FR2898359A1

FR2898359A1 - Pharmaceutical composition, useful to treat asthma, kidney cancer, osteopetrosis, scleroderma, idiopathic pulmonary fibrosis, septic shock, allergic dermatitis and rheumatoid arthritis, comprises thermostable human interferon-gamma variant

Info

Publication number: FR2898359A1
Application number: FR0602064A
Authority: FR
Inventors: Jose Berenguer; Marc Delcourt; Helene Chautard; Thierry Menguy
Original assignee: Biomethodes SA
Current assignee: Biomethodes SA
Priority date: 2006-03-08
Filing date: 2006-03-08
Publication date: 2007-09-14
Anticipated expiration: 2026-03-08
Also published as: FR2898359B1

Abstract

Pharmaceutical composition comprises human interferon-gamma variants with improved thermostability or functional fragment e.g. S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R or T95V, positions indicated corresponding to SEQ ID NO: 2 (not defined). The variant does not carry non-peptide group attached on the residue introduced by the first substitution. Independent claims are included for: (1) an antiviral, antiproliferative and/or immunomodulator medicament comprising the pharmaceutical composition and an active ingredient principle; (2) a nucleic acid coding the variant; (3) an expression cassette comprising of a nucleic acid; (4) a vector comprising the nucleic acid or the expression cassette; and (5) a host cell comprising the nucleic acid, the expression cassette or the vector. ACTIVITY : Antiasthmatic; Antibacterial; Dermatological; Hemostatic; Cytostatic; Osteopathic; Antiinflammatory; Hepatotropic; Virucide; Immunosuppressive; Antiallergic; Antiarthritic; Antirheumatic. MECHANISM OF ACTION : None given.

Description

VARIANTS AMELIORES DE L'INTERFERON- GAMMA HUMAIN (IFNy) Introduction LaIMPROVED VARIANTS OF THE HUMAN INTERFERON- GAMMA (IFNy) Introduction

présente invention relève du domaine de l'amélioration des protéines. Elle porte sur l'amélioration de l'interféron y humain (IFNy), ainsi que des compositions comprenant un IFNy amélioré, un acide nucléique codant celui-ci, et leurs utilisations. The present invention is in the field of protein enhancement. It relates to the enhancement of human interferon-y (IFNy), as well as compositions comprising an improved IFNγ, a nucleic acid encoding it, and their uses.

L'IFNy est une cytokine de 166 acides aminés. La molécule possède un peptide signal permettant sa translocation membranaire et sa sécrétion, un site de clivage et une partie dite protéine mature. Le peptide signal de l'IFNy est constitué des 23 premiers ou des 20 premiers acides aminés selon les auteurs. En effet, il existe un doute dans la littérature sur la présence du triplet d'acides aminés Cys-Tyr-Cys (CYC) en N-terminal de la séquence mature. L'IFNy existe sous forme d'un homodimère dans lequel les deux sous unités ne sont pas liées covalemment. Chaque sous-unité possède deux sites de N- glycosylation (positions 48 et 120 du précurseur de 166 aa). On notera, si les CYC ne sont pas inclus, l'absence de ponts disulfures et de cystéines sur la protéine mature in vivo. Chacun de ces monomères possèdent six hélices alpha avec une partie compacte constituée des 4 premières hélices alpha les plus N-terminales (hélices alpha A, B, C, et D) et une partie C-terminale composée de deux hélices alpha isolées et étroitement en interaction avec le second monomère d'IFNy. IFNγ is a cytokine of 166 amino acids. The molecule has a signal peptide allowing its membrane translocation and its secretion, a cleavage site and a so-called mature protein part. The signal peptide of IFNγ is made up of the first 23 or first 20 amino acids according to the authors. Indeed, there is doubt in the literature on the presence of the amino acid triplet Cys-Tyr-Cys (CYC) in N-terminal of the mature sequence. IFNy exists as a homodimer in which the two subunits are not covalently bound. Each subunit has two N-glycosylation sites (positions 48 and 120 of the 166 aa precursor). It will be noted, if the CYCs are not included, the absence of disulfide bridges and cysteines on the mature protein in vivo. Each of these monomers has six alpha helices with a compact part consisting of the first 4 most N-terminal alpha helices (alpha A, B, C, and D helices) and a C-terminal part consisting of two isolated alpha helices and closely interaction with the second IFNy monomer.

L'IFNy est l'exemple type de cytokine pléiotrope au large spectre d'activités. En effet, les interférons (IFNs) sont doués d'activités telles que l'inhibition de la réplication virale, l'inhibition de la multiplication cellulaire et l'induction de l'apoptose. IFNy is the typical example of a pleiotropic cytokine with a broad spectrum of activities. Indeed, interferons (IFNs) are endowed with activities such as inhibition of viral replication, inhibition of cell multiplication and induction of apoptosis.

Notamment, la stimulation des macrophages par l'IFNy induit les réponses suivantes : - l'augmentation de la phagocytose et de la bactéricidie (mécanismes directs anti-microbiens et anti-tumoraux) ; - la stimulation des voies de présentation et de dégradation des antigènes, 30 expression du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) de type I et II à la surface des macrophages ; 2 - la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes sécréteurs d'anticorps, ce qui a pour conséquence la production d'IgG et l'activation du complément ; - l'activation de la NO synthase donnant naissance à la production de NO et de radicaux libres oxygénés cytotoxiques ; et/ou - l'augmentation de la production de cytokines et la production d'IFN endogène. L'action de l'IFNy sur les lymphocytes T est de favoriser leur différenciation modulant ainsi la réponse immunitaire spécifique. In particular, stimulation of macrophages by IFNγ induces the following responses: - the increase in phagocytosis and bactericidal activity (direct anti-microbial and anti-tumor mechanisms); stimulation of the pathways of presentation and degradation of antigens, expression of the major histocompatibility complex (MHC) of type I and II on the surface of macrophages; 2 - the differentiation of B lymphocytes into antibody secreting plasma cells, which results in the production of IgG and the activation of complement; activation of the NO synthase giving rise to the production of NO and cytotoxic oxygenated free radicals; and / or - increased cytokine production and endogenous IFN production. The action of IFNy on T lymphocytes is to promote their differentiation thus modulating the specific immune response.

En raison de son large spectre d'activités (antivirale, antiproliférative et immunomodulatrice), l'IFNy est une molécule développée comme agent thérapeutique humain dans le traitement de nombreuses maladies, de natures variées. Les IFNy commerciaux (Actimmune, et Biogamma) sont aujourd'hui utilisés pour deux indications thérapeutiques principales : la granulomatose chronique et la fibrose pulmonaire idiopathique, en association avec la prednisolone par voie orale. De nombreuses nouvelles indications thérapeutiques secondaires sont actuellement en cours de développement à différentes phases cliniques, en particulier pour leur rôle d'immuno-suppresseur par exemple en complément des IFNa pégylés/ribavirine dans le cadre du traitement de l'Hépatite C. On peut citer aussi : infections à mycobactérie atypique ; cancer du rein ; ostéopétrose ; sclérodermie généralisée ; hépatite chronique à virus B ; hépatite chronique à virus C ; différentes infections virales dont à papillomavirus ; choc septique ; dermatite allergique ; la polyarthrite rhumatoïde ; cancer de l'ovaire ; la fibrose du foie ; l'asthme ; et le lymphome. Because of its broad spectrum of activities (antiviral, antiproliferative and immunomodulatory), IFNy is a molecule developed as a human therapeutic agent in the treatment of many diseases, of various natures. Commercial IFNy (Actimmune, and Biogamma) are now used for two main therapeutic indications: chronic granulomatosis and idiopathic pulmonary fibrosis, in combination with oral prednisolone. Many new secondary therapeutic indications are currently being developed at different clinical phases, in particular for their role as immunosuppressors, for example in addition to pegylated IFNα / ribavirin in the context of the treatment of Hepatitis C. Mention may be made of also: atypical mycobacterium infections; kidney cancer; osteopetrosis; generalized scleroderma; chronic hepatitis B virus; chronic hepatitis C virus; various viral infections including papillomavirus; septic shock ; allergic dermatitis; rheumatoid arthritis; ovarian cancer; fibrosis of the liver; asthma; and lymphoma.

Les principaux effets indésirables des IFNs sont dose-dépendants et donc étroitement liés au rythme d'administration. Ces effets sont cumulatifs et s'aggravent avec le temps. Outre la toxicité aiguë entraînant après injection (2 à 8 heures après injection sous cutanée) malaises, nausées et vomissements, les effets indésirables les plus fréquents sont les symptômes pseudo-grippaux (frissons, céphalées, asthénie), les réactions inflammatoires au site d'injection et l'élévation des transaminases du foie. Les effets indésirables les plus sérieux sont des cas de dépressions, lymphopénies ou de rares cas de nécrose au site d'injection sous-cutanés. Chez des malades traités avec de fortes doses d'IFN, un diabète peut survenir après le début du traitement. En outre, la tolérance de l'injection d'IFN est parfois limitée dans le temps et se traduit par le développement d'anticorps neutralisants (chez approximativement 10-20% des patients). The main adverse effects of IFNs are dose-dependent and therefore closely related to the rate of administration. These effects are cumulative and worsen over time. In addition to the acute toxicity resulting after injection (2-8 hours after subcutaneous injection), nausea and vomiting, the most frequent adverse effects are flu-like symptoms (chills, headache, asthenia), inflammatory reactions at the site of injection and elevation of liver transaminases. The most serious adverse effects are cases of depression, lymphopenia or rare cases of necrosis at the subcutaneous injection site. In patients treated with high doses of IFN, diabetes may occur after the start of treatment. In addition, the tolerance of IFN injection is sometimes limited in time and results in the development of neutralizing antibodies (in approximately 10-20% of patients).

La demi-vie de l'IFNy humain recombinant in vivo est de 25-35 min seulement. Pour cette raison, un traitement efficace avec l'IFNy implique des injections fréquentes. Dès 1990, et l'utilisation du l'IFNy humain recombinant commercialisé sous le nom d'Actimmune (Int:ermune inc), le besoin d'améliorer la demi-vie de l'IFNy s'est fait ressentir, d'autant plus que de tous les interférons la stabilité thermique de l'IFNy est la plus faible. Un IFNy plus stable permettrait en effet une fréquence d'administration moins importante, ce qui améliorerait le confort du patient. Un IFNy plus stable permettrait également un meilleur effet in vivo, puisque l'effet in vivo est la conséquence de la combinaison entre l'activité spécifique de la protéine et sa durée d'action. Les intérêts économiques à améliorer la stabilité de l'IFNy sont donc clairs : une molécule plus stable (soit parce qu'il s'agit d'un variant, soit parce que des additifs sont ajoutés à la molécule, soit parce que la formulation est améliorée, etc...), pourra permettre d'obtenir des médicaments de seconde génération, susceptibles de remplacer les molécules actuellement sur le marché. On peut même considérer qu'un IFNy plus stable permettrait d'étendre les indications de cette molécule : En effet, dans le cas d'un certain nombre de pathologies, les IFNa et g, entre autres molécules, ont constitué le traitement de référence. L'IFNy n'a pas été retenu en raison de sa durée de vie trop courte. Enfin, à plus long terme, on peut espérer qu'un IFNy stabilisé puisse permettre des formulations différentes d'administration de la molécule (forme orale notamment). The half-life of recombinant human IFNγ in vivo is only 25-35 min. For this reason, effective treatment with IFNy involves frequent injections. Since 1990, and the use of the recombinant human IFNγ marketed under the name of Actimmune (Int: ermune inc), the need to improve the half-life of IFNy has been felt, especially that of all the interferons the thermal stability of the IFNy is the weakest. A more stable IFNy would indeed allow a lower frequency of administration, which would improve the comfort of the patient. A more stable IFNγ would also allow a better effect in vivo, since the in vivo effect is the result of the combination between the specific activity of the protein and its duration of action. The economic interests to improve the stability of IFNy are therefore clear: a more stable molecule (either because it is a variant, or because additives are added to the molecule, or because the formulation is improved, etc ...), will allow to obtain second generation drugs, likely to replace the molecules currently on the market. One could even consider that a more stable IFNy would make it possible to extend the indications of this molecule: Indeed, in the case of a certain number of pathologies, the IFNa and g, among other molecules, constituted the treatment of reference. IFNy was not selected because of its short life span. Finally, in the longer term, it can be hoped that a stabilized IFNγ could allow different formulations of administration of the molecule (especially oral form).

De nombreux travaux de recherche ont déjà été menés sur l'IFNy : Variants naturels de l'IFNy Plusieurs formes mutées naturelles ont été décrites. L'une de ces formes est celle incluant la séquence N-terminale CYC. Deux variants naturels de l'IFNy humain présentant une mutation ponctuelle ont également été décrits K29Q et R160Q (Nishi et al. (J. Biochem. 97:153-159, 1985). Mais ces polymorphismes ne sont associés pour l'instant à aucun effet. Many research studies have already been conducted on IFNy: Natural variants of IFNy Several natural mutated forms have been described. One of these forms is that including the N-terminal sequence CYC. Two naturally occurring variants of human IFNγ with a point mutation have also been described K29Q and R160Q (Nishi et al., J. Biochem 97: 153-159, 1985), but these polymorphisms are not associated with any of these at present. effect.

Mutants artificiels de l'IFNy US 4,832,959 contient des polypeptides avec des séquences partielles de l'IFNy humain comprenant les résidus 1-127, 5-146 et 5-127 de l'IFNy mature et possédant les 3 acides aminés additionnels CYC. US 6,120,762 décrit un fragment peptidique comprenant les résidus 118-157 de l'IFNy précurseur et son utilisation. Artificial mutants of IFNγ US 4,832,959 contain polypeptides with partial sequences of human IFNγ including residues 1-127, 5-146 and 5-127 of mature IFNγ and possessing the 3 additional amino acids CYC. US 6,120,762 discloses a peptide fragment comprising residues 118-157 of the precursor IFNγ and its use.

WO2004005341 décrit les méthodes pour générer et produire une série de mutants 10 actifs de l'IFNy comprenant les 143 acides aminés de la forme mature de l'IFNy sans CYC avec une variation comprenant au moins une des mutations dans le groupe S155 et S165 et au moins une mutation dans le groupe R160, R162 et R163. Ces mutants seraient utiles notamment dans le traitement de la fibrose pulmonaire idiopathique. WO2004005341 discloses the methods for generating and producing a series of IFNy active mutants comprising the 143 amino acids of the mature form of IFNy without CYC with a variation comprising at least one of mutations in the S155 and S165 group and at minus one mutation in the group R160, R162 and R163. These mutants would be useful especially in the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis.

15 De nombreuses formes tronquées à divers endroits de la région C-terminale de l'IFNy ont été décrites. EP 0 219 781 décrit l'utilisation de séquences partielles d'IFNy humain comprenant les acides amines 3-124 de la protéine mature. L'importance des 20 derniers acides aminés sur l'activité et la stabilité de l'IFNy a constitué et constitue encore une source d'études controversées. Des IFNy humains avec l'extrémité Cterminale tronquée ont été décrits par Slodowski et al qui ont réalisé des troncatures de taille différente (de 10 à 20 acides aminés tronqués) (Eur. J. Biochem. 202:1133-1140, 1991). Many truncated forms at various locations in the C-terminal region of IFNγ have been described. EP 0 219 781 discloses the use of partial sequences of human IFNγ comprising amino acids 3-124 of the mature protein. The importance of the last 20 amino acids on the activity and stability of IFNy has been and still is a source of controversial studies. Human IFNγ's with the truncated end-end were described by Slodowski et al who performed truncations of different size (from 10 to 20 truncated amino acids) (Eur J. Biochem 202: 1133-1140, 1991).

Dans le brevet EP 0 306870, des variants de l'IFNy ont été générés avec une activité qui 25 est significativement augmentée en coupant de 7 à 11 résidus C-terminaux. De plus, il est connu que, lorsque l'IFNy est produit en cellules de mammifères, une population hétérogène de polypeptide IFNy est obtenue à cause de troncatures naturelles par des activités d'endo- et d'exo- protéases sécrétées par la cellule hôte productrice. L'une des façons de résoudre ce problème de production est décrit dans le brevet US 6,958,388 : 30 cela consiste à produire un IFNy tronqué contenant les 155 premiers acides aminés de la protéine totale associée par exemple aux mutations améliorant la glycosylation de la molécule (S122T, E61N+S63T).5 WO 2004/022593 analyse in silico des séquences de nombreuses protéines à visée thérapeutique, y compris l'IFNy, pour l'existence de sites de protéolyse sensibles à des protéases présentes dans le sérum humain (telles que la trypsine, l'endoprotéinase Asp- N, la chymotrypsine et la proline endopeptidase). Les mutations censées apporter une protection contre les protéases citées sont les suivantes : L53V, L53I, K57Q, K57N, K60Q, K60N, E61Q, E61N, E61H, E62Q, E62N, E62H, K78Q, K78N, K81Q, K81N, K84Q, K84N, D85Q, D85N, D86Q. Les améliorations (activité ou stabilité) susceptibles d'être apportées par ces mutations 10 n'ont à ce jour pas été vérifiées expérimentalement pour aucun de ces mutants : il ne s'agit donc ici que de théories scientifiques. In EP 0306870, variants of IFNγ have been generated with an activity which is significantly increased by cutting 7 to 11 C-terminal residues. Moreover, it is known that, when IFNγ is produced in mammalian cells, a heterogeneous population of IFNγ polypeptide is obtained due to natural truncations by endo- and exoprotease activities secreted by the host cell. producer. One of the ways to solve this production problem is described in US Pat. No. 6,958,388: this consists in producing a truncated IFNγ containing the first 155 amino acids of the total protein associated for example with mutations improving the glycosylation of the molecule (S122T , E61N + S63T) .5 WO 2004/022593 in silico analysis of sequences of numerous therapeutic proteins, including IFNγ, for the existence of proteolysis sites sensitive to proteases present in human serum (such as trypsin, endoproteinase Asp-N, chymotrypsin and proline endopeptidase). The mutations expected to provide protection against the proteases mentioned are: L53V, L53I, K57Q, K57N, K60Q, K60N, E61Q, E61N, E61H, E62Q, E62N, E62H, K78Q, K78N, K81Q, K81N, K84Q, K84N, D85Q, D85N, D86Q. The improvements (activity or stability) that can be made by these mutations have so far not been experimentally verified for any of these mutants: therefore, these are only scientific theories.

Mutants de l'IFNy avec une amélioration de la thermostabilité On sait que 1' IFNy (sous forme monomérique en particulier) est peu stable. Cela se 15 traduit par une sensibilité importante de la protéine dite sauvage à deux critères : pH acide et température. Il est attendu que la stabilité accrue de mutants dans ces conditions non physiologiques sera associée au même gain de stabilité dans les conditions physiologiques. Des travaux ont ainsi porté sur la recherche de mutants ayant en premier lieu gagné en thermostabilité, ce paramètre étant le plus simple à mesurer. 20 WO 92/08737 décrit des variants de l'IFNy comprenant une méthionine additionnelle en N-terminal en position -1, les 132 premiers acides aminés de la séquence mature sans CYC, le 133ème acide aminé étant une leucine au lieu d'une glutamine. Ce variant, tronqué des 10 acides aminés Cterminaux de l'IFNy, est appelé Delta 10 L ou encore 25 C l OL. Il aurait une activité biologique améliorée et présente une stabilité à la température légèrement améliorée (tm 55 C) comparée à l'IFNy sauvage (tm = 52-53 C). Mutants of IFNγ with an Improvement of Thermostability It is known that IFNγ (in monomeric form in particular) is not very stable. This results in a high sensitivity of the so-called wild-type protein to two criteria: acidic pH and temperature. It is expected that the increased stability of mutants under these non-physiological conditions will be associated with the same stability gain under physiological conditions. Work has thus focused on the search for mutants having first gained thermostability, this parameter being the simplest to measure. WO 92/08737 discloses variants of IFNγ comprising an additional N-terminal methionine at the -1 position, the first 132 amino acids of the mature sequence without CYC, the 133rd amino acid being a leucine instead of a glutamine . This truncated variant of the 10 amino acids Cterminal IFNy is called Delta 10 L or 25 C l OL. It would have improved biological activity and show slightly improved temperature stability (tm 55 C) compared to wild IFNγ (tm = 52-53 C).

US 4,898,931 décrit une série de mutants de l'IFNy produit chez E.coli avec des 30 troncatures des 9 derniers résidus C-terminaux couplées aux mutations de certains acides aminés N- et C-terminaux. Ces mutations introduisent des ponts disulfures qui confèrent alors à ces molécules des propriétés thermostables tout en conservant une 6 activité anti-virale et anti-tumorale. Dans ce brevet, les acides aminés CYC font partie de la protéine mature et des variants des cystéines de ce triplet ont été réalisés. Sauvage (séquence totale) 25% d'activité résiduelle après 1 h à 50 C Mutation Ml57C + Delta 9 81% d'activité résiduelle après 1 h à 50 C Mutation C21S-M157C et Delta 9 86% d'activité résiduelle après 1 h à 50 C Mutation C23 S-M 157C et Delta 9 98% d'activité résiduelle après 1 h à 50 C Mutation C21S-C23S-M157C et Delta 9 23% d'activité résiduelle après 1 h à 50 C US 4,898,931 describes a series of mutants of IFNγ produced in E. coli with truncations of the last 9 C-terminal residues coupled to mutations of certain N- and C-terminal amino acids. These mutations introduce disulfide bridges which then confer on these molecules thermostable properties while maintaining anti-viral and anti-tumor activity. In this patent, the amino acids CYC are part of the mature protein and variants of the cysteines of this triplet were made. Wild (total sequence) 25% residual activity after 1 h at 50 ° C. Mutation Ml57C + Delta 9 81% residual activity after 1 h at 50 ° C. Mutation C21S-M157C and Delta 9 86% residual activity after 1 h at 50 C Mutation C23 SM 157C and Delta 9 98% residual activity after 1 h at 50 C Mutation C21S-C23S-M157C and Delta 9 23% residual activity after 1 h at 50 C

US 6,046,034 décrit des variants thermostables de l'IFNy humain pour lesquels des paires de cystéines ont été incorporées à des endroits précis de la structure de l'IFNy de façon à créer des ponts disulfures inter-monomère et intra-monomère et ainsi assurer la stabilisation de l'homodimère d'IFNy. La seule paire de cystéines qui permet la conservation de l'activité biologique de l'IFNy est E30C-S92C qui relie les hélices A et D d'un même monomère, les autres paires de cystéines inter-monomère détruisant l'activité biologique de l'IFNy. Dans ce brevet, ces mutants possèdent aussi une extrémité C-terminale tronquée correspondant au mutant Delta 10. No. 6,046,034 discloses thermostable variants of human IFNγ for which pairs of cysteines have been incorporated at specific locations in the structure of IFNγ so as to create inter-monomer and intra-monomer disulfide bridges and thereby provide stabilization. of the IFNy homodimer. The only pair of cysteines that preserve the biological activity of IFNy is E30C-S92C, which links helices A and D of the same monomer, the other pairs of inter-monomeric cysteines destroying the biological activity of IFNy. 'IFN. In this patent, these mutants also have a truncated C-terminus corresponding to the Delta 10 mutant.

La modification de l'IFNy par ajout de polymères a été reportée par Kita et al. (Drug Des. Deliv. 6:157-167, 1990), et dans les brevets EP 236987 et US 5,109,120.). 20 WO 99/03887 décrit des variants de protéines de la super-famille structurale de l'hormone de croissance (dont fait partie 1'IFNy). Dans ce brevet, certains résidus non essentiels de la structure peptidique sont remplacés par une cystéine : l'IFNy y est décrit comme exemple de cette super-famille mais aucun exemple expérimental de 25 modifications n'est décrit dans le cas de l'IFNy. Modification of IFNy by addition of polymers has been reported by Kita et al. (Drug Des., Deliv., 6: 157-167, 1990), and in EP 236987 and US 5,109,120.). WO 99/03887 discloses protein variants of the structural super-family of growth hormone (of which IFNγ is part). In this patent, some non-essential residues of the peptide structure are replaced by a cysteine: IFNγ is described as an example of this super-family but no experimental example of modifications is described in the case of IFNy.

WO 01/36001 décrit de nouvelles molécules d'IFNy modifiées par insertions de sites de glycosylations et/ou de dérivation par des entités type PEG. Ces molécules ont des propriétés améliorées telles que une demi-vie améliorée et/ou une bio-disponibilité 30 améliorée. WO 01/36001 discloses novel IFNγ molecules modified by insertion of glycosylation sites and / or derivation by PEG type entities. These molecules have improved properties such as improved half-life and / or improved bioavailability.

WO03002152 décrit une composition pharmaceutique contenant un dérivé sulfoalkyl éther cyclodextrine d'interféron, dont la stabilité serait améliorée. WO03002152 discloses a pharmaceutical composition containing a sulfoalkyl ether interferon cyclodextrin derivative, the stability of which would be improved.

Aucun de ces variants n'est pour l'instant disponible sous forme de médicament. C'est pour cette raison qu'il existe toujours une forte demande pour un IFNy amélioré, et notamment un [FNy présentant une meilleure stabilité dans les conditions physiologiques. Ce gain de stabilité en conditions physiologiques peut être évalué par un gain de stabilité à haute température. Résumé de l'invention La présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci. None of these variants are currently available as a drug. It is for this reason that there is still a strong demand for improved IFNγ, and in particular a [FNy having a better stability under physiological conditions. This gain in stability under physiological conditions can be evaluated by a gain of stability at high temperature. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a thermostable variant of human IFNγ or a functional fragment thereof.

En particulier, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en C21 G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A.147M, A147P, A147S, M157Q, M157W, M157L, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E et S165V. De préférence, le variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprend au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en C21W, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, K109C, K109L, K109Q, K110H, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157W, M157Q, M157L, L158C, L158I, L158W, F159C, F159V, R160A, R162D, R162Q et R162E. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, le variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprend au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en Q24A, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, K60H, K60R, E61K, E62C, 8 S63C, K109C, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157Q, M157L, L1581, F159C, F159V, R160A, R162E, R162Q et R162D. In particular, the present invention relates to a thermostable variant of human IFNγ or a functional fragment thereof comprising at least one selected from the group consisting of C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D. , V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K , M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A.147M, A147P, A147S, M157Q , M157W, M157L, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E and S165V. Preferably, the thermostable variant of human IFNγ or a functional fragment thereof comprises at least one substitution selected from the group consisting of C21W, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, K109C, K109L, K109Q, K110H, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157W, M157Q, M157L, L158C, L158I, L158W, F159C, F159V, R160A, R162D, R162Q and R162E. In an even more preferred embodiment, the thermostable variant of human IFNγ or a functional fragment thereof comprises at least one substitution selected from the group consisting of Q24A, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, K60H, K60R, E61K, E62C, S63C, K109C, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157Q, M157L, L1581 , F159C, F159V, R160A, R162E, R162Q and R162D.

La présente invention concerne également un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant soit une unique substitution C23S ou M157C, soit une substitution C23S ou M157C en combinaison avec une ou plusieurs substitutions sélectionnées parmi le groupe consistant en C21 G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157L, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E et S165V. Par le terme présentant est entendu que le variant ou le fragment de celui-ci ne comporte que les substitutions indiquées. The present invention also relates to a thermostable variant of human IFNγ or a functional fragment thereof having either a single C23S or M157C substitution, or a C23S or M157C substitution in combination with one or more substitutions selected from the group consisting of C21 G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157L, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E and S165V. By the term, it is understood that the variant or fragment thereof contains only the substitutions indicated.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne en particulier un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une unique substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en C21 G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, C23S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157W, M157L, M157C, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E et S165V. De préférence, le variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présente une unique substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en C21W, C23S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, K109C, K109L, K109Q, K110H, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157W, M157Q, M157L, M157C, L158C, L158I, L158W, F159C, F159V, R160A, R162D, R162Q et R162E. In a particular embodiment, the present invention particularly relates to a thermostable variant of human IFNγ or a functional fragment thereof having a single substitution selected from the group consisting of C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, C23S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157W, M157L, M157C, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E and S165V. Preferably, the thermostable variant of human IFNγ or a functional fragment thereof has a single substitution selected from the group consisting of C21W, C23S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y. , L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, K109C, K109L, K109Q, K110H, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G , A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157W, M157Q, M157L, M157C, L158C, L158I, L158W, F159C, F159V, R160A, R162D, R162Q and R162E.

Dans un mode de réalisation encore plus préféré, le variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présente une unique substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en C23S, Q24A, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, K60H, K60R, E61K, E62C, S63C, K109C, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157Q, M157L, M157C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162E, R162Q et R162D. In an even more preferred embodiment, the thermostable variant of human IFNγ or a functional fragment thereof has a single substitution selected from the group consisting of C23S, Q24A, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K. , T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, K60H, K60R, E61K, E62C, S63C, K109C, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157Q, M157L, M157C , L158I, F159C, F159V, R160A, R162E, R162Q and R162D.

Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en C21 G+F 159C, Al47E+R162D, M100N+T119Y, Y76D+K131I, T50Y+Y121T+M140P, P26D+S122P, Y22S+L158W+R163G, Y22D+S122H, R162Q+A164E, et Y22T+K 109C+T 119P+A 147F+R 163L. In another embodiment, the present invention relates to a thermostable variant of human IFNγ or a functional fragment thereof having a combination of substitutions selected from the group consisting of C21 G + F 159C, Al47E + R162D, M100N + T119Y, Y76D + K131I, T50Y + Y121T + M140P, P26D + S122P, Y22S + L158W + R163G, Y22D + S122H, R162Q + A164E, and Y22T + K 109C + T 119P + A 147F + R 163L.

La présente invention concerne un acide nucléique codant un variant thermostable de l'IFNy humain selon la présente invention, une cassette d'expression d'un acide nucléique selon la présente invention, un vecteur comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon la présente invention. Le vecteur peut être sélectionné de préférence parmi un plasmide et un vecteur viral. The present invention relates to a nucleic acid encoding a thermostable variant of human IFNγ according to the present invention, a nucleic acid expression cassette according to the present invention, a vector comprising a nucleic acid or an expression cassette according to the present invention. present invention. The vector may be preferably selected from a plasmid and a viral vector.

La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur selon la présente invention pour transformer ou transfecter une cellule. Elle concerne en outre une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur codant un variant thermostable de l'IFNy humain selon la présente invention. Elle concerne l'utilisation d'une telle cellule pour produire un variant thermostable de l'IFNy humain selon la présente invention. Elle concerne également une méthode de production d'un variant thermostable de l'IFNy humain selon la présente invention comprenant la transformation ou transfection d'une cellule par un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du variant thermostable de l'IFNy humain produit par la cellule. La cellule peut être procaryote ou eucaryote. 10 The present invention relates to the use of a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the present invention to transform or transfect a cell. It further relates to a host cell comprising a nucleic acid, an expression cassette or a vector encoding a thermostable variant of human IFNγ according to the present invention. It relates to the use of such a cell to produce a thermostable variant of human IFNγ according to the present invention. It also relates to a method for producing a thermostable variant of human IFNγ according to the present invention comprising the transformation or transfection of a cell with a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the present invention; culturing the transfected / transformed cell; and harvesting the thermostable variant of human IFNγ produced by the cell. The cell may be prokaryotic or eukaryotic. 10

La présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un variant thermostable de 1"IFNy selon la présente invention ou un acide nucléique codant pour celle-ci. Ainsi, elle concerne en outre l'utilisation d'un variant thermostable de l'IFNy selon la présente invention ou de cette composition pharmaceutique comme médicament. Notamment, la présente invention concerne l'utilisation d'un variant thermostable de l'IFNy selon la présente invention ou de cette composition pharmaceutique pour la préparation d'un médicament antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur. En particulier, le médicament selon la présente invention est destiné au traitement d'une pathologie sélectionnée parmi l'asthme, la granulomatose chronique familiale, la fibrose pulmonaire idiopathique, une infection à mycobactérie atypique, le cancer du rein, l'ostéoporose, une sclérodermie généralisée, une hépatite chronique à virus B ou C, un choc septique, une dermatite allergique, et l'arthrite rhumatoïde. The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a thermostable variant of 1 "IFNγ according to the present invention or a nucleic acid coding for it, and thus relates to the use of a thermostable variant of IFNγ according to the present invention. The present invention relates, in particular, to the use of a thermostable variant of IFNγ according to the present invention or of this pharmaceutical composition for the preparation of an antiviral, antiproliferative or immunomodulatory drug. In particular, the medicament according to the present invention is intended for the treatment of a pathology selected from asthma, chronic familial granulomatosis, idiopathic pulmonary fibrosis, an atypical mycobacterium infection, kidney cancer, osteoporosis, generalized scleroderma. , chronic hepatitis virus B or C, septic shock, allergic dermatitis , and rheumatoid arthritis.

Brève description des figures Figure 1 : Schéma du vecteur pNCK utilisé pour la génération des banques de mutants et leur sélection dans Thermus thermophilus. Figure 2: Résultats de l'analyse fonctionnelle des simples mutants de l'IFNy sélectionnés par Thermus thermophilus - Analyse thermostabilité (% d'activité résiduelle panneau A), activité totale relative par rapport à la protéine sauvage (panneau B) et indice d'amélioration défini par produit (activité résiduelle par activité totale relative vis-à-vis de la protéine sauvage /100) (panneau C) Figure 3 : Résultats de l'analyse fonctionnelle des simples mutants de l'IFNy issus des positions doubles et multiples sélectionnées par Thermus thermophilus - Analyse thermostabilité ( ro d'activité résiduelle panneau A), activité totale relative par rapport à la protéine sauvage (panneau B) et indice d'amélioration défini par produit (activité résiduelle par activité totale relative vis-à-vis de la protéine sauvage /100) (panneau C) Figure 4 : Résultats d'analyse fonctionnelle des simples mutants ponctuels de l'IFNy générés de façon systématique et ayant été améliorés pour leur stabilité et/ou leur activité - Analyse thermostabilité (% d'activité résiduelle panneau A), activité totale relative par rapport à la protéine sauvage (panneau B) et indice d'amélioration défini par produit (activité résiduelle par activité totale relative vis-à-vis de la protéine sauvage /100) (panneau C) Tableau 1 : Mutants issus de la sélection primaire de la banque de l'IFNy dans Thermus thermophilus. Les numéros correspondent à la position de la mutation dans la forme du précurseur de 166 résidus. Tableau 2 : Mutants validés en test de sélection secondaire dans Thermus thermophilus. Les numéros correspondent à la position de la mutation dans la forme du précurseur de 166 résidus. Description détaillée de l'invention La présente invention concerne des variants de l'interféron gamma humain (IFNy) dont la stabilité, en particulier la stabilité thermique, est accrue par rapport à l'IFNy sauvage. Les variants protéiques de l'IFNy de cette invention ont été obtenus en couplant la génération d'une grande diversité de mutations par évolution dirigée à une méthode de sélection directe des variants améliorées pour leur thermostabilité. La stabilité face à la dénaturation thermique des candidats améliorés ainsi que la conservation de leur activité a été validée par des tests biologiques. Les variants de cette invention constituent des alternatives aux IFNNy recombinants actuellement utilisés dans le domaine thérapeutique, notamment dans les traitements de la granulomatose chronique et de la fibrose pulmonaire idiopathique. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1: Diagram of the pNCK vector used for the generation of mutant libraries and their selection in Thermus thermophilus. FIG. 2: Results of functional analysis of simple mutants of IFNγ selected by Thermus thermophilus - thermostability analysis (% of residual activity panel A), total relative activity with respect to the wild-type protein (panel B) and index of product-defined improvement (residual activity by relative total activity against wild-type protein / 100) (panel C) Figure 3: Results of functional analysis of single IFNy mutants from selected double and multiple positions by Thermus thermophilus - thermostability analysis (ro residual activity panel A), relative total activity relative to the wild-type protein (panel B) and product-defined improvement index (residual activity by total relative activity with respect to the wild-type protein (100) (panel C) FIG. 4: Functional analysis results of single point mutants of IFNy generated systematically and having been improved for their stability and / or their activity - Thermostability analysis (% of residual activity panel A), total relative activity with respect to the wild-type protein (panel B) and product-defined improvement index (residual activity by total relative activity to wild-type protein (100) (panel C) Table 1: Mutants from the primary selection of the IFNγ library in Thermus thermophilus. The numbers correspond to the position of the mutation in the form of the 166 residue precursor. Table 2: Mutants validated in secondary selection test in Thermus thermophilus. The numbers correspond to the position of the mutation in the form of the 166 residue precursor. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to variants of human gamma interferon (IFNy) whose stability, in particular thermal stability, is increased relative to wild-type IFNγ. The IFNγ protein variants of this invention were obtained by coupling the generation of a wide variety of mutations by directed evolution to a direct selection method of the improved variants for their thermostability. The stability against the thermal denaturation of the improved candidates as well as the conservation of their activity was validated by biological tests. The variants of this invention are alternatives to recombinant IFNNγ currently used in the therapeutic field, particularly in the treatment of chronic granulomatosis and idiopathic pulmonary fibrosis.

Compte-tenu des doutes résidants sur la présence des acides aminés CYC en N-terminal de la protéine mature de 1'IFNy, et de ce fait sur la numération correspondant aux acides aminés de la protéine mature, la numérotation adoptée dans la présente demande sera celle qui tient compte de l'ensemble des résidus de l'IFNy avec la séquence du peptide signal incluse (numérotation en acides aminés totaux de 1 pour la méthionine N-terminale peptide signal inclus à 166 pour la glutamine de l'extrémité C-terminale de l'interféron ù la séquence SEQ ID No 2). La position de la substitution dans les deux autres formes (mature sans CYC, SEQ ID No 4, ou avec CYC, SEQ ID No 6) pourra facilement être déterminée par l'homme du métier.30 12 La présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution décrite dans le tableau 1, le tableau 2 et les Figures 2 à 4. In view of the resident doubts about the presence of the N-terminal CYC amino acids of the mature IFNγ protein, and thus on the amino acid count of the mature protein, the numbering adopted in the present application will be that which takes into account all the residues of IFNy with the signal peptide sequence included (total amino acid numbering of 1 for the N-terminal signal peptide methionine included at 166 for glutamine of the C-terminus interferon to sequence SEQ ID No. 2). The position of the substitution in the other two forms (mature without CYC, SEQ ID No. 4, or with CYC, SEQ ID No. 6) will be readily determinable by those skilled in the art. The present invention relates to a thermostable variant of human IFNγ or a functional fragment thereof comprising at least one substitution described in Table 1, Table 2 and Figures 2 to 4.

La présente invention concerne de préférence un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en C21 G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157W, M157L, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E et S165V ou une combinaison de ceux-ci. La combinaison peut consister en 2, 3 ou 4 substitutions sélectionnées dans ce groupe. Par ailleurs, le variant thermostable de l'IFNy humain selon la présente invention peut comprendre d'autres mutations non-décrites dans ce groupe, de préférence des substitutions, notamment certaines connues dans le domaine. De préférence, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en C21W, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, K109C, K109L, K109Q, K110H, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157W, M157Q, M157L, L158C, L158I, L158W, F159C, F159V, R160A, R162D, R162Q et R162E ou une combinaison de ceux-ci. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une des mutations sélectionnées parmi le groupe consistant en Q24A, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, K60H, K60R, E61K, E62C, S63C, K109C, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157Q, M157L, L158I, F159C, F159V, R160A, R162E, R162Q et R162D ou une combinaison de ceux-ci. The present invention preferably relates to a thermostable variant of human IFNγ or a functional fragment thereof comprising at least one selected from the group consisting of C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157W, M157L, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E and S165V or a combination thereof. The combination may consist of 2, 3 or 4 substitutions selected from this group. Furthermore, the thermostable variant of human IFNγ according to the present invention may comprise other mutations not described in this group, preferably substitutions, in particular some known in the art. Preferably, the present invention relates to a thermostable variant of human IFNγ or a functional fragment thereof comprising at least one selected from the group consisting of C21W, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, K109C, K109L, K109Q, K110H, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157W, M157Q, M157L, L158C, L158I, L158W, F159C, F159V, R160A, R162D, R162Q and R162E or a combination thereof. In a preferred embodiment, the present invention relates to a thermostable variant of human IFNγ or a functional fragment thereof comprising at least one of mutations selected from the group consisting of Q24A, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D. , G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, K60H, K60R, E61K, E62C, S63C, K109C, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157Q, M157L , L158I, F159C, F159V, R160A, R162E, R162Q and R162D or a combination thereof.

Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne également un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant soit une unique substitution C23S ou M157C, soit une substitution C23S ou M157C en combinaison avec une ou plusieurs substitutions sélectionnées parmi le groupe consistant en C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G411, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157L, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E et S165V. In another embodiment, the present invention also relates to a thermostable variant of human IFNγ or a functional fragment thereof having either a single C23S or M157C substitution, or a C23S or M157C substitution in combination with one or more substitutions. selected from the group consisting of C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G411, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157L, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E and S165V.

Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une unique substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, C23S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L511, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K1311, E135V,M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157W, M157L, M157C, L158W, L158C, L1581, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E et S165V. De préférence, la substitution est sélectionnée parmi le groupe consistant en C21W, C23S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, K109C, K109L, K109Q, K110H, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157W, M157Q, M157C, M157L, L158C, L158I, L158W, F159C, F159V, R160A, R162D, R162Q et R162E. De manière encore plus préférée, la substitution est sélectionnée parmi le groupe consistant en C23S, Q24A, P26D, V28C, G411, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, K60H, K60R, E61K, E62C, S63C, K109C, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157Q, M157C, M157L, L158I, F159C, F159V, R160A, R162E, R162Q et R162D. 14 In one embodiment, the present invention relates to a thermostable variant of human IFNγ or a functional fragment thereof having a single substitution selected from the group consisting of C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, C23S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L511, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K1311, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157W, M157L, M157C, L158W, L158C, L1581, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E and S165V. Preferably, the substitution is selected from the group consisting of C21W, C23S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, K109L, K109Q, K110H, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, M157L, L158C, L158I, L158W, F159C, F159V, R160A, R162D, R162Q and R162E. Even more preferably, the substitution is selected from the group consisting of C23S, Q24A, P26D, V28C, G411, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, K60H, K60R, E61K. , E62C, S63C, K109C, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157Q, M157C, M157L, L158I, F159C, F159V, R160A, R162E, R162Q and R162D. 14

Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en C21G+F159C, Al47E+R162D, M100N+T119Y, Y76D+K131I, T50Y+Y121T+M140P, P26D+S122P, Y22S+L158W+R163G, Y22D+S122H, R162Q+A164E, et Y22T+K 109C+T 1 19P+A147F+R163L. In another embodiment, the present invention relates to a thermostable variant of human IFNγ or a functional fragment thereof having a combination of substitutions selected from the group consisting of C21G + F159C, Al47E + R162D, M100N + T119Y, Y76D + K131I, T50Y + Y121T + M140P, P26D + S122P, Y22S + L158W + R163G, Y22D + S122H, R162Q + A164E, and Y22T + K109C + T1 19P + A147F + R163L.

Les séquences SEQ ID Nos 1-6 décrivent les séquences protéiques de l'IFNy humain précurseur et mature ainsi que des séquences nucléiques codant celles-ci. Il peut correspondre à la protéine précurseur de 166 acides aminés (SEQ ID Nos 1-2), ou à la protéine mature avec ou sans le tripeptide CYC (SEQ ID Nos 3-6). The sequences SEQ ID Nos. 1-6 describe the protein sequences of the precursor and mature human IFNγ as well as the nucleic sequences coding therefor. It may correspond to the precursor protein of 166 amino acids (SEQ ID Nos. 1-2), or to the mature protein with or without the tripeptide CYC (SEQ ID Nos. 3-6).

Par fragment fonctionnel est entendu un fragment de l'IFNy humain présentant l'activité de l'IFNy humain. Par exemple, ce fragment peut correspondre à l'IFNy humain avec une délétion C-terminale de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 acides aminés. Le fragment peut comprendre 100, 110, 120, 130 ou 140 acides aminés consécutifs de l'IFNy humain. By functional fragment is meant a fragment of human IFNγ exhibiting the activity of human IFNγ. For example, this fragment may correspond to human IFNγ with a C-terminal deletion of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19 or 20 amino acids. The fragment may comprise 100, 110, 120, 130 or 140 consecutive amino acids of human IFNγ.

Les variants selon la présente invention présentent une augmentation de la thermostabilité par rapport à l'IFNy humain sauvage. Cette augmentation est d'au moins 5 %, de préférence au moins 10, 20 ou 30 %. Par thermostabilité , est entendu la capacité de la protéine à conserver son activité après avoir été soumise à l'action de la chaleur. Par exemple, la protéine peut être incubée 10 minutes à 59 C. La thermostabilité du variant est alors estimée par le pourcentage d'activité résiduelle après ce prétraitement. Cette mesure de la thermostabilité d'un variant est alors comparée à la même valeur obtenue en utilisant l'IFNy sauvage produit dans les mêmes conditions. The variants according to the present invention exhibit an increase in thermostability with respect to wild-type human IFNγ. This increase is at least 5%, preferably at least 10, 20 or 30%. By thermostability is meant the ability of the protein to retain its activity after being subjected to the action of heat. For example, the protein can be incubated for 10 minutes at 59 ° C. The thermostability of the variant is then estimated by the percentage of residual activity after this pretreatment. This measure of the thermostability of a variant is then compared to the same value obtained using the wild IFNγ produced under the same conditions.

Un variant qui présente une thermostabilité améliorée mais une activité réduite peut être utilisable. De préférence, les variants thermostables de la présente invention conservent une activité (condition sans prétraitement) qui correspond à au moins 10 % de l'activité de l'IFNy humain sauvage, de préférence à au moins 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90 % de l'activité de l'IFNy humain sauvage. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, les variants thermostables de la présente invention conservent une activité équivalente à celle de l'IFNy humain sauvage, voire augmentée. A variant that has improved thermostability but reduced activity may be useful. Preferably, the thermostable variants of the present invention retain an activity (condition without pretreatment) which corresponds to at least 10% of the activity of wild-type human IFNγ, preferably at least 20, 30, 40, 50, 60 , 70, 80 or 90% of the activity of wild-type human IFNγ. In a particularly preferred embodiment, the thermostable variants of the present invention retain an activity equivalent to that of wild-type IFNγ, or even increased.

Un facteur intéressant de sélection des variants d'intérêt est l'activité relative du variant 5 multiplié par le pourcentage d'activité résiduelle. An interesting factor in selection of the variants of interest is the relative activity of the variant multiplied by the percentage of residual activity.

Le variant de l'IFNy humain selon la présente invention peut être glycosylé, de préférence aux positions 48 et 120. Par ailleurs, il peut être modifié par ajout de polymères (Kita et al., Drug Des. Deliv. 6:157-167, 1990 ; EP 236987 et US 5,109,120) 10 ou par pégylation (W099/03887 ; Voir WO2004005341 Conjugation of a polymer molecule ). The variant of human IFNγ according to the present invention can be glycosylated, preferably at positions 48 and 120. Moreover, it can be modified by addition of polymers (Kita et al., Drug Des., Deliv., 6: 157-167 1990, EP 236987 and US 5,109,120) or pegylation (WO99 / 03887, see WO2004005341 Conjugation of a polymer molecule).

La présente invention concerne un acide nucléique codant un variant thermostable de l'IFNy humain selon la présente invention. La présente invention concerne également 15 une cassette d'expression d'un acide nucléique selon la présente invention. Elle concerne en outre un vecteur comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon la présente invention. Le vecteur peut être sélectionné parmi un plasmide et un vecteur viral. The present invention relates to a nucleic acid encoding a thermostable variant of human IFNγ according to the present invention. The present invention also relates to a nucleic acid expression cassette according to the present invention. It also relates to a vector comprising a nucleic acid or an expression cassette according to the present invention. The vector may be selected from a plasmid and a viral vector.

20 L'acide nucléique peut être de l'ADN (ADNc ou ADNg), de l'ARN, un mélange des deux. Il peut être sous forme simple chaîne ou en duplexe ou un mélange des deux. Il peut comprendre des nucléotides modifiés, comprenant par exemple une liaison modifiée, une base purique ou pyrimidique modifiée, ou un sucre modifié. Il peut être préparé par toutes méthodes connues de l'homme du métier, dont la synthèse chimique, 25 la recombinaison, la mutagenèse, etc... The nucleic acid can be DNA (cDNA or gDNA), RNA, a mixture of both. It can be in simple chain or duplex form or a mixture of both. It can comprise modified nucleotides, comprising, for example, a modified linkage, a modified purine or pyrimidine base, or a modified sugar. It can be prepared by any method known to those skilled in the art, including chemical synthesis, recombination, mutagenesis, etc.

La cassette d'expression comprend tous les éléments nécessaires à l'expression du variant thermostable de l'IFNy humain selon la présente invention, notamment les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction dans la cellule hôte. La cellule 30 hôte peut être procaryote ou eucaryote. En particulier, la cassette d'expression comprend un promoteur et un terminateur, facultativement un amplificateur. Le promoteur peut être procaryote ou eucaryote. Des exemples de promoteurs procaryotes préférés sont les suivants : Lacl, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, les promoteurs 16 d'ARN polymérase de bactériophage T3 or T7, le promoteur de la polyhèdrine, le promoteur PR ou PL du phage lambda. Des exemples de promoteurs eucaryotes préférés sont les suivants : promoteur précoce du CMV, promoteur de la thymidine kinase de HSV, promoteur précoce ou tardif de SV40, le promoteur de la métallothionéine-L de souris, et les régions LTR de certains rétrovirus. De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996; Immunology in Current Protocols in Molecular Biology). The expression cassette comprises all the elements necessary for the expression of the thermostable variant of human IFNγ according to the present invention, in particular the elements necessary for transcription and translation in the host cell. The host cell may be prokaryotic or eukaryotic. In particular, the expression cassette comprises a promoter and a terminator, optionally an amplifier. The promoter may be prokaryotic or eukaryotic. Examples of preferred prokaryotic promoters are: LacI, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, T3 or T7 bacteriophage RNA polymerase promoters, polyhedrin promoter, phage lambda PR or PL promoter. Examples of preferred eukaryotic promoters are: early CMV promoter, HSV thymidine kinase promoter, SV40 early or late promoter, mouse L-metallothionein promoter, and LTR regions of some retroviruses. In general, for the choice of a suitable promoter, the skilled person can advantageously refer to the work of Sambrook et al. (1989) or the techniques described by Fuller et al. (1996) Immunology in Current Protocols in Molecular Biology.

La présente invention concerne un vecteur portant un acide nucléique ou une cassette d'expression codant pour un variant thermostable de 1'IFNy humain selon la présente invention. Le vecteur est de préférence un vecteur d'expression, c'est-à-dire qu'il comprend les éléments nécessaires à l'expression du variant dans la cellule hôte. La cellule hôte peut être un procaryote, par exemple E. coli, ou un eucaryote. L'eucaryote peut être un eucaryote inférieur comme une levure (par exemple, S cerevisiae) ou un champignon (par exemple du genre Aspergillus) ou un eucaryote supérieur comme une cellule d'insecte, de mammifère ou de plante. La cellule peut être une cellule mammifère, par exemple COS, CHO (US 4,889,803 ; US 5,047,335). Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non-humaine et non-embryonnaire. Le vecteur peut être un plasmide, un phage, un phagemide, un cosmide, un virus, un YAC, un BAC, un plasmide pTi d'Agrobacterium, etc... Le vecteur peut comprendre de préférence un ou plusieurs éléments sélectionnés parmi une origine de réplication, un site de clonage multiple et un gène de sélection. Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur est un plasmide. Des exemples non-exhaustifs de vecteurs procaryotes sont les suivants : pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pDl0, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pBR322, et pRIT5 (Pharmacia), pET (Novagen). Des exemples non-exhaustifs de vecteurs eucaryotes sont les suivants : pWLNEO, pSV2CAT, pPICZ, pcDNA3.1 (+) Hyg (Invitrogen), pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pCI-neo (Stratagene), pMSG, pSVL (Pharmacia); et pQE-30 (QLAexpress). Les vecteurs viraux peuvent être de manière non-exhaustive des adénovirus, des AAV, des HSV, des 17 lentivirus, etc... De préférence, le vecteur d'expression est un plasmide ou un vecteur viral. La séquence codant l'IFNy selon la présente invention peut comprendre ou ne pas comprendre le peptide signal. Dans le cas où elle ne le comprend pas, une méthionine peut être éventuellement ajoutée à l'extrémité N-terminale. Dans une autre alternative, un peptide signal hétérologue peut être introduit. Ce peptide signal hétérologue peut être dérivé d'un procaryote tel que E. coli ou d'un eucaryote, notamment une cellule mammifère, d'insecte ou d'une levure. The present invention relates to a vector carrying a nucleic acid or an expression cassette encoding a thermostable variant of human IFNγ according to the present invention. The vector is preferably an expression vector, i.e. it comprises the elements necessary for the expression of the variant in the host cell. The host cell may be a prokaryote, for example E. coli, or a eukaryotic. The eukaryote may be a lower eukaryote such as a yeast (eg, S. cerevisiae) or a fungus (eg, Aspergillus genus) or a higher eukaryote such as an insect, mammalian or plant cell. The cell may be a mammalian cell, for example COS, CHO (US 4,889,803; US 5,047,335). In a particular embodiment, the cell is non-human and non-embryonic. The vector may be a plasmid, a phage, a phagemid, a cosmid, a virus, a YAC, a BAC, an Agrobacterium pTi plasmid, etc. The vector may preferably comprise one or more elements selected from an origin. replication site, a multiple cloning site and a selection gene. In a preferred embodiment, the vector is a plasmid. Non-exhaustive examples of prokaryotic vectors are: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pBR322, and pRIT5 (Pharmacia), pET (Novagen). Non-exhaustive examples of eukaryotic vectors are: pWLNEO, pSV2CAT, pPICZ, pcDNA3.1 (+) Hyg (Invitrogen), pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pCI-neo (Stratagene), pMSG, pSVL (Pharmacia); and pQE-30 (QLAexpress). The viral vectors may be non-exhaustively adenoviruses, AAVs, HSVs, lentiviruses, etc. Preferably, the expression vector is a plasmid or a viral vector. The sequence coding for IFNγ according to the present invention may or may not comprise the signal peptide. In the case where it does not understand it, a methionine may be optionally added at the N-terminus. In another alternative, a heterologous signal peptide can be introduced. This heterologous signal peptide can be derived from a prokaryote such as E. coli or from a eukaryotic, especially a mammalian, insect or yeast cell.

La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur selon la présente invention pour transformer ou transfecter une cellule. La présente invention concerne une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur codant un variant thermostable de l'IFNy humain et son utilisation pour produire un variant thermostable de l'IFNy humain recombinant selon la présente invention. Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non-humaine et non-embryonnaire. Elle concerne également une méthode de production d'un variant thermostable de l'IFNy humain recombinant selon la présente invention comprenant la transformation ou transfection d'une cellule par un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du variant thermostable de l'IFNy humain produit par la cellule. Dans un mode de réalisation alternatif, la méthode de production d'un variant thermostable de l'IFNy humain recombinant selon la présente invention comprenant la fourniture d'une cellule comprenant un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du variant thermostable de l'IFNy humain produit par la cellule. En particulier, la cellule peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable par l'acide nucléique codant le variant. Cet acide nucléique peut être contenu dans la cellule sous forme d'épisome ou sous forme chromosomique. Les méthodes de production de protéines recombinantes sont bien connues par l'homme du métier. Par exemple, on peut citer les modes spécifiques décrits dans US 5,004,689, EP 446 582, Wang et al. (Sci. Sin. B 24:1076-1084, 1994 et Nature 295, page 503) pour une production dans E. coli, et JAMES et al. (Protein Science (1996), 5:331-340) pour une production en cellules mammifères. The present invention relates to the use of a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the present invention to transform or transfect a cell. The present invention relates to a host cell comprising a nucleic acid, an expression cassette or a vector encoding a thermostable variant of human IFNγ and its use for producing a thermostable variant of recombinant human IFNγ according to the present invention. In a particular embodiment, the cell is non-human and non-embryonic. It also relates to a method for producing a thermostable variant of recombinant human IFNγ according to the present invention comprising the transformation or transfection of a cell with a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the present invention; culturing the transfected / transformed cell; and harvesting the thermostable variant of human IFNγ produced by the cell. In an alternative embodiment, the method for producing a thermostable variant of recombinant human IFNγ according to the present invention comprising providing a cell comprising a polynucleotide, an expression cassette or a vector according to the present invention; culturing the transfected / transformed cell; and harvesting the thermostable variant of human IFNγ produced by the cell. In particular, the cell may be transformed / transfected transiently or stably by the nucleic acid encoding the variant. This nucleic acid may be contained in the cell as an episome or in a chromosomal form. Methods of producing recombinant proteins are well known to those skilled in the art. For example, the specific modes described in US 5,004,689, EP 446,582, Wang et al. (Sci Sin B 24: 1076-1084, 1994 and Nature 295, page 503) for production in E. coli, and JAMES et al. (Protein Science (1996), 5: 331-340) for mammalian cell production.

L'activité in vitro de l'IFNy est généralement déterminée par la réduction de l'effet cytopathique de virus sur une lignée cellulaire par traitement avec des quantités croissantes d'IFNy. Il existe d'autres tests biologiques spécifiques de l'IFNy (Meager, Journal of immunological Methods, 261, (2002) 21-36 pour une revue). Ces nouveaux tests permettent notamment d'évaluer plus spécifiquement l'une des caractéristiques de l'activité pléiotrope de l'IFNy. Il existe également des tests d'activité in vivo. The in vitro activity of IFNγ is generally determined by reducing the cytopathic effect of virus on a cell line by treatment with increasing amounts of IFNγ. There are other biological tests specific for IFNy (Meager, Journal of Immunological Methods, 261, (2002) 21-36 for a review). These new tests make it possible to evaluate more specifically one of the characteristics of the pleiotropic activity of IFNy. There are also in vivo activity tests.

La réponse anti-virale à des doses d'IFNy peut être mesurée sur différents couples de systèmes (virus /lignée cellulaire adhérente répondant à l'IFNy et sensible au virus employé). Par exemple, on peut citer les couples suivants : VSV/MDBK ; VSV ou EMCV/ A549 ; VSV, EMCV, SFV ou virus Sindbis/ WISH ; VSV ou EMCV/ HeLa ; VSV, EMCV ou Mengovirus/ FS4, FS71, ou Hep2 ; VSV, EMCV, Mengovirus ou virus Sindbis/ FL ; EMCV/ 2D9, avec VSV = virus de la stomatite vésiculaire ; EMCV = virus de l'encéphalomyocardite ; SFV = virus de la forêt de Semliki. De préférence, les virus utilisés seront le virus de la vaccine ou le virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV). Le virus de l'herpès simplex (HSV) et le cytomégalovirus peuvent également être utilisés. The anti-viral response to doses of IFNγ can be measured on different pairs of systems (virus / adherent cell line that responds to the IFNγ and sensitive to the virus used). For example, the following pairs may be mentioned: VSV / MDBK; VSV or EMCV / A549; VSV, EMCV, SFV or Sindbis / WISH virus; VSV or EMCV / HeLa; VSV, EMCV or Mengovirus / FS4, FS71, or Hep2; VSV, EMCV, Mengovirus or Sindbis / FL virus; EMCV / 2D9, with VSV = vesicular stomatitis virus; EMCV = encephalomyocarditis virus; SFV = Semliki Forest Virus. Preferably, the viruses used will be vaccinia virus or lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV). Herpes simplex virus (HSV) and cytomegalovirus can also be used.

L'activité de l'IFNy peut également être testée en utilisant un gène rapporteur, par exemple la luciférase, sous le contrôle d'un promoteur sensible à l'IFNy contenant des éléments GAS (gamma-interféron activation sites) ou ISRE (interferon stimulated response element) . Ainsi, le gène rapporteur est dosé suite à une stimulation par l'IFNy. Les vecteurs pGAS/Luciférase et pISRE/Luciférase sont disponibles commercialement (#219091, Stratagene). Dans un mode de réalisation préféré, la méthode avec le vecteur pGAS/luciférase est utilisée pour mesurer l'activité de l'IFNy. The activity of IFNγ can also be tested using a reporter gene, for example luciferase, under the control of an IFNγ sensitive promoter containing GAS elements (gamma-interferon activation sites) or ISRE (interferon stimulated response element). Thus, the reporter gene is assayed following stimulation with IFNy. The pGAS / Luciferase and pISRE / Luciferase vectors are commercially available (# 219091, Stratagene). In a preferred embodiment, the pGAS / luciferase vector method is used to measure the activity of IFNy.

L'augmentation de la thermostabilité de 1'IFNy tout en conservant son activité biologique permet d'envisager l'élaboration de traitements plus efficaces permettant, à activité biologique égale, une réduction des doses thérapeutiques utilisées, et par là même une réduction des effets secondaires associés au traitement. Cela permet également des traitements à plus forte dose d'IFNy pour réduire les infections virales telles que l'herpès, ces traitements étant jusqu'ici inenvisageables avec ce type de molécules. Increasing the thermostability of IFNy while maintaining its biological activity makes it possible to envisage the development of more effective treatments which, with equal biological activity, a reduction of the therapeutic doses used, and thereby a reduction of the side effects. associated with the treatment. It also allows higher dose IFNγ treatments to reduce viral infections such as herpes, as these treatments have so far been unenforceable with this type of molecule.

La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant un variant de l'IFNy thermostable selon la présente invention. La présente invention peut également concerner une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique codant un variant de l'IFNy thermostable selon la présente invention. La composition pharmaceutique peut comprendre en outre un support ou un excipient pharmaceutiquement acceptable. De tels supports et excipients sont bien connus de l'homme du métier (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed. , Pharmaceutical Press[2000]). The present invention therefore relates to a pharmaceutical composition comprising a thermostable IFNγ variant according to the present invention. The present invention may also relate to a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid encoding a thermostable IFNγ variant according to the present invention. The pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Such carriers and excipients are well known to those of skill in the art (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro AR, Ed., Mack Publishing Company [1990], Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard , Eds., Taylor & Francis [2000] and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]).

La présente invention concerne également l'utilisation d'un variant de l'IFNy thermostable selon la présente invention comme médicament. The present invention also relates to the use of a thermostable IFNγ variant according to the present invention as a medicament.

Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont appropriées pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, intraoculaire, intra- auriculaire, ledit principe actif pouvant être administré sous forme unitaire d'administration. The pharmaceutical compositions of the invention are suitable for oral, sublingual, subcutaneous, intramuscular, intravenous, topical, local, intratracheal, intranasal, transdermal, rectal, intraocular, intra-auricular administration, said active ingredient being administrable under unitary form of administration.

Les formes unitaires d'administration peuvent être par exemple des comprimés, des gélules, des gels des granules, des poudres, des solutions ou suspensions orales ou injectables, des timbres transdermiques (patch), des formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, intra-auriculaire, par inhalation, des formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse, des formes d'administration rectale ou des implants. Pour l'administration topique, on peut envisager des crèmes, gels, pommades, lotions ou collyres. Ces formes galéniques sont préparées selon les méthodes usuelles des domaines considérés. Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique est liquide. The unit dosage forms may be, for example, tablets, capsules, granule gels, powders, oral or injectable solutions or suspensions, transdermal patches (patches), sublingual, oral, intratracheal, Intraocular, intranasal, intra-auricular, inhalation, topical, transdermal, subcutaneous, intramuscular or intravenous administration forms, rectal administration forms or implants. For topical administration, one can consider creams, gels, ointments, lotions or eye drops. These galenic forms are prepared according to the usual methods of the fields considered. In a preferred embodiment, the pharmaceutical composition is liquid.

Lesdites formes unitaires sont dosées pour permettre une administration journalière de 0,001 à 100 g de principe actif par kg de poids corporel, selon la forme galénique. Il peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont appropriés; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse du patient. Dans un mode de réalisation préféré, l'IFNy est administré par la voie parentérale, et préférentiellement par injection sous-cutanée. Par exemple, une dose habituelle d'IFNy par injection sous-cutanée est comprise entre 1 et 100 g/m2 si la surface corporelle est supérieure à 0,5 m2 et entre 0,01 et 10 g/kg de poids corporel si la surface corporelle est inférieure ou égale à 0,5 m2. L'IFNy est l'exemple type de cytokine pléiotrope au large spectre d'activités. En effet, les interférons (IFNs) sont doués d'activités telles que l'inhibition de la réplication virale, l'inhibition de la multiplication cellulaire et l'induction de l'apoptose. 20 Notamment, la stimulation des macrophages par l'IFNy induit les réponses suivantes : -l'augmentation de la phagocytose et de la bactéricidie (mécanismes directs anti-microbiens et anti-tumoraux) ; - la stimulation des voies de présentation et de dégradation des antigènes, expression du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) de type I et II à la surface 25 des macrophages ; - la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes sécréteurs d'anticorps, ce qui a pour conséquence la production d'immunoglobuline de type G et l'activation du complément ; - l'activation de la NO synthase donnant naissance à la production de NO et de 30 radicaux libres oxygénés cytotoxiques ; et/ou - l'augmentation de la production de cytokines et la production d'IFN endogène.15 21 L'action de l'IFNy sur les lymphocytes T est de favoriser leur différenciation modulant ainsi la réponse immunitaire spécifique. Said unit forms are dosed to allow daily administration of 0.001 to 100 g of active ingredient per kg of body weight, according to the dosage form. There may be special cases where higher or lower dosages are appropriate; such dosages are not outside the scope of the invention. According to the usual practice, the dosage appropriate to each patient is determined by the physician according to the mode of administration, the weight and the response of the patient. In a preferred embodiment, IFNγ is administered parenterally, and preferentially by subcutaneous injection. For example, a usual dose of IFNγ by subcutaneous injection is between 1 and 100 g / m2 if the body surface area is greater than 0.5 m2 and between 0.01 and 10 g / kg body weight if the surface area is body weight is less than or equal to 0.5 m2. IFNy is the typical example of a pleiotropic cytokine with a broad spectrum of activities. Indeed, interferons (IFNs) are endowed with activities such as inhibition of viral replication, inhibition of cell multiplication and induction of apoptosis. In particular, the stimulation of macrophages by IFNγ induces the following responses: the increase in phagocytosis and bactericidal activity (direct anti-microbial and anti-tumor mechanisms); stimulation of the pathways of presentation and degradation of antigens, expression of the major histocompatibility complex (MHC) of type I and II on the surface of macrophages; differentiation of B lymphocytes into antibody secreting plasma cells, which results in the production of type G immunoglobulin and complement activation; activation of the NO synthase giving rise to the production of NO and of 30 cytotoxic oxygenated free radicals; and / or - the increase in cytokine production and the production of endogenous IFN. The action of IFNγ on T lymphocytes is to promote their differentiation thus modulating the specific immune response.

Parmi les propriétés pharmacologiques de l'IFNy, l'effet principal recherché et 5 développé en phases cliniques est principalement l'aspect immunomodulateur, l'aspect de molécule thérapeutique anti-virale étant moins développé à ce jour. Among the pharmacological properties of IFNγ, the main effect sought and developed in clinical phases is mainly the immunomodulatory aspect, the aspect of anti-viral therapeutic molecule being less developed to date.

En raison de son large spectre d'activités (antivirale, antiproliférative et immunomodulatrice), l'IFNy est une molécule développée comme agent thérapeutique 10 humain dans le traitement de nombreuses maladies assez variées. Les IFNy commerciaux (Actimmune, et Biogamma) sont notamment utilisés pour deux indications thérapeutiques principales : la granulomatose chronique et la fibrose pulmonaire idiopathique, en association avec la prednisolone par voie orale. En plus des indications thérapeutiques principales, de nombreuses nouvelles indications 15 thérapeutiques secondaires sont actuellement en cours de développement à différentes phases cliniques (II et III), en particulier pour leur rôle d'immuno-suppresseur par exemple en complément des IFNa pégylés/ribavirine dans le cadre du traitement de l'Hépatite C. On peut citer aussi infections à mycobactérie atypique ; cancer du rein ; ostéopétrose ; sclérodermie généralisée ; hépatite chronique à virus B ; hépatite 20 chronique à virus C ; choc septique ; dermatite allergique ; la polyarthrite rhumatoïde ; cancer de l'ovaire ; la fibrose du foie ; l'asthme ; et le lymphome. Due to its broad spectrum of activities (antiviral, antiproliferative and immunomodulatory), IFNy is a molecule developed as a human therapeutic agent in the treatment of many quite varied diseases. Commercial IFNy (Actimmune, and Biogamma) are used for two main therapeutic indications: chronic granulomatosis and idiopathic pulmonary fibrosis, in combination with oral prednisolone. In addition to the main therapeutic indications, numerous new secondary therapeutic indications are currently being developed at different clinical phases (II and III), in particular for their role as immunosuppressors, for example in addition to pegylated IFNα / ribavirin in part of the treatment of Hepatitis C. We can also mention atypical mycobacterium infections; kidney cancer; osteopetrosis; generalized scleroderma; chronic hepatitis B virus; chronic hepatitis C virus; septic shock ; allergic dermatitis; rheumatoid arthritis; ovarian cancer; fibrosis of the liver; asthma; and lymphoma.

L'IFNy est également utile dans le traitement d'infections virales variées, possède une activité contre l'infection par les papillomavirus humains, et les infections hépatiques à 25 virus B et à virus C. IFNγ is also useful in the treatment of various viral infections, has activity against infection by human papillomaviruses, and hepatitis B virus and C virus infections.

De plus, si le problème de toxicité associée aux fortes doses d'IFNy était atténué ou résolu par une molécule plus stable, et ayant donc un plus important effet in vivo, l'utilisation de l'IFNy dans de nouvelles indications, et notamment pour traiter les 30 infections virales type herpès (HSV) de type I et II pourrait être reconsidéré. Moreover, if the toxicity problem associated with high doses of IFNγ was attenuated or resolved by a more stable molecule, and thus having a greater effect in vivo, the use of IFNy in new indications, and especially for treating herpes viral infections type HSV type I and II could be reconsidered.

Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'un variant de l'IFNy thermostable selon la présente invention ou d'une composition pharmaceutique selon la présente 22 invention pour la préparation d'un médicament antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur. Ainsi, ce médicament est destiné à traiter des maladies inflammatoires, des cancers, des infections, des troubles osseux, des maladies auto-immunes, etc... Dans un mode de réalisation préféré, le médicament est destiné au traitement d'une pathologie sélectionnée parmi l'asthme, la granulomatose chronique familiale, la fibrose pulmonaire idiopathique, une infection à mycobactérie atypique, le cancer du rein, l'ostéoporose, une sclérodermie généralisée, une hépatite chronique à virus B ou C, un choc septique, une dermatite allergique, et l'arthrite rhumatoïde. Dans des modes de réalisation alternatifs, le médicament est destiné au traitement d'une pathologie sélectionnée parmi un prurigo, une névrodermite, le diabète de type I, une sténose vasculaire, un épithélioma basocellulaire, un cancer ou un lymphome tel que un cancer de l'ovaire, un cancer du rein, une leucémie telle qu'un désordre hyperprolifératif des cellules B ou T, la leucémie myéloïde chronique et des syndromes apparentés, un cancer du sein, un cancer des poumons, un mélanome, un cancer du colon, un cancer du cerveau, un cancer de la plèvre, un cancer de l'estomac, un cancer du pancréas, une infection virale, par exemple par le virus de l'hépatite C ou B, la maladie de Crohn, le psoriasis, la sclérose en plaque, et la sclérose amyotrophique latérale. Thus, the present invention relates to the use of a thermostable IFNγ variant according to the present invention or a pharmaceutical composition according to the present invention for the preparation of an antiviral, antiproliferative or immunomodulatory drug. Thus, this medicament is intended to treat inflammatory diseases, cancers, infections, bone disorders, autoimmune diseases, etc. In a preferred embodiment, the medicament is intended for the treatment of a selected pathology. among asthma, familial chronic granulomatosis, idiopathic pulmonary fibrosis, atypical mycobacterium infection, kidney cancer, osteoporosis, generalized scleroderma, chronic hepatitis B or C virus, septic shock, allergic dermatitis , and rheumatoid arthritis. In alternative embodiments, the medicament is for the treatment of a pathology selected from prurigo, neurodermatitis, type I diabetes, vascular stenosis, basal cell carcinoma, cancer or lymphoma such as cancer of the liver. ovarian cancer, kidney cancer, leukemia such as hyperproliferative disorder of B or T cells, chronic myeloid leukemia and related syndromes, breast cancer, lung cancer, melanoma, colon cancer, cancer of the brain, pleural cancer, stomach cancer, pancreatic cancer, viral infection, for example by the hepatitis C or B virus, Crohn's disease, psoriasis, multiple sclerosis plaque, and amyotrophic lateral sclerosis.

Le variant thermostable de l'IFNy selon la présente invention peut être utilisé en combinaison avec un autre principe actif, par exemple un principe actif sélectionné parmi un anticorps, un agent anti-tumoral ou de chimiothérapie, un glucocorticoïde, un agent anti-histaminique, une hormone adrénocorticale, un agent anti-allergique, un vaccin, un broncodilatateur, un stéroïde, un agent béta-adrénergique, un agent immunomodulateur, une cytokine telle que l'interféron alpha ou béta, l'interleukine 1 ou 2, le TNF (facteur de nécrose tumorale), l'hydroxyurée, un agent alkylant, un antagoniste de l'acide folique, un antimétabolite du métabolisme des acides nucléiques, un poison fusoral, un antibiotique, un analogue de nucléotides, un rétonoïde, un inhibiteur de lipoxygénase et de cyclo-oxygénase, un acide fumarique et ses sels, un analgésique, un spasmolytique, un antagoniste du calcium et une combinaison de ceux-ci. Le principe actif additionnel peut être administré avant, simultanément ou après l'administration de l'IFNy selon la présente invention. De plus, il peut être administré par la même voie d'administration ou par deux voies d'administration distinctes. Ainsi, 23 la présente invention concerne un produit comprenant le variant thermostable de l'IFNy selon la présente invention et un autre principe actif, de préférence sélectionné dans la liste ci-dessus, pour une préparation combinée destinée à une utilisation simultanée, séquentielle ou séparée pour le traitement d'une des pathologies citées ci-dessus. The thermostable variant of IFNγ according to the present invention may be used in combination with another active principle, for example an active ingredient selected from an antibody, an antitumor or chemotherapy agent, a glucocorticoid, an antihistamine agent, an adrenocortical hormone, an antiallergic agent, a vaccine, a broncodilator, a steroid, a beta-adrenergic agent, an immunomodulatory agent, a cytokine such as interferon alpha or beta, interleukin 1 or 2, TNF ( tumor necrosis factor), hydroxyurea, an alkylating agent, a folic acid antagonist, an antimetabolite of nucleic acid metabolism, a fusal poison, an antibiotic, a nucleotide analogue, a retonoid, a lipoxygenase inhibitor, and cyclooxygenase, fumaric acid and its salts, analgesic, spasmolytic, calcium antagonist and a combination thereof. The additional active ingredient may be administered before, simultaneously with or after administration of IFNγ according to the present invention. In addition, it can be administered by the same route of administration or by two separate routes of administration. Thus, the present invention relates to a product comprising the thermostable variant of IFNγ according to the present invention and another active ingredient, preferably selected from the above list, for a combined preparation intended for simultaneous, sequential or separate use. for the treatment of one of the pathologies mentioned above.

La combinaison avec un anticorps est utile pour le traitement de cancer. En effet, l'IFNy est capable d'augmenter l'effet des anticorps par l'ADCC (antibody-dependant cellular cytotoxicity). L'anticorps est de préférence dirigé contre un antigène exposé par les cellules cancéreuses. L'anticorps peut être un anticorps polyclonal, monoclonal, humanisé, ou chimérique. De préférence, l'anticorps est monoclonal et humanisé. Par exemple, dans le cas d'un désordre hyperprolifératif des cellules B tel que le lymphome non-hodgkinien, l'antigène peut être CD20. Cet anticorps peut être le Rituximab. The combination with an antibody is useful for the treatment of cancer. Indeed, IFNγ is able to increase the effect of antibodies by ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity). The antibody is preferably directed against an antigen exposed by the cancer cells. The antibody may be a polyclonal, monoclonal, humanized, or chimeric antibody. Preferably, the antibody is monoclonal and humanized. For example, in the case of a hyperproliferative disorder of B cells such as non-Hodgkin's lymphoma, the antigen may be CD20. This antibody may be Rituximab.

La combinaison avec un glucocorticoïde est utile pour le traitement des maladies pulmonaires alvéolaires telles que la fibrose pulmonaire idiopathique. Des exemples de glucocorticoïdes adaptés sont l'hydrocortisone, la cortisone, la dexaméthasone, la bétaméthasone, la prednisolone, la méthyl prednisolone et leurs sels pharmaceutiquement acceptables. Un mode de réalisation préféré de la présente invention concerne l'utilisation d'une combinaison entre l'IFNy selon la présente invention et la prednisolone. The combination with a glucocorticoid is useful for the treatment of alveolar lung diseases such as idiopathic pulmonary fibrosis. Examples of suitable glucocorticoids are hydrocortisone, cortisone, dexamethasone, betamethasone, prednisolone, methyl prednisolone and their pharmaceutically acceptable salts. A preferred embodiment of the present invention relates to the use of a combination of IFNγ according to the present invention and prednisolone.

La combinaison avec un agent anti-histaminique, une hormone adrénocorticale, un agent anti-allergique est utile notamment pour le traitement de maladies de la peau telles que un prurigo ou une névrodermite. La combinaison avec un agent anti-allergique, un broncodilatateur, un stéroïde, un agent béta-adrénergique, un agent immunomodulateur, ou une cytokine est utile notamment pour le traitement de l'asthme. The combination with an antihistamine agent, an adrenocortical hormone, an antiallergic agent is useful in particular for the treatment of skin diseases such as a prurigo or a neurodermatitis. The combination with an antiallergic agent, a broncodilator, a steroid, a beta-adrenergic agent, an immunomodulatory agent, or a cytokine is useful in particular for the treatment of asthma.

30 La présente invention concerne en outre une méthode de traitement antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur chez un patient le nécessitant, comprenant l'administration d'une quantité thérapeutique efficace d'un variant thermostable de l'IFNy selon la présente invention au patient. De préférence, la méthode de traitement25 24 est destinée au traitement d'une pathologie citée ci-dessus. Facultativement, la méthode peut comprendre en outre l'administration d'un autre principe actif, de préférence sélectionné parmi ceux cités ci-dessus. The present invention further relates to a method of antiviral, antiproliferative or immunomodulatory therapy in a patient in need thereof comprising administering a therapeutically effective amount of a thermostable IFNγ variant according to the present invention to the patient. Preferably, the method of treatment 24 is for the treatment of a pathology mentioned above. Optionally, the method may further comprise the administration of another active ingredient, preferably selected from those mentioned above.

Exemples Sélection des variants thermostables de l'IFNy humain Les inventeurs ont mis en oeuvre une méthode de sélection directe de variants protéiques thermostables appelée THR et décrite dans la demande de brevet français numéro 0505935. Examples Selection of thermostable variants of human IFNγ The inventors have implemented a method of direct selection of thermostable protein variants called THR and described in French Patent Application No. 0505935.

Cette méthode est basée sur la préparation de protéine de fusion entre les variants de l'IFNy humain et un variant d'une protéine de résistance à la kanamycine, présentant une thermostabilité accrue (Ce double mutant de la kanamycine nucléotydil transférase est décrit dans Liao, Enzyme Microb. Technol., 1993, 15, 286-92). La banque de variants de l'IFNy humain a été préparée par la méthode de Massive Mutagenesis décrite dans FR2813314, et a été transformée à haute température dans la souche HB27 de Thermus thermophilus. Les clones transformants de cette banque ont été sélectionnés à des concentrations croissantes en kanamycine pour lesquelles la production de la fusion IFNy (sauvage)-KNTase ne permet plus aux cellules de pousser. Les clones obtenus dans ces conditions sont théoriquement associés à un gain de stabilité à haute température, comme indiqué dans la demande de brevet FR 05 05935 déposé le 10 juin 2005. Les mutations portées par les clones sélectionnés ont été identifiées et les séquences résultantes sont répertoriées dans le tableau 1. Les différents mutants isolés lors de cette sélection primaire ont été transformés à nouveau individuellement et leur niveau de résistance a été comparé à celui de la construction sauvage. 20 mutants, conférant à la souche une résistance plus ou moins importante mais toujours supérieure au sauvage, ont ainsi été confirmés (tableau 2). Génération systématique de variants ponctuels de l'IFNy_ Par ailleurs, à partir du clone d'expression pORF/IFNy, nous avons généré une importante collection de mutations ponctuelles de l'IFNy présentant une et une seule différence d'acide aminé avec les positions de l'IFNy dit sauvage (en prenant comme référence la SEQ N 6). This method is based on the preparation of fusion protein between variants of human IFNγ and a variant of a kanamycin resistance protein, having increased thermostability (This double mutant of kanamycin nucleotydil transferase is described in Liao, Enzyme Microb Technol., 1993, 15, 286-92). The human IFNγ variant library was prepared by the Massive Mutagenesis method described in FR2813314, and was transformed at high temperature into Thermus thermophilus strain HB27. The transforming clones of this library were selected at increasing concentrations of kanamycin for which the production of the IFNy (wild) -KNTase fusion no longer allows the cells to grow. The clones obtained under these conditions are theoretically associated with a gain in stability at high temperature, as indicated in the patent application FR 05 05935 filed on June 10, 2005. The mutations carried by the selected clones have been identified and the resulting sequences are listed. in Table 1. The different mutants isolated during this primary selection were transformed again individually and their level of resistance was compared to that of the wild-type construct. 20 mutants, giving the strain resistance more or less important but still superior to the wild, have thus been confirmed (Table 2). Systematic Generation of Spot Variants of IFNγ_ Furthermore, from the pORF / IFNy expression clone, we generated a large collection of IFNy point mutations with one and only one amino acid difference with the IFNy says wild (taking as reference SEQ N 6).

Analyse fonctionnelle des variants de lIFNy Les variants de l'IFNy humain sélectionnés par notre méthode de sélection ou générés de façon systématique sur toutes les positions de l'FNI, ont été exprimés transitoirement en cellules animales COS7. Ces protéines sont sécrétées dans le surnageant de culture. De façon à évaluer la stabilité et la conservation de l'activité de ces variants, les surnageants de culture de cellules COS7 ont été soumis à une dénaturation thermique (10 minutes à 59 C). On a ensuite fait agir ces protéines (dénaturées ou non) sur des cellules HeLa transfectées contenant la luciférase comme gène rapporteur. Après 16 heures de stimulation, pour chaque mutant et pour chaque condition, nous avons mesuré le signal de la ftrefly luciférase correspondant à l'activité de l'IFNy testé. On a ensuite comparé l'activité induite par la protéine non dénaturée à l'activité induite par cette même protéine dénaturée et on en a déduit l'activité résiduelle après dénaturation thermique pour la protéine étudiée (Activité résiduelle = Activité dénaturée/ Activité non dénaturée * 100). L'activité basale du variant non dénaturé a également été comparée à celle de l'IFNy non muté. Functional Analysis of IFNy Variants The human IFNγ variants selected by our selection method or systematically generated at all positions of the FNI were transiently expressed in COS7 animal cells. These proteins are secreted in the culture supernatant. In order to evaluate the stability and the conservation of the activity of these variants, the COS7 cell culture supernatants were subjected to thermal denaturation (10 minutes at 59 ° C.). These proteins (denatured or otherwise) were then activated on transfected HeLa cells containing luciferase as the reporter gene. After 16 hours of stimulation, for each mutant and for each condition, we measured the signal of the ftrefly luciferase corresponding to the activity of the IFNγ tested. The activity induced by the undenatured protein was then compared with the activity induced by this same denatured protein and deduced the residual activity after thermal denaturation for the studied protein (Residual activity = denatured activity / undenatured activity * 100). The basal activity of the undenatured variant was also compared to that of the non-mutated IFNγ.

Détails des expériences : Biologie moléculaire Constructions plasmidiques Système THR : Le vecteur qui a été utilisé comportait les origines de réplication de E. coli et de T. Thermophilus, un gène de résistance à l'ampicilline qui permet la sélection de transformants dans E. coli, un gène codant la KNTase thermostable sous contrôle d'un promoteur actif à la fois chez E. coli et de T. thermophilus (le promoteur ps1pA). Voir Figure1. La séquence nucléotidique de l'IFNy (codant pour la forme mature de 146 acides aminés SEQ ID N 5) a été clonée entre les sites Ncol et Notl du vecteur en N-terminal de la KNTase. L'IFNy et la KNTase en fusion sont séparés par une séquence codant un peptide de liaison ( linker ) qui présentait la séquence peptidique AAAGSSGSI (SEQ ID No 8) et était codée par la séquence nucléique GCG-GCCGCA-GGA-AGC-TCT-GGT-TCC-ATC (SEQ ID No 7). Details of Experiments: Molecular Biology Plasmid Constructs THR System: The vector that was used included the origins of replication of E. coli and T. Thermophilus, an ampicillin resistance gene that allows the selection of transformants in E. coli a gene encoding thermostable KNTase under the control of a promoter active in both E. coli and T. thermophilus (the ps1pA promoter). See Figure1. The nucleotide sequence of IFNγ (coding for the mature form of 146 amino acids SEQ ID N 5) was cloned between the NcoI and NotI sites of the N-terminal vector of KNTase. The IFNγ and the mutated KNTase are separated by a sequence encoding a linker peptide that has the peptide sequence AAAGSSGSI (SEQ ID No. 8) and is encoded by the GCG-GCCGCA-GGA-AGC-TCT-nucleic acid sequence. GGT-TCC-ATC (SEQ ID No. 7).

Système d'expression eucaryote : Pour l'expression de l'IFNy en cellules de mammifères, nous avons utilisé le pORF/IFNy (Invivogen) dans lequel lIFNy est clonée dans une cassette d'expression contenant le promoteur hybride (EF-la-HLTV) et le signal de polyadénylation fort du SV40. 26 Génération de mutants références de l 'IFNy Plusieurs mutants thermostables décrits dans la bibliographie ont été construits et utilisés à titre de contrôles positifs. Ils codent pour : - la protéine IFNy E30C/S92C : mutant avec un pont disulfure (gain de stabilité 5 TM +15 C, Waschutza et al., 1996) - la protéine IFNy delta 10 (extrémité Cterminale de la protéine délétée de ces 10 derniers acides aminés activté et stabilité améliorée, TM + 7,5 C et activité antivirale multipliée par 4, Slodowski et al., 1991). Ces mutants sont générés au niveau des matrices pNCK-IFNy et PORF-IFNy par la 10 méthode de Massive Mutagenesis décrite dans FR2813314. Génération dans le pORF-IFNy des mutants de 1'IFNy sélectionnés par la méthode THR Les mutations simples et multiples correspondants aux mutations identifiées sur les séquences des clones sélectionnés par la méthode THR sont introduites sur le pORFIFNy par la méthode de Massive Mutagenesis décrite dans FR2813314. 15 Génération systématique des mutations simples de l 'IFNy dans le pORF/ IFNy La génération de façon systématique de tous les variants simples de 1' IFNy (c'est-à-dire la substitution de l'acide aminé de la protéine mature de type sauvage par les 19 autres acides aminés du code génétique) a été réalisée par la méthode de Massive Mutagenesis décrite dans FR2813314 sur la matrice pORF/IFNy . 20 Sélection de mutants thermostables par la méthode THR Une banque de variants de l'IFNy cloné dans le vecteur pNCK a été générée grâce à Massive Mutagenesis . Une diversité totale a été introduite sur toutes les positions (de 21 à 166). La banque a ensuite été transformée à haute température (70 C) dans la souche HB27 de Thermus thermophilus et sélectionnée sur 20 ou 40 g/ml de 25 kanamycine (conditions où la fusion IFNy (sauvage)-KNTase ne permet plus à la cellule de pousser). Les nutations identifiées après séquençage sur des clones poussant sur milieu sélectif sont répertoriées dans le tableau 1. Les différents mutants isolés par le moyen de cette sélection primaire ont ensuite été retransformés de manière unique et leur niveau de résistance a été comparé à celui de la construction sauvage. 20 mutants, 30 conférant à la souche une résistance plus ou moins importante mais toujours supérieure au sauvage ont ainsi été confirmés (tableau 2). Eukaryotic Expression System: For the expression of IFNy in mammalian cells, we used pORF / IFNy (Invivogen) in which IFNy is cloned into an expression cassette containing the hybrid promoter (EF-la-HLTV ) and the strong polyadenylation signal of SV40. Generation of Reference Mutants of IFNy Several thermostable mutants described in the bibliography were constructed and used as positive controls. They encode: - the IFNγ E30C / S92C protein: mutant with a disulfide bridge (gain of stability TM +15 C, Waschutza et al., 1996) - the IFNy delta protein (end-point of the deleted protein of these 10 last amino acids activated and improved stability, TM + 7.5 C and antiviral activity multiplied by 4, Slodowski et al., 1991). These mutants are generated at the pNCK-IFNγ and PORF-IFNγ matrices by the Massive Mutagenesis method described in FR2813314. Generation in pORF-IFNy mutants of IFNy selected by the THR method The single and multiple mutations corresponding to mutations identified on the sequences of the clones selected by the THR method are introduced on pORFIFNy by the method of Massive Mutagenesis described in FR2813314 . Systematic Generation of Simple IFNγ Mutations in pORF / IFNy The Systematic Generation of All Simple IFNγ Variants (i.e., the Substitution of the Amino Acid of the Mature Protein wild by the other 19 amino acids of the genetic code) was carried out by the Massive Mutagenesis method described in FR2813314 on the pORF / IFNy template. Selection of thermostable mutants by the THR method A library of IFNγ variants cloned into the pNCK vector was generated using Massive Mutagenesis. Total diversity has been introduced in all positions (from 21 to 166). The library was then transformed at high temperature (70 C) in Thermus thermophilus strain HB27 and selected at 20 or 40 g / ml of kanamycin (conditions where the IFNy (wild) -KNTase fusion no longer allows the cell to push). The nutations identified after sequencing on clones growing on selective medium are listed in Table 1. The different mutants isolated by means of this primary selection were then uniaxtransformed and their level of resistance was compared to that of the construct. wild. 20 mutants, conferring on the strain resistance more or less important but still superior to the wild were thus confirmed (Table 2).

Validation fonctionnelle de la stabilité et de l'activité des mutants del' IFNy Tous les réactifs de culture cellulaire ont été fournis par Invitrogen. Les cellules HeLa ((human cervix epitheloid carcinoma cells) et les cellules COS-7 (African green monkey SV40 transformed kidney cells) ont été cultivées dans des conditions standards de culture (37 C en atmosphère humide contenant 5% CO2) en utilisant respectivement les milieux Dulbecco's Modified Eagle's Medium (D-MEM) et Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM). Tous ces milieux de culture contiennent un analogue de la L-glutamine (le glutamax) et sont supplémentés en sérum de veau foetal décomplémenté (10% final) et en antibiotiques à raison de 100 units/ml de pénicilline et 0.1 mg/ml de streptomycine. Le vecteur pSV-betagal TM (Promega), qui exprime la béta galactosidase sous le contrôle du promoteur précoce SV40, a été utilisé pour normaliser les efficacités de toutes les transfections réalisées. Expression des mutants uniques de l'IFNy humain en cellules de mammifères COS7 Afin de réaliser les transfections des cellules COS7 par les constructions pORF/ IFNy natif ou muté, ces cellules ont été trypsinisées lorsqu'elles atteignaient 90% de confluence. Les cellules COS7 ont été ré-ensemencées suivant le ratio (c'est-à-dire de façon à ce qu'elles représentent, une fois adhérées sur la surface, une confluence de 25% environ). La transfection des cellules COS7 a été réalisée en plaque 24 puits avec un ensemencement de 30 000 à 60 000 cellules par puits lorsque les cellules atteignent 70-80% confluence. La transfection a été réalisée avec environ 50ng d'ADN et du Jet PEI (Polyplus transfection) en utilisant un ratio Jet PEUADN de 5 en laissant 30 minutes à température ambiante. Après 24h de transfection, le milieu (5001.tL IMDM + SVF + antibiotiques) a été changé. Les surnageants contenant l'IFNy (avec un niveau d'expression de l'ordre de 0,5 à 1 g/ml) ont été récupérés à T=24H post-transfection. Functional Validation of the Stability and Activity of IFNγ Mutants All cell culture reagents were provided by Invitrogen. The HeLa ((human cervix epitheloid carcinoma cells) cells and the COS-7 (African green monkey SV40 transformed kidney cells) cells were cultured under standard culture conditions (37 C in a humid atmosphere containing 5% CO2) using respectively the Dulbecco's Modified Eagle's Medium Medium (D-MEM) and Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) All of these culture media contain an L-glutamine analogue (glutamax) and are supplemented with decomplemented fetal calf serum (10% final) and antibiotics at 100 units / ml penicillin and 0.1 mg / ml streptomycin The pSV-betagal TM vector (Promega), which expresses beta-galactosidase under the control of the SV40 early promoter, has been used to normalize efficacies. of all the transfections carried out Expression of the unique mutants of human IFNγ in COS7 mammalian cells In order to perform the transfections of COS7 cells by the pORF / I constructs Native or mutated FNy, these cells were trypsinized when they reached 90% confluency. The COS7 cells were reseeded according to the ratio (i.e. they represent, when adhered to the surface, a confluence of about 25%). Transfection of COS7 cells was performed in a 24-well plate with seeding of 30,000 to 60,000 cells per well when the cells reached 70-80% confluency. Transfection was performed with about 50ng of DNA and Jet PEI (Polyplus transfection) using a Jet PEUADN ratio of 5 leaving for 30 minutes at room temperature. After 24h transfection, the medium (5001.tL IMDM + SVF + antibiotics) was changed. Supernatants containing IFNγ (with an expression level of the order of 0.5 to 1 g / ml) were recovered at T = 24H post-transfection.

Ils ont été aliquotés et conservés à -20 C avant le dosage de l'activité de l'IFNy. Test primaire activité Il a été déjà été décrit que l'IFNy active spécifiquement les récepteurs à l'IFNy présents sur les cellules HeLa. La stimulation de la voie des Jak/Statl des cellules HeLa par l'IFNy s'effectue en ayant, en particulier, pour conséquence l'activation de la transcription des gènes sous le contrôle de promoteur possédant des séquences GAS pour Gamma Activated Site . Il est alors possible de mesurer et de comparer les activités des variants de l'IFNy en transfectant dans les cellules HeLa un système de gène rapporteur dans lequel la luciférase (firefly luciferase) est en aval d'un promoteur possédant plusieurs sites GAS (plasmide pGAS/Luciférase de Stratagene). Transfection transitoire des cellules HeLa par le pGAS/Luciférase Les cellules HeLa ont été trypsinisées lorsqu'elles atteignaient 90% de confluence et ont été ré-ensemencées avec un ratio de 1/3. Les transfections de cellules HeLa à 50-80 % de confluence ont été réalisées en plaque 96 puits selon le protocole du fournisseur : 20 000 cellules par puits ont été transfectées avec environ 150ng d'ADN pGAS/Luciférase et du jet PEI dans un rapport Jet PEI/ADN de 5. Le tout a été vortexé 30s et laissé à température ambiante 30 min. Puis, 20 L du mélange ADN/Jet PEI ont été répartis dans chaque puits de la plaque et les cellules ainsi transfectées sont cultivées pendant 24 heures à 37 C et en 5% CO2. Mesure de l'activité totale basale des variants de l'IFNy (protéine non dénaturée) / protéine sauvage Les surnageants de cellules COS7 contenant l'IFNy ont été dilués au 1/100eme. They were aliquoted and stored at -20 ° C. before assaying for IFNy activity. Primary Activity Test It has already been described that IFNγ specifically activates the IFNγ receptors present on HeLa cells. The stimulation of the Jak / Statl pathway of HeLa cells by IFNγ is carried out with, in particular, the consequence of activating the transcription of genes under the control of promoters having GAS sequences for Gamma Activated Site. It is then possible to measure and compare the activities of IFNγ variants by transfecting in HeLa cells a reporter gene system in which luciferase (firefly luciferase) is downstream of a promoter possessing several GAS sites (plasmid pGAS Stratagene Luciferase). Transient Transfection of HeLa Cells by pGAS / Luciferase HeLa cells were trypsinized when they reached 90% confluency and were re-seeded at a ratio of 1/3. Transfections of HeLa cells at 50-80% confluence were performed in 96-well plate according to the supplier's protocol: 20,000 cells per well were transfected with approximately 150ng of pGAS / Luciferase DNA and PEI jet in a Jet report. PEI / DNA of 5. The whole was vortexed 30s and left at room temperature for 30 min. Then, 20 L of the DNA / PEI Jet mixture were distributed in each well of the plate and the cells thus transfected are cultured for 24 hours at 37 ° C. and 5% CO 2. Measurement of Total Basal Activity of IFNγ (Undenatured Protein) / Wild-Protein Variants The COS7 cell supernatants containing IFNγ were diluted 1/100.

10 L de ces dilutions de surnageants de cellules COS7 contenant l'IFNy ont été ajoutés sur les cellules HeLa transfectées par du pGAS/Luciférase. Après 16 heures à 37 C 5% CO2 pendant lesquelles l'expression cytoplasmique de la firefly luciférase s'est effectuée, les culots de cellules ont été récupérés et congelés.10 μl of these IFNγ-containing COS7 cell supernatant dilutions were added to pGAS / Luciferase transfected HeLa cells. After 16 hours at 37 C 5% CO2 during which the cytoplasmic expression of firefly luciferase was carried out, the cell pellets were recovered and frozen.

5011L de Glo lysis buffer TM (Promega), ont été ajoutés pour lyser les cellules. La lyse s'est effectuée pendant 10 min sous agitation à température ambiante de façon à libérer la luciférase produite en réponse à la stimulation spécifique de l'IFNy. Le test de l'activité luciférase à proprement dit a été initialisé par l'ajout du réactif Bright Glo TM (Promega) et la quantité de luciférase accumulée a ensuite été comptée avec un luminomètre (FLX 800, Bio-Tek Instrument). Le calcul de l'activité totale (par rapport à la protéine sauvage) de chaque variant (non dénaturé) est une moyenne réalisée sur la base de résultats obtenus sur 5 manipulations différentes (duplicates au minimum) et sur des surnageants de culture provenant, au minimum, de deux transfections indépendantes. Les barres d'erreur présentées sont calculées par la formule de l'erreur standard sur la moyenne (s.e.m). L'une des façons de présenter les résultats d'activité totale est de rapporter l'activité de base de chaque variant en pourcentage de l'activité de base de l'IFNy non muté exprimé dans les mêmes conditions pour chaque transfection. Mesure de l'activité résiduelle des variants après dénaturation thermique par gène rapporteur luciférase Comme précédemment décrit par le test primaire d'activité par gène rapporteur, la quantité de luciférase a été mesurée après stimulation des cellules par 101.tL de surnageants de cellules COS7 dilués au 1/ 100ème contenant l'IFNy qui, suivant les cas, ont été soumis à un traitement thermique de 10 minutes à 59 C ou bien n'ont pas été traités. L'une des façons de présenter la fraction d'activité de chaque variant conservée après dénaturation thermique est de calculer l'activité résiduelle conservée de chaque variant définie par le pourcentage de l'activité basale du même variant avant dénaturation. Le calcul de l'activité résiduelle par rapport à une activité totale déterminée avant dénaturation est une moyenne réalisée sur la base de résultats obtenus sur 5 manipulations différentes (duplicates au minimum) et sur des surnageants de culture provenant., au minimum, de deux transfections indépendantes. Les barres d'erreur présentées sont calculées sur la formule de l'erreur standard sur la moyenne (s.e.m). Mesure d'un indice d'amélioration des variants de l'IFNy (amélioration de la thermostabilité et/ou de l'activité) Une fois que l'on a vérifié qu'un variant de l'IFNy étudié présente à la fois une amélioration de la thermostabilité et une conservation au moins partielle de l'activité intrinsèque de la protéine, on peut calculer le produit de l'activité résiduelle du mutant étudié après prétraitement, par son activité (sans prétaitement). Cette indice donne une idée de la résultante du gain de thermostabilité et de perte relative d'activité, et donne donc une idée de l'effet in vivo attendu de la protéine. Les valeurs obtenues avec les protéines de référence sont les suivantes : un indice de 37 pour l'IFNy non muté et de près de 76 pour le variant delta 10 connu dans la bibliographie.5011L of Glo lysis buffer TM (Promega), were added to lyse the cells. The lysis was carried out for 10 minutes with stirring at room temperature so as to release the luciferase produced in response to the specific stimulation of IFNy. The luciferase activity test itself was initiated by the addition of Bright Glo TM reagent (Promega) and the amount of accumulated luciferase was then counted with a luminometer (FLX 800, Bio-Tek Instrument). The calculation of the total activity (relative to the wild-type protein) of each variant (undenatured) is an average carried out on the basis of results obtained on 5 different manipulations (at least duplicates) and on culture supernatants coming from minimum of two independent transfections. The error bars presented are calculated by the formula of the standard error on the mean (s.e.m). One way to present the total activity results is to report the baseline activity of each variant as a percentage of the base activity of the non-mutated IFNγ expressed under the same conditions for each transfection. Measurement of the residual activity of the variants after thermal denaturation by luciferase reporter gene As previously described by the primary test of reporter gene activity, the amount of luciferase was measured after stimulation of the cells by 101 μl of diluted COS7 cell supernatants. 1 / 100th containing IFNγ which, depending on the case, were subjected to a heat treatment of 10 minutes at 59 C or were not treated. One of the ways to present the fraction of activity of each conserved variant after thermal denaturation is to calculate the conserved residual activity of each variant defined by the percentage of the basal activity of the same variant before denaturation. The calculation of the residual activity with respect to a total activity determined before denaturation is an average carried out on the basis of results obtained on 5 different manipulations (at least duplicates) and on culture supernatants originating from, at least, two transfections. independent. The error bars presented are calculated on the standard error formula on the mean (s.e.m). Measurement of an IFNy variant improvement index (improvement of thermostability and / or activity) Once it has been verified that a variant of the IFNγ studied has both an improvement of the thermostability and at least partial preservation of the intrinsic activity of the protein, it is possible to calculate the product of the residual activity of the mutant studied after pretreatment, by its activity (without pretreatment). This index gives an idea of the resultant thermostability gain and relative loss of activity, and thus gives an idea of the expected in vivo effect of the protein. The values obtained with the reference proteins are the following: an index of 37 for the non-mutated IFNγ and close to 76 for the delta variant 10 known in the bibliography.

Claims

claims

1- thermostable variant of human interferon gamma (IFNy) or a functional fragment thereof comprising at least one substitution selected from the group consisting of F159C, R162E, A147E, C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157W, M157L, L158W, L158C, L1581, F159V, R160A, R162D, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E and S165V, the positions indicated corresponding to those of SEQ ID No. 2.

2- thermostable variant of IFNγ according to claim 1, wherein the variant has a single substitution.

The thermostable IFNy variant according to claim 1, wherein the variant has a combination of substitutions selected from the group consisting of C21G + F159C, A147E + R162D, M100N + T119Y, Y76D + K131I, T50Y + Y121T + M140P, P26D + S122P, Y22S + L158W + R163G, Y22D + S122H, R162Q + A164E, and Y22T + K109C + T119P + A147F + R163L, the positions indicated corresponding to those of SEQ ID No. 2.

4- Therapeutic variant of human interferon gamma (IFNy) or a functional fragment thereof having either a single C23S or M157C substitution, or a C23S or M157C substitution in combination with one or more substitutions selected from the group consisting of C21G , C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H , K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, MI00N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E , A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157L, L158W, L158C, L158I, 30F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E and S165V, the positions indicated corresponding to those of SEQ ID No. 2.

5- Nucleic acid encoding a thermostable IFNγ variant according to any one of claims 1-4.

Nucleic acid expression cassette according to claim 5.

A vector comprising a nucleic acid according to claim 5 or an expression cassette according to claim 6.

A host cell comprising a nucleic acid according to claim 5, an expression cassette according to claim 6 or a vector according to claim 7.

9. A pharmaceutical composition comprising a thermostable variant of IFNγ according to any one of claims 1-4.

The pharmaceutical composition of claim 9, further comprising at least one component selected from the group consisting of an antibody, a chemotherapeutic agent, a glucocorticoid, an antihistamine agent, an adrenocortical hormone, an antiallergic agent, a cytokine, a vaccine,

11- thermostable IFNγ variant according to any one of claims 1-4 or pharmaceutical composition according to claim 9 as a medicament.

12- Use of a thermostable IFNγ variant according to any one of claims 1-4 or a pharmaceutical composition according to claim 9 for the preparation of an antiviral, antiproliferative or immunomodulatory drug. 30

The use according to claim 12, wherein the medicament is for the treatment of a selected pathology among asthma, familial chronic granulomatosis, idiopathic pulmonary fibrosis, atypical mycobacterium infection, kidney cancer, osteoporosis, generalized scleroderma, chronic hepatitis B or C virus, septic shock, allergic dermatitis, and rheumatoid arthritis.

14- Use of a nucleic acid according to claim 5, an expression cassette according to claim 6, a vector according to claim 7 or a cell according to claim 8 for producing a thermostable variant of IFNy according to any of claims 1-4.10