ITUD20080055A1 - Procedimento per la produzione di una proteina umana in pianta, in particolare un enzima lisosomiale umano ricombinante in endosperma di cereali - Google Patents
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Description
"PROCEDIMENTO PER LA PRODUZIONE DI UNA PROTEINA UMANA IN PIANTA, IN PARTICOLARE UN ENZIMA LISOSOMIALE UMANO RICOMBINANTE IN ENDOSPERMA DI CEREALI"
CAMPO DI APPLICAZIONE
Il presente trovato riguarda la produzione di una proteina umana, in particolare dell'enzima lisosomiale umano ricombinante beta-glucosidasi acida (EC 3.2.1.45) attraverso trasformazione e modificazione genetica di piante, in particolare di specie cereali. La specie su cui si applica in via preferenziale detta invenzione è Oryza sativa L. (riso coltivato) per la possibilità di attuare una lavorazione industriale del seme con allontanamento del germe ed eliminazione dello strato aleuronico contenente numerose proteine contaminanti .
La medesima tecnologia può essere utilizzata per l'espressione endosperma-specifica di altri enzimi lisosomiali umani la cui assenza o incompleta funzionalità genera stati patologici
STATO DELLA TECNICA
Le malattie rare sono un gruppo eterogeneo di patologie accomunate dalla bassa incidenza e prevalenza nella popolazione.
Esse manifestano un decorso cronico e conseguenze gravemente invalidanti, determinando non di rado la morte dei pazienti.
Tra le malattie rare rientrano le malattie lisosomiali, causate dal deficit di specifici enzimi lisosomiali, o proteine carrier.
Più in particolare, nella classe delle malattie lisosomiali ricadono le seguenti sfingolipidosi: malattia di Gaucher, glicogenosi 2, malattia di Fabry, malattia di Niemann-Pick B, Mucopolisaccaridosi I, II, IV.
Un approccio terapeutico condiviso in campo medico è quello della terapia enzimatica di sostituzione. Ad esempio la terapia enzimatica sostitutiva della malattia di Gaucher si fonda sulla regolare somministrazione al paziente di beta-glucosidasi acida umana. Si ha, tuttavia, un elevato costo della terapia e una difficoltà di accesso al farmaco da parte di tutti i pazienti. Ciò a causa delle difficoltà di produzione della beta-glucosidasi acida umana, solitamente tramite linee cellulari umane o mammifere.
Le piante geneticamente modificate possono costituire una soluzione alternativa alle linee cellulari umane o mammifere nella produzione di enzimi lisosomiali, in particolare beta-glucosidasi acida umana ricombinante, anche dal punto di vista strettamente economico poiché la loro coltivazione richiede materiali di consumo poco costosi e l'impiego di infrastrutture agricole già esistenti sul territorio.
In WO-A-97/10353 (WO'353) è descritta la sintesi di enzimi lisosomiali, tra cui beta-glucosidasi acida umana, esclusivamente in foglia e, in particolare, in foglie di specie da biomassa, quali il tabacco (Nicotiana tabacum L.).
Tuttavia, WO'353 presenta inconvenienti legati all'elevato contenuto in acqua dei tessuti fogliari e alla presenza di un numero elevato di proteine contaminanti, nonché di polifenoli, gomme, essudati, alcaloidi tossici, che contribuiscono, assieme all'elevata dispersione della proteina ricombinante, a complicare i processi di estrazione e purificazione. Inoltre, si possono avere fenomeni di fitotossicità dovuti a un'alterazione del normale metabolismo cellulare, che si manifestano talvolta in modo inatteso e non possono essere risolti in maniera prevedibile
In WO'353, l'espressione di beta-glucosidasi acida segue la trasformazione di tabacco con vettori di espressione contenenti il promotore MeGA (inducibile da ferita, derivato dal promotore HMG2 di pomodoro) o, alternativamente, il promotore CaMV35S (dal virus del mosaico del cavolfiore); quest'ultimo è un elemento di controllo della trascrizione genica di tipo costitutivo, molto noto e utilizzato in campo vegetale, oltre che rappresentativo di promotori costitutivi diversi.
In WO'353, oltre ai promotori esemplificati, i promotori utilizzati possono essere costitutivi o inducibili .
Per quanto riguarda i promotori inducibili da ferita, in WO'353 essi hanno un impiego esclusivo in foglia e le piante devono essere preventivamente ferite per realizzare l'espressione di beta-glucosidasi acida. Ciò comporta un aggravio dei costi, maggiori difficoltà di gestione del processo produttivo, la degradazione parziale dell'enzima a seguito della liberazione di proteinasi normalmente confinate nel vacuolo o in altri compartimenti cellulari, nonché la possibilità di contaminazioni aggiuntive del materiale ferito con batteri e funghi.
I promotori indotti dalla luce di WO'353 non risultano efficacemente espressi in tessuti diversi dal mesofillo fogliare, come ad esempio in seme, in particolare nei semi di piante cereali, per la mancanza di radiazione luminosa trasmessa e/o per la mancanza di fattori di trascrizione presenti invece nei classici tessuti fotosintetizzanti.
In relazione ai promotori costitutivi, tutti gli esempi sono forniti utilizzando CaMV35S, anche a motivo della sua rappresentatività. Tuttavia, esperimenti hanno dimostrato che nel seme l'efficienza di trascrizione determinata da CaMV35S è marginalmente bassa, al punto da escludere qualunque interesse al suo impiego nella sintesi di proteine eterologhe. Tale affermazione è ancor più valida nel caso di piante monocotiledoni come i cereali, dove tale promotore appare in generale meno adatto a dirigere elevati livelli di espressione genica anche nei tessuti fogliari di elezione.
Nella domanda di brevetto WO-A-03/073839 (WO'839) è stato riportato che il gene codificante una betaglucosidasi mutata posto sotto il controllo del promotore CaMV35S non viene espresso in seme a livelli tali da rendere rilevabile la proteina in saggi immunologici condotti con un anticorpo specifico. Pertan to, è possibile concludere, in analogia con quanto affermato in WO'839, che WO'353 non fornisce in realtà insegnamenti su come effettuare la produzione di beta-glucosidasi acida umana, né di altri enzimi lisosomiali in tessuti diversi dal mesofillo fogliare e, più specificatamente, nel seme.
Va inoltre rilevato che, da successivi esperimenti (Reggi et al. 2005, Plant Molec Biol 57:101-113), gli insegnamenti di WO'353 per la produzione di betaglucosidasi acida in foglie di tabacco consentono solo l'ottenimento di ridotti quantitativi di enzima, tali da escludere un reale interesse a livello industriale. Peraltro, da WO'353 la quantità di enzima purificabile dalla biomassa fogliare è bassa, qualora espressa in termini di attività enzimatica, suggerendo l'esistenza di limiti nella tecnologia di produzione fondata sull'espressione in foglia, in particolare con sistemi di tipo costitutivo.
In WO'839 si afferma che la produzione di enzimi lisosomiali è possibile in seme e che i livelli di espressione ottenibili sono tali da rendere economicamente conveniente il sistema. Si afferma inoltre che gli enzimi vengono accumulati nell'apoplasto, il che garantirebbe la loro stabilità nel lungo termine a causa dei valori subacidi di pH.
Tuttavia, in WO'839 non sono presenti insegnamenti per la produzione di enzimi lisosomiali, e in particolare della beta-glucosidasi acida, in seme di piante monocotiledoni, né per eludere, attenuare o superare le problematiche connesse, e le limitazioni conseguenti, alla espressione tissutale e alla localizzazione subcellulare di detti enzimi, e in particolare della beta-glucosidasi acida, all'interno del seme, non essendo note o, alternativamente, essendo state trascurate tali problematiche.
Infatti, in WO'839 gli esempi forniti relativamente alla costruzione di vettori di espressione di enzimi lisosomiali riportano sempre l'impiego di promotori per proteine di riserva di piante dicotiledoni. Gli esempi riguardanti l'effettiva espressione di enzimi lisosomiali sono limitati a una beta-glucosidasi acida umana modificata e la pianta ospite utilizzata è sempre il tabacco (Nicotiana tabacum L.).
Nella descrizione di WO'839, non viene fatto alcun accenno a effetti fitotossici derivanti alle piante di tabacco trasformate e/o alle loro progenie dall'accumulo di beta-glucosidasi acida nel seme sicché il procedimento potrebbe sembrare efficace nel fornire una soluzione ai problemi produttivi di tali enzimi e, specificatamente, della beta-glucosidasi acida. Tuttavia, esperimenti successivi condotti sul seme di piante di tabacco trasformate proprio con il costrutto citato in WO'839 hanno svelato che l'accumulo di beta-glucosidasi ha importanti ripercussioni sulla capacità di germinazione del seme medesimo. In particolare, è stato dimostrato che, già a concentrazioni dell'enzima prossime a 200 U/kg di seme (1 U=quantità di enzima in grado di demolire 1 μΜ 4-metilumbelliferil beta-D-glucopiranoside in 1 minuto a 37 °C, pH 5.9), si manifestano anomalie riproduttive dovute a scarsa germinazione e forte riduzione dell'energia germinativa. Inoltre, concentrazioni superiori a 500 U/kg di seme si riflettono in una perdita totale di germinabilità.
In esperimenti successivi eseguiti dalla Richiedente, è emerso che la germinabilità del seme di tabacco trasformato con il costrutto citato in WO'839 non può essere restaurata in alcun modo noto.
Ulteriori indagini condotte al microscopio elettronico a trasmissione hanno consentito di accertare una disorganizzazione e destrutturazione del sistema cellulare di membrane nel seme non germinabile, confermando l'impossibilità di ottenimento di una progenie vitale dalle linee transgeniche utilizzabili a livello industriale per la produzione dell'enzima. Sempre attraverso microscopia elettronica a trasmissione è stato verificato che il sito di deposizione della beta-glucosidasi ricombinante ottenibile con il costrutto descritto in WO'839 non corrisponde in realtà a quello atteso in WO'839 (spazio apoplastico) ma ai vacuoli di riserva proteica interni alle cellule parenchimatiche dell'embrione.
Anche la domanda di brevetto WO-A-00/04146 (WO'146), che descrive l'espressione di lattoferrina umana ma anche di proteine con attività generalmente enzimatica nel seme, è in realtà silente per ciò che concerne la produzione di enzimi funzionalmente attivi, ancor più di enzimi lisosomiali.
In WO'146 non viene fornito alcun dato a supporto della validità del procedimento esposto per la produzione di enzimi ed in esso, non essendo diretto alla produzione di proteine enzimatiche, sono trascurati problemi di fondamentale rilievo relativi alla loro stabilità, conformazione e funzionalità.
In generale, benché in linea teorica le piante necessarie alla produzione dei quantitativi di seme necessari alla estrazione e purificazione industriale dell'enzima possano essere ottenute attraverso micropropagazione in vitro di piante elite, il ricorso a tale sistema è imprescindibilmente connesso a notevoli difficoltà di gestione del processo produttivo per la necessità di garantirsi l'approvvigionamento di un gran numero di piante da mettere a dimora in un tempo relativamente breve. Per programmare una produzione di 600 q di seme di tabacco transgenico teoricamente necessario al soddisfacimento della domanda nazionale di enzima, sarebbe necessario un investimento in superficie almeno pari a 150 ettari, ma soprattutto la produzione in vitro, 1'abituazione in serra e il trapianto di almeno 9 milioni di piantine, una situazione ben diversa da un punto di vista organizzativo ed economico dalla semina diretta a spaglio o a file ravvicinate della linea di tabacco transgenica; quest 'ultima operazione, effettuabile solo con seme normalmente germinabile, garantirebbe non solo un sensibile risparmio in termini di costi diretti e di gestione ma consentirebbe anche una produzione di seme per unità di superficie superiore di 4-6 volte e ciò a motivo della maggiore densità delle piante. Ottenere, mediante trapianto, densità di impianto simili a quelle realizzate con la semina diretta non è concepibile, poiché il costo di ciascuna pianta trapiantata sarebbe ancor meno remunerato in termini produttivi: esiste infatti una relazione di proporzionalità inversa tra produzione per pianta e numero di piante per unità di superficie. Dal lato dei costi di micropropagazione, va rilevato che ciascuna pianta dovrebbe essere lavorata singolarmente e manualmente e questo fatto, unito alla scarsissima quantità di seme (pochi grammi) prodotta da ciascuna pianta di tabacco ridurrebbe di fatto in modo drastico i benefici derivanti dall'impiego di piante come organismi ospite per la produzione di enzimi lisosomiali.
Scopo del presente trovato è mettere a punto un procedimento per la produzione di una proteina umana in pianta, in particolare in pianta monocotiledone, in particolare di un enzima lisosomiale umano ricombinante in endosperma di cereali che superi gli inconvenienti di cui alla tecnica nota, in particolare che:
- consenta un'efficace espressione tissutale e localizzazione subcellulare di detti enzimi, e in particolare della beta-glucosidasi acida, all'interno del seme;
- agevoli i processi di estrazione e purificazione; - elimini il rischio di fenomeni di fitotossicità; - mantenga un'efficace germinabilità del seme;
- abbia costi ridotti;
- abbia maggiore facilità di gestione del processo produttivo
elimini il rischio di degradazione parziale dell'enzima e di contaminazioni con batteri e funghi. Per ovviare agli inconvenienti della tecnica nota e per ottenere questi ed ulteriori scopi e vantaggi, la Richiedente ha studiato, sperimentato e realizzato il presente trovato.
ESPOSIZIONE DEL TROVATO
Il presente trovato è espresso e caratterizzato nelle rivendicazioni indipendenti.
Le relative rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristiche del presente trovato o varianti dell'idea di soluzione principale.
In accordo con i suddetti scopi, un procedimento per la produzione di una proteina umana in pianta, in particolare un enzima lisosomiale umano ricombinante in endosperma di pianta, comprende:
- una prima fase di trasformazione delle piante mediante la quale realizzare il confinamento della proteina in un endosperma non assorbito dall'embrione e permettere che la presenza di elevati quantitativi della proteina nell'endosperma del seme non determini effetti negativi sulla germinabilità e sull'energia germinativa del seme;
- l'utilizzazione, nella prima fase di trasformazione delle piante, di un promotore endosperma specifico a monte del gene codificante detta proteina e di un peptide segnale per l'invio cotraduzionale della proteina nascente nel lume del reticolo endoplasmico delle cellule componenti il tessuto dell'endosperma e per il suo accumulo tissutale;
una seconda fase d'accumulo della proteina all'interno dell'endosperma del seme delle piante. Il presente trovato permette, così, di accumulare proteine eterologhe in tessuti di riserva esterni all'embrione del seme.
Inoltre, con il presente trovato si ha la possibilità di accumulare proteine con elevato potenziale fitotossico/destrutturante in tessuti di riserva esterni all'embrione del seme che al termine dello sviluppo intraprendono spontaneamente un processo di morte cellulare programmata.
Ulteriormente, si può accumulare proteine potenzialmente dannose in tessuti di riserva non vitali che vengono investiti da un'intensa attività degradativa di tipo idrolitico che subentra all'atto della imbibizione e germinazione del seme.
Tali proteine potenzialmente dannose possono essere accumulate all'interno dei vacuoli di riserva proteica o dei corpi proteici senza che dette proteine vengano necessariamente in contatto o debbano attraversare la membrana cellulare.
Il presente trovato permette di produrre esattamente la sequenza amminoacidica desiderata anziché varianti non autentiche della medesima caratterizzate dalla presenza di residui amminoacidici aggiuntivi inutili e per ciò stesso potenzialmente dannosi in termini di localizzazione, stabilità, attività biologica e, non ultimo, impiego della proteina per scopi terapeutici .
Vantaggiosamente, la proteina prodotta viene accumulata nell'endosperma all'interno dei vacuoli di riserva proteica (Protein Storage Vacuoles, PSV) o nei corpi proteici (Protein Bodies, PB).
Poiché l'estraibilità delle proteine dai PSV e dai PB mostra differenze di poco conto, la localizzazione dell'enzima nell'uno o nell'altro compartimento subcellulare è indifferente ai fini del presente trovato.
Una forma d'esecuzione del presente trovato prevede di realizzare un vettore di espressione in pianta per la trasformazione di dette piante, comprendente una sequenza nucleotidica contenente i seguenti elementi: i) un promotore endosperma-specifico di origine naturale o artificiale;
ii) una regione 5' UTR di origine naturale o artificiale;
iii) una sequenza nucleotidica di origine naturale o artificiale codificante un peptide segnale per l'invio della proteina ricombinante all'interno del lume del reticolo endoplasmico delle cellule componenti il tessuto dell'endosperma e per il suo accumulo tissutale;
iv) una sequenza nucleotidica di origine naturale o artificiale codificante la forma matura della proteina umana;
v) una regione 3' UTR di origine naturale o artificiale;
e prevede di impiegare il vettore d'espressione così realizzato per la trasformazione delle piante.
Vantaggiosamente, la sequenza nucleotidica contenuta nel vettore d'espressione è come indicata in SEQ ID NO: 1.
Secondo una forma d'esecuzione, il vettore d'espressione viene introdotto in ceppi batterici, i quali sono utilizzati, direttamente od indirettamente, per la trasformazione delle piante.
Vantaggiosamente, il ceppo batterico è scelto in un gruppo comprendente le specie Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes.
Preferibilmente, le piante trasformate sono cereaSecondo una forma realizzativa preferita, il ceppo batterico viene utilizzato per la trasformazione di calli embriogenici di riso (Oryza sativa ssp. japonica, varietà CR W3).
Secondo una variante vantaggiosa, l'enzima lisosomiale è la beta-glucosidasi acida umana.
Secondo un'altra variante, l'enzima lisosomiale è 1 'alfa-glucosidasi acida umana.
Infatti, il presente trovato è egualmente efficace nella sintesi, estrazione e purificazione di quantità significative del precursore dell'alfa-glucosidasi acida umana, la quale ha massa, struttura e funzione nettamente diversa da quelle della beta-glucosidasi acida.
In accordo con una forma d'esecuzione, il presente trovato comprende una terza fase di lavorazione industriale del seme delle piante.
Secondo una soluzione, la lavorazione industriale prevede di sottoporre i semi maturi raccolti dalle piante di cereali trasformate ad operazioni di sbramatura e sbiancatura per l'allontanamento della componente fibrosa, del germe, e dello strato aleuronico contenente proteine contaminanti .
In accordo con una forma d'esecuzione ulteriore, il presente trovato comprende una quarta fase di purificazione della proteina ottenuta.
La fase di purificazione prevede nell'ordine una cromatografia a interazioni idrofobiche, una cromatografia a scambio ionico e una gel-filtrazione.
La fase di purificazione può prevedere, inoltre, in alternativa od aggiunta, l'applicazione di resine cromatografiche affini per composizione chimica e/o struttura e/o funzione, di parziale modificazione dei parametri di eluizione, di duplicazione di un passaggio per ricarico dell'eluato in colonna.
Con il presente trovato l'enzima viene completamente purificato in quantitativi facilmente superiori a 100 U/kg di seme, fino anche a 500 U/Kg di seme.
Inoltre, l'enzima prodotto è spiccatamente attivo, non porta delezioni, addizioni o sostituzioni amminoacidiche, risultando in ciò identico alla controparte nativa umana.
Inoltre, tale enzima non determina alcuna alterazione della germinabilità o della energia germinativa del seme.
La cassetta molecolare di espressione con cui si realizza la produzione dell'enzima viene normalmente ereditata dalla progenie e, al pari di un qualsiasi fattore mendeliano, può essere portata in omozigosi od essere trasferita per incrocio ad altre linee trasformate, ottenendo in entrambi i casi un ulteriore aumento della produttività.
Il procedimento oggetto del presente trovato, contrariamente alle tecniche note nello stato dell'arte, è evidentemente innovativo e vantaggioso in quanto consente di ottenere linee transgeniche, ad esempio di riso, in grado di produrre quantità industrialmente rilevanti di beta-glucosidasi acida umana senza per questo manifestare alcuna alterazione del normale fenotipo, a livello tanto macroscopico quanto microscopico, e in particolare alcuna anomalia riproduttiva o alterazione della capacità germinativa del seme, anche a concentrazioni superiori a 500 U/Kg di seme; di estrarre e purificare detto enzima in forma pienamente attiva, mantenendo inalterata l'identità della sequenza amminoacidica rispetto alla controparte nativa umana.
Rientra nel presente trovato una sequenza nucleotidica atta all'utilizzo per la trasformazione di una pianta per l'espressione di una proteina umana in pianta, in particolare un enzima lisosomiale umano ricombinante in endosperma di pianta, che comprende i seguenti elementi:
i) un promotore endosperma-specifico di origine naturale o artificiale;
ii) una regione 5' UTR di origine naturale o artificiale;
iii) una sequenza nucleotidica di origine naturale o artificiale codificante un peptide segnale per l'invio della proteina ricombinante all'interno del lume del reticolo endoplasmico delle cellule componenti il tessuto dell'endosperma e per il suo accumulo tessutale;
iv) una sequenza nucleotidica di origine naturale o artificiale codificante la forma matura della proteina umana;
v) una regione 3' UTR di origine naturale o artificiale .
Secondo una forma realizzativa, il promotore i) è il promotore della gluteiina 4 di riso (GluB4), la cui sequenza è indicata in SEQ ID NO: 2.
Secondo una forma realizzativa vantaggiosa, la regione 5' UTR ii) è la sequenza 5' UTR nota come LL-TCK, riportata nella domanda di brevetto internazionale PCT/EP2007/064590 ed indicata in SEQ ID NO: 3.
In accordo con un ulteriore forma realizzativa, la sequenza nucleotidica dell'elemento iii) è la sequenza PSGluB4, come indicata in SEQ ID NO: 4, codificante il peptide segnale utilizzato in riso per veicolare il precursore della gluteiina 4 all'interno del reticolo endoplasmico.
Secondo un'altra realizzazione, la sequenza nucleotidica dell'elemento iv) è la sequenza GCase codificante la forma umana matura della beta-glucosidasi acida, come indicata in SEQ ID NO: 5.
In accordo con una realizzazione vantaggiosa del trovato, la regione 3' UTR dell'elemento v) è il terminatone NOS, la cui sequenza è indicata in come indicata in SEQ ID NO: 6. Alternativamente, si può impiegare il terminatore del gene Glub4.
Tipicamente, la sequenza nucleotidica complessiva della cassetta d'espressione è come indicata in SEQ ID NO: 1.
Rientrano nel presente trovato le sequenze complementari alle sequenze nucleotidiche sopra espresse.
Rientrano nel presente trovato le sequenze derivanti da processi di mutazione, quali delezioni, inserzioni, transizioni, trasversioni di uno o più nucleotidi delle sequenze sopra espresse o delle sequenze ad esse complementari.
Rientrano nel presente trovato le combinazioni delle sequenze nucleotidiche sopra espresse codificanti la forma matura della beta-glucosidasi acida umana con elementi promotore, sequenze per l'invio nel reticolo endoplasmico e regioni non tradotte in 5' e 3' diverse da quelle presenti nella sequenza come indicata in SEQ ID NO: 1, adatte a ottenere la sintesi e l'accumulo dell'enzima specificamente nell'endosperma del seme o con sequenze nucleotidiche complementari a dette sequenze.
Fanno parte del presente trovato anche la combinazioni degli elementi i), ii), iii), iv) e v) come sopra espressi, con sequenze codificanti l'enzima maturo diverse da quella riportata nella sequenza come indicata in SEQ ID NO: 1 per la presenza di mutazioni sinonime o polimorfismi rinvenibili all'interno della specie umana o combinazioni realizzate con sequenze nucleotidiche complementari a dette sequenze.
Inoltre, rientrano nell'ambito del presente trovato anche la combinazioni degli elementi di sequenze nucleotidiche i), ii), iii), iv) e v) come sopra espressi con sequenze codificanti le forme mature o i precursori di altri enzimi lisosomiali, o combinazioni realizzate con sequenze nucleotidiche complementari a dette sequenze.
Inoltre, fanno parte del presente trovato anche le combinazioni sopra espresse, in cui l'enzima è 1'alfa-glucosidasi acida umana.
Fa parte del presente trovato anche una sequenza come sopra espressa, in cui le piante trasformate sono cereali.
Rientra nel presente trovato un vettore molecolare di espressione di proteina umana in pianta, in particolare di un enzima lisosomiale umano in endosperma di pianta, comprendente la suddetta sequenza nucleotidica. Tipicamente, il vettore molecolare d'espressione è un plasmide.
Secondo una soluzione vantaggiosa, l'enzima lisosomiale è la beta-glucosidasi acida umana.
Alternativamente, l'enzima lisosomiale è l'alfaglucosidasi acida umana.
Rientra nel presente trovato anche l'uso del vettore d'espressione come sopra indicato per la trasformazione di una pianta per la produzione di una proteina, in particolare un enzima lisosomiale umano. Rientra nel presente trovato anche un ceppo batterico comprendente vettori di espressione sopra descritti .
Vantaggiosamente, tale ceppo batterico può essere scelto in un gruppo comprendente le specie Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes.
Fanno parte del presente trovato anche cellule vegetali trasformate con vettori di espressione come sopra descritti.
Secondo una soluzione del trovato, tali cellule sono cellule di cereali, preferibilmente appartenenti alla specie del riso coltivato (Oryza sativa L.). Si ha preferenza per le varietà di riso inadatte all'impiego alimentare.
Rientra nel trovato, così, l'utilizzo di tipi waxy, sfruttati industrialmente per l'estrazione e la produzione d'amido e suoi derivati.
Alternativamente, le cellule sono appartenenti alla famiglia delle Graminaceae (Poaceae) quali ad esempio mais (Zea mays L.), orzo (Hordeum vulgare L.) e frumento (Triticum spp.).
Fa parte del presente trovato anche un seme di pianta trasformata per l'espressione di una proteina umana, in particolare un enzima lisosomiale umano, che contiene un vettore di espressione come sopra descritto.
Secondo una soluzione del trovato, il seme è di una pianta trasformata appartenente ai cereali, preferibilmente la pianta trasformata è appartenente alla specie del riso coltivato (Oryza sativa L.).
Rientra nell'ambito di tutela del presente trovato anche una pianta trasformata per l'espressione di una proteina umana, in particolare un enzima lisosomiale umano, la quale viene trasformata mediante un vettore di espressione come sopra descritto.
Vantaggiosamente, tale pianta è un cereale, preferibilmente appartenente alla specie del riso coltivato (Oryza sativa L.).
Fanno parte del presente trovato anche le progenie ottenute per autofecondazione o incrocio, oppure linee trasformate selezionate a partire da una pianta trasformata come sopra descritta.
II presente trovato è relativo anche ad un seme come sopra descritto per l'uso nel trattamento terapeutico.
Inoltre, il trovato è riferito anche all'uso del suddetto seme per la produzione di un medicamento per un trattamento terapeutico enzimatico di sostituzione.
In particolare, si fa riferimento ad un trattamento terapeutico enzimatico di sostituzione nelle seguenti malattie: malattia di Gaucher, glicogenosi 2, malattia di Fabry, malattia di Niemann-Pick B, Mucopolisaccaridosi I, II, IV.
Il trovato è relativo anche ad un seme come sopra espresso per l'uso nel trattamento terapeutico enzimatico di sostituzione.
In particolare, il trovato si riferisce ad un seme come sopra indicato per l'uso nel trattamento terapeutico enzimatico di sostituzione nelle seguenti malattie: malattia di Gaucher, glicogenosi 2, malattia di Fabry, malattia di Niemann-Pick B, Mucopolisaccaridosi I, II, IV.
ILLUSTRAZIONE DEI DISEGNI
Queste ed altre caratteristiche del presente trovato appariranno chiare dalla seguente descrizione di una forma preferenziale di realizzazione, fornita a titolo esemplificativo, non limitativo, con riferimento agli annessi disegni in cui:
- la fig. 1 è uno schema del vettore finale di espressione pSV2006[GluB4pro/LL-TCK/PSGluB4/GCase/NOSter ] utilizzato per la produzione endosperma specifica dell'enzima beta-glucosidasi acida umana;
- la fig. 2A rappresenta uno schema sperimentale della procedura di sintesi del leader LL-TCK a valle del promotore GluBs4 attraverso recursive PCR;
- la fig. 2B rappresenta i risultati di una corsa elettroforetica di prodotti PCR-duplex ottenuti con primer specifici per l'amplificazione dei geni GCase e HPT II su DNA genomico estratto da piante di riso putativamente trasformate. Corsia 1: Ladder 1 Kb (NEB); corsia 2: CN, DNA genomico da pianta non trasformata; corsia 3: CP, vettore pSV2006[GluB4pro/LL-TCK/PSGluB4/GCase/N0Ster]; corsie 4-16: piante saggiate;
- le figg. 3A e 3B rappresentano i risultati ottenuti su estratti proteici prodotti in prove di estrazione mediante SDS-PAGE (A) e analisi Western blot (B). In A e B le corsie 1,2,3,4,5 corrispondono a estrazioni consecutive di uno stesso campione di riso sbiancato, le corsie 6 e 7 a due estrazioni consecutive di uno stesso campione di farinaccio. CP: controllo positivo per Western blot corrispondente a 100 ng imiglucerasi. Come risulta evidenziato, gran parte della betaglucosidasi acida umana è recuperabile nelle prime tre estrazioni da seme di riso sbiancato;
- la fig. 4A raffigura i risultati ottenuti in analisi Western blot condotte su estratti proteici totali da seme. Corsia 1: marker Precision Plus Protein standard (BioRad); Corsia 2: CP (100 ng imiglucerasi); Corsia 3: CN (estratto proteico da seme non trasformato della var. di riso CR W3); Corsie 4-10: estratti proteici da seme prodotto da diversi trasformati primari;
la fig. 4B mostra le 3 glicoforme di betaglucosidasi acida umana evidenziate mediante Western blotting successivamente a elettroforesi 2-D di un estratto proteico da seme di riso trasformato;
- le figg. 5A e 5B riportano un'immagine ottenuta al microscopio elettronico a trasmissione (ingr. 12500x) dell'immunolocalizzazione eseguita su sezioni di seme di riso non trasformato (A) e trasformato (B). E' evidente come l'accumulo di betaglucosidasi acida umana avvenga esclusivamente nei vacuoli proteici di riserva. PSV: Protein Storage Vacuole;
- le figg. 6A e 6B riportano i cromatogrammi delle cromatografie HIC (A) e IEC (B). In evidenza, i picchi di eluizione contenenti la beta-glucosidasi acida umana;
- la fig. 7 riporta il grafico delle fluorescenze registrate per le aliquote cromatografiche ottenute da CN (pianta non trasformata) e da pianta transgenica, e il corrispondente Western blot. ES: estratto grezzo; R: flow through; E: aliquote di eluizione. L'attività enzimatica di Gcase (E2-E3) viene distinta da quella endogena (E6); ciò trova conferma nell'analisi WB: solo i campioni contenenti Gcase (E2-E3) danno una banda dal peso molecolare atteso; CP: imiglucerasi;
- le figg. 8A e 8B mostrano i risultati dell'analisi SDS-PAGE (A) sul campione purificato di beta-glucosidasi acida umana ottenuto da gel-filtrazione e il corrispondente segnale in Western blot (B);
- la fig. 9 riporta lo spettro delle masse ottenuto dall'analisi MALDI-TOF di un campione purificato mediante cromatografie HIC e IEC di beta-glucosidasi acida umana.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DEL PRESENTE TROVATO
Il presente trovato è, in particolòare, relativo ad un procedimento per la produzione di una betaglucosidasi acida umana in endosperma di riso (Oryza sativa L.) che comprende:
- una prima fase di trasformazione delle piante mediante la quale realizzare il confinamento della beta-glucosidasi in un endosperma non assorbito dall'embrione e permettere che la presenza di elevati quantitativi della proteina nell'endosperma del seme non determini effetti negativi sulla germinabilità e sull'energia germinativa del seme;
- l'utilizzazione, nella prima fase di trasformazione delle piante, di un promotore endospermaspecifico a monte del gene codificante detta proteina e di un peptide segnale per l'invio cotraduzionale della beta-glucosidasi nascente nel lume del reticolo endoplasmico delle cellule componenti il tessuto dell'endosperma e per il suo accumulo tissutale nell'endosperma all'interno dei vacuoli di riserva proteica (Protein Storage Vacuoles, PSV) o nei corpi proteici (Protein Bodies, PB);
una seconda fase d'accumulo della betaglucosidasi all'interno dell'endosperma del seme delle piante.
Il procedimento prevede di trasformare le piante mediante un vettore di espressione comprendente una sequenza nucleotidica contenente i seguenti elementi: i) un promotore endosperma-specifico di origine naturale o artificiale;
ii) una regione 5' UTR di origine naturale o artificiale;
iii) una sequenza nucleotidica di origine naturale o artificiale codificante un peptide segnale per l'invio della beta-glucosidasi ricombinante all'interno del lume del reticolo endoplasmico delle cellule componenti il tessuto dell'endosperma e per il suo accumulo tissutale;
iv) una sequenza nucleotidica di origine naturale o artificiale codificante la forma matura della betaglucosidasi umana;
v) una regione 3' UTR di origine naturale o artificiale .
La sequenza nucleotidica contenuta nel vettore d'espressione è, ad esempio, come indicata in SEQ ID NO: 1.
Tra i possibili noti promotori endosperma-specifici di piante graminacee e di riso in particolare, il presente trovato impiega vantaggiosamente il promotore della proteina GluB4, la cui sequenza è indicata in SEQ ID NO: 2, in quanto tale proteina GluB4 presenta una distribuzione più uniforme all'interno dell'endosperma del seme.
Inoltre, il promotore di GluB4 è contraddistinto da un'attività trascrizionale più elevata, qualora comparato con i promotori di geni codificanti altre proteine di riserva presenti nell'endosperma di riso, quali globuline, prolamine o gluteline diverse da GluB4.
Il promotore di GluB4 è stato isolato mediante PCR dalla varietà waxy CR W3 (Ente Nazionale Risi) unitamente alla regione leader. Tuttavia, quest'ultima è apparsa piuttosto breve e scarsamente dotata di elementi CAA e CT ripetuti in grado di rafforzare l'espressione genica ed è stata conseguentemente sostituita con la sequenza 5' UTR nota come LL-TCK (De Amicis et al. 2007, Transgenic Research) e riportata nella domanda di brevetto internazionale PCT/EP2007/064590 ed indicata in SEQ ID NO: 3.
La sequenza GluB4pro/LL-TCK è stata saldata con PSGlub4/GCase dove:
- PSGluB4 è la sequenza (come indicata in SEQ ID NO: 4) codificante il peptide segnale utilizzato in riso per veicolare il precursore della glutelina 4 all'interno del reticolo endoplasmico;
- GCase è la sequenza (come indicata in SEQ ID NO: 5) codificante la forma umana matura della betaglucosidasi acida, intendendo per forma matura il tratto polipeptidico che risulta a seguito di rimozione del peptide segnale nativo. Per evitare l'aggiunta di amminoacidi estranei al terminale amminico dell'enzima maturo conseguente all'addizione di siti di riconoscimento per endonucleasi di restrizione utilizzate nell'unione delle due sequenze, è stato prodotto per sintesi artificiale un tratto di DNA comprendente la sequenza PSGluB4 e la regione iniziale di GCase fino al sito Hind III naturalmente presente all'interno di detta sequenza.
La sequenza PSGluB4 presente entro tale tratto, pur essendo totalmente sinonima, non corrisponde a quella naturale di riso, poiché essa è stata ridisegnata allo scopo di favorire il riconoscimento del codone di inizio traduzione in associazione alla sequenza LL-TCK e di evitare l'impiego di codoni rari o generanti contesti intercodonici sfavorevoli.
Al contrario, la regione iniziale di GCase è stata mantenuta inalterata rispetto alla sequenza umana nativa, sicché l'intera sequenza GCase corrisponde esattamente a quella contraddistinta dal n. di accessione GenBank M16328 nel tratto compreso tra le posizioni 553 e 2046.
Dopo aver fuso mediante impiego del sito Hind III la sequenza sintetica con il tratto codificante la parte rimanente dell'enzima, l'intero complesso è stato a sua volta legato al terminale 3 ' di GluB4pro/LL-TCK precedentemente clonato all'interno del vettore binario pSV2006. Tale vettore è stato sviluppato dalla Richiedente a partire dal plasmide pCAMBIA 1301 (www.cambia.org); il segnale di poliadenilazione utilizzato nel costrutto relativo alla beta-glucosidasi acida umana è stato NOSter, ovvero il terminatore del gene codificante la nopalina sintasi di Agrobacterium tumefaciens. La sequenza del terminatore NOS è indicata in SEQ ID NO: 6.
Dopo aver provveduto a una verifica di tutte le sequenze utilizzate nella costruzione del vettore finale pSV2 006[GluB4pro/LL-TCK/PSGluB4/GCase/NOSter] (fig. 1), esso è stato introdotto mediante elettroporazione in Agrobacterium tumefaciens ceppo EHA 105. Successivamente a controllo, il ceppo ingegnerizzato è stato utilizzato per la trasformazione di calli embriogenici di riso (Oryza sativa ssp. japonica, varietà CR W3). L'intera procedura di trasformazione e rigenerazione di plantule su substrato selettivo si è svolta regolarmente. Allo stesso modo, non è stata osservata alcuna anomalia di sviluppo nelle piante allevate alle condizioni di luce, temperatura e umidità dell'aria normalmente applicate per il riso nelle celle climatiche di confinamento. La fertilità degli organi maschile e femminile e la percentuale di aborto fiorale sono risultate comparabili a quelle rilevate in piante non trasformate della varietà CR W3. Tutti i trasformati primari hanno fornito seme con germinabilità superiore al 95%, indipendentemente dal livello di espressione della beta-glucosidasi acida. L'energia germinativa ha inoltre mostrato i valori massimi della specie (entro 4-6 giorni, la quasi totalità del seme germinabile aveva emesso le radici primarie e il coleottile). Al pari dei trasformati primari, anche le loro progenie si sono sviluppate normalmente e hanno prodotto seme contenente betaglucosidasi acida. La presenza del gene codificante l'enzima è stata verificata mediante analisi PCR su tutte le piante putativamente trasformate e su oltre 150 piante campionate a caso entro le popolazioni di piante derivate per autofecondazione dai migliori trasformati primari. In tali analisi, si è fatto uso di controlli negativi costituiti da estratti di DNA totale ottenuti da piante non trasformate della varietà CR W3 e positivi (estrazioni in miniprep del vettore plasmidico di espressione). Inoltre, è stata verificata l'effettiva amplificabilità del DNA totale estratto da ciascuna pianta conducendo PCR con una coppia di primer in grado di appaiarsi al DNA cloroplastico di riso. Nel complesso, le analisi PCR hanno dimostrato l'effettiva trasformazione del riso con il gene per la beta-glucosidasi acida umana e il passaggio di detto gene alla progenie. La trasmissione ereditaria del carattere è stata dimostrata non solo nelle progenie ottenute a seguito di autofecondazione ma anche in quelle derivanti da incrocio tra piante trasformate e controllo negativo o tra una pianta trasformata e l'altra.
Per accertare la produzione di RNA messaggero per la beta-glucosidasi acida umana, cariossidi di riso allo stadio di maturazione latteo-cerosa sono state raccolte e utilizzate per l'estrazione di RNA totale. Sull 'RNA totale dei campioni sono state effettuate le seguenti analisi: a. assenza di contaminazione con DNA genomico a mezzo PCR; b. amplificazione con RT-PCR del messaggero per la beta-glucosidasi acida umana; c. amplificazione con RT-PCR del messaggero per la glutelina 4. In tutti i casi, il gene per la betaglucosidasi acida è apparso regolarmente espresso e ha manifestato il medesimo profilo di espressione del gene per la proteina di riserva glutelina 4. Come atteso, utilizzando l'RNA totale estratto dal controllo negativo, è stata ottenuta unicamente l'amplificazione del gene GluB4.
Facendo uso di cariossidi allo stadio di maturazione cerosa, è stata inoltre identificata mediante immunoelettromicroscopia a trasmissione l 'esatta localizzazione della proteina ricombinante nel seme . Quest 'ultima è risultata presente unicamente nei vacuoli di riserva proteica interni alle cellule dell ' endosperma. Impiegando le medesime tecniche , nei campioni prelevati da piante CR W3 non trasformate non è comparso alcun segnale, a dimostrazione dell 'efficacia dell ' analisi e della assoluta specificità dell ' anticorpo utilizzato.
La disponibilità di un buon anticorpo unitamente alla possibilità di misurare attraverso un saggio fluorimetrico affidabile e sensibile l ' attività betaglucosidasica sono state entrambe sfruttate per la definizione di un metodo di purificazione della proteina all 'omogeneità e per la selezione delle migliori linee transgeniche. In relazione al primo punto, sono stati sviluppati protocolli per la prima lavorazione del seme, per l 'ottenimento di estratti proteici crudi e per l ' isolamento e la purificazione della beta-glucosidasi umana ricombinante . Quest'ultimo protocollo è composto da tre passaggi seriali : cromatografia a interazioni idrofobiche, cromatografia a scambio cationico, gel-filtrazione . La sbramatura e sbiancatura del seme sono risultate adatte a rimuovere gran parte delle proteine contaminanti con una perdita contenuta dell'enzima desiderato; scarse sono anche risultate le perdite in fase di estrazione. La rimozione dell'enzima endogeno avente attività betaglucosidasica è stata ottenuta con un procedimento di eluizione frazionata applicato al termine della cromatografia a scambio cationico; questo passaggio ha consentito di diminuire alquanto il numero delle proteine contaminanti assegnando alla successiva gelfiltrazione il ruolo di finitura del campione.
In SDS-PAGE, la proteina purificata ha manifestato una mobilità del tutto paragonabile a imiglucerasi (Cerezyme, Genzyme Corp.) e un peso molecolare apparente attorno a 60 kDa. In Western blotting, la proteina purificata è apparsa fortemente e specificamente segnalata da un anticorpo anti-imiglucerasi appositamente prodotto in coniglio. Sottoponendo la proteina purificata a saggio fluorimetrico per la determinazione dell'attività beta-glucosidasica, essa ha dimostrato di demolire efficacemente il substrato fluorogenico 4-metilumbelliferil beta-D-glucoside manifestando la stessa cinetica di reazione di imiglucerasi e un'attività specifica comparabile. Effettuando una elettroforesi 2-D, la banda unica evidenziata in analisi Western successive a SDS-PAGE è apparsa in realtà composta da almeno 3 glicoforme della proteina. Ulteriori analisi hanno inteso provare l'integrità della beta-glucosidasi acida umana ricombinante prodotta in endosperma di riso e la piena identità di sequenza amminoacidica tra quest'ultima e la controparte umana nativa. Il microsequenziamento del terminale amminico della proteina prodotta in pianta ha dimostrato che 1'ottapeptide iniziale corrisponde a ARPCIPKSF ovvero al medesimo N-terminale delle beta-glucosidasi acida umana. Inoltre, analisi condotte in MALDI-TOF su digesto triptico di betaglucosidasi acida umana ricombinante prodotta in endosperma di riso hanno stabilito che anche il terminaie carbossilico corrisponde esattamente alla betaglucosidasi acida umana. La tecnica di peptide mass fingerprinting eseguita in MALDI-TOF ha non solo definitivamente confermato l'identità di sequenza amminoacidica tra le due proteine ma anche dimostrato che il quinto sito di N-glicosilazione non è occupato da glicani. Al contrario, il primo, secondo, terzo e quarto sito di N-glicosilazione della proteina sono apparsi glicosilati. La presenza di N-glicani a livello del primo sito assume particolare significato in vista dell'importanza che quest'ultimi rivestono nell'acquisizione di attività enzimatica da parte della proteina.
ESEMPI
Esempio 1; costruzione della cassetta molecolare di espressione
Viene di seguito riportata una procedura atta a dirigere l'espressione endosperma-specifica della betaglucosidasi acida umana in riso. Procedure analoghe possono essere utilizzate per la realizzazione di varianti del costrutto caratterizzate dalla presenza di altri promotori endosperma-specifici e/o sequenze per l'invio nel reticolo endoplasmico.
Isolamento del promotore della Glutelina 4 (GluB4pro) Per isolare il promotore della gluteiina 4 di Oryza sativa, è stata effettuata una PCR sul DNA genomico estratto dalla var. CR W3. In detta PCR, sono stati utilizzati i seguenti primer disegnati sulla base della sequenza del promotore depositata in banca dati (GenBank acc. n° AY427571):
Primer GluB4pro for: come indicato nelle sequenza SEQ ID NO: 7.
Primer GluB4pro rev: come indicato nelle sequenza SEQ ID NO: 8.
Al fine di favorire le successive operazioni di clonazione, il primer GluB4 for inserisce al terminale 5' i siti di restrizione Sph I ed Eco RI, il primer GluB4 rev il sito Xba I in 3'.
Ciclo: 95°C per 2', 40x(95°C per 45", 63°C per 40", 72°C per 2'), 72°C per 5'.
L'amplificato ottenuto è stato quindi clonato nel vettore pGEM-T (Promega) e interamente sequenziato. Sostituzione del leader nativo con il leader sintetico LL-TCK nel promotore GluB4pro
Per effettuare la sostituzione del leader nativo del promotore della gluteiina 4 (GluB4pro) di riso con il leader sintetico LL-TCK (De Amicis et al., 2007), sono state eseguite tre PCR seriali utilizzando primer disegnati ad hoc (un primer forward e tre primer reverse) secondo lo schema rappresentato in fig. 2A.
Nella prima PCR è stato utilizzato come stampo il plasmide pGEM-T[GluB4pro], nelle due PCR successive il prodotto della reazione precedente. Il primer forward 1 inizia con il sito di restrizione Bfr I e appaia con un tratto di sequenza di GluB4pro che si trova al terminale 3' dello stesso, in posizione precedente al leader. Il primer reverse 1 appaia nella sua porzione 3' con il tratto di sequenza interna a GluB4pro immediatamente a monte dell'inizio del leader nativo. La parte che non appaia porta alla creazione del tratto iniziale di LL-TCK. Il primer reverse 2 appaia con il nuovo tratto aggiunto e incorpora a sua volta un altro tratto, proseguendo nella sintesi della sequenza leader desiderata. Infine, il primer reverse 3 codifica per l'ultimo tratto di sequenza del leader sintetico LL-TCK e introduce in 3' il sito di restrizione Xba I. Le miscele di reazione sono state allestite utilizzando Accu Taq (Sigma) e il seguente ciclo: 98°C per 2', 15(1 e II PCR)-25(111 PCR)x(94°C per 30", 65°C per 30", 68°C per 1'), 68°C per 10’.
Il prodotto finale di PCR è stato clonato in pGEM-T e verificato tramite analisi PCR, digestione enzimatica e sequenziamento.
Si è quindi eseguita la sostituzione del leader nativo presente in GluB4pro con il leader sintetico LL-TCK appena costruito. Per far ciò, il tratto terminale di GluB4pro (contenente il leader nativo) è stato rimosso mediante digestione con gli enzimi Bfr l e Xba I, e al suo posto è stata introdotta la nuova sequenza sintetizzata, digerita a sua volta con Bfr I e Xba I. Vettore e inserto sono stati saldati mediante T4 DNA ligasi e il vettore risultante pGEM-T[GluB4pro/LL-TCK] è stato verificato tramite analisi PCR e digestione enzimatica.
Sostituzione del PS nativo con il PSGluB4 ottimizzato per l'espressione in riso
Per migliorare il costrutto di espressione, si è deciso di anteporre alla sequenza codificante la forma matura della beta-glucosidasi acida (GCase) quella relativa al peptide segnale della gluteiina 4 ottimizzato per l'espressione in riso (PSGluB4). Per evitare l'aggiunta di amminoacidi estranei al terminale amminico dell'enzima maturo conseguente all'addizione di siti di riconoscimento per endonucleasi di restrizione utilizzate nell'unione delle due sequenze, è stato prodotto per sintesi artificiale un tratto di DNA comprendente la sequenza PSGluB4 munita al terminale 5' del sito Xba I e la regione iniziale di GCase fino al sito Hind III. La sequenza codificante PSGluB4 è stata disegnata tenendo conto della preferenza codonica di riso. L'intero tratto è stato sintetizzato artificialmente e clonato all'interno di pUC57 (Fermentas). Dopo essere stato verificato mediante sequenziamento, esso è stato clonato in sostituzione della sequenza codificante il PS nativo all'interno di pGEM-T[GCase] ovvero del plasmide contenente l'intera sequenza codificante la betaglucosidasi acida umana così come depositata al numero di accessione GenBank M16328. Entrambi i vettori pUC57[PSGluB4 ] e pGEM-T[GCase] sono stati digeriti con Xba I e Hind III in modo da generare rispettivamente l'inserto e il vettore da sottoporre a saldatura con T4 DNA ligasi per la realizzazione di pGEM-T[PSGluB4/GCase ]. Tale vettore è stato opportunamente controllato mediante digestioni enzimatiche.
Assemblaggio della cassetta molecolare di espressione della beta-glucosidasi acida umana
Le regioni corrispondenti a GluB4pro/LL-TCK e PSGluB4/GCase sono state introdotte con due distinte subclonazioni nel plasmide pUC18[NOSter] derivato da pUC18 (Pharmacia) per inclusione della sequenza di poliadenilazione del gene NOS di Agrobacterium tumefaciens. A tal fine, sono stati sfruttati i siti di restrizione introdotti ai terminali 5' e 3' di ciascuna regione, in particolare Sph I e Xba I per GluB4pro/LL-TCK, Xba I e Sac I per PSGluB4/GCase.
Realizzazione del vettore pSV2006rGluB4pro/LL-TCK/PSGluB4 /GCase/NOSter1
Per l'ottenimento del vettore finale di espressione è stato utilizzato il plasmide pSV2006, derivato da pCAMBIA 1300. Mediante digestione con Eco RI, è stata rimossa: da pSV2006 una precedente cassetta di espressione; da pUC18[GluB4pro/LL-TCK/PSGluB4/GCase/NOSter ] il costrutto molecolare di interesse. Si è proceduto quindi alla saldatura dei frammenti per l'ottenimento del vettore finale (fig.
1), il quale è stato sottoposto a specifiche verifiche (fig. 2B) prima di essere movimentato per elettroporazione in Agrobacterium tumefaciens, ceppo EHA 105. Il ceppo di Agrobacterium tumefaciens ingegnerizzato è stato impiegato per la trasformazione di Oryza sativa ssp. japonica, var. CR W3.
Esempio 2; trasformazione di riso mediante Agrobacterium tumefaciens
Per la trasformazione di riso si è utilizzato il protocollo di Hiei et al. (1994), modificato da Hoge (Rice Research Group, Institute of Plant Science, Leiden University) e Guiderdoni (programma Biotrop, Cirad, Montpellier, France). Qui di seguito sono brevemente descritte le fasi principali della procedura.
Sviluppo di calli embriogenici
La trasformazione di riso è avvenuta su calli embriogenici derivati da scutello.
Per indurre la proliferazione di calli da tessuto scutellare, è stata dapprima eseguita la sbramatura dei semi di riso. Per eliminare potenziali patogeni e saprofiti contaminanti, si è proceduto quindi alla disinfezione delle cariossidi e a una serie di lavaggi in acqua sterile. Successivamente, i semi sono stati asciugati su carta bibula sterile e depositati su piastre Petri contenenti il substrato per l'induzione a callo (CIM, callus-induction medium). Le piastre così ottenute sono state incubate al buio, a una temperatura di 28 °C per 21 giorni; dopo 1 settimana di incubazione si è proceduto all'eliminazione dell'endosperma e della radichetta per favorire lo sviluppo del callo proveniente dallo scutello.
Terminate le 3 settimane di induzione, si è operato il trasferimento del callo su substrato CIM rinnovato, a cui ha fatto seguito la frammentazione delle masse callose. La sub-coltura è stata fatta proseguire per altri 10 giorni in modo da sviluppare il callo embriogenico e renderlo idoneo alla trasformazione. Co-coltura dei calli con Agrobacterium tumefaciens Per ottenere quantità sufficienti di Agrobacterium tumefaciens per la trasformazione, il ceppo portante il vettore di espressione è stato incubato per 3 giorni a 30°C in LB agar.
Ottenute le colture di agrobatterio, le relative patine di crescita batterica sono state prelevate e sospese nel mezzo liquido di co-coltivazione (CCML, co-cultivation medium liquid), fino ad ottenere una O.D.600di circa 1.0, corrispondente a 3-5*10<9>cellule/mL
I calli migliori, cioè quelli con un diametro di circa 2 mm, compatti e dal colore tendente al bianco, sono stati incubati con la sospensione. Dopo asciugatura, i calli, in numero massimo di 20 per piastra Petri high-edge (Sarstedt), sono stati depositati sul substrato solido per la co-coltura (CCMS, cocultivation medium solidified) e incubati in ambiente buio, a una temperatura di 25°C per 3 giorni.
Selezione di calli resistenti all'antibiotico igromicina
I calli provenienti dalla co-coltura sono stati trasferiti su substrato selettivo I (SMI, selection medium I) e incubati al buio, a una temperatura di 28°C per 2 settimane.
In seguito, i calli sono stati trasferiti su piastre Petri high-edge contenenti il substrato di selezione II (SMII, selection medium II) e incubati alle stesse condizioni sopraindicate per un'ulteriore settimana.
Rigenerazione di piantine di riso da calli trasformati
La rigenerazione delle piantine transgeniche è avvenuta grazie a un'opportuna stimolazione ormonale del callo trasformato.
I calli embriogenici di riso resistenti all'igromicina sono stati selezionati, trasferiti su piastre Petri high-edge contenenti il substrato per la pre-rigenerazione (PRM, pre-regeneration medium) e incubati per 1 settimana a 28°C. I calli sono stati quindi trasferiti sul substrato per la rigenerazione (RM, regeneration medium) nel numero massimo di 8-10 unità per piastra Petri high-edge. La rigenerazione delle piantine è avvenuta in presenza di luce, a 28°C per 3-4 settimane.
Quando le piantine sono risultate sufficientemente grandi da poter essere separate dal callo (≥ 3 cm di altezza), si è proceduto al loro trasferimento in tubi di coltura contenenti 25 mL del substrato per la radicazione (ROM, rooting medium). La sub-coltura all'interno di tubi è proseguita per circa 3 settimane sempre a 28°C alla luce.
A conclusione del processo rigenerativo, le piante sono state trasferite in torba e allevate in fitotrone a 24°C, umidità relativa 85%, con illuminazione fornita da lampade ad alogenuri metallici Osram Powerstar<®>HQI<®>-BT 400 W/D (fotoperiodo 16 h luce/8 h buio) .
Esempio 3: estrazione di proteine totali da semi di riso
I semi di riso trasformati sono stati inizialmente sbramati e sbiancati con sbiancatrice Satake TO-92 (Satake Corporation, Japan). I semi sbiancati sono stati poi macinati e la farina risultante è stata omogeneizzata in tampone di estrazione (50 mM sodioacetato, 350 mM NaCl, pH = 5.5), utilizzando un rapporto tra volume di tampone (mL) e peso della farina (g) pari a 10:1.5. Dopo incubazione a 4°C per un'ora, si è eseguita una centrifugazione a 14000xg per 45 minuti. Dopo il recupero del surnatante, il pellet residuo è stato sottoposto a due ulteriori estrazioni applicando la medesima procedura.
Gli estratti proteici ottenuti da seme sbiancato e da farinaccio sono stati analizzati in SDS-PAGE (figg. 3A e 3B) e Western blot; queste analisi hanno dimostrato che gran parte della beta-gluocosidasi acida è contenuta nel seme sbiancato e che essa può essere recuperata efficacemente con tre estrazioni consecutive .
Esempio 4: analisi Western-Blot ed elettroforesi 2-D su estratti proteici totali
Gli estratti proteici totali sono stati separati in elettroforesi SDS-PAGE (Laemmli, 1970) utilizzando l'apparato Mini Protean II (BioRad), con uno spessore del gel di 0.75 mm e una percentuale di acrilammide pari al 10%. Prima del caricamento, i campioni sono stati denaturati a 100°C per 5 min in assenza di beta-mercaptoetanolo .
Le proteine separate sono state trasferite su membrana di polivinilidene difluoride (PVDF, Immobilon-PSQ-Millipore ) utilizzando l'apparato Trans-BLOT<®>SD (BioRad) a 15V per 30 minuti.
I campioni sono stati quindi ibridati con un anticorpo policlonale (anti-GCase) prodotto immunizzando due conigli con l'analogo commerciale imiglucerasi (Genzyme Corp.). Sono state applicate le seguenti condizioni di ibridazione: un'ora di incubazione a temperatura ambiente utilizzando una diluizione 1:1000 in soluzione di blocking (7.5% p/v latte scremato in polvere-Oxoid in PBS). Dopo i lavaggi in PBS Tween 0.1% v/v, è stata effettuata un'incubazione di 1 ora in anticorpo secondario anti-IgG di coniglio coniugato con HRP (Sigma, diluizione 1:10000). In tutti i casi è stato utilizzato il sistema di rilevazione ECL Plus™ (GE Healthcare). Per la determinazione dei pesi molecolari è stato usato il marker Precision Plus Protein standard (Bio-Rad) in abbinamento all'anticorpo Precision Streptactin coniugato con HRP (BioRad). (fig. 4A)
Due campioni contenenti circa 200 μg di proteine totali estratte da seme di una pianta trasformata, sono stati sottoposti a isoelettrofocusing e SDS-PAGE. La prima analisi è stata condotta utilizzando l'apparato PROTEAN IEF focusing System (BioRad) e le strip ReadyStrip IPG di 7 cm con un range di pH non lineare compreso tra 3 e 10 (BioRad). Gli estratti proteici sono stati precipitati mediante il sistema 2D Clean-Up Kit (GE Healthcare) e risospesi in 130 μL di DeStreak Rehydratation Solution (GE Healthcare), a cui è stato aggiunto lo 0.6% di amfoliti Bio-Lytes 3-10 (BioRad). Sono state applicate le seguenti condizioni di corsa:
stepl: 250 V per 15 minuti
step2: 4000 V per 2 ore
step3: 20000 V-ora in 24 ore circa.
A fine corsa, le strip sono state sottoposte a due lavaggi di equilibrazione: 15 minuti nel tampone di equilibrazione I (2% DTT, 2% SDS, 50 mM Tris-HCl, 6 M urea, 30% glicerolo e 0.002% blu di bromofenolo, pH = 8.8) e 20 minuti nel tampone di equilibrazione II (2.5% iodoacetamide, 2% SDS, 50 mM Tris-HCl, 6 M urea, 30% glicerolo e 0.002% blu di bromofenolo, pH = 8.8). Per entrambi i campioni, è stata quindi eseguita la corsa della seconda dimensione in SDS-PAGE secondo protocollo standard.
A fine corsa, il gel è stato colorato mediante una soluzione di Colloidal Coomassie Blue (0.08% Coomassie Blue R-250, 1.6% acido orto-fosforico, 8% ammonio solfato, 20% metanolo), mentre il secondo è stato sottoposto ad analisi Western blot (fig. 4B). L'intera procedura è stata eseguita in parallelo anche per due campioni proteici ottenuti da semi di CR W3 non trasformati.
Esempio 5: determinazione del sito di accumulo mediante immunolocalizzazione
Cariossidi di riso trasformato in fase di maturazione lattea avanzata sono state raccolte, private delle glume, tagliate in frammenti di circa 1 mm<s>e fissate in glutaraldeide 0.2% per 1 ora a temperatura ambiente. E' seguita una fase di lavaggio in tampone fosfato 0.15 M e la disidratazione in gradiente di etanolo assoluto (da 25 a 100%). I campioni disidratati sono state infiltrati in resina LR White (London Resin Co.) e infine polimerizzati a 60°C per 24 ore. Le sezioni (spessore 2-3 μm) sono state tagliate con un microtomo LKB Nova (Reichter), depositate su retini di nichel (Electron Microscopy Sciences), incubate in una soluzione di siero normale di capra (Aurion), diluito 1:30 in buffer C (0.05 M Tris—HCl pH 7.6, 0.2% BSA), per 15 min e successivamente ibri date con 1'anticorpo primario (anti-GCase), diluito 1:500 in buffer C, per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo una serie di lavaggi in buffer B (0.5 M Tris-HCl pH 7.6, 0.9% NaCl) con Tween 20 0.1% p/v (6 x 5 minuti), le sezioni sono state incubate con 1'anticorpo secondario coniugato con oro colloidale (15 nm, Aurion) diluito 1:40 in buffer E (0.02 M Tris—HC1, pH 8.2 contenente 0.9% NaCl e 1% BSA) per 1 ora a temperatura ambiente.
Terminata l'ibridazione, le sezioni sono state sottoposte a una serie di lavaggi e a colorazione con acetato di uranile e piombo citrato (Reynolds, 1963) e infine osservate al microscopio ottico a trasmissione (TEM) Philips CM10.
I risultati ottenuti hanno permesso di evidenziare la presenza di GCase nei soli vacuoli proteici di riserva (PSV, acronimo di Protein Storage Vacuole) presenti nell'endosperma della cariosside: 1'anticorpo policlonale anti-GCase ha permesso di identificare GCase in maniera molto evidente grazie a un segnale intenso e privo di rumore di fondo.
La prova eseguita con la medesima procedura su cariossidi di riso non trasformato ha confermato la mancanza di siti di legame aspecifici per 1'anticorpo anti-GCase, evidenziando quindi un'elevata specificità della IgG nei confronti dell'enzima (figg. 5A e 5B).
Esempio 6: purificazione all'omogeneità di betaglucosidasi acida umana
Per la purificazione di GCase, è stato messo a punto un protocollo scalabile industrialmente basato su una prima fase di capturing eseguita con una cromatografia a interazioni idrofobiche (HIC) (fig. 6A); una fase intermedia attuata con una cromatografia a scemibio ionico (IEC) (fig. 6B); una fase finale di polishing realizzata mediante gel-filtrazione. Tutte le cromatografie sono state effettuate con il cromatografo AKTA Prime (GE Healthcare).
Cromatografia a interazioni idrofobiche (HIC)
E' stata utilizzata una colonna preimpaccata HiTrap Octyl FF da 5 mL (GE Healthcare). Inizialmente la colonna è stata equilibrata con 1 volume di tampone di carico (50 mM sodio acetato, 350 mM NaCl e 100 mM ammonio solfato, pH=5.5); prima del carico, mediante una soluzione di 3 M ammonio solfato, l'estratto di proteine totali è stato portato a una concentrazione finale di 100 mM ammonio solfato e filtrato mediante filtri da 0.2 μπι (Millipore). Il carico in colonna è stato eseguito a una velocità di 1 mL/minuto. La colonna è stata quindi lavata con 3 volumi di tampone di carico e con 50 mM sodio acetato, pH = 5.5 fino a ottenere un cromatogramma piatto. L'eluizione è stata eseguita con 66% di etilen glicole in 50 mM sodio acetato. Alla fine della procedura, la colonna è stata lavata e rigenerata con 20% etanolo.
Cromatografia a scambio ionico (IEC)
E' stata utilizzata una colonna preimpaccata HiTrap SP FF da 5 mL (GE Healthcare), contenente una resina a scambio cationico equilibrata in tampone 50 mM sodio acetato, pH = 5.5; è seguito il carico dell'eluato derivato da cromatografia HIC diluito 1:1 con il suddetto tampone. Dopo opportuni lavaggi, è stata impostata un'eluizione basata su un gradiente discontinuo con percentuali crescenti di NaCl pari a 15, 20 e 100%. La procedura si è conclusa mediante lavaggio e rigenerazione della resina con 20% etanolo. Le analisi immunologiche condotte su aliquote prelevate da ciascuna fase della cromatografia hanno dimostrato che la beta-glucosidasi acida umana viene eluita con il 20% NaCl.
Prove di attività enzimatica condotte su eluati derivati da estratti di seme non trasformato hanno dimostrato che la separazione della beta-glucosidasi acida umana dalla componente responsabile dell'attività beta-glucosidasica endogena si realizza in questo passaggio cromatografico.
In particolare, è stato chiarito che, alla concentrazione di 20% NaCl, l'analogo endogeno viene efficacemente trattenuto in colonna (fig. 7).
Gel-filtrazione
E' stata utilizzata una colonna preimpaccata HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 High Resolution (GE Healthcare) e il tampone di eluizione costituito da 20 mM sodio acetato e 200 mM NaCl, pH = 5.5. La colonna è stata inizialmente equilibrata con due volumi di tampone a cui è seguito il carico in colonna dell'eluato concentrato prodotto mediante cromatografia IEC. L'intera procedura è stata eseguita a una velocità di flusso pari a 0.3 mL/minuto. Il picco di interesse è stato sottoposto a SDS-PAGE e Western blotting (figg.
8A e 8B).
Esempio 7; determinazione dell'attività enzimatica E' stata utilizzata una soluzione di saggio contenente 75 mM tampone K-fosfato, 0.125% (p/v) taurocolato e 3 mM 4-metilumbelliferil beta-D-glucopiranoside (4-MUG), pH = 5.9; la reazione enzimatica è stata condotta a 37°C per 1 ora aggiungendo 10 μL di campione a 300 μL di soluzione di saggio. La reazione è stata quindi bloccata innalzando il pH a valori prossimi a 10 con 1690 μL di stop buffer, costituito da 0.1 M glicina e 0.1 M NaOH, pH = 10.0. L'attività enzimatica è stata misurata mediante fluorimetro a una lunghezza d'onda di eccitazione pari a 365 ± 7 nm e una di emissione pari a 460 ± 15 nm. Una unità enzimatica (U) è stata definita come la quantità di enzima che degrada una micromole di substrato per minuto.
Esempio 8; determinazione della sequenza N-terminale La sequenza amminoacidica N-terminale di Gcase è stata determinata per microsequenziamento della proteina trasferita su membrana.
A tal fine, dopo la separazione elettroforetica dell'eluato cromatografico ottenuto dalla duplice purificazione mediante HIC e IEC, il campione è stato trasferito dal gel alla membrana PVDF (Millipore) utilizzando l'apparato Trans-Blot Semi-Dry (BioRad) (trasferimento: 25 V costanti per 30 min in tampone 10 mM CAPS e 10% metanolo, pH 11).
Dopo il trasferimento, la membrana PVDF è stata colorata con una soluzione 0.25% (w/v) Coomassie-blue R-250 in 50% metanolo per 5 minuti, lavata con acqua e decolorata con una soluzione 50% metanolo per 10 minuti al fine di visualizzare la banda proteica di interesse .
Il microsequenziamento è stato condotto secondo la chimica di Edman (Edman, 1950). L'analisi ha permesso di ottenere una sequenza di 9 amminoacidi (ARPCIPKSF) perfettamente coincidente con quella attesa per la forma matura della beta-glucosidasi acida umana. Il microsequenziamento ha quindi dimostrato che il peptide segnale della gluteiina 4 di riso viene riconosciuto e rimosso correttamente.
Esempio 9: analisi MALDI-TOF
Digestione della proteina mediante tripsina
Dopo corsa elettroforetica e colorazione del gel con una soluzione contenente 0.25% (w/v) Coomassie blue R-250 in acqua, 50% metanolo, 10% acido acetico glaciale, la banda corrispondente a GCase è stata tagliata dal gel e lavata a 37°C con 300 pL di una soluzione 100 mM NH4HC03e acetonitrile (ACN) in rapporto 50:50, pestellata e disidratata con ulteriori 100 μL ACN.
La proteina è stata quindi sottoposta a riduzione dei ponti disolfuro mediante trattamento con 50 pL 10 mM DTT a 56°C per un'ora e ad alchilazione per 30 minuti con 50 μL 50 mM IAA (iodoacetamide) in 100 mM NH4HC03. Il frammento di gel è stato inoltre lavato con 300 μL 100 mM NH4HC03e con 300 μL di una soluzione 20 mM NH4HC03e ACN in rapporto 50:50, e disidratato nuovamente aggiungendo 100 μL ACN.
Infine, la banda è stata reidratata con 5-10 μL di un buffer di digestione contenente 100 mM NH4HC03e 50 nq/μL di tripsina (Promega), cui sono stati aggiunti dopo 30 minuti 20 μ1>20 mM NH4HC03. Dopo una notte a 37°C, il buffer contenente i peptidi è stato rimosso e si è effettuata un'ulteriore estrazione dei peptidi aggiungendo al gel 10 μL di una soluzione 2% acido formico e 60% ACN (50:50). I due surnatanti, nei quali sono diluiti i peptidi, sono stati riuniti e utilizzati per l'analisi MALDI-TOF (Perkin Elmer).
Purificazione dei peptidi mediante resina C18 Prima di essere sottoposti ad analisi, il digerito proteico è stato purificato con zip-tip C18 (Millipore) per eliminare contaminanti e sali in eccesso.
Sui puntali zip-tip è impaccata una resina che supporta una fase inversa (C18) sulla quale si legano i peptidi presenti nel digerito.
Le punte sono state lavate 4 volte con 10 μL di 100% ACN e 3 volte con 10 μL 0.1% TFA (acido trifluoroacetico). Alle punte attivate è stato quindi aggiunto il campione; dopo 3 lavaggi con 0.1% TFA, i peptidi legati alla resina sono stati eluiti con 10 μL ACN e 0.1% TFA in rapporto 70:50.
Identificazione della proteina in spettrometria di massa MALDI-TOF mediante Peptide Mass Fingerprinting La preparazione del campione per l'analisi MALDI-TOF è stata ottenuta aggiungendo a 1 μL di soluzione concentrata di matrice CHCA (acido a-ciano-4-idrossicinnamico) posta su un supporto metallico, 1 μL della soluzione contenente i peptidi purificati. L'analisi (fig. 9) ha dimostrato che la proteina purificata con la procedura descritta nell'esempio 6 corrisponde alla beta-glucosidasi acida umana; in particolare, l'identificazione dell'enzima è avvenuta con un punteggio pari a 10<-32>e una percentuale di copertura dei peptidi riconosciuti pari al 53%. Si tratta di risultati di assoluta garanzia, se si considera che risultano significativi valori che presentano un punteggio ≤ a 10<-6>e una copertura ≥ a 30%. Nell'elenco dei peptidi generati con tripsina e riconosciuti come appartenenti alla beta-glucosidasi acida umana rientrano anche i frammenti N- e C-terminale della proteina (si veda tabella 1 seguente).
Tab. 1: evidenziazione delle principali assegnazion: dei peptidi triptici analizzati in MALDI-TOF per il campione purificato di GCase
È chiaro che al procedimento per la produzione di una proteina umana in pianta, in particolare un enzima lisosomiale umano ricombinante in endosperma di cereali fin qui descritto possono essere apportate modifiche e/o aggiunte di parti e/o fasi, senza per questo uscire dall'ambito del presente trovato.
È anche chiaro che, sebbene il presente trovato sia stato descritto con riferimento ad alcuni esempi specifici, una persona esperta del ramo potrà senz'altro realizzare molte altre forme equivalenti di procedimento per la produzione di una proteina umana in pianta, in particolare un enzima lisosomiale umano ricombinante in endosperma di cereali, aventi le caratteristiche espresse nelle rivendicazioni e quindi tutte rientranti nell'ambito di protezione da esse definito.
LISTA DI SEQUENZE
<110> Transactiva S.r.l.
<120> PROCEDIMENTO PER LA PRODUZIONE DI UNA PROTEINA UMANA IN PIANTA, IN PARTICOLARE UN ENZIMA LISOSOMIALE UMANO RICOMBINANTE IN ENDOSPERMA DI CEREALI
<130> U3-2601
<160> 8
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 3357
<212> DNA
<213> Artificiale
<220>
<223> Cassetta di espressione
<400> 1
gaattctaca gggttccttg cgtgaagaag ggtggcctgc ggttcaccat taacggtcac 60 gactacttcc agctagtact ggtgaccaac gtcgcggcgg cagggtcaat caagtccatg 120 gaggttatgg gttccaacac agcggattgg atgccgatgg cacgtaactg gggcgcccaa 180 tggcactcac tggcctacct caccggtcaa ggtctatcct ttagggtcac caacacagat 240 gaccaaacgc tcgtcttcac caacgtcgtg ccaccaggat ggaagtttgg ccagacattt 300 gcaagcaagc tgcagttcaa gtgagaggag aagcctgaat tgataccgga gcgtttcttt 360 tgggagtaac atctctggtt gcctagcaaa catatgattg tatataagtt tcgttgtgcg 420 tttattcttt cggtgtgtaa aataacatac atgctttcct gatattttct tgtatatatg 480 tacacacaca cgacaaatcc ttccatttct attattattg aacaatttaa ttgcgagggc 540 gagtacttgt ctgtttacct tttttttttc agatggcatt ttatagttta acctttcatg 600 gaccggcagt agttctaacc atgaatgaaa agaaatcata gtccacacca cgcagggaca 660 ttgtggtcat tttagacaag acgatttgat taatgtcttg tatgatatgg tcgacagtga 720 ggactaacaa acatatggca tattttatta ccggcgagtt aaataaattt atgtcacagt 780 aataaactgc ctaataaatg cacgccagaa aatataatga taaaaaaaag aaaagataca 840 taagtccatt gcttctactt ttttaaaaat taaatccaac attttctatt ttttggtata 900 aacttggaag tactagttgg atatgcaaaa tcatctaacc tccatatatt tcatcaattt 960 gtttacttta catatgggag aggatagtat gtcaaagaaa atgacaacaa gcttacaagt 1020 ttcttatttt aaaagttccg ctaacttatc aagcatagtg tgccacgcaa aactgacaac 1080 aaaccaacaa atttaaggag cgcctaactt atcatctatg acataccgca caaaatgata 1140 acatactaga gaaactttat tgcacaaaag gaaatttatc cataaggcaa aggaacatct 1200 taaggctttg gatatacatt taccaacaag cattgtttgt attaccccta aagcgcaaga 1260 catgtcatcc atgagtcata gtgtgtatat ctcaacattg caaagctacc ttttttctat 1320 tatacttttc gcattatagg ctagatatta tctatacatg tcaacaaact ctatccctac 1380 gtcatatctg aagattcttt tcttcactat ataagttggc ttccctgtca ttgaactcac 1440 atcaaccagc ccaacacgta tttttacaac aataccaaca acaacaacaa caaacaacat 1500 tacaattacg tatttctctc tctagaatgg ccaccattgc gttctcccgg ctgtccatct 1560 acttctgcgt gctgctgctg tgccacggct ccatggccgc ccgcccctgc atccctaaaa 1620 gcttcggcta cagctcggtg gtgtgtgtct gcaatgccac atactgtgac tcctttgacc 1680 ccccgacctt tcctgccctt ggtaccttca gccgctatga gagtacacgc agtgggcgac 1740 ggatggagct gagtatgggg cccatccagg ctaatcacac gggcacaggc ctgctactga 1800 ccctgcagcc agaacagaag ttccagaaag tgaagggatt tggaggggcc atgacagatg 1860 ctgctgctct caacatcctt gccctgtcac cccctgccca aaatttgcta cttaaatcgt 1920 acttctctga agaaggaatc ggatataaca tcatccgggt acccatggcc agctgtgact 1980 tctccatccg cacctacacc tatgcagaca cccctgatga tttccagttg cacaacttca 2040 gcctcccaga ggaagatacc aagctcaaga tacccctgat tcaccgagcc ctgcagttgg 2100 cccagcgtcc cgtttcactc cttgccagcc cctggacatc acccacttgg ctcaagacca 2160 atggagcggt gaatgggaag gggtcactca agggacagcc cggagacatc taccaccaga 2220 cctgggccag atactttgtg aagttcctgg atgcctatgc tgagcacaag ttacagttct 2280 gggcagtgac agctgaaaat gagccttctg ctgggctgtt gagtggatac cccttccagt 2340 gcctgggctt cacccctgaa catcagcgag acttcattgc ccgtgaccta ggtcctaccc 2400 tcgccaacag tactcaccac aatgtccgcc tactcatgct ggatgaccaa cgcttgctgc 2460 tgccccactg ggcaaaggtg gtactgacag acccagaagc agctaaatat gttcatggca 2520 ttgctgtaca ttggtacctg gactttctgg ctccagccaa agccacccta ggggagacac 2580 accgcctgtt ccccaacacc atgctctttg cctcagaggc ctgtgtgggc tccaagttct 2640 gggagcagag tgtgcggcta ggctcctggg atcgagggat gcagtacagc cacagcatca 2700 tcacgaacct cctgtaccat gtggtcggct ggaccgactg gaaccttgcc ctgaaccccg 2760 aaggaggacc caattgggtg cgtaactttg tcgacagtcc catcattgta gacatcacca 2820 aggacacgtt ttacaaacag cccatgttct accaccttgg ccacttcagc aagttcattc 2880 ctgagggctc ccagagagtg gggctggttg ccagtcagaa gaacgacctg gacgcagtgg 2940 cactgatgca tcccgatggc tctgctgttg tggtcgtgct aaaccgctcc tctaaggatg 3000 tgcctcttac catcaaggat cctgctgtgg gcttcctgga gacaatctca cctggctact 3060 ccattcacac ctacctgtgg catcgccagt gagagctcga tcgttcaaac atttggcaat 3120 aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt 3180 tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg 3240 tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc 3300 gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cgaattc 3357
<210> 2
<211> 1448
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<220>
<223> Sequenza GluB4pro
<400> 2
tacagggttc cttgcgtgaa gaagggtggc ctgcggttca ccattaacgg tcacgactac 60 ttccagctag tactggtgac caacgtcgcg gcggcagggt caatcaagtc catggaggtt 120 atgggttcca acacagcgga ttggatgccg atggcacgta actggggcgc ccaatggcac 180 tcactggcct acctcaccgg tcaaggtcta tcctttaggg tcaccaacac agatgaccaa 240 acgctcgtct tcaccaacgt cgtgccacca ggatggaagt ttggccagac atttgcaagc 300 aagctgcagt tcaagtgaga ggagaagcct gaattgatac cggagcgttt cttttgggag 360 taacatctct ggttgcctag caaacatatg attgtatata agtttcgttg tgcgtttatt 420 ctttcggtgt gtaaaataac atacatgctt tcctgatatt ttcttgtata tatgtacaca 480 cacacgacaa atccttccat ttctattatt attgaacaat ttaattgcga gggcgagtac 540 ttgtctgttt accttttttt tttcagatgg cattttatag tttaaccttt catggaccgg 600 cagtagttct aaccatgaat gaaaagaaat catagtccac accacgcagg gacattgtgg 660 tcattttaga caagacgatt tgattaatgt cttgtatgat atggtcgaca gtgaggacta 720 acaaacatat ggcatatttt attaccggcg agttaaataa atttatgtca cagtaataaa 780 ctgcctaata aatgcacgcc agaaaatata atgataaaaa aaagaaaaga tacataagtc 840 cattgcttct acttttttaa aaattaaatc caacattttc tattttttgg tataaacttg 900 gaagtactag ttggatatgc aaaatcatct aacctccata tatttcatca atttgtttac 960 tttacatatg ggagaggata gtatgtcaaa gaaaatgaca acaagcttac aagtttctta 1020 ttttaaaagt tccgctaact tatcaagcat agtgtgccac gcaaaactga caacaaacca 1080 acaaatttaa ggagcgccta acttatcatc tatgacatac cgcacaaaat gataacatac 1140 tagagaaact ttattgcaca aaaggaaatt tatccataag gcaaaggaac atcttaaggc 1200 tttggatata catttaccaa caagcattgt ttgtattacc cctaaagcgc aagacatgtc 1260 atccatgagt catagtgtgt atatctcaac attgcaaagc tacctttttt ctattatact 1320 tttcgcatta taggctagat attatctata catgtcaaca aactctatcc ctacgtcata 1380 tctgaagatt cttttcttca ctatataagt tggcttccct gtcattgaac tcacatcaac 1440 cagcccaa 1448
<210> 3
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificiale
<220>
<223> Sequenza leader LL-TCK
<400> 3
acacgtattt ttacaacaat accaacaaca acaacaacaa acaacattac aattacgtat 60 ttctctctct aga 73
<210> 4
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificiale
<220>
<223> Sequenza nucleotidica codificante PSGluB4
<400> 4
atggccacca ttgcgttctc ccggctgtcc atctacttct gcgtgctgct gctgtgccac 60 ggctccatgg cc 72 <210> 5
<211> 1494
<212> DNA
<213> Sequenza nucleotidica codificante la forma matura della betaglucosidasi acida umana
<400> 5
gcccgcccct gcatccctaa aagcttcggc tacagctcgg tggtgtgtgt ctgcaatgcc 60 acatactgtg actcctttga ccccccgacc tttcctgccc ttggtacctt cagccgctat 120 gagagtacac gcagtgggcg acggatggag ctgagtatgg ggcccatcca ggctaatcac 180 acgggcacag gcctgctact gaccctgcag ccagaacaga agttccagaa agtgaaggga 240 tttggagggg ccatgacaga tgctgctgct ctcaacatcc ttgccctgtc accccctgcc 300 caaaatttgc tacttaaatc gtacttctct gaagaaggaa tcggatataa catcatccgg 360 gtacccatgg ccagctgtga cttctccatc cgcacctaca cctatgcaga cacccctgat 420 gatttccagt tgcacaactt cagcctccca gaggaagata ccaagctcaa gatacccctg 480 attcaccgag ccctgcagtt ggcccagcgt cccgtttcac tccttgccag cccctggaca 540 tcacccactt ggctcaagac caatggagcg gtgaatggga aggggtcact caagggacag 600 cccggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagttcct ggatgcctat 660 gctgagcaca agttacagtt ctgggcagtg acagctgaaa atgagccttc tgctgggctg 720 ttgagtggat accccttcca gtgcctgggc ttcacccctg aacatcagcg agacttcatt 780 gcccgtgacc taggtcctac cctcgccaac agtactcacc acaatgtccg cctactcatg 840 ctggatgacc aacgcttgct gctgccccac tgggcaaagg tggtactgac agacccagaa 900 gcagctaaat atgttcatgg cattgctgta cattggtacc tggactttct ggctccagcc 960 aaagccaccc taggggagac acaccgcctg ttccccaaca ccatgctctt tgcctcagag 1020 gcctgtgtgg gctccaagtt ctgggagcag agtgtgcggc taggctcctg ggatcgaggg 1080 atgcagtaca gccacagcat catcacgaac ctcctgtacc atgtggtcgg ctggaccgac 1140 tggaaccttg ccctgaaccc cgaaggagga cccaattggg tgcgtaactt tgtcgacagt 1200 cccatcattg tagacatcac caaggacacg ttttacaaac agcccatgtt ctaccacctt 1260 ggccacttca gcaagttcat tcctgagggc tcccagagag tggggctggt tgccagtcag 1320 aagaacgacc tggacgcagt ggcactgatg catcccgatg gctctgctgt tgtggtcgtg 1380 ctaaaccgct cctctaagga tgtgcctctt accatcaagg atcctgctgt gggcttcctg 1440 gagacaatct cacctggcta ctccattcac acctacctgt ggcatcgcca gtga 1494
<210> 6
<211> 253
<212> DNA
<213> Sequenza terminatore NOS
<400> 6
gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60 atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120 atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180 gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240 atgttactag atc 253
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificiale
<220>
<223> Sequenza primer sintetizzata artificialmente
<400> 7
gcatgcgaat tctacagggt tccttgcgtg 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificiale
<220>
<223> Sequenza primer sintetizzata artificialmente
<400> 8
tctagaagct atttgaggat gttattggaa
Claims (53)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la produzione di una proteina umana in pianta, in particolare un enzima lisosomiale umano ricombinante in endosperma di pianta, caratterizzato dal fatto che comprende: - una prima fase di trasformazione delle piante mediante la quale realizzare il confinamento della proteina in un endosperma non assorbito dall'embrione e permettere che la presenza di elevati quantitativi della proteina nell'endosperma del seme non determini effetti negativi sulla germinabilità e sull'energia germinativa del seme; - l'utilizzazione, nella prima fase di trasformazione delle piante, di un promotore endosperma-specifico a monte del gene codificante detta proteina e di un peptide segnale per l'invio cotraduzionale della proteina nascente nel lume del reticolo endoplasmico delle cellule componenti il tessuto dell'endosperma e per il suo accumulo tissutale; - una seconda fase d'accumulo della proteina all'interno dell'endosperma del seme delle piante.
- 2. Procedimento come nella rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la proteina viene accumulata nell'endosperma all'interno dei vacuoli di riserva proteica (Protein Storage Vacuoles, PSV) o nei corpi proteici (Protein Bodies, PB).
- 3. Procedimento come nella rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che prevede di realizzare un vettore di espressione in pianta per la trasformazione di dette piante, comprendente una sequenza nucleotidica contenente i seguenti elementi: i) un promotore endosperma-specifico di origine naturale o artificiale; ii) una regione 5' UTR di origine naturale o artificiale; iii) una sequenza nucleotidica di origine naturale o artificiale codificante un peptide segnale per l'invio della proteina ricombinante all'interno del lume del reticolo endoplasmico delle cellule componenti il tessuto dell'endosperma e per il suo accumulo tissutale; iv) una sequenza nucleotidica di origine naturale o artificiale codificante la forma matura della proteina umana; v) una regione 3' UTR di origine naturale o artificiale ; e che prevede di impiegare il vettore d'espressione così realizzato per la trasformazione delle piante.
- 4. Procedimento come nella rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che la sequenza nucleotidica contenuta nel vettore d'espressione è come indicata in SEQ ID NO: 1.
- 5. Procedimento come nella rivendicazione 3 o 4, caratterizzato dal fatto che il vettore d'espressione viene introdotto in ceppi batterici, i quali sono utilizzati, direttamente od indirettamente, per la trasformazione delle piante.
- 6. Procedimento come nella rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che il ceppo batterico è scelto in un gruppo comprendente le specie Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes.
- 7. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che le piante trasformate sono cereali.
- 8. Procedimento come nella rivendicazione 5 e 7 o 6 e 7, caratterizzato dal fatto che il ceppo batterico viene utilizzato per la trasformazione di calli embriogenici di riso (Oryza sativa ssp. japonica, varietà CR W3).
- 9 .Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che l'enzima lisosomiale è la beta-glucosidasi acida umana.
- 10. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 8, caratterizzato dal fatto che l'enzima lisosomiale è 1'alfa-glucosidasi acida umana.
- 11. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che comprende una terza fase di lavorazione industriale del seme delle piante.
- 12. Procedimento come nella rivendicazione 11, caratterizzato dal fatto che la lavorazione industriale prevede di sottoporre i semi maturi raccolti dalle piante di cereali trasformate ad operazioni di sbramatura e sbiancatura per l'allontanamento della componente fibrosa, del germe, e dello strato aleuronico contenente proteine contaminanti.
- 13. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che comprende una quarta fase di purificazione della proteina ottenuta.
- 14. Procedimento come nella rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che la fase di purificazione prevede nell'ordine una cromatografia a interazioni idrofobiche, una cromatografia a scambio ionico e una gel-filtrazione .
- 15. Procedimento come nella rivendicazione 13 o 14, caratterizzato dal fatto che la fase di purificazione prevede l'applicazione di resine cromatografiche affini per composizione chimica e/o struttura e/o funzione, di parziale modificazione dei parametri di eluizione, di duplicazione di un passaggio per ricarico dell'eluato in colonna.
- 16. Sequenza nucleotidica atta all'utilizzo per la trasformazione di una pianta per l'espressione di una proteina umana in pianta, in particolare un enzima lisosomiale umano ricombinante in endosperma di pianta, caratterizzata dal fatto che comprende i seguenti elementi: i) un promotore endosperma-specifico di origine naturale o artificiale; ii) una regione 5' UTR di origine naturale o artificiale; iii) una sequenza nucleotidica di origine naturale o artificiale codificante un peptide segnale per l'invio della proteina ricombinante all'interno del lume del reticolo endoplasmico delle cellule componenti il tessuto dell'endosperma e per il suo accumulo tissutale; iv) una sequenza nucleotidica di origine naturale o artificiale codificante la forma matura della proteina umana; v) una regione 3' UTR di origine naturale o artificiale.
- 17. Sequenza come nella rivendicazione 16, caratterizzata dal fatto che il promotore i) è il promotore della glutelina 4 di riso (GluB4).
- 18. Sequenza come nella rivendicazione 16 o 17, caratterizzato dal fatto che la regione 5' UTR ii) è la sequenza 5' UTR nota come LL-TCK.
- 19. Sequenza come nella rivendicazione 16, 17, o 18, caratterizzata dal fatto che la sequenza nucleotidica dell'elemento iii) è la sequenza PSGluB4 codificante il peptide segnale utilizzato in riso per veicolare il precursore della glutelina 4 all'interno del reticolo endoplasmico.
- 20. Sequenza come in una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 16 alla 19, caratterizzata dal fatto che la sequenza nucleotidica dell'elemento iv) è la sequenza GCase codificante la forma umana matura della beta-glucosidasi acida.
- 21. Sequenza come in una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 16 alla 20, caratterizzata dal fatto che la regione 3' UTR dell'elemento v) è il terminatore NOS o il terminatore del gene Glub4.
- 22. Sequenza nucleotidica come in una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 16 alla 21, come indicata in SEQ ID NO: 1.
- 23. Sequenze complementari alle sequenze nucleotidi che come in una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 16 alla 22.
- 24. Sequenze derivanti da processi di mutazione, quali delezioni, inserzioni, transizioni, trasversioni di uno o più nucleotidi delle sequenze come in una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 16 alla 22 o delle sequenze ad esse complementari come nella rivendicazione 23.
- 25. Combinazioni delle sequenze nucleotidiche come in una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 16 alla 22 codificanti la forma matura della beta-glucosidasi acida umana con elementi promotore, sequenze per l'invio nel reticolo endoplasmico e regioni non tradotte in 5' e 3' diverse da quelle presenti nella sequenza come indicata in SEQ ID NO: 1, adatte a ottenere la sintesi e l'accumulo dell'enzima specificamente nell'endosperma del seme o con sequenze nucleotidiche complementari a dette sequenze.
- 26. Combinazioni degli elementi i), ii), iii), iv) e v) come nella rivendicazione 16 con sequenze codificanti l'enzima maturo diverse da quella riportata nella sequenza come indicata in SEQ ID NO: 1 per la presenza di mutazioni sinonime o poliformismi rinvenibili all'interno della specie umana o combinazioni realizzate con sequenze nucleotidiche complementari a dette sequenze.
- 27. Combinazioni degli elementi di sequenze nucleotidiche i), ii), iii), iv) e v) come nella rivendicazione 16 con sequenze codificanti le forme mature o i precursori di altri enzimi lisosomiali, o combinazioni realizzate con sequenze nucleotidiche complementari a dette sequenze.
- 28. Combinazioni come nella rivendicazione 27, in cui l'enzima è 1'alfa-glucosidasi acida umana.
- 29. Sequenza come in una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 16 alla 28 caratterizzata dal fatto che le piante trasformate sono cereali.
- 30. Vettore molecolare di espressione di proteina umana in pianta, in particolare di un enzima lisosomiale umano in endosperma di pianta, comprendente la sequenza nucleotidica come in una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 16 alla 29.
- 31. Vettore come nella rivendicazione 30, caratterizzato dal fatto che l'enzima lisosomiale è la betaglucosidasi acida umana.
- 32. Vettore come nella rivendicazione 30, caratterizzato dal fatto che l'enzima lisosomiale è l'alfaglucosidasi acida umana.
- 33. Vettore come nella rivendicazione 30, 31 o 32, caratterizzato dal fatto che è un plasmide.
- 34. Uso del vettore d'espressione come in una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 30 alla 33 per la trasformazione di una pianta per la produzione di una proteina, in particolare un enzima lisosomiale umano.
- 35. Ceppo batterico comprendente vettori di espressione come in una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 30 alla 33.
- 36. Ceppo batterico come nella rivendicazione 35 scelto in un gruppo comprendente le specie Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes.
- 37. Cellule vegetali trasformate con vettori di espressione come in una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 30 alla 33.
- 38. Cellule come nella rivendicazione 37 caratterizzate dal fatto che sono cellule di cereali.
- 39. Cellule come nella rivendicazione 38 appartenenti alla specie del riso coltivato (Oryza sativa L.).
- 40. Cellule come nella rivendicazione 38 appartenenti alla famiglia delle Graminaceae (Poaceae) quali ad esempio mais (Zea mays L.), orzo (Hordeum vulgare L.) e frumento (Triticum spp.).
- 41. Seme di pianta trasformata per l'espressione di una proteina umana, in particolare un enzima lisosomiale umano, caratterizzato dal fatto che contiene un vettore di espressione come in una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 30 alla 33.
- 42. Seme come nella rivendicazione 41, caratterizzato dal fatto che la pianta trasformata è appartenente ai cereali.
- 43. Seme come nella rivendicazione 41 o 42, caratterizzato dal fatto che la pianta trasformata è appartenente alla specie del riso coltivato (Oryza sativa L.).
- 44. Pianta trasformata per l'espressione di una proteina umana, in particolare un enzima lisosomiale umano, caratterizzata dal fatto che viene trasformata mediante un vettore di espressione come in una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 30 alla 33.
- 45. Pianta trasformata come nella rivendicazione 44, caratterizzata dal fatto che è un cereale.
- 46. Pianta trasformata come nella rivendicazione 44 o 45 appartenente alla specie del riso coltivato (Oryza sativa L.).
- 47. Progenie ottenute per autofecondazione o incrocio, oppure linee trasformate selezionate a partire da una pianta trasformata come nella rivendicazione 44. 45 o 46.
- 48. Seme come nella rivendicazione 41, 42 o 43 per l'uso nel trattamento terapeutico.
- 49. Uso del seme come nella rivendicazione 41, 42 o 43 per la produzione di un medicamento per un trattamento terapeutico enzimatico di sostituzione.
- 50. Uso del seme come nella rivendicazione 49 per la produzione di un medicamento per un trattamento terapeutico enzimatico di sostituzione nelle seguenti malattie: malattia di Gaucher, glicogenosi 2, malattia di Fabry, malattia di Niemann-Pick B, Mucopolisaccaridosi I, II, IV.
- 51. Seme come nella rivendicazione 41, 42 o 43 per l'uso nel trattamento terapeutico enzimatico di sostituzione .
- 52. Seme come nella rivendicazione 51 per l'uso nel trattamento terapeutico enzimatico di sostituzione nelle seguenti malattie: malattia di Gaucher, glicogenosi 2, malattia di Fabry, malattia di Niemann-Pick B, Mucopolisaccaridosi I, II, IV.
- 53. Procedimento per la produzione di una proteina umana in pianta, in particolare un enzima lisosomiale umano ricombinante in endosperma di cereali, sostanzialmente come descritto, con riferimento agli annessi disegni.
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