FR2460138A1

FR2460138A1 - Preparation antithrombinique et son procede de fabrication

Info

Publication number: FR2460138A1
Application number: FR7917217A
Authority: FR
Inventors: Yahiro Uemura; Midori Nagatomo; Satoshi Funakoshi; Tadakazu Suyama
Original assignee: GREEN CROSS CORP
Current assignee: GREEN CROSS CORP
Priority date: 1978-01-07
Filing date: 1979-07-03
Publication date: 1981-01-23
Also published as: JPS597693B2; NL181781C; GB2064545A; JPS5495715A; NL7905220A; FR2460138B1; CH645537A5; BE877439A; WO1980002798A1; SE8101065L; US4340589A; GB2064545B; SE459784B; NL181781B; CA1126652A

Abstract

L'INVENTION SE RAPPORTE A UNE PREPARATION ANTITHROMBINIQUE SECHE CONTENANT DE L'ANTITHROMBINE-III D'ORIGINE HUMAINE COMME INGREDIENT PRINCIPAL, ET A SON PROCEDE DE FABRICATION. ON LYOPHILISE UNE SOLUTION AQUEUSE D'ANTITHROMBINE-III D'ORIGINE HUMAINE EN PRESENCE D'UNE QUANTITE EFFICACE D'AU MOINS UNE ESPECE DE STABILISANT CHOISI PARMI LE GROUPE CONSTITUE DES PROTEINES, DES SUCRES, DES AMINO-ACIDES, DES SELS MINERAUX ET DES SELS ORGANIQUES. L'ANTITHROMBINE-III UTILISEE DANS L'INVENTION PEUT ETRE N'IMPORTE QUELLE ANTITHROMBINE-III QUI A ETE PURIFIEE PAR L'UN QUELCONQUE DES PROCEDES DECRITS JUSQU'A UNE PURETE DE 30 OU DAVANTAGE, ET L'ANTITHROMBINE-III ELLE-MEME N'EST PAS PARTICULIEREMENT LIMITEE. APPLICATION EN MEDECINE.

Description

Le présente invention se rapporte à nepréparation anti-

thrombinique sèche contenant de l'antithrombine-ITI d'origine

humaine comme ingrédient principal, et sorn procédé de fabrication.

Il est bien connu que la thrombins ayant une action coagulante agit sur la fibrine en donnant un monomère fibri- nique, lequel se polymérise en formant un réseau de fibres de fibrine, cependant que le réseau emprisonne des corpuscules du sang pour donner un thrombus grâce auquel les saignements

sont stoppés.

Bien que la thrombine existe habituellement dans les organismes vivants sous forme de prothrombine inactive, elle peut quelquefois ître activée progressivement en donnant de la thrombine. Cependant, la thrombine est neutralisée par les antithrombines qui existent simultanément dans l'organisma vivant, de sorte que la coagulation du sang ne se produit pas immédiatement. Dans les cas de coagulation intravasculaire c esmie (iDIC) et de fibronopénie, l'activation de la prothrombine dans l'organisme vivant est accélêrée de façon anormale et elle dépasse l'action neutralisante de l'antithrombins, ce qui entraîne la coagulation du sang et la formation de thrombi

dans divers endroits de l'organisme.

En conséquence, on peut remédier à des anomalies

telles que la DIC en renforçant l'action de l'antithronboina.

Comme substance ayant une activité antithrombique in vivo, on citera l' antithrortbine-I I, la fibrine et ses produits de

décomposition, l'12-macroglobulinc etc.; parmi ceux-ci, i'anti-

thrombine-III présente i'activité la plus élevée, de sorte qu'il

est souhaitable de produire une prépaeation stable de i2:alle-ci.

L'antithrombirie-III dont il est question ici est une substance capable d'inactive- la thrombine humaine. Elle peut être obtenuea à 'oriir du sang cnrier, du plasma ou du sé;um huinuin. Ls saru,.'xl3Z{Sé, partir de sarng coagulé contient cette substance, quie ne peut

pas coaguler le fibrinogène purifié.

Comme procédés de purification dE lkantithrombina-II, on citera le procédé d'absorption sur hydroxyde d'aluminium, la chromatographie par échange d'ions sur DEAE-cellulose, et la méthode d'absorption héparine- séphalose (brevet japonais

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Kokai n0 35017/1973, brevet des U.S.A. no 3 842 06t). Bien que l'antithrombine-III obtenue par ces procédés soit relativement stable à l'état liquide, la perte d'antithrombine-III est assez importante lors de la congélation ou de la lyophylisation qui sont généralement considérés comme des procédés très efficaces pour la stabilisation à long terme des protéines etc. Comme l'antithrombine-III présente une certaine stabilité à l'état liquide, il est possible de produire une préparation liquide d'antithrombine-III. Mais la préparation o10 liquide est peu souhaitable car l'activité de la préparation liquide diminue après un stockage prolongé et il se dépose dans

certains lots une matière insoluble.

Bien qu'on ait déjà signalé plusieurs procédés de purification de l'antithrombine-III comme ci-dessus, on n'a pas encore mis au point de procédé de production d'une préparation médicale à partir de celle-ci, ce qui résulte de ce qu'il n'existe aucune technique de stabilisation du

produit purifié pendant une durée prolongée.

La demanderesse a effectué une étude détaillée d'un procédé pour transformer l'antithrombine-I.II en une préparation, et du procédé de stabilisation de l'antithrombine-III au cours de la lyophylisation. A la suite de cette étude, la demanderesse a découvert un stabilisant utilisable à ces effets et elle a

développé une préparation d'antithrombine contenant une anti-

thrombine-III lyophylisée comme ingrédient principal sous une forme sûre et stabilisée pour une durée prolongée. La présente

invention est basée sur ce succès.

Un des buts de l'invention est de fournir une prépa-

ration d'entithrombine sèche contenant comme ingrédient principal de l'antithrombine-III, laquelle est sûre, stable pendant une

durée prolongée, et un procédé pour sa production.

D'autres buts et avantages de l'invention ressortiront

de la description ci-dessous.

Conformément à l'invention, il est fourni une prépa-

ration d'antithrombine stable, sèche contenant de l'antithrombine-

III d'origine humaine.

L'invention fournit aussi une préparation d'antithrombine sèche contenant de l'antithrombine III comme ingrédient principal et une quantité efficace d'au moins-une espèce de stabilisant choisi parmi les protéines, les sucres, les amino-acides, les

sels minéraux et les sels d'acides organiques.

En outre, conformément à l'invention, il est fourni un procédé de production d'une préparation d'antithrombine sèche caractérisé en ce qu'on lyophylise une solution aqueuse d'antithrombine-III d'origine humaine en présence d'une quantité efficace d'au moins une espèce de stabilisant choisi 1o parmi le groupe constitué des protéines, des sucres, des

amino-acides, des sels minéraux et des sels organiques.

L'antithrombine-III utilisée dans l'invention peut être n'importe qu'elle antithrombine-III qui a été purifiée par l'un quelconque des procédés décrits jusqu'à

une pureté de 30 % ou davantage, et l'antithrombine-III elle-

même n'est pas particulièrement limitée.

Le stabilisant utilisé pour le traitement de lyophylisation de l'antithrombine-III doit âtre un stabilisant physiologiquement acceptable. Comme exemples de ces stabilisants, on citera des sels minéraux tels que le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le phosphate de sodium, le phosphate

de potassium, le bicarbonate de sodium etc.; des sels organi-

ques tels que le citrate de sodium, le citrate de potassium, l'acétate de sodium, l'oxalate de potassium etc.; des protéines comme l'albumine, la globuline, le fibrinogène, l'urokinase, le plasminogène, la gélatine etc.; des sucres comme le mannitol, le glucose, le saccharose, l'héparine etc.; et des amino-acides tels que la glycine, la lysine etc. Ces stabilisants ont également une action stabilisante dans le traitement thermique d'inactivation du virus de l'hépatite,

qui peut être contenu dans l'antithrombine-III.

- On peut obtenir une quantité efficace de chaque stabilisant en ajoutant 0,1 à 5,0 parties en poids du stabilisant

à une solution aqueuse contenant une partie en poids d'anti-

thrombine-III. Parmi les stabilisants ci-dessus, les protéines, les sucres et les amino-acides peuvent également servir d'excipient de la préparation, de sorte que leur utilisation

en combinaison avec d'autres stabilisants est favorable.

Lorsqu'on utilise deux espèces de stabilisants ou davantage dans le mélange, la quantité totale des additifs peut être

dans l'intervalle mentionné ci-dessus.

Pour utiliser ces stabilisants, on dissout une quantité déterminée de ceux-ci dans une solution aqueuse d'antithrombine-III ayant une concentration et un pH appropriés,

La concentration de la solution obtenue doit être dans l'inter-

valle de 0,1 à 3 fois la concentration d'isotonique, et être de préférence égal à la concentration isotonique. Le ph de la solution aqueuse doit âtre ajusté à 6,2-9,0, de préférence

à 7-8.

La solution aqueuse contenant l'antithrombine-III et le stabilisant est soumise à un traitement thermique (60 C, heures) pour inactiver le virus de l'hépatite, ou à une filtration stérilisante ou aux deux, si nécessaire, après quoi on la divise en portions égales à l'unité de conditionnement, de telle sorte qu'un conditionnement contienne 1 000 à 100 000 unités d'antithrombine-III. Puis la solution divisée est lyophylisée rapidement, ce qui fournit une préparation plus

virulente.

La préparation sèche d'antithrombine-III ainsi obtenue contient 0,1 à 5,0 parties en poids de stabilisant

pour une partie en poids d'antithrombine-III.

Lorsqu'on applique la préparation de l'invention à un patient ayant une DIC ou une fibrinopénie, on en fait une solution contenant environ 1 à10 % P/V d'antithrombine-III avec de l'eau distillée pour injections, ou mieux en une solution ayant une concentration en sels physiologiquement

isotonique, puis on administre la solution par voie intra-

veineuse. Bien que la dose puisse être choisie de façon

appropriée en fonction des besoins, la préparation est généra-

lement utilisée sous la forme de l'unité de conditionnement.

La préparation de l'invention ne perd pas son activité du tout au cours du traitement de lyophylisation, et elle a une

stabilité dans le temps tellement élevée qu'elle reste entière-

ment stable après avoir été stockée à 370C pendant environ 24 mois. Par conséquent, elle est très intéressante dans le domaine médical en tant que préparation antithrombine contenant

de l'antithrombine-III comme ingrédient principal.

Les concentrations de l'antithrombine-III indiquées

dans la description et les revendications ci-après ont été déterminées

en faisant réagir un échantillon avec de la thrombine à 231C pendant 5 mn, en mesurant la prolongation du temps de coagulation provoquée par l'addition de fibrinogène au mélange réactionnel, et en calculant la concentration à partir de celui-ci en se

référant à une courbe de calibrage préalablement établie.

A ce moment, l'unité et l'activité de l'antithrombine est choisie pour des raisons de commodité, de telle sorte qu'une activité antithrombinique d'un liquide surnageant obtenue par traitement thermique d'un plasma humain normal à 561C pendant 3 mn, puis en défibrinant le produit de la réaction, soit

égal à 100 unités/ml.

Dans le présent mémoire et les revendications, P/V %

ainsi que le pourcentage de poids unitaire du soluté par

volume unitaire de solution aqueuse.

Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à

titre d'illustration de l'invention.

Exemple 1.

On met en suspension 10 kg de la fraction pâteuse IV-1 obtenue par la méthode de fractionnement à l'alcool froid de

Chon dans 100 1 de solution de chlorure de sodium physiologique.

On ajoute à la suspension 5 % P/V de sulfate de sodium et on agite le mélange à la température ambiante pendant 30 mn, de telle sorte que la faible quantité de prothrombine présente

dans le mélange est absorbée sur la sulfate de barium et éliminée.

On ajoute au liquide surnageant 13 % P/V de polyéthylàneglycol 4000, on élimine le précipité formé par centrifugation, on y ajoute 30 dû P/V supplémentaire de polyéthylèneglycol 4000 et

on recueille le précipité formé par centrifugation.

On dissout le précipité dans environ 20 1 d'une solution de chlorure de sodium physiologique froid et on le verse dans une colonne d'héparine séphalose préalablement préparée pour y faire absorber leantithrombinesIII. On lave la colonne avec une solution 0,4 M de chlorure de sodium pour éliminer les protéines présentes comme impuretés, après quoi on verse sur la colonne une solution 2,0 M de chlorure de

sodium et on recueille l'éluat sous forme de fraction d'anti-

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thrombine-III. Le rendement est de 510 x 10 unités, et le taux de récupération est d'environ 50 % par rapport à la matière

de départ. On dialyse une nuit la solution aqueuse de l'anti-

thrombine-III purifiée ainsi obtenue contre 0,5 % P/V de citrate de sodium et 0,4 % P/V de chlorure de sodium ce qui fournit une solution aqueuse à 1 % P/V d'antithrombine-III. On ajoute 1 % P/V d'albumine humaine, on soumet le mélange à une filtration stérilisante au moyen d'un filtre millipore stérile, et on divise le filtrat en portions de 50 000 unités, puis on le

lyophylise pour obtenir les préparations sèches.

Après lyophylisation, le titre est de 50 000 unités, ce qui indique qu'aucune perte de titre ne s'est produite à la suite de la lyophylisation. Le préparation ne présente ni perte de titre ni détérioration de la solubilité même après repos

à 37 C pendant 24 mois, ce qui démontre son extrême stabilité.

Lorsqu'on dissout cette fraction lyophylisée dans de l'eau distillée pour injection et que l'on administre une quantité de la solution correspondant à 40 000 unités/kg à 5 souris à travers la veine de la queue on n'observe aucune anomalie sur les 7 jours qui suivent. Lorsqu'on administre la même solution que ci-dessus à des rats domestiques à la dose de 000 unités/kg,on n'observe aucune modification anormale de la

température du corps sur les 24 h suivantes.

Exemple 2.

On chauffe à 56 C pendant 3 mn un litre de plasma

humain normal et on élimine la fibrine déposée par purification.

On mélange le liquide surnageant avec 5 % P/V de sulfate de barium et on l'agite pendant 1 h, après quoi on élimine le sulfate de baryum par centrifugation. On soumet le liquide surnageant à un traitement d'absorption sur de l'hydroxyde d'aluminium conformément au procédé Monkhouse et al., puis

on l'élue, ce qui donne une antithrombine-III semi-purifiée.

On verse l'éluat dans une colonne de DEAE-cellulose préala-

blement équilibrée avec une solution tampon d'acécate 0,02 M, pour faire absorber l'antithrombine-III sur la solonne. On lave la colonne avec la même solution tampon que ci-dessus, puis on la soumet à une élution par gradient de concentration avec du chlorure de sodium 1 M pour recueillir une fraction ayant une

activité d'antithrombine-III élevée. On obtient 2,3 x 104 unités.

On ajoute du citrate de sodium à la solution aqueuse d'anti-

thrombine-III, de fagon à ce que la concentration de citrate de sodium soit de 0,6 M et on ajuste son pH à 7,8, après quoi on la chauffe à 60 C pendant 10 h pour y activer le virus de l'hépatite, puis on la dyalise une nuit contre une solution 0,9 % de chlorure de sodium, après quoi on la soumet à une

séparation centrifuge, ce qui donne une solution limpide.

On mélange cette solution aqueuse à 1 % P/V d'anti-

thrombine-III à 2 % P/V de mannitol at 0,2 % P/V de citrate de sodium, on dilue le mélange avec une faible quantité d'eau distillée froide, de telle sorte que la concentration en chlorure de sodium soit de 0,5 % P/V, on ajuste le pH de la dilution à 7,6 avec de l'hydroxide de sodium 1 N, on la soumet à une filtration stérilisante au moyen d'un filtre Millipore stérile, et on divise le filtrat en portions de 5 000 unités,

puis on le lyophylise pour obtenir des préparations sèches.

La préparation à un titre de 4 950 unités après la lyophylisation, ce qui indique qu'il ne. s'est pas produit de perte de titre observable. Elle ne présente aucune modification de solubilité ni perte de titre même après repos à la température

ambiante pendant 24 mois ou davantage.

De la même manière qu'à l'exemple 1, on administre à des souris 10 000 unités/kg et on observe les animaux pendant 7 jours. Ceux-ci ne présentent aucune anomalie, et leur poids corporel augmente normalement, ce qui démontre la sécurité de la préparation. On administre la mCme solution que ci-dessus à des lapins domestiques à la dose de 2 000 unités/kg. On

n'observe aucune anomalie sur les 24 h suivantes.

Exemple 3.

On ajoute à la solution aqueuse à 1 % P/V l'antithrom-

bine-III purifiée obtenue dans l'exemple 1, 1 % P/V de glycine,

0,2 % P/V de chlorure de sodium et 1 % P/V d'albumine humaine.

Après avoir ajusté le pH du mélange à 7,2, on le soumet à une filtration stérilisante au moyen d'un filtre millipore stérile, on le répartit en 50 milliportions et le lyophylise pour obtenir des préparations sèches. Après séchage,on n'observeaucune perte de

titre et la solubilité reste bonne.

Exemple 4.

On ajoute à la solution aqueuse à 1 % P/V d'anti-

thrombine-III purifiée obtenue à l'exemple 1, 0,5 % P/V (5 000 unités/ml) d'urokinase (fabriquée par la Green Cross Corporation), 0,3 % P/V de chlorure de sodium et t % P/V de mannitol. Après avoir ajusté le pH du mélange 7,2, on le soumet à une filtration stérilisante au moyen d'un filtre millipore stérile, on le divise en portions de 50 000 unités, et le lyophylise pour obtenir des préparations sèches. Après séchage, on n'observe aucune perte de titre et la solubilité reste bonne. L'activité de l'antithrombine-III est stable

même après repos à 37 C pendant 24 mois.

Exemple 5.

On obtient une préparation sèche en répétant le mode opératoire de l'exemple 4, excepté que l'on remplace l'urokinase par de l'héparine à 0, 1 % P/V. Après séchage, on observe aucune perte de titre et la solubilité reste bonne. L'activité de l'antithrombine-III est stable même

après repos à 37 C pendant 24 mois.

Exemple expérimental.

En utilisant une antithrombine-III qui a été purifiée

et récupérée conformément à l'exemple 1, on compare expéri-

mentalement les stabilités dans le temps obtenues par addition de divers stabilisants. Ainsi, dans cette expérience, une

masse liquide d'antithrombine-III est mélangée à divers tran-

quilisants et lyophylisée, puis on étudie les taux d'activité résiduelle juste après séchage et après un laps de temps d'une

année, en prenant l'activité avant séchage comme égale à 100.

On prépare les échantillons en ajustant 10 ml d'une solution aqueuse contenant 50 000 unités d'antithrombine-III (0,5 % P/V) à pH 7,5-7,7, et en y ajoutant divers stabilisants dans les proportions indiquées dans le tableau suivant. Les résultats

de ces expériences sont résumés dans le tableau suivant.

Tableau

Taux d'activité résiduel Stabilisant et i _ _ _ _ proportion aussitôt au bout au bout au bout après de 3 de 6 de 12 séchage mois mois mois Albumine (1%) 100 100 100 100

Albumine (1%) et chlo-

rure de sodium (0,5%) 108 103 100 100 Chlorure de sodium (1%) 101 101 102 101 Albumine (1%) et citrate de sodium (0,4%) 100 103 102 100 Citrate de sodium (1,0% 100C 100 101 102 Mannitol (1%) 100 103 101 100 Mannitol (1%) et oxalatE de potassium (0,5%) 100 100 101 101 Gélatine (1%) 101 101 102 102 Lysine (1,5%) 100 100 100 101 Albumine (1%) et citrate de sodium (0, 4%) et chlorure de sodium (0,5%) 102 103 103 102 Aucun 67 60 O 0

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Claims

REVENDICATIONS

1. Préparation d'antithrombine sèche contenant une quantité efficace d'antithrombine-III et une quantité efficace d'au moins un membre du groupe constitué par les protéines, les sucres, les amino-acides, les sels minéraux et les sels d'acides organiques comme stabilisant.

2. Préparation d'antithrombine sèche suivant la revendication t, caractérisée en ce que la quantité de ces stabilisants est de 0,1 à 5,0 parties en poids pour une partie

en poids d'antithrombine-III.

3. Préparation d'antithrombine sèche suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a été traitée

thermiquement pour inactiver le virus de l'hépatite.

4. Préparation d'antithrombine sèche suivant la revendication I caractérisée en ce que ce stabilisant est un mélange d'au moins un membre choisi dans le groupe constitué des protéines, des sucres, et des aminoacides, et d'au moins un membre choisi dans le groupe constitué des sels minéraux

et des sels d'acides organiques.

5. Préparation d'antithrombine sèche suivant la

revendication 4, caractérisée en ce que la quantité de stabili-

sant choisie dans le groupe constitué des protéines, des sucres et des amino-acides est suffisante pour qu'ils jouent le r81e d'excipient.

6. Préparation d'antithrombine sèche suivant la revendication 1, caractérisée en ce que cette protéine ait au moins un membre choisi dans le groupe constituéde l'albumine, la globuline, le fibrinogène, l'urokinase, le plasminogène

et la gélatine.

7. Préparation d'antithrombine sèche suivant la revendication 1 caractérisée en ce que ce sucre ait au moins un membre choisi dans le groupe constitué du mannitol, du

glucose, du saccharose et de l'héparine.

8. Préparation d'antithrombine sèche suivant la revendication 1, caractérisée en ce que cet amino-acide ait au moins un membre choisi dans un groupe constitué de la

glycine et de la lysine.

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9. Préparation d'antithrombine sèche selon la revendication 1, caractérisée en ce que ce sel minéral ait au moins un membre choisi dans le groupe constitué du chlorure de sodium, du chlorure de potassium, du phosphate de sodium, du phosphate de potassium et du bicarbonate de sodium.

10. Préparation d'antithrombine sèche suivant la revendication 1 caractérisée en ce que ce sel d'acide organique ait au moins un membre choisi dans le groupe constitué des sels de l'acide citrique, des sels de l'acide acétique et des

sels de l'acide oxalique.

11. Procédé de fabrication d'une préparation d'anti-

thrombine sèche, caractérisé en ce qu'on lyophylise une solution aqueuse contenant de l'antithrombine-III comme cosntituant principal en présence d'une quantité efficace d'au moins un membre choisi dans le groupe constitué des protéines, des sucres, des amino-acides, des sels minéraux et des sels organiques

comme stabilisant.

12. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé

en ce que le pH de cette solution aqueuse est de 6,2-9,0.

13. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que cette solution aqueuse contenant ce stabilisant et l'antithrombine-III est soumise à un traitement thermique

avant la lyophylisation pour inactiver le virus de l'hépatite.

14. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que la solution aqueuse contenant ce stabilisant et l'antithrombine-III est une solution dont la concentration

est de 0,1-3,0 fois la concentration isotonique.

15. Utilisation de la préparation d'antithrombine sèche suivant la revendication I pour le traitement de la DIC

et de la fibrinopénie.