JP2000515003A

JP2000515003A - タンパク質加水分解物を得る方法

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Publication number: JP2000515003A
Application number: JP09541414A
Authority: JP
Inventors: ムンクニエルセン，ペール
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-05-20
Filing date: 1997-05-20
Publication date: 2000-11-14
Also published as: DE69736247T2; DE69736247D1; CN1219106A; AU722915B2; CN1099839C; WO1997043910A1; BR9709006A; CN1326687A; AU2765097A; EP0969736B1; EP0969736A1

Abstract

(57)【要約】本発明はフレーバリング剤として有用なタンパク質加水分解物を得る方法に関する。より詳細には、本発明はタンパク性基質から遊離グルタミン酸及び／またはグルタミン酸残基含有ペプチドに富んだ加水分解物を得る方法を提供し、その方法は前記基質を脱アミド化過程にかける工程及び前記基質を特異的に作用するタンパク質分解性酵素の作用にかける工程を含むものである。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質加水分解物を得る方法技術分野本発明は、フレーバリング剤として有用なタンパク質加水分解物を得る方法に関する。より詳細には、本発明は、タンパク性の基質から、遊離グルタミン酸及び／またはペプチド結合グルタミン酸残基に富んだ加水分解物を得る方法を提供し、その方法は基質を脱アミド化過程にかける工程及び基質を特異的に作用するタンパク質分解酵素の作用にかける工程を含む。従来技術種々の食品、たとえば、スープ、ソース及び調味料は、タンパク性材料の加水分解により得られたフレーバリング剤を含む。伝統的にこの加水分解は強塩酸を用い、続いて、水酸化ナトリウムを用いる中和によりもたらされる。しかしながら、上記化学的加水分解は加水分解の間に得られたアミノ酸の苛酷な分解とこの化学反応の間に形成された有害副生物をももたらす。したがって、化学的加水分解により得られたフレーバリング剤の使用に関する増大する懸念が酵素加水分解方法の進歩をもたらした。酵素加水分解方法は高加水分解度（DH）を得ることを目的とし、これは通常非 −特異的に作用するタンパク質分解酵素（すなわち、非−特異的に作用するエンド−及びエキソ−ペプチダーゼ）の複合体を用いて達成される。この方法において、たとえば、国際特許出願公開第94／25580号は、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）から得られた、非−特異的に作用する酵素調製品を用いることにより、タンパク質を加水分解する方法を記載している。特異的に作用するタンパク質分解性酵素は、このような酵素は不十分な程度の加水分解をもたらすだけであるという理由で、この目的には用いられなかった。比較的に少数の特異的に作用するタンパク質分解酵素のみが報告されていた。したがって、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）〔Dra peau G R，Boily Y及びHoumard J 「J.Biol.Chem.」，247(20)，p.6720〜6726、 1972年〕、アクチノミセス種（Actinomyces sp.）〔Mosolova O V，Rudenskaya G N，Stepanov V M，Khodova O M及びTsaplina I A「Biokhimiya」52(3)，p．41 4〜422、1987年〕、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）〔 Yoshida N，Tsuruyama S，Nagata K，Hirayama K，Noda K及びMakisumi S「J.Bi ockem」104，p.451〜456、1988年〕、ストレプトミセス・テルモブルガリス（St reptomyces thermovulgaris）〔Khaldrova N Y，Rudenskaya G N，Revina L P， Stephanov V M及びEgorov N S「Biochimiia Moscow Eng.」54(l)，p.32〜38、19 89年〕、バシラス・ズブチリス（Bacillus subtilis）〔Niidome T，Yoshida N ，Ogata F，Ito A及びNoda K「J.Biochem.」108，p.965〜970、1990年〕及びバシラス・リヘニホルミス（Bacillus licheniformis）〔国際特許出願公開91／13 554号、A1〕から得られたグルタモイル−ペプチド結合で優先的にペプチドを開裂するタンパク質分解酵素(Glu−特異的プロテアーゼ)が報告された。 Glu−特異的プロテアーゼは主にタンパク質の構造の研究に用途を見い出す。しかしながら、Glu−特異的スタフィロコッカス・アウレウスのプロテアーゼをカゼインの溶解度及び構造的特性を変性するために用いることが報告され〔Chob ert J M，Sitohy M Z及びWhitaker J R．「J.Agric.Food Chem.」36，p．220〜2 24、1988年〕、国際特許出願公開91／13554号（A1）は、バシラス・リヘニホルミスをタンパク質の限定された特異的加水分解を得るために用いることを記載している。グルタミン(Gln)はほとんど無味であるのに、グルタミン酸(Glu)は、遊離か、ペプチドに結合しているかにかかわらず、タンパク質加水分解物の風味及び美味に重要な役割を演じる。グルタミン酸は遊離のグルタミンをグルタミン酸に変えることにより生成させることができる。この変換（すなわち、脱アミド化）は強塩酸を用いる伝統的な化学的加水分解の間に本質的に起こる。代りに、グルタミン酸は遊離グルタミンからグルタミナーゼ(Ｌ−グルタミナーゼ、EC 3.5.1.22またはＤ−グルタミナーゼ、EC 3.5.1.35)の作用により生成させることができる。しかしながら、グルタミンの実質的な量は、同時にそれがピログルタミンに変わるので失なわれるだろう。グルタミナーゼと対照的に、ペプチドグルタミナーゼ（PGアーゼ）はペプチド結合グルタミンに作用する、２つの型のペプチドグルタミナーゼが知られている。ペプチジル−グルタミナーゼ(EC 3.5.1.43、ペプチドグルタミナーゼＩ)はα −アミノ基で置換されたグルタミンに特異的で、タンパク質−グルタミングルタミナーゼ(EC 3.5.1.44、ペプチドグルタミナーゼII)は、カルボキシル位置またはα−アミノ位置及びカルボキシル位置の両方で置換されたグルタミンに特異的である。アスペルギルス・ジャポニクス(Aspergillus japonicus)、バシラス・サーキュランス（Bacillus circulans）、クリプトコッカス・アルビダス（Cr yptococcus albidus）及びデバリオミセス・クロエヘリ（Debaryomyces kloeche ri）が報告された〔Kikuchi M 及びSakaguchi「Agr.Bio.Chem．」37(4)，p．719 〜724、1973年〕。ペプチドグルタミナーゼは公知であって食用タンパク質を変性するのに有用である。タンパク質の構造的な変性はそれらの機能的性質を改良し、それらの食品成分としての用途を拡大する。このように米国特許第5,082,672号は、ペプチドグルタミナーゼを用いる脱アミド化により食用タンパク質を処理する方法を記載しており、その方法により、大豆タンパク質の溶解性、乳化性、泡立ち性及び他の機能的性質が改良される。しかしながら、米国特許第5,082,672号は、ペプチドグルタミナーゼの完全な大豆タンパク質を脱アミド化する能力はその大きな分子サイズ及び／または特有のコンフォメーションにより制限されることも報告する。したがって、米国特許第5,082,672号は、Alcalase（商標）、すなわち、バシラス・リヘニホルミスから得られた、非−特異的に作用するエンド−／エキソ −ペプチダーゼ複合体を用いる加水分解及び／または加熱処理による基質の初期の分解を教示し、加水分解大豆タンパク質の予熱及び後−加熱処理は最大の程度の脱アミド化を引き起こしたことを確認する。米国特許第3,857,967号はバシラス・サーキュランスから得られたペプチドグルタミナーゼを用いて食品及び飲料を製造する方法を記載している。また、最大の程度の脱アミド化を得るために、米国特許第3,857,967号は、非−特異的に作用するエンド／エキソ−ペプチダーゼを用いることによる、タンパク性基質の初期の分解を教示する。ミモウニ他〔Mimouni B，Raymond J，Merle-Desnoyers A M，Azanza J L及びD ucastaing A，「Journal of Cereal Science」21，p．153〜165、1994年〕は小麦グルテンの機能的性質の改良のため一体とした酸脱アミド化及び酵素加水分解を記載する。より詳細にはミモウニ他は酸脱アミド化と非−特異的に作用するエンド−ペプチダーゼの使用との組み合わせを記載している。発明の概要優れた風味及び機能のタンパク質加水分解が脱アミド化過程と特異的に作用するタンパク質分解酵素の一体とした作用にタンパク性物質をかけることにより得ることができることを今や発見した。したがって、本発明はタンパク性基質から遊離グルタミン酸及び／またはペプチド結合グルタミン酸残基に富む加水分解物を得る方法を提供し、その方法は前記基質を脱アミド化過程にかける工程及び前記基質を特異的に作用するタンパク質分解酵素の作用にかける工程を含む。好ましい態様では、本発明はタンパク性基質からグルタミン酸に富んだ加水分解物を得る方法を提供し、その方法は基質をペプチドグルタミナーゼの作用にかける工程と基質を優先的にグルタモイル−ペプチド結合を開裂するタンパク質分解酵素の作用にかける工程に続いて、１または２以上の非−特異的に作用するエンド−及び／またはエキソ−ペプチダーゼ酵素の作用にかける工程を含む。発明の詳細な説明本発明は遊離グルタミン酸及び／またはペプチド結合グルタミン酸残基に富んだ加水分解物を得る方法に関し、その方法は、（ｉ）基質を脱アミド化過程にかける工程及び（ii）基質を特異的に作用するタンパク質分解酵素の作用にかける工程を含む。２つの工程、（ｉ）及び（ii）は同時に達成するか、工程（ii）を工程（ｉ）に引き続いて行うことができる。特に、優れた風味のタンパク質加水分解物は、グルタミン酸(Glu)が、遊離であるかペプチドに結合しているかにかかわらず、タンパク質加水分解物の風味及び食味のために重要な役割を演じる。しかしながら、本発明の方法により、特に改良された溶解度、改良された乳化性、増大した加水分解度及び改良された泡立ち性に関して、改良された機能のタンパク質加水分解物を得ることもできる。脱アミド化過程アンモニアの放出を経て、アミド（グルタミンまたはアスパラギン）の荷電した酸（グルタミン酸またはアスパラギン酸）への変換は脱アミド化として公知である。脱アミド化は非−酵素的または酵素的脱アミド化過程として起こる。好ましい態様では、脱アミド化は酵素脱アミド化工程として実施する。特に酵素脱アミド過程は、基質をトランスグルタミナーゼの作用またはペプチドグルタミナーゼの作用にかけることにより実施することができる。トランスグルタミナーゼ好ましい態様では、脱アミド化は、基質をトランスグルタミナーゼの作用にかける、酵素脱アミド化過程として行なわれる。トランスグルタミナーゼは、活性化因子ＸIII（たとえば、国際特許出願公開93／15234号参照）を包含する、哺乳動物由来のもの（たとえば、日本特許第1050382号及び日本特許第5023182号参照）、魚由来のもの（たとえば、欧州特許第555,649号参照）及び微生物由来のもの（たとえば、欧州特許第379,606号、国際特許出願公開96／06931号及び国際特許出願公開96／22366号参照）を包含するあらゆる手ごろな源からのものでよい。他の特異的な態様では、トランスグルタミナーゼは、フィトフトラ（Phytopht hora）属の株、特にフィトフトラ・カクトルム（cactorum）、ピチウム(Pythium )属の株、特にピチウム・イレギュラレ（irregulare）、ピチウム種、ピチウム・インターメデイウム(intermedium)、ピチウム・ウルチム(ultimum)及びピチウム・ペリールム（periilum）〔またはＰ．ペリプロクム（periplocum）〕を包含する卵菌類（Oomycete）から由来する。さらに他の態様では、トランスグルタミナーゼは細菌起原のものであって、好ましくは、バシラス属の株、特にバシラス・ズブチリス（subtilis）、ストレプトベルチシリウム(Streptoverticillium)属の株、特にストレプトペルチシリウム・モバラエンシス(mobaraensis)、ストレプトベルチシリウム・グリセオカルネウム(griseocarneum)、ストレプトベルチシリウム・シナモネウム(cinnamoneu m)及びストレプトミセス（Streptomyces）属の株、特にストレプトミセス・リディクス(lydicus)に由来する。トランスグルタミナーゼはタンパク性基質に有効量で加える。トランスグルタミナーゼは脱アミド過程において慣用の量で加えることができる。現在では有効量のトランスグルタミナーゼは基質の量に関連して酵素調製品の約0.01〜約５％（ｗ／ｗ）の範囲、好ましくは基質の量に関連して酵素調製品の約0.1〜約１％（ｗ／ｗ）の範囲と考えられる。酵素処理（インキュベート）は、酵素調製品が不活性にならない任意の手頃な温度、好ましくは約20℃〜約70℃の範囲で行うことができる。確立されたプラクティスにしたがって、酵素調製品は、酵素が不活性になる温度まで、たとえば約70℃より高く、インキュベート混合物の温度を上昇させるか、同様に酵素が不活性となる値まで、たとえば約4.0未満まで、インキュベート混合物のpHを減少させることにより、適切に不活性化させることができる。ペプチドグルタミナーゼ他の好ましい態様では、脱アミド化は、基質をペプチドグルタミナーゼの作用にかける、酵素脱アミド化過程として行なわれる。より特異的な態様では、本発明の方法において用いられるペプチドグルタミナーゼはペプチドグルタミナーゼＩ(ペプチジル−グルタミナーゼ、EC 3.5.1.43) またはペプチドグルタミナーゼII(タンパク質−グルタミングルタミナーゼ、E C 3.5.1.44)または、これらの任意の混合物である。ペプチドグルタミナーゼは、アスペルギルス属の株、特にアスペルギルス・ジャポニクスの株、バシラス属の株、特にバシラス・サーキュランスの株、クリプトコッカス属の株、特にクリプトコッカス・アルビダス(albidus)の株、またはデバリオミセス（Debaryomyce s）属の株、特にデバリオミセス・クロエヘリの株に由来するものである。ペプチドグルタミナーゼはタンパク性基質に有効量で加える。ペプチドグルタミナーゼは脱アミド過程で慣用の量で加えることができる。現在では、有効量のペプチドグルタミナーゼは100ｇの基質当り約0.01〜約100.000PGアーゼ単位の範囲、特に100ｇの基質当り約0.1〜約10.000PGアーゼ単位の範囲と考えられている。酵素処理（インキュベート）は、酵素調製品が不活性にならない任意の手頃な温度、好ましくは約20℃〜約70℃の範囲で行うことができる。確立されたプラクティスにしたがって、酵素調製品は、酵素が不活性になる温度まで、たとえば約70℃より高く、インキュベート混合物の温度を上昇させるか、同様に酵素が不活性となる値まで、たとえば約4.0未満まで、インキュベート混合物のpHを低下させることにより、適切に不活性化させることができる。特異的に作用するタンパク質分解酵素本発明の方法は基質を特異的に作用するタンパク質分解酵素の作用にかける工程を含む。より詳細にはその特異的に作用するタンパク質分解酵素は特異的に作用するエンド−ペプチダーゼまたは特異的に作用するエキソ−ペプチダーゼでよい。特異的に作用するタンパク質分解酵素はあらゆる入手可能な源からのものでよい。エンド−ペプチダーゼ好ましい態様では、特異的に作用するタンパク質分解酵素は、エンド−ペプチダーゼ、たとえば、（ｉ）グルタミルエンドペプチダーゼ（EC 3.4.21.19）、（ii）リシルエンドペプチダーゼ（EC 3.4.21.50）、（iii）ロイシルエンドペプチダーゼ（EC 3.4.21.57）、（iv）グリシルエンドペプチダーゼ（EC 3.4.22.25）、（ｖ）プロリルエンドペプチダーゼ（EC 3.4.21.26）、（vi）トリプシン(EC 3.4.21.4)またはトリプシン様（リシン／アルギニン特異的）エンドペプチダーゼ、または（vii）ペプチジル−Aspメタロエンドペプチダーゼ（EC 3.4.24.33）である。（ｉ）のグルタミルエンドペプチダーゼ（EC 3.4.21.19）、すなわち、優先的にグルタモイル−ペプチド結合を開裂するタンパク質分解酵素は、好ましくは、バシラス属の株、特にバシラス・リヘニホルミス(licheniformis)及びバシラス・ズブチリス、スタフィロコッカス属の株、特にスタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトミセス属の株、特にストレプトミセス・テルモブルガリス及びストレプトミセス・グリセウスまたはアクチノミセス(Actinomyces)種の株であることができる。（ii）のリシルエンドペプチダーゼ（EC 3.4.21.50）は好ましくはアクロモバクター(Achromobacter)属の株、特にアクロモバクター・リチクス(lyticus)、リゾバクター（Lysobacter）属の株、特にリゾバクター・エンチモジェネス(enzymogenes)またはシュードモナス(Pseu domonas)属の株、特にシュードモナス・エルギノサ（aeruginosa）由来のものであり得る。（iii）のロイシルエンドペプチダーゼ（EC 3.4.21.57）は植物起原のものでよい。（iv）のグリシルエンドペプチダーゼ（EC 3.4.22.25）は好ましくはパパイア植物(Carica papaya)由来のものでよい。（ｖ）のプロリルエンドペプチダーゼ（EC 3.4.21.26）は好ましくはフラボバクテリウム（Flavobacterium）属の株から由来するか、または植物起原のものでよい。（vi）のトリプシン様エンドペプチダーゼは、好ましくは、フザリウム（Fusa rium）属の株、特にたとえば、国際特許出願公開89／06270号または国際特許出願公開94／25583号に記載されたようなフザリウム・オキシスポルム(oxysporum) 、由来のものでよい。（vi）のペプチジル−Aspメタロエンドペプチダーゼ（EC 3.4.24.33）は好ましくはシュードモナス属の株、特にシュードモナス・フラジ(fragi)由来のものでよい。エキソ−ペプチダーゼ他の好ましい態様では、特異的に作用する酵素はペプチドのどちらかの末端から作用し得るエキソ−ペプチダーゼ酵素であって、アミノペプチダーゼであることもカルボキシペプチダーゼであることもできる。好ましい態様では、特異的に作用するタンパク質分解酵素は、カルボキシペプチダーゼ、たとえば、（ｉ）ロイシルアミノペプチダーゼ(EC 3.4.11.1)または（ii）トリペプチドアミノペプチダーゼ(EC 3.4.11.4)である。他の好ましい態様では、特異的に作用するタンパク質分解酵素は、カルボキシペプチダーゼ、たとえば、（ｉ）プロリンカルボキシペプチダーゼ(EC 3.4.16.2)、（ii）カルボキシペプチダーゼＡ(EC 3.4.17.1)、（iii）カルボキシペプチダーゼＢ(EC 3.4.17.2)、（iv）カルボキシペプチダーゼＣ(EC 3.4.16.5)、（ｖ）カルボキシペプチダーゼＤ(EC 3.4.16.6)、（vi）リシン（アルギニン）カルボキシペプチダーゼ(EC 3.4.17.3)、（vii）グリシンカルボキシペプチダーゼ(EC 3.4.17.4)、（viii）アラニンカルボキシペプチダーゼ(EC 3.4.17.6)、（ix）グルタメートカルボキシペプチダーゼ(EC 3.4.17.11)、（ｘ）ペプチジル−ジペプチダーゼＡ(EC 3.4.15.1)、または（xi）ペプチジル−ジペプチダーゼ(EC 3.4.15.5)である。特異的に作用するエンド−またはエキソ−ペプチダーゼ酵素は有効量でタンパク性基質に添加される。タンパク質分解酵素はタンパク質加水分解過程で慣用される量で加えることができる。現在では有効量のエンド−ペプチダーゼは約0.05 〜約15CPU／100ｇの基質の範囲、特に約0.1〜約５CPU／100ｇの基質の範囲で、有効量のエキソ−ペプチダーゼは、約0.001〜約0.5AU／100ｇの基質の範囲、特に約0.01〜約0.1AU／100ｇの基質の範囲であると考えられる。酵素処理（インキュベート）は、酵素調製品が不活性にならない任意の手頃な温度、好ましくは約20℃〜約70℃の範囲で行うことができる。確立されたプラクティスにしたがって、酵素調製物は、酵素が不活性になる温度まで、たとえば約70℃より高く、インキュベート混合物の温度を上昇させるか、同様に酵素が不活性となる値まで、たとえば約4.0 未満まで、インキュベート混合物のpHを低下させることにより、適切に不活性化させることができる。非−特異的に作用するタンパク質分解性酵素より特異的な態様においては、本発明の方法はさらに（iii）基質を１または２以上の非−特異的に作用するエンド−及び／またはエキソ−ペプチダーゼ酵素の作用にかける、追加の工程を含む。この工程においては、基質は慣用の加水分解工程を受ける。この追加の工程は、（ｉ）及び（ii）の工程と同時に行なうことができるか、または工程（ｉ）及び（ii）に引き続いて達成できる。特に基質は工程（ｉ）及び（ii）の反応混合物であることができる。好ましい態様では、非−特異的に作用するエンド−及び／またはエキソ−ペプチダーゼ酵素は、アスペルギルス属の株、特にアスペルギルス・ニガー(niger) の株、アスペルギルス・オリザエの株、もしくはアスペルギルス・ソイエ(soyae )の株、またはバシラス属の株、特にバラシス・アミロリケファシエンス(amylol iquefaciens)の株、バシラス・レンツス（lentus）の株、バシラス・リヘニホルミスの株、もしくはバシラス・ズブチリスの株に由来する。非−特異的に作用するエンド−及び／またはエキソ−ペプチダーゼ酵素は約0. 05〜約15CPU/100ｇの基質の範囲の量で、特に約0.1〜約５CPU／100ｇの基質の範囲の量で基質に添加される。酵素処理（インキュベート）は、酵素調製品が不活性にならない任意の手頃な温度、好ましくは約20℃〜約70℃の範囲で行うことができる。確立されたプラクティスにしたがって、酵素調製品は、酵素が不活性になる温度まで、たとえば約70℃より高く、インキュベート混合物の温度を上昇させるか、同様に酵素が不活性となる値まで、たとえば約4.0 未満まで、インキュベート混合物のpHを低下させることにより、適切に不活性化させることができる。タンパク性基質本発明の方法にかけるタンパク性基質は完全なタンパク質からなるか、予備加水分解タンパク質（ペプチド）からなるか、またはこれらの混合物であってもよい。また、タンパク性基質は植物起原または動物起原であってもよい。好ましくは、前記タンパク性基質は植物起原のもので、特に大豆タンパク質、穀物タンパク質、たとえば、小麦グルテン、コーングルテン、大麦、ライムギ、エンバク、米、ゼイン、木綿種子タンパク質、セイヨウアブラナ種子タンパク質、ピーナッツ、アルファルファタンパク質、エンドウ豆タンパク質、マメ科の豆のタンパク質、ゴマ種子タンパク質またはひまわりであることができる。動物起原のタンパク性基質は、特に、ホエータンパク質、カゼイン、肉（meat ）タンパク質、魚タンパク質、赤血球、卵白身、ゼラチンまたはラクトアルブミンであることができる。産業上の用途本発明の方法で得られた、遊離グルタミン酸及び／またはペプチド結合グルタミン酸残基に富んだ加水分解物は種々の産業上の用途、特に機能的タンパク質の混和の必要のある用途に用いることができる。したがって、他の観点では、本発明は、本発明の方法により得られた遊離グルタミン酸及び／またはペプチド結合グルタミン酸残基に富む加水分解物を含む食品を提供する。さらに他の面では、本発明は、本発明の方法により得られた遊離グルタミン酸及び／またはペプチド結合グルタミン酸残基に富んだ加水分解物を含む動物飼料添加物を提供する。酵素活性のためのアッセイペプチドグルタミナーゼ活性ペプチドグルタミナーゼ活性はセドランゴロ他〔Cedrangoro他、「Enzymologi a」29，p.143、1965年〕の手順にしたがって及び米国特許第3,857,967号に記載のように測定できる。この方法にしたがって、１ＮのNaOHを用いてpH6.5に調整した、0.5mlの酵素試料を小さい容器に装填する。セドランゴロ他の手順にしたがって、放出されたアンモニアを５Ｎの硫酸に吸収させ、混合物をネスラー試薬で発色させ、形成された色の吸光係数を420mrで測定する。１PGアーゼ単位はこれらの条件下で１ｒモル／分のアンモニアを産生可能な酵素の量である。代りに、ペプチドグルタミナーゼ活性は下記の例２に記載の手順にしたがって測定できる。タンパク質分解活性：カゼインプロテアーゼ単位(CPU) タンパク質分解活性は基質としてカゼインを用いて測定することができる。１カゼインプロテアーゼ単位(CPU)は、標準条件下、すなわち、25℃でpH9.5で30分間のインキュベートにより、１分当り１mMの第１級アミノ基を遊離させる酵素の量（セリン標準との比較により決定する）と定義される。この分析法をより詳細に記載する印刷物AF 228/1はノボノルディスクＡ／Ｓ（デンマーク）に請求すれば入手でき、この印刷物を参照により本明細書に組み入れる。タンパク質分解活性：アンソン単位（AU）代りにタンパク質分解活性を基質として変性ヘモグロビンを用いて測定できる。タンパク質分解活性の測定のためのアンソン−ヘモグロビン法においては、ヘモグロビンを消化させ、未消化のヘモグロビンをトリクロル酢酸(T CA)を用いて沈澱させる。TCA溶解性生成物の量をフェノール試薬（チロシン及びトリプトファンに青色を示す）を用いて測定する。１アンソン単位（AU）は、標準条件（すなわち、25℃、pH7.5で10分の反応時間）下で、ヘモグロビンを、フェノール試薬で１ミリ当量のチロシンと同じ色を示す、TCA溶解性生成物の量を１分当りに遊離する初期速度で消化する酵素の量と定義される。この分析法をより詳細に記載する印刷物AF 4/5はノボノルディスクＡ／Ｓ（デンマーク）に請求すれば入手でき、この印刷物を参照により本明細書に包含させる。タンパク質分解活性：ロイシンアミノペプチダーゼ単位（LAPU）代替的にタンパク質分解活性を基質としてロイシン−ｐ−ニトロアニリドを用いて測定できる。加水分解すると、ｐ−ニトロアニリドが遊離され、溶液を黄色に変える。活性をｐ−ニトロアニリドを発色団として用いて測定し、生成された黄色を405nmで測光する。１ロイシンアミノペプチダーゼ単位（LAPU）は、次の条件、すなわち、基質として26mMのＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド、0.1ＭのTris緩衝液（pH8.0）、40℃、反応時間10分で、１分当り１μＭの基質を分解する酵素の量である。例本発明をさらに次の例で説明するが、この例は、請求の範囲の発明をいかなる風にも制限するものではない。例１脱アミド化により増大したタンパク質の溶解性及びグルタミン酸塩の遊離加水分解小麦グルテン（WG）をCargill（JOB5141）から得、脱アミド化小麦グルテン(D WG)をStaPro Consultancy B.V.(オランダ国9422 TH Smilde，Lemdijk 32)から得た。タンパク質８％の懸濁液を11ｇのグルテンと89ｇの水を混合することによって作った。NaOHでpHを6.5に調整した。国際特許出願公開91／13554号に記載のようにして得られる、グルタミン酸／アスパラギン酸特異的プロテアーゼ(SP446) または国際特許出願公開89／06270号に記載のようにして得られる、リシン／アルギニン特異的プロテアーゼ(SP387)を懸濁液に加えた。投与量はSP446については１ｇのタンパク質当り0.01AUで、SP387については１ｇのタンパク質当り0.006 AUであった。Flavourzyme(商標)(エンド−及びエキソ−ペプチド活性を含有し、アスペルギルス・オリザエの発酵により得られた、ノボノルディスクＡ／Ｓ，デンマーク、から入手できる、非−特異的に作用するプロテアーゼ調製品)を、１ｇのタンパク質当り20LAPUの投与量でいくつかの加水分解物に加えた。さらにpHを調整することなしに、50℃で18時間加熱分解を行なった。85℃で15分間加熱することにより酵素を不活性化した。pHを５に調整して、加水分解物を遠心分離した。上清中のタンパク質及び遊離グルタミン酸塩の量を測定した。タンパク質の測定タンパク質を6.25のキエルダール因子を用いてキエルダール分析により測定した。グルタミン酸塩の測定遊離グルタミン酸塩の量をグルタミン酸塩測定のためのベーリンガー・マンハイム・キット（カタログ番号：139092）を用いて測定した。この方法をミクロタイタープレートで用いるために適合させた。結果小麦グルテン（WG）を脱アミド化小麦グルテン(DWG)と比較すると、より多くのタンパク質が溶解性になるというように、脱アミド化はグルテンへの特異的プロテアーゼの感受性を増加させることを示している。特異的プロテアーゼのてっぺんにFlavourzyme(商標)を加えると、脱アミド化のため、グルタミン酸塩の遊離が２倍になる。例２酵素脱アミド化とグルタミン酸塩の遊離バシラス・サーキュランスの発酵 ATCC 21590株のバシラス・サーキュランス培養を、pH7.2に調整された、１％のポリペプトン、0.5％のラクトース、0.025％のMgSO₄・7H₂O、0.005％のFeSO₄ ・7H₂O、0.025％のKH₂PO₄及び17％のNa₂HPO₄・12H₂Oからなる、200mlの培地を含有する容量400mlの振とうフラスコ中で増殖させた。発酵を270rpmの撹拌を用いて30℃で20時間行なった。細胞を１ｌフラスコ中で4000rpmの遠心分離により収集した。細胞を凍結した。バシラス・サーキュランスからのペプチドグルタミナーゼの精製すべての工程を室温で行なった。凍結バシラス・サーキュランス細胞を融解させ、溶解緩衝液（50mMのTris／HC 1、25％（ｗ／ｖ）のスクロース、１mMのEDTA、pH8.0）中に、均質な懸濁液が得られるまで、懸濁させた。１ｌの溶解緩衝液当り100ｇの湿った細胞。Lysozyme( 商標)(Fluka 62971、10mg／ml)及びDNAse Ｉ(Sigma DN-25、10mg／ml)を溶解緩衝液に溶解した。１ｌの細胞懸濁液当り、100mlのLysozyme（商標）溶液、10ml の1.0Ｍ MgCl₂及び１mlのDNAse Ｉ溶液を加えた。酵素を１時間作用させた。懸濁液をザイツ深度ろ過プレートを通してろ過し、ろ液をSephadex G25カラム (Pharmacia)上の10mMのKH₂PO₄／NaOH、pH 8.0（緩衝液Ａ）に移した。酵素溶液を緩衝液Ａで平衡化したSOURCE Qカラム（Pharmacia）に適用し、緩衝液Ａ中の直線NaClグラジエント(０→500mM)で溶出させた。カラムからの分画を下記のようにペプチドグルタミナーゼについて分析し、活性のある分画を貯留した。280n mでの貯留した分画の吸収は1.78であった。したがって、タンパク質含量は1.8mg ／mlと推定された。ペプチドグルタミナーゼIIのプールにおけるタンパク質の純度は、SDS-PAGEゲルから判断すると約25％であった。したがって、調製物は１ml当り約0.5mgの純ペプチドグルタミナーゼIIを含有していた。ペプチドグルタミナーゼ検定法酵素活性をアンモニア測定のためのベーリンガー−マンハイムキット（カタログ番号1112732）を用いて、γ−カルボキシアミドのＮ−tert−ブトキシカルボニル（N-t-BOC-Gln-Pro，SIGMA No.B-4403）の加水分解の間に生成したアンモニアを測定することにより決定した。このキットでは、グルタミン酸デハイドロゲナーゼによるNADHの消費の測定によりアンモニアを測定し、N-t-BOC-Gln-Proを加えないブランクを他のNADH消費酵素の影響を引くためにも適用した。小麦グルテンの加水分解 200mgの小麦グルテンタンパク質を９mlの沸騰水に加え、冷却後、pHを7.0に調整した。次に250μｌの上記ペプチドグルタミナーゼII調製品(PEP)を加えた。例１からのグルタミン酸／アスパラギン酸特異的プロテアーゼ(SP446)を１ｇのタンパク質当り0.04AUの量で加え、例１からのFlavourzyme(商標)を１ｇのタンパク質当り20LAPUの量で加えた。加水分解はpHの調整なしで50℃で18時間続行した。ペプチドグルタミナーゼを添加しないブランクも作出した。加水分解物を遠心分離して、グルタミン酸塩を例１に記載のように測定した。小麦グルテンタンパク質の加水分解度（DH）を下記のように測定した。加水分解度（DH）の測定アドラ−ニッセン〔Adler-Nissen J「Enzymic Hydrolysis of Food proteins 」Elsevier Applied Science Publishers、1986年〕に記載のように定義されたタンパク質のDHを上清とOPA(オルト−フタル酸ジアルデヒド、Sigma)との反応により測定した。OPA試薬については、160mgのOPAを４mlのエタノールに溶解し、7 .62ｇのテトラホウ酸ジナトリウム・10水和物及び200mgのドデシル硫酸ナトリウム及び176mgのジチオスレイトールの溶液を含有する200mlの容量のフラスコに移し、そのフラスコをマークのところまで水を充てんした。試薬は光感受性である。 25μｌの適切に希釈された上清をミクロタイタープレートウェル中で200μｌのOPA試薬と混合し、25℃で正確に２分反応させた。 340nmでの吸収をミクロタイタープレート読取り機中で測定し、ブランク値(OPA−試薬と反応した水)の引き算の後で、95mMのＬ−セリン標準溶液の吸収と比較した。真のDHを見い出すために、前記上清中で測定したセリン当量を、前記のOPA法と同じ応答を与える、トリニトロベンゼンスルホン酸法〔Adler -Nissen J．「Agricultural and Food Chemistry」27(6)，p.1256、1979年〕のためにアドラー−ニッセンにより提案された因子で修正した。加水分解度を加水分解混合物中のタンパク質の合計量を基準として（溶解性タンパク質基準ではなく）計算した。結果表から分かるように、ペプチドグルタミナーゼ調整品を用いる加水分解はDH並びにグルタミン酸塩の遊離を増加させる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．タンパク性基質から、グルタミン酸及び／またはペプチド結合グルタミン酸残基に富んだ加水分解物を得る方法であって、（ｉ）前記基質を脱アミド化過程にかける工程、及び（ii）前記基質を特異的に作用するタンパク質分解性酵素の作用にかける工程を含む前記方法。２．前記脱アミド化過程を非−酵素脱アミド化として実施する請求項１に記載の方法。３．前記脱アミド化過程を酵素脱アミド化として実施する請求項１に記載の方法。４．前記脱アミド化過程を、前記基質をトランスグルタミナーゼの作用にかけることにより実施する請求項３に記載の方法。５．前記トランスグルタミナーゼが、フィトフトラ属の株、特にフィトフトラ・カクトルム、ピチウム属の株、特にピチウム・イレギュラレ、ピチウム種、ピチウム・インターメディウム、ピチウム・ウルチム及びピチウム・ペリールム（またはピチウム・ペリプロクム）を包含する、卵菌類に由来するものである請求項５に記載の方法。６．前記トランスグルタミナーゼが細菌起原のものであって、好ましくは、バシラス属の株、特にバシラス・ズブチリス、ストレプトベルチシリウム属の株、特にストレプトベルチシリウム・モバラエンシス、ストレプトベルチシリウム・グリセオカルネウム及びストレプトベルチシリウム・シナモネウム並びにストレプトミセス属の株、特にストレプトミセス・リディクス由来のものである請求項５に記載の方法。７．前記酵素脱アミド化過程を前記基質をペプチドグルタミナーゼの作用にかけることにより実施する請求項３に記載の方法。８．前記ペプチドグルタミナーゼがペプチドグルタミナーゼＩ(ペプチジル− グルタミナーゼ、EC 3.5.1.43)またはペプチドグルタミナーゼII(タンパク質− グルタミングルタミナーゼ、EC 3.5.1.44)またはこれらの混合物である請求項７に記載の方法。９．前記ペプチドグルタミナーゼが、アスペルギルス属の株、特にアスペルギルス・ジャポニクスの株、バシラス属の株、特にバシラス・サーキュランスの株、クリプトコッカス属の株、特にクリプトコッカス・アルビダスの株またはデバリオミセス属の株、特にデバリオミセス・クロエヘリの株由来のものである請求項７または８のいずれかに記載の方法。 10．前記ペプチドグルタミナーゼを基質に、100ｇの基質当り約0.01〜約100.0 00PGアーゼ単位の範囲、特に100ｇの基質当り約0.1〜約10.000PGアーゼ単位の範囲の量で加えるものである請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。 11．前記特異的に作用するタンパク質分解性酵素がエンド−ペプチダーゼ、たとえば、（ｉ）グルタミルエンドペプチダーゼ（EC 3.4.21.19）、（ii）リシルエンドペプチダーゼ（EC 3.4.21.50）、（iii）ロイシルエンドペプチダーゼ（EC 3.4.21.57）、（iv）グリシルエンドペプチダーゼ（EC 3.4.22.25）、（ｖ）プロリルエンドペプチダーゼ（EC 3.4.21.26）、（vi）トリプシン(EC 3.4.21.4)またはトリプシン様（リシン／アルギニン特異的）エンドペプチダーゼ、または（vi）ペプチジル−Aspメタロエンドペプチダーゼ（EC 3.4.24.33）である、請求項1〜10のいずれか１項に記載の方法。 12．前記（ｉ）のグルタミルエンドペプチダーゼが、バシラス属の株、特にバシラス・リヘニホルミス及びバシラス・ズブチリス、スタフィロコッカス属の株、特にスタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトミセス属の株、特にストレプトミセス・テルモブルガリス及びストレプトミセス・グリセウスまたはアクチノミセス種の株由来のものである請求項11に記載の方法。 13．前記（ii）のリシルエンドペプチダーゼが、アクロモバクター属の株、特にアクロモバクター・リチクス、リゾバクター属の株、特にリゾバクター・エンチモジェネスまたはシュードモナス属の株、特にシュードモナス・エルギノサ由来のものである請求項11に記載の方法。 14．前記（iv）のグリシルエンドペプチダーゼが、パパイア植物（カリカ・パパイア）由来のものである請求項11に記載の方法。 15．前記（ｖ）のプロリルエンドペプチダーゼがフラボバクテリウム属の株由来のものである請求項11に記載の方法。 16．前記（vi）のトリプシン様エンドペプチダーゼがフザリウム属の株、特にフザリウム・オキシスポルム由来のものである請求項11に記載の方法。 17．前記（vii）のペプチジル−Aspメタロエンドペプチダーゼ（EC 3.4.24.33 ）がシュードモナス属の株、特にシュードモナス・フラジ由来のものである請求項11に記載の方法。 18．前記特異的に作用するタンパク質分解酵素がエキソ−ペプチダーゼ酵素である請求項１−16のいずれか１項に記載の方法。 19．前記エキソ−ペプチダーゼがアミノペプチダーゼ、たとえば、（ｉ）ロイシルアミノペプチダーゼ(EC 3.4.11.1)または（ii）トリペプチドアミノペプチダーゼ(EC 3.4.11.4)である請求項17に記載の方法。 20．前記エキソ−ペプチダーゼが、カルボキシペプチダーゼ、たとえば、（ｉ）プロリンカルボキシペプチダーゼ(EC 3.4.16.2)、（ii）カルボキシペプチダーゼＡ(EC 3.4.17.1)、（iii）カルボキシペプチダーゼＢ(EC 3.4.17.2)、（iv）カルボキシペプチダーゼＣ(EC 3.4.16.5)、（ｖ）カルボキシペプチダーゼＤ(EC 3.4.16.6)、（vi）リシン（アルギニン）カルボキシペプチダーゼ(EC 3.4.17.3)、（vii）グリシンカルボキシペプチダーゼ(EC 3.4.17.4)、（viii）アラニンカルボキシペプチダーゼ(EC 3.4.17.6)、（ix）グルタメートカルボキシペプチダーゼ(EC 3.4.17.11)、（ｘ）ペプチジル−ジペプチダーゼＡ(EC 3.4.15.1)、または（xi）ペプチジル−ジペプチダーゼ(EC 3.4.15.5)である請求項17に記載の方法。 21．タンパク性基質からグルタミン酸に富んだ加水分解物を得る、請求項７〜 10のいずれか１項に記載の方法であって、（ｉ）前記基質をペプチドグルタミナーゼの作用にかける工程、及び（ii）前記基質を優先的にグルタモイル−ペプチド結合を開裂するタンパク質分解酵素（すなわち、グルタミルエンドペプチダーゼ、EC 3.4.21.19）の作用にかける工程、を含む前記方法。 22．前記特異的に作用するタンパク質分解酵素を100ｇの基質当り約0.05〜約1 5CPUの範囲、特に100ｇの基質当り約0.1〜約５CP Uの範囲の量で前記基質に加える請求項１〜21のいずれか１項に記載の方法。 23．請求項１の工程（ｉ）及び工程（ii）を同時に達成する請求項１〜22のいずれか１項に記載の方法。 24．請求項１の工程（ii）を請求項１の工程（ｉ）に続いて達成する請求項１〜22のいずれか１項に記載の方法。 25．請求項１〜24のいずれか１項に記載の方法であって、（iii）前記基質を１または２以上の非−特異的に作用するエンド−及び／またはエキソ−ペプチダーゼ酵素の作用にかける追加の工程を含む前記方法。 26．工程（ｉ），（ii）及び（iii）を同時に達成する請求項25に記載の方法。 27．工程（iii）を工程（ｉ）〜（ii）に連続して達成する請求項25に記載の方法。 28．工程（iii）の非−特異的に作用するエンド−及び／またはエキソ−ペプチダーゼ酵素が、アスペルギルス属の株、特にアスペルギルス・ニガーの株、アスペルギルス・オリザエの株もしくはアスペルギルス・ソイエの株、またはバシラス属の株、特にバラシス・アミロリケファシエンスの株、バシラス・レンツスの株、バシラス・リヘニホルミスの株もしくはバシラス・ズブチリスの株由来のものである請求項25〜27のいずれか１項に記載の方法。 29．前記非−特異的に作用するエンド−及び／またはエキソ−ペプチダーゼ酵素を100ｇの基質当り約0.05〜約15CPUの範囲、特に100ｇの基質当り約0.1〜約５ CPUの範囲の量で、または100ｇの基質当り約0.001〜約0.5AUの範囲、特に100ｇの基質当り約0.01〜約0.1AUの範囲の量で前記基質に加える請求項25〜28のいずれか１項に記載の方法。 30．前記タンパク性基質が植物起原のものであって、特に大豆タンパク質、穀物タンパク質、たとえば、小麦グルテン、コーングルテン、大麦、ライムギ、エンバク、米、ゼイン、木綿種子タンパク質、セイヨウアブラナ種子タンパク質、ピーナッツ、アルファルファタンパク質、エンドウ豆タンパク質、マメ科の豆のタンパク質、ゴマ種子タンパク質またはひまわりである請求項１〜29のいずれか１項に記載の方法。 31．前記タンパク性基質が、動物起原のものであって特に、ホエータンパク質、カゼイン、肉タンパク質、魚タンパク質、赤血球、卵白身、ゼラチンまたはラクトアルブミンである請求項１〜29のいずれか１項に記載の方法。 32．請求項１〜31のいずれか１項に記載の方法によって得られた、遊離グルタミン酸及び／またはペプチド結合グルタミン酸残基に富んだ加水分解物を含む食品。 33．請求項１〜31のいずれか１項に記載の方法によって得られた、遊離グルタミン酸及び／またはペプチド結合グルタミン酸残基に富んだ加水分解物を含む動物飼料添加剤。