JP2004144532A - キャピラリー泳動分取システム及び分取方法 - Google Patents

Abstract

【課題】キャピラリー電気泳動で、生体物質の高精度、高分離な分離が困難だった。
【解決手段】レーザー光３０２をフローセル３内部のキャピラリー１のキャピラリー終端２付近に直接照射して蛍光検出を行うオンカラム検出を行い、キャピラリー終端２から試料成分５が溶出後、シース液流１６により試料成分５を回収点８まで移動し、試料成分５を回収する。
【効果】検出点４０１からキャピラリー終端２までの距離を短く出来るため、溶出時間の誤差を小さく出来、高精度な分取を行うことが出来る。
【選択図】　図３

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質等の生体物質の分析に関する。特にＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の分離回収に有効なキャピラリー電気泳動の分取システム及び分取方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子の配列解析に伴い、生体物質の分析は近年ますます重要になってきている。なかでも発現遺伝子の解析は遺伝子診断や治療、創薬などに役立つと注目されている。発現遺伝子の解析は現在、スラブゲル電気泳動によりＤＮＡ試料を分離後、特定のＤＮＡ断片をゲル切り出しにより回収し、配列解析することにより行われている。しかしながらこの分離・回収といった分取作業は手間がかかり熟練を要する。またゲル切り出しに伴い、分取の精度・分離能が低くなるという問題がある。このため、キャピラリー電気泳動による分取の自動化、高速化・高分離化が望まれている。キャピラリー電気泳動の高分離能により、一塩基精度の分取が可能となれば、その後ダイレクトシーケンスなど多くの応用が広がる。
【０００３】
キャピラリー電気泳動で分取を行う場合、試料を注入する側とは反対側のキャピラリー終端側に分取容器を設ける。泳動が終り、分離した試料成分がキャピラリー終端から溶出し、分取容器に達したところで試料成分を回収する。代表的な形態の主要部構成を図１に示す。キャピラリー１のキャピラリー終端２をフローセル３内に接続し、フローセル３内をシース液４で満たす。シース液４は、シース液送液チューブ９からフローセル３内に供給され、回収管６を通してフローセル３から排出される。その結果、シース液送液チューブ９、フローセル３、回収管６内にシース液流１６が形成される。シース液流１６の流速は時間的に精度良く一定に保たれる。電気泳動により試料はポリマー溶液１０４が満たされたキャピラリー１で試料成分５に分離され、検出点４０１にて検出される。その後キャピラリー終端２から溶出した試料成分５は、シース液流１６によりフローセル３、回収管６内を通り、回収管終端すなわち回収点８より排出される。通常は回収点８には廃液容器１４を設置し、回収管６から流れ出るシース液４を回収しているが、注目している試料成分５が回収点８に到達する時刻にタイミングを合わせ、回収点８に設置した廃液容器１４を分取容器７に切りかえ試料成分５を回収する。タイミングの計算方法は検出点４０１の位置により異なり、従来以下の二つの例が報告されている。
【０００４】
（ａ）レーザー光３０２をフローセル３の外部のキャピラリー１に直接照射して蛍光検出を行うオンカラム検出を行い、キャピラリー終端２から試料成分５が溶出後、シース液流１６により試料成分５を回収点８まで移動し、試料成分５を回収する方式。構成は図１と同様。（Ｋａｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．　１９９５，６７，２９７４−２９８０）。
【０００５】
（ｂ）キャピラリー終端２から試料成分５が溶出後、フローセル３内シース液４中で試料成分５をレーザー光３０２を照射して蛍光検出を行うシースフロー検出を行い、シース液流１６により試料成分５を回収点８まで移動し、試料成分５を回収する方式。構成を図２に示す。（Ｉｒｉｅ　ｅｔ　ａｌ．　，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　２０００，　２１，　３６７−３７４）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
高分離な分取行うためには、回収点８に設置した廃液容器１４を分取容器７に切りかえるタイミングを精度よく見積もる必要がある。そのためには試料成分５が検出点４０１から回収点８に到達するまでの到達時間を精度良く予測しなくてはならない。
【０００７】
（ａ）の方式では到達時間は、試料成分５が検出点４０１からキャピラリー終端２までキャピラリー１中を電気泳動する時間である溶出時間と、キャピラリー終端２から回収点８までシース液４中を流れる時間であるシース液流時間の和として計算される。溶出時間は、検出点４０１からキャピラリー終端２までの距離を、測定した電気泳動速度で割ることにより求められる。電気泳動速度は、キャピラリー１の試料注入端から検出点４０１までのキャピラリー長である泳動距離を、試料成分５がキャピラリーの試料注入端から検出点４０１まで泳動されるのに要する時間である検出時間で割ることによりキャピラリー全体の平均電気泳動速度として求められる。しかしながら、電気泳動速度はポリマー溶液１０４の状態により変化し、経験上、測定値と±２％程度の揺らぎがある。このため溶出時間は検出点４０１からキャピラリー終端２の距離に比例して誤差が大きくなり、距離を短くすることは物理的な配置上難しかったため、到達時間を高精度に決めることは出来なかった。
【０００８】
一方（ｂ）の方式では到達時間は検出点４０１から回収点８までの距離をシース液流１６の流速で割ることにより求められる。シース液流１６の流速は時間的に精度良く一定に保つことができるのでシース液流時間は高精度に求まる。しかしながら、シース液流時間の間、試料成分５がシース液４中に拡散するため回収点８における分離能が低下する問題があった。シース液流１６の流速を上げてシース液流時間を小さくすることにより、拡散による分離能低下を抑えることが出来るが、シース液流１６の流速は感度の問題から一定以上に速くすることが出来ず、このため一塩基精度の分離能で分取を行うことは出来なかった。
【０００９】
これらの理由からこれまでＤＮＡ断片を一塩基精度の高分離能で分取を行う方式はまだ確立されていない。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明ではキャピラリー電気泳動装置のフローセル３内部を図３のような構成とした。レーザー光３０２をフローセル３内部のキャピラリー１に直接照射して蛍光検出を行うオンカラム検出を行い、キャピラリー終端２から試料成分５が吐出後、シース液流１６により試料成分５を回収点８まで移動させ、試料成分５を回収する。
【００１１】
本方式では（ａ）のオンカラム方式で問題であった検出点４０１からキャピラリー終端２までの距離を限りなく短くすることが出来るため、溶出時間の誤差を小さくすることが出来、結果として到達時間を高精度に予測することが可能である。
【００１２】
ここで、ＤＮＡを一塩基精度で分取するために必要な到達時間の予測精度を見積もる。キャピラリー１の試料注入端から検出点までの距離は３６０ｍｍ、温度５０℃、電圧１５ｋＶ、ポリマー溶液１０４にはＰＯＰ６、試料１０１にはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社ＧｅｎｅＳｃａｎ　５００　Ｒｏｘを用い、電気泳動を行った場合の蛍光計測結果を図４に示す。４９０塩基長のＤＮＡ断片検出時間は６１．９分であり５００塩基長ＤＮＡ断片検出時間は６２．７分であった。これらの検出時間差は約０．８×６０＝４８（秒）である。これより、この塩基長における一塩基あたりの検出時間間隔は４８（秒）／１０（塩基）＝４．８（秒／一塩基）と計算できる。これを基準とすると、到達時間を一塩基精度で予測するためには、到達時間を誤差±０．５秒以下で予測できることが望ましい。
【００１３】
本方式の場合、検出点４０１をキャピラリー終端に限りなく近づけることが出来るので、到達時間の誤差も小さく出来る。
【００１４】
さらに高精度な分取を考えた場合、図５のような二点検出の方式も考えられる。図３の場合ではキャピラリー１全体の平均電気泳動速度を測定しているので、キャピラリーの位置による温度差の影響を受ける。これに対して図５のようにキャピラリー終端２近傍の二点で検出を行い、二点間の平均電気泳動速度を測定する場合（二点検出方式）、キャピラリー終端２近傍の温度がほぼ等しくなるように調整すると、キャピラリーの位置による温度差の影響はほぼなくなり、精度の高い電気泳動速度の測定が可能になる。ただし、２点検出方式でも電気泳動速度にはある程度の揺らぎが生じる。これはポリマー溶液１０４内のゴミ、ごく小さな気泡に起因するものと考えられており、経験上その大きさは電気泳動速度で±２％程度である。従って、二点検出の場合も検出点と終端までの距離（図５の距離Ｘ）を小さくしなければならない。
【００１５】
二点検出方式の溶出時間予測誤差を考察する。図５のように、フローセル３内部のキャピラリー１に第一検出点４０２、第二検出点４０３を設ける。第二検出点４０３からキャピラリー終端２までの長さをｘ、測定した二点間平均泳動速度をｖ、電気泳動速度の揺らぎを±２（％）とすると、ｘの長さ泳動するのにかかる溶出時間の予測誤差の大きさ｜Δｔ｜は｜Δｔ｜＝（１／ｖ−１／１．０２ｖ）ｘと表される。
【００１６】
ここで｜Δｔ｜が０．５秒以下であれば、一塩基精度の分離能でＤＮＡ断片が分取可能である。式より｜Δｔ｜を小さくするためには距離ｘを小さくすることが有効である。
【００１７】
今５００塩基長のＤＮＡ断片を分取する場合を考える。図４の電気泳動条件ではキャピラリー１の試料注入端から検出点までの距離が３６０ｍｍ、５００塩基長の検出時間が６２．７分であったので、５００塩基長の電気泳動速度は３６０／６２．７／６０＝０．０９６≒０．１０（ｍｍ／秒）より、約０．１０　ｍｍ／秒と測定された。図６は溶出時間予測誤差の大きさ｜Δｔ｜と溶出時間ｔをｘの距離に対してプロットしたものである。ｘに比例してΔｔは増加し、｜Δｔ｜を０．５秒以下とするためには、距離ｘは２．６　ｍｍ以下でなくてはならないことがわかる。ここでは、図５の装置を用いて説明したが、図４の装置、即ち１点検出の場合には、検出点４０１とキャピラリー終端２と間の長さをｘとする。このときも、｜Δｔ｜を０．５秒以下とするためには、距離ｘは２．６　ｍｍ以下でなくてはならない。
【００１８】
しかしながら、図１に示したようにフローセル３の外部でオンカラム検出を行う従来法では、検出系、容器の配置上の問題より、ｘを２．６　ｍｍ以下の長さにすることは難しい。ここでｘは検出点４０１からキャピラリー終端２までの長さを表す。実際従来法（Ｋａｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，６７，２９７４−２９８０）ではｘは１０．０　（ｍｍ）であり、上記の計算に合わせて考えると溶出時間予測誤差は約±２．０秒にもなる。一塩基精度の分取に必要な予測時間精度は誤差±０．５秒であるため、従来法では一塩基の精度で溶出時間を予測することはできない。
【００１９】
本方式のようにフローセル３内部のキャピラリー１上に直接照射してオンカラム検出を行うことにより、検出点４０１からキャピラリー終端２までの泳動距離を短くできる。その結果、溶出時間の予測誤差が小さくなり、検出点４０１から回収点８までの到達時間を高精度に求めることができる。また、キャピラリー１上で検出することから、シース液流１６の流速を大きくしても検出感度に対する影響はないため、拡散の影響を抑えることが出来、高分離に分取を行うことが出来る。さらに検出点４０１を二点以上設けることにより電気泳動速度をより正確に予測し、到達時間の精度を上げることも可能である。
【００２０】
なお、上記は蛍光を用いた検出について説明したが、勿論、重水素ランプや紫外線レーザーなどの紫外線光源を用いて、検出点４０１に紫外線を照射し、通過した紫外線の光量を計測することにより、吸収を検出しても良い。
【００２１】
また、上記は、ＤＮＡの分離について説明したが、ＤＮＡの他、ＲＮＡや蛋白質でも良い。
【００２２】
以上のように、本発明ではフローセル内でオンカラム検出を行うことにより、ｘ≦２．６　ｍｍを実現し、溶出時間予測誤差±０．５秒以下により１塩基分離の分取を可能とするシステムを提供する。これにより、その後の工程で精製する手間がなくなり、例えばＤＮＡ断片が一塩基の違いで分取できると、分取した試料を用いたダイレクトシーケンスを行うことができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
（実施例１）
本実施例では生体物質の試料として、塩基長の異なる複数の蛍光標識ＤＮＡ断片を混合したＤＮＡ試料を用い、キャピラリー電気泳動により塩基長違いで分離後、各ＤＮＡ断片をそれぞれ回収することを目的とした。
【００２４】
装置構成を図７に示す。装置はキャピラリー１、温調板１０、シース液容器１１、シース液送液チューブ９、フローセル３、回収管６、試料注入側ユニット１００、終端側ユニット２００、検出部ユニット３００からなる。試料は試料注入側ユニット１００からキャピラリー１内に注入され、キャピラリー１の両端に電圧を印加することで、キャピラリー１内を終端側ユニット２００に向かって電気泳動し、電気泳動速度の違いにより試料成分５に分離する。試料成分５は検出部ユニット３００により検出された後、キャピラリー終端側ユニット２００で回収される。
【００２５】
キャピラリー１には外径３６０μｍ、内径５０μｍ、長さ３６０　ｍｍのポリイミド被覆石英管（ポリマイクロ社）を用いた。本実施例においてはキャピラリー１として断面が丸型の石英管を用いたが、断面が四角型の石英管を用いても良い。キャピラリー１中央部は温調板１０により温度を調節した。温度は５０℃とした。
【００２６】
試料注入側ユニット１００の詳細を図８に示す。容器１１０上に試料１０１、バッファー１０２、純水１０３、ポリマー溶液１０４、シリンジ１０５を用意し、容器１１０はＹ，Ｚ方向に移動可能な基台１０６に上に設置した。試料１０１には１６１塩基長、２０１塩基長、２７１塩基長、３６３塩基長、３６４塩基長、４２１塩基長、４８９塩基長、５６２塩基長の８種類の蛍光標識ＤＮＡ断片が混合した溶液を用いた。濃度はそれぞれ１０　ｆ　ｍｏｌ／μｌであった。バッファー１０２にはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社３７００　ｂｕｆｆｅｒを用いた。ポリマー溶液１０４にはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社ＰＯＰ６を用いた。キャピラリー１の試料注入端１１１近傍に負電極１０７を設けた。
【００２７】
終端側ユニット２００の詳細を図９に示す。回収管６には長さ７０　ｍｍ、内径５００μｍであるステンレスの中空管を用い、グランド電極２０３と繋げた。グランド電極は電気的に常にグランドに落ちているものとする。回収管６の下には受け皿２０４と分取容器７を設けた。受け皿２０４はＸ，Ｚ方向に駆動可能であり、廃液チューブ２０５を介して廃液容器１４に繋がっている。分取容器７はＸ，Ｙ，Ｚ方向に駆動可能な分取容器台２０２上に設置した。分取容器７には３８４ウェルのタイタープレート（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社３８４　ｐｌａｔｅ）を用いた。本実施例では回収する試料成分５が８種類あり、それぞれを別のウェルに回収するよう駆動させた。
【００２８】
フローセル３内の構成は図５と同様である。フローセル３は石英製とし、内部の断面積は１　ｍｍ×１　ｍｍとした。キャピラリー１のキャピラリー終端２から１０　ｍｍの区間のポリイミド被覆を剥ぎ取り、この区間内に二点の検出点４０２、４０３をおいた。第一検出点４０２と第二検出点４０３との距離は５　ｍｍ、第二検出点４０３からキャピラリー終端２までの距離を２．５　ｍｍとした。またキャピラリー終端２と回収管入り口１５の距離は２　ｍｍとした。それぞれの検出点で試料成分５の蛍光分子を励起出来るよう、第一検出点４０２、第二検出点４０３にそれぞれフローセル３とキャピラリー１を通して、第一レーザー光３５１、第二レーザー光３５２を照射した。シース液４にはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社３７００　ｂｕｆｆｅｒを用いた。シース液４の流量は１μｌ　／　秒とした。
【００２９】
図１０は正面から見た検出部ユニット３００の概略図である。レーザー光源３０１から発したレーザー光３０２をミラー３０３により方向を調整し、ピンホール３０４、λ／２波長板３０５を通し、ウォラストンプリズム３０６に入射させた。分離角５°のウォラストンプリズム３０６によりレーザー光３０２を二つのレーザー光に分割し、それぞれを第一レーザー光３５１、第二レーザー光３５２とした。分割後シャッター３０７を通し、集光レンズ３０８を用いてフローセル３内部のキャピラリー１内に第一レーザー光３５１、第二レーザー光３５２をそれぞれ集光させた。ウォラストンプリズム３０６の中心位置と集光レンズ３０８との距離を集光レンズ３０８の焦点距離と同じとした。安全のためキャピラリー１を通過した第一レーザー光３５１、第二レーザー光３５２はレーザーストッパー３０９に入射させ、外部への反射、散乱がないよう留意した。レーザー光源３０１にはＣｏｈｅｒｅｎｔ社Ｓａｐｐｈｉｒｅ　４８８−２０を用いた。レーザ光波長は４８８　ｎｍ、レーザー強度は２０　ｍＷであった。ウォラストンプリズム３０６にはシグマ光機製、分離角５°のものを用いた。集光レンズ３０８にはφ＝　１５　ｍｍ、ｆ　＝　４０　ｍｍのレンズを用いた。
【００３０】
図１１は図１０の右側方から見た検出部ユニット３００の概略図である。第一検出点４０２、第二検出点４０３の二点の検出点に対し、一つの対物カメラレンズ３１０を用いて両検出点からの蛍光を受光する。対物カメラレンズ３１０にはオリンパスＦ　１．２、ｆ　＝　５０　ｍｍのものを用いた。両検出点からの蛍光は対物カメラレンズ３１０により平行光束にされた後、ノッチフィルター３１１を透過し、結像カメラレンズ３１２によって、ＣＣＤ検出器３１３上に結像された。ノッチフィルター３１１にはＫＡＩＳＥＲ社ＳｕｐｅｒＮｏｔｃｈ−Ｐｌｕｓ　４８８　ｎｍ用を用いた。このノッチフィルターにより第一レーザー光３５１、第二レーザー光３５２の光を遮ることができる。またノッチフィルター３１１の代わりにレーザー波長をカットし、蛍光波長を透過させるロングパスフィルターを用いても良い。結像カメラレンズ３１２にはニコンＦ　１．４、ｆ＝５０　ｍｍのカメラレンズを用い、ＣＣＤ検出器３１３にはＡｎｄｏｒ社製ＣＣＤを用いた。ＣＣＤ検出器３１３で検出したシグナルは解析用コンピューター５００に送り解析を行った。
【００３１】
分取操作の手順を図１２に示す。試料注入側ユニット１００で、キャピラリー１の試料注入端１１１を試料容器１１０内のポリマー溶液１０４に浸し、シリンジ１０５によってポリマー溶液１０４を加圧し、キャピラリー１内にポリマー溶液１０４を充填した。充填の際にはＯリング１０８がキャピラリー１のポリマー充填用ふた１０９と密着させ、加圧状態にあるポリマー溶液１０４を確実にキャピラリー１内に充填させた。一回のポリマー充填量は５μｌとした。充填されたポリマー溶液１０４の余剰分はフローセル３内部のキャピラリー終端２により排出され、シース液流１６により回収管６を通じて流し出した。ポリマー溶液１０４の充填はキャピラリー終端２から行う場合、フローセル３内を通じてポリマー溶液１０４を充填することになるが、フローセル３にはキャピラリー１以外に回収管６、シース液送液チューブ９が接続されており、ポリマー溶液１０４を加圧し、充填することが困難である。本実施例のように試料注入側からポリマー充填を行うことでポリマー溶液１０４を加圧し、充填することが容易となった。ポリマー充填後、キャピラリー１の試料注入端１１１及び負電極１０７を純水１０３に浸して洗浄し、試料１０１に浸した。終端側ユニット２００のグランド電極２０３はグランドに落とし、負電極１０７に電圧−１ｋＶ印加することによりキャピラリー１両端に電圧を印加した。ＤＮＡは負に帯電しているので、ＤＮＡ試料は試料注入側から終端側に向かって泳動し、試料はキャピラリー１内に注入される。１５秒の電圧印加により試料１０１をキャピラリー１内に注入した。試料注入後キャピラリー１の試料注入端１１１、負電極１０７を純水１０３に浸した後、バッファー１０２に浸した。終端側ユニット２００のグランド電極２０３はグランドに落とし、負電極１０７に電圧を−１５　ｋＶ印加することによりキャピラリー１両端に電圧を印加して、電気泳動を行った。ＤＮＡ試料は電気泳動により塩基長違いで試料成分５に分離される。
【００３２】
第一検出点４０２、第二検出点４０３にそれぞれ第一レーザー光３５１、第二レーザー光３５２が照射され、試料成分５が通過する際にＤＮＡ断片に標識された蛍光分子が励起される。試料成分５からの発光蛍光はＣＣＤ検出器３１３で検出され、検出したシグナルは解析用コンピューター５００に送られる。それぞれ検出点ごとにシグナルの時間変化を記録した。目的ＤＮＡ断片が電気泳動され、第一検出点での時刻をｔ_１、第二検出点での時刻をｔ_２で検出された場合、二点間の平均電気泳動速度Ｖ_１は検出点間の距離Δｄを検出時間差（ｔ_２−ｔ_１）で割ったものであるから、Ｖ_１＝Δｄ／（ｔ_２−ｔ_１）である。第二検出点４０３からキャピラリー終端２までの距離をｘとすると、溶出時間Ｔ_ａはＴ_ａ＝ｘ／Ｖ_１により求められる。このＴ_ａは各塩基長のＤＮＡ断片ごとに求めることが出来る。
【００３３】
例えばｔ_２＝３１００（秒）、ｔ_１＝３０５０（秒）だった場合、Δｄ＝５ｍｍより泳動速度Ｖ１＝５／（３１００−３０５０）＝０．１ｍｍ／秒となり、ｘ＝２．５ｍｍよりＴ_ａ＝２．５／０．１＝２５（秒）となる。
【００３４】
ＤＮＡ断片はキャピラリー終端２から溶出した後、シース液流１６によりフローセル３内を流れ、回収管６を通って回収点８に到達する。ＤＮＡ断片がキャピラリー終端２から回収点８までに移動するのに要する時間をシース液流時間Ｔ_ｂとする。Ｔ_ｂはフローセル３中を流れる時間Ｔ_ｂ１と回収管６中を通過する時間Ｔ_ｂ２に分けることが出来る。フローセル３の内部断面積は１　ｍｍ×１　ｍｍ、シース液流１６の流量は１μｌ／　秒であるから、フローセル３中のシース液流１６の平均流速は１　ｍｍ／秒である。キャピラリー終端２から回収管入り口１５までの距離は２　ｍｍであるのでＴ_ｂ１＝２　（ｍｍ）／１（ｍｍ／　秒）＝２　（秒）である。
【００３５】
一方、回収管の内径は５００μｍ、流量が１μｌ／秒であるため、回収管６中のシース液流１６の平均流速は１／（０．２５×０．２５×３．１４）＝５．１　ｍｍ／　秒である。回収管６の長さは７０　ｍｍであるのでＴ_ｂ２はＴ_ｂ２＝７０／　５．１＝１３．７（秒）である。
よってＴ_ｂ＝Ｔ_ｂ１＋Ｔ_ｂ２＝２＋１３．７＝１５．７　（秒）である。
【００３６】
以上より第二検出点４０３から回収点８までの時間、すなわち到達時間はＴ_ａ＋Ｔ_ｂで表され、Ｔ_ａ＋Ｔ_ｂ＝２５＋１３．７＝３８．７秒となる。
【００３７】
なお、これらの解析は、解析部（解析用コンピュータ５００）にて行われる。
【００３８】
通常回収管６から流れ出るシース液４は受け皿２０４から廃液チューブ２０５を通じて外部の廃液容器１４に送られる。分取を行う際は解析用コンピューター５００から駆動命令を出し、目的ＤＮＡ断片の到達時間に合わせて受け皿２０４と切りかえ、分取容器７を回収点８に設置し、目的ＤＮＡ断片とともにシース液４を分取容器７の３８４プレートの内の一つのウェルに回収する。本実施例では受け皿２０４を分取容器７に切りかえてから、分取容器７を受け皿２０４に再び戻すまでの間の時間は５秒とした。すなわちあるＤＮＡ断片の到達時間が３８．７秒とすると、第二検出点４０３で検出してから３６．２秒後に受け皿２０４から分取容器７に切りかえ、４１．２秒後に再び受け皿２０４に戻す。
【００３９】
本実施例で回収した８種のＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅し、再びキャピラリー電気泳動を行うことによって分取精度の確認を行った。
【００４０】
本実施例の特長はレーザー光をフローセル３内部でキャピラリー１上をオンカラムに照射し、検出することにより、第二検出点４０３とキャピラリー終端２までの距離を２．５　ｍｍと短くでき、分取を行うためのタイミングの誤差を小さく出来ることである。また二点検出を行っていることからキャピラリー終端２付近での二点間の電気泳動速度を測定出来る。以上により正確に到達時間を予測することができ、一塩基精度の分取が可能となる。
【００４１】
本実施例においては、試料成分５の二点の検出点における検出時間差から電気泳動速度を求めたが、検出点における試料成分５の分子の動きをＣＣＤ検出器により直接イメージングし、分子の電気泳動速度を求めても良い。
【００４２】
また本実施例では試料にＤＮＡを用いたが、蛍光分子を標識した蛋白質やＲＮＡを用いても良い。また本実施例では電気泳動分離した試料成分５を蛍光検出を用いて計測したが、ＵＶ吸収検出により計測しても良い。例えば、レーザー光源３０１にＵＶレーザーを用い、試料に蛍光標識されていない生体物質を用いても良い。
（実施例２）
本実施例は検出点を一つとし、装置構成を簡易化することを目的とした。検出点をキャピラリー終端付近におくことにより、溶出時間の予測誤差を小さくすることが可能であり、到達時間を正確に予測することが出来る。
【００４３】
装置構成は、実施例１の場合と検出部ユニット３００の構成のみ異なり、それ以外は同等である。図１３に本実施例の検出部ユニット３００の構成を示す。レーザー光源３０１から発したレーザー光３０２をミラー３０３により方向を調整し、ピンホール３０４、シャッター３０７を通し、集光レンズ３０８を用いてフローセル３内部のキャピラリー１の検出点４０１に照射した。
【００４４】
フローセル３内の構成は図３と同等である。検出点４０１とキャピラリー終端２の間隔を０．１２　ｍｍとした。
【００４５】
分取の手順を図１４に示す。検出とタイミングの計算方法以外は実施例１と同等である。異なる部分を以下に説明する。試料成分５を検出した時間をＴ_ａｌｌとし、キャピラリー１の試料注入端１１１から検出点４０１までの距離をＬとすると、Ｌの距離の平均電気泳動速度Ｖ_ａｌｌは、Ｖ_ａｌｌ＝Ｌ／Ｔ_ａｌｌにより求めることが出来る。検出点４０１からキャピラリー終端２までの距離をｘとし、ｘの間の電気泳動速度がＶ_ａｌｌと同じであると仮定し、溶出時間Ｔ_ａをＴ_ａ＝ｘ／Ｖ_ａｌｌにより求める。ｘ＝０．１２（ｍｍ）、Ｌ＝３６０（ｍｍ）、Ｔ_ａｌｌ＝３０００（秒）のとき、Ｖ_ａｌｌはＶ_ａｌｌ＝３６０／３０００＝０．１２（ｍｍ／秒）となり、Ｔ_ａ＝０．１２／０．１２＝１．０（秒）である。またシース液流１６を移動する時間すなわちシース液流時間Ｔ_ｂは、実施例１と同様であるため１５．７（秒）である。これより到達時間はＴ_ａ＋Ｔ_ｂ＝１５．７＋１．０＝１６．７（秒）と予想される。これらの解析は、解析部（解析用コンピュータ５００）にて行われる。
【００４６】
解析用コンピュータ５００により到達時間にタイミングを合わせ受け皿２０４から分取容器７に切りかえ、目的の試料成分を回収する。
【００４７】
本方式の特徴はフローセル３内部でオンカラム検出することにより、検出点とキャピラリー終端までの距離を十分短く出来、溶出時間の予測誤差を小さく出来るため、高精度に分取を行うことが出来る。
（実施例３）
本実施例では異なる複数の蛍光分子で標識された生体試料をそれぞれ識別しながら検出出来るように発光蛍光をグレーティングにより波長分散して蛍光検出を行った。
【００４８】
装置構成は実施例１と同等であるが、以下に示す検出部ユニット３００の構成が異なる。
【００４９】
本実施例の検出部ユニット構成を図１５に示す。第一検出点４０２、第二検出点４０３からの蛍光を対物カメラレンズ３１０、ノッチフィルター３１１、透過型グレーティング３１４を通し、結像カメラレンズ３１２によりＣＣＤ検出器３１３上に結像させる。２つの検出点それぞれからの波長分散された発光蛍光シグナルを解析用コンピューター５００に送り、データを解析する。
【００５０】
図１６は、図１５の検出部ユニット３００を左側面方向から見た図である。図１６に示したように、透過型グレーティング３１４の配置により、第一検出点４０２、第二検出点４０３からの発光蛍光の波長分散方向３１５、及び波長分散角θを変化させることができる。ここで、波長分散角θは、レーザー光３５１、３５２の進行方向と波長分散方向のなす角度であり、本実施例では０°＜θ≦９０°である。
【００５１】
また、ＣＣＤ検出器３１３の画素配列方向を波長分散方向一致させることにより、各発光の波長分散された蛍光スペクトルを容易に取得することができる。本実施例では、レーザー光の波長である４８８　ｎｍの光は、ノッチフィルター３１１により遮断されるため、ＣＣＤ検出器３１３に入射しない。しかし、４８８　ｎｍのレーザー光によって、シース液４、及びポリマー溶液１０４に含まれる水のラマン散乱が５８４　ｎｍ付近に生じる。これらのラマン散乱光はＣＣＤ検出器３１３に入射し、蛍光スペクトル上に重なり、蛍光検出の際の背景光スペクトルとなる。波長分散角をθ＝０°とした場合、蛍光スペクトル上には、蛍光検出点４０２、または４０３におけるキャピラリー１内部のポリマー溶液１０４由来のラマン散乱光だけでなく、フローセル３内部のレーザー光３５１、または３５２上のシース液４由来のラマン散乱光が重なる。この場合の背景光スペクトルを図１７Ａに示した。このように背景光強度が非常に高くなるため、蛍光検出の障害になり、検出感度の低下、及びダイナミックレンジの縮小を招く。そこで、本実施例では、θ＝４５°とすることにより、フローセル３内部のレーザー光３５１、または３５２上のシース液４由来のラマン散乱光が蛍光スペクトル上に重ならないようにした。この場合の背景光スペクトルを図１７Ｂに示した。このように、蛍光検出点４０２、または４０３におけるキャピラリー１内部のポリマー溶液１０４由来のラマン散乱光だけが蛍光スペクトルに重なるため、背景光強度が図１７Ａと比較して１０分の１程度に低減することができた。その結果、高感度、かつ広いダイナミックレンジな蛍光検出が可能になった。
【００５２】
波長分散角をθ＝９０°（ほぼ９０°）、すなわち波長分散方向３１５をキャピラリー１の軸方向と一致させても同様の効果が得られる。ただし、この場合、蛍光検出点４０２及び４０３からの各発光の各蛍光スペクトルがＣＣＤ検出器３１３の同一画素上に重なってしまう可能性がある。この可能性を回避するためには、二点の検出点の相対距離を十分に離せば良い。
【００５３】
本実施例では、二点検出の場合を示したが、図１３に示した一点検出の場合にも同様の検出ユニットの構成により、同様の効果が得られる。
（実施例４）
本実施例ではキャピラリー電気泳動ならびに分取操作のスループットを上げることを目的とし、複数のキャピラリーをアレイ化し、全てのキャピラリーについて電気泳動ならびに分取操作を並列して行えるようにした。レーザー光をキャピラリーアレイに対して側面入射させ、全てのキャピラリーについて同時にレーザー照射、蛍光検出する方式（特開平９−２８８０８８参照）を用いた例を示す。
【００５４】
本実施例の全体の装置構成を図１８に示す。操作、手順は実施例１と同等であり、それぞれのキャピラリーごとに独立して行う。
【００５５】
構成要素は実施例１と同等である。キャピラリー１は４本ならべ、キャピラリーアレイとした。４本ともに均等に温度調節が出来るようキャピラリー１同士が重ならないよう配置した。キャピラリー１には外径２００μｍ、内径１００μｍ、長さは３６　ｃｍのポリイミド被覆石英管（ポリマイクロ社）を用いた。
【００５６】
試料注入側ユニット１００の詳細を図１９に示す。試料容器５０１に試料１０１をキャピラリーと同じ数だけ用意し、バッファー容器５０２にバッファー１０２を入れ、純水容器５０３に純水１０３を入れ、ポリマー容器５０４にポリマー溶液１０４をいれ、シリンジ１０５をセットした。これらの容器をＸ，Ｚ方向に駆動可能な基台１０６上に設置した。
【００５７】
次にフローセル３内の構造を図２０に示す。各キャピラリー１をレーザー光と垂直に図のように同一平面上にならべて配置した。第一レーザー光３５１、第二レーザー光３５２が各キャピラリー１の第一検出点４０２、第二検出点４０３において集光されるように、各キャピラリー１間にロッドレンズ１３を配置した。ロッドレンズ１３には石英製で屈折率はキャピラリー１と同じ１．４６のものを用いた。またシース液の屈折率は１．３３、ポリマー溶液１０４の屈折率は１．４１のものを用いた。これらの条件により４本全てのキャピラリー内に効率的にレーザー光が集光される（Ｋａｍｂａｒａ　ｅｔ　ａｌ．　，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　１９９９　２０　５３９−５４６）。またフローセル内の各キャピラリー１に対向する位置にそれぞれ回収管６を配置した。回収管６にはキャピラリー１と同じポリイミド被覆石英管を使用し、その長さは７０　ｍｍとした。各回収管６の間にもそれぞれロッドレンズ１３を配置した。終端側電極２０３はフローセル３内部のシース液４に浸しシース液４全体をグランドにした。検出部ユニットの他の構成は実施例３と同じとした。ただしθ＝９０°、すなわち波長分散方向３１５はレーザー光にほぼ垂直方向とした。このとき二つの検出点それぞれからのシグナルが波長分散した後にＣＣＤ検出器３１３上で重なりあわないよう二点の検出点の相対距離を十分に離した。また各回収管６は回収点８において、ａ＝８　ｍｍ間隔で直線上に配列され、回収管全長は同一になるように各回収管６を曲げた。
【００５８】
終端側にユニット構成を図２１に示す。各回収管６に対応させてそれぞれの分取容器７をａ＝８　ｍｍ間隔で配列した。４つのキャピラリーについてそれぞれ独立に分取操作できるように、４つの分取容器台２０２の上に各分取容器７をそれぞれ設置し、ＸＺ方向にそれぞれ別個に駆動できるようにした。分取の際は解析用ＰＣで解析したデータに合わせ、受け皿２０４が移動し、分取容器７により目的の試料成分５を回収する。キャピラリーごとに検出し、駆動命令を発するので、それぞれの試料の分取操作を並列に行うことが出来る。
【００５９】
以上複数のキャピラリーをアレイ化することにより、キャピラリーの本数分と同じだけスループットを向上することが出来た。
（実施例５）
本実施例ではキャピラリー電気泳動ならびに分取操作のスループットを上げることを目的とし、複数のキャピラリーをアレイ化し、全てのキャピラリーが電気泳動ならびに分取操作を並列して行えるようにした。レーザーをスキャンすることによって全てのキャピラリーのレーザー照射、蛍光検出を順番に行う方式（参照Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２　Ｖｏｌ．６４，Ｎｏ．１８）を用いた例を示す。
【００６０】
基本的な構成は実施例４に準ずる。手順は実施例２と同様である。検出部ユニット３００が実施例４と異なる。まずフローセル３内の構造を図２２に示す。４本のキャピラリー１を密着させて同一平面上にならべた。検出点は各キャピラリーについて一点とし、キャピラリー終端２より０．１２　ｍｍの位置に置いた。実施例２同様、検出点４０１をキャピラリー終端２に近づけ、溶出時間の予測誤差が小さくなるようにした。レーザー光は図２２の紙面とほぼ垂直方向から各キャピラリー照射され、蛍光検出はレーザー光３０２の照射と同じ側から行う。検出部ユニット３００の構造の概略図を図２３に示す。レーザー光源３０１から出たレーザー光３０２は、第一ダイクロイックミラー３２１を通過し、ミラー３０３で反射され、対物レンズ３２２により集光され、キャピラリー１の検出点に照射される。第一ダイクロイックミラー３２１はレーザー光４８８　ｎｍは通過し、５２０　ｎｍ以上の光は反射する。ミラー３０３と対物レンズ３２２は駆動ユニット３２０を構成し、各キャピラリー１が並んでいる配列方向と同方向に高速往復駆動することが出来る。これにより各キャピラリーをレーザー光３０２で次々とスキャン照射する。キャピラリー１の検出点４０１からの発光蛍光は同じ対物レンズ３２２で集光する。蛍光はミラー３０３で反射され、第一ダイクロイックミラー３２１で反射される。次に第二ダイクロイックミラーで２種類の蛍光波長に分割され、集光レンズ３０８を通り、ピンホール３０４を通過し、ＣＣＤ検出器３１３で受光される。この構成では蛍光波長の異なる２種類の生体物質を検出できる。検出したシグナルを解析用コンピューター５００に送り、データ解析を行う。他の装置構成は実施例４と同様であり、分取の手順は実施例２と同様である。
【００６１】
以上アレイ化することによりキャピラリーの本数分スループットを向上することが出来た。
【００６２】
【発明の効果】
本発明により高精度・高分離の分取が可能となる。これにより高精度に生体物質を分取することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来のオンカラム検出によるキャピラリー電気泳動分取システムの主要部構成を示す図。
【図２】従来のシースフロー検出によるキャピラリー電気泳動分取システムの主要部構成を示す図。
【図３】本発明のキャピラリー電気泳動分取システムの主要部構成を示す図。
【図４】キャピラリー電気泳動によるＤＮＡ長さ分離の蛍光計測結果を示す図。
【図５】二点検出方式を採用した本発明のキャピラリー電気泳動分取システムの主要部構成を示す図。
【図６】溶出時間予測誤差の大きさと検出点から終端までの距離の関係を示す図。
【図７】本発明の実施形態１における装置構成を示す図。
【図８】本発明の実施形態１における試料注入側ユニットの詳細を示す図。
【図９】本発明の実施形態１における終端側ユニットの詳細を示す図。
【図１０】本発明の実施形態１における検出部ユニットを正面から見た場合の概略を示す図。
【図１１】本発明の実施形態１における検出部ユニットを右側方から見た場合の概略を示す図。
【図１２】本発明の実施形態１における分取操作の手順を示す図。
【図１３】本発明の実施形態２における検出部ユニットの概略を示す図。
【図１４】本発明の実施形態２における分取操作の手順を示す図。
【図１５】本発明の実施形態３における検出部ユニットの概略を示す図。
【図１６】本発明の実施形態３における主要部構成を示す図。
【図１７】本発明の実施形態３におけるレーザー光の進行方向と波長分散方向のなす角度をかえた場合の背景光スペクトルの強度を示す図。
【図１８】本発明の実施形態４における装置構成を示す図。
【図１９】本発明の実施形態４における試料注入側ユニットの詳細を示す図。
【図２０】本発明の実施形態４における主要部構成を示す図。
【図２１】本発明の実施形態４における終端側ユニットの詳細を示す図。
【図２２】本発明の実施形態５における主要部構成を示す図。
【図２３】本発明の実施形態５における検出部ユニットの概略を示す図。
【符号の説明】
１…キャピラリー
２…キャピラリー終端
３…フローセル
４…シース液
５…試料成分
６…回収管
７…分取容器
８…回収点
９…シース液送液チューブ
１０…温調板
１１…シース液容器
１２…キャピラリーアレイ
１３…ロッドレンズ
１４…廃液容器
１５…回収管入り口
１６…シース液流
１００…試料注入側ユニット
２００…終端側ユニット
３００…検出部ユニット
１０１…試料
１０２…バッファー
１０３…純水
１０４…ポリマー溶液
１０５…シリンジ
１０６…基台
１０７…試料注入側電極
１０８…Ｏ−リング
１０９…ポリマー充填用ふた
１１０…試料容器
１１１…試料注入端
２０１…分取容器
２０２…分取容器台
２０３…終端側電極
２０４…受け皿
２０５…廃液チューブ
３０１…レーザー光源
３０２…レーザー光
３０３…ミラー
３０４…ピンホール
３０５…λ／２波長板
３０６…ウォラストンプリズム
３０７…シャッター
３０８…集光レンズ
３０９…レーザーストッパー
３１０…対物カメラレンズ
３１１…ノッチフィルター
３１２…結像カメラレンズ
３１３…ＣＣＤ検出器
３１４…透過型グレーティング
３１５…波長分散方向
３２０…駆動ユニット
３２１…第一ダイクロイックミラー
３２２…対物レンズ
３２３…第二ダイクロイックミラー
３５１…第一レーザー光
３５２…第二レーザー光
４０１…検出点
４０２…第一検出点
４０３…第二検出点
５００…解析用コンピューター
５０１…試料容器
５０２…バッファー容器
５０３…純水容器
５０４…ポリマー容器。

Claims (18)

1. 生体物質を泳動分離するためのキャピラリーと、
   前記キャピラリーの終端から吐出する、前記生体物質の分離成分を、容器に流すための、前記キャピラリーの終端の周囲に設けられたフローセルと、
   前記キャピラリー及び前記フローセルに、光を照射する照射器と、
   前記キャピラリーからの光を検出する検出器とを有することを特徴とするキャピラリー泳動分取システム。
2. 前記生体物質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載のキャピラリー電気泳動システム。
3. 前記キャピラリーと前記光の交点と、前記終端の距離は、２．６ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１記載のキャピラリー泳動分取システム。
4. 前記キャピラリー泳動分取システムは、更に解析部を有し、前記光は、１の検出点で、前記キャピラリー及び前記フローセルに照射され、前記解析部は、分離する生体物質の平均泳動速度を求める手段と、前記平均泳動速度から前記検出点から前記終端までの溶出時間Ｔａと、前記フローセル内に流れるシース液流の流速から前記終端から前記生体物質の回収点に要する時間Ｔｂとを求める手段と、前記ＴａとＴｂの和から前記検出点から前記回収点までの到達時間を予測する手段とを有し、
   前記解析部で前記予測した到達時間をもとに、前記容器を駆動させる駆動手段と、を有することを特徴とする請求項１記載のキャピラリー泳動分取システム。
5. 前記光は、２の検出点で、前記キャピラリー及び前記フローセルに照射されるように構成されたことを特徴とする請求項１記載のキャピラリー泳動分取システム。
6. 前記２の検出点のうち、前記終端に近い側の検出点と、前記終端との距離は、２．６ｍｍ以下であることを特徴とする請求項５記載のキャピラリー泳動分取システム。
7. 前記キャピラリー泳動分取システムは、更に解析部を有し、
   前記解析部は、前記２の検出点から分離する生体物質の平均泳動速度を求める手段と、前記平均泳動速度から前記２の検出点のうち前記終端に近い側の検出点から前記終端までの溶出時間Ｔａと、前記フローセル内に流れるシース液流の流速から前記終端から前記生体物質の回収点に要する時間Ｔｂとを求める手段と、前記ＴａとＴｂの和から前記終端に近い側の検出点から前記回収点までの到達時間を予測する手段とを有し、
   前記解析部で前記予測した到達時間をもとに、前記容器を駆動させる駆動手段と、を有することを特徴とする請求項５記載のキャピラリー泳動分取システム。
8. 前記生体物質には、蛍光が付されており、
   前記検出器にて、前記蛍光によって励起された光を検出することを特徴とする請求項１記載のキャピラリー泳動分取システム。
9. 前記照射器は紫外光を照射するものであり、
   前記検出器は、前記分離成分の前記紫外光の吸収を検出するものであることを特徴とする請求項１記載のキャピラリー泳動分取システム。
10. 前記キャピラリーは複数備えられ、前記照射、前記検出、及び前記分離成分の回収を、前記複数のキャピラリー毎に行うことを特徴とする請求項１に記載のキャピラリー電気泳動システム。
11. 前記キャピラリーは複数備えられ、前記フローセル内部で同一平面上に配列されており、前記光を前記平面の側面方向より導入し、前記複数のキャピラリーを一括して照射するように構成されたことを特徴とする請求項１に記載のキャピラリー電気泳動システム。
12. 前記キャピラリーは複数備えられ、前記キャピラリーは、前記フローセル内部で、集光手段と交互に同一平面上に配列され、前記光を前記平面の側面方向より導入して前記複数のキャピラリーを一括して照射するように構成されたことを特徴とする請求項１に記載のキャピラリー電気泳動システム。
13. 前記集光手段がガラス製のロッドレンズであることを特徴とする請求項１２に記載のキャピラリー電気泳動システム。
14. 前記キャピラリーは複数備えられ、前記キャピラリーは前記フローセル内部で同一平面上に配列され、前記光及び前記検出器を前記配列方向に走査する手段を有することを特徴とする請求項１に記載のキャピラリー電気泳動システム。
15. 前記光は前記キャピラリーに対してほぼ垂直方向から照射され、
    前記光の検出は、前記キャピラリーに対してほぼ垂直方向から行われ、
    更に、前記光の波長分散手段を備え、前記検出器が波長分散された前記光を検出し、前記キャピラリーに照射される前記光が進行する方向と前記波長分散の方向のなす角度θが０°＜θ≦９０°であることを特徴とする請求項１に記載のキャピラリー電気泳動システム。
16. 前記レーザー光は前記キャピラリーに対してほぼ垂直方向から照射され、
    前記光の検出は、前記キャピラリーに対してほぼ垂直方向から行われ、
    更に、前記光の波長分散手段を備え、前記検出器が波長分散された前記発光を検出し、前記複数のキャピラリーに照射される前記光が進行する方向と前記波長分散の方向のなす角度θがほぼ９０°であることを特徴とする請求項１に記載のキャピラリー電気泳動システム。
17. キャピラリーで、生体物質を泳動分離し、
    前記キャピラリーの終端から吐出した、前記泳動分離された生体物質を、前記キャピラリーの終端の周囲に設けられたフローセルにシース液を流すことによって、前記フローセルから流出させ、
    前記キャピラリー及び前記フローセルに光を照射し、前記キャピラリーからの光を検出し、前記検出結果をもとに、前記フローセルから流出した前記生体物質を、各容器に分取することを特徴とする分取方法。
18. 前記キャピラリーの始端より電解質溶液は、導入され、その後前記キャピラリーで前記生体物質を泳動分離することを特徴とする請求項１７に記載の分取方法。

Images