 4 ° C. The plate was washed once with PBS. 100 μl of each culture supernatant dilution was added to duplicate wells and incubated on a plate rotating plate for 60 minutes at room temperature. The plate was washed 7 times with Wash solution. 100 μl of goat anti-human IgG H + L-HRP (Zymed) diluted 4,000 times in addition to sample / conjugate diluent was added to the sample and the plate was placed on a plate rotating plate and incubated for 60 minutes at room temperature. Samples were washed 7 times with Wash buffer and then incubated for 10-15 minutes at room temperature with 100 μL / well TMB substrate (BioFx) on a plate rotating plate. The reaction was stopped with 100 μL / well of TMB stop reagent (BioFx) and the absorbance value at 450 nm was determined using an automated microtiter plate ELISA reader (Spectramax Plus, Molecular Devices).

陽性対照として、もともとのマウスモノクローナル抗体M130を使用し、2千倍希釈したヤギ抗マウスFcHRPコンジュゲートを用いて検定した。図7は、細胞へのpLG1 MEGAプラスミドの形質移入によって、黄色ブドウ球菌ペプチドグリカンに結合する分子を産生する細胞が得られることを示している。これらの結果は、マウス/ヒトキメラ抗体A130が、それが由来するマウスモノクローナル抗体M130のペプチドグリカン結合能を保持していることを示唆する。   As a positive control, the original mouse monoclonal antibody M130 was used, and assayed using a goat anti-mouse FcHRP conjugate diluted 2000 times. FIG. 7 shows that transfection of the pLG1 MEGA plasmid into the cells yields cells that produce molecules that bind to S. aureus peptidoglycan. These results suggest that the mouse / human chimeric antibody A130 retains the peptidoglycan binding ability of the mouse monoclonal antibody M130 from which it is derived.

モノクローナル抗体のPepGへの特異的結合
モノクローナル抗体がPepGに特異的であり、表7に示したELISAアッセイに使用したPepG調製物中の汚染物質に結合しないことを確認するため、サンドイッチアッセイを実施した。簡潔に述べると、マルチウェルプレートを、PepG、LTA、または未知の抗原に特異的な「捕捉(capture)」抗体でコートし、次いでPepGをウェルに加え、抗体によって結合させ、次いで「検出」抗体を加えて、捕捉抗体によって捕捉されたPepGに対する親和性を測定した。
Specific binding of monoclonal antibody to PepG A sandwich assay was performed to confirm that the monoclonal antibody was specific to PepG and did not bind to contaminants in the PepG preparation used in the ELISA assay shown in Table 7. . Briefly, a multiwell plate is coated with a “capture” antibody specific for PepG, LTA, or an unknown antigen, then PepG is added to the well, bound by the antibody, and then the “detection” antibody And the affinity for PepG captured by the capture antibody was measured.

詳細には、モノクローナル抗体M110、M130、MAb-11-230.3、MAb-11-232.3、MAb-11-391.4、MAb-11-557.3、MAb-11-564.4、MAb-11-580.5、およびMAb-11-586.3を、PBSに加えて3μg/mlに希釈した。ハイブリドーマ11-230.3、11-232.3、11-391.4、11-557.3、11-564.4、11-580.5、および11-586.3は、UVで死滅させた完全黄色ブドウ球菌で免疫感作したマウスから得た。上述のように、MAb-11-230.3、MAb-11-232.3、MAb-11-557.3、MAb-11-564.4、およびMAb-11-586.3はPepGに結合し、MAb11-391.4はLTAに結合し、MAb-11-580.5は黄色ブドウ球菌上の未知のエピトープに結合することが予めわかっている。これらのMAbは、Nunc Maxisorpストリップウェル(Nuncカタログ番号469949)の縦4列をコートするのに使用したが、これらを「捕捉」抗体と呼ぶ。各捕捉抗体によるコーティングは、3μg/mlの溶液100μlを適切なウェルに加え、室温で終夜(18〜26時間)インキュベートして実施した。次いで、PBS-Tで4回洗浄して、結合していない物質をウェルから除去した。各捕捉抗体につき、PBS-T中に10μg/mlに希釈した(実施例2に記載のとおりにS. Fosterによって調製された)黄色ブドウ球菌ペプチドグリカンを、縦4列のうち2列のウェルに加え、ペプチドグリカンを含まないPBS-Tを別の2列のウェルに加えた。   Specifically, monoclonal antibodies M110, M130, MAb-11-230.3, MAb-11-232.3, MAb-11-391.4, MAb-11-557.3, MAb-11-564.4, MAb-11-580.5, and MAb-11 -586.3 was diluted to 3 μg / ml in PBS. Hybridomas 11-230.3, 11-232.3, 11-391.4, 11-557.3, 11-564.4, 11-580.5, and 11-586.3 were obtained from mice immunized with UV-killed S. aureus. As mentioned above, MAb-11-230.3, MAb-11-232.3, MAb-11-557.3, MAb-11-564.4, and MAb-11-586.3 bind to PepG, MAb11-391.4 binds to LTA, MAb-11-580.5 has been previously known to bind to an unknown epitope on S. aureus. These MAbs were used to coat four columns of Nunc Maxisorp strip wells (Nunc catalog number 469949), which are referred to as “capture” antibodies. Coating with each capture antibody was performed by adding 100 μl of a 3 μg / ml solution to the appropriate wells and incubating overnight (18-26 hours) at room temperature. The unbound material was then removed from the wells by washing 4 times with PBS-T. For each capture antibody, S. aureus peptidoglycan (prepared by S. Foster as described in Example 2) diluted to 10 μg / ml in PBS-T was added to 2 wells in 4 rows. PBS-T without peptidoglycan was added to another two rows of wells.

ウェルを室温で30〜60分間インキュベートし、PBS-Tで4回洗浄した。次いで、表17に示した濃度(5μg/mlから0.078μg/mlまでの2倍希釈)のA130 100μlをウェルに入れた。上述の抗PepGモノクローナル抗体A130は、「検出」抗体であり、0.1%ヒト血清を含み、IgG、IgA、およびIgMを含まないPBS-T(Axell Cat BYA20341、Lot H2415)に加えて希釈した。この検出抗体は、コーティングに使用した捕捉MAbに結合したどんなPepGとも反応することが予想された。それと共に、LTAに特異的なMAb M110および391.4でコートされたウェルや、特異性が未知のMAbであるMAb-11-580.5でコートされたウェルでは、PepGは捕捉されていないはずであることが予想された。   Wells were incubated at room temperature for 30-60 minutes and washed 4 times with PBS-T. Next, 100 μl of A130 at the concentration shown in Table 17 (2-fold dilution from 5 μg / ml to 0.078 μg / ml) was placed in the well. The anti-PepG monoclonal antibody A130 described above is a “detection” antibody and was diluted in addition to PBS-T (Axell Cat BYA20341, Lot H2415) containing 0.1% human serum and no IgG, IgA, and IgM. This detection antibody was expected to react with any PepG bound to the capture MAb used for coating. At the same time, PepG should not be captured in wells coated with LTA-specific MAbs M110 and 391.4, or with MAb-11-580.5, an MAb of unknown specificity. Expected.

さらに30〜60分間インキュベートした後、ウェルをPBS-Tで洗浄し、各ウェルに、PBS-Tに加えて6千倍に希釈したHRP結合γ特異的ヤギ抗ヒトIgG(Zymed Cat 62-8420)95μlを入れた。30〜60分後、ウェルをPBS-Tで洗浄し、100μlのTMB基質溶液(BioFX Cat TMBW-0100-01)を各ウェルに加えた。室温、暗所で15分間反応を進行させ、100μlのTMB停止試薬(BioFX Cat STPR-0100-01)を各ウェルに加えて反応を停止させた。450nmフィルターを装着したMolecular Devices Vmaxマイクロプレートリーダーを使用して、各ウェルの吸光度を測定した。   After further incubation for 30-60 minutes, the wells were washed with PBS-T and each well was diluted 6000 times with HRP-conjugated γ-specific goat anti-human IgG (Zymed Cat 62-8420) in PBS-T. 95 μl was added. After 30-60 minutes, the wells were washed with PBS-T and 100 μl of TMB substrate solution (BioFX Cat TMBW-0100-01) was added to each well. The reaction was allowed to proceed for 15 minutes in the dark at room temperature, and 100 μl of TMB stop reagent (BioFX Cat STPR-0100-01) was added to each well to stop the reaction. The absorbance of each well was measured using a Molecular Devices Vmax microplate reader equipped with a 450 nm filter.

表18は、一連の捕捉MAbを使用した後PepGを使用し、次いで検出MAbとしてA130を使用する捕捉アッセイの結果を示す。ウェルをMAb-11-230.2、MAb-11-232.3、MAb-11-557.3、MAb-11-564.4、またはMAb-11-586.3でコートし、PepGと共にインキュベートした後、検出抗体A130が、プレート上に捕捉されたPepGに結合する。ハイブリドーマ391.4によって産生されたものまたはM110などの抗LTA抗体を使用して捕捉する場合、おそらく捕捉抗体がPepGを結合しないので、A130は結合しない。さらに、特異性が未知であるMAb-11-580.5も、A130による結合が不十分であることから明らかなように、PepGをそれほど捕捉しない。陽性対照として、A130と同一の可変領域を有するM130を使用してPepGを捕捉する場合、A130はプレートに強く結合する。これらの結果は、PepGに結合すると考えられる一連の異なる抗体でPepGを捕捉すると、A130と捕捉された物質とが結合するので、A130がPepGに結合し、かつPepG調製物中の汚染物質に結合しないことを示唆している。

Figure 2005524624
Table 18 shows the results of a capture assay using a series of capture MAbs followed by PepG and then using A130 as the detection MAb. After the wells were coated with MAb-11-230.2, MAb-11-232.3, MAb-11-557.3, MAb-11-564.4, or MAb-11-586.3 and incubated with PepG, detection antibody A130 was Bind to captured PepG. When capturing using an anti-LTA antibody such as that produced by hybridoma 391.4 or M110, A130 does not bind, probably because the capture antibody does not bind PepG. Furthermore, MAb-11-580.5, whose specificity is unknown, does not capture PepG as much, as evidenced by insufficient binding by A130. As a positive control, when Mep having the same variable region as A130 is used to capture PepG, A130 binds strongly to the plate. These results show that when PepG is captured by a series of different antibodies that are thought to bind to PepG, A130 binds to the captured material, so A130 binds to PepG and binds to contaminants in the PepG preparation. Suggests not to.
Figure 2005524624

抗PepG抗体が、PepG調製物中の可能なLTA汚染物質に結合しないことを確認するために、LTAに結合するA110を捕捉抗体として使用し、LTAを捕捉抗体に結合させ、次いで検出抗体を加えて捕捉されたLTAへの結合を測定した、同様のサンドイッチアッセイを実施した。   To confirm that the anti-PepG antibody does not bind to possible LTA contaminants in the PepG preparation, use A110 binding to LTA as the capture antibody, bind LTA to the capture antibody, and then add the detection antibody A similar sandwich assay was performed in which binding to captured LTA was measured.

Nunc Maxisorpストリップウェル(Nuncカタログ番号469949)をPBS中3μg/mlのA110 100μlでコートし、室温で終夜(18〜26時間)インキュベートした。終夜インキュベートした後、PBS-Tで4回洗浄して結合していない物質をウェルから除去した。次いで複製ウェルに100μlのLTA溶液(Sigmaカタログ番号2515、PBS-Tに加えて1μg/mlに希釈したもの)またはPBS-Tのみを入れた。次いで、ウェルを室温で30〜60分間インキュベートし、PBS-Tで4回洗浄した。   Nunc Maxisorp strip wells (Nunc catalog number 469949) were coated with 100 μl of 3 μg / ml A110 in PBS and incubated overnight (18-26 hours) at room temperature. After overnight incubation, unbound material was removed from the wells by washing 4 times with PBS-T. Replicate wells then received 100 μl of LTA solution (Sigma catalog number 2515, PBS-T diluted to 1 μg / ml) or PBS-T alone. The wells were then incubated for 30-60 minutes at room temperature and washed 4 times with PBS-T.

0.1%のヒト血清を含み、IgG、IgA、およびIgMを含まないPBS-T(Axell Cat BYA20341、Lot H2415)中に5μg/mlから0.078μg/mlまでの2倍希釈に滴定された、モノクローナル抗体M110、M130、MAb-11-230.3、MAb-11-232.3、MAb-11-391.4、MAb-11-557.3、MAb-11-564.4、MAb-11-580.5、およびMAb-11-586.3から選択された抗体100μlをウェルに入れた。   Monoclonal antibody titrated to 2-fold dilution from 5 μg / ml to 0.078 μg / ml in PBS-T (Axell Cat BYA20341, Lot H2415) with 0.1% human serum and no IgG, IgA, and IgM Selected from M110, M130, MAb-11-230.3, MAb-11-232.3, MAb-11-391.4, MAb-11-557.3, MAb-11-564.4, MAb-11-580.5, and MAb-11-586.3 100 μl of antibody was placed in the well.

それぞれのMabは、2列にLTAを入れ、もう2列にPBS-Tのみを入れておいた縦4列で滴定された。これらマウスMAbを、表18で使用したA130検出抗体と同様の検出抗体として利用した。   Each Mab was titrated in 4 columns with LTA in 2 rows and PBS-T alone in the other 2 rows. These mouse MAbs were used as detection antibodies similar to the A130 detection antibody used in Table 18.

さらに30〜60分間インキュベートした後、ウェルをPBS-Tで再度洗浄し、各ウェルに、PBS-T中に1万倍に希釈したHRP結合γ特異的抗マウスIgG(Jackson Immunoresearch Cat 115-035-164)95μlを入れた。30〜60分後、ウェルをPBS-Tで洗浄し、各ウェルに100μlのTMB基質溶液(BioFX Cat TMBW-0100-01)を加えた。室温の暗所で15分間反応を進行させ、各ウェルに100μlのTMB停止試薬(BioFX Cat STPR-0100-01)を加えて反応を停止させた。450nmフィルターを装着したMolecular Devices Vmaxマイクロプレートリーダーを使用して、各ウェルの吸光度を測定した。   After further incubation for 30-60 minutes, the wells were washed again with PBS-T and each well contained HRP-conjugated γ-specific anti-mouse IgG (Jackson Immunoresearch Cat 115-035-) diluted 10,000-fold in PBS-T. 164) 95 μl was added. After 30-60 minutes, the wells were washed with PBS-T, and 100 μl of TMB substrate solution (BioFX Cat TMBW-0100-01) was added to each well. The reaction was allowed to proceed for 15 minutes in the dark at room temperature, and 100 μl of TMB stop reagent (BioFX Cat STPR-0100-01) was added to each well to stop the reaction. The absorbance of each well was measured using a Molecular Devices Vmax microplate reader equipped with a 450 nm filter.

表19は、A110を捕捉抗体として使用した後LTAを使用し、次いで一連の検出MAbを使用するサンドイッチアッセイの結果を示す。このアッセイでは、PepGに結合すると考えられる抗体が、PepG調製物中の可能なLTA汚染物質に実際に結合しないことが確認される。プレート上のLTAを捕捉する捕捉抗体としてA110を使用した。MAb-11-230.2、MAb-11-232.3、MAb-11-557.3、MAb-11-564.4、MAb-11-586.3、およびM130は、すべてPepGに結合するが、プレート上に捕捉されたLTAに結合しない。予想されたように、ハイブリドーマ391.4によって産生されたものおよびM110を含む抗LTA抗体は、捕捉されたLTAに強く結合する。最後に、特異性が未知であるMAb-11-580.5は、捕捉されたLTAに結合しない。これらの結果から、M130を含む抗PepGモノクローナル抗体がLTAに結合しないことがさらに確認される。

Figure 2005524624
Table 19 shows the results of a sandwich assay using A110 as a capture antibody followed by LTA and then using a series of detection MAbs. This assay confirms that antibodies that are thought to bind to PepG do not actually bind to possible LTA contaminants in the PepG preparation. A110 was used as a capture antibody to capture LTA on the plate. MAb-11-230.2, MAb-11-232.3, MAb-11-557.3, MAb-11-564.4, MAb-11-586.3, and M130 all bind to PepG but bind to LTA captured on the plate do not do. As expected, anti-LTA antibodies, including those produced by hybridoma 391.4 and M110, bind strongly to captured LTA. Finally, MAb-11-580.5 of unknown specificity does not bind to captured LTA. These results further confirm that anti-PepG monoclonal antibody containing M130 does not bind to LTA.
Figure 2005524624

最後に、M110が、M130によって認識されるPepG調製物中の汚染物質を捕捉しないことをさらに確認するために、以下のサンドイッチアッセイを実施した。M110を捕捉抗体としてプレートに結合させ、次いで、LTAまたはPepGをプレートに結合させた後、A110またはA130のいずれかを検出抗体として結合させた。   Finally, to further confirm that M110 does not capture contaminants in the PepG preparation recognized by M130, the following sandwich assay was performed. M110 was bound to the plate as a capture antibody, and then either LTA or PepG was bound to the plate followed by either A110 or A130 as the detection antibody.

Nunc Maxisorpストリップウェル(Nuncカタログ番号469949)を3μg/mlのM110 100μlでコートし、室温で終夜(18〜26時間)インキュベートした。PBS-Tで4回洗浄して結合していない物質をウェルから除去した。次いで、100μl/ウェルのLTA溶液(Sigmaカタログ番号2515、PBS-Tに加えて1μg/mlに希釈したもの)を縦4列のウェルに入れ、100μl/ウェルのPepG溶液(PBS-T中10μg/ml)を縦4列のウェルに入れ、さらにPBS-Tのみを縦4列のウェルに入れた。ウェルを室温で30〜60分間インキュベートし、次いでPBS-Tで4回洗浄した。LTA結合、PepG結合、およびPBS-tのそれぞれの2列に、0.1%のヒト血清を含み、IgG、IgA、およびIgMを含まないPBS-T(Axell Cat BYA20341、Lot H2415)中に5μg/mlから0.078μg/mlまでの2倍希釈に滴定されたA130 100μlを入れた。同様に希釈および滴定されたA110を、LTA結合、PepG結合、およびPBS-tのそれぞれの2列に入れた。これらのキメラ抗体は、表18で使用したA130検出抗体と同様の「検出」抗体として使用した。   Nunc Maxisorp strip wells (Nunc catalog number 469949) were coated with 100 μl of 3 μg / ml M110 and incubated overnight (18-26 hours) at room temperature. Unbound material was removed from the wells by washing 4 times with PBS-T. Next, 100 μl / well of LTA solution (Sigma catalog number 2515, diluted in PBS-T and diluted to 1 μg / ml) was placed in 4 columns of wells and 100 μl / well of PepG solution (10 μg / well in PBS-T). ml) was placed in four vertical wells, and only PBS-T was placed in four vertical wells. The wells were incubated for 30-60 minutes at room temperature and then washed 4 times with PBS-T. 5 μg / ml in PBS-T (Axell Cat BYA20341, Lot H2415) with 0.1% human serum and no IgG, IgA, and IgM in each two rows of LTA, PepG, and PBS-t 100 μl of A130 titrated to a 2-fold dilution from 1 to 0.078 μg / ml. A110, similarly diluted and titrated, was placed in two rows of LTA binding, PepG binding, and PBS-t, respectively. These chimeric antibodies were used as “detection” antibodies similar to the A130 detection antibody used in Table 18.

30〜60分間インキュベートした後、ウェルをPBS-Tで洗浄し、各ウェルに、PBS-T中に6千倍に希釈したHRP結合γ特異的ヤギ抗ヒトIgG(Zymed Cat 62-8420)95μlを加えた。30〜60分後、ウェルをPBS-Tで洗浄し、各ウェルに100μlのTMB基質溶液(BioFX Cat TMBW-0100-01)を加えた。室温、暗所で15分間反応を進行させ、各ウェルに100μlのTMB停止試薬(BioFX Cat STPR-0100-01)を加えて反応を停止させた。450nmフィルターを装着したMolecular Devices Vmaxマイクロプレートリーダーを使用して、各ウェルの吸光度を測定した。   After incubating for 30-60 minutes, the wells were washed with PBS-T, and each well received 95 μl of HRP-conjugated γ-specific goat anti-human IgG (Zymed Cat 62-8420) diluted 6000 times in PBS-T. added. After 30-60 minutes, the wells were washed with PBS-T, and 100 μl of TMB substrate solution (BioFX Cat TMBW-0100-01) was added to each well. The reaction was allowed to proceed for 15 minutes in the dark at room temperature, and 100 μl of TMB stop reagent (BioFX Cat STPR-0100-01) was added to each well to stop the reaction. The absorbance of each well was measured using a Molecular Devices Vmax microplate reader equipped with a 450 nm filter.

表20は、M110を捕捉抗体として使用した後、PepGまたはLTAを使用し、次いでA110またはA130を検出抗体として使用するサンドイッチアッセイの結果を示す。これらの結果は、M110が、A130によって結合され得る抗原を捕捉しないことをここでも実証している。さらに、抗-LTA M110抗体でPepG調製物を捕捉しても、A110の背景レベルを上回る結合を示すのに十分なLTAが捕捉されないので、この結果は、これらアッセイで使用したPepG調製物がLTAをそれほどのレベルで含んでいないことを実証している。

Figure 2005524624
Table 20 shows the results of a sandwich assay using M110 as the capture antibody followed by PepG or LTA and then A110 or A130 as the detection antibody. These results again demonstrate that M110 does not capture an antigen that can be bound by A130. Furthermore, capturing PepG preparations with anti-LTA M110 antibody does not capture enough LTA to show binding above the background level of A110, so this result indicates that the PepG preparation used in these assays is Is not included at such a high level.
Figure 2005524624

PepGを結合するヒト抗体
上述のような処理の際のHAMA応答を最小限に抑えるのにマウス抗体をヒト化するよりも、当業者ならば、完全にヒトである防御性抗PepG抗体を単離することができる。完全にヒトの組換え抗体を生成するのに当業者が使用してよい代替戦略のいくつかがよく知られている。その1つは、ファージディスプレイ技術を使用する抗体の生成である(50、54)。詳細には、ヒトRNAを使用して、バクテリオファージの表面上に発現される抗体の重鎖および軽鎖断片のcDNAライブラリーを作製する。そのようなライブラリーを使用して、関心のある抗原(すなわちPepG)を探索することができ、次いで、表面に抗体が発現されているために結合するファージを単離する。可変領域をコードするDNAの配列を決定し、抗体を発現させるためのクローン化を行う。
Human antibodies that bind PepG Rather than humanizing mouse antibodies to minimize the HAMA response during treatment as described above, those skilled in the art will isolate protective anti-PepG antibodies that are fully human. can do. Some of the alternative strategies that can be used by those skilled in the art to generate fully human recombinant antibodies are well known. One is the production of antibodies using phage display technology (50, 54). Specifically, human RNA is used to create a cDNA library of antibody heavy and light chain fragments expressed on the surface of bacteriophage. Such a library can be used to search for the antigen of interest (ie, PepG) and then isolate the phage that bind because the antibody is expressed on the surface. The sequence of the DNA encoding the variable region is determined, and cloning is performed to express the antibody.

ヒト抗体を生成する別の方法は、「ヒト化」マウスを利用する。そのようなトランスジェニックマウスは、自身の抗体遺伝子がヒト抗体遺伝子複合体の一部と入れ替わっているので、抗原を接種すると、ヒト抗体を産生する(48、50、51、52、54)。その結果得られる抗体産生細胞は、次いで、特定のモノクローナル抗体を産生する細胞系統を樹立するための標準のハイブリドーマ技術に組み入れることができる。   Another method of generating human antibodies utilizes “humanized” mice. Such transgenic mice produce human antibodies when inoculated with an antigen (48, 50, 51, 52, 54) because their antibody genes have replaced part of the human antibody gene complex. The resulting antibody producing cells can then be incorporated into standard hybridoma technology to establish cell lines that produce specific monoclonal antibodies.

組換えヒト抗体は、抗PepG応答の強いヒトのボランティアから抗体産生B細胞を単離することによっても生成される。蛍光活性化細胞選別法(FACS)および蛍光標識したPepGを使用して、抗PepG抗体を産生する細胞を他の細胞から分離することができる。次いでRNAを抽出し、反応性抗体の可変領域の配列を決定することができる(49、53)。その機能し得る可変領域のDNA配列は、組換えヒト抗体の大規模生産のために、合成してもよいし、哺乳動物性発現ベクターにクローン化してもよい。   Recombinant human antibodies can also be generated by isolating antibody producing B cells from human volunteers with strong anti-PepG responses. Using fluorescence activated cell sorting (FACS) and fluorescently labeled PepG, cells that produce anti-PepG antibodies can be separated from other cells. RNA can then be extracted and the variable region of the reactive antibody can be sequenced (49, 53). The functional variable region DNA sequence may be synthesized or cloned into a mammalian expression vector for large-scale production of recombinant human antibodies.

結論
モノクローナル抗体は、マウスにおいて、グラム陽性細菌上の豊富な細胞表面分子である黄色ブドウ球菌PepGに対して産生させた。ハイブリドーマ・クローンの1つ99-110FC12IE4は、ELISAアッセイにおいてPepGに強く結合するが、表皮ブドウ球菌株Hay、またはグラム陽性細菌に共通の別の表面分子であるLTAに結合しないIgM抗体を産生する(実施例1、表5)。
Conclusion Monoclonal antibodies were raised in mice against S. aureus PepG, an abundant cell surface molecule on Gram-positive bacteria. One hybridoma clone, 99-110FC12IE4, binds strongly to PepG in an ELISA assay, but produces IgM antibodies that do not bind to LTA, another surface molecule common to S. epidermidis strain Hay, or Gram-positive bacteria ( Example 1, Table 5).

モノクローナル抗体を、枯草菌PepGに対しても産生させた。ハイブリドーマBB4/A4およびBB4/A5は、枯草菌PepGに結合するIgG抗体を産生する(実施例2)。BB4/A4、BB4/A5、11-232.3、11-248.2、11-569.3によって産生されたモノクローナル抗体、およびハイブリドーマ11-232.3から精製された抗体702PGの親和性について、数種の異なる細菌由来のPepGへの結合をELISAアッセイで試験した。同じマウスから産生されたMAb-BB4/A4およびMAb-BB4/A5は、枯草菌および表皮ブドウ球菌由来のPepGに強く結合し、MAb-11-232.3およびMAb-11-248.2は、PepG黄色ブドウ球菌に強く結合した(実施例3、表6)。これらの結果は、あるグラム陽性細菌由来のPepGに対するモノクローナル抗体が、別のグラム陽性細菌由来のPepGと結合し得ることを示しており、このことは、PepG上の保存されたエピトープとの結合を示しているのかもしれない。   Monoclonal antibodies were also raised against Bacillus subtilis PepG. Hybridomas BB4 / A4 and BB4 / A5 produce IgG antibodies that bind to Bacillus subtilis PepG (Example 2). PepG from several different bacteria for the affinity of monoclonal antibodies produced by BB4 / A4, BB4 / A5, 11-232.3, 11-248.2, 11-569.3, and antibody 702PG purified from hybridoma 11-232.3 Binding to was tested in an ELISA assay. MAb-BB4 / A4 and MAb-BB4 / A5 produced from the same mouse bind strongly to PepG from Bacillus subtilis and Staphylococcus epidermidis, while MAb-11-232.3 and MAb-11-248.2 are PepG Staphylococcus aureus (Example 3, Table 6). These results indicate that a monoclonal antibody against PepG from one gram-positive bacterium can bind to PepG from another gram-positive bacterium, which indicates binding to a conserved epitope on PepG. Maybe it shows.

A110、MAb-11-232.3、MAb-11-248.2、MAb-99-110FC12IE4、およびMAb-11-569.3が黄色ブドウ球菌PepGに結合するかどうかをELISAアッセイで試験した。UVで死滅させた完全黄色ブドウ球菌、または黄色ブドウ球菌PepGのどちらかに対して産生されたMAb-11-232.3、MAb-11-248.2、およびMAb-99-110FC12IE4は、黄色ブドウ球菌PepGに強く結合した。MAb-11-569.3は、これもUV死滅完全黄色ブドウ球菌に対して産生されたのであるが、PepGへの結合が弱く、この抗体が黄色ブドウ球菌表面上のPepG以外のエピトープに結合する可能性が示唆された。抗LTA抗体であるA110は、黄色ブドウ球菌PepGに結合しなかった(実施例4、表7)。抗体の黄色ブドウ球菌LTAへの結合を測定する同様のアッセイでは、かなりの結合を示したのがA110だけであった(実施例4、表8)。こうした結果は、UV死滅完全黄色ブドウ球菌に対して産生された抗体が実際に黄色ブドウ球菌表面上のPepGに特異的であるかもしれないことを実証している。   An ELISA assay tested whether A110, MAb-11-232.3, MAb-11-248.2, MAb-99-110FC12IE4, and MAb-11-569.3 bind to S. aureus PepG. MAb-11-232.3, MAb-11-248.2, and MAb-99-110FC12IE4 produced against either UV-killed S. aureus or S. aureus PepG are highly resistant to S. aureus PepG. Combined. MAb-11-569.3, which was also produced against UV-killed S. aureus, has weak binding to PepG, and this antibody may bind to non-PepG epitopes on the surface of S. aureus Was suggested. A110, an anti-LTA antibody, did not bind to S. aureus PepG (Example 4, Table 7). In a similar assay measuring the binding of antibody to S. aureus LTA, only A110 showed significant binding (Example 4, Table 8). These results demonstrate that antibodies raised against UV killed S. aureus may indeed be specific for PepG on the surface of S. aureus.

次いで、それぞれの抗体がメタノール-固定化表皮ブドウ球菌株Hayに結合するかどうかを試験した。表皮ブドウ球菌LTAに対して産生されたA110は、メタノール-固定化表皮ブドウ球菌に最も強く結合した。MAb-11-569.3およびMAb-11-248.2も、UV死滅黄色ブドウ球菌に対して産生されたにもかかわらず、メタノール−固定化表皮ブドウ球菌に強く結合した。このことは、これらの抗体が、2種の細胞株の表面上の保存されたエピトープに結合する可能性を示唆している。MAb-11-232.3は、これもUV死滅黄色ブドウ球菌に対して産生されたものであるが、メタノール−固定化表皮ブドウ球菌にそれほど強く結合しなかった。同様に、黄色ブドウ球菌PepGに対して産生されたMAb99-110FC12IE4は、メタノール−固定化表皮ブドウ球菌に結合しなかった(実施例4、表9)。   Each antibody was then tested to bind to methanol-immobilized Staphylococcus epidermidis strain Hay. A110 produced against S. epidermidis LTA bound most strongly to methanol-immobilized Staphylococcus epidermidis. MAb-11-569.3 and MAb-11-248.2 also bound strongly to methanol-immobilized Staphylococcus epidermidis despite being produced against UV killed S. aureus. This suggests that these antibodies may bind to a conserved epitope on the surface of two cell lines. MAb-11-232.3, which was also produced against UV killed Staphylococcus aureus, did not bind very strongly to methanol-immobilized Staphylococcus epidermidis. Similarly, MAb99-110FC12IE4 produced against S. aureus PepG did not bind to methanol-immobilized S. epidermidis (Example 4, Table 9).

最後に、A110、MAb-11-232.3、およびMAb-11-569.3がメタノール−固定化黄色ブドウ球菌に結合するかどうかを試験した。驚くべきことではないが、MAb-11-232.3およびMAb-11-569.3は、UV死滅完全黄色ブドウ球菌に対して産生されているので強く結合した。熱死滅表皮ブドウ球菌に対して産生されたものであるが、A110もメタノール−固定化黄色ブドウ球菌に結合し、この抗体が、2種の細菌間に保存されたエピトープに結合できることが示された(実施例4、表10)。   Finally, it was tested whether A110, MAb-11-232.3, and MAb-11-569.3 bind to methanol-immobilized S. aureus. Not surprisingly, MAb-11-232.3 and MAb-11-569.3 bound strongly because they were produced against UV-killed S. aureus. Although produced against heat-killed Staphylococcus epidermidis, A110 also binds to methanol-immobilized S. aureus, indicating that this antibody can bind to a conserved epitope between the two bacteria. (Example 4, Table 10).

黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌に対する抗体を除去してあるヒト血清由来の補体およびPMNの存在下で、ハイブリドーマ99-110FC12IE4の上清の、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌に対するオプソニン活性を試験した。MAb-99-110FC12IE4は、黄色ブドウ球菌に対してオプソニン性であったが、表皮ブドウ球菌に対してはオプソニン性でなかった(実施例5、表11)。これまでの段落で論じたように、MAb-99-110FC12IE4は、黄色ブドウ球菌PepGに結合したが、完全表皮ブドウ球菌には結合せず、結合能とオプソニン活性の相関が示唆された。   The opsonin activity against Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis was tested in the supernatant of hybridoma 99-110FC12IE4 in the presence of complement and PMN from human serum from which antibodies against S. aureus and S. epidermidis were removed. MAb-99-110FC12IE4 was opsonic against S. aureus but not opsonic against S. epidermidis (Example 5, Table 11). As discussed in previous paragraphs, MAb-99-110FC12IE4 bound to Staphylococcus aureus PepG, but not to complete S. epidermidis, suggesting a correlation between binding ability and opsonin activity.

それぞれUV死滅完全黄色ブドウ球菌に対して産生されたMAb-11-232.2、MAb-11-569.3、MAb-11-248.2、精製黄色ブドウ球菌PepGに対して産生されたMAb-99-110FC12IE4、ならびにA110を、5型黄色ブドウ球菌に対する類似のオプソニン食作用アッセイで試験した。UV死滅黄色ブドウ球菌に対して産生された抗体MAb-11-232.2、MAb-11-569.3、およびMAb-11-248.2、ならびに黄色ブドウ球菌PepGに対して産生されたMAb-110FC12IE4は、このアッセイにおいて黄色ブドウ球菌を少なくとも75%死滅させた。表皮ブドウ球菌由来のLTAに対して産生された抗LTA抗体であるA110は、23%の死滅しか示さなかった(実施例5、表12)。驚くべきことに、A110は、黄色ブドウ球菌LTAおよびメタノール−固定化完全黄色ブドウ球菌の両方に強く結合したものの、黄色ブドウ球菌に対するオプソニン性が強くなかった。キメラでない型のA110であるM110は、前述のアッセイにおいて黄色ブドウ球菌に対するオプソニン性が若干強かった(実施例5、表12B)。しかし、このばらつきは、A110が表皮ブドウ球菌に対する活性を失わないでいるので、キメラ抗体と非キメラ抗体間の活性の差というよりも、アッセイ間の差異および用量の影響のためであると思われる(実施例5、表13)。一方、黄色ブドウ球菌PepGに対して、またUV死滅完全黄色ブドウ球菌に対して産生された抗体は、予想どおりその細菌に対して強いオプソニン活性を示した。   MAb-11-232.2, MAb-11-569.3, MAb-11-248.2 produced against UV-killed S. aureus, MAb-99-110FC12IE4 produced against purified S. aureus PepG, respectively, and A110 Were tested in a similar opsonophagocytic assay against type 5 S. aureus. Antibodies MAb-11-232.2, MAb-11-569.3, and MAb-11-248.2 produced against UV-killed Staphylococcus aureus, and MAb-110FC12IE4 produced against S. aureus PepG were used in this assay. At least 75% of S. aureus was killed. A110, an anti-LTA antibody raised against LTA from Staphylococcus epidermidis, showed only 23% killing (Example 5, Table 12). Surprisingly, A110 bound strongly to both S. aureus LTA and methanol-immobilized complete S. aureus, but was not highly opsonic to S. aureus. M110, a non-chimeric form of A110, was slightly more opsonic to S. aureus in the above assay (Example 5, Table 12B). However, this variability appears to be due to inter-assay differences and dose effects rather than differences in activity between chimeric and non-chimeric antibodies since A110 does not lose activity against S. epidermidis. (Example 5, Table 13). On the other hand, antibodies raised against S. aureus PepG and against UV killed S. aureus showed strong opsonin activity against the bacteria as expected.

表皮ブドウ球菌株Hayに対する同様のアッセイでは、MAb-11-232.2、MAb-11-569.3、およびMAb-11-248.2は、少なくとも66%の死滅を示したが、MAb-99-110FC12IE4は、ほとんどまたはまったく死滅を示さなかった。A110は、前述のアッセイとは対照的に、表皮ブドウ球菌株Hayを少なくとも98%死滅させた(実施例5、表13)。これらの結果および上で論じた結果は、メタノール−固定化細菌に結合できる能力と、その細菌に対するオプソニン活性との強い相関を示すものである。しかし、A110は、メタノール−固定化黄色ブドウ球菌に結合することができるが、生きた黄色ブドウ球菌に対してオプソニン性でないので、留意すべき例外である。さらに、これらの結果は、UV死滅黄色ブドウ球菌に対して産生されたモノクローナル抗体が、表皮ブドウ球菌に対してオプソニン活性を示し得ることを実証しており、一方に対して産生されたMAbを他方に対してオプソニン性にする、2種の細菌間の保存された決定基の存在を示唆する。MAb-11.232.3は、メタノール−固定化細菌ELISAにおいて表皮ブドウ球菌に対する結合が弱いにもかかわらず、それでもこの細菌に対して若干オプソニン性であったので、これらの結果は、オプソニン活性にとっては弱い結合で十分であるかもしれないことも示している。   In a similar assay for S. epidermidis strain Hay, MAb-11-232.2, MAb-11-569.3, and MAb-11-248.2 showed at least 66% killing, while MAb-99-110FC12IE4 was almost or It did not show any death. A110 killed at least 98% of S. epidermidis strain Hay, in contrast to the previous assay (Example 5, Table 13). These results and those discussed above show a strong correlation between the ability to bind to methanol-immobilized bacteria and the opsonin activity against that bacteria. However, A110 is an exception to note because it can bind to methanol-immobilized S. aureus but is not opsonic to live S. aureus. In addition, these results demonstrate that monoclonal antibodies raised against UV-killed Staphylococcus aureus can exhibit opsonin activity against S. epidermidis, while the MAb produced against one is Suggests the existence of a conserved determinant between the two bacteria that makes them opsonic. These results are weak for opsonin activity since MAb-11.232.3 was still slightly opsonic to this bacterium, despite weak binding to Staphylococcus epidermidis in methanol-immobilized bacterial ELISA It also shows that a bond may be sufficient.

MAb-11-232.3が鼻腔でのコロニー形成を阻止する能力を、マウスにおいて試験した。対照群では9匹中9匹のマウスに黄色ブドウ球菌によるコロニー形成があったのに対し、5型黄色ブドウ球菌をMAb-11-232.3と共にプレインキュベートした後では、8匹中3匹のマウスだけに黄色ブドウ球菌のコロニー形成があった。さらに、コロニー形成のあったマウスのうちで、MAb-11232.3と共にプレインキュベートした黄色ブドウ球菌を受容したマウスの細菌コロニー数は、対照マウスの10分の1であった(実施例6、表14)。これらの結果は、黄色ブドウ球菌に結合し、かつそれに対してオプソニン性であるMAb-11-232.3が、細菌による鼻腔でのコロニー形成を阻止でき、またコロニー形成のあるマウスにおける細菌数も低減できることを示唆している。   The ability of MAb-11-232.3 to block colonization in the nasal cavity was tested in mice. In the control group, 9 out of 9 mice were colonized by Staphylococcus aureus, whereas after preincubating type 5 S. aureus with MAb-11-232.3, only 3 out of 8 mice There was colonization of Staphylococcus aureus. Furthermore, among the mice with colony formation, the number of bacterial colonies of mice that received S. aureus preincubated with MAb-11232.3 was 1/10 that of control mice (Example 6, Table 14). . These results indicate that MAb-11-232.3, which binds to and is opsonic to S. aureus, can block bacterial colonization in the nasal cavity and reduce the number of bacteria in colonized mice. It suggests.

ハイブリドーマ11-232.3をサブクローニングし、サブクローン11-232.3IE9によって産生された抗体M130をさらに分析した。M130が数種の異なる細菌に結合するかどうかを生細菌ELISAアッセイで試験した。M130は、生きた黄色ブドウ球菌の3種の異なる株に結合したが、溶血性連鎖球菌または表皮ブドウ球菌には結合しなかった(実施例7、表16)。これらの結果は、MAb-11-232.3が黄色ブドウ球菌に強く結合したが、表皮ブドウ球菌には弱くしか結合しなかったメタノール−固定化化細菌ELISAと一致している。したがって、MAb-11.232.3およびM130は黄色ブドウ球菌に特異的であるとはいえ、MAb-11-232.3が、表皮ブドウ球菌に対して、結合の強さは劣るにもかかわらず若干はオプソニン性であるように、種々の細菌株に対して幅広い反応性を有する。   Hybridoma 11-232.3 was subcloned and antibody M130 produced by subclone 11-232.3IE9 was further analyzed. A live bacterial ELISA assay was used to test whether M130 binds to several different bacteria. M130 bound to three different strains of live S. aureus but not hemolytic streptococci or S. epidermidis (Example 7, Table 16). These results are consistent with a methanol-immobilized bacterial ELISA in which MAb-11-232.3 bound strongly to S. aureus but only weakly to S. epidermidis. Therefore, although MAb-11.232.3 and M130 are specific for Staphylococcus aureus, MAb-11-232.3 is slightly opsonic to Staphylococcus epidermidis, although its binding strength is inferior. As such, it has a broad reactivity against various bacterial strains.

M130の可変領域をクローン化し、M130可変領域とヒト定常領域を有するヒト/マウスキメラ抗体を作製した(実施例8および9)。A130と称したこのようなキメラ抗体は、黄色ブドウ球菌PepGへの結合能を保持していた(実施例10、図7)。こうしたヒト/マウスキメラ抗体は、ヒトにおけるHAMA応答が低減されていることが予想され、治療上有利であるかもしれない。   The variable region of M130 was cloned to produce a human / mouse chimeric antibody having an M130 variable region and a human constant region (Examples 8 and 9). Such a chimeric antibody designated A130 retained the ability to bind to S. aureus PepG (Example 10, FIG. 7). Such human / mouse chimeric antibodies are expected to have a reduced HAMA response in humans and may be therapeutically advantageous.

最後に、サンドイッチアッセイを実施して、本発明の抗PepG抗体が実際にPepGに特異的であり、PepG調製物中の汚染物質に結合しないことを確認した。最初のアッセイでは、一連の抗体を使用してプレート上のPepGを捕捉し、次いでA130を検出抗体として使用して、捕捉されたPepGを検出した(実施例11、表18)。予想どおり、PepGに結合することがわかっている抗体は、A130抗体の結合よって検出されるように、PepGを捕捉することができた。LTAに結合する抗体は、A130によって検出できた抗原を捕捉せず、A130がLTAに結合しないことが示唆された。第2のアッセイでは、抗LTA A110抗体を使用してプレート上のLTAを捕捉し、次いでそれを、最初のアッセイで捕捉用に用いたものと同じ一連の抗体で検出した(実施例11、表19)。予想どおり、抗LTA抗体は、A110によって捕捉されたLTAを検出することができた。一方、抗PepG抗体は、A110によって捕捉された抗原を検出することができず、この種の抗体がLTAに結合しないことが示唆された。最後に、M110を使用して、プレート上のLTAまたはPepGのどちらかを捕捉し、次いで捕捉された抗体をA110またはA130で検出した(実施例11、表20)。予想どおり、M110は、PepG調製物またはLTA調製物由来の、A130によって検出可能であった抗原を捕捉できなかった。しかし、M110は、A110によって検出可能であったLTAを捕捉することができた。重要なことに、M110は、PepG調製物由来のLTAを、A110によって測定可能に検出されるのに十分なだけ捕捉することができず、PepG調製物がLTAをほとんど含んでいないことが示唆された。PepG調製物の純度がこのレベルであることは、これまで実証されていなかった。   Finally, a sandwich assay was performed to confirm that the anti-PepG antibodies of the present invention are indeed specific for PepG and do not bind to contaminants in the PepG preparation. In the first assay, a series of antibodies was used to capture PepG on the plate, and then A130 was used as a detection antibody to detect the captured PepG (Example 11, Table 18). As expected, antibodies known to bind to PepG were able to capture PepG, as detected by binding of the A130 antibody. Antibodies that bind to LTA did not capture the antigen that could be detected by A130, suggesting that A130 does not bind to LTA. In the second assay, anti-LTA A110 antibody was used to capture LTA on the plate, which was then detected with the same series of antibodies used for capture in the first assay (Example 11, Table 1). 19). As expected, anti-LTA antibody was able to detect LTA captured by A110. On the other hand, the anti-PepG antibody could not detect the antigen captured by A110, suggesting that this type of antibody does not bind to LTA. Finally, M110 was used to capture either LTA or PepG on the plate, and then the captured antibody was detected with A110 or A130 (Example 11, Table 20). As expected, M110 failed to capture antigens that were detectable by A130 from PepG or LTA preparations. However, M110 was able to capture LTA that was detectable by A110. Importantly, M110 was unable to capture LTA from PepG preparations enough to be measurablely detected by A110, suggesting that PepG preparations contain very little LTA. It was. This level of purity of the PepG preparation has not been demonstrated to date.

これまでは、使用されたポリクローナル血清が、細菌表面上の多くの異なるエピトープに結合する多くの異なる抗体を含んでおり、そのまとまった結合および活性の総和が血清全体としての活性になっているかもしれないので、モノクローナル抗体がグラム陽性細菌の食作用を増強することができるかどうかは不明であった。そこで本発明者らは、細菌表面上の単一のエピトープに結合するモノクローナル抗体が、その細菌に対してオプソニンになり得ることを実証した。また、PepGに対するモノクローナル抗体がそうした活性をもち得ること、ならびにこの種の抗体がいくつかの異なる型のグラム陽性細菌に対してオプソニンであり得ることも実証した。   So far, the polyclonal sera used contain many different antibodies that bind to many different epitopes on the bacterial surface, and the sum of the combined binding and activity may be the activity of the whole serum. As such, it was unclear whether monoclonal antibodies could enhance the phagocytosis of Gram-positive bacteria. Thus, the inventors have demonstrated that a monoclonal antibody that binds to a single epitope on the surface of a bacterium can be opsonized against that bacterium. We have also demonstrated that monoclonal antibodies against PepG can have such activity, and that this type of antibody can be opsonized against several different types of Gram-positive bacteria.

本発明の抗体は、鼻腔コロニー形成を阻止または軽減することができる。したがって、本発明の抗体は、抗生物質耐性のグラム陽性細菌感染と闘う際の有用な防御分子となり得る。   The antibodies of the present invention can prevent or reduce nasal colonization. Thus, the antibodies of the present invention can be useful protective molecules in combating antibiotic-resistant gram positive bacterial infections.

参考文献

Figure 2005524624
Figure 2005524624
Figure 2005524624
Figure 2005524624
Figure 2005524624
Figure 2005524624
Figure 2005524624
上記のとおり本発明を完全に説明したが、当業者ならば、本発明の思想および範囲から逸脱することなく、過度の実験を要することもなく、本発明を均等および条件の範囲内で実施できることがわかるであろう。また特定の実施形態および実施例に照らして本発明を説明してきたが、本発明者らは、それらはさらに変更可能なものであると考える。本出願は、上述の一般原理に従う本発明の変形、使用または改変にまで及ぶことを意図している。 References
Figure 2005524624
Figure 2005524624
Figure 2005524624
Figure 2005524624
Figure 2005524624
Figure 2005524624
Figure 2005524624
Although the present invention has been described completely as described above, those skilled in the art can implement the present invention within the scope of equality and conditions without departing from the spirit and scope of the present invention and without undue experimentation. You will understand. Also, although the present invention has been described in the context of particular embodiments and examples, the inventors believe that they can be further modified. This application is intended to cover any variations, uses, or modifications of the invention according to the general principles set forth above.

本明細書は、参考文献の列挙を含むが、その参考文献を参考として本明細書中に特に取り入れるものとする。   This specification includes a list of references, which are specifically incorporated herein by reference.

M130の重鎖可変領域および軽鎖可変領域についてのcDNAクローン化戦略を示す図である。FIG. 2 shows the cDNA cloning strategy for the heavy chain variable region and light chain variable region of M130. (A)M130抗体軽鎖可変領域(配列番号1および配列番号2)および(B)M130抗体重鎖可変領域(配列番号3および配列番号4)のポリペプチド配列および核酸配列を示す図である。It is a figure which shows the polypeptide sequence and nucleic acid sequence of (A) M130 antibody light chain variable region (sequence number 1 and sequence number 2) and (B) M130 antibody heavy chain variable region (sequence number 3 and sequence number 4). (A)M130抗体軽鎖可変領域(配列番号1および配列番号2)および(B)M130抗体重鎖可変領域(配列番号3および配列番号4)のポリペプチド配列および核酸配列を示す図である(図2-1のつづき)。(A) shows the polypeptide and nucleic acid sequences of the M130 antibody light chain variable region (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) and (B) M130 antibody heavy chain variable region (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) ( (Continued in Figure 2-1.) pJSB22重鎖発現プラスミドを示す図である。It is a figure which shows pJSB22 heavy chain expression plasmid. pJSB6軽鎖発現プラスミドを示す図である。It is a figure which shows the pJSB6 light chain expression plasmid. pLG1 ビ-シストロン性発現プラスミドを示す図である。FIG. 2 shows a pLG1 bicistronic expression plasmid. 抗ヒトIgGのマウス/ヒトキメラ抗体A130への結合を示す図である。It is a figure which shows the coupling | bonding of the anti-human IgG to the mouse / human chimeric antibody A130. マウス/ヒトキメラ抗体A130の黄色ブドウ球菌ペプチドグリカンに対する結合活性を示す図である。It is a figure which shows the binding activity with respect to S. aureus peptidoglycan of the mouse / human chimeric antibody A130.

【配列表】

Figure 2005524624
Figure 2005524624
Figure 2005524624
Figure 2005524624
Figure 2005524624
[Sequence Listing]
Figure 2005524624
Figure 2005524624
Figure 2005524624
Figure 2005524624
Figure 2005524624

Claims (22)

グラム陽性細菌のペプチドグリカン(PepG)に結合する治療上有効量の少なくとも1つのMAbを含み、該MAbが、患者への投与の際に治療上有益な結果をもたらす医薬。   A medicament comprising a therapeutically effective amount of at least one MAb that binds to peptidoglycan (PepG) of gram positive bacteria, wherein the MAb produces a therapeutically beneficial result upon administration to a patient. 投与によって患者のグラム陽性細菌数が低減される、請求項1に記載の医薬。   The medicament according to claim 1, wherein the administration reduces the number of Gram-positive bacteria in the patient. 少なくとも1つのMAbが、ELISAにおいて背景と比べて少なくとも2倍大きいレベルでグラム陽性細菌PepGを結合する、請求項1に記載の医薬。   The medicament according to claim 1, wherein the at least one MAb binds the Gram positive bacterium PepG at a level at least twice as large as the background in ELISA. 少なくとも1つのMAbが、グラム陽性細菌に対するオプソニン食作用を少なくとも50%増強する、請求項1に記載の医薬。   2. The medicament of claim 1, wherein the at least one MAb enhances opsonophagocytosis on Gram positive bacteria by at least 50%. 医薬上許容可能な担体をさらに含む、請求項1に記載の医薬。   The medicament according to claim 1, further comprising a pharmaceutically acceptable carrier. 少なくとも1つの抗ブドウ球菌薬をさらに含む、請求項1に記載の医薬。   The medicament according to claim 1, further comprising at least one anti-staphylococcal drug. グラム陽性細菌のリポテイコ酸(LTA)に結合する少なくとも1つのMAbをさらに含む、請求項1に記載の医薬。   2. The medicament of claim 1, further comprising at least one MAb that binds to lipoteichoic acid (LTA) of gram positive bacteria. 少なくとも1つのMAbが、患者の鼻孔への点滴注入の際にグラム陽性細菌によるコロニー形成を阻止する、請求項1に記載の医薬。   The medicament according to claim 1, wherein the at least one MAb prevents colonization by Gram positive bacteria upon instillation into the patient's nostril. 少なくとも1つのMAbが、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)、およびリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)から選択されたグラム陽性細菌のPepGと特異的に結合する、請求項1に記載の医薬。   At least one MAb is Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus mutans, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Enterococcus faecalis The medicament according to claim 1, which specifically binds to PepG of a Gram-positive bacterium selected from Enterococcus faecalis) and Listeria monocytogenes. 少なくとも1つのMAbが、MAb-11-232.3、 MAb-11-248.2、MAb-11-569.3、MAb-11-232.3IE9、MAb99-110FC12IE4、A130、およびM130から選択される、請求項1に記載の医薬。   The at least one MAb is selected from MAb-11-232.3, MAb-11-248.2, MAb-11-569.3, MAb-11-232.3IE9, MAb99-110FC12IE4, A130, and M130. Medicine. 少なくとも1つのMAbが、配列番号1および配列番号3から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む可変領域を含む、請求項1に記載の医薬。   The medicament of claim 1, wherein the at least one MAb comprises a variable region comprising a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3. 少なくとも1つのMAbが、配列番号1および配列番号3から選択されたアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチドを含む可変領域を含む、請求項1に記載の医薬。   The medicament according to claim 1, wherein the at least one MAb comprises a variable region comprising a polypeptide having at least 80% identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3. 少なくとも1つのMAbが、キメラMAb、ヒト化MAb、およびヒトMAbから選択される、請求項1に記載の医薬。   The medicament according to claim 1, wherein the at least one MAb is selected from a chimeric MAb, a humanized MAb, and a human MAb. 少なくとも1つのMAbが、改変されたFc部分を含み、該改変によって、該Fc部分を介する該Mabの非特異的結合が低減される、請求項1に記載の医薬。   2. The medicament of claim 1, wherein at least one MAb comprises a modified Fc portion, wherein the modification reduces non-specific binding of the Mab through the Fc portion. 少なくとも1つのMAbが、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、SFv、およびscFvから選択される、請求項1に記載の医薬。 The medicament according to claim 1, wherein the at least one MAb is selected from Fab, Fab ', F (ab') 2 , Fv, SFv, and scFv. 患者に請求項1〜15のいずれかに記載の医薬を治療上有効量投与することを含む、患者の治療方法。   A method for treating a patient, comprising administering to the patient a therapeutically effective amount of the medicament according to any one of claims 1 to 15. 前記患者が、入院中の乳幼児、早産児、火傷被害者、高齢の患者、免疫無防備状態の患者、免疫抑制状態の患者、侵襲性の処置を受けている患者、および保健医療従事者から選択される、請求項16に記載の方法。   The patient is selected from hospitalized infants, premature babies, burn victims, elderly patients, immunocompromised patients, immunosuppressed patients, patients undergoing invasive procedures, and health care workers The method according to claim 16. 防御性モノクローナル抗体を、静脈内、腹腔内、体内注射、関節内、心室内、クモ膜下内、筋肉内、皮下、鼻腔内、膣内、および経口から選択された経路によって投与する、請求項1に記載の方法。   The protective monoclonal antibody is administered by a route selected from intravenous, intraperitoneal, intracorporeal injection, intra-articular, intraventricular, intrathecal, intramuscular, subcutaneous, intranasal, intravaginal, and oral. The method according to 1. ATCCに受託番号PTA-2492で寄託されているハイブリドーマ細胞系。   A hybridoma cell line deposited with ATCC under accession number PTA-2492. ATCCに受託番号PTA-3659で寄託されているハイブリドーマ細胞系。   A hybridoma cell line deposited with ATCC under accession number PTA-3659. 医薬上許容可能な担体中に少なくとも1つの精製PepG、ペプチド、その断片およびエピトープを含むワクチン。   A vaccine comprising at least one purified PepG, peptide, fragment thereof and epitope in a pharmaceutically acceptable carrier. 請求項21記載のワクチンを治療上有効量投与することを含む、患者の治療方法。   23. A method for treating a patient, comprising administering a therapeutically effective amount of the vaccine of claim 21.
JP2003559424A 2001-12-21 2002-12-23 Multifunctional monoclonal antibody against peptidoglycan of gram-positive bacteria Pending JP2005524624A (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34180601P 2001-12-21 2001-12-21
US34344401P 2001-12-21 2001-12-21
PCT/US2002/041032 WO2003059259A2 (en) 2001-12-21 2002-12-23 Multifunctional monoclonal antibodies directed to peptidoglycan of gram-positive bacteria

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009193403A Division JP2010013454A (en) 2001-12-21 2009-08-24 Multifunctional monoclonal antibodies directed to peptidoglycan of gram-positive bacteria

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2005524624A true JP2005524624A (en) 2005-08-18
JP2005524624A5 JP2005524624A5 (en) 2006-02-16

Family

ID=26992674

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003559424A Pending JP2005524624A (en) 2001-12-21 2002-12-23 Multifunctional monoclonal antibody against peptidoglycan of gram-positive bacteria
JP2009193403A Withdrawn JP2010013454A (en) 2001-12-21 2009-08-24 Multifunctional monoclonal antibodies directed to peptidoglycan of gram-positive bacteria

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009193403A Withdrawn JP2010013454A (en) 2001-12-21 2009-08-24 Multifunctional monoclonal antibodies directed to peptidoglycan of gram-positive bacteria

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1470237A4 (en)
JP (2) JP2005524624A (en)
AU (2) AU2002364740A1 (en)
CA (1) CA2469714A1 (en)
WO (1) WO2003059259A2 (en)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008255084A (en) * 2007-04-04 2008-10-23 Isako Hashimoto Anti-pollinosis agent or foodstuff
JP2009539360A (en) * 2006-06-06 2009-11-19 クルセル ホランド ベー ヴェー Human binding molecule having killing activity against staphylococci and methods of use thereof
JP2011519974A (en) * 2008-05-12 2011-07-14 ストロックス バイオファーマスーティカルズ,エルエルシー Antibody preparation specific to Staphylococcus aureus

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ572775A (en) * 2006-06-06 2011-09-30 Crucell Holland Bv Human binding molecules having killing activity against enterococci and staphylococcus aureus and uses thereof
JP5586952B2 (en) 2006-06-06 2014-09-10 クルセル ホランド ベー ヴェー Human binding molecules having killing activity against enterococci and methods of use thereof
WO2010085590A1 (en) * 2009-01-23 2010-07-29 Biosynexus Incorporated Opsonic and protective antibodies specific for lipoteichoic acid gram positive bacteria
EP2872535A1 (en) 2012-07-16 2015-05-20 Pfizer Inc. Saccharides and uses thereof
JP6371758B2 (en) * 2013-03-12 2018-08-08 全薬工業株式会社 Anti-staphylococcal antibody, method for producing the same and use thereof
CN106749652A (en) * 2017-03-14 2017-05-31 天津喜诺生物医药有限公司 A kind of polyclonal antibody of aureus peptide glycan
US20210355429A1 (en) * 2018-10-25 2021-11-18 Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. Method for collecting microorganism cell

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4596769A (en) * 1984-03-05 1986-06-24 Temple University Monoclonal antibodies to peptidoglycan and methods of preparing same
WO1998057994A2 (en) * 1997-06-16 1998-12-23 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Opsonic and protective monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of gram positive bacteria
WO2000056357A2 (en) * 1999-03-19 2000-09-28 Nabi Staphylococcus antigen and vaccine

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2356402B (en) * 2000-07-22 2001-10-31 Michael G Morgan Use of radio-labelled antibody to bacterial compounds in the diagnosis of focal infection in humans

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4596769A (en) * 1984-03-05 1986-06-24 Temple University Monoclonal antibodies to peptidoglycan and methods of preparing same
WO1998057994A2 (en) * 1997-06-16 1998-12-23 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Opsonic and protective monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of gram positive bacteria
WO2000056357A2 (en) * 1999-03-19 2000-09-28 Nabi Staphylococcus antigen and vaccine

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009539360A (en) * 2006-06-06 2009-11-19 クルセル ホランド ベー ヴェー Human binding molecule having killing activity against staphylococci and methods of use thereof
JP2008255084A (en) * 2007-04-04 2008-10-23 Isako Hashimoto Anti-pollinosis agent or foodstuff
JP2011519974A (en) * 2008-05-12 2011-07-14 ストロックス バイオファーマスーティカルズ,エルエルシー Antibody preparation specific to Staphylococcus aureus

Also Published As

Publication number Publication date
EP1470237A2 (en) 2004-10-27
WO2003059259A3 (en) 2004-06-17
CA2469714A1 (en) 2003-07-24
WO2003059259A2 (en) 2003-07-24
JP2010013454A (en) 2010-01-21
AU2009210372B2 (en) 2012-07-26
EP1470237A4 (en) 2006-02-01
AU2002364740A1 (en) 2003-07-30
AU2009210372A1 (en) 2009-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11447543B2 (en) Antibodies to S. aureus surface determinants
US7777017B2 (en) Nucleic acids encoding opsonic monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of gram positive bacteria
US20080014202A1 (en) Multifunctional monoclonal antibodies directed to peptidoglycan of gram-positive bacteria
JP4691225B2 (en) Opsonic and protective monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of Gram-positive bacteria
JP2010013454A (en) Multifunctional monoclonal antibodies directed to peptidoglycan of gram-positive bacteria
AU2009202762B2 (en) Opsonic monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of Gram positive bacteria
US7438909B2 (en) Immunization and treatment methods for anthrax
US20030224000A1 (en) Methods for blocking or alleviating staphylococcal nasal colonization by intranasal application of monoclonal antibodies
AU2013251165A1 (en) Cross-reactive Staphylococcus aureus antibody
WO2021052461A1 (en) Anti-alpha-hemolysin antibody and use thereof
JP2018058871A (en) Compositions and methods related to antibodies that neutralize coagulase activity during staphylococcus aureus disease
JP2005514053A6 (en) Opsonic monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of Gram-positive bacteria
US20050281830A1 (en) Detection, prevention, and treatment systems for anthrax
AU2012254925B2 (en) Opsonic monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of gram positive bacteria
AU2002365440A1 (en) Methods for blocking or alleviating staphylococcal nasal colonization by intranasal application of monoclonal antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20051222

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20051222

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090224

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20090518

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20090525

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090824

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20091027

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20100121

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20100128

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100720

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20101007

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20101015

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20110329