JP2002527527A - 最小プロモーターおよびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 最小プロモーター配列を、記載する。これらの最小プロモーター配列を含む核酸分子を含む試薬もまた、記載する。これらの試薬を構築するための方法、およびこれらの試薬を使用するための方法もまた、記載する。本発明は、核酸構築物の使用を提供し、この核酸構築物は、哺乳動物細胞において目的のポリペプチドの発現を得る際に使用するための医薬の製造における、このポリペプチドをコードするコード配列に作動可能に連結された最小プロモーター配列を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、分子生物学および免疫学の一般的分野に関し、そして一般的には、
核酸免疫技術に有用な試薬に関する。より詳細には、本発明は、短縮化形態の転
写プロモーターエレメント、このようなプロモーターエレメントを含む核酸分子
、および核酸免疫化および遺伝子治療のための、このような核酸分子を含む試薬
の使用に関する。

【０００２】 （背景） 発現産物に対する免疫化の目的のための、ＤＮＡおよびｍＲＮＡの哺乳動物組
織への注入のための技術は、当該分野で記載されている。例えば、欧州特許出願
ＥＰ ０ ５００ ７９９および米国特許第５，５８９，４６６号を参照のこと
。本明細書中で「核酸免疫化」と呼ばれる技術は、体液性免疫応答および細胞媒
介免疫応答の両方を誘発することが示されている。例えば、包膜糖タンパク質ｇ
ｐ１６０をコードするＤＮＡ構築物で免疫化されたマウス由来の血清は、イムノ
アッセイにおいて、組換えｇｐ１６０と反応することが示され、その注射された
マウス由来のリンパ球は、組換えｇｐ１２０に応答して増殖することが示された
。Ｗａｎｇら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９０：４１５６−４１６０。同様に、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子で免疫
化されたマウスは、抗体ベースの免疫応答を示した。Ｔａｎｇら、（１９９２）
Ｎａｔｕｒｅ ３５６：１５２−１５４。哺乳動物プロモーターによって駆動さ
れるインフルエンザ核タンパク質をコードするＤＮＡの筋内注射は、ＣＤ８＋Ｃ
ＴＬ応答を誘発することが示されており、これは、その後のウイルスでの致死性
チャレンジに対してマウスを保護し得る。Ｕｌｍｅｒら（１９９３）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２５９：１７４５−１７４９。注入部位の免疫組織化学的研究は、そのＤ
ＮＡが、骨髄芽球によって取り込まれ、そしてウイルスタンパク質の細胞質での
産生が、少なくとも６ヶ月間実証され得たことを示した。

【０００３】 宿主細胞に送達された目的の遺伝子または配列について可能な限り高いレベル
の産生を提供する発現系を同定および設計することが、遺伝子治療および核酸免
疫化の分野の当業者の主な目標であった。高レベルの産生は、遺伝子治療（十分
なレベルの治療遺伝子産物を提供するために）または核酸免疫化（コードされる
抗原産物に対する十分な免疫応答を提供するために）において使用される任意の
発現系について必須条件であると考えられている。いくつかの因子が、このよう
なトランスフェクトされた宿主細胞から達成され得る産物のレベル（トランスフ
ェクション効率（例えば、細胞におけるコピー数）および目的の遺伝子または配
列が転写され、そしてｍＲＮＡが翻訳される効率を含む）に影響を与えることが
公知である。

【０００４】 従って、多くの発現系が当該分野において記載され、これらの各々は、代表的
には、発現制御配列に作動可能に連結された目的の遺伝子またはヌクレオチド配
列を含むベクターからなり、この発現制御配列は、この遺伝子またはヌクレオチ
ド配列の発現を制御する。これらの制御配列は、転写プロモーター配列ならびに
転写開始配列および転写終結配列を含む。転写プロモーター配列は、一般的に、
ＲＮＡ転写物の開始部位のすぐ上流に位置され、そして、それぞれ、その開始部
位の上流約３０ヌクレオチドおよび８０ヌクレオチド（例えば、約−３０位およ
び−８０位）に位置される、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＡＴ」ボックス
を含む。Ｃｏｒｄｅｎら、（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４０６−１
４１４；Ｃｈａｍｂｏｎ，Ｐ．（１９８１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
５０：３４９−３８３。哺乳動物細胞発現系に一般に使用されるプロモーターと
しては、とりわけ、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば、
ＣＭＶ最初期プロモーター（Ｃｈａｐｍａｎら、（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１９：３９７９−３９８６））、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプ
ロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、および単
純ヘルペスウイルスプロモーターが挙げられる。非ウイルスプロモーター（例え
ば、マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター）もまた、このような発
現系に一般的に使用される。これらのプロモーター系は、通常、所定の配列につ
いて可能な最も高いレベルの発現を提供するように選択される。

【０００５】 種々の遺伝子の上流１１０ヌクレオチド（−１１０）を超えるところに見出さ
れる多くの転写調節エレメントもまた、当該分野において一般的に使用されてい
る。これらの上流配列は、サル、マウスおよびヒトのＤＮＡウイルスにおける初
期遺伝子の発現に必須であると考えられ、そして通常「エンハンサー」と呼ばれ
る。エンハンサーは、シス作用性因子として広く定義され、これは、プロモータ
ー／遺伝子配列に作動可能に連結された場合、その遺伝子配列の転写を劇的に増
加させる。エンハンサーは、他の発現制御エレメント（例えば、プロモーター）
よりも、目的の配列からさらにより離れた位置から機能し得、そして目的の配列
に対していずれかの方向で位置する場合に作動し得る。Ｂａｎｅｒｊｉら（１９
８１）Ｃｅｌｌ ２７：２９９−３０８，ｄｅＶｉｌｌｅｉｒｓら（１９８１）
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９：６２５１−６２６４。エ
ンハンサーは、多くのウイルス供給源から同定されており、これらの供給源とし
ては、ポリオーマウイルス、ＢＫウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、
アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、モロニー肉腫ウイルス、
ウシパピローマウイルス、およびラウス肉腫ウイルス（ｄｅＶｉｌｌｅｉｒｓら
、前出、Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：７４９
−７５５、Ｈｅａｒｉｎｇら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：６９５−７０３、Ｗ
ｅｅｋｓら、（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１２２２−１２３
４、Ｌｅｖｉｎｓｏｎら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９５：５６８−５７２お
よびＬｕｃｉｗら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：７０５−７１６）が挙げられる
。これらのエンハンサーエレメントは、しばしば、同種および異種プロモーター
配列に結合されて、発現系における使用のためのエンハンサー／プロモーター対
を提供する。しかし、遺伝子治療および核酸免疫化において使用される、最も頻
繁に使用されるエンハンサー／プロモーター対は、おそらく、ｈＣＭＶ最初期エ
ンハンサー／プロモーター対である。例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉに対する米国特許
第５，１６８，０６２号および同第５，３８５，８３９号、ならびに欧州特許出
願０ ３２３ ９９７ Ｂ１を参照のこと。ｈＣＭＶエンハンサーエレメントは
また、例えば、ｈＣＭＶプロモーターエレメントなしで使用されて、異種プロモ
ーター配列を調節している。例えば、欧州特許出願０１７３１７７Ｂ１を参照の
こと。ｈＣＭＶ最初期エンハンサー／プロモーター対は、目的の種々の異なる配
列から強力な発現を提供し、そしてこの高いレベルの発現は、一般に、任意の所
定の発現系についての「ゴールドスタンダード（ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）
」を確立するものとして考えられる。

【０００６】 （発明の要旨） 本発明の主な目的は、哺乳動物細胞（特に、インビボにおける）においてより
良好な発現特性を提供するプロモーター系を提供することである。驚くべきこと
に、発現系において、通常、その同種のエンハンサー配列と対形成されるプロモ
ーター配列の使用は、そのプロモーターが、発現系において短縮化された、エン
ハンサーレス（ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｌｅｓｓ）（エンハンサーのない）形態で使
用される場合に、コードされる抗原に対して非常に増強された免疫応答を提供す
ることが、現在見出されている。この「エンハンサーレス」プロモーター配列は
、本明細書中で、「最小プロモーター」と呼ばれる。このプロモーター系を組み
込む核酸ワクチン組成物に対する改善された免疫応答が、達成され得る。より有
効な遺伝子治療もまた達成され得る。

【０００７】 従って、本発明は、哺乳動物細胞において目的のポリペプチドの発現を得る際
に使用するための医薬の製造において、その目的のポリペプチドをコードするコ
ード配列に作動可能に連結された最小プロモーター配列を含む核酸構築物の使用
を提供する。本発明はまた、以下を提供する： 哺乳動物細胞において目的のポリペプチドの発現を得る方法であって、この方
法は、この細胞に、このポリペプチドのコード配列に作動可能に連結された最小
プロモーター配列を含む核酸構築物を移入する工程を包含する、方法： 粒子媒介核酸免疫化における使用に適切な被覆粒子であって、この粒子は、抗
原をコードするコード配列に作動可能に連結された、最小プロモーター配列を含
む核酸構築物で被覆された、キャリア粒子を含む、被覆粒子； 粒子媒介核酸免疫化に適切な粒子加速デバイスであって、このデバイスは、本
発明の被覆粒子で充填されている、粒子加速デバイス； 単離精製された、最小プロモーター配列；および コード配列に作動可能に連結された最小プロモーター配列を含む、核酸構築物
。

【０００８】 核酸構築物は、ベクター構築物（例えば、プラスミドベクターまたは組換えウ
イルスベクター）で存在し得る。目的の抗原に対して免疫応答を誘発し得る核酸
免疫化試薬は、このように提供され、この試薬は、最小プロモーター配列の転写
制御下で目的の核酸配列を含む、核酸構築物を含む。発現系は、核酸免疫化にお
ける使用のために構築され、目的の抗原に対する非常に増強された免疫応答を提
供し得る。

【０００９】 本発明のこれらおよび他の目的、局面、実施形態ならびに利点は、本明細書中
の開示から当業者に容易に想到される。

【００１０】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の例示された分子またはプロセ
スパラメーターに限定されず、これらは、もちろん、変化し得ることが理解され
るべきである。本明細書中で使用される技術は、本発明の特定の実施形態を記載
する目的だけのものであり、限定することを意図されないことも理解されるべき
である。さらに、本発明の実施は、他に示されない限り、ウイルス学、微生物学
、分子生物学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の従来の方法を使用し、これらは
、全て当業者の範囲内である。このような技術は、文献に十分に説明される。例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｇ
ｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．
Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；およびＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓおよ
びＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）を参照のこと。

【００１１】 本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願（上記または下記
に関わらず）は、その全体が参考として本明細書によって援用される。

【００１２】 本明細書および添付の特許請求の範囲に使用されるような、単数形態「ａ」、
「ａｎ」および「ｔｈｅ」が、その内容が明らかに他を示さない限り、複数の対
象物を含むことに留意されなければならない。

【００１３】 （Ａ．定義） 他に示されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語
は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を
有する。本明細書中に記載される方法および材料に類似または等価な、多くの方
法および材料が、本発明の実施において使用され得るが、好ましい材料および方
法が、本明細書中に記載される。

【００１４】 本発明を記載することにおいて、以下の用語は、以下に示されるように使用さ
れ、そして以下に示されるように定義されることが意図される。

【００１５】 用語「核酸免疫化」は、抗原（単数または複数）のインビボ発現のために、１
以上の選択された抗原をコードする核酸分子の宿主細胞への導入をいうために、
本明細書中で使用される。核酸分子は、例えば、注射；経皮粒子送達；吸入；局
所的、あるいは経口、鼻内または粘膜投与形態によって、レシピエント被験体に
直接的に導入され得る。あるいは、この分子は、被験体から取り出された細胞に
エキソビボで導入され得る。この後者の場合、細胞は、被験体に再導入され、こ
こで、免疫応答が、核酸分子によってコードされる抗原に対してマウントされ得
る。

【００１６】 「抗原」とは、個体において免疫学的応答を誘発し得る任意の薬剤（一般的に
、高分子）をいう。この用語は、個々の高分子あるいは抗原性高分子の同種集団
または異種集団をいうために使用され得る。本明細書中で使用される場合、「抗
原」は、一般的には、１以上のエピトープを含むタンパク質分子またはその部分
をいうために使用される。本発明の目的のために、抗原は、任意の公知のウイル
ス病原体、細菌病原体、寄生生物病原体または真菌病原体から得られ得るか、ま
たは誘導され得る。この用語はまた、任意の種々の腫瘍特異的抗原および自己免
疫疾患に関連する抗原を意図する。さらに、本発明の目的のために、「抗原」は
、そのタンパク質が、十分な免疫原性を維持する限り、ネイティブ配列に対する
改変（例えば、欠失、付加および置換（一般的には、天然で保存的））を有する
タンパク質を含む。これらの改変は、意図的（例えば、部位特異的変異誘発によ
って）になされ得るか、または偶発性（例えば、抗原を産生する宿主の変異によ
って）であり得る。

【００１７】 本発明の様々な局面において、この抗原は、１つ以上のＴ細胞エピトープを含
む。「Ｔ細胞エピトープ」とは、一般に、Ｔ細胞応答を誘導し得るペプチド構造
の特徴をいう。この点に関して、当該分野では、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣ分
子のペプチド結合裂内の伸長された立体配置をとる線状ペプチド決定因子を含む
ことが受容されている（Ｕｎａｎｕｅら、（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６
：５５１−５５７）。本明細書中で使用される場合、Ｔ細胞エピトープは、一般
に、少なくとも約３〜５アミノ酸残基、好ましくは少なくとも５〜１０以上のア
ミノ酸残基を有するペプチドである。細胞に媒介される免疫学的応答を刺激する
特定の抗原の能力は、以下のような多数の周知のアッセイによって決定され得る
：リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイ、
または感作された被験体における抗原に特異的なＴリンパ球についてのアッセイ
。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：４
１８９−４１９９；およびＤｏｅら、（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．２４：２３６９−２３７６を参照のこと。

【００１８】 本発明の別の局面において、この抗原は、１つ以上のＢ細胞エピトープを含む
。「Ｂ細胞エピトープ」とは、一般に、特定の抗体分子が結合する抗原上の部位
をいう。抗体応答を惹起し得るエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使
用して容易に達成される。例えば、以下を参照のこと：Ｇｅｙｓｅｎら、（１９
８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４０
０２（所定の抗原における免疫原性エピトープの局在を決定するために迅速にペ
プチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエ
ピトープを同定しそして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら
、（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３：７０９−７
１５（所定の抗体について高親和性を有するペプチドを同定するための技術）。

【００１９】 目的の抗原に対する「免疫応答」は、抗原に対する個々の体液性および／また
は細胞性の免疫応答における発達である。本発明の目的のために、「体液性免疫
応答」とは、抗体分子によって媒介される免疫応答をいい、一方、「細胞性免疫
応答」とは、Ｔリンパ球および／または他の白血球によって媒介されるものをい
う。

【００２０】 「コード配列」、またはポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配
列の制御下に配置される場合、インビボでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）
および翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。このコード配列の境界は
、５’（アミノ）末端での開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端での翻訳終
止コドンによって決定される。本発明の目的のために、コード配列は、以下を含
み得るがこれらに限定されない：ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物もしくは真
核生物のｍＲＮＡ、ウイルス由来のゲノムＤＮＡは配列もしくは原核生物ＤＮＡ
、およびさらに合成ＤＮＡ配列。転写終結配列は、このコード配列の３’側に位
置し得る。

【００２１】 「核酸」分子としては、以下が挙げられ得るがこれらに限定されない：原核生
物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例え
ば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、およびさらに合成ＤＮＡ配列。
この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の既知の塩基アナログを含む配列を
捕獲する。

【００２２】 「作動可能に連結された（る）」とは、そのように記載される成分がそれらの
通常の機能を行うように配置されるエレメントの配置をいう。従って、コード配
列に作動可能に連結される所定のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合、
このコード配列の発現をもたらし得る。このプロモーターはその発現を指向する
ように機能する限りは、コード配列に連続する必要はない。従って、例えば、介
在性の翻訳されていなくて転写された配列が、プロモーター配列とコード配列と
の間に存在し得、そしてこのプロモーター配列は、このコード配列に「作動可能
に連結される」となおみなされ得る。

【００２３】 「組換え」とは、核酸分子を記載するために本明細書中で使用される場合、ゲ
ノム、ｃＤＮＡ、半合成または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、これらは
、その起源または操作によって、（１）天然に会合するポリヌクレオチドの全て
または一部と会合しないもの、および／あるいは（２）天然に連結されるものと
は異なるポリヌクレオチドに連結されるものである。

【００２４】 ２つの核酸配列は、これらの分子の規定された長さにわたって、少なくとも約
７０％、好ましくは少なくとも約８０〜９０％、および最も好ましくは少なくと
も約９５％のヌクレオチドが一致する場合、「実質的に相同」である。本明細書
中で使用される場合、実質的に相同とはまた、特定の核酸に対する同一性を示す
配列をいう。実質的に相同である核酸配列は、例えば、特定の計について規定さ
れるように、ストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験
において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、
当該技術範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；ＤＮＡ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉ
ｄｉｚａｔｉｏｎ、前出を参照のこと。このような配列はまた、ＰＣＲ産物の直
接配列決定によって確認され得、そしてさらに特徴付けられ得る。

【００２５】 用語「個体」および「被験体」は、以下をいうために本明細書中で交換可能に
使用される：亜門脊椎動物門（ｃｏｒｄａｔａ）の任意のメンバー（限定しない
が、ヒトおよび他の霊長類（チンパンジーおよび他のサル（ａｐｅおよびｍｏｎ
ｋｅｙ）種のような非ヒト霊長類を含む）を含む）；農場動物（ｆａｒｍ ａｎ
ｉｍａｌ）（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）；家畜（例えば、
イヌおよびネコ）；実験動物（マウス、ラットおよびモルモットのような齧歯類
を含む）；トリ（飼いならされたトリ、野生の鳥、および競技用のトリ（例えば
、ニワトリ、七面鳥および他の家禽類のトリ、アヒル、ガチョウなど）を含む）
。この用語は、特定の齢を意味しない。従って、成体および新生仔の個体の両方
が包含されることが意図される。本明細書中に記載される方法は、上記の脊椎動
物種のいずれかにおいて使用することが意図される。なぜなら、全てのこれらの
脊椎動物の免疫系は同様に操作されるからである。

【００２６】 （Ｂ．一般方法） 最小プロモーターが、本明細書中に使用される。この最小プロモーター配列は
、一般に、ＤＮＡウイルスに由来する。代表的には、このプロモーターは、初期
ウイルス遺伝子と関連し、そしてエンハンサーエレメントの上流または下流によ
って通常調節される、プロモーターである。このプロモーター配列は、そのエン
ハンサーレス形態で使用される（すなわち、本発明の状況で使用される場合その
ネイティブのエンハンサー配列と結合されないが、他の異種エンハンサー配列を
含む構築物において使用され得る）。従って、本発明の最小プロモーターは、代
表的には、約１３０塩基以下のヌクレオチド配列から構成され、この配列は、そ
のネイティブのウイルス初期遺伝子のＲＮＡ合成の開始に対して、−１〜約−１
３０位に及ぶ配列に対応する。

【００２７】 好ましい実施形態において、この最小プロモーターは、ヘルペスファミリーの
ウイルスのメンバーから得られるか、またはそれに由来する。特定の実施形態に
おいて、この最小プロモーターは、本質的に以下からなる：サル、マウスまたは
ヒトのＣＭＶウイルス由来のエンハンサーレスプロモーター配列（例えば、ｓＣ
ＭＶまたはｈＣＭＶ最初期プロモーター）、ＲＳＶウイルス由来のエンハンサー
レスプロモーター配列、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）由来のエンハンサーレス
プロモーター配列（例えば、ＰＲＶ初期プロモーター領域）、またはそれらの機
能的改変体。この最小プロモーター配列は、それゆえ、本質的に以下からなり得
る：ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）最初期プロモーター配列、仮性狂犬
病ウイルス（ＰＲＶ）初期プロモーター領域、サルサイトメガロウイルス（ｓＣ
ＭＶ）最初期プロモーター配列、またはそれらの機能的改変体。

【００２８】 機能的改変体配列は、１以上の塩基の置換、欠失または挿入によって、ネイテ
ィブのプロモーター配列から変化し得る。１〜３０（例えば、５〜２０）の塩基
置換および／または１〜３０（例えば、５〜２０）の塩基欠失および／または１
〜３０（例えば、５〜２０）の塩基挿入が存在し得る。ネイティブのプロモータ
ー配列の機能的フラグメントが使用され得る。

【００２９】 改変体配列は、部位特異的変異誘発のような慣用的な方法論によって容易に構
築され得る。プロモーターとして作用しかつ機能を保持する改変体配列の能力は
、実験によって決定され得る。改変体配列は、適切な発現系において、そして決
定される発現の存在下または非存在下で、レポーター遺伝子に結合され得る。本
発明は、特に、ヒトに対して適用可能であるので、改変体配列がヒト細胞株にお
けるインビトロでの発現を駆動する能力が試験され得る。

【００３０】 この最小プロモーター配列は、目的の異種ヌクレオチド配列、代表的には、遺
伝子治療の状況で使用される場合は全長遺伝子、または核酸免疫化の状況で使用
される場合は、抗原に対するコード配列と結合される。遺伝子治療の場合、目的
のヌクレオチド配列は、その発現が処置下の被験体に対して利益を付与するタン
パク質をコードする。遺伝子欠損は、このように補償され得る。このコード配列
は、治療用タンパク質をコードし得る。

【００３１】 このタンパク質は、凝固タンパク質（例えば、キノゲン（ｋｉｎｏｇｅｎ）、
プロトロンビン、フィブリノーゲン第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、または第Ｉ
Ｘ因子）のような血液タンパク質であり得る。このタンパク質は、代謝酵素また
は同化酵素のような酵素であり得る。この酵素は、胃腸管酵素、代謝（例えば、
解糖系またはＫｒｅｂｓサイクル）酵素または細胞シグナル伝達酵素であり得る
。この酵素は、脂質、脂肪酸、グリコーゲン、アミノ酸、タンパク質、ヌクレオ
チド、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）または炭水化物（例
えば、糖）を作製、破壊または修飾し得、従って代表的には、プロテアーゼ、リ
パーゼまたはカルボヒドラーゼであり得る。この酵素は、タンパク質修飾酵素（
例えば、タンパク質からの化学部分を付加するかまたは得る酵素（例えば、キナ
ーゼまたはホスファターゼ））であり得る。

【００３２】 このタンパク質は、輸送タンパク質または結合タンパク質（例えば、ビタミン
、金属イオン、アミノ酸または脂質（例えば、コレステロールエステル移入タン
パク質、ホスホリピド移入タンパク質もしくはＨＤＬ結合タンパク質）を結合お
よび／または輸送する）であり得る。このタンパク質は、結合組織タンパク質（
例えば、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅ）、エラスチンもしくはフィブロネクチン
）、または筋肉タンパク質（例えば、アクチン、ミオシン、ジストロフィンもし
くはフィブロネクチン）であり得る。このタンパク質は、神経、肝臓、心臓また
は脂肪細胞のタンパク質であり得る。このタンパク質は細胞傷害性であり得る。
このタンパク質は、シトクロムであり得る。

【００３３】 このタンパク質は、細胞の複製、増殖または分化を引き起こすことが可能であ
り得る。このタンパク質は、発生遺伝子であり得る（例えば、この遺伝子は、誕
生の前にのみ発現される）。このタンパク質は、転写遺伝子もしくは翻訳遺伝子
を補助し得るか、または転写もしくは翻訳を調節し得る（例えば、転写因子また
は転写因子もしくはポリメラーゼを結合するタンパク質）。このタンパク質は、
細胞内もしくは細胞外シグナル伝達分子（例えば、ホルモン）のようなシグナル
伝達分子であり得る。

【００３４】 このタンパク質は、以下のような免疫系の遺伝子であり得る：抗体、Ｔ細胞レ
セプター、ＭＨＣ分子、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３
、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１
０、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＧＦ−β）、インターフェロン（ＩＦＮ−α、
ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、ケモカイン（ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−ｌβ、ＲＡＮ
ＴＥＳ）、免疫レセプター（例えば、上記のサイトカイン、インターフェロンま
たはケモカインのいずれかについてのレセプターのような、サイトカイン、イン
ターフェロンまたはケモカインについてのレセプター）、細胞表面マーカー（例
えば、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞の表面マーカ
ー）（例えば、ＣＤ １、２、３、４、５、６、７、８、１６、１８、１９、２
８、４０、もしくは４５；またはその天然のリガンド）あるいは相補遺伝子。

【００３５】 このタンパク質は、栄養因子（例えば、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ
、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＮＴ３、Ｔ５、ＨＡＲＰ）またはア
ポリポタンパク質であり得る。このタンパク質は、腫瘍サプレッサー遺伝子（例
えば、ｐ５３、Ｒｂ、ＲａｐｌＡ、ＤＣＣもしくはｋ−ｒｅｖ）または自殺遺伝
子（チミジンキナーゼもしくはシトシンデアミナーゼ）であり得る。

【００３６】 核酸免疫化に関して使用される場合、最小プロモーターは、目的の抗原をコー
ドするコード配列に作動可能に連結される。目的の抗原は、好ましくは、病原体
（例えば、ウイルス、細菌もしくは寄生虫病原体）に関連するか、またはこの抗
原は、腫瘍特異的抗原であり得る。この抗原は、全長タンパク質であり得る。あ
るいは、この抗原は、本質的に、ちょうど、抗原のＢ細胞エピトープまたはＴ細
胞エピトープからなり得る。

【００３７】 腫瘍特異的抗原としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＭＡＧ
Ｅ １、ＭＡＧＥ ２、ＭＡＧＥ ３（ＨＬＡ−Ａ１ペプチド）、ＭＡＧＥ ４
などを含む様々なＭＡＧＥ（黒色腫関連抗原Ｅ）のいずれか；様々なチロシナー
ゼ（ＨＬＡ−Ａ２ペプチド）のいずれか；変異体ｒａｓ；変異体ｐ５３；ならび
にｐ９７黒色腫抗原。他の腫瘍特異的抗原としては、以下が挙げられる：進行し
た癌に関連するＲａｓペプチドおよびｐ５３ペプチド、頸部癌と関連するＨＰＶ
１６／１８およびＥ６／Ｅ７抗原、乳癌腫と関連するＭＵＣ１−ＫＬＨ抗原、
結腸直腸癌と関連するＣＥＡ（癌胎児抗原）、黒色腫に関連するｇｐ１００また
はＭＡＲＴ１抗原、ならびに前立腺癌に関連するＰＳＡ抗原。ｐ５３遺伝子配列
は公知であり（例えば、Ｈａｒｒｉｓら、（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．６：４６５０−４６５６を参照のこと）、そして登録番号Ｍ１４６９４の
元にＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。

【００３８】 適切なウイルス抗原としては、以下の肝炎ファミリーのウイルス由来の抗原を
コードするポリヌクレオチド配列が挙げられるがこれらに限定されない：Ａ型肝
炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣ
Ｖ）、δ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎
ウイルス（ＨＧＶ）。例示の目的で、ＨＢＶのウイルスゲノム配列は、それに由
来する抗原コード配列を得るための方法として公知である。例えば、以下を参照
のこと：Ｇａｎｅｍら、（１９８７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６
：６５１−６９３；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｆ．Ｂ．（１９９０）Ｈｅｐａｔｉｔ
ｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ，第ＩＩ巻、２１７１−２２３５頁、Ｆｉｅｌｄｓら（編
），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，
ＮＹ；ならびにＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（１９８０）Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒａｌ
Ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｍａｊｏｒ Ｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅｓ，５７−７０頁、Ｆｉｅｌｄｓら（編
），Ａｎｉｍａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。ＨＢＶゲノムは、いくつかのウイルスタンパ
ク質をコードし、このタンパク質としては、以下が挙げられる：大きな表面抗原
ポリペプチド、中間の表面抗原ポリペプチド、および主要な表面抗原ポリペプチ
ド、Ｘ遺伝子ポリペプチド、ならびにコアポリペプチド。例えば、以下を参照の
こと：Ｙｏｋｏｓｕｋａら、（１９８６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１５：
１１８７−１１９２；Ｉｍａｚｅｋｉら、（１９８７）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ
７：７５３−７５７；Ｋａｎｅｋｏら、（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：３
９７９−３９８４；およびＯｕら、（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：４５７
８−４５８１。同様の様式において、ＨＣＶのウイルスゲノム配列は、この配列
を得るための方法として公知である。例えば、国際公開番号ＷＯ ８９／０４６
６９；ＷＯ ９０／１１０８９；およびＷＯ ９０／１４４３６を参照のこと。
ＨＣＶゲノムは、いくつかのウイルスタンパク質（Ｅ１およびＥ２を含む）をコ
ードする。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、（１９９１）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ
１４：３８１−３８８を参照のこと。これらのＨＢＶおよびＨＣＶタンパク質を
コードする配列ならびにその抗原性フラグメントは、本発明の方法における使用
を見出す。同様に、ＨＤＶ由来のδ−抗原についてのコード配列は公知である（
例えば、米国特許第５，３７８，８１４号を参照のこと）。

【００３９】 同様の様式において、ヘルペスウイルスファミリー由来の広範な種々のタンパ
ク質抗原をコードする配列が、本発明において使用され得、この抗原としては、
以下が挙げられる：ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２糖タンパク質ｇＢ、ｇＤおよび
ｇＨのような単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型由来の抗原；水痘
−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）および
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶ ｇＢおよびｇＨを含む）由来の抗原
；ならびにＨＨＶ６およびＨＨＶ７のような他のヒトヘルペスウイルス由来の抗
原。（例えば、Ｃｈｅｅら、（１９９０）Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ
（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１２５−
１６９頁；ＭｃＧｅｏｃｈら、（１９８８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１
５３１−１５７４；米国特許第５，１７１，５６８号；Ｂａｅｒら、（１９８４
）Ｎａｔｕｒｅ ３１０：２０７−２１１；ならびにＤａｖｉｓｏｎら、（１９
８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７：１７５９−１８１６を参照のこと）。

【００４０】 ＨＩＶ抗原（例えば、多数のＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２単離体（ＨＩＶの様
々な遺伝子サブタイプのメンバーを含む）についてのｇｐ１２０配列）が既知で
あり、そして報告されており（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ
Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；およびＭ
ｏｄｒｏｗら、（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：５７０−５７８を参照のこ
と）、そしてこれらの単離体のいずれかに由来する抗原は、本発明の方法におけ
る使用を見出す。さらに、本発明は、様々なＨＩＶ単離体のいずれかに由来する
他の免疫原性部分に等しく適用可能であり、ｇｐ１６０およびｇｐ４１のような
様々なエンベロープタンパク質、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇのようなｇａ
ｇ抗原、ならびに、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ
、ｖｐｕおよびＨＩＶのＬＴＲ領域由来のタンパク質が挙げられる。

【００４１】 他のウイルスに由来するかまたは他のウイルスから得られる抗原をコードする
配列はまた、特許請求された方法における使用が見出され、例えば、限定しない
が、以下の科のメンバー由来の配列である：ピコルナウイルス科（例えば、ポリ
オウイルスなど）；カルシウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス
、デング熱ウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイル
ス科；ビルナウイルス科；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）
（例えば、狂犬病ウイルスなど）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（
例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルスなど）；ブンヤ
ウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｄａｅ
）（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、
ＬＡＶ，ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしても公知））（単離体ＨＩＶ_IIIb、ＨＩＶ_{SF 2} 、ＨＩＶ_LAV、ＨＩＶ_LAI、ＨＩＶ−１_MLN由来の抗原を含むがコレラに限定され
ない）；ＨＩＶ−１_CM235、ＨＩＶ−ｌ_US4；ＨＩＶ−２など。例えば、これらお
よび他のウイルスの記載については、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏ
ｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版
（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、１９９１）を参照のこと
。

【００４２】 適切な細菌および寄生虫の抗原をコードする配列が、以下のような疾患を担う
既知の原因因子から得られるか、またはそれに由来する：ジフテリア（Ｄｉｐｔ
ｈｅｒｉａ）、百日咳、破傷風、結核、細菌もしくは真菌の肺炎、コレラ、腸チ
フス、ペスト、細菌性赤痢もしくはサルモネラ症、Ｌｅｇｉｏｎａｉｒｅ疾患、
ライム病、らい病、マラリア、鉤虫、オンコセルカ症、住血吸虫症、トリパノソ
ーマ症（Ｔｒｙｐａｍａｓｏｍｉａｌｓｉｓ）、リシューマニア症（Ｌｅｓｍａ
ｎｉａｓｉｓ）、ジアルジア鞭毛虫症、アメーバ症（Ａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、
フィラリア症、Ｂｏｒｅｌｉａ、および旋毛虫症。なおさらなる抗原は、以下：
クールー、クロイツフェルト−ヤーコプ病（ＣＪＤ）、スクラピー、ミンクの伝
染性脳症、および慢性消耗病の原因因子のような従来ではないウイルスまたはウ
イルス様因子、あるいは蛋白様感染粒子（例えば、狂牛病に関連するプリオン）
から得られ得るか、またはそれに由来し得る。

【００４３】 最小プロモーターおよび目的のコード配列についての配列はともに、公知の方
法を用いて獲得および／または調製され得る。例えば、実質的に純粋な抗原調製
物は、標準的な分子生物学的ツールを用いて得られ得る。すなわち、上記の抗原
をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え方法を用いて（例えば、この遺伝
子を発現する細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリー
をスクリーニングすることによって、またはこの遺伝子を含むことが公知のベク
ターからこの遺伝子を駆動することによって）得られ得る。さらに、所望の遺伝
子またはプロモーター配列は、標準的な技術（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤ
ＮＡのフェノール抽出またはＰＣＲ）を用いて、この所望の遺伝子またはプロモ
ーター配列を含む細胞および組織から直接単離され得る。例えば、ＤＮＡを獲得
および単離するために使用される技術の記載については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（
前出）を参照のこと。ポリヌクレオチド配列はまた、クローニングされるよりむ
しろ、合成的に生成され得る。

【００４４】 特定の核酸分子を単離するためのなお別の従来法は、ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）による。Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ
．１５５：３３５−３５０。この技術は、ＤＮＡポリメラーゼ（通常は、熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼ）を使用して、ＤＮＡの所望の領域を複製し得る。複製さ
れるＤＮＡの領域は、複製反応をプライムするための、所望のＤＮＡの対向する
末端および対向する鎖に相補的な特定の配列のオリゴヌクレオチドにより同定さ
れる。第１回の複製の産物は、それ自体、その後の複製のためのテンプレートで
あり、従って複製の反復される連続サイクルにより、使用されるプライマー対に
より範囲が決定されるＤＮＡフラグメントの幾何的複製が生じる。

【００４５】 一旦最小プロモーターおよび目的のコード配列についての配列が得られると、
標準的なクローニングまたは分子生物学技術を用いて、それらを共に連結して、
核酸分子を提供する。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７
５６；Ｎａｍｂａｉｒｔら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９；お
よびＪａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照の
こと。次いで、この核酸分子が適切なベクター（例えば、発現プラスミドまたは
ウイルスベクター構築物）に挿入される。

【００４６】 最小プロモーターおよび選択されたコード配列を含む核酸構築物は、一般に、
他の制御配列もまた含み得る。これらの他の制御配列としては、代表的に、ター
ミネーターおよび／または翻訳開始配列（例えば、ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧまたは
ＧＣＣＣＣＣＡＴＧＧ）および／または翻訳停止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡ
ＧまたはＴＧＡ）および／またはポリアデニル化シグナルおよび／またはＲＮＡ
転写中断部位（ｐａｕｓｅ ｓｉｔｅ）が挙げられる。しかし、プロモーター配
列についてのネイティブなエンハンサーは、存在しない。一般に、エンハンサー
は全く存在しない。

【００４７】 遺伝子治療目的については、この核酸構築物は、これが導入された細胞のゲノ
ムに組み込まれる。従って、この核酸構築物はまた、構築物の組み込みを増強す
る配列を含み、例えば、これらの配列としては、バクテリオファージＰ１ Ｃｒ
ｅ組換え系のｌｏｘＰ部位、酵母ＦＬＰ組換え系のＦＲＴ部位またはアデノ随伴
ウイルス（ＡＡＶ）末端反復配列が挙げられる。

【００４８】 一旦完了すると、この構築物は、標準的な遺伝子送達プロトコルを用いて遺伝
子治療または核酸免疫化のために使用され得る。遺伝子送達の方法は、当該分野
で公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８
５９号、同第５，５８９，４６６号を参照のこと。遺伝子は、被験体に直接送達
され得るか、あるいは被験体に由来し、そしてこの被験体に再移植される細胞に
エキソビボで送達され得るかのいずれかである。

【００４９】 多くのウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発され
てきた。例えば、選択されるコード配列は、当該分野で公知の方法を用いて、ベ
クターに挿入さ得れ、そしてレトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次
いで、組換えウイルスは、単離され、そして被験体の細胞に、インビボまたはエ
キソビボのいずれかで送達され得る。多くのレトロウイルス系が記載されている
（米国特許第５，２１９，７４０号；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈ
ｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５−１４；およびＢｕｒｎｓら（１
９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０３３−８
０３７）。

【００５０】 多くのアデノウイルスベクターもまた記載されている（Ｈａｊ−Ａｈｍａｄら
（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら（１９９３）
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら．（１９
９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７１７−７２９；ならびに
Ｒｉｃｈら（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１−
４７６）。さらに、種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系が遺伝子送
達のために開発されてきている。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を用
いて容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第
５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ ９２／０１０７０号（１９９２年１
月２３日公開）および同ＷＯ ９３／０３７６９号（１９９３年３月８日公開）
；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３
９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；
Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３： ５３３−５３９； Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ
．（１９９２） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；ならびにＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ
．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１を
参照のこと。目的の抗原をコードする核酸分子を送達するための使用を見出すさ
らなるウイルスベクターとしては、ポックスファミリーのウイルス（ワクシニア
ウイルスおよび鳥類ポックスウイルスを含む）に由来するものが挙げられる。

【００５１】 ウイルスベクターが所望されない場合、リポソーム調製物を代替的に用いて、
本発明の核酸分子を送達し得る。有用なリポソーム調製物としては、カチオン性
（正に荷電した）調製物、アニオン性（負に荷電した）調製物、および中性調製
物が挙げられるが、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソー
ムは、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１６）およびｍＲＮＡ（Ｍａ
ｌｏｎｅら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６
：６０７７−６０８１）の細胞内送達を媒介することが示されている。

【００５２】 ウイルスベクター系のなお別の代替手段として、本発明の核酸分子は、粒子状
キャリアにカプセル化され得るか、それに吸着され得るか、またはそれと会合さ
れ得る。適切な粒子状キャリアとしては、ポリメチルメタクリレートポリマーに
由来するもの、ならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−コ−グリコリ
ド）に由来するＰＬＧ微粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら（１９９
３）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１０：３６２−３６８を参照のこと。他の粒子系およ
びポリマー（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミ
ン、スペルミジンのようなポリマー、ならびにこれらの分子の結合体）もまた使
用され得る。

【００５３】 上記の核酸分子を含む組成物の処方は、全てが当業者が容易に利用可能な、標
準的な薬学的処方化学および方法論を用いて行われ得る。例えば、１つ以上の核
酸分子を含む組成物は、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクルと
組み合わせられ得る。補助物質（例えば、湿潤剤、または乳化剤、ｐＨ緩衝化物
質など）が賦形剤またはビヒクル中に存在し得る。これらの賦形剤、ビヒクルお
よび補助物質は、一般に、この組成物を与えられた個体における免疫応答を誘導
せず、そして過度の毒性なく投与され得る薬剤である。薬学的に受容可能な賦形
剤としては、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセ
ロールおよびエタノールのような液体が挙げられるが、これらに限定されない。
薬学的に受容可能な塩（例えば、鉱酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン
酸塩、硫酸塩など）；および有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マ
ロン酸塩、安息香酸塩など）もまたそこに含まれ得る。核酸の取り込みおよび／
または発現の特定の促進剤（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）としてはまた、組成物中
に含まれ得、例えば、ブピバカイン、心臓毒およびスクロースのような促進剤が
挙げられ得る。薬学的に受容可能な賦形剤の議論を通して、ビヒクルおよび補助
物質は、本明細書中に参考として援用されるＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲ
ＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ
．１９９１）において利用可能である。

【００５４】 核酸免疫化に使用される場合、処方された組成物は、上記に規定されたとおり
、免疫応答を高めるに十分な、目的の抗原量を含む。適切な有効量は、当業者に
より容易に決定され得る。このような量は、比較的広範な範囲であり、慣用的な
知見を通じて得られ得る。この組成物は、約０．１％〜約９９．９％の抗原を含
み得、そして被験体に直接投与され得るか、あるいは当業者に公知の方法を用い
て被験体に由来する細胞にエキソビボで送達され得る。例えば、エキソビボ送達
および形質転換細胞の被験体への再移植のための方法は、公知である（例えば、
デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱、エレクトロポ
レーション、および核への直接マイクロインジェクション）。インビボ送達方法
は、従来のシリンジを使用した注射を必要とし得る。この構築物は、皮下、表皮
、皮内、粘膜内（例えば、経鼻、直腸および膣）、腹腔内、静脈内、経口、また
は筋肉内のいずれかに注射され得る。他の投与形態としては、経口投与および肺
投与、坐剤、および経皮的適用が挙げられる。

【００５５】 しかし、この核酸分子は、粒子加速デバイス（これは、核酸を被覆した微粒子
を標的組織に発射するか、または粒子状核酸組成物を経皮的に送達する）を用い
て送達されることが好ましい。これに関しては、粒子媒介（ときおり、「遺伝子
銃」とよばれる）核酸免疫化は、ナノグラム量のＤＮＡの経皮的送達後に、体液
性および細胞傷害性Ｔリンパ球免疫応答の両方を誘発することが示された。Ｐｅ
ｒｔｍｅｒら（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１４２７−１４３０。粒子媒
介送達技術を他の型の核酸接種と比較し、そして明らかに優れていることを見出
した。Ｆｙｎａｎら（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ
ｏｇｙ １７：７９−８３，Ｆｙｎａｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１４７８−１１４８２、およびＲａｚら（１
９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９５１９−９
５２３。このような研究により、表面的な皮膚および筋肉組織の両方への核酸ベ
ースのワクチンの粒子媒介送達を調査した。

【００５６】 核酸調製物を送達するための粒子媒介方法は、当該分野で公知である。従って
、一旦調製され、そして適切に精製されると、上記の核酸分子は、当該分野で公
知の種々の技術を用いてキャリア粒子に被覆し得る。キャリア粒子は、遺伝子銃
デバイスからの細胞内送達のために代表的に使用される粒子サイズの範囲におい
て適切な密度を有する材料から選択される。最適なキャリア粒子サイズは、もち
ろん、標的細胞の直径に依存する。

【００５７】 本発明の目的のためには、タングステン、金、白金およびイリジウムのキャリ
ア粒子が使用され得る。タングステンおよび金の粒子が好ましい。タングステン
粒子は、直径が０．５〜２．０μｍの平均サイズで容易に利用可能である。金粒
子または微晶質金（例えば、金粉末 Ａ１５７０，Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ Ｃｏｒ
ｐ．，Ｅａｓｔ Ｎｅｗａｒｋ，ＮＪから入手可能）はまた、本発明での使用が
見出される。サイズが均一な金粒子が提供される（１〜３μｍの粒子サイズは、
Ａｌｐｈａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手可能、または０．９５μｍを含む粒子
サイズの範囲は、Ｄｅｇｕｓｓａ，Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪか
ら入手可能）。微晶質金は、異なる粒子サイズ分布（代表的には、０．５〜５μ
ｍの範囲で）を提供する。しかし、微晶質金の不規則な表面積は、核酸の高効率
な被覆を提供する。

【００５８】 金またはタングステンの粒子にＤＮＡまたはＲＮＡを被覆または沈着させるた
めの多くの方法は、公知であり、そして記載されている。大部分のこのような方
法は、一般に、予め決定された量の金またはタングステンをプラスミドＤＮＡ、
ＣａＣｌ₂、およびスペルミジンと合わせる。得られた溶液は、被覆手順の間連
続してボルテックスされて、確実に反応混合物が均一になるようにする。核酸が
沈澱した後、被覆した粒子を適切な膜へ移し得、そして使用する前に乾かして、
サンプルモジュールまたはカセットの表面に被覆し得るか、または特定の遺伝子
銃機器における使用のための送達カセットにロードし得る。

【００５９】 粒子媒介送達に適切な種々の粒子加速デバイスが当該分野で公知であり、そし
て本発明の実施における使用に全て適応される。現在のデバイス設計は、爆発的
放出、電気的放出、またはガス放出を用いて、被覆したキャリア粒子を標的細胞
に向かって推進させる。被覆したキャリア粒子は、それ自体が可動式キャリアシ
ートに取り外し可能に取り付けられ得るか、またはガス流動が通過する表面に取
り外し可能に取り付けられ得、この表面から粒子を持ち上げ、そしてそれらを標
的に向かって加速する。ガス放出デバイスの例は、米国特許第５，２０４，２５
３号に記載される。爆発型デバイスは、米国特許第４，９４５，０５０号に記載
される。ヘリウム放出型粒子加速装置の１つの例は、ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ Ｘ
Ｒ（登録商標）機器（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍ
ａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）であり、この機器は、米国特許第５，１２０，６５７号に
記載される。本明細書中に記載される使用に適切な電気的放出装置は、米国特許
第５，１４９，６５５号に記載される。これらの特許の開示は、本明細書中に参
考として援用される。

【００６０】 あるいは、粒子状核酸組成物は、無針シリンジデバイスを用いて経皮的に投与
され得る。例えば、本発明の核酸組成物を含む粒子状組成物は、一般的な薬学的
方法（例えば、単純なエバポレーション（結晶化）、真空乾燥、噴霧乾燥または
凍結乾燥）を用いて得られ得る。所望であれば、この粒子は、共有に係る国際公
開ＷＯ９７／４８４８５（本明細書中に参考として援用される）に記載の技術を
用いてさらに濃縮され得る。次いで、これらの粒子組成物は、無針シリンジシス
テム（例えば、共有に係る国際公開ＷＯ９４／２４２６３、ＷＯ９６／０４９４
７、ＷＯ９６／１２５１３、およびＷＯ９６／２００２２に記載のものであり、
これらの全ては、本明細書中に参考として援用される）から送達され得る。

【００６１】 粒子組成物または被覆した粒子は、投薬処方物と適合した様式で、および本発
明の目的のために有効な量で個体に投与される。送達される組成物の量は、試験
される個体に依存する。必要とされる正確な量は、処置される個体の年齢および
全般的状態に依存して変化し、そして適切な有効量は、本明細書中を読む際に、
当業者に容易に決定され得る。

【００６２】 （Ｃ．実験） 本発明を実施するために特定の実施形態の例が以下に示される。この例は、例
示目的で提供され、本発明の範囲を如何様にも限定することは意図されない。

【００６３】 使用される数値（例えば、量、温度など）については正確さを保証するように
努めてきたが、いくつかの実験誤差および偏差はもちろん、許容される。

【００６４】 （実施例１） 多くの発現系を構築して、（インビトロ発現試験法を使用して）増強されたプ
ロモーターおよび対応する最小プロモーターの転写制御下で抗原コード配列を含
むベクターからの抗原発現を比較した。次いで、このベクター構築物の免疫原性
を、インビボ核酸免疫試験法を用いて（この抗原に対する抗体応答を誘発する能
力について）評価した。

【００６５】 具体的には、シミアンＣＭＶプロモーターをそのエンハンサーとともに含むベ
クター（「ｓＣＭＶ」）またはそのエンハンサーを含まないベクター（「ｍＰ−
ｓＣＭＶ」）、ヒトＣＭＶ前初期プロモーターをそのエンハンサーとともに含む
ベクター（「ＣＭＶ」）またはエンハンサーを含まないベクター（「ｍｐ」また
は「ｍｐ−ＣＭＶ」）、およびＰＲＶプロモーターをそのエンハンサーとともに
含むベクター（「ＰＲＶ」）またはそのエンハンサーを含まないベクター（「ｍ
ｐ−ＰＲＶ」）を、抗原生成（インビトロ発現）および抗体生成（インビボ免疫
原性）の両方について評価した。結果を添付の図面に示す。全ての場合において
、エンハンサー配列の除去により、（増強プロモーターと比較して）最小プロモ
ーター構築物からの発現レベルが減少した（データは示さず）。しかし、図面に
みられるように、最小プロモーター構築物は、この研究のインビボ成分において
、（増強プロモーターと比較して）劇的に増加した抗体生成を提供した。

【００６６】 （実施例２） 核酸免疫化プロトコルにおいてエンハンサーレスプロモーター系を使用する効
果をさらに評価するために、多数の実験を行って、全長（増強された）プロモー
ター系を含む抗原構築物の免疫原性と、本発明の最小（エンハンサーレス）プロ
モーター系を含む抗原構築物の免疫原性を比較した。

【００６７】 より詳細には、一連の、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）構築物を、以下のよ
うに構築した。このＨＢｓＡｇコード領域を作製するために、ｐＡＭ６構築物（
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、「ＡＴ
ＣＣ」から得た）を、ＮｃｏＩを用いて切断し、そしてマングマメヌクレアーゼ
を用いて処理して、このＸ−抗原の開始コドンを除去した。次いで、得られたＤ
ＮＡをＢａｍＨＩを用いて切断し、そしてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて処
理して、このＤＮＡを平滑末端化し、そしてＨＢｓＡｇ発現カセットを作製した
。このＨＢｓＡｇ発現カセットは、１．２ｋＢフラグメントに存在する。全長ヒ
トＣＭＶ（Ｔｏｗｎｅ株）を含むプラスミド構築物ＰＪＶ７０７７（Ｓｃｈｍａ
ｌｊｏｈｎら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９５６３〜９５６９）極初期
プロモーター（エンハンサーを有する）をＨｉｎｄ３およびＢｇｌ２を用いて切
断し、次いで、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼおよび仔ウシアルカリホスファターゼ
を用いて処置して、平滑末端ＤＮＡ付加物（ａｄｊａｃｅｎｔ）を作製した。

【００６８】 このＰＪＶ７２３２宿主プラスミド（上記のＰＪＶ７０７７構築物の誘導体）
は、ＳａｌＩ部位およびＢａｍＨＩ部位が隣接する、プロモーター挿入部位を含
む。新しいプロモーターは、目的のプロモーター領域に相同なプライマーを使用
して、ウイルスストック、感染細胞、プラスミドなどの中からＰＣＲされた。こ
れらのプライマーは、末端にＳａｌＩ制限部位およびＢａｍＨＩ制限部位を有す
るように設計した。その結果、そのＰＣＲフラグメントは、同じように切断した
ＰＪＶ７２３２構築物への簡単な挿入を容易にするように、これらの酵素を用い
て切断し得る。次いで、この方法を使用して、全長（増強された）シミアンＣＭ
Ｖプロモーター系および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）プロモーター系により駆
動される、ＨＢｓＡｇ発現カセットを構築した。すべてのＰＣＲ反応を、標準的
条件下で実施して、製造業者の指示に従って、その標的配列からプロモーターエ
レメントを増幅した。この指示は、詳細には、以下である： １×ＰＣＲコア緩衝液ｗ／１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂； センスプライマーおよびアンチセンスプライマー、各々０．４μＭ； ２００μＭの各ｄＮＴＰ； ２．５μｇ Ｔａｑポリメラーゼ： ０．１〜１．０μｇ標的サンプル（ｓＣＭＶに関してはＡＴＣＣ＃ＶＲ７０６
、そしてＰＲＶに関してはＡＴＣＣ＃ＶＲ１３５） 水で１００μＬにし；そして ミネラルオイルを上層した。 熱サイクラーを、以下のルーチンを実行するようにプログラムした： ９５℃で４分； ３０サイクルの（９５℃で１分＋５５℃で１分１５秒＋７２℃で１分）； ７２℃で１０分；および ４℃で固定。 熱サイクルが完了した後、Ｔａｑポリメラーゼを、ＰＣＲ産物のフェノール／ク
ロロホルム抽出およびエタノール沈殿により除去した。次に、この増幅したＤＮ
Ａ、およびＰＪＶ７２３２構築物を、ＳａｌＩ制限酵素およびＢａｍＨＩ制限酵
素を用いて切断した。

【００６９】 適切な制限酵素を用いて切断した（そして必要な場合は、平滑末端化した）後
、そのＤＮＡを、アガロースゲル上で泳動して、目的のＤＮＡバンドを、分離、
精製および単離した。次に、これらの単離されたバンドを、連結反応中で一緒に
混合し、そして１６℃にて一晩インキュベートした。この連結反応物を、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ細胞に形質転換した。切断されたＰＣＶ７０７７構築物およびＰＪＶ７２
３２構築物は、適切な昆虫フラグメントを含まない限りは、抗生物質選択下で、
この細菌宿主細胞において増殖し得ない。従って、この新しい組換えＤＮＡ構築
物（全長ｈＣＭＶプロモーター、ｓＣＭＶプロモーターまたはＰＲＶプロモータ
ーによりプロモートされるＨＢｓＡｇ配列）を含む細菌コロニーは、寒天プレー
ト上で増殖し、そしてそのＤＮＡをこれらのコロニーから単離した。このＤＮＡ
を、その種々のフラグメントの適切な連結について分析した。正確な連結産物を
保有する細菌単離物を、大量液体培養において増殖し、それに対して、大スケー
ルＤＮＡ抽出を実施した。次いで、得られたＤＮＡを、ワクチンロットとして使
用する。

【００７０】 上記のｈＣＭＶ−ｓＡＧ構築物、ｓＣＭ−ｓＡＧ構築物およびＰＲＶ−ｓＡＧ
構築物の、対応する最小プロモーター（エンハンサーレス）バージョンを作製す
るために、これらのＤＮＡを、制限酵素の対（それぞれ、ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ
、ＳａｌＩ／ＳａｌＩまたはＳａｌＩ／ＮｏｔＩ）を用いて切断した。その切断
されたＤＮＡを、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて処理して、平滑末端化ＤＮ
Ａを作製した。その平滑末端ＤＮＡを、本明細書中上記に示されるのと同じ条件
を使用して、自己連結し、形質転換し、分析し、そして増幅した。この手順で作
製したワクチンロットは、各エンハンサー配列のうちの少なくとも大部分が、そ
のプロモーターから欠失していた。

【００７１】 次に、そのＤＮＡワクチン生成物を、金粒子の上にコートし、そして粒子媒介
性送達技術を使用して、マウス被験体に投与した。詳細には、試験する各プラス
ミドＤＮＡ構築物について、２μｍ金粉末２５ｍｇを、微小遠心チューブに量り
入れた。５０ｍＭスペルミジン（Ａｌｄｒｉｃｈ）の２５０μＬアリコートを添
加した後、このチューブをボルテックスし、そして短く超音波処理した。次に、
この金を微量遠心し、そして新鮮な１００μＬアリコートでスペルミジンを置換
した。次に、この金をボルテックスにより再懸濁し、その後、ＤＮＡ２５μｇを
このチューブに添加し、そして混合した。このチューブを軽くボルテックスしつ
つ、１０％ＣａＣｌ（Ｆｕｊｉｓａｗａ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）１００μＬを添加
して、このＤＮＡをこの金のビーズ上に沈殿させた。この沈殿反応を卓上で１０
分間進行させ、その後、この金を、短い微量遠心分離により収集し、そして無水
エタノール（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を用いて３回洗浄して、過剰な沈殿試薬を除去
した。次に、この洗浄された金／ＤＮＡ複合体を、無水エタノール中の０．０５
ｍｇ／ｍｌポリビニルピロリドン（３６０ｋＤ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を用いて再
懸濁した。次に、得られたスラリーを、チューブターナー（ｔｕｒｎｅｒ）被覆
機（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗ
Ｉ）に収容されたＴＥＦＺＥＬ（登録商標）チューブ（ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａ
ｒｒ）に注入した。この被覆機は、このチューブの内側を、金／ＤＮＡ複合体で
コートする。このチューブターナー機は、米国特許第５，７３３，６００号に記
載される。この被覆手順が完了した後、このチューブを切断して、０．５インチ
の「ショット」にし、これを、マウスへの送達のために、粒子媒介性送達デバイ
ス（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ ＸＲＩデバイス、ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ Ｖａｃｃ
ｉｎｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に装填した。

【００７２】 ワクチン手順のために、４週〜６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、ＫＥＴＡＳＥ
Ｔ（登録商標）（ＦｏｒｔＤｏｄｇｅ）麻酔薬およびＲＯＭＰＵＮ（登録商標）
（Ｂａｙｅｒ）麻酔薬の混合物を用いて麻酔した。腹部を、一対の電子クリッパ
ーを用いて剃毛して、体毛を除去した。そして重複しない２つのワクチンの「シ
ョット」を、このＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ ＸＲ１デバイス（４５０ｐｓｉ）から
、この剃毛した領域に送達した。この動物を６週間の間ケージに戻し、その後、
血液サンプルを、抗ＨＢｓＡｇ抗体の血清分析のために得た。

【００７３】 より詳細には、血液サンプルを、このワクチンした動物から収集した。次に、
この血液サンプルから単離した２００μＬまでのアリコートを、ＡＵＳＡＢ（登
録商標）ＥＩＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｋｉｔ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）とともに供給される反応容器のウェル中に配置した。添加した血
清の量は、そのサンプルの抗体力価に依存した。そして、各サンプルを、サンプ
ル希釈緩衝液を用いて希釈して、イムノアッセイキットによって読み取り可能な
値内に低下させた。標準化パネルサンプルのアリコート２００μＬを、この反応
容器のウェルに添加した。ビーズを各ウェルに添加し、その後、この容器を密封
し、そして４０℃にて２時間インキュベートした。次に、このウェルから、すべ
ての液体反応成分を洗い流した。次に、結合体混合物のアリコート２００μＬを
、各洗浄済みウェルに添加し、その後、この容器を密封し、そして４０℃にて２
時間インキュベートした。次に、このウェルから、すべての反応成分を洗い流し
、そしてこのビーズを、新しい反応チューブに移し、その後、発色緩衝液３００
μＬを添加した。３０分後、この発色反応を、１Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄を添加して停止し
、そして、その吸光度を、Ｑｕａｎｔｕｍ ＩＩ^TM分光光度計を使用して、４９
０ｎｍにて測定した。この分光光度計を使用して、各サンプルの抗体レベルを、
標準化パネルを用いて作製した標準曲線に対してこのサンプルの吸光度を比較す
ることによって、計算した。次に、この抗体レベルを、すべての希釈係数につい
て補正し、そしてその最終データを、特定のＤＮＡワクチン構築物によりワクチ
ンしたすべての動物の幾何平均力価として記録した。

【００７４】 これらの研究結果を、図２〜図４に示す。図２は、完全に増強されたｈＣＭＶ
プロモーター系と本発明の最小ｈＣＭＶプロモーター系との間の比較を示す。理
解され得るように、この最小プロモーター系は、この完全の増強されたプロモー
ター−系の約３倍の抗体力価の改善を生じた（この結果は、１グループにつき８
匹のマウスの、４つの独立した実験からプールした）。図３および図４は、全長
（増強された）プロモーターとその対応する最小（エンハンサーレス）プロモー
ター誘導体との間の比較からの、同様の結果を示す。

【００７５】 従って、新規な最小プロモーター系、およびこれらの系を含む核酸試薬が、記
載された。本発明の好ましい実施形態がいくらか詳細に記載されているが、明ら
かな改変が、添付の特許請求の範囲により規定されるような、本発明の精神およ
び範囲から逸脱することなく、なされ得ることが、理解される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、本発明の最小プロモーター構築物とその対応する増強されたプロモー
ター構築物との間の比較を示す。これらのプロモーター構築物のインビトロでの
能力を、これらの構築物での核酸免疫化を受けている動物において、目的の抗原
に対する抗体の産生を測定することによって評価した。

【図２】 図２は、本発明に従って産生された最小ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ
）プロモーター構築物と、その対応する、十分に増強されたｈＣＭＶプロモータ
ー構築物との間の比較を示す。

【図３】 図３および図４は、本発明の最小プロモーター構築物、およびその対応する増
強されたプロモーター構築物を使用するインビボワクチン接種研究から得られた
、比較結果を示す。ここで再度、これらのプロモーター構築物のインビトロでの
能力を、これらの構築物での核酸免疫化を受けている動物において、目的の抗原
に対する抗体の産生を測定することによって評価した。

【図４】 図３および図４は、本発明の最小プロモーター構築物、およびその対応する増
強されたプロモーター構築物を使用するインビボワクチン接種研究から得られた
、比較結果を示す。ここで再度、これらのプロモーター構築物のインビトロでの
能力を、これらの構築物での核酸免疫化を受けている動物において、目的の抗原
に対する抗体の産生を測定することによって評価した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/002 Ａ６１Ｋ 39/002 39/12 39/12 47/02 47/02 Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/12 31/18 31/18 31/20 31/20 31/22 31/22 33/00 33/00 35/00 35/00 37/06 37/06 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 BA32 CA04 FA02 FA06 GA11 GA13 HA17 4C076 AA19 AA31 AA93 BB01 BB11 BB21 BB25 BB31 CC03 CC27 DD21A FF02 4C084 AA02 AA13 BA35 MA24 MA52 MA56 MA59 MA63 MA66 NA14 ZB081 ZB261 ZB321 ZB331 ZB371 ZC551 4C085 AA03 BA02 BA51 BA69 BA78 BA89 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 MA24 MA52 MA56 MA59 MA63 MA66 NA14 ZB08 ZB26 ZB32 ZB33 ZB37 ZC55

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 核酸構築物の使用であって、該核酸構築物は、哺乳動物細胞
   において目的のポリペプチドの発現を得る際に使用するための医薬の製造におけ
   る、該ポリペプチドをコードするコード配列に作動可能に連結された最小プロモ
   ーター配列を含む核酸構築物の使用。
2. 【請求項２】 前記コード配列が、抗原をコードし、そして前記医薬が、核
   酸免疫化における使用のためのものである、請求項１に記載の使用。
3. 【請求項３】 前記抗原が、ウイルス病原体、細菌病原体、寄生生物病原体
   または真菌病原体の抗原である、請求項２に記載の使用。
4. 【請求項４】 前記抗原が、腫瘍特異的抗原または自己免疫疾患に関連する
   抗原である、請求項２に記載の使用。
5. 【請求項５】 前記抗原が、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを含
   む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の使用。
6. 【請求項６】 前記核酸構築物が、キャリア粒子上に被覆される、請求項２
   〜５のいずれか１項に記載の使用。
7. 【請求項７】 前記医薬が、遺伝子治療における使用のためのものである、
   請求項１に記載の使用。
8. 【請求項８】 前記核酸構築物が、ウイルスベクターまたはリポソーム調製
   物中に提供される、請求項７に記載の使用。
9. 【請求項９】 前記核酸構築物が、ＤＮＡ構築物である、請求項１〜８のい
   ずれか１項に記載の使用。
10. 【請求項１０】 前記最小プロモーター配列が、本質的に、ヒトサイトメガ
    ロウイルス（ｂＣＭＶ）最初期プロモーター配列、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ
    ）初期プロモーター領域、サルサイトメガロウイルス（ｓＣＭＶ）最初期プロモ
    ーター配列、またはそれらの機能的改変体からなる、請求項１〜９のいずれか１
    項に記載の使用。
11. 【請求項１１】 前記最小プロモーター配列が、本質的に、ｈＣＭＶ最初期
    プロモーター領域の０〜−１１８位にわたる配列、または該配列の機能的改変体
    からなる、請求項１０に記載の使用。
12. 【請求項１２】 哺乳動物細胞において目的のポリペプチドの発現を得る方
    法であって、該方法は、該細胞に、該ポリペプチドのコード配列に作動可能に連
    結された最小プロモーター配列を含む核酸構築物を移入する工程を包含する、方
    法。
13. 【請求項１３】 前記構築物が、被験体に直接送達される、請求項１２に記
    載の方法。
14. 【請求項１４】 前記構築物が、注射、経皮粒子送達、吸入、局所的、経口
    的、鼻内的または経粘膜的によって送達される、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記構築物が、無針注射によって送達される、請求項１４
    に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記構築物が、被験体から採取された細胞内へエキソビボ
    送達され、そして該細胞が、該被験体に再導入される、請求項１２に記載の方法
    。
17. 【請求項１７】 前記被験体が、ヒトである、請求項１３〜１６のいずれか
    １項に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記ポリペプチドが、抗原である、請求項１２〜１７のい
    ずれか１項に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記抗原が、ウイルス病原体、細菌病原体、寄生生物病原
    体または真菌病原体の抗原である、請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記抗原が、腫瘍特異的抗原または自己免疫疾患に関連す
    る抗原である、請求項１８に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記抗原が、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを
    含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記核酸構築物が、キャリア粒子上に被覆される、請求項
    １２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記核酸構築物が、ＤＮＡ構築物である、請求項１２〜２
    ２のいずれか１項に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記最小プロモーター配列が、本質的に、ヒトサイトメガ
    ロウイルス（ｂＣＭＶ）最初期プロモーター配列、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ
    ）初期プロモーター領域、サルサイトメガロウイルス（ｓＣＭＶ）最初期プロモ
    ーター配列、またはそれらの機能的改変体からなる、請求項１２〜２３のいずれ
    か１項に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記最小プロモーター配列が、本質的に、ｈＣＭＶ最初期
    プロモーター領域の０〜−１１８位にわたる配列、または該配列の機能的改変体
    からなる、請求項２４に記載の方法。
26. 【請求項２６】 粒子最核酸免疫化における使用に適切な被覆粒子であって
    、該粒子は、抗原をコードするコード配列に作動可能に連結された、最小プロモ
    ーター配列を含む核酸構築物で被覆された、キャリア粒子を含む、被覆粒子。
27. 【請求項２７】 前記キャリア粒子が、タングステン粒子または金粒子であ
    る、請求項２６に記載の被覆粒子。
28. 【請求項２８】 前記抗原が、ウイルス病原体、細菌病原体、寄生生物病原
    体または真菌病原体の抗原である、請求項２６または２７に記載の被覆粒子。
29. 【請求項２９】 前記抗原が、腫瘍特異的抗原または自己免疫疾患に関連す
    る抗原である、請求項２６または２７に記載の被覆粒子。
30. 【請求項３０】 前記抗原が、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを
    含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の被覆粒子。
31. 【請求項３１】 前記核酸構築物が、ＤＮＡ構築物である、請求項２６〜３
    ０のいずれか１項に記載の被覆粒子。
32. 【請求項３２】 前記最小プロモーター配列が、本質的に、ヒトサイトメガ
    ロウイルス（ｂＣＭＶ）最初期プロモーター配列、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ
    ）初期プロモーター領域、サルサイトメガロウイルス（ｓＣＭＶ）最初期プロモ
    ーター配列、またはそれらの機能的改変体からなる、請求項２６〜３１のいずれ
    か１項に記載の被覆粒子。
33. 【請求項３３】 前記最小プロモーター配列が、本質的に、ｈＣＭＶ最初期
    プロモーター領域の０〜−１１８位にわたる配列、または該配列の機能的改変体
    からなる、請求項３２に記載の被覆粒子。
34. 【請求項３４】 粒子媒介核酸免疫化に適切な粒子加速デバイスであって、
    該デバイスは、請求項２６〜３３のいずれか１項に定義されるような被覆粒子で
    充填されている、粒子加速デバイス。
35. 【請求項３５】 単離精製された、最小プロモーター配列。
36. 【請求項３６】 コード配列に作動可能に連結された最小プロモーター配列
    を含む、核酸構築物。
37. 【請求項３７】 請求項３６に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
38. 【請求項３８】 プラスミドである、請求項３７に記載のベクター。