ES2984285T3 - Cargómeros - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Cargómeros
1. Referencia cruzada con las solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 62/543,470 presentada el 10 de agosto de 2017 y la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 62/582,924, presentada el 7 de noviembre de 2017, la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 62/582,930, presentada el 7 de noviembre de 2017, y la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 62/630,210, presentada el 13 de febrero de 2018.
2. Listado de secuencias
La presente solicitud contiene un listado de secuencias que se presentó electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 3 de agosto de 2018, se llama CRN-020WO_ST25.txt y tiene un tamaño de 10848 bytes.
3. Antecedentes
Los vehículos de administración de fármacos son tecnologías diseñadas para la administración dirigida y/o liberación controlada de agentes terapéuticos. Los vehículos de administración de fármacos también son útiles para retardar la degradación de un agente terapéutico. Se han descrito diversos vehículos de administración de fármacos, que incluyen vehículos de administración liposomales (ver,por ejemplo,Sercombe y otros, 2015 Front Pharmacol. 6:286), vehículos de administración de lipoproteínas de alta densidad (HDL) (ver,por ejemplo,Lacko y otros, 2015 Front Pharmacol.
6:247), y vehículos de administración basados en albúmina (ver,por ejemplo,Larsen y otros, 2016, Mol Cell Ther.
4:3).
Los liposomas son vesículas de fosfolípidos formadas por una o más bicapas lipídicas concéntricas que encierran espacios acuosos discretos. Los liposomas se han usado como vehículos de administración tanto de moléculas hidrófobas, que pueden insertarse en la membrana de la bicapa lipídica, como de moléculas hidrófilas, que pueden encerrarse en el núcleo acuoso de un liposoma. Históricamente, los liposomas se consideraron mínimamente tóxicos, pero más recientemente se descubrió que pueden desencadenar respuestas inmunitarias innatas, que incluye la pseudoalergia relacionada con la activación de C (CARPA) (Szebeni, 2005, Toxicology 216:106-121; Szebeni y Moghimi, 2009, J Liposome Res.19(2):85-90). Muchos síntomas de CARPA son los mismos que se observan en las reacciones alérgicas comunes, mientras que otros son exclusivos de CARPA, por ejemplo, una reacción que surge de la primera exposición a un alérgeno. Se ha reportado que los medicamentos liposomales comercializados causan reacciones de hipersensibilidad (HSR) con síntomas compatibles con CARPA. Se ha reportado que la frecuencia de HSR a fármacos liposomales varía entre el 3 % y el 45 % (Szebeni, 2005, Toxicology 216:106-121).
Las HDL son una de las cuatro clases principales de partículas de lipoproteínas que participan en el sistema de transporte de grasas. Las partículas de lipoproteínas tienen un núcleo hidrófobo compuesto de colesterol (colesterol en forma de colesterol y colesterol esterificado) y triglicéridos. El núcleo está rodeado por una capa superficial que comprende fosfolípidos, colesterol no esterificado y apolipoproteínas. Las partículas de HDL usualmente comprenden al menos 1 molécula, y usualmente de dos a cuatro moléculas, de apolipoproteína A-I (ApoA-I). Las HDL median el transporte inverso de colesterol (RCT), la eliminación de los lípidos de colesterol, en particular de los tejidos extrahepáticos al hígado, donde se almacena, cataboliza, elimina o recicla. Las HDL también desempeñan un papel en el transporte inverso de otros lípidos y moléculas apolares, y en la desintoxicación,es decir,el transporte de lípidos desde células, órganos y tejidos al hígado para su catabolismo y excreción. El uso de las HDL como partícula de administración de fármacos se sugirió hace más de 30 años (Counsell y Pohland, 1982, J Med Chem. 25(10):1115-20). Desde entonces, las HDL se han estudiado preclínicamente como portador de fármacos contra el cáncer (ver,por ejemplo,McConathy y otros, 2008, Anticancer Drugs. 19(2):183-8), fármacos cardiovasculares (ver,por ejemplo,Zhang y otros, 2012 Pharmazie. 67(4):324-30), y ácidos nucleicos (ver,por ejemplo,Yangy otros,2011, 7(5):568-73). Sin embargo, todavía no existe ninguna terapia comercializada que use las HDL como vehículo de administración.
La albúmina es la proteína plasmática más abundante en la sangre humana. La albúmina transporta naturalmente varios tipos diferentes de ligandos, que incluye ligandos endógenos como ácidos grasos y esteroides, así como también ligandos exógenos tales como warfarina, penicilina y diazepam (Larsen y otros, 2016, Mol Cell Ther. 4:3). La capacidad de la albúmina para unirse a los ácidos grasos se ha usado para desarrollar fármacos modificados con ácidos grasos que se unen a la albúmina tras su administración y se disocian con el tiempo. Por ejemplo, Levemir®(Insulina detemir), que se comercializa por Novo Nordisk para el tratamiento de la diabetes, es un análogo de la insulina modificada con ácido mirístico. Novo Nordisk también comercializa Victoza®(liraglutida), que comprende un agonista del péptido 1 similar al glucagón modificado con ácido palmítico, también para el tratamiento de la diabetes. Abraxane®, que se comercializa por Celgene para el tratamiento de diversos cánceres, contiene paclitaxel dentro de una nanopartícula a base de albúmina. La capa exterior de la nanopartícula consiste en albúmina, mientras que el núcleo interior contiene paclitaxel. También se han desarrollado nanopartículas de diagnóstico basadas en albúmina. Nanocoll® y Albures® son partículas de albúmina agregadas que pueden usarse para administrar tecnecio 99m, un isómero nuclear metaestable, para procedimientos de diagnóstico por imágenes. Aunque la albúmina ha demostrado ser útil para administrar algunos agentes terapéuticos y de diagnóstico en la clínica, su capacidad de carga es limitada porque tiene un bolsillo apolar limitado para transportar moléculas de carga. Las nanopartículas basadas en albúmina también pueden tener un gran tamaño debido a la agregación de múltiples moléculas de albúmina. Por ejemplo, Abraxane® tiene un tamaño medio de partícula de aproximadamente 130 nanómetros (www.rxlist.com/abraxanedrug.htm). Otras nanolipopartículas tienen limitaciones en términos de capacidad de carga, biocompatibilidad, seguridad, costo de fabricación o capacidad de direccionamiento (Ver, Wilhelm y otros, 2016, Nature Reviews Materials 1:16014).
También se han descrito en la técnica complejos de administración basados en cargómeros con apolipoproteína, restos de carga y una cantidad de moléculas anfipáticas tales como lípidos (cf. WO 2012/109162 A1).
Por tanto, existe una necesidad de nuevos vehículos de administración de fármacos, por ejemplo vehículos de administración con mayor capacidad de transporte de carga, menor tamaño y/o mejor capacidad de direccionamiento.
4. Resumen
Esta descripción se refiere a complejos de administración que comprenden una apolipoproteína en forma monomérica o multimérica y uno o más restos de carga. Los restos de carga pueden ser anfipáticos o no anfipáticos(por ejemplo,apolar). Los restos de carga anfipáticos pueden facilitar la solubilización de la apolipoproteína y evitar que se agregue. Cuando los restos de carga no son anfipáticos o insuficientes para solubilizar la(s) molécula(s) de apolipoproteína, los complejos de administración también pueden comprender una o más moléculas anfipáticas adicionales para solubilizar la apolipoproteína. Por tanto, la referencia a moléculas anfipáticas en el contexto de los complejos de administración de la descripción abarca moléculas anfipáticas que son restos de carga, moléculas anfipáticas que no son restos de carga, o alguna de sus combinaciones.
En consecuencia, la presente invención se refiere a un cargómero que comprende:
(a) 1-8 moléculas de apolipoproteína;
(b) uno o más restos de carga;
(c) una cantidad de moléculas anfipáticas suficiente para solubilizar las moléculas de apolipoproteína, en donde uno o más de los restos de carga de (b) y una o más de las moléculas anfipáticas de (c) pueden ser la(s) misma(s) molécula(s) en el cargómero;
(d) opcionalmente, uno o más anclajes que acoplan no covalentemente uno o más restos de carga a las moléculas de apolipoproteína;
y (e) opcionalmente, uno o más enlazadores que acoplan covalentemente uno o más restos de carga a una o más moléculas de apolipoproteína, una o más moléculas anfipáticas o uno o más anclajes,
en donde (i) las moléculas anfipáticas, los restos de carga y, si están presentes, los anclajes y/o enlazadores juntos contribuyen a una carga neta de al menos 1 o -1 por molécula de apolipoproteína en el cargómero, y (ii), la relación molar de apolipoproteína a molécula anfipática varía de 8:1 a 1:15.
Otras modalidades de la presente invención son como se definen en las reivindicaciones anexas.
Los complejos de administración de la descripción se denominan en la presente descripción "Cargómeros". Después de la administración a un sujeto, los cargómeros pueden interactuar con, y/o administrar los restos de carga a, un tejido u órgano en el sujeto. Los restos de carga pueden ser las moléculas anfipáticas que se usan para solubilizar la apolipoproteína y/u otras moléculas o agentes biológicamente activos o útiles para el diagnóstico.
Se cree que los cargómeros proporcionan varias ventajas sobre otros vehículos de administración. Una vez que se administra la cargain vivo,la apolipoproteína restante puede integrarse en las vías naturales del metabolismo de las lipoproteínas, evitando de esta manera la acumulación de un portador vacío. Debido a que los cargómeros de la descripción contienen una cantidad relativamente pequeña de moléculas anfipáticas con relación a la apolipoproteína, se cree que los cargómeros de la descripción pueden evitar problemas de toxicidad tales como, pero no se limita a, toxicidad hepática y pseudoalergia relacionada con la activación de C (CARPA), que potencialmente puede resultar de vehículos en base a lípidos, como los liposomas. Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que otra ventaja sobre otros portadores es la flexibilidad de las apolipoproteínas para adaptarse a diferentes tamaños de complejos. A diferencia de la cavidad de la albúmina, que debido a su pequeño tamaño restringe la carga a solo unas pocas moléculas, los cargómeros ofrecen un amplio intervalo de capacidad de carga.
Generalmente, los cargómeros comprenden una o más moléculas de apolipoproteína, cada una de las cuales forma complejos con una o más moléculas anfipáticas. Los cargómeros también incluyen restos de carga que son biológicamente activos y/o útiles para el diagnóstico después de la administración a un sujeto. Los restos de carga pueden ser los mismos que las moléculas anfipáticas (en cuyo caso podría no haber necesidad de moléculas anfipáticas separadas para solubilizar las moléculas de apolipoproteína).
Los restos de carga son moléculas biológicamente activas(por ejemplo,fármacos, productos biológicos (por ejemplo, compuestos de péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, azúcares, lípidos, formas modificadas de los anteriores tales como ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o una combinación de dichos componentes), inmunógenos, adyuvantes, etc.) u otros agentes, por ejemplo agentes que se usan en el diagnóstico. Como se usa en la presente, los términos "molécula" y "agente" también incluyen complejos y conjugados (por ejemplo, conjugados anticuerpo-fármaco). Los términos "biológicamente activo", "útil para el diagnóstico" y similares no se limitan a sustancias con actividad farmacológica o biológica directa, y pueden incluir sustancias que se vuelven activas después de la administración, por ejemplo debido al metabolismo de un profármaco o a la escisión de un enlazador. En consecuencia, los términos "biológicamente activo" y "útil para el diagnóstico" también incluyen sustancias que se vuelven biológicamente activas o útiles para el diagnóstico después de la administración, mediante la creación de metabolitos u otros productos de escisión que ejercen un efecto farmacológico o biológico y/o son detectables en una prueba de diagnóstico.
Pueden usarse apolipoproteínas tanto monoméricas como multiméricas para formar cargómeros, de esta manera permite fabricar vehículos de administración con una capacidad de transporte de carga cada vez mayor a medida que aumenta el número de moléculas de apolipoproteína. Se cree que los cargómeros que comprenden apolipoproteínas multiméricas tienen una capacidad de carga superior a la de la albúmina, que tiene un bolsillo apolar limitado para transportar moléculas de carga. Los cargómeros también contienen una cantidad relativamente baja de moléculas anfipáticas en comparación con las HDL discoidales o esféricas, lo que puede proporcionar costos de producción más bajos y un proceso de fabricación más simple. También se cree que, debido a su tamaño reducido en comparación con los vehículos de administración basados en HDL, los cargómeros pueden penetrar la barrera hematoencefálica y/o ser absorbidos por la linfa, lo que proporciona otra ventaja sobre los vehículos de administración de fármacos más grandes.
Opcionalmente, los cargómeros pueden comprender uno o más restos de anclaje (directa o indirectamente) que acoplan los restos de carga a una molécula apolar, la(s) molécula(s) anfipática(s) y/o la(s) molécula(s) de apolipoproteína. Los restos de anclaje son típicamente anfipáticos. Las moléculas anfipáticas útiles como restos de anclaje pueden tener una carga neta positiva, una carga neta negativa o una carga neta de cero. El uso de un resto de anclaje anfipático cargado puede evitar o reducir la necesidad de moléculas anfipáticas adicionales para solubilizar la(s) molécula(s) de apolipoproteína. Por tanto, en determinadas modalidades, los restos de anclaje y las moléculas anfipáticas en los cargómeros son los mismos.
Opcionalmente, los cargómeros también pueden comprender, además de o en lugar de restos de anclaje, uno o más restos enlazadores. Los restos enlazadores unen covalentemente uno o más restos de carga(por ejemplo,cualquiera de los restos de carga que se describen en la sección 6.1.3 a una o más moléculas de apolipoproteína, una o más moléculas anfipáticas y/o uno o más restos de anclaje.
Las moléculas anfipáticas en los cargómeros cumplen al menos la función de solubilizar la apolipoproteína y/o reducir o minimizar la agregación de apolipoproteína, pero también pueden tener otras funciones en el cargómero. Por ejemplo, como se analiza en la sección 6.1.3 más abajo, las moléculas anfipáticas pueden tener utilidad terapéutica y, por lo tanto, pueden ser los restos de carga que se destinan a administrarse por el cargómero tras su administración a un sujeto. Adicionalmente, como se analiza en la sección 6.1.4 más abajo, pueden usarse moléculas anfipáticas para anclar un resto de carga no anfipático a la apolipoproteína en el cargómero. Por tanto, en algunas modalidades, el resto de carga y la molécula anfipática en un cargómero son los mismos. En otras modalidades, el resto de anclaje y la molécula anfipática en un cargómero son los mismos. Aún en otras modalidades, el resto de carga, el resto de anclaje y la molécula anfipática en un cargómero son los mismos (por ejemplo, donde la molécula anfipática tiene actividad terapéutica y también ancla a otra molécula biológicamente activa a la(s) molécula(s) de apolipoproteína). La unión de las moléculas anfipáticas a la apolipoproteína típicamente no es covalente, pero también se contempla la unión covalente de las moléculas anfipáticas a la apolipoproteína.
Los restos de anclaje y/o enlazadores son particularmente útiles para cargómeros en los que el resto de carga no es una molécula anfipática.
En determinados aspectos, las moléculas anfipáticas, los restos de carga y los anclajes y enlazadores opcionales contribuyen juntos con una carga neta de al menos 1 o -1 por molécula de apolipoproteína en un cargómero. En la sección 6.1.1 se describen apolipoproteínas ilustrativas que pueden usarse en los cargómeros de la descripción. En la sección 6.1.2 se describen moléculas anfipáticas ilustrativas. En la sección 6.1.3 se describen restos de carga ilustrativas. En la sección 6.1.4 se describen anclajes ilustrativos. En la sección 6.1.5 se describen enlazadores ilustrativos.
La descripción proporciona además composiciones que comprenden un cargómero de la descripción, que incluyen composiciones farmacéuticas, composiciones de vacunas y composiciones de diagnóstico. Las composiciones ilustrativas se describen en la sección 6.2.
La descripción proporciona además los cargómeros para el uso en métodos de tratamiento de un sujeto que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un cargómero o una composición farmacéutica de la descripción al sujeto.
La descripción proporciona además los cargómeros para el uso en métodos para diagnosticar a un sujeto que comprenden administrar una cantidad efectiva de un cargómero o composición de diagnóstico de la descripción al sujeto.
La descripción proporciona además métodos para usar los cargómeros o composiciones de diagnóstico de la descripción para seleccionar un tratamiento para un sujeto (o para seleccionar sujetos a incluir en un ensayo clínico) y/o monitorear la eficacia del tratamiento.
La descripción proporciona además los cargómeros para el uso en métodos de inmunización de un sujeto que comprenden administrar una cantidad efectiva de un cargómero o composición de vacuna de la descripción al sujeto.
La descripción proporciona además los cargómeros para el uso en métodos para desensibilizar a un sujeto a un antígeno o inducir tolerancia a un antígeno que comprende administrar una cantidad efectiva de un cargómero o composición de vacuna de la descripción al sujeto.
En la sección 6.3 se describen métodos ilustrativos que proporcionan los cargómeros para el uso en: tratara un sujeto, métodos para diagnosticar a un sujeto, métodos para inmunizar a un sujeto y métodos para desensibilizar a un sujeto a un antígeno o inducir tolerancia a un antígeno.
5. Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra esquemáticamente un proceso mediante el cual el inventor considera cargómeros que comprenden 8 moléculas de apolipoproteína, moléculas anfipáticas cargadas negativamente y moléculas biológicamente activas como restos de carga(por ejemplo,como se describió en la sección 6.1.3) que no están unidos covalentemente a las moléculas anfipáticas. Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que los cargómeros que tienen 1 molécula de apolipoproteína se forman primero a partir de monómeros de apolipoproteína, moléculas anfipáticas y restos de carga. Los cargómeros con 2 moléculas de apolipoproteína(es decir,cargómeros con dímeros de apolipoproteína) se forman luego mediante dimerización de los cargómeros que tienen 1 molécula de apolipoproteína y los cargómeros que tienen 4 moléculas de apolipoproteína (es decir, cargómeros con tetrámeros de apolipoproteína) se forman luego mediante dimerización de los cargómeros con 2 moléculas de apolipoproteína. Finalmente, los cargómeros con 8 moléculas de lipoproteínas(es decir,los cargómeros con octámeros de apolipoproteína) se forman mediante dimerización de los cargómeros que tienen 4 moléculas de apolipoproteína. Aunque las flechas que se muestran en la figura 1 están representadas en una dirección, se cree que la formación de cargómeros da como resultado la formación de diferentes especies que están presentes en equilibrio. El equilibrio puede verse influenciado por condiciones tales como el pH, la concentración, la fuerza iónica y la temperatura,por ejemplo,como se describió en la sección 6.1. Debe entenderse que los números de las moléculas componentes que se muestran en la figura 1 son meramente ilustrativos y que se contemplan cargómeros que tienen diferentes relaciones de moléculas componentes, y que los cargómeros pueden formarse directamente a partir de una apolipoproteína en una solución, en una suspensión, en un precipitado o un agregado.
La figura 2 muestra esquemáticamente un proceso mediante el cual el inventor cree que se forman cargómeros que comprenden 8 moléculas de apolipoproteína y moléculas cargadas biológicamente activas que funcionan como moléculas anfipáticas y restos de carga. Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que los cargómeros que tienen 1 molécula de apolipoproteína se forman primero a partir de monómeros de apolipoproteína y las moléculas biológicamente activas cargadas. Los cargómeros con 2 moléculas de apolipoproteína(es decir,cargómeros con dímeros de apolipoproteína) se forman luego mediante dimerización de los cargómeros que tienen 1 molécula de apolipoproteína y los cargómeros que tienen 4 moléculas de apolipoproteína(es decir,cargómeros con tetrámeros de apolipoproteína) se forman luego mediante dimerización de los cargómeros con 2 moléculas de apolipoproteína. Finalmente, los cargómeros con 8 moléculas de lipoproteínas(es decir,los cargómeros con octámeros de apolipoproteína) se forman mediante dimerización de los cargómeros que tienen 4 moléculas de apolipoproteína. Aunque las flechas que se muestran en la figura 2 están representadas en una dirección, se cree que la formación de cargómeros da como resultado la formación de diferentes especies que están presentes en equilibrio. El equilibrio puede verse influenciado por condiciones tales como el pH, la concentración, la fuerza iónica y la temperatura,por ejemplo,como se describió en la sección 6.1. Debe entenderse que los números de las moléculas componentes que se muestran en la figura 2 son meramente ilustrativos y que se contemplan cargómeros que tienen diferentes relaciones de moléculas componentes.
La figura 3 muestra esquemáticamente un proceso mediante el cual el inventor cree que se forman cargómeros que comprenden 8 moléculas de apolipoproteína y moléculas anfipáticas que tienen restos de carga acoplados covalentemente a la misma a través de un enlazador. Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que los cargómeros que tienen 1 molécula de apolipoproteína se forman primero a partir de monómeros de apolipoproteína y las moléculas anfipáticas que tienen restos de carga unidos covalentemente a la misma. Los cargómeros con 2 moléculas de apolipoproteína(es decir,cargómeros con dímeros de apolipoproteína) se forman luego mediante dimerización de los cargómeros que tienen 1 molécula de apolipoproteína y los cargómeros que tienen 4 moléculas de apolipoproteína(es decir,cargómeros con tetrámeros de apolipoproteína) se forman luego mediante dimerización de los cargómeros con 2 moléculas de apolipoproteína. Finalmente, los cargómeros con 8 moléculas de lipoproteínas(es decir,los cargómeros con octámeros de apolipoproteína) se forman mediante dimerización de los cargómeros que tienen 4 moléculas de apolipoproteína. Aunque las flechas que se muestran en la figura 3 están representadas en una dirección, se cree que la formación de cargómeros da como resultado la formación de diferentes especies que están presentes en equilibrio. El equilibrio puede verse influenciado por condiciones tales como el pH, la concentración, la fuerza iónica y la temperatura,por ejemplo,como se describió en la sección 6.1. Debe entenderse que los números de las moléculas componentes que se muestran en la figura 3 son meramente ilustrativos y que se contemplan cargómeros que tienen diferentes relaciones de moléculas componentes.
La figura 4 muestra esquemáticamente un proceso mediante el cual el inventor cree que se forman cargómeros que comprenden 8 moléculas de apolipoproteína y moléculas de anclaje que tienen restos de carga directamente acoplados covalentemente a la misma. Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que los cargómeros que tienen 1 molécula de apolipoproteína se forman primero a partir de monómeros de apolipoproteína y las moléculas anfipáticas que tienen restos de carga unidos covalentemente a la misma. Los cargómeros con 2 moléculas de apolipoproteína(es decir,cargómeros con dímeros de apolipoproteína) se forman luego mediante dimerización de los cargómeros que tienen 1 molécula de apolipoproteína y los cargómeros que tienen 4 moléculas de apolipoproteína(es decir,cargómeros con tetrámeros de apolipoproteína) se forman luego mediante dimerización de los cargómeros con 2 moléculas de apolipoproteína. Finalmente, los cargómeros con 8 moléculas de lipoproteínas(es decir, los cargómeros con octámeros de apolipoproteína) se forman mediante dimerización de los cargómeros que tienen 4 moléculas de apolipoproteína. Aunque las flechas que se muestran en la figura 4 están representadas en una dirección, se cree que la formación de cargómeros da como resultado la formación de diferentes especies que están presentes en equilibrio. El equilibrio puede verse influenciado por condiciones tales como el pH, la concentración, la fuerza iónica y la temperatura,por ejemplo,como se describió en la sección 6.1. Debe entenderse que los números de las moléculas componentes que se muestran en la figura 4 son meramente ilustrativos y que se contemplan cargómeros que tienen diferentes relaciones de moléculas componentes.
La figura 5 muestra el esquema del estudio que se describe en el ejemplo 2.
Las figuras 6A-C muestran los volúmenes tumorales de B16F10 en ratones C57BL/6 desde la inducción del tumor hasta la terminación del estudio para los 8 grupos de tratamiento que se describen en el ejemplo 2. La figura 6A: excluye datos de animales que no sobrevivieron hasta la terminación del estudio; la figura 6B: incluye la última medición de los animales que no sobrevivieron hasta la terminación del estudio; la figura 6C: incluye datos para cada grupo hasta la muerte del primer animal del grupo.
Las figuras 7A-7B muestran los pesos corporales (figura 7A) y los pesos corporales corregidos al inicio (figura 7B) para los animales en los 8 grupos de tratamiento que se describen en el ejemplo 2.
Las figuras 8A-8J muestran las curvas de crecimiento tumoral individuales con fracción de regresión tumoral completa (CR) para los 8 grupos de tratamiento que se describe en el ejemplo 2 (figura 8A: vehículo; figura 8B ApoA-I; figura 8C: TAs+Col CpG; figura 8D: cargómeros 1:2; figura 8E: cargómeros 1:4; figura 8F: cargómeros 1:2 inmunoterapia; figura 8G cargómeros 1:4 inmunoterapia; figura 8H: inmunoterapia; figura 8I: cargómeros 1:2 inmunoterapia; figura 8J: cargómeros 1:4 inmunoterapia). Las curvas de crecimiento para los grupos 6 y 7 se muestran ampliadas en el eje Y en la figura 8I y figura 8J, respectivamente.
La figura 9 muestra la proporción de supervivencia para cada grupo de tratamiento del ejemplo 2 a lo largo del tiempo.
Las figuras 10A-10E muestran los volúmenes tumorales para los grupos de tratamiento del ejemplo 3 (figura 10A: control; figura 10B: cargómeros 1:2; figura 10C: cargómeros 1:2 inmunoterapia; figura 10D: cargómeros 1:4; figura 10E: cargómeros 1:4 inmunoterapia).
Las figuras 11A-11B muestran los pesos corporales (figura 11A) y los pesos corporales corregidos al inicio (figura 11B) para los animales del ejemplo 4 durante el transcurso del estudio.
La figura 12 muestra los volúmenes tumorales para los diferentes grupos de tratamiento del ejemplo 4.
La figura 13 muestra los pesos de los tumores para los animales de cada grupo del ejemplo 4.
La figura 14 muestra el volumen tumoral para los animales de cada grupo del ejemplo 5.
Las figuras 15A-I muestran los volúmenes tumorales para los animales de los grupos de tratamiento del ejemplo 5 (figura 15A: vehículo; figura 15B: ApoA-I; figura 15c : TAs CpG; figura 15D: TAs CpG inmunoterapia; figura 15E: inmunoterapia; figura 15F: cargómeros 1:2; figura 15G: cargómeros 1:4; figura 15H: cargómeros 1:2 inmunoterapia; figura 15I: cargómeros 1:4 inmunoterapia).
Las figuras 16A-D muestran los cromatogramas de exclusión por tamaño para los cargómeros que contienen oligonucleótido antisentido anti-STAT3 y para los componentes del mismo (figura 16A: oligonucleótido STAT3 (el pico más grande muestra una DO de 260 nm, el pico más pequeño muestra una DO de 280 nm); figura 16B: ApoA-I (el pico más grande muestra una DO de 280 nm, el pico más pequeño muestra una DO de 260 nm); figura 16C: oligonucleótido ApoA-I:STAT3 en una relación molar 10:1 (el pico más grande muestra una DO de 280 nm, el pico más pequeño muestra una DO de 260 nm); figura 16D: superposición de cargómeros de oligonucleótido STAT3 y oligonucleótido ApoA-I:STAT3).
Las figuras 17A-D muestran los cromatogramas de exclusión por tamaño para los cargómeros que contienen ARNip anti-KRAS y para los componentes del mismo (figura 17A: ARNip de KRAS; figura 17B: premezcla de cargómeros de ARNip de ApoA-I:KRAS; figura 17C: preparación final de cargómeros de ARNip de ApoA-I:KRAS; figura 17D: superposición de la premezcla y preparaciones finales de ARNip de ApoA-I:KRas).
Las figuras 18A-D muestran los cromatogramas de exclusión por tamaño para los cargómeros que contienen ARNip anti-EGFR y para los componentes del mismo (figura 18A: ARNip de EGFR; figura 18B: premezcla de cargómeros de ARNip de ApoA-I:ARNip de EGFR; figura 18C: preparación final de cargómeros de ApoA-I:ARNip de EGFR; figura 18D: superposición de la premezcla y preparaciones finales de ApoA-I:ARNip de EGFR).
Las figuras 19A-D muestran los cromatogramas de exclusión por tamaño para los cargómeros que contienen oligonucleótidos CpG y para los componentes de los mismos (figura 19A: Col-CpG; figura 19B: ApoA-I; figura 19C: cargómeros de ApoA-I:Col-CpG; figura 19D: superposición de cargómeros de ApoA-I:Col-CpG y Col-CpG).
Las figuras 20A-D muestran los resultados de un ensayo de transferencia western para medir la eficacia silenciadora de diversos cargómeros ilustrativos (La figura 20A y la figura 20B muestran las membranas de transferencia; la figura 20C y la figura 20D muestran intensidades relativas de las bandas).
Las figuras 21A-D muestran los cromatogramas de exclusión por tamaño para ApoA-I (figura 21A), M27 (figura 21B), TRP2 (figura 21C) y M30 (figura 21D).
Las figuras 22A-D muestran los cromatogramas de exclusión por tamaño para el péptido M27 (figura 22A) y los cargómeros que contienen el péptido M27 (figuras 22B-22D).
Las figuras 23A-D muestran los cromatogramas de exclusión por tamaño para el péptido M30 (figura 23A) y los cargómeros que contienen el péptido M30 (figs. 23B: -23D).
Las figuras 24A-F muestran los cromatogramas de exclusión por tamaño para el péptido TRP2 (figura 24A), ApoA-I (figura 24B) y los cargómeros que contienen el péptido TRP2 (figuras 24C-24F).
Las figuras 25A-D muestran las micrografías electrónicas de ApoA-I (figura 25A), CER-001 (figura 25B), cargómeros de ApoA-I:M27 (1:2) ilustrativos (figura 25C) y cargómeros ApoA-I:M27 (1:2) ilustrativos y CER-001 (figura 25D), que muestra que los cargómeros ilustrativos son pequeños y no discoidales.
Las figuras 26A-G muestran los cromatogramas para cargómeros que contienen col-CpG, componentes de los mismos, CER-001 y CER-001 con col-CpG. Figura 26A: ApoA-I (cromatograma superior 280 nm; cromatograma inferior 260 nm); figura 26B: CER-001 (pico principal cromatograma superior 280 nm; cromatograma inferior 260 nm); figura 26C: Col-CpG (cromatograma superior 260 nm; cromatograma inferior 280 nm); figura 26D: Cargómeros ApoA-I:SM:Col-CpG (relación molar 1:2:0,1) (cromatograma superior 280 nm; cromatograma inferior 260 nm); figura 26E: Cargómeros ApoA-I:Col-CpG (relación molar 1:0,1) (cromatograma superior 280 nm; traza inferior 260 nm); figura 26F: SM:Col-CpG (relación molar 2:0,1) (cromatograma superior 260 nm; cromatograma inferior 280 nm); figura 26G: CER-001:Col-CpG (relación molar 1:0,5) (pico a los 22,37 minutos cromatograma superior 280 nm; cromatograma inferior 260 nm) (pico a los 28,42 minutos cromatograma superior 260 nm; cromatograma inferior 280 nm).
6. Descripción detallada
6.1. Cargómeros
Los cargómeros de la descripción comprenden de 1-8 moléculas de apolipoproteína(por ejemplo,1, 2, 4 u 8 moléculas de lipoproteína) que forman complejos con un número suficiente de moléculas anfipáticas para solubilizar las moléculas de apolipoproteína. Preferentemente, los cargómeros de la descripción no son discoidales, por ejemplo, según se determinó mediante el uso de espectroscopía de RMN, microscopía de fuerza atómica, microscopía electrónica u otra técnica adecuada conocida en la técnica.
Las moléculas de apolipoproteína forman complejos con las moléculas anfipáticas en una relación molar de apolipoproteína:molécula anfipática que varía de 8:1 a 1:15(porejemplo, de 8:1 a 1:15, de 7:1 a 1:15, de 6:1 a 1:15, de 5:1 a 1:15 de 4:1 a 1:15 de 3:1 a 1:15 de 2:1 a 1:15 de 1:1 a 1:15 de 8:1 a 1:14 de 7:1 a 1:14 de 6:1 a 1:14 de
En algunas modalidades, las moléculas de apolipoproteína forman complejos con las moléculas anfipáticas en una relación molar de apolipoproteína:molécula anfipática que varía de 6:1 a 1:6(por ejemplo,de 5:1 a 1:6, de 4:1 a 1:6, de 3:1 a 1:6, de 2:1 a 1:6, de 5:1 a 1:5, de 4:1 a 1:5, de 3:1 a 1:5, de 2:1 a 1:5, de 5:1 a 1:4, de 4:1 a 1:4, de 3:1 a 1:4, de 2:1 a 1:4, de 5:1 a 1:3, de 4:1 a 1:3, de 3:1 a 1:3, de 2:1 a 1:3, de 5:1 a 1:2, de 4:1 a 1:2, de 3:1 a 1:2, de 2:1 a 1:2, de 5:1 a 1:1, de 4:1 a 1:1, de 3:1 a 1:1, de 2:1 a 1:1, de 1:1 a 1:6, de 1:1 a 1:5, de 1:1 a 1:4, de 1:1 a 1:3, de 1:1 a 1:2, de 1:2 a 1:6, de 1:2 a 1:5, de 1:2 a 1:4, de 1:2 a 1:3, de 1:3 a 1:6, de 1:3 a 1:5, de 1:3 a 1:4, de 1:4 a 1:6, de 1:4 a 1:5, de 1:5 a 1:6, de 1,5:1 a 1:2, de 5:4 a 4:5, de 5:3 a 3:5, de 5:2 a 2:5, o de 3:2 a 2:3).
Los cargómeros incluyen uno o más restos de carga, que opcionalmente están acoplados a los cargómeros mediante un anclaje y/o un enlazador. En algunas modalidades, al menos uno de los restos de carga, la mayoría de los restos de carga o todos los restos de carga en un cargómero están acoplados al cargómero mediante anclajes. En algunas modalidades, al menos uno de los restos de carga en un cargómero está acoplado al cargómero mediante anclajes.
En algunas modalidades, la mayoría de los restos de carga en un cargómero están acoplados al cargómero mediante anclajes. En algunas modalidades, todos los restos de carga en un cargómero están acoplados al cargómero mediante anclajes. Cada anclaje en un cargómero puede ser el mismo o, alternativamente, pueden incluirse diferentes tipos de anclajes en un solo cargómero(por ejemplo,un tipo de resto de carga puede acoplarse al cargómero mediante un tipo de anclaje y un segundo tipo de resto de carga puede acoplarse al cargómero mediante un segundo tipo de anclaje).
Un "anclaje" como se usa en la presente se refiere a un resto anfipático o apolar que está unido covalentemente a un resto carga y que está acoplado de forma no covalente a la apolipoproteína en el cargómero, ya sea directamente o, donde el cargómero incluye una molécula anfipática distinta de la resto de anclaje, a través de otra molécula anfipática en el cargómero. El uso de un resto de anclaje anfipático puede, en determinadas modalidades, contribuir a la relación molar de apolipoproteína:molécula anfipática. En otras modalidades, la molécula anfipática de anclaje no se usa en el cálculo de la relación molar de apolipoproteína:molécula anfipática.
Un "enlazador", como se usa en la presente, se refiere a un resto que une covalentemente un resto de carga a una molécula de apolipoproteína, una molécula anfipática o un anclaje.
La relación molar de moléculas de apolipoproteína a moléculas anfipáticas puede ser, pero no necesariamente tiene que ser, números enteros o reflejar una relación uno a uno entre la apolipoproteína y las moléculas anfipáticas. A manera de ejemplo y sin limitación, un cargómero puede tener una relación molar de apolipoproteína a molécula anfipática de 2:5, 8:7, 3:2 o 4:7.
Las moléculas anfipáticas, restos de carga, anclajes y enlazadores, si están presentes, pueden contribuir juntos con una carga neta de al menos 1 o -1 por apolipoproteína en el cargómero(por ejemplo,+1, 2, 3, -1, -2 o -3). En algunas modalidades, por ejemplo, cuando un resto carga comprende un oligonucleótido tal como un ARNip, las moléculas anfipáticas, los restos carga, los anclajes y los enlazadores, si están presentes, pueden contribuir juntos con una carga neta de más de 3(por ejemplo,5 a 30, 5 a 20, 5 a 10, 10 a 30, 10 a 20 o 20 a 30). En algunas modalidades, la carga neta es una carga negativa. En otras modalidades, la carga neta es una carga positiva. Amenos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera, la carga se mide a pH fisiológico.
Los cargómeros de la descripción pueden prepararse, por ejemplo, mediante la combinación y la mezcla de una composición que comprende moléculas de apolipoproteína(por ejemplo,una composición que comprende agregados multiméricos de apolipoproteína) con una solución que comprende las moléculas anfipáticas(porejemplo,una solución que comprende las moléculas anfipáticas solas o una solución que comprende las moléculas anfipáticas y restos de carga).
Por ejemplo, los cargómeros pueden prepararse mediante la mezcla de dos soluciones orgánicas, una que contiene una apolipoproteína y la otra que contiene una molécula anfipática cargada, y luego se retira el solvente mediante métodos tales como evaporación, secado por congelación (liofilización), secado por pulverización, calentamiento o cualquier otro método que se conoce en la técnica. Los cargómeros también pueden prepararse mediante la mezcla de dos soluciones acuosas, una que contiene una apolipoproteína y la otra que contiene una molécula anfipática cargada, hasta obtener una solución homogénea. Los cargómeros también pueden prepararse mediante la hidratación de una apolipoproteína con una solución acuosa de moléculas anfipáticas cargadas y luego se mezcla hasta obtener una solución homogénea. Las soluciones que se usan para fabricar cargómeros,por ejemplo,soluciones acuosas, pueden estar a temperatura ambiente, a una temperatura más alta que la temperatura ambiente, o a una temperatura más baja que la temperatura ambiente durante la formación de los cargómeros. Alternativamente, las soluciones pueden someterse a un ciclo térmico entre una temperatura más alta y más baja,por ejemplo,como se describió en el ejemplo 1 o el documento WO 2012/109162, preferentemente hasta que se obtengan cargómeros de al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % de homogeneidad. Si la solución que comprende las moléculas anfipáticas no contiene los restos de carga, puede combinarse y mezclarse una solución que comprende los restos de carga con la solución que contiene la apolipoproteína y las moléculas anfipáticas(por ejemplo,antes del ciclo térmico).
Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que el proceso de producción de cargómeros da como resultado la formación de múltiples especies de cargómeros que tienen diferentes números de moléculas de apolipoproteína en equilibrio. Se sabe en la técnica que la autoasociación de ApoA-I libre de lípidos está influenciada por condiciones tales como pH, concentración, fuerza iónica y temperatura (ver,por ejemplo,Gianazza y otros, 1997, Biochemistry, 36:7898-7905; Jayaraman y otros, Journal of Biological Chemistry, 286(41):35610-35623; Schonfeld y otros, 2016 J. Phys. Chem. B, 120:1228-1235) y se cree que el equilibrio entre diferentes especies de cargómeros está de manera similar influenciado por el pH, la concentración, la fuerza iónica y la temperatura. Por ejemplo, el pH ácido promueve la formación de ApoA-I monomérica, mientras que el pH alcalino promueve la formación de formas multiméricas, las concentraciones bajas de ApoA-I favorecen la ApoA-I monomérica, mientras que las concentraciones altas favorecen las formas multiméricas y las formas monoméricas de ApoA-I se favorecen a medida que aumenta la temperatura o disminuye desde el máximo de autoasociación de ApoA-I de 22 °C. Una vez que se forman los cargómeros, se cree que son relativamente estables y pueden no ser tan susceptibles a la disociación en comparación con la apolipoproteína libre de lípidos.
En algunas modalidades, la relación de moléculas de apolipoproteína a moléculas anfipáticas es aproximadamente 1:1. En otras modalidades, la relación de moléculas de apolipoproteína a moléculas anfipáticas es aproximadamente 1:2. Aún en otras modalidades, la relación de moléculas de apolipoproteína a moléculas anfipáticas es aproximadamente 1:3. Aún en otras modalidades, la relación de moléculas de apolipoproteína a moléculas anfipáticas es aproximadamente 1:4. Aún en otras modalidades, la relación de moléculas de apolipoproteína a moléculas anfipáticas es aproximadamente 1:5. Aún en otras modalidades, la relación de moléculas de apolipoproteína a moléculas anfipáticas es aproximadamente 1:6.
En algunas modalidades, un cargómero comprende 1 molécula de apolipoproteína.
En otras modalidades, un cargómero comprende 2 moléculas de apolipoproteína. Los cargómeros que comprenden 2 moléculas de apolipoproteína tienen preferentemente un radio de Stokes de 5 nm o menos (por ejemplo, 4 nm o menos o 3 nm o menos). Se cree que el tamaño de un cargómero depende generalmente del tamaño del resto de carga, de manera que se espera que los cargómeros que comprenden un resto de carga relativamente grande tengan generalmente un radio de Stokes mayor que un cargómero que tiene un resto de carga más pequeño. En algunas modalidades, un cargómero puede comprender 2 moléculas de apolipoproteína y 1, 2 o 3 moléculas anfipáticas cargadas negativamente(por ejemplo,moléculas de fosfolípidos cargadas negativamente) por molécula de apolipoproteína.
En otras modalidades, un cargómero comprende 4 moléculas de apolipoproteína. Los cargómeros que comprenden 4 moléculas de apolipoproteína tienen preferentemente un radio de Stokes de 5 nm o menos(por ejemplo,4 nm o menos o 3 nm o menos). En algunas modalidades, un cargómero puede comprender 4 moléculas de apolipoproteína y 1, 2 o 3 moléculas anfipáticas cargadas negativamente(por ejemplo,moléculas de fosfolípidos cargadas negativamente) por molécula de apolipoproteína.
En otras modalidades, un cargómero comprende 8 moléculas de apolipoproteína. Los cargómeros que comprenden 8 moléculas de apolipoproteína tienen preferentemente un radio de Stokes de 5 nm o menos(por ejemplo,4 nm o menos o 3 nm o menos). En algunas modalidades, un cargómero puede comprender 8 moléculas de apolipoproteína y 1, 2 o 3 moléculas anfipáticas cargadas negativamente(por ejemplo,moléculas de fosfolípidos cargadas negativamente) por molécula de apolipoproteína. En determinadas modalidades, los cargómeros de la descripción no contienen colesterol y/o un derivado de colesterol(por ejemplo,un éster de colesterol).
Los cargómeros de la descripción son preferentemente solubles en un fluido biológico, por ejemplo uno o más de linfa, líquido cefalorraquídeo, humor vítreo, humor acuoso y sangre o una fracción de la sangre(por ejemplo,suero o plasma).
Los cargómeros pueden incluir una funcionalidad de direccionamiento, por ejemplo para dirigir los cargómeros a un tipo de célula o tejido particular, o a un agente infeccioso. En algunas modalidades, el cargómero incluye un resto de direccionamiento unido a una molécula de apolipoproteína o una molécula anfipática. En algunas modalidades, uno o más restos de carga que se incorporan al cargómero tienen una capacidad de direccionamiento.
6.1.1. Apolipoproteínas
Las apolipoproteínas adecuadas que pueden incluirse en los cargómeros de la descripción incluyen las apolipoproteínas ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoA-V, ApoB, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD, ApoE, ApoJ, ApoH y cualquier combinación de dos o más de las anteriores. También pueden usarse las formas polimórficas, isoformas, variantes y mutantes, así como también las formas truncadas de las apolipoproteínas anteriores, siendo las más comunes la apolipoproteína A-IMilano (A<po>A-I<m>), apolipoproteína A-IParís (ApoA-IP), y la apolipoproteína A-IZaragoza (ApoA-I<z>). También se conocen mutantes de apolipoproteínas que contienen residuos de cisteína y también pueden usarse (ver,por ejemplo,publicación de los Estados Unidos núm. 2003/0181372). Las apolipoproteínas pueden modificarse en su secuencia primaria para hacerlas menos susceptibles a las oxidaciones, por ejemplo, como se describió en las publicaciones de Estados Unidos núms. 2008/0234192 y 2013/0137628, y las patentes de Estados Unidos núms.
8,143,224 y 8,541,236. Las apolipoproteínas pueden incluir residuos correspondientes a elementos que facilitan su aislamiento, tal como etiquetas de His, u otros elementos que se diseñan para otros fines. Preferentemente, la apolipoproteína en el cargómero es soluble en un fluido biológico(por ejemplo,linfa, líquido cefalorraquídeo, humor vítreo, humor acuoso, sangre o una fracción de la sangre(por ejemplo,suero o plasma).
En algunas modalidades, puede incluirse un péptido adicional en un cargómero además de una apolipoproteína. Dichos péptidos adicionales incluyen fragmentos de apolipoproteínas, agonistas peptídicos de apolipoproteínas, análogos peptídicos de apolipoproteínas y péptidos anfipáticos. Estos péptidos pueden prepararse con aminoácidos naturales, D-aminoácidos o pueden contener aminoácidos naturales y/o no naturales. Los agonistas peptídicos ilustrativos se describen en las patentes de Estados Unidos núms. 6,004,925, 6,037,323, 6,046,166, y 6,265,377.
Las apolipoproteínas pueden purificarse a partir de fuentes animales (y en particular de fuentes humanas) o producirse de forma recombinante como se conoce bien en la técnica, ver,por ejemplo,Chung y otros, 1980, J. Lipid Res.
21(3):284-91; Cheung y otros, 1987, J. Lipid Res. 28(8):913-29. Ver también las patentes de Estados Unidos núms.
5,059,528, 5,128,318, 6,617,134; las publicaciones de los Estados Unidos núms. 2002/0156007, 2004/0067873, 2004/0077541, y 2004/0266660; y las publicaciones PCT núms. WO 2008/104890 y WO 2007/023476. También son posibles otros métodos de purificación, por ejemplo como se describió en la publicación PCT núm. WO 2012/109162.
La apolipoproteína puede estar en forma de preproforma, proforma o madura. Por ejemplo, un cargómero puede comprender ApoA-I(por ejemplo,ApoA-I humana) en el que la ApoA-I es preproApoA-I, proApoA-I o ApoA-I madura. En algunas modalidades, el cargómero comprende ApoA-I que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2. En otras modalidades, el cargómero comprende ApoA-I que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2. En otras modalidades, el cargómero comprende ApoA-I que tiene al menos 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2. En otras modalidades, el cargómero comprende ApoA-I que tiene al menos 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2. En otras modalidades, el cargómero comprende ApoA-I que tiene 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2.
La(s) molécula(s) de apolipoproteína pueden comprender una apolipoproteína quimérica que comprende una apolipoproteína y uno o más restos funcionales unidos, tales como, por ejemplo, uno o más restos de direccionamiento, un resto que tiene una actividad biológica deseada, una etiqueta de afinidad para ayudar con la purificación, y/o una molécula reportera para estudios de caracterización o localización. Un resto unido con actividad biológica puede tener una actividad que es capaz de aumentar y/o crear sinergia con la actividad biológica de un resto de carga que se incorpora en un cargómero. Por ejemplo, un resto con actividad biológica puede tener actividad antimicrobiana (por ejemplo, antifúngica, antibacteriana, antiprotozoaria, bacteriostática, fungistática o antiviral). En una modalidad, un resto funcional unido de una apolipoproteína quimérica no está en contacto con superficies hidrófobas del cargómero. En otra modalidad, un resto funcional unido está en contacto con superficies hidrófobas del cargómero. En algunas modalidades, un resto funcional de una apolipoproteína quimérica puede ser intrínseco a una proteína natural. En algunas modalidades, una apolipoproteína quimérica incluye un ligando o secuencia reconocida por o capaz de interactuar con un receptor de la superficie celular u otro resto de la superficie celular.
En una modalidad, una apolipoproteína quimérica incluye un resto de direccionamiento que no es intrínseco a la apolipoproteína nativa, tal como, por ejemplo, el péptido del factor de apareamiento a de S.cerevisiae,ácido fólico, transferrina o lactoferrina. En otra modalidad, una apolipoproteína quimérica incluye un resto con una actividad biológica deseada que aumenta y/o tiene sinergia con la actividad de un resto carga que se incorpora en el cargómero. En una modalidad, una apolipoproteína quimérica puede incluir un resto funcional intrínseco a una apolipoproteína. Un ejemplo de un resto funcional intrínseco de apolipoproteína es el resto de direccionamiento intrínseco formado aproximadamente por los aminoácidos 130-150 de la ApoE humana, que comprende la región de unión al receptor que se reconoce por los miembros de la familia de receptores de lipoproteínas de baja densidad. Otros ejemplos de restos funcionales intrínsecos de apolipoproteína incluyen la región de ApoB-100 que interactúa con el receptor de lipoproteínas de baja densidad y la región de ApoA-I que interactúa con el receptor depurador de tipo B 1. En otras modalidades, puede añadirse un resto funcional de forma sintética o recombinante para producir una apolipoproteína quimérica. Otro ejemplo es una apolipoproteína con la secuencia prepro o pro de otra preproapolipoproteína(porejemplo,la secuencia prepro de preproapoA-II sustituida por la secuencia prepro de preproapoA-I). Otro ejemplo es una apolipoproteína en la que algunos de los segmentos de la secuencia anfipática fueron sustituidos por otros segmentos de la secuencia anfipática de otra apolipoproteína.
Como se usa en la presente, "quimérico" se refiere a dos o más moléculas que son capaces de existir por separado y están unidas para formar una única molécula que tiene la funcionalidad deseada de todas sus moléculas constituyentes. Las moléculas constituyentes de una molécula quimérica pueden unirse sintéticamente mediante conjugación química o, cuando las moléculas constituyentes son todas polipéptidos o análogos de los mismos, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos pueden fusionarse de forma recombinante de manera que se exprese un único polipéptido continuo. Dicha molécula quimérica se denomina proteína de fusión. Una "proteína de fusión" es una molécula quimérica en la que las moléculas constituyentes son todas polipéptidos y están unidas (fusionadas) entre sí de manera que la molécula quimérica forma una cadena única continua. Los diversos constituyentes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden acoplarse a través de uno o más enlazadores. Uno o más segmentos de diversos constituyentes pueden, por ejemplo, insertarse en la secuencia de una apolipoproteína o, como otro ejemplo, pueden añadirse como un extremo N o extremo C a la secuencia de una apolipoproteína. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender una cadena ligera de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una cadena pesada de anticuerpo o un anticuerpo de dominio único.
En algunas modalidades, se prepara una apolipoproteína quimérica mediante conjugación química de la apolipoproteína y el resto funcional que se va a unir. Los expertos en la técnica se conocen bien los medios para conjugar químicamente moléculas. Dichos medios variarán de acuerdo con la estructura del resto a unir, pero serán fácilmente determinables por los expertos en la técnica. Los polipéptidos típicamente contienen una variedad de grupos funcionales,por ejemplo,grupos ácido carboxílico (--COOH), amino libre (--NH2) o sulfhidrilo (--SH), que están disponibles para la reacción con un grupo funcional adecuado en el resto funcional o en un enlazador para unir el resto al mismo. Un resto funcional puede estar unido al extremo N, al extremo C o a un grupo funcional en un residuo interior(es decir,un residuo en una posición intermedia entre los extremos N y C de una molécula de apolipoproteína. Alternativamente, la apolipoproteína y/o el resto a etiquetar puede derivatizarse para exponer o unir grupos funcionales reactivos adicionales.
En algunas modalidades, las proteínas de fusión que incluyen un resto funcional polipeptídico se sintetizan mediante el uso de sistemas de expresión recombinantes. Típicamente, esto implica la creación de un ácido nucleico(por ejemplo,ADN) secuencia que codifica la apolipoproteína y el resto funcional de manera que los dos polipéptidos estarán en marco cuando se expresen, colocando el ADN bajo el control de un promotor, mediante la expresión de la proteína en una célula huésped y el aislamiento de la proteína expresada.
Puede incorporarse un ácido nucleico que codifica una apolipoproteína quimérica en un vector de expresión recombinante en una forma adecuada para la expresión en una célula huésped. Como se usa en la presente, un "vector de expresión" es un ácido nucleico que, cuando se introduce en una célula huésped apropiada, puede transcribirse y traducirse en un polipéptido. El vector también puede incluir secuencias reguladoras tales como promotores, potenciadores u otros elementos de control de la expresión(por ejemplo,señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se conocen por los expertos en la técnica (ver,por ejemplo,Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Meth. Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, Calif.; Bergery Kimmel, Guideto Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Sambrook y otros, 1989, Molecular Cloning--A Laboratory Manual (2da ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, etc.).
En algunas modalidades, se modificó una apolipoproteína de manera que cuando la apolipoproteína se incorpora a un cargómero, la modificación aumentará la estabilidad del cargómero, conferirá capacidad de direccionamiento o aumentará la capacidad. En una modalidad, la modificación incluye la introducción de residuos de cisteína en moléculas de apolipoproteína para permitir la formación de enlaces disulfuro intramoleculares o intermoleculares, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio. En otra modalidad, se usa un agente reticulante químico para formar enlaces intermoleculares entre moléculas de apolipoproteína para mejorar la estabilidad de los cargómeros. La reticulación intermolecular previene o reduce la disociación de moléculas de apolipoproteína de los cargómeros y/o previene el desplazamiento por moléculas de apolipoproteína endógenas dentro de un individuo al que se administran los cargómeros. En otras modalidades, una apolipoproteína se modifica mediante derivatización química de uno o más residuos de aminoácidos o mediante mutagénesis dirigida al sitio, para conferir capacidad de direccionamiento o reconocimiento por parte de un receptor de superficie celular.
Los cargómeros pueden dirigirse a un receptor de superficie celular específico mediante la ingeniería de propiedades de reconocimiento del receptor en una apolipoproteína. Por ejemplo, los cargómeros pueden dirigirse a un tipo de célula particular que se sabe que alberga un tipo particular de agente infeccioso, por ejemplo mediante la modificación de la apolipoproteína para hacerla capaz de interactuar con un receptor en la superficie del tipo de célula objetivo. Por ejemplo, los cargómeros pueden dirigirse a los macrófagos mediante la alteración la apolipoproteína para conferir el reconocimiento por parte del receptor depurador endocítico de clase A de los macrófagos (SR-A). La capacidad de unión de SR-A se puede conferir aun cargómero mediante la modificación de la apolipoproteína mediante mutagénesis dirigida al sitio para reemplazar uno o más aminoácidos cargados positivamente con un aminoácido neutro o cargado negativamente. El reconocimiento de SR-A también puede conferirse mediante la preparación de una apolipoproteína quimérica que incluye una extensión del extremo N o C que tiene un ligando reconocido por SR-A o una secuencia de aminoácidos con una alta concentración de residuos cargados negativamente. Los cargómeros también pueden interactuar con receptores de apolipoproteína tales como, pero no se limita a, receptores ABCA1, receptores ABCG1, CD36, megalina, cubulina y receptores HDL como SR-B1.
El receptor SR-B1 y otros receptores de HDL(por ejemplo,ABCA1) son receptores depuradores esenciales para la homeostasis, la proliferación y el crecimiento celular que pueden regularse positivamente en las células cancerosas. Por lo tanto, los cargómeros de la descripción pueden usarse para dirigir la administración de agentes terapéuticos(por ejemplo,como se describió en la sección 6.1.3.2) a células cancerosas y tumores mediante la expresión de SR-B1 y otros receptores de HDL en la superficie de las células cancerosas.
6.1.2. Moléculas anfipáticas
Una molécula anfipática es una molécula que posee elementos tanto hidrófobos (apolares) como hidrófilos (polares). Las moléculas anfipáticas que pueden usarse en los cargómeros de la descripción incluyen lípidos, detergentes, ácidos grasos y moléculas apolares y esteroles unidos covalentemente a moléculas polares tales como, pero no se limita a, azúcares o ácidos nucleicos. Los cargómeros de la descripción pueden incluir una única clase de molécula anfipática(porejemplo,una sola especie de fosfolípidos o una mezcla de fosfolípidos), o puede contener una combinación de clases de moléculas anfipáticas(porejemplo,fosfolípidos y detergentes). El cargómero puede contener una especie de moléculas anfipáticas o una combinación de moléculas anfipáticas configuradas para facilitar la solubilización de la(s) molécula(s) de apolipoproteína.
61.2.1. Lípidos
Los cargómeros de la descripción pueden incluir uno o más lípidos. En diversas modalidades, uno o más lípidos pueden ser saturados y/o insaturados, naturales y/o sintéticos, cargados o no, zwitteriónicos o no. Los fosfolípidos pueden tener dos cadenas de acilo que son iguales o diferentes (por ejemplo, cadenas que tienen un número diferente de átomos de carbono, un grado diferente de saturación entre las cadenas de acilo, una ramificación diferente de las cadenas de acilo o una de sus combinaciones). El lípido también puede modificarse para que contenga una sonda fluorescente(por ejemplo,como se describió en avantilipids.com/product-category/products/fluorescent-lipids/). Preferentemente, el lípido comprende al menos un fosfolípido.
Los fosfolípidos pueden tener cadenas de acilo saturadas o insaturadas que varían de aproximadamente 6 a aproximadamente 24 átomos de carbono(por ejemplo,6-20, 6-16, 6-12, 12-24, 12-20, 12-16, 16-24, 16-20 o 20-24). En algunas modalidades, un fosfolípido usado en un cargómero tiene una o dos cadenas de acilo de 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24 carbonos(porejemplo,dos cadenas de acilo de la misma longitud o dos cadenas de acilo de diferente longitud).
En la tabla 1, más abajo, se proporcionan ejemplos no limitantes de cadenas de acilo presentes en ácidos grasos comunes que pueden incluirse en fosfolípidos:
Los lípidos que pueden estar presentes en los cargómeros incluyen, pero no se limitan a, fosfolípidos de cadena de alquilo pequeña, fosfatidilcolina de huevo, fosfatidilcolina de soja, dipalmitoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina, 1 -miristoil-2-palmitoilfosfatidilcolina, 1 -palmitoil-2-miristoilfosfatidilcolina, 1 -palmitoil-2-estearoilfosfatidilcolina, 1 -estearoil-2-palmitoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina dioleofosfatidiletanolamina, dilauroilfosfatidilglicerol fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilgliceroles, difosfatidilgliceroles tales como dimiristoilfosfatidilglicerol, dipalmitoilfosfatidilglicerol, diestearoilfosfatidilglicerol, dioleoilfosfatidilglicerol, ácido dimiristoilfosfatídico, ácido dipalmitoilfosfatídico, dimiristoilfosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidiletanolamina, dimiristoilfosfatidilserina, dipalmitoilfosfatidilserina, fosfatidilserina cerebral, esfingomielina cerebral, palmitoilesfingomielina, dipalmitoilesfingomielina, esfingomielina de huevo, esfingomielina de leche, fitoesfingomielina, diestearoilesfingomielina, sales de dipalmitoilfosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, galactocerebrósido, gangliósidos, cerebrósidos, dilaurilfosfatidilcolina, (1,3)-D-manosil-(1,3)diglicérido, aminofenilglucósido, glicolípidos de éter de 3-colesteril-6'-(glicosiltio)hexilo y colesterol y sus derivados. Pueden usarse lípidos sintéticos, tales como la palmitoilesfingomielina sintética o la N-palmitoil-4-hidroxiesfinganina-1-fosfocolina (una forma de fitoesfingomielina) para minimizar la oxidación de los lípidos.
En algunas modalidades, el cargómero incluye dos tipos de fosfolípidos: un lípido neutro,porejemplo,lecitina y/o esfingomielina (abreviada SM o SPH) y un fosfolípido cargado(porejemplo,un fosfolípido cargado negativamente). Un fosfolípido "neutro" tiene una carga neta de aproximadamente cero a pH fisiológico. En muchas modalidades, los fosfolípidos neutros son zwitteriones, aunque se conocen y pueden usarse otros tipos de fosfolípidos neutros netos. En algunas modalidades, la relación molar del fosfolípido cargado(por ejemplo,fosfolípido cargado negativamente) a fosfolípido neutro varía de 1:1 a 1:3, por ejemplo, aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:2 o aproximadamente 1:3.
El fosfolípido neutro puede comprender, por ejemplo, una o ambas de lecitina y/o SM, y opcionalmente puede incluir otros fosfolípidos neutros. En algunas modalidades, el fosfolípido neutro comprende lecitina, pero no Sm . En otras modalidades, el fosfolípido neutro comprende SM, pero no lecitina. En otras modalidades más, el fosfolípido neutro comprende tanto lecitina como SM. Todas estas modalidades ilustrativas específicas pueden incluir fosfolípidos neutros además de la lecitina y/o SM, pero en muchas modalidades no incluyen dichos fosfolípidos neutros adicionales.
La identidad del SM que se usa no es fundamental para el éxito. Por tanto, como se usa en la presente, la expresión "SM" incluye esfingomielinas derivadas o que se obtienen de fuentes naturales, así como también análogos y derivados de SM de origen natural que son impermeables a la hidrólisis por LCAT, como lo es el SM de origen natural. La SM es un fosfolípido muy similar en estructura a la lecitina, pero, a diferencia de la lecitina, no tiene una cadena principal de glicerol y, por lo tanto, no tiene enlaces éster que unan las cadenas de acilo. Más bien, la SM tiene una cadena principal de ceramida, con enlaces amida que conectan las cadenas de acilo. La SM puede obtenerse prácticamente de cualquier fuente. Por ejemplo, la SM puede obtenerse a partir de leche, huevo o cerebro. También pueden usarse análogos o derivados de S<m>. Los ejemplos no limitantes de análogos y derivados de SM útiles incluyen, pero no se limitan a, palmitoilesfingomielina, N-palmitoil-4-hidroxiesfinganina-1-fosfocolina (una forma de fitoesfingomielina), palmitoilesfingomielina, estearoilesfingomielina, D-eritro-N-16:0-esfingomielina y su isómero dihidro, D-eritro-N-16:0-dihidro-esfingomielina. Pueden usarse SM sintéticas tales como la palmitoilesfingomielina sintética o la N-palmitoil-4-hidroxiesfinganina-1-fosfocolina (fitoesfingomielina) para producir complejos más homogéneos y con menos contaminantes y/o productos de oxidación que los esfingolípidos de origen animal. Los métodos para sintetizar SM se describen en la publicación de Estados Unidos núm. 2016/0075634.
Las esfingomielinas aisladas de fuentes naturales pueden enriquecerse artificialmente en una cadena de acilo saturada o insaturada particular. Por ejemplo, la esfingomielina de la leche (Avanti Phospholipid, Alabaster, Alabama) se caracteriza por largas cadenas de acilo saturadas(es decir,cadenas de acilo que tienen 20 o más átomos de carbono). Por el contrario, la esfingomielina de huevo se caracteriza por cadenas de acilo cortas y saturadas (es decir, cadenas de acilo que tienen menos de 20 átomos de carbono). Por ejemplo, mientras que solo aproximadamente el 20 % de la esfingomielina de la leche comprende cadenas de acilo C16:0 (16 carbonos, saturadas), aproximadamente el 80 % de la esfingomielina de huevo comprende cadenas de acilo C16:0. Mediante el uso de extracción con solventes, la composición de la esfingomielina de la leche puede enriquecerse para tener una composición de cadena de acilo comparable a la de la esfingomielina del huevo, o viceversa.
La SM puede ser semisintética de manera que tenga cadenas de acilo particulares. Por ejemplo, la esfingomielina de la leche puede purificarse primero a partir de la leche, luego una cadena acilo particular,por ejemplo,la cadena de acilo C16:0, puede escindirse y reemplazarse por otra cadena de acilo. La SM también puede sintetizarse completamente, mediantepor ejemplo,síntesis a gran escala. Ver,por ejemplo,Dong y otros, patente de Estados Unidos núm. 5,220,043, titulada Synthesis of D-erythro-sphingomyelins, expedida el 15 de junio de 1993;Weis, 1999, Chem. Phys. Lipids 102 (1-2):3-12. La SM puede ser completamente sintética, por ejemplo, como se describió en la publicación de Estados Unidos núm. 2014/0275590.
Las longitudes y los niveles de saturación de las cadenas de acilo que comprenden una SM semisintética o sintética pueden variarse selectivamente. Las cadenas de acilo pueden ser saturadas o insaturadas y pueden contener de aproximadamente 6 a aproximadamente 24 átomos de carbono. Cada cadena puede contener el mismo número de átomos de carbono o, alternativamente, cada cadena puede contener diferentes números de átomos de carbono. En algunas modalidades, la SM semisintética o sintética comprende cadenas de acilo mixtas de manera que una cadena está saturada y la otra insaturada. En dichas SM de cadena de acilo mixta, las longitudes de cadena pueden ser iguales o diferentes. En otras modalidades, las cadenas de acilo de la SM semisintética o sintética están ambas saturadas o ambas insaturadas. Nuevamente, las cadenas pueden contener el mismo o diferente número de átomos de carbono. En algunas modalidades, ambas cadenas de acilo que comprenden la SM semisintética o sintética son idénticas. En una modalidad específica, las cadenas corresponden a las cadenas acilo de un ácido graso natural, tal como por ejemplo el ácido oleico, palmítico o esteárico. En otra modalidad, se usa una SM con cadenas funcionalizadas saturadas o insaturadas. En otra modalidad específica, ambas cadenas de acilo están saturadas y contienen de 6 a 24 átomos de carbono. En la tabla 1 anterior se proporcionan ejemplos no limitantes de cadenas de acilo presentes en ácidos grasos comunes que pueden incluirse en SM semisintéticas y sintéticas.
En algunas modalidades, la SM es palmitoil SM, tal como palmitoil SM sintética, que tiene cadenas de acilo C16:0, o es SM de huevo, que incluye como componente principal palmitoil SM.
En una modalidad específica, se usa una SM funcionalizada, tal como fitoesfingomielina.
La lecitina puede derivarse o aislarse de fuentes naturales o puede obtenerse sintéticamente. Ejemplos de lecitinas adecuadas aisladas de fuentes naturales incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilcolina de huevo y fosfatidilcolina de soja. Ejemplos adicionales no limitantes de lecitinas adecuadas incluyen dipalmitoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina, 1 -miristoil-2-palmitoilfosfatidilcolina, 1 -palmitoil-2-miristoilfosfatidilcolina, 1 -palmitoil-2-estearoilfosfatidilcolina, 1 -estearoil-2-palmitoilfosfatidilcolina, 1 -palmitoil-2-oleoilfosfatidilcolina, 1-oleoi1-2-palmitoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina y sus derivados éteres o análogos del mismo.
Las lecitinas derivadas o aisladas de fuentes naturales pueden enriquecerse para incluir cadenas de acilo específicas. En modalidades que emplean lecitinas semisintéticas o sintéticas, la(s) identidad(es) de las cadenas de acilo pueden variarse selectivamente, como se analizó anteriormente en relación con SM. En algunas modalidades de los cargómeros que se describen en la presente descripción, ambas cadenas de acilo en la lecitina son idénticas. En algunas modalidades de cargómeros que incluyen tanto SM como lecitina, las cadenas de acilo de SM y lecitina son todas idénticas. En una modalidad específica, las cadenas de acilo corresponden a las cadenas de acilo del ácido mirístico, palmítico, oleico o esteárico.
Los cargómeros incluyen preferentemente uno o más fosfolípidos cargados negativamente (por ejemplo, solos o en combinación con uno o más fosfolípidos neutros). Como se usa en la presente, "fosfolípidos cargados negativamente" son fosfolípidos que tienen una carga negativa neta a pH fisiológico. El fosfolípido cargado negativamente puede comprender un único tipo de fosfolípido cargado negativamente, o una mezcla de dos o más fosfolípidos diferentes, cargados negativamente. En algunas modalidades, los fosfolípidos cargados son glicerofosfolípidos cargados negativamente. Ejemplos específicos de fosfolípidos cargados negativamente adecuados incluyen, pero no se limitan a, un 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)], un fosfatidilglicerol, un fosfatidilinositol, una fosfatidilserina, un ácido fosfatídico y sales del mismo(por ejemplo,sales de sodio o sales de potasio). En algunas modalidades, el fosfolípido cargado negativamente comprende uno o más de fosfatidilinositol, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol y/o ácido fosfatídico. En una modalidad específica, el fosfolípido cargado negativamente comprende o consiste en una sal de un fosfatidilglicerol o una sal de un fosfatidilinositol. En otra modalidad específica, el fosfolípido cargado negativamente comprende o consiste en 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)], o DPPG, o una sal del mismo.
Los fosfolípidos cargados negativamente pueden obtenerse de fuentes naturales o prepararse mediante síntesis química. En modalidades que emplean fosfolípidos sintéticos cargados negativamente, las identidades de las cadenas de acilo pueden variarse selectivamente, como se analizó anteriormente en relación con SM. En algunas modalidades de los cargómeros que se describen en la presente descripción, ambas cadenas de acilo en los fosfolípidos cargados negativamente son idénticas. En algunas modalidades, las cadenas de acilo de todos los tipos de fosfolípidos que se incluyen en un cargómero son todas idénticas. En una modalidad específica, el cargómero comprende fosfolípidos cargados negativamente y/o SM, todos ellos con cadenas de acilo C16:0 o C16:1. En una modalidad específica, el resto de ácido graso de la SM es predominantemente palmitoilo C16:1. En una modalidad específica, las cadenas de acilo del(los) fosfolípido(s) cargado(s), lecitina y/o SM corresponden a la cadena de acilo del ácido palmítico. Aún en otra modalidad específica, las cadenas de acilo del(los) fosfolípido(s) cargado(s), lecitina y/o SM corresponden a la cadena de acilo del ácido oleico.
Los cargómeros pueden incluir uno o más lípidos cargados positivamente(por ejemplo,solos o en combinación con uno o más fosfolípidos neutros). Ejemplos de fosfolípidos cargados positivamente que pueden incluirse en los cargómeros de la descripción incluyen N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropil)amino]-4-[di(3-aminopropil)amino]butilcarboxamido)etil]-3,4-di[oleiloxi]-benzamida, 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano, 1,2-dimiristoleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dimiristoil-snglicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano, 1,2-dimiristoil-3-dimetilamonio-propano, 1,2-dipalmitoil-3-dimetilamonio-propano, N-(4-carboxibencil)-N,N-dimetil-2,3-bis(oleoiloxi)propan-1-amonio, 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-estearoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano, 1,2-dimiristoil-3-trimetilamonio-propano, bromuro de N-[1-(2,3-dimiristiloxi)propil]-N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)amonio, metilsulfato de N,N,N-trimetil-2-bis[(1-oxo-9-octadecenil)oxi]-(Z,Z)-1propanaminio y sales de los mismos(por ejemplo,sales de cloruro o bromuro). También pueden usarse otros lípidos cargados positivamente tales como estearilamina.
Los lípidos que se usan son preferentemente al menos 95 % puros y/o tienen niveles reducidos de agentes oxidantes (tales como, pero no se limita a, peróxidos). Los lípidos que se obtienen de fuentes naturales tienen preferentemente menos restos de ácidos grasos poliinsaturados y/o restos de ácidos grasos que no son susceptibles a la oxidación. El nivel de oxidación en una muestra puede determinarse mediante el uso de un método yodométrico, que proporciona un valor de peróxido, que se expresa en miliequivalentes de yoduros aislados por kg de muestra, abreviado meq O/kg.Ver, por ejemplo,Gray, 1978, Measurement of Lipid Oxidation: A Review, Journal ofthe American Oil Chemists Society 55:539-545; Heaton, F.W. y Ur, Improved lodometric Methods forthe Determination of Lipid Peroxides, 1958, Journal of the Science of Food and Agriculture 9:781-786. Preferentemente, el nivel de oxidación, o nivel de peróxido, es bajo, por ejemplo, menor que 5 meq O/kg, menor que 4 meq O/kg, menor que 3 meq O/kg o menor que 2 meq O/kg.
En algunas modalidades, los cargómeros pueden incluir pequeñas cantidades de lípidos adicionales. Puede usarse prácticamente cualquier tipo de lípidos, que incluye, pero no se limita a, lisofosfolípidos, galactocerebrósidos, gangliósidos, cerebrósidos, glicéridos, triglicéridos y esteroles y derivados de esteroles(por ejemplo,un esterol vegetal, un esterol animal, tal como colesterol, o un derivado de esterol, tal como un derivado de colesterol). Por ejemplo, un cargómero puede contener colesterol o un derivado de colesterol,por ejemplo,un éster de colesterol. El derivado de colesterol también puede ser un colesterol sustituido o un éster de colesterol sustituido. Los cargómeros de la descripción también pueden contener un esterol oxidado tal como, pero no se limita a, colesterol oxidado o un derivado de esterol oxidado (tal como, pero no se limita a, un éster de colesterol oxidado). En algunas modalidades, los cargómeros no incluyen colesterol y/o sus derivados (tales como un éster de colesterol o un éster de colesterol oxidado).
Las moléculas de lípidos(por ejemplo,moléculas de fosfolípidos) pueden contribuir juntas con una carga neta de 1-3(por ejemplo,1-3, 1-2, 2-3, 1, 2 o 3) por molécula de apolipoproteína en el cargómero. En algunas modalidades, la carga neta es negativa. En otras modalidades, la carga neta es positiva.
6.1.2.2. Detergentes
Los cargómeros de la descripción pueden contener uno o más detergentes. El detergente puede serzwitteriónico, no iónico, catiónico, aniónico o una de sus combinaciones. Los detergentes zwitteriónicos ilustrativos incluyen 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-2-hidroxi-1-propanosulfonato (CHAPSO) y N-óxido de N,N-dimetildodecilamina (LDAO). Los detergentes no iónicos ilustrativos incluyen 6-monooleato de D-(+)-trehalosa, N-octanoil-N-metilglucamina, N-nonanoil-N-metilglucamina, N-decanoil-N-metilglucamina, 1-(7Z-hexadecenoil)-rac-glicerol, 1-(8Z-hexadecenoil)-rac-glicerol, 1-(8Z-heptadecenoil)-rac-glicerol, 1-(9Z-hexadecenoil)-rac-glicerol, 1-decanoil-rac-glicerol. Los detergentes catiónicos ilustrativos incluyen clorhidrato de (S)-O-metil-serina dodecilamida, cloruro de dodecilamonio, bromuro de deciltrimetilamonio y sulfato de cetiltrimetilamonio. Los detergentes aniónicos ilustrativos incluyen hemisuccinato de colesterilo, colato, sulfatos de alquilo y sulfonatos de alquilo.
En algunas modalidades, los cargómeros de la descripción carecen de detergentes.
6.1.2.3. Ácidos grasos
Los cargómeros pueden contener uno o más ácidos grasos. El uno o más ácidos grasos pueden incluir ácidos grasos de cadena corta que tienen colas alifáticas de cinco o menos carbonos(por ejemplo,ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico o ácido isovalérico), ácidos grasos de cadena media que tienen colas alifáticas de 6 a 12 carbonos(por ejemplo,ácido caproico, ácido caprílico, ácido cáprico o ácido láurico), ácidos grasos de cadena larga que tienen colas alifáticas de 13 a 21 carbonos(por ejemplo,ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico o ácido araquídico), ácidos grasos de cadena muy larga que tienen colas alifáticas de 22 o más carbonos(por ejemplo,ácido behénico, ácido lignocérico o ácido cerótico), o una de sus combinaciones. El uno o más ácidos grasos pueden estar saturados(por ejemplo,ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido behénico, ácido lignocérico o ácido cerótico), insaturado(por ejemplo,ácido miristoleico, ácido palmitoleico, ácido sapienico, ácido oleico, ácido elaídico, ácido vaccénico, ácido linoleico, ácido linoelaídico, ácido a-linolénico, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido erúcico o ácido docosahexaenoico) o una de sus combinaciones. Los ácidos grasos insaturados pueden ser ácidos grasos cis o trans. En algunas modalidades, los ácidos grasos insaturados que se usan en los cargómeros de la descripción son ácidos grasos cis.
6.1.2.4. Moléculas apolares y esteroles unidos a un azúcar
Los cargómeros pueden contener una o más moléculas anfipáticas que comprenden una molécula o resto apolar(por ejemplo,una cadena hidrocarbonada, una cadena de acilo o diacilo) o un esterol(por ejemplo,colesterol) unido a un azúcar(por ejemplo,un monosacárido tal como glucosa o galactosa, o un disacárido tal como maltosa o trehalosa). El azúcar puede ser un azúcar modificado o un azúcar sustituido. Las moléculas anfipáticas ilustrativas que comprenden una molécula apolar unida a un azúcar incluyen dodecan-2-iloxi-p-D-maltósido, tridecan-3-iloxi-p-D-maltósido, tridecan-2-iloxi-p-D-maltósido, n-dodecil-p-D-maltósido (DDM), n-octil-p-D-glucósido, n-nonil-p-D-glucósido, n-decil-p-D-maltósido, n-dodecil-p-D-maltopiranósido, 4-n-dodecil-a,a-trehalosa, 6-n-dodecil-a,a-trehalosa y 3-n-dodecil-a,a-trehalosa.
6.1.3. Restos de carga
Los cargómeros de la descripción comprenden uno o más restos de carga(por ejemplo,uno, dos o tres restos de carga por cargómero). En algunas modalidades, un cargómero tiene de 1 a 25 restos de carga(por ejemplo,1 a 5, 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 5 a 10, 5 a 15, 5 a 20, 10 a 25, 10 a 20, 10 a 15, 15 a 25, 15 a 20, o 20 a 25 restos de carga). Un cargómero puede tener, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 restos de carga.
Un resto de carga puede ser, por ejemplo, una molécula o ensamble molecular que es biológicamente activo o que tiene utilidad diagnóstica(por ejemplo,como se describió en las secciones 6.1.3.1 a 6.1.3.10).
El resto de carga puede ser una molécula anfipática, por ejemplo, un gangliósido. Cuando el resto de carga es anfipático, el cargómero no necesita incluir otras moléculas anfipáticas, por ejemplo para solubilizar la apolipoproteína, aunque los cargómeros que incluyen restos de carga anfipáticos y moléculas anfipáticas adicionales están dentro del alcance de la presente invención.
El resto de carga no tiene por qué ser anfipático. En dichos casos, el resto de carga puede estar unido de forma no covalente o covalente a otro componente del cargómero. A manera de ejemplo, pero sin limitación, el resto de carga puede (a) unirse de forma no covalente a una región apolar del cargómero(por ejemplo,un núcleo apolar de un cargómero formado por regiones apolares de moléculas de apolipoproteína), (b) acoplado al cargómero mediante un injerto en un anclaje anfipático o apolar que puede unirse de forma no covalente a una región apolar del cargómero (directamente o mediante un enlazador) o (c) acoplado covalentemente a una molécula de apolipoproteína, por ejemplo, mediante un enlace directo o mediante un enlazador.
El resto de carga puede estar cargado o sin carga. Los restos de carga cargados pueden contribuir con una carga neta (positiva o negativa) de 1, 2, 3 o más de 3 por apolipoproteína en el cargómero. En algunas modalidades, el resto de carga contribuye con una carga neta de 1 (positiva o negativa) por molécula de apolipoproteína en el cargómero. En algunas modalidades, el resto de carga contribuye con una carga neta de 2 (positiva o negativa) por molécula de apolipoproteína en el cargómero. En algunas modalidades, el resto de carga contribuye con una carga neta de 3 (positiva o negativa) por molécula de apolipoproteína en el cargómero. En algunas modalidades, el resto de carga contribuye con una carga neta de más de 3 (positiva o negativa) por molécula de apolipoproteína en el cargómero. En otras modalidades, los restos de carga cargados pueden contribuir con una carga neta (ya sea positiva o negativa) de 1, 2, 3 o más de 3 al cargómero. En algunas modalidades, el resto de carga contribuye con una carga neta de 1 (positiva o negativa) al cargómero. En algunas modalidades, el resto de carga contribuye con una carga neta de 2 (positiva o negativa) al cargómero. En algunas modalidades, el resto de carga contribuye con una carga neta de 3 (positiva o negativa) al cargómero. En algunas modalidades, el resto de carga contribuye con una carga neta de más de 3 (positiva o negativa) al cargómero. Por ejemplo, un resto de carga de ácido nucleico puede tener una carga relativamente grande.
Los restos de carga adecuados incluyen agentes terapéuticos, agentes de diagnóstico, inmunógenos y adyuvantes. Los agentes de diagnóstico que pueden incluirse son agentes marcados tales como agentes marcados con oro, agentes marcados con isótopos estables, agentes marcados con isótopos radiactivos y agentes marcados con sondas fluorescentes. Los agentes terapéuticos que pueden incluirse en el cargómero incluyen agentes inmunoinhibidores, agentes inmunoestimulantes, agentes anticancerígenos, agentes antiinfecciosos, fármacos de ácidos nucleicos, agentes antiinflamatorios, agentes para el tratamiento de trastornos cardiovasculares, inhibidores de caspasa y moléculas bioactivas. A menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera, la identificación de un agente específico abarca las sales de los mismos. Por tanto, por ejemplo, la mención de "warfarina" abarca "warfarina de sodio", la mención de "clopidogrel" abarca "bisulfato de clopidogrel",etc.
Los cargómeros pueden comprender un resto de carga que dirige el cargómero a una región del cuerpo que se desee(por ejemplo,un órgano diana). La característica de direccionamiento puede ser parte o estar separada del agente terapéutico, agente de diagnóstico, inmunógeno o adyuvante. Dichos restos de carga pueden ayudar en la administración de los cargómeros a las regiones del cuerpo que se desee(por ejemplo,regiones del cuerpo afectadas por un trastorno relacionado con el sistema cardiovascular) y, en algunos casos, administrar en conjunto un efecto biológico(por ejemplo, terapéutico) efecto en la región del cuerpo que se desee. Ejemplos de agentes de direccionamiento que se pueden incluir en un cargómero incluyen un anticuerpo o fragmento de anticuerpo(por ejemplo,un anticuerpo compuesto por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, un fragmento Fab, un anticuerpo de cadena pesada o un anticuerpo de dominio único), ligando del receptor, hormona, vitamina y antígeno. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es específico para un antígeno específico de una enfermedad. En algunas modalidades, el ligando del receptor incluye, pero no se limita a, un ligando para CFTR, EGFR, receptor de estrógeno, FGR2, receptor de folato, receptor de IL-2, glicoproteína y VEGFR. En algunas modalidades, el ligando del receptor es ácido fólico. En algunas modalidades, el resto de apolipoproteína es el ligando de un receptor.
61.3.1. Agentes inmunoinhibidores e inmunoestimulantes
Un cargómero puede incluir uno o más agentes inmunoinhibidores. Los agentes inmunoinhibidores que pueden incluirse en los cargómeros incluyen esteroides, ácido retinoico, dexametasona, ciclofosfamida y sus combinaciones.
Un cargómero puede incluir uno o más agentes inmunoestimulantes. Los agentes inmunoestimulantes que pueden incluirse en los cargómeros incluyen oligonucleótidos CpG (ODN), ácido poliinosínico:policitidílico (poli-I:poli-C) y otros adyuvantes(por ejemplo,como se describió en la sección 6.2). Los ODN de CpG son ADN monocatenario sintético específico de especie que incorpora dinucleótidos CpG no metilados. El motivo CpG óptimo en humanos es GTCGTT y GACGTT en ratón. Los ODN de CpG imitan los efectos de estimulación inmunitario de secuencias bacterianas o virales no metiladas y activan receptores transmembrana de reconocimiento de patrones, promueven la secreción de citocinas y generan respuestas rápidas a patógenos microbianos. Los ODN de CpG imitan el ligando natural del receptor tipo Toll (TLR) 9 para la producción de factores de señalización y desencadenan una cascada de respuestas inmunitarias contra las células cancerosas. Estas moléculas pueden tener una cadena principal fosforotioada (PS) parcial o completamente, lo opuesto a la cadena principal fosfodiéster (PO) que se encuentra en el ADN bacteriano genómico. Hay tres clases principales (A, B, C) de ODN de CpG estimuladores en base a las características estructurales y la actividad en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas, tales como las células B y las células dendríticas plasmocitoides (pDC).
Los ODN de CpG de clase A contienen una secuencia de fosfodiéster (PO) palindrómica central que contiene CpG y una cadena poli-G 3' modificada con PS. Las colas de poli G forman tétradas intermoleculares para mejorar la estabilidad y aumentar la captación endosómica que luego puede promover la maduración de las pDC y, por lo tanto, la producción de grandes cantidades de IFN-a. Esta clase activa fuertemente las células asesinas naturales (NK) a través de la señalización indirecta de citocinas mientras estimula débilmente la señalización de NF-<k>B y la producción de citocinas proinflamatorias(por ejemploIL-6). Las moléculas de clase B son estructuralmente lineales y contienen una cadena principal completamente PS con uno o más motivos CpG de 6 unidades. Los ODN de CpG-B estimulan fuertemente la proliferación y activación de las células B junto con la activación de las células NK a través de la señalización de NF-<k>B para mostrar actividad antitumoral. Estas moléculas son potentes adyuvantes de vacunas de células T colaboradoras (Th1) tipo 1, pero son activadores débiles de la secreción de IFN-a. Los ODN de CpG-C son una amalgama de clases A y B con una cadena principal de PS completa y un motivo palindrómico que contiene CpG. Estas moléculas son fuertes estimuladores de las células B, la secreción de IFN tipo I y los adyuvantes inductores de Th1. Todos los ODN de CpG contienen uno o más dinucleótidos CpG no metilados en contextos de secuencia específicos, que las células de mamíferos reconocen fácilmente como una indicación de invasión microbiana, debido a la rareza de esta estructura en los genomas de mamíferos.
En algunas modalidades, el cargómero comprende un oligonucleótido de CpG que es un oligonucleótido de CpG de clase A, por ejemplo, un oligonucleótido de CpG que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende oque consiste de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4. En algunas modalidades, el cargómero comprende un oligonucleótido de CpG que es un oligonucleótido de CpG de clase B, por ejemplo, un oligonucleótido de CpG que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende o que consiste de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO: 7. Aún en otras modalidades, el cargómero comprende un oligonucleótido de CpG que es un oligonucleótido de CpG de clase C, por ejemplo, un oligonucleótido de CpG que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende o que consiste de la secuencia de nucleótidos de SEQ Id NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10.
Un resto lipídico(por ejemplo,que tiene características como las del colesterol u otros esteroles) puede conjugarse con un extremo de un ODN de CpG para usarse como anclaje para acoplar el ODN de CpG al cargómero. Puede añadirse una etiqueta de colesterol en el extremo 3' o 5' de un ODN mediante el uso de un enlazador C4 a C8 o un enlazador de polietilenglicol para mejorar la transducción de la molécula y mejorar la resistencia a las nucleasas con una mayor actividad antiviral diana. Otro método de conjugar un ODN de CpG con un lípido consiste en la conjugación de ODN con cadenas de alquilo (superiores a 12 carbonos), ácidos grasos o éteres de corona sustituidos con lípidos. Los dendrímeros lipófilos pueden conjugarse con los extremos 5' o 3' de los ODN para aumentar su absorción celular, pero aumentar el tamaño del dendrímero puede ir en detrimento de la actividad de unión de su diana dentro de la célula. Los grupos fosfatidilo son susceptibles a la conjugación con ODN y proporcionan una gran similitud en la estructura molecular con muchos constituyentes lipídicos de las membranas celulares. Pueden usarse 1,2-ditetra, 1,2-dihexa- y 1,2-dioctadecanoilglicerol que tienen la configuración S en el carbono estereogénico. Las fosforamiditas resultantes tienen la misma estereoquímica en el centro quiral que los fosfolípidos naturales(R)para permitir el paso al interior de las células. Además, pueden usarse los 5'-0- fosfatidiloligodesoxinucleótidos con colas de fosfatidilo variables y/o la secuencia y longitud del resto de ODN.
En algunas modalidades, el cargómero comprende un oligonucleótido poli-I:poli-C que se une a un colesterol, un fosfolípido o un ácido graso.
6.I.3.2. Agentes anticancerígenos
Un cargómero puede incluir uno o más agentes anticancerígenos. Los agentes anticancerígenos que pueden incluirse en el cargómero incluyen inhibidores de topoisomerasa, agentes alquilantes de ADN, agentes inductores de rotura de hebras de ADN, agentes antimicrotúbulos, agentes antimetabólicos, antraciclinas, alcaloides de vinca, epipodofilotoxinas, inhibidores de tirosina cinasa, inhibidores de CDK, inhibidores de MAP cinasa, inhibidores de EGFR e inhibidores de VEGFR.
En determinados aspectos, el agente anticancerígeno es un agente quimioterapéutico,por ejemplo,un agente citotóxico o citostático. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y CYTOXAN® ciclofosfamida; sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfán, piposulfán y treosulfán; decarbazina; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; TLK286 (TELCYTA)™); acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina (que incluye el análogo sintético topotecán (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (que incluye sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (que incluye los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenetesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; bisfosfonatos, tales como clodronato; antibióticos tales como los antibióticos enedinas (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gamma1I y calicheamicina omegall (ver, por ejemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994)) y antraciclinas tales como anamicina, AD 32, alcarrubicina, daunorrubicina, dexrazoxan, DX-52-1, epirrubicina, GPX-100, idarrubicina, KRN5500, menogaril, dinamicina, que incluye la dinamicina A, una esperamicina, cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos enedinos de cromoproteína relacionados, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas (por ejemplo, bleomicina A2, bleomicina B2 y peplomicina), cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMICINA® doxorrubicina (que incluye morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina, doxorrubicina liposomal y desoxidoxorrubicina), esorubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como la mitomicina C, ácido micofenólico, tiazofurina, ribavarina, EICAR, nogalamycina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina y zorubicina; análogos del ácido fólico tales como denopterina, pteropterina y trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina y tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina y floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano y testolactona; antisuprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano y trilostano; reponedor de ácido fólico tal como ácido folínico (leucovorina); aceglatona; agentes antineoplásicos antifolato tales como ALlMTA®, LY231514 pemetrexed, inhibidores de la dihidrofolato reductasa tales como metotrexato y trimetrexato, antimetabolitos tales como el 5-fluorouracilo (5-FU) y sus profármacos como UFT, S-1 y capecitabina, e inhibidores de la timidilato sintasa e inhibidores de la glicinamida ribonucleótido formiltransferasa tales como raltitrexed (TOMUDEXRM, TDX); inhibidores de la dihidropirimidina deshidrogenasa tales como eniluracilo; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrino; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; deferoxamina; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK® complejo de polisacárido (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESINA®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromán; gacitosina; arabinósido de citosina ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides ytaxanos, por ejemplo, TAXOL®paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, Nueva Jersey), ABRAXANE™ formulación de nanopartículas de paclitaxel diseñadas con albúmina y sin cremofor (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, III.) y TAXOTERE® doxetaxel (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; gemcitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; platino; análogos de platino o análogos basados en platino tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; vinblastina (VELBAN®); epipodofilinas tales como etopósido (VP-16), tenipósido, tepotecán, 9-aminocamptotecina, camptotecina y crisnatol; ifosfamida; mitoxantrona; alcaloides de la vinca como la vincristina (ONCOVIN®), vindesina, alcaloide de la vinca y vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilhilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
En algunas modalidades, el agente anticancerígeno es metotrexato, taxol, L-asparaginasa, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiurea, citarabina, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureas, cisplatino, carboplatino, mitomicina, dacarbazina, procarbizina, topotecán, mostazas nitrogenadas, citoxano, etopósido, 5-fluorouracilo, BCNU, irinotecán, camptotecinas, bleomicina, doxorrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, asparaginasa, vinblastina, vincristina, vinorelbina, paclitaxel o docetaxel.
En algunas modalidades, el agente anticancerígeno es un anticuerpo. En determinadas modalidades, el anticuerpo anticancerígeno es un anticuerpo anti-CD20,por ejemplo,rituximab o tositumomab (que son útiles para tratar,entre otros,linfoma no Hodgkin de células B), un anticuerpo anti-CD52,por ejemplo,alemtuzumab (que es útil para tratar la leucemia linfocítica crónica de células B), un anticuerpo anti-receptor de<e>G<f>,por ejemplo,cetuximab o panitumumab (que son útiles para tratar el cáncer de cabeza y cuello y el cáncer colorrectal), un anticuerpo anti-VEGF,por ejemplo,bevacizumab (que es útil para tratar, entre otros, el cáncer colorrectal), o un anticuerpo anti-HER2,por ejemplo,trastuzumab (que es útil para tratar el cáncer de mama metastásico HER2 positivo).
En algunas modalidades, el agente anticancerígeno tiene forma de un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC). Los ADC ilustrativos incluyen gemtuzumab ozogamicina (aprobado para tratar la leucemia mieloide aguda), brentuximab vedotina (aprobado para tratar el linfoma de Hodgkin), trastuzumab emtansina (aprobado para tratar el cáncer de mama metastásico HER2 positivo) e inotuzumab ozogamicina (aprobado para tratar la leucemia linfoblástica aguda).
Los inhibidores de la topoisomerasa ilustrativos incluyen inhibidores de tipo I tales como irinotecán, topotecán, camptotecina y lamelarina D e inhibidores de tipo II tales como etopósido, tenipósido, doxorrubicina, daunorrubicina, mitoxantrona, amsacrina, elipticinas, ácido aurintricarboxílico y HU-331. Los agentes alquilantes de ADN ilustrativos incluyen agentes alquilantes de ADN clásicos tales como mostazas nitrogenadas(por ejemplo,ciclofosfamida, mecloretamina, uramustina, melfalán, clorambucilo, ifosfamida y bendamustina) nitrosoureas(por ejemplo,carmustina, lomustina y estreptozocina) y sulfonatos de alquilo(por ejemplo,busulfano), agentes de tipo alquilante tales como cisplatino, carboplatino, nedaplatino, oxaliplatino, satraplatino y tetranitrato de triplatino, y agentes alquilantes no clásicos tales como procarbazina y altretamina. Los agentes inductores de rotura de la hebra de ADN ilustrativos incluyen calicheamicina, etopósido, doxorrubicina, ginsenósido Rg3, bleomicina A5, raltitrexed y SCH-900776. Los agentes antimicrotúbulos ilustrativos incluyen paclitaxel, docetaxel y cabazitaxel. Los agentes antimetabólicos ilustrativos incluyen 5-fluorouracilo (5-FU), 6-mercaptopurina (6-MP), capecitabina, citarabina, floxuridina, fludarabina, gemcitabina, hidroxicarbamida, metotrexato y pemetrexed. Las antraciclinas ilustrativas incluyen daunorrubicina y doxorrubicina. Los alcaloides de la vinca ilustrativos incluyen vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, vincaminol, vineridina y vinburnina. Las epipodofilotoxinas ilustrativas incluyen etopósido y tenipósido. Los inhibidores de tirosina cinasa ilustrativos incluyen imatinib, gefitinib y erlotinib. Los inhibidores de CDK ilustrativos incluyen palbociclib, abemaciclib y ribociclib. Los inhibidores de EGFR ilustrativos incluyen gefitinib, erlotinib, afatinib, brigatinib, icotinib y cetuximab. Los inhibidores de VEGFR ilustrativos incluyen pazopanib, vatalanib, sunitinib y sorafenib.
En determinadas modalidades, un cargómero de la descripción comprende un agente anticancerígeno que es útil en el tratamiento del melanoma. Se ha demostrado que los melanomas que expresan niveles altos de SR-B1 se asocian con peores resultados que los melanomas que expresan niveles bajos de SR-B1 (Mikula y otros, 2017, Mol. Cancer Res., doi:10.1158/1541-7786). Sin estar ligado a ninguna teoría, se espera que los cargómeros que portan agentes antimelanoma sean capaces de dirigirse a las células de melanoma que son más resistentes a la terapia. En consecuencia, en determinados aspectos, la descripción proporciona cargómeros que comprenden un agente antimelanoma, tal como, pero no se limita a, aldesleucina, cobimetinib, dabrafenib, dacarbazina, talimogene laherparepvec, ipilimumab, pembrolizumab, trametinib, nivolumab u orvemurafenib). Dichos cargómeros pueden administrarse a sujetos con melanoma como monoterapia o como parte de regímenes de terapia combinada, por ejemplo con agentes quimioterapéuticos o terapias basadas en interferón(por ejemplo,interferón alfa-2b recombinante, peginterferón alfa-2a o peginterferón alfa-2b).
6.1.3.3. Agentes antiinfecciosos
Un cargómero puede incluir uno o más agentes antiinfecciosos. Los agentes antiinfecciosos que pueden incluirse en los cargómeros de la descripción incluyen agentes antibacterianos, agentes antivirales, agentes antiparasitarios, agentes antifúngicos y agentes antimicobacterianos.
Los agentes antibacterianos ilustrativos incluyen antibióticos p-lactámicos, penicilinas(por ejemplo,penicilina, meticilina, ampicilina, amoxicilina), cefalosporinas(por ejemplo,avibactam, cefalexina, cefepima, ceftarolina), inhibidores de p-lactamasa(por ejemplo,tebipenem, clavulanato, sulbactam y tazobactam), vancomicina, aminoglucósidos(por ejemplo,gentamicina, neomicina B, neomicina C, neomicina E, estreptomicina), tetraciclinas(por ejemplo,tetraciclina, limeciclina, metaciclina y doxiciclina), cloranfenicol, eritromicina, lincomicina, clindamicina, rifampicina, metronidazol, polimixinas(por ejemplo,polimixina B y polimixina E), sulfonamidas(por ejemplo,sulfisoxazol y sulfaisodimidina) y quinolonas(por ejemplo,cinoxacina, ciprofloxacina, balofloxacina y gatifloxacina).
Los agentes antivirales ilustrativos incluyen amantadina, rimantadina, ribivarina, aciclovir, vidarabina, trifluorotimidina, ganciclovir, zidovudina, retinovir e interferones.
Los agentes antifúngicos ilustrativos incluyen imidazoles(por ejemplo,bifonazol, sertaconazol), triazoles(por ejemplo,albaconazol, isavuconazol), antibióticos macrólidos poliénicos(por ejemplo,anfotericina B, nistatina y natamicina), griseofulvina, anfotericina B y flucitosina.
Los agentes antiparasitarios incluyen antihelmínticos y agentes antiprotozoarios.
6.1.3.4. Fármacos de ácido nucleico
Un cargómero puede incluir uno o más fármacos de ácido nucleico (término que incluye ácidos nucleicos que se destinan a la terapia génica). Los fármacos de ácido nucleico que pueden incluirse en el cargómero de la descripción incluyen ADN de origen natural o no natural, ARN de origen natural o no natural, oligonucleótidos, moléculas que forman triple hélice, ácidos nucleicos inmunoestimulantes, pequeños ARN de interferencia (ARNip), microARN (ARNmi), oligonucleótidos antisentido, aptámeros, ribozimas, genes o fragmentos de genes y secuencias reguladoras.
Los fármacos de ácido nucleico pueden incluir nucleótidos modificados y/o una cadena principal modificada,por ejemplo,un fármaco de ácido nucleico puede comprender ácidos nucleicos peptídicos (ver,por ejemplo,Pansuwan y otros, 2017, Bioconjug Chem. 28(9):2284-2292). El ácido nucleico puede formar complejos con un resto para facilitar la unión o la absorción por una célula diana. El ácido nucleico puede unirse de manera conveniente a una molécula que interactúa con el cargómero. Por ejemplo, un ácido nucleico puede estar unido covalentemente a un esterol, un ácido graso o un fosfolípido como los que se describen en la sección 61.2.1.
En algunas modalidades, el fármaco de ácido nucleico es un ARNip u oligonucleótido antisentido. El oligonucleótido antisentido puede ser, por ejemplo, un oligonucleótido bicatenario(por ejemplo,como se describió en el documento US 2017/0137816). Dichas modalidades no se limitan a un tamaño o tipo de molécula particular. La longitud de la región del ARNip u oligonucleótido antisentido complementario a la diana, por ejemplo, puede ser de 15 a 100 nucleótidos, de 18 a 25 nucleótidos, de 20 a 23 nucleótidos o más de 15, 16, 17 o 18 nucleótidos. Cuando hay discrepancias con la región diana correspondiente, generalmente se requiere que la longitud de la región complementaria sea algo más larga.
En determinadas modalidades, se contempla que la administración de ARNip u oligonucleótidos antisentido mediante el uso de los cargómeros que se describen en la presente descripción puede usarse para inhibir cualquier gen de interés.
La carga de un fármaco de ácido nucleico en los cargómeros puede facilitarse a través de la modificación del colesterol del fármaco de ácido nucleico. Por ejemplo, el ARNip puede modificarse con colesterol en la hebra sentido 3' y puede usarse un nivel intermedio de modificación química para estabilizar el ARNip en el suero sin comprometer significativamente su efecto silenciador.
Los fármacos de ácido nucleico pueden etiquetarse con un agente de formación de imágenes(por ejemplo,colorante fluorescente Cy3) para permitir la visualización de la biodistribución del fármaco de ácido nucleico a nivel de órganos y también el perfil de administración intracelular. En algunas modalidades, se usan la RT-PCR y transferencia western para analizar la proteína diana a nivel de ARNm y a nivel de proteína, respectivamente.
En algunas modalidades, los cargómeros comprenden uno o más ARNip específicos para la proproteína convertasa subtilisina/kexina 9 (PCSK9). En algunas modalidades, la secuencia de ARNip de PCSK9 tiene reactividad cruzada con ARNm de PCSK9 murino, de rata, de primates no humanos y humano (ver,por ejemplo,Frank-Kamenetsky, y otros, 2008, Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America 105(33):11915-11920).
En algunas modalidades, los cargómeros comprenden uno o más ARNip específicos para el gen que codifica la apolipoproteína B, la apolipoproteína de las lipoproteínas LDL.
En algunas modalidades, los cargómeros comprenden una o más moléculas silenciadoras de genes dirigidas(por ejemplo,ARNip) para bloquear la producción de la proteína huntingtina (Htt) disfuncional, la causa de la enfermedad de Huntington, un trastorno neurodegenerativo hereditario mortal (ver,por ejemplo,www.scbt.com/scbt/product/huntingtin-sirna-h-shrna-and-lentiviral-particle-gene-silencers).
En algunas modalidades, los cargómeros comprenden una o más moléculas silenciadoras de genes dirigidas(por ejemplo,ARNip) para bloquear la producción de productos de la proteína precursora de amiloide (APP), que causan la enfermedad de Alzheimer.
En algunas modalidades, los cargómeros comprenden una o más moléculas silenciadoras de genes dirigidas, como las que se describen en el documento WO 2014076195 A1, para bloquear la producción de proteínas involucradas en procesos patológicos.
En algunas modalidades, los cargómeros comprenden una o más moléculas silenciadoras de genes dirigidas(por ejemplo,oligonucleótidos antisentido o ARNip) para bloquear la producción de STAT3, que puede usarse, por ejemplo, para tratar el cáncer de páncreas.
En algunas modalidades, los cargómeros comprenden una o más moléculas silenciadoras de genes dirigidas(por ejemplo,oligonucleótidos antisentido o ARNip) para bloquear la producción de KRAS, que puede usarse, por ejemplo, para tratar el cáncer de páncreas.
En algunas modalidades, los cargómeros comprenden una o más moléculas silenciadoras de genes dirigidas(por ejemplo,oligonucleótidos antisentido o ARNip) para bloquear la producción de EGFR, que puede usarse, por ejemplo, para tratar el cáncer de páncreas.
6.1.3.5. Agentes antiinflamatorios
Un cargómero puede incluir uno o más agentes antiinflamatorios. Los agentes antiinflamatorios que pueden incluirse en los cargómeros de la descripción incluyen uno o más de alclofenaco, dipropionato de alclometasona, acetónido de algestona, alfa amilasa, amcinafal, amcinafida, amfenaco de sodio, clorhidrato de amiprilosa, anakinra; anirolaco; anitrazafeno; apazona; aspirina; balsalazida disódica; bendazaco; benoxaprofeno; clorhidrato de bencidamina; bromelinas; broperamol; budesonida; carprofeno; cicloprofeno; cintazone; cliprofeno; propionato de clobetasol; butirato de clobetasona; clopiraco; propionato de cloticasona; acetato de cormetasona; cortodoxona; deflazacort; desonida; desoximetasona; dipropionato de dexametasona; diclofenaco de potasio; diclofenaco de sodio; diacetato de diflorasona; diflumidona de sodio; diflunisal; difluprednato; diftalona; sulfóxido de dimetilo; drocinonida; endrisona; enlimomab; enolicam de sodio; epirizola; etodolaco; etofenamato; felbinaco; fenamol; fenbufeno; fenclofenaco; fencloraco; fendosal; fenpipalona; fentiazaco; flazalona; fluazacort; ácido flufenámico; flumizola; acetato de flunisolida; flunixina; flunixina meglumina; fluocortina de butilo; acetato de fluorometolona; flucuazona; flurbiprofeno; fluretofeno; propionato de fluticasona; furaprofeno; furobufeno; halcinonida; propionato de halobetasol; acetato de halopredona; ibufenaco; ibuprofeno; ibuprofeno aluminio; ibuprofeno piconol; ilonidap; indometacina; indometacina de sodio; indoprofeno; indoxol; intrazol; acetato de isoflupredona; isoxepaco; isoxicam; ketoprofeno; clorhidrato de lofemizol; lornoxicam; etabonato de loteprednol; meclofenamato de sodio; ácido meclofenámico; dibutirato de meclorisona; ácido mefenámico; mesalamina; meseclazona; suleptanato de metilprednisolona; morniflumato; nabumetona; naproxeno; naproxeno de sodio; naproxol; nimazona; olsalazina de sodio; orgoteína; orpanoxina; oxaprozina; oxifenbutazona; clorhidrato de paranilina; polisulfato de pentosano de sodio; glicerato de fenbutazona de sodio; pirfenidona; piroxicam; cinamato de piroxicam; piroxicam olamina; pirprofeno; prednazato; prifelona; ácido prodólico; procuazona; proxazol; citrato de proxazol; rimexolona; romazarit; salcolex; salnacedina; salsalato; salicilatos; cloruro de sanguinaria; seclazona; sermetacina; sudoxicam; sulindaco; suprofeno; talmetacina; talniflumato; talosalato; tebufelona; tenidap; tenidap de sodio; tenoxicam; tesicam; tesimida; tetridamina; tiopinaco; pivalato de tixocortol; tolmetina; tolmetina de sodio; triclonida; triflumidato; zidometacina; glucocorticoides; gemcabeno, ácido bempedoico y zomepiraco de sodio.
6.1.3.6. Agentes para el tratamiento de trastornos relacionados con el sistema cardiovascular
Los cargómeros de la descripción pueden incluir uno o más agentes para tratar trastornos relacionados con el sistema cardiovascular, tales como aterosclerosis, insuficiencia cardíaca, arritmia, fibrilación auricular, hipertensión, enfermedad de las arterias coronarias y angina de pecho. Ejemplos de agentes terapéuticos que se sabe que son útiles en el tratamiento y/o prevención de trastornos cardiovasculares incluyen inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA)(por ejemplo,benazepril, enalapril, lisinopril, perindopril, ramipril), adenosina, alfabloqueantes (medicamentos antagonistas alfa adrenérgicos)(por ejemplo,clonidina, guanabenzo, labetalol, fenoxibenzamina, terazosina, doxazosina, guanfacina, metildopa, prazosina), bloqueadores de los receptores de angtiotensina II (BRA)(por ejemplo,candesartán, irbesartán, olmesartán medoxomilo, telmisartán, eprosartán, losartán, tasosartán, valsartán), anticoagulantes(por ejemplo,heparina fondaparinux, warfarina, ardeparina, enoxaparina, reviparina, dalteparina, nadroparina, tinzaparina), agentes antiplaquetariosfporejemplo,abciximab, clopidogrel, eptifibatida, ticlopidina, cilostazol, dipiridamol, sulfinpirazona, tirofiban), bloqueadores beta(por ejemplo,acebutolol, betaxolol, carteolol, metoprolol, penbutolol, propranolol, atenolol, bisoprolol, esmolol, nadolol, pindolol, timolol), bloqueadores de los canales de calcio(por ejemplo,amlopidina,felodipina, isradipina, nifedipina, verapamilo, diltiazem, nicardipina, nimodipina, nisoldipina), diuréticos, bloqueadores de aldosterona, diuréticos de asa(por ejemplo,bumetanida, furosemida, ácido etacrínico, torsemida), diuréticos ahorradores de potasio, diuréticos tiazídicos (porejemplo,clorotiazida, clortalidona, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, metilclotiazida, metolazona, politiazida, quinetazona, triclormetiazida), inoptrópicos, secuestrantes de ácidos biliares(por ejemplo,colestiramina, coltipol, colesevelam), fibratos(por ejemplo,clofibrato, gemfibrozilo, fenofibrato), estatinas(por ejemplo,atorvastatina, lovastatina, simvastatina, fluvastatina, pravastatina), inhibidores selectivos de la absorción de colesterol(por ejemplo,ezetimiba), gemcabeno, ácido bempedoico, bloqueadores de los canales de potasio(por ejemplo,amidarona,ibutilida, dofetilida), bloqueadores de los canales de sodio(porejemplo,disopiramida, mexiletina, procainamida, quinidina, flecainida, moricizina, propafenona), agentes trombolíticos(porejemplo,alteplasa, reteplasa, tenecteplasa, anistreplasa, estreptoquinasa, uroquinasa), vasoconstrictores, vasodilatadores(porejemplo,hidralazina, minoxidil, mecamilamina, dinitrato de isorbida, mononitrato de isorbida, nitroglicerina), inhibidores de proteínas de transferencia de ésteres de colesterilo (por ejemplo, anacetrapib, evacetrapib), agonistas de PPAR (por ejemplo, K-877, CER-002, DSP-8658, INT131, GFT505), activadores de ApoA-I(porejemplo,RVX-208), esfingosina-1-fosfato, agonistas del receptor de retinoides X (RXR)(porejemplo,bexaroteno, CD3254, ácido docosahexaenoico, fluorobexaroteno, isotretinoína, ácido retinoico, SRI 1237, fenretinida, HX630, diclorhidrato de liarozol, LG100754 y LG101506), agonistas del receptor hepático X (LXR)(porejemplo,TO901317, ATI-111, LXR-623, XL-652, hipocolamida, GW3965, N,N-dimetil-3beta-hidroxi-colenamida (d Mh Ca ), 22(R)-hidroxicolesterol, 24(S)-hidroxicolesterol, (-)antrabenzoxocinona y (-)biscloroantrabenzoxocinona ((-)-BABX)).
6.1.3.7. Inhibidores de caspasa
Los cargómeros de la descripción pueden incluir uno o más inhibidores de caspasa (por ejemplo, un inhibidor de caspasa-1, un inhibidor de caspasa-3 o un inhibidor de caspasa-8). Los inhibidores de caspasa pueden ser útiles para tratar la enfermedad del hígado graso no alcohólico, la epilepsia, los trastornos isquémicos, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedades autoinmunitarias como la artritis reumatoide, la osteoartritis, la enfermedad inflamatoria intestinal, las infecciones virales (por ejemplo, hepatitis C) y sepsis. Los inhibidores de caspasa ilustrativos que se han estudiado clínicamente y que pueden incluirse en los cargómeros de la descripción incluyen emricasan, pralnacasan y VX-765. Otros inhibidores de caspasa que pueden incluirse en los cargómeros se describen en los documentos US 2010/0041661, WO/2001/021600, y US 9,365,612.
6.1.3.8. Agentes bioactivos
Los cargómeros de la descripción pueden incluir uno o más agentes bioactivos, que están opcionalmente deuterados. Los agentes bioactivos altamente deuterados pueden resultar útiles para inhibir procesos biológicos. Los agentes bioactivos ilustrativos incluyen polifenoles, tales como flavonoides(por ejemplo,antoxantinas tales como luteolina, apigenina, tangeritina, quercetina, kaempferol, miricetina, fisetina, galangina, isorhamnetina, paquipodol, ramnazina, piranoflavonoles y furanoflavonoles; flavanonas tales como hesperetina, naringenina, eriodictiol y homoeriodictiol; flavanonoles tales como dihidroquercetina y dihidrokaempferol, flavanos tales como catequina, galocatequina, 3-galato de catequina, 3-galato de galocatequina, epicatequinas, epigalocatequina, 3-galato de epicatequina, 3-galato de epigalocatequina, teaflavina y leucoantocianidina), carotenoides(porejemplo,betacaroteno, alfacaroteno, betacriptoxantina y gammacaroteno, luteína, licopeno, astaxantina, zeaxantina) y fitoesteroles.
6.1.3.9. Agentes de diagnóstico
Los cargómeros de la descripción pueden incluir uno o más agentes de formación de imágenes tales como un resto fluorescente, un resto fosforescente, oro, un resto radiactivo, un emisor beta o una de sus combinaciones. Los agentes de formación de imágenes adecuados incluyen, pero no se limitan a, moléculas fluorescentes tales como las que se describen por Molecular Probes (Handbook of fluorescent probes and research products), tales como rodamina, fluoresceína, rojo de Texas, naranja de acridina, Alexa Fluor (diversos), aloficocianina, 7-aminoactinomicina D, BOBO-1, BODIPY (diversos), Calcien, calcio carmesí, verde de calcio, naranja de calcio, 6-carboxirodamina 6G, azul Cascade, amarillo Cascade, DAPI, DiA, DID, Di1, DiO, DiR, ELF 97, Eosina, ER Tracker Azul-Blanco, EthD-1, Bromuro de etidio, Fluo-3, Fluo4, FM1-43, FM4-64, Fura-2, Fura Red, Hoechst 33258, Hoechst 33342, 7-hidroxi-4-metilcumarina, Indo-1, JC-1, JC-9, tinte JOE, lisamina rodamina B, amarillo de Lucifer CH, azul LysoSensor DND-167, verde LysoSensor, amarillo/azul LysoSensor, verde Lysotracker FM, verde de magnesio, azul Marina, verde Mitotracker FM, naranja Mitotracker CMTMRos, rojo MitoTracker CMXRos, Monobromobimano, aminas NBD, NeruoTrace 500/525 verde, Rojo Nilo, verde Oregon, azul Pacific. POP-1, yoduro de propidio, rodamina 110, rojo rodamina, R-ficoeritrina, resorfina, RH414, rodamina-2, verde rodamina, rodamina 123, colorante ROX, verde sodio, azul SYTO (diversos), verde SYTO (diversos), naranja SYTO (diversos), azul SYTOX, verde SYTOX, naranja SYTOX, tetrametilrodamina B, TOT-1, TOT-3, X-rodamina-1, YOYO-1, YOYO-3. En algunas modalidades, se proporcionan ceramidas como agentes de formación de imágenes. En algunas modalidades, se proporcionan agonistas de S1P como agentes de formación de imágenes. Adicionalmente, pueden usarse radionucleidos como agentes de formación de imágenes. Los radionucleidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, especies radiactivas de Fe(III), Fe(II), Cu(II), Mg(II), Ca(N)yZn(I1), indio, galio y tecnecio. Por ejemplo, el agente de formación de imágenes puede ser una especie radiactiva de hierro, cobre, magnesio, calcio, zinc, indio, galio(por ejemplo,galio-67), tecnecio, flúor(por ejemplo,flúor-18), criptón(por ejemplo,criptón-81), rubidio(por ejemplo,rubidio-82), nitrógeno(por ejemplo,nitrógeno-13), yodo(por ejemployodo-123), xenón(por ejemploxenón-133), talio(por ejemplotalio-201), circonio(por ejemplo,circonio-89), o una de sus combinaciones. En algunas modalidades, el agente de formación de imágenes comprende circonio-89.
Otros agentes de contraste adecuados incluyen iones metálicos que se usan generalmente para quelación en agentes de contraste MIR paramagnéticos de tipo T1, e incluyen cationes divalentes y trivalentes tales como cobre, cromo, hierro, gadolinio, manganeso, erbio, europio, disprosio y holmio. Los iones metálicos que pueden quelarse y usarse para obtener imágenes con radionúclidos incluyen, pero no se limitan a, metales tales como galio, germanio, cobalto, calcio, indio, iridio, rubidio, itrio, rutenio, itrio, tecnecio, renio, platino, talio y samario. Adicionalmente, los iones metálicos que se sabe que son útiles en la terapia de radiación de captura neutrónica incluyen boro y otros metales con grandes secciones transversales nucleares. También son adecuados iones metálicos útiles en composiciones de contraste para ultrasonidos y de contraste para rayos X. Ejemplos de otros agentes de contraste adecuados incluyen gases o compuestos emisores de gases que son radioopacos.
Los agentes de formación de imágenes de metales(por ejemplo,metales radiactivos) pueden unirse a un cargómero mediante un quelante de metales, como el quelante bifuncional p-isotiocianatobencildesferrioxamina (Df-Bz-NCS). Ver, Zheng y otros, 2016, Atherosclerosis 251 :381-388; Perez-Medina y otros, 2015, Journal of Nuclear Medicine, 56(8):1272-1277; y Vosjan y otros, 2010, Nat Protoc. 5(4):739-43. En algunas modalidades, el quelante está unido covalentemente a una molécula anfipática (directamente o a través de un enlazador). En otras modalidades, el quelante está unido covalentemente a una molécula de apolipoproteína (directamente o a través de un enlazador).
6.1.3.10. Inmunógenos
Los cargómeros pueden incluir uno o más inmunógenos tales como un antígeno o un ácido nucleico que codifica un antígeno. El antígeno puede ser un antígeno asociado con una reacción alérgica, por ejemplo, un polen, un veneno, caspa de animales, una espora de hongo, un alérgeno farmacológico o un alérgeno alimentario. El antígeno puede ser un autoantígeno, por ejemplo, un antígeno de lupus, un antígeno de esclerosis múltiple, un antígeno de artritis reumatoide, un antígeno de diabetes mellitus tipo I, un antígeno de enfermedad inflamatoria intestinal, un antígeno de tiroiditis o un antígeno de enfermedad celíaca.
El antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno basado en péptidos, un antígeno basado en proteínas, un antígeno basado en polisacáridos, un antígeno basado en sacáridos, un antígeno basado en lípidos, un antígeno basado en glicolípidos, un antígeno basado en ácidos nucleicos, un antígeno basado en organismos inactivados, un antígeno basado en un organismo atenuado, un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno de parásito, un antígeno derivado de un alérgeno o un antígeno tumoral.
Un antígeno basado en péptidos puede ser, por ejemplo, un péptido retroinverso (por ejemplo, como se describió en van Regenmortel y otros, 1998, Dev Biol Stand. 92:139-43).
En algunas modalidades, el antígeno es un autoantígeno, que es un antígeno inmunogénico o epítopo nativo de un mamífero y que puede estar implicado en la patogénesis de una enfermedad autoinmunitaria.
En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno viral. Los antígenos virales pueden aislarse de cualquier virus, que incluye, pero no se limita a, un virus de cualquiera de las siguientes familias virales:Arenaviridae, Arterivirus, Astroviridae, Baculoviridae, Badnavirus, Barnaviridae, Birnaviridae, Bromoviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Capillovirus, Carlavirus, Caulimovirus, Circoviridae, Closterovirus, Comoviridae, Coronaviridae (por ejemplo,coronavirus, como el virus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS)),Corticoviridae, Cystoviridae, Deltavirus, Diantovirus, Enamovirus, Filoviridae (por ejemplo,virus de Marburgo y virus del Ébola(por ejemplo,cepa Zaire, Reston, Costa de Marfil o Sudán)),Flaviridae, (por ejemplo,virus de la hepatitis C, virus del dengue 1, virus del dengue 2, virus del dengue 3 y virus del dengue 4),Hepadnaviridae, Herpesviridae (por ejemplo,Herpesvirus humano 1, 3, 4, 5 y 6, y Citomegalovirus),Hypoviridae, Iridoviridae, Leviviridae, Lipothrixviridae, Microviridae, Orthomyxoviridae (por ejemplo,Influenzavirus A y B y C),Papovaviridae, Paramixoviridae (por ejemplo,sarampión, paperas y virus respiratorio sincitial humano),Parvoviridae, Picornaviridae (por ejemplo,poliovirus, rinovirus, hepatovirus y aftovirus),Poxviridae (por ejemplo,vaccinia y virus de la viruela),Reoviridae(por ejemplo,rotavirus),Retroviridae (por ejemplo,lentivirus, como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) 1 y VIH 2),Rhabdoviridae(por ejemplo, virus de la rabia, virus del sarampión, virus sincitial respiratorio, etc.),Togaviridae(por ejemplo, virus de la rubéola, virus del dengue, etc.), yTotiviridae.Los antígenos virales adecuados también incluyen todo o parte de la proteína M del dengue, la proteína E del dengue, la D1NS1 del Dengue, la D1NS2 del Dengue y la D1NS3 del Dengue.
Los antígenos virales pueden derivarse de una cepa particular, tal como un virus del papiloma, un virus del herpes,es decirherpes simple 1 y 2; un virus de la hepatitis, por ejemplo, el virus de la hepatitis A (HAV), el virus de la hepatitis B (HBV), el virus de la hepatitis C (HCV), el virus delta de la hepatitis D (HDV), el virus de la hepatitis E (HEV) y el virus de la hepatitis G (HGV), los virus de la encefalitis transmitida por garrapatas; parainfluenza, varicela zoster, citomeglavirus, Epstein-Barr, rotavirus, rinovirus, adenovirus, coxsackievirus, encefalitis equina, encefalitis japonesa, fiebre amarilla, fiebre del Valle del Rift y coriomeningitis linfocítica.
En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno bacteriano. Los antígenos bacterianos pueden originarse a partir de cualquier bacteria, que incluye, pero no se limita a,Actinomyces, Anabaena, Bacillus, Bacteroides, Bdellovibrio, Bordetella, Borrelia, Campylobacter, Caulobacter, Chlamydia, Chlorobium, Chromatium, Clostridium, Corynebacterium, Cytophaga, Deinococcus, Escherichia, Francisella, Halobacterium, Heliobacter, Haemophilus, Hemophilus influenzatipo B (HIB),Hyphomicrobium, Legionella, Leptspirosis, Listeria, MeningococcusA, B y C,Methanobacterium, Micrococcus, Myobacterium, Mycoplasma, Myxococcus, Neisseria, Nitrobacter, Oscilatoria, Prochloron, Proteus, Pseudomonas, Phodospirillum, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Spirillum, Spirochaeta, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Sulfolobus, Thermoplasma, Thiobacillus,yTreponema, Vibrio,yYersinia.
En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno de parásito. Los antígenos de parásitos pueden obtenerse a partir de parásitos tales como Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Candida tropicalis, Nocardia asteroides, Rickettsia ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydial psittaci, Chlamydial trachomatis, Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis y Schistosoma mansoni. Estos incluyen antígenos de esporozoos, antígenos de plasmodios, tales como todo o parte de una proteína de circumsporozoito, una proteína de superficie de esporozoito, un antígeno de etapa hepática, una proteína asociada a la membrana apical o una proteína de superficie de merozoito.
En algunas modalidades, el antígeno es un alérgeno y un antígeno ambiental, tal como, pero no se limita a, un antígeno derivado de alérgenos naturales tales como alérgenos de polen (alérgenos de polen de árboles, hierbas, malas hierbas y gramíneas), alérgenos de insectos (alérgenos inhalados, saliva y veneno), alérgenos del pelo y la caspa de animales y alérgenos alimentarios. Los alérgenos importantes del polen de árboles, pastos y hierbas se originan en los órdenes taxonómicos de Fagales, Oleales, Pinales y platanáceas, que incluye el abedul(Betula),aliso(Alnus),avellana(Corilo),carpe(Carpino)y oliva(Olea),cedro(CriptomeriayEnebro),plátano(Platanus),el orden de Poales que incluye, es decir, gramíneas de losgénerosLolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale,ySorgo,los órdenes de Asterales y Urticales, que incluye, entre otras, hierbas de los génerosAmbrosía, Artemisia,yParietaria.Otros antígenos alérgenos que pueden usarse incluyen alérgenos de ácaros del polvo doméstico delgénerodermatofagoidesyeuroglifo,ácaro de almacenamientoporejemplo, Lepidoglyphys, GlycyphagusyTyrophagus,losde cucarachas, mosquitos y pulgasporejemplo, Blatella, Periplaneta, ChironomusyCtenocepphalides,losde mamíferos como gatos, perros y caballos, aves, alérgenos de veneno, que incluye los que se originan en insectos que muerden o pican, tal como los del orden taxonómico de Hymenoptera, que incluye las abejas (superfamilia Apidae), avispas (superfamilia Vespidea) y hormigas (superfamilia Formicoidae). Aún otros antígenos alérgenos que pueden usarse incluyen alérgenos por inhalación de hongos tales como los del géneroAlternaríayCladosporio.
En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno tumoral. El antígeno puede ser un antígeno tumoral, que incluye un antígeno asociado a un tumor o específico de un tumor o un fragmento peptídico que provoca una respuesta inmunitaria contra un antígeno asociado a un tumor o específico de un tumor. Ejemplos de antígenos asociados a tumores o específicos de tumores incluyen, pero no se limitan a, alfa-actinina-4, proteína de fusión Bcr-Abl, Casp-8, beta-catenina, cdc27, cdk4, cdkn2a, coa-1, proteína de fusión dek-can, EF2, proteína de fusión ETV6-AML1, proteína de fusión LDLR-fucosiltransferasaAS, HLA-A2, HLA-A11, hsp70-2, KIAAO205, Mart2, Mum-1, 2 y 3, neo-PAP, miosina clase I, OS-9, proteína de fusión pml-RARa, PTPRK, K-ras, N-ras, isómeros de triosafosfato, Bage-1, Gage 3,4,5,6,7, GnTV, Herv-K-mel, Lage-1, Mage-A1,2,3,4,6,10,12, Mage-C2, NA-88, NY-Eso-1/Lage-2, SP17, SSX-2 y TRP2-Int2, MelanA(MART-I), gp100(Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15(58), CEA, RAGE, NY-ESO (LAGS), SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, H-Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos del virus de Epstein Barr, EBN<a>, antígenos del virus del papiloma humano (VPH) E6 y E7, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p-Catenina, CDK4, Mum-1, p16, TAGE, PSMA, PSCA, CT7, telomerasa, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, a-fetoproteína, 13HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB\70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína de unión a Mac-2\asociada a la proteína ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP y TPS.
En algunas modalidades, el antígeno es PCSK9.
En algunas modalidades, el antígeno es melanoma gp100.
En algunas modalidades, el antígeno es un neoantígeno. El término neoantígeno se usa en la presente descripción para definir cualquier determinante antigénico expresado recientemente. Los neoantígenos pueden surgir tras un cambio conformacional en una proteína, como determinantes recién expresados (especialmente en las superficies de células transformadas o infectadas), como resultado de la formación de complejos de una o más moléculas o como resultado de la escisión de una molécula con un presentación resultante de nuevos determinantes antigénicos. Por tanto, como se usa en la presente, el término neoantígeno cubre antígenos que se expresan tras la infección(por ejemploinfección viral, infección por protozoos o infección bacteriana), en enfermedades mediadas por priones, una transformación celular (cáncer), en cuyo último caso el neoantígeno puede denominarse antígeno asociado a tumores.
La identificación de neoantígenos puede implicar la identificación de todas, o casi todas, las mutaciones en la neoplasia/tumor a nivel de ADN mediante el uso de la secuenciación del genoma completo, la secuenciación del exoma completo(por ejemplo,solo exones capturados), o la secuenciación del ARN del tumor contra las muestras de línea germinal coincidentes de cada paciente. En algunas modalidades, la identificación de neoantígenos implica analizar las mutaciones identificadas con uno o más algoritmos de predicción de unión de péptido-MHC para generar una pluralidad de candidatos de epítopos de células T de neoantígenos que se expresan dentro de la neoplasia/tumor y pueden unirse a los alelos HLA del paciente. En algunas modalidades, la identificación de neoantígenos implica sintetizar la pluralidad de candidatos de péptidos de neoantígenos que se seleccionaron de los conjuntos de todos los neo péptidos de marco de lectura abierto y péptidos de unión previstos para su usar en una vacuna contra el cáncer. Varias organizaciones de investigación por contrato ofrecen servicios de identificación de neoantígenos, que incluye Personalis (www.personalis.com), BGI (www.bgi.com) y Cancer Genetics Incorporated (www.cancergenetics.com).
En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno compartido,es decir,un antígeno sobreexpresado en células malignas pero que también existe en células no malignas.
En determinadas modalidades, el tamaño de una molécula de péptido neoantigénico o de una molécula de péptido antigénico compartido puede ser, por ejemplo, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39, aproximadamente 40, aproximadamente 41, aproximadamente 42, aproximadamente 43, aproximadamente 44, aproximadamente 45, aproximadamente 46, aproximadamente 47, aproximadamente 48, aproximadamente 49, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120 o más residuos de moléculas de amino, y cualquier intervalo que se derive de estos. En modalidades específicas, las moléculas peptídicas neoantigénicas o antigénicas compartidas son iguales o menores que 50 aminoácidos. En algunas modalidades, las moléculas peptídicas neoantigénicas o peptídicas antigénicas compartidas son iguales a aproximadamente 10 a 30 aminoácidos. En algunas modalidades, las moléculas peptídicas neoantigénicas o las moléculas peptídicas antigénicas compartidas son iguales a aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos. En una modalidad preferida, las moléculas peptídicas neoantigénicas o las moléculas peptídicas antigénicas compartidas son iguales a aproximadamente 20 a aproximadamente 30 aminoácidos.
Los cargómeros pueden incluir uno o más péptidos neoantigénicos. En algunas modalidades, un cargómero comprende un péptido neoantigénico. En algunas modalidades, un cargómero comprende dos péptidos neoantigénicos. En algunas modalidades, un cargómero comprende al menos 5 o más péptidos neoantigénicos. En algunas modalidades, un cargómero comprende al menos aproximadamente 6, aproximadamente 8, aproximadamente 10, aproximadamente 12, aproximadamente 14, aproximadamente 16, aproximadamente 18 o aproximadamente 20 péptidos distintos. En algunas modalidades, un cargómero comprende al menos 20 péptidos distintos.
Los cargómeros pueden incluir uno o más péptidos antigénicos compartidos. En algunas modalidades, un cargómero comprende un péptido antigénico compartido. En algunas modalidades, un cargómero comprende dos péptidos antigénicos compartidos. En algunas modalidades, un cargómero comprende al menos 5 o más péptidos antigénicos compartidos. En algunas modalidades, un cargómero comprende al menos aproximadamente 6, aproximadamente 8, aproximadamente 10, aproximadamente 12, aproximadamente 14, aproximadamente 16, aproximadamente 18 o aproximadamente 20 péptidos distintos. En algunas modalidades, un cargómero comprende al menos 20 péptidos distintos.
Los péptidos neoantigénicos y antigénicos compartidos, polipéptidos y análogos pueden modificarse además de modo que contengan restos químicos adicionales que normalmente no forman parte de la proteína. Esos restos derivatizados pueden mejorar la solubilidad, la vida media biológica, la absorción de la proteína o la afinidad de unión. Los restos pueden también reducir o eliminar cualquier efecto secundario conveniente de las proteínas y similares. Puede encontrarse una descripción general de estos restos en Allen y otros, eds., 2012, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22ma edición, Pharmaceutical Press, Londres, UK. Por ejemplo, los péptidos y polipéptidos neoantigénicos y compartidos que tienen la actividad deseada pueden modificarse según sea necesario para proporcionar determinados atributos deseados,por ejemplocaracterísticas farmacológicas mejoradas, mientras se aumenta o al menos se retiene sustancialmente toda la actividad biológica del péptido no modificado para unirse a la molécula de MHC deseada y activar la célula T apropiada. Por ejemplo, los péptidos neoantigénicos o antigénicos compartidos y polipéptidos pueden estar sujetos a diversos cambios, tales como sustituciones, ya sean conservadoras o no conservadoras, donde tales cambios podrían proporcionar determinadas ventajas en su uso, tales como una unión al MHC mejorada. Dichas sustituciones conservadoras pueden abarcar la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido que sea biológica y/o químicamente similar,por ejemplo,un residuo hidrófobo por otro, o un residuo polar por otro. El efecto de las sustituciones de un único aminoácido también se puede analizar mediante el uso de D-aminoácidos. Dichas modificaciones pueden realizarse mediante el uso de procedimientos de síntesis de péptidos bien conocidos.
En algunas modalidades, los péptidos neoantigénicos o antigénicos compartidos y polipéptidos pueden modificarse con agentes de enlace con el propósito de facilitar la formación de complejos con el cargómero. La descripción no se limita a un tipo o clase particular de agente de enlace. En algunas modalidades, el agente de enlace es una molécula de cisteína-serina-serina (CSS).
En algunas modalidades en donde el péptido neoantigénico o antigénico compartidos o polipéptido se modifica con CSS, el cargómero se modifica adicionalmente con dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[3-(2-piridilditio)propionato](DOPE- PDP) en donde tras la mezcla, el DOPE-PDP y el CSS se acoplan de esta manera dando como resultado un complejo (enlace) del CSS-Ag con el cargómero.
Los péptidos y polipéptidos neoantigénicos o antigénicos compartidos también puede modificarse al extender o disminuir la secuencia de aminoácidos del compuesto,por ejemplo,mediante la adición o eliminación de aminoácidos. Los péptidos neoantigénicos o antigénicos compartidos, polipéptidos o análogos también pueden modificarse mediante la alteración del orden o la composición de determinados residuos. El experto apreciará que determinados residuos de aminoácidos esenciales para la actividad biológica,por ejemplo,aquellos en sitios de contacto críticos o residuos conservados, generalmente no pueden alterarse sin un efecto adverso sobre la actividad biológica. Los aminoácidos no críticos no necesitan limitarse a los que se encuentran naturalmente en las proteínas, tales como los L-a-aminoácidos, o sus isómeros D, pero pueden incluir aminoácidos no naturales, tales como p-Y-6-aminoácidos, así como también muchos derivados de L-a-aminoácidos. Los aminoácidos no críticos pueden diseñarse de modo que el péptido sea un sustrato para una proteasa, que puede promover la liberación del péptido dentro de las células. Los residuos de cisteína en aminoácidos no críticos (por ejemplo, que se añaden al extremo N o al extremo C) pueden facilitar el acoplamiento a un anclaje(por ejemplo,un esterol, fosfolípido o ácido graso). Dichos péptidos pueden liberarse en un entorno reductor.
Típicamente, un polipéptido o péptido neoantigénico o antigénico compartido puede optimizarse mediante el uso de una serie de péptidos con sustituciones de un único aminoácido para determinar el efecto de la carga electrostática, la hidrofobicidad, etc. sobre la unión al MHC. Por ejemplo, puede realizarse una serie de sustituciones de aminoácidos cargados positivamente(por ejemplo,Lys o Arg) o cargados negativamente(por ejemplo,Glu) a lo largo de la longitud del péptido, lo que revela diferentes patrones de sensibilidad hacia diversas moléculas de MHC y receptores de células T. Además, pueden emplearse múltiples sustituciones mediante el uso de restos pequeños, relativamente neutros tales como Ala, Gly, Pro o residuos similares. Las sustituciones pueden ser homooligómeros o heterooligómeros. El número y los tipos de residuos que se sustituyen o añaden dependen de la separación necesaria entre los puntos de contacto esenciales y determinados atributos funcionales que se buscan (por ejemplo, hidrofobicidad versus hidrofilicidad). Estas sustituciones también pueden aumentar la afinidad de unión a una molécula de MHC o un receptor de células T, en comparación con la afinidad del péptido original. En cualquier caso, tales sustituciones deberían emplear residuos de aminoácidos u otros fragmentos moleculares elegidos para evitar, por ejemplo, interferencia estérica y de carga que podría alterar la unión. Típicamente, las sustituciones de aminoácidos son de residuos únicos. Pueden combinarse sustituciones, eliminaciones, inserciones o cualquiera de sus combinaciones para llegar a un péptido final.
Un experto en la técnica apreciará que hay una variedad de formas de producir dichos neoantígenos o antígenos compartidos específicos de tumores. En general, dichos neoantígenos y antígenos compartidos específicos de tumores pueden producirse ya seain vitrooin vivo.Se pueden producir neoantígenos y antígenos compartidos específicos de tumoresin vitrocomo péptidos o polipéptidos, que luego pueden formularse en una vacuna contra neoplasia personalizada y administrarse aun sujeto. Dicha producción in vitro puede producirse mediante una variedad de métodos conocidos por un experto en la técnica tales como, por ejemplo, síntesis de péptidos o expresión de un péptido/polipéptido a partir de una molécula de ADN o ARN en cualquiera de una variedad de sistemas de expresión bacterianos, eucariotas o de virus recombinantes, seguido de la purificación del péptido/polipéptido expresado.
Alternativamente, los neoantígenos específicos de tumores pueden producirsein vivomediante la introducción de moléculas(por ejemplo,ADN, ARN, sistemas de expresión viral y similares) que codifican neoantígenos específicos de tumores en un sujeto, con lo cual se expresan los neoantígenos específicos de tumores codificados.
En algunas modalidades, los cargómeros pueden comprender uno o más neoantígenos(por ejemplo,un péptido de 10 a 30 residuos de aminoácidos) que se identificó en sujetos que tienen cáncer de esófago unido a un anclaje(por ejemplo,un esterol, un fosfolípido o un ácido graso) que puede usarse, por ejemplo, para tratar el cáncer de esófago(por ejemplo,adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas u otros). El uno o más neoantígenos pueden unirse directamente a un anclaje o a través de un enlazador,por ejemplo,como se describió en la sección 6.1.5.
En algunas modalidades, los cargómeros pueden comprender uno o más neoantígenos(por ejemplo,un péptido de 10 a 30 residuos de aminoácidos) que se identificó en sujetos con cáncer de páncreas unido a un anclaje(por ejemplo,un esterol, un fosfolípido o un ácido graso), que pueden usarse, por ejemplo, para tratar el cáncer de páncreas. El uno o más neoantígenos pueden unirse directamente a un anclaje o a través de un enlazador,por ejemplo,como se describió en la sección 6.1.5.
En algunas modalidades, los cargómeros pueden comprender uno o más antígenos compartidos(por ejemplo,un péptido de 10 a 30 residuos de aminoácidos) que se identificó en sujetos que tienen cáncer(puede usarsecáncer de páncreas) unido a un anclaje(por ejemplo,un esterol, un fosfolípido o un ácido graso), que puede usarse, por ejemplo, para tratar sujetos que tienen cáncer(por ejemplo,cáncer de páncreas). El uno o más antígenos compartidos pueden unirse directamente a un anclaje o a través de un enlazador,por ejemplo,como se describió en la sección 6.1.5.
En algunas modalidades, los cargómeros pueden comprender uno o más neoantígenos(por ejemplo,un péptido de 10 a 30 residuos de aminoácidos) que se identificó en sujetos con cáncer de páncreas unido a un anclaje(por ejemplo,un esterol, un fosfolípido o un ácido graso), que pueden usarse, por ejemplo, para tratar el cáncer de páncreas. El uno o más neoantígenos pueden unirse directamente a un anclaje o a través de un enlazador,por ejemplo,como se describió en la sección 6.1.5.
En algunas modalidades, los cargómeros pueden comprender uno o antígenos(por ejemplo,un péptido de 10 a 30 residuos de aminoácidos) de una proteína RAS mutada (por ejemplo, KRAS, HRAs o NRAs ) unida a un anclaje(por ejemplo,un esterol, un fosfolípido o un ácido graso), que pueden usarse, por ejemplo, para tratar el cáncer de páncreas. El uno o más antígenos pueden unirse directamente a un anclaje o a través de un enlazador,por ejemplo,como se describió en la sección 6.1.5.
Las proteínas o péptidos pueden prepararse mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica, que incluye la expresión de proteínas, polipéptidos o péptidos a través de técnicas de biología molecular estándar, el aislamiento de proteínas o péptidos de fuentes naturales, o la síntesis química de proteínas o péptidos. Las secuencias de nucleótidos y proteínas, polipéptidos y péptidos correspondientes a diversos genes se divulgaron previamente y pueden encontrarse en bases de datos computarizadas conocidas por los expertos en la técnica. Una de dichas bases de datos es las bases de datos Genbank y GenPept del Centro Nacional de Información Biotecnológica ubicadas en el sitio web de los Institutos Nacionales de Salud. Las regiones codificantes de genes conocidos pueden amplificarse y/o expresarse mediante el uso de las técnicas que se describen en la presente descripción o como sabrían los expertos en la técnica. Alternativamente, los expertos en la técnica conocen diversas preparaciones comerciales de proteínas, polipéptidos y péptidos.
Los antígenos pueden proporcionarse como antígenos únicos o pueden proporcionarse en combinación. Los antígenos también pueden proporcionarse como mezclas complejas de polipéptidos o ácidos nucleicos.
6.1.4. Anclajes
Un resto de carga puede unirse covalentemente a un resto anfipático o apolar para facilitar el acoplamiento del resto de carga a un cargómero. Los restos anfipáticos y apolares pueden interactuar con regiones apolares en los cargómeros, anclando de esta manera los restos de carga unidos a los restos anfipáticos y apolares a los cargómeros.
Los restos anfipáticos que pueden usarse como anclajes incluyen lípidos(por ejemplo,como se describió en la sección 6.1.2.1) y ácidos grasos(por ejemplo,como se describió en la sección 6.1.2.3). En algunas modalidades, los anclajes comprenden un esterol o un derivado de esterol, por ejemplo, un esterol vegetal, un esterol animal o un derivado de esterol tal como una vitamina). Por ejemplo, los esteroles tal como el colesterol pueden unirse covalentemente a un resto de carga(por ejemplo,a través del grupo hidroxilo en la posición 3 del anillo A del esterol) y se usa para anclar el resto de carga a un cargómero. Los restos apolares que pueden usarse como anclajes incluyen cadenas de alquilo, cadenas de acilo y cadenas de diacilo. Los restos de carga pueden unirse covalentemente a restos de anclaje directa o indirectamente a través de un enlazador(por ejemplo,a través de un péptido difuncional u otro enlazador que se describió en la sección 6.1.5). Los restos de carga que son biológicamente activos pueden retener su actividad biológica mientras están unidos covalentemente al anclaje (o al enlazador unido al anclaje), mientras que otros pueden requerir la escisión del enlace covalente(por ejemplo, mediante hidrólisis) uniendo el resto de carga al anclaje (o enlazador unido al anclaje) para recuperar la actividad biológica.
6.1.5. Enlazadores
Los enlazadores comprenden una cadena de átomos que unen covalentemente restos de carga a otros restos en un cargómero, que incluye a las moléculas de apolipoproteína, moléculas anfipáticas y anclajes. Un número de moléculas enlazadoras están disponibles comercialmente, por ejemplo de ThermoFisher Scientific. Los expertos en la técnica conocen bien los enlazadores adecuados e incluyen, pero no se limitan a, enlazadores de carbono de cadena lineal o ramificada, enlazadores de carbono heterocíclicos o enlazadores peptídicos. Un enlazador puede ser un enlazador bifuncional, que es homobifuncional o heterobifuncional.
Los enlazadores adecuados incluyen enlazadores escindibles y no escindibles.
Un enlazador puede ser un enlazador escindible, que facilita la liberación de un resto de cargain vivo.Los enlazadores escindibles incluyen enlazadores lábiles a los ácidos(por ejemplo,que comprende hidrazina o cis-aconitilo), sensible a proteasas(por ejemplo,sensibles a peptidasa), enlazadores fotolábiles o enlazadores que contienen disulfuro (Chari y otros, 1992, Cancer Research 52:127-131; patente de Estados Unidos núm. 5,208,020). Un enlazador escindible típicamente es susceptible de escisión bajo condiciones intracelulares. Los enlazadores escindibles adecuados incluyen, por ejemplo, un enlazador peptídico escindible por una proteasa intracelular, tal como una proteasa lisosomal o una proteasa endosomal. En modalidades ilustrativas, el enlazador puede ser un enlazador dipéptido, tal como un enlazador valina-citrulina (val-cit), una fenilalanina-lisina (phe-lys) o un enlazador serina-serina.
Un enlazador escindible puede ser sensible al pH,es decir,sensible a la hidrólisis a determinados valores de pH. Típicamente, un enlazador sensible al pH es hidrolizable bajo condiciones ácidas. Por ejemplo, puede usarse un enlazador sensible a ácidos que es hidrolizable en el lisosoma(por ejemplo,una hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal o similares). (Ver,por ejemplo,las patentes de Estados Unidos núms. 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville y otros, 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661). Dichos enlazadores son relativamente estables bajo condiciones de pH neutro, tal como el de la sangre, pero son inestables a un pH por debajo de 5,5 o 5,0, el pH aproximado del lisosoma. En determinadas modalidades, el enlazador hidrolizable es un enlazador tioéter (tal como,por ejemplo,un tioéter unido al resto de carga a través de un enlace acil-hidrazona (ver,por ejemplo,lapatente de Estados Unidos núm. 5,622,929).
En algunas modalidades, el enlazadores escindible bajo condiciones reductoras(por ejemplo,un enlazador disulfuro). Se conoce una variedad de enlazadores disulfuro en la técnica, que incluyen, por ejemplo, los que pueden formarse mediante el uso de SATA (5-acetiltioacetato de N-succinimidilo), SPDP (3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo), SPDB (3-(2-piridilditio)butirato de N-succinimidilo) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridilditio)tolueno), SPDB y SMPT (ver,por ejemplo,Thorpe y otros, 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak y otros, en Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C.W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Ver también, la patente de Estados Unidos núm. 4,880,935).
En algunas modalidades, el enlazador es escindible mediante un agente de escisión,por ejemplo,una enzima, que está presente en el entorno intracelular(por ejemplo,dentro de un lisosoma o endosoma o caveola). El enlazador puede serpor ejemplo,un enlazador de peptidilo que se escinde mediante una enzima peptidasa o proteasa intracelular, que incluye, pero no se limita a, una proteasa lisosomal o endosomal. En algunas modalidades, el enlazador de peptidilo es al menos de dos aminoácidos de longitud de al menos dos aminoácidos o al menos tres aminoácidos de longitud. Los agentes de escisión pueden incluir catepsinas B y D y plasmina, todos los cuales se sabe que hidrolizan los derivados del fármaco dipeptídico lo que resulta en la liberación del fármaco activo dentro de las células diana (ver,por ejemplo,Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). En algunas modalidades, el enlazador de peptidilo escindible mediante una proteasa intracelular es un enlazador de Val-Cit o un enlazador de Phe-Lys.
En algunas modalidades, el enlazador es un enlazador de malonato (Johnson y otros, 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), un enlazador maleimidobenzoilo (Lau y otros, 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), o un análogo de 3'-N-amida (Lau y otros, 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1305-12).
En otras modalidades, la unidad enlazadora no se puede escindir y el resto de carga se libera, por ejemplo, mediante degradación del cargómero. Los enlazadores no escindibles ilustrativos incluyen maleimidocaproilo, 4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato de N-succinimidilo (SMCC) y 4-(yodoacetil)-aminobenzoato de N-succinimidilo (SlAB).
6.2. Composiciones que comprenden cargómeros
La descripción proporciona composiciones que comprenden cargómeros de la descripción. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir cargómeros y uno o más portadores, excipientes, diluyentes o una de sus combinaciones farmacéuticamente aceptables. Los cargómeros de la descripción también pueden incluirse en una composición de vacuna que comprende cargómeros y uno o más portadores, diluyentes, excipientes, adyuvantes farmacéuticamente aceptables o una de sus combinaciones. Los cargómeros de la descripción también pueden incluirse en una composición de diagnóstico que comprende cargómeros y uno o más portadores, diluyentes, excipientes o una de sus combinaciones que sean adecuados para uso diagnóstico.
Los portadores ilustrativos incluyen solventes o medios de dispersión que contienen, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. Los diluyentes ilustrativos incluyen agua para inyección, solución salina, soluciones tamponadas tales como solución salina tamponada con fosfato y soluciones de azúcares tales como soluciones de sacarosa o dextrano. Los excipientes ilustrativos incluyen rellenos, aglutinantes, desintegrantes, solventes, agentes solubilizantes y agentes colorantes. Los excipientes ilustrativos también incluyen moléculas cargadas positivamente tales como, pero no se limita a, lisina, arginina, ornitina, poli-lisina, poli-arginina, poli-ornitina, poli-lis-arg y poli-lis-orn.
Los adyuvantes ilustrativos incluyen CPG, polilC, poli-ICLC, 1018 ISS, sales de aluminio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, monofosforil lípido A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel. RTM, sistema vectorial, micropartículas de PLGA, imiquimod, resiquimod, gardiquimod, 3M-052, SRL172, virosomas y otras partículas similares a virus, YF-17D, VEGF trap, betaglucano, Pam3Cys, QS21 stimulon de Aquila, vadimezan y AsA404 (DMXAA).
Las composiciones de la descripción pueden formularse de acuerdo con técnicas que se conocen en la técnica(por ejemplo,como se describió en Allen y otros, eds., 2012, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22a edición, Pharmaceutical Press, Londres, Reino Unido.). Por ejemplo, las composiciones pueden formularse para inyección subcutánea, intradérmica, intravenosa o intraperitoneal(por ejemplo,como solución), inhalación (inhalación intranasal o intrapulmonar), implantación(por ejemplo,como supositorio), administración ocular o intraocular(por ejemplo,mediante gotas para los ojos).
En algunas modalidades, las composiciones se envasan en cantidades de dosificación unitarias adecuadas para la administración. Por ejemplo, en algunas modalidades, las composiciones comprenden cantidades de dosificación unitaria de cargómeros secos (por ejemplo liofilizados) que se envasan en viales sellados. Dichas composiciones son adecuadas para la reconstitución con agua, solución fisiológica (tal como solución salina) o tampón y la administración mediante inyección. Dichas composiciones pueden incluir opcionalmente uno o más agentes antiaglomerantes y/o antiaglutinantes para facilitar la reconstitución de los cargómeros, o uno o más agentes tampón, agentes de isotonicidad (por ejemplo, sacarosa y/o manitol), azúcares o sales (por ejemplo, cloruro de sodio) diseñado para ajustar el pH, la osmolalidad y/o la salinidad de la suspensión reconstituida. Las composiciones que se describieron anteriormente pueden fabricarse en condiciones que minimicen la oxidación, reduciendo de esta manera el riesgo de efectos secundarios, tales como daño hepático, causado por productos oxidados. Por ejemplo, las composiciones pueden fabricarse bajo un gas inerte, tal como nitrógeno, helio o argón.
Los cargómeros también pueden formularse en composiciones farmacéuticas para liberación controlada. Como se usa en la presente, "liberación controlada" se refiere a la liberación de un resto de carga de una formulación a una velocidad en la que la concentración en sangre del resto de carga en un individuo se mantiene dentro del intervalo terapéutico durante un período prolongado, durante un período de tiempo del orden de horas, días, semanas o más. Los cargómeros pueden formularse en una matriz controlada bioerosionable o no bioerosionable, algunas de las cuales se conocen bien en la técnica. Una matriz de liberación controlada puede incluir un polímero o copolímero sintético, por ejemplo en forma de hidrogel. Ejemplos de dichos polímeros incluyen poliésteres, poliortoésteres, polianhídridos, polisacáridos, poli(fosfoésteres), poliamidas, poliuretanos, poli(imidocarbonatos) y poli(fosfacenos), y polilactida-co-glicolida (PLGA), un copolímero de poli(ácido láctico) y poli(ácido glicólico). También pueden usarse materiales que contienen colágeno, albúmina y fibrinógeno.
Preferentemente, las composiciones de la descripción contienen solo una pequeña cantidad de moléculas anfipáticas que están en forma no complejada, apolipoproteína y restos de carga. En algunas modalidades, no más del 20 % de las moléculas anfipáticas en la composición están en forma no complejada. En otras modalidades, no más del 10 % de las moléculas anfipáticas están en forma no complejada. Aún en otras modalidades, no más del 5 % de las moléculas anfipáticas están en forma no acomplejada. Aún en otras modalidades, no más del 2 % de las moléculas anfipáticas están en forma no complejada.
La homogeneidad de los cargómeros y las composiciones de las descripciones puede medirse mediante cromatografía de permeación en gel. Una composición altamente homogénea generalmente tendrá un pico principal correspondiente a los cargómeros y, posiblemente, uno o más picos secundarios correspondientes a uno o más de proteínas libres, moléculas anfipáticas libres y restos de carga libres. También pueden observarse picos secundarios correspondientes a cargómeros o complejos de diferente tamaño a los cargómeros del pico principal. El área del pico principal en un cromatograma de permeación en gel con relación al área total de los picos principal y secundario determina el por ciento de homogeneidad de una composición. En algunas modalidades, las composiciones de la descripción son al menos 75 % homogéneas. En otras modalidades, las composiciones de la descripción son al menos 85 % homogéneas. En otras modalidades, las composiciones de la descripción son al menos 95 % homogéneas. Aún en otras modalidades, las composiciones de la descripción son al menos 98 % homogéneas.
En algunas modalidades, la homogeneidad de los cargómeros en las composiciones de la descripción(es decir,el área del pico principal con respecto al área total de los picos principal y secundario correspondientes a cargómeros que tienen tanto apolipoproteína como moléculas anfipáticas) es al menos 75 %. En otras modalidades, los cargómeros en las composiciones de la descripción son al menos 85 % homogéneos. En otras modalidades, los cargómeros en las composiciones de la descripción son al menos 95 % homogéneos. En otras modalidades, los cargómeros en las composiciones de la descripción son al menos 98 % homogéneos.
En las composiciones de la descripción, los complejos de lipoproteínas que (a) tienen radios de Stokes superiores a 2 nm o 3,4nm(por ejemplo,como se determinó por cromatografía de permeación en gel) y/o (b) son discoidales y/o (c) tienen una relación molar de apolipoproteína:molécula anfipática de 1:8 o mayor, si están presentes, preferentemente no representan más del 10 % de la apolipoproteína en la composición en base al peso. En algunas modalidades, dichos complejos representan no más del 5 % de la apolipoproteína en la composición en peso. En algunas modalidades, dichos complejos representan no más del 2 % de la apolipoproteína en la composición en peso. En algunas modalidades, las composiciones están libres de complejos de lipoproteínas detectables que (a) tienen radios de Stokes superiores a 3,4 nm y/o (b) son discoidales y/o (c) tienen una relación molar de apolipoproteína:molécula anfipática de 1:8 o mayor cuando las composiciones se someten a cromatografía de permeación en gel bajo condiciones capaces de resolver dichos complejos. Preferentemente, las composiciones de la descripción están libres de complejos de lipoproteínas que tienen un radio de Stokes superior a 3,25 nm.
La identidad y cantidad de moléculas de lipoproteínas en una composición de cargómeros puede determinarse, por ejemplo, mediante espectrometría de masas (ver, por ejemplo, Zhang y otros, 2010, Methods Mol Biol. 673: 211-222) y en particular FT-MS o por RMN. La identidad y cantidad de moléculas anfipáticas en una composición de cargómeros puede determinarse, por ejemplo, mediante cromatografía en capa delgada (ver,por ejemplo,Clogston y Patri, 2011, Methods Mol Biol. 697:109-17). La presencia de partículas discoidales en una composición de cargómeros puede determinarse, por ejemplo, mediante el uso de espectroscopía de RMN.
6.3. Usos de los cargómeros
Los siguientes métodos y usos deben interpretarse como que se dirigen a los cargómeros para su uso en dichos métodos y usos.
6.3.1. Usos terapéuticos de los cargómeros
Los cargómeros y las composiciones farmacéuticas de la descripción pueden usarse para tratar a un sujeto por una enfermedad o afección tratable con el uno o más restos de carga. Por ejemplo, puede usarse un cargómero que tiene un resto de carga que es un agente anticancerígeno para tratar a un sujeto que padece cáncer. Los métodos de tratamiento pueden comprender administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un cargómero o una composición farmacéutica que contiene el cargómero al sujeto solo o en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de un segundo cargómero de la descripción o composición que comprende el segundo cargómero(por ejemplo,una segunda composición farmacéutica o una composición de vacuna). Preferentemente, el cargómero y el segundo cargómero comprenden diferentes restos de carga. El cargómero y el segundo cargómero (o composiciones de los mismos) pueden administrarse de forma secuencial o simultánea. Cuando se administran simultáneamente, los cargómeros que tienen diferentes restos de carga pueden formularse en una única composición o formularse en dos composiciones separadas.
Los cargómeros y las composiciones farmacéuticas de cargómero pueden administrarse a un sujeto de acuerdo con cualquier régimen de administración adecuado, por ejemplo, semanalmente, dos veces por semana o diariamente. Los cargómeros y las composiciones farmacéuticas de cargómero pueden administrarse durante un número determinado de dosis(por ejemplo, 1a 24 dosis, 1 a 12 dosis o 12 a 24 dosis), tal como cuando los cargómeros contienen un agente antiinfeccioso, o pueden administrarse hasta que desaparezca una enfermedad o afección que padece el sujeto. En algunas modalidades, la administración de un cargómero o una composición farmacéutica de cargómero puede repetirse después de verificar que un marcador biológico de una enfermedad o afección regresó.
Los cargómeros que comprenden un inmunógeno y composiciones de vacuna de la descripción pueden usarse para inmunizara un sujeto (o inducirtolerancia a un antígeno en un sujeto) mediante la administración una cantidad efectiva de dicho cargómero o composición de vacuna al sujeto. Los métodos para inmunizar a un sujeto pueden comprender administrar una cantidad efectiva del cargómero o composición de vacuna sola o en combinación con una cantidad efectiva de un segundo cargómero de la descripción o composición que comprende el segundo cargómero. Preferentemente, el cargómero y el segundo cargómero comprenden diferentes restos de carga. El cargómero y el segundo cargómero (o composiciones de los mismos) pueden administrarse de forma secuencial o simultánea. Cuando se administran simultáneamente, los cargómeros que tienen diferentes restos de carga pueden formularse en una única composición o formularse en dos composiciones separadas.
Los cargómeros configurados para activar una respuesta inmunitaria y las composiciones de vacunas que contienen dichos cargómeros son útiles para tratar a un sujeto que tiene o está predispuesto a cualquier enfermedad o trastorno para el cual el sistema inmunitario del sujeto genera una respuesta inmunitaria. Las composiciones son útiles como vacunas profilácticas, que confieren resistencia a un sujeto a la exposición subsecuente a agentes infecciosos. Las composiciones también son útiles como vacunas terapéuticas, que pueden usarse para iniciar o potenciar la respuesta inmunitaria de un sujeto a un antígeno preexistente, tal como un antígeno tumoral en un sujeto con cáncer, o un antígeno viral en un sujeto infectado con un virus. Por ejemplo, los sujetos que tienen o corren riesgo de padecer cáncer tal como cáncer de esófago pueden tratarse con un cargómero que contiene un péptido neoantígeno. Como otro ejemplo, los sujetos que tienen o corren riesgo de padecer un cáncer tal como cáncer de páncreas pueden tratarse con un cargómero que contiene un péptido antigénico compartido. Los péptidos antigénicos compartidos ilustrativos incluyen péptidos de una proteína RAS mutada (por ejemplo, KRAS, HRAS o NRAS) y péptidos que se derivan de la misma, por ejemplo, péptidos que comprenden una secuencia peptídica de neoantígeno y una secuencia de aminoácidos de extremo N o extremo C añadida, útil para el acoplamiento del péptido a una molécula anfipática o anclaje. En las SEQ ID NO:15-28 se muestran péptidos ilustrativos basados en antígenos compartidos que pueden incluirse en los cargómeros de la descripción.
Las composiciones también son útiles como vacunas desensibilizantes, que funcionan para hacer que un individuo sea tolerante a un antígeno ambiental, tal como un alérgeno.
Los cargómeros que comprenden un péptido neoantigénico pueden usarse para inducir una respuesta inmunitaria específica de neoplasia/tumor en un sujeto, vacunar contra una neoplasia/tumor, tratar y/o aliviar un síntoma de cáncer en un sujeto mediante la administración al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de dicho cargómero o una composición de vacuna que comprende el cargómero. Dichos cargómeros y composiciones de vacuna pueden usarse para un sujeto al que se le diagnosticó cáncer o que está en riesgo de desarrollar cáncer. En algunas modalidades, el sujeto tiene un tumor sólido tal como mama, ovario, próstata, pulmón, riñón, gástrico, esofágico, colon, testicular, cabeza y cuello, páncreas, cerebro, melanoma y otros tumores de órganos tisulares y tumores hematológicos, tales como linfomas y leucemias, que incluye leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica de células T y linfomas de células B. El cargómero o composición de vacuna puede administrarse en una cantidad suficiente para inducir una respuesta de CTL, sola o en combinación con otros agentes terapéuticos(por ejemplo,un agente quimioterapéutico o bioterapéutico, radiación, inmunoterapia o un agente antiinmunosupresor o inmunoestimulante). Por ejemplo, a un sujeto que tiene melanoma puede administrarse un cargómero o composición de vacuna de la descripción en combinación con otro agente terapéutico usado para tratar el melanoma (por ejemplo, aldesleucina, cobimetinib, dabrafenib, dacarbazina, talimogén laherparepvec, interferón alfa-2b recombinante, ipilimumab, pembrolizumab, trametinib, nivolumab, peginterferón alfa-2a, peginterferón alfa-2b u orvemurafenib).
En algunas modalidades, un cargómero o composición de vacuna de la descripción se administra a un sujeto que se diagnosticó con cáncer o en riesgo de desarrollar cáncer en combinación con un agente de inmunoterapia. Los agentes de inmunoterapia ilustrativos incluyen alemtuzumab, atezolizumab, ipilimumab, ofatumumab, nivolumab, pembrolizumab, rituximab y rurvalumab.
En algunas modalidades, un cargómero o composición de vacuna de la descripción se administra a un sujeto que se diagnosticó con cáncer o en riesgo de desarrollar cáncer en combinación con un agente de inmunoterapia que es un inhibidor de punto de control. Los inhibidores de puntos de control ilustrativos incluyen atezolizumab, ipilimumab, pembrolizumab y nivolumab.
En algunas modalidades, un cargómero o composición de vacuna de la descripción se administra a un sujeto que se diagnosticó con cáncer o en riesgo de desarrollar cáncer en combinación con un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) que comprende un agente anticancerígeno (por ejemplo, como se describió en la sección 6.1.3.2). Los ADC ilustrativos incluyen gemtuzumab ozogamicina (aprobado para tratar la leucemia mieloide aguda), brentuximab vedotina (aprobado para tratar el linfoma de Hodgkin), trastuzumab emtansina (aprobado para tratar el cáncer de mama metastásico HER2 positivo) e inotuzumab ozogamicina (aprobado para tratar la leucemia linfoblástica aguda).
Los sujetos con o en riesgo de padecer afecciones inmunosupresoras pueden tratarse terapéutica o profilácticamente con cargómeros que se configuran para activar una respuesta inmunitaria como se describe en la presente descripción. Los cargómeros que se describen en la presente descripción pueden usarse para el tratamiento de enfermedades que se caracterizan por inmunosupresión, que incluyen, pero no se limita a, SIDA o complejos relacionados con el SIDA, inmunosupresión idiopática, inmunosupresión inducida por fármacos, otras afecciones inducidas por virus o por el medio ambiente, y determinadas deficiencias inmunitarias congénitas. Dichos cargómeros también pueden emplearse para aumentar la función inmunitaria que se afectó por el uso de radioterapia de fármacos inmunosupresores (por ejemplo, determinados agentes quimioterapéuticos) y, por lo tanto, pueden ser particularmente útiles cuando se usan junto con dichos fármacos o radioterapia.
Los sujetos con o en riesgo de enfermedad coronaria y/o niveles elevados de LDL-C pueden tratarse terapéutica o profilácticamente con cargómeros que se configuran para activar una respuesta inmunitaria como se describe en la presente descripción. Las modalidades de la descripción en donde los cargómeros incluyen un antígeno PCSK9 y un adyuvante CpG abordan dichas necesidades. De hecho, la vacunación contra PCSK9 con dichos cargómeros puede usarse para inhibir la interacción entre PCSK9 y LDLR, mientras evita al mismo tiempo la necesidad de inyecciones repetidas de AcM costosos.
Los sujetos que tienen o corren riesgo de sufrir una enfermedad coronaria y/o niveles elevados de LDL-C pueden tratarse con un cargómero que contiene un ARNip contra un gen PCSK9 y/o un gen ApoB.
Los sujetos que tienen o corren riesgo de padecer la enfermedad de Huntington pueden tratarse con un cargómero que contiene un ARNip contra un gen disfuncional de la huntingtina.
Los sujetos que tienen o corren riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer pueden tratarse con un cargómero que contiene un ARNip contra un gen de la proteína precursora de amiloide.
Los cargómeros y las composiciones pueden administrarse en los métodos de la descripción a un sujeto (que es preferentemente un mamífero y con la máxima preferencia un ser humano) por cualquier ruta adecuada. Por ejemplo, la administración puede ser mediante inyección(por ejemplo,inyección subcutánea, intradérmica, intravenosa o intraperitoneal), inhalación(por ejemplo,inhalación intranasal o intrapulmonar, implantación, opcionalmente(por ejemplo,a través de un supositorio), o por vía ocular o intraocular(por ejemplo,mediante gotas para los ojos). En algunas modalidades, la solución se administra como una inyección de depósito. En algunas modalidades, una composición de un cargómero se administra como una perfusión durante 15 a 24 horas(por ejemplo,15 minutos a 1 hora, 1 hora a 3 horas, 3 horas a 6 horas, 6 horas a 12 horas o 12 horas a 24 horas).
6.3.2. Usos diagnósticos de los cargómeros
Los cargómeros de la descripción que comprenden un agente de diagnóstico y composiciones de diagnóstico que comprenden dichos cargómeros pueden usarse para diagnosticar un sujeto con una enfermedad o afección o evaluar el efecto de un tratamiento en el sujeto. Por ejemplo, los cargómeros de la descripción que comprenden un agente de formación de imágenes pueden usarse en lugar de agentes de formación de imágenes convencionales en un procedimiento de formación de imágenes(por ejemplo,tomografía computarizada o resonancia magnética).
6.3.2.1. Métodos para obtener imágenes de un tumor
La descripción proporciona métodos para obtener imágenes de tumores mediante el uso de cargómeros. En un aspecto, un método para obtener imágenes de un tumor comprende administrar un cargómero que comprende un agente de formación de imágenes(por ejemplo,circonio-89) a un sujeto y subsecuentemente obtener imágenes del sujeto para detectar la administración del agente de formación de imágenes al tumor. El cargómero puede administrarse mediante cualquier medio adecuado antes de la obtención de imágenespor ejemplo,por vía oral o intravenosa. En una modalidad preferida, el cargómero se administra por vía intravenosa. Las imágenes pueden realizarse en una parte del cuerpo del sujeto que se sabe que contiene un tumor(por ejemplo,un órgano o región del cuerpo, tal como abdomen, cabeza o cuello), o puede comprender una exploración de cuerpo completo (que puede ser útil, por ejemplo, para identificar un tumor secundario).
La cantidad de tiempo entre la administración del cargómero y la obtención de imágenes del sujeto típicamente varía desde menos de 1 hora(por ejemplo,15 a 45 minutos, 15 a 30 minutos o 30 a 45 minutos) a varios días (porejemplo,3 días a 4 días). En algunas modalidades, la obtención de imágenes del sujeto se realiza desde 30 minutos hasta 4 días después de la administración del cargómero(por ejemplo,1 hora a 3 días, 1 hora a 1 día o 1 día a 3 días). En modalidades específicas, la obtención de imágenes se realiza 1 hora después de la administración del cargómero, 1 día después de la administración del cargómero, 2 días después de la administración del cargómero, 3 días después de la administración del cargómero o 4 días después de la administración del cargómero.
El tipo de procedimiento de obtención de imágenes usado para detectar la administración del agente de formación de imágenes al tumor dependerá del tipo de agente de formación de imágenes en el cargómero. Por ejemplo, pueden usarse exploraciones de imágenes nucleares para detectar agentes de formación de imágenes que comprenden un resto radiactivo. Ejemplos de exploraciones por imágenes nucleares que pueden usarse para detectar la administración de un resto radiactivo a un tumor incluyen tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía por emisión de positrones-tomografía computarizada (PET-CT), gammagrafía (centellografía), tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) y tomografía computarizada por emisión de fotón único-tomografía computarizada (SPECT-CT). Cuando el agente de formación de imágenes comprende un resto radiactivo, la cantidad de cargómeros que se administran al sujeto por administración puede contener, por ejemplo, de 5 Mbq a 20 Mbq de radiactividad(por ejemplo,5 Mbq a 10 Mbq, 10 Mbq a 15 Mbq, o 15 Mbq a 20 Mbq). En algunas modalidades, la cantidad de cargómeros marcados que se administran al sujeto por administración contiene de 10 Mbq a 18 Mbq de radiactividad.
Puede usarse imágenes por resonancia magnética (MRI) (por ejemplo, imágenes por resonancia magnética mejorada con contraste dinámico (DCE-MRI)) cuando el agente de formación de imágenes comprende un agente de contraste, y pueden usarse imágenes de fluorescencia (FI) cuando el agente de formación de imágenes comprende un resto fluorescente.
En algunas modalidades, una técnica de obtención de imágenes para detectar la administración del agente de formación de imágenes a un tumor se realiza en combinación con una segunda técnica de obtención de imágenes(por ejemplo,poco antes o después de la primera técnica de imagen). Por ejemplo, la resonancia magnética mejorada con contraste dinámico (DCE-MRI) puede usarse para evaluar la microcirculación tumoral.
6.3.2.2. Métodos de monitoreo de la progresión, regresión o recurrencia del tumor
La descripción proporciona además métodos de uso de cargómeros marcados para monitorear la progresión, regresión o recurrencia del tumor. En un aspecto, los métodos comprenden administrar un cargómero que comprende un agente de formación de imágenes al sujeto en una primera administración y obtener imágenes del sujeto para detectar la administración del agente de formación de imágenes al tumor (por ejemplo, como se describió en la sección 6.3.2.1), y administrar el cargómero que comprende un agente de formación de imágenes para el sujeto en una segunda administración y obtención de imágenes del sujeto para detectar la administración del agente de formación de imágenes al tumor(por ejemplo,como se describió en la sección 6.3.2.1). La repetición de la administración de cargómero que comprende un agente de formación de imágenes y la obtención de imágenes puede usarse para monitorear la progresión de un tumor (por ejemplo,en ausencia de cualquier tratamiento o en respuesta a un tratamiento), regresión de un tumor (por ejemplo,en respuesta a un tratamiento), o recurrencia de un tumor (por ejemplo,después de una cirugía para eliminar el tumor o después de suspender un tratamiento contra el cáncer). Como se usa en la presente, la expresión "cirugía para eliminar un tumor" y similares abarca cirugías en las que se elimina todo o solo parte de un tumor del sujeto.
La primera administración del cargómero puede realizarse, por ejemplo, antes de la cirugía para eliminar el tumor y/o antes de comenzar el tratamiento con una terapia anticancerígena, proporcionando de esta manera una base para evaluar el éxito de la cirugía y/o eficacia del tratamiento. Alternativamente, la primera administración del cargómero puede realizarse después de una cirugía para eliminar el tumor y/o después de comenzar el tratamiento con una terapia anticancerígena, proporcionando de esta manera una base para evaluar la recurrencia del tumor y/o la eficacia o la eficacia continua de la terapia anticancerígena.
La segunda administración del cargómero puede realizarse, por ejemplo, después de la cirugía para eliminar el tumor y/o después de que el sujeto haya comenzado a recibir tratamiento con una terapia anticancerígena, permitiendo de esta manera una evaluación del éxito de la cirugía y/o eficacia de la terapia anticancerígena. La administración del cargómero que comprende un agente de formación de imágenes y la obtención de imágenes puede repetirse una o más veces(por ejemplo,una vez por semana a una vez por mes) para monitorear más a fondo la progresión, regresión o recurrencia de un tumor. La administración del cargómero que comprende un agente de formación de imágenes y formación de imágenes puede repetirse, por ejemplo, durante un período de tiempo determinado, de forma indefinida, o hasta que ocurra un evento específico(por ejemplo,remisión del cáncer o cuando el tumor se vuelve indetectable mediante imágenes).
Los métodos para monitorear la progresión, regresión o recurrencia del tumor pueden usarse para guiar el tratamiento del sujeto. Por ejemplo, para un paciente que recibe tratamiento con una terapia anticancerígena, si las imágenes indican una disminución en el tamaño del tumor desde la primera administración del cargómero que comprende un agente de formación de imágenes hasta la segunda administración del cargómero que comprende un agente de formación de imágenes, puede ser ventajoso para el paciente continuar recibiendo la terapia anticancerígena. Sin embargo, si las imágenes no indican una disminución en el tamaño del tumor (o indican un aumento) desde la primera administración del cargómero que comprende un agente de formación de imágenes hasta la segunda administración del cargómero que comprende un agente de formación de imágenes, puede ser ventajoso alterar el tratamiento que el sujeto está recibiendo(por ejemplo,interrumpir el tratamiento de la terapia anticancerígena, aumentar la dosis de la terapia anticancerígena y/o comenzar el tratamiento con una terapia anticancerígena diferente, por ejemplo comenzar el tratamiento con un cargómero que comprende un agente anticancerígeno que es diferente de un cargómero que comprende un agente anticancerígeno que el sujeto ya recibió). Después de continuar o alterar el tratamiento, la administración del cargómero que comprende un agente de formación de imágenes y la obtención de imágenes puede repetirse una o más veces(por ejemplo,como se describió en el párrafo anterior) para seguir monitoreando la eficacia del tratamiento continuado o alterado.
6.3.2.3. Métodos para seleccionar un sujeto que padece un cáncer para un tratamiento
La descripción proporciona además métodos para seleccionar un sujeto que padece un cáncer para tratamiento con un cargómero que comprende un agente anticancerígeno. En un aspecto, un método para seleccionar un sujeto que padece un cáncer para tratamiento con un cargómero que comprende un agente anticancerígeno comprende administrar un cargómero que comprende un agente de formación de imágenes al sujeto y obtener imágenes del sujeto para detectar la administración del agente de formación de imágenes al tumor(por ejemplo,como se describió en la sección 6.3.2.1), y seleccionar el sujeto para el tratamiento con un cargómero que comprende un agente anticancerígeno si las imágenes muestran la administración del agente de formación de imágenes al tumor. Si las imágenes no muestran la administración del agente de formación de imágenes al tumor, puede seleccionarse un tratamiento alternativo para el sujeto(por ejemplo,con una o más de las terapias anticancerígenas que se describen en la sección 6.1.3.2).
En algunas modalidades, el sujeto se selecciona para recibir tratamiento con un cargómero que comprende un agente anticancerígeno como monoterapia. En otras modalidades, el sujeto se selecciona para recibir tratamiento con un cargómero que comprende un agente anticancerígeno en combinación con una segunda terapia anticancerígena. La segunda terapia anticancerígena puede ser, por ejemplo, cualquiera de las terapias anticancerígenas identificadas en la sección 6.1.3.2. En algunas modalidades, la segunda terapia anticancerígena comprende un segundo cargómero que comprende un segundo agente anticancerígeno. El sujeto puede seleccionarse para recibir el tratamiento con un cargómero que comprende un agente anticancerígeno antes, simultáneamente o después del tratamiento con la segunda terapia anticancerígena. El término "simultáneamente con" no se limita a regímenes de tratamiento en los que las dos terapias se administran al sujeto en una sola administración, sino que abarca regímenes en los que el efecto terapéutico de las dos terapias se superpone.
En los métodos para seleccionar un sujeto que padece un cáncer para el tratamiento con un cargómero que comprende un agente anticancerígeno que se describe en la presente descripción, el sujeto puede seleccionarse para recibir el tratamiento con un cargómero que comprende un agente anticancerígeno que comienza antes o después de la cirugía para eliminar el tumor. En algunas modalidades, el sujeto puede seleccionarse para recibir tratamiento con un cargómero que comprende un agente anticancerígeno que comienza antes de la cirugía para eliminar el tumor y continúa después de la cirugía. En otras modalidades, el sujeto puede seleccionarse para recibir el tratamiento con un cargómero que comprende un agente anticancerígeno en ausencia de cirugía para eliminar el tumor(por ejemplo,cuando el curso de tratamiento del sujeto no incluye una cirugía para eliminar el tumor, por ejemplo, cuando el tumor es inoperable).
6.3.2.4. Métodos para tratar a un sujeto que padece cáncer después de obtener imágenes del tumor
La descripción proporciona además métodos para tratar a un sujeto que padece cáncer después de obtener imágenes del tumor. En un aspecto, los métodos para tratar a un sujeto que padece un cáncer comprenden administrar un cargómero que comprende un agente de formación de imágenes al sujeto y obtener imágenes del sujeto para detectar la administración del agente de formación de imágenes al tumor(por ejemplo,como se describió en la sección 6.3.2.1), y administrar un cargómero que comprende un agente anticancerígeno al sujeto si las imágenes muestran la administración del agente de formación de imágenes al tumor. Si las imágenes no muestran la administración del agente de formación de imágenes al tumor, puede seleccionarse un tratamiento alternativo para el sujeto(por ejemplo,con una o más de las terapias anticancerígenas que se describen en la sección 6.1.3.2).
En algunas modalidades, al sujeto se le administra tratamiento con un cargómero, un agente anticancerígeno, como monoterapia. En otras modalidades, al sujeto se le administra tratamiento con un cargómero que comprende un agente anticancerígeno en combinación con una segunda terapia anticancerígena. La segunda terapia anticancerígena puede ser, por ejemplo, cualquiera de las terapias anticancerígenas identificadas en la sección 6.1.3.2. En algunas modalidades, la segunda terapia anticancerígena comprende un segundo cargómero que comprende un segundo agente anticancerígeno.
En los métodos para tratar a un sujeto que padece un cáncer que se describe en la presente descripción, al sujeto puede administrarse un cargómero que comprende un agente anticancerígeno por primera vez antes o después de la cirugía para eliminar el tumor. En algunas modalidades, el sujeto puede comenzar a recibir tratamiento con un cargómero que comprende un agente anticancerígeno antes de la cirugía para eliminar el tumor y continuar recibiendo el cargómero que comprende un agente anticancerígeno después de la cirugía. En otras modalidades, al sujeto puede administrarse un cargómero que comprende un agente anticancerígeno en ausencia de cirugía para eliminar el tumor (por ejemplo, cuando el curso de tratamiento del sujeto no incluye una cirugía para eliminar el tumor, por ejemplo, cuando el tumor es inoperable).
7. Métodos ilustrativos para preparar cargómeros
Los cargómeros que tienen un número definido de moléculas de apolipoproteína pueden prepararse en una solución acuosa definiendo el pH apropiado, la concentración de monómeros de apolipoproteína y moléculas anfipáticas, la fuerza iónica y la temperatura para fabricar una solución de cargómeros "vacíos". Se pueden añadir restos de carga a la solución de cargómeros vacíos como una solución o como un polvo para fabricar cargómeros cargados que tienen una relación molar definida de apolipoproteína a restos de carga. Los cargómeros cargados pueden usarse directamente después de formarse o pueden purificarse para separar los cargómeros cargados de las moléculas no unidas(por ejemplo,restos de carga no unidas).
Cuando las moléculas de carga no son fácilmente solubles en soluciones acuosas, la apolipoproteína, las moléculas anfipáticas y los restos de carga pueden solubilizarse en una solución de solvente orgánico para fabricar una solución homogénea y evitar agregados o precipitados. Luego, el solvente puede eliminarse mediante cualquier técnica adecuada conocida en la técnica para retirar un solvente de una solución, tal como, pero no se limita a, evaporación, liofilización, secado por pulverización, etc., con el fin de fabricar un polvo o película sólidos en el que la apolipoproteína, las moléculas anfipáticas y los restos de carga se han mezclado íntimamente. Se puede añadir una solución acuosa con el pH y la fuerza iónica apropiados al polvo o película para solubilizar las moléculas y formar espontáneamente cargómeros cargados en las concentraciones apropiadas. La adición de la solución acuosa puede realizarse a una temperatura fija o, inmediatamente después de la adición, la mezcla puede calentarse a una temperatura de hasta 80 grados Celsius. La mezcla también puede someterse a un ciclo térmico(por ejemplo,entre 2 y 10 ciclos) entre una temperatura baja(por ejemplo,no inferior a 10 grados Celsius) y una temperatura alta(por ejemplo,no superior a 80 grados Celsius) para formar los cargómeros. Se han descrito métodos de ciclado térmico para fabricar complejos de lipoproteínas discoidales (ver, documento WO 2012/109162), y esos métodos pueden usarse de manera similar para fabricar cargómeros. Entre los solventes orgánicos, para la liofilización se prefieren soluciones de paraxileno, ortoxileno o ácido acético. En algunas modalidades, se usan soluciones de ácido acético del 70 al 100 %. Pueden usarse otros solventes o mezclas de solventes y eliminarlos posteriormente mediante diferentes técnicas para retirar solventes que son bien conocidas en la técnica. Pueden seleccionarse solventes para solubilizar cada componente de los cargómeros. En el caso de una mezcla de solventes, estos deben ser miscibles entre sí. Después de la hidratación (adición de la solución acuosa), los cargómeros pueden purificarse mediante cualquier técnica apropiada conocida en la técnica, tales como, pero no se limita a, cromatografía, filtración, electroforesis, etc. para eliminar el material no unido o usarse sin separación/purificación adicional. Después de la hidratación (adición de la solución acuosa), puede ajustarse el pH y/o puede ajustarse la fuerza iónica y/o puede ajustarse la osmolalidad.
En una modalidad, pueden seguirse las siguientes etapas para preparar cargómeros que comprenden apolipoproteína multimérica. 1) Seleccionar condiciones que favorezcan la formación de apolipoproteína multimérica(por ejemplo,ApoA-l),por ejemplo,seleccione una concentración de apolipoproteína, temperatura, fuerza iónica del solvente acuoso que se usa y pH que favorezcan las formas multiméricas (ver la sección 6.1). 2) Confirmar la presencia de apolipoproteína multimérica mediante un método analítico,por ejemplo,dispersión dinámica de la luz (DLS), dispersión de la luz estática, cromatografía de exclusión por tamaño o electroforesis en gel. Ver,por ejemplo,Schonfeld y otros, 2016, J. Phys. Chem. B, 120:1228-1235; Jayaraman y otros, 2011, Journal of Biological Chemistry, 286(41):35610-35623; Gianazza y otros, 1997, Biochemistry, 36:7898-7905. Dicho análisis debe realizarse mediante el uso de condiciones que no perturben la existencia de la apolipoproteína multimérica. Por ejemplo, diluir significativamente una muestra y/o añadir la muestra a un tampón con alto contenido de sal para su análisis puede provocar la disociación de la apolipoproteína multimérica. 3) A la solución de apolipoproteína, añada uno o más restos de carga (opcionalmente unidos a anclajes) y una cantidad de moléculas anfipáticas suficiente para solubilizar las moléculas de apolipoproteína. El uno o más de restos de carga y la una o más de moléculas anfipáticas pueden ser las mismas moléculas o moléculas diferentes. La adición de cada ingrediente puede realizarse de forma secuencial, en mezcla o todo a la vez. La forma multimérica de la apolipoproteína puede determinarse para la solución de apolipoproteína sola o después de mezclar la apolipoproteína con uno o más ingredientes. La mezcla que contiene todos los componentes del cargómero puede incubarse(por ejemplo,a una sola temperatura o ciclado térmico) y/o mediante la mezcla para promover la formación del cargómero. Los ensayos funcionales pueden usarse para probar y seleccionar los cargómeros mejor cargados desde el punto de vista de la estructura, el punto de vista de la homogeneidad o desde el punto de vista de la eficacia.
8. Ejemplos
8.1. Ejemplo 1: Cargómeros de ApoA-I/DPPG/esfingomielina
Se pesaron cantidades equimolares de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)](DPPG) y esfingomielina (SM) y se solubilizaron en CHChy se secaron bajo una corriente de N2. La película lipídica se dispersó en tampón fosfato 10 mM, pH 8,0 a 37 °C, mediante el uso de un mezclador Ultra-Turax T25 de alto cizallamiento durante 5 minutos. La solución se mantuvo bajo una capa de nitrógeno durante la preparación.
Se preparó una solución que comprende un agente terapéutico mediante la disolución una cantidad del agente terapéutico en agua.
Se descongeló una solución de ApoA-I humana purificada a temperatura ambiente. Se mezclaron la solución de ApoA-I, la solución de DPPG:SM y la solución del agente terapéutico para proporcionar una mezcla que tiene ApoA-I, DPPG y SM en una relación molar de 1:2:2 y el agente terapéutico. La mezcla se calentó hasta 37 °C durante 4 horas. Luego, la mezcla se sometió a ciclos térmicos (tres ciclos de 20 minutos a 57 /-2 °C y 5 minutos a 37+/-2 °C) para completar la formación de los cargómeros. Después de la terminación el ciclo térmico, la solución de cargómero se enfrió y se almacenó a 4°C.
8.2. Ejemplo 2: Estudio de cargómeros cargados con péptidos de antígenos tumorales y oligonucleótidos de colesterol-CpG en un modelo de cáncer de ratón singénico
El propósito de este estudio es evaluar la eficacia de los cargómeros cargados con péptidos de antígeno tumoral (TA) y oligonucleótidos de colesterol-CpG (col-CpG) en un modelo de cáncer de ratón singénico. El esquema para el estudio se muestra en la figura 5.
8.2.1. Materiales y Métodos
8.2.11. Cargómeros
Se prepararon cargómeros que comprenden ApoA-I y col-CpG (5'-T*<c>*<c>*<a>*T*G*A*C*G*T*T*C*C*T*G*A*C*G*T*T/3C<o>ITEG/-3' (SEQ ID NO: 11)) en una relación molar de 10:1 y cargómeros que comprenden ApoA-I y péptidos TA M27 (LCPG<n>K<y>EM (SEQ ID NO:12)), M30 (CSSVDWENVSPELNSTDQ (SEQ ID NO:13)), y TRP2 (CSVYDFFVWL (SEQ ID NO:14)) en una relación molar de péptido ApoA-I:TA de 1:2 y 1:4. Para fabricar los cargómeros que comprenden péptidos TA, primero se hicieron reaccionar los péptidos Ta con lípido PDP-PE (N-(3-(2-piridilditio)propionato de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, sal de sodio) y luego se incorporaron a los cargómeros. Los cargómeros se almacenaron a 4 °C después de la preparación y se dejaron reposar a temperatura ambiente antes de su uso. Los cargómeros que contienen col-CpG y los cargómeros que contienen los péptidos TA se mezclaron antes de la administración.
8.2.1.2. Ratones
En el estudio se usaron 64 ratones hembras C57BU6 de 5 semanas de edad y que pesaban entre 18-22 g al comienzo del estudio. Los animales se alojaron enjaulas en 8 grupos de 8 animales. A los animales se les permitió un período mínimo de aclimatación de 4 días en la sala de alojamiento antes del inicio del estudio. Durante la aclimatación y durante la duración del estudio, se ofreció alimento y agua a los ratonesad libitum.
8.2.1.3. Cultivo celular e inducción del tumor
Se cultivaron células de melanoma murino B16F10 en medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal al 10 % y glutamina 2 mM y se mantuvieron en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2 en aire a 37 °C. La inducción del tumor se realizó mediante la implantación de 1*105 células de melanoma murino B16F10 mediante inyección subcutánea en el flanco derecho de cada animal. Las células para implantación se prepararon en PBS y se inyectó a cada ratón un volumen final de 0,1 ml de suspensión celular. La implantación se realizó el día 0 después del afeitado y depilación de los animales el día -1.
El injerto tumoral se monitoreó mediante observación y palpación diaria. La medición con el calibre se realizó cada dos días. Se estimó el tamaño del tumor en mm3 a partir de la fórmulaw2xl x n/6donde 7 ' es el diámetro más largo del tumor y "w" es el diámetro perpendicular al diámetro más largo medido en milímetros.
8.2.1.4. Tratamientos
Los 8 grupos de ratones recibieron uno de los 8 tratamientos como se muestra en la tabla 2:
La vacunación se realizó una vez por semana durante 3 semanas (los días 4, 11 y 18) mediante inyección subcutánea. La inmunoterapia que consiste de anticuerpos anti-CTLA4 y anti-PD1 administrados mediante inyección intraperitoneal (100 |jg de cada anticuerpo en un volumen final de 0,2 ml en PBS por ratón) se realizó dos veces por semana durante 3 semanas (en los días 5, 8, 12, 15, 19 y 22).
8.2.1.5. Resultados
Los volúmenes tumorales para cada uno de los 8 grupos de tratamiento durante el curso del estudio se muestran en las figs. 6A-6C. Las figs. 6A-6C muestran que los dos tratamientos que comprenden una combinación de cargómeros que tienen col-CpG y TA e inmunoterapia superaron en gran medida a todos los demás tratamientos.
Los pesos corporales y los pesos corporales corregidos al inicio para los grupos de tratamiento se muestran en la figura 7A y la figura 7B, respectivamente.
Las curvas de crecimiento tumoral individuales con fracción de regresión tumoral completa (CR) para los 8 grupos de tratamiento se muestran en las figs. 8A-8H, con las curvas de crecimiento para los grupos 6 y 7 expandidas en el eje Y en la figura 8I y la figura 8J, respectivamente.
La proporción de supervivencia para cada grupo de tratamiento se muestra en la figura 9.
Por tanto, los resultados muestran que los cargómeros que comprenden col-CpG y TA pueden usarse con éxito para administrar col-CpG y TA para la inmunoterapia contra el cáncer.
8.3. Ejemplo 3: Estudio de seguimiento con ratones supervivientes del ejemplo 2
A los animales supervivientes del ejemplo 2 que fueron tratados con cargómeros (con o sin tratamiento con inhibidor de punto de control) se les inyectaron nuevas células tumorales y se les hizo un seguimiento a lo largo del tiempo. Se añadieron ratones sin tratamiento previo de la misma edad como grupo de control.
Los tumores crecieron rápidamente en la mayor parte del grupo de control, mientras que los ratones tratados anteriormente con cargómero tuvieron una progresión lenta, como se muestra en la figura 10. Por tanto, la vacunación con cargómeros demostró ser muy efectiva y duradera. Como los ratones del grupo superviviente recibieron solo tres vacunas con cargómeros, se prevé que se podría lograr una protección permanente con más vacunas o con vacunación recurrente.
8.4. Ejemplo 4: Estudio de cargómeros cargados con péptidos de antígenos tumorales y oligonucleótidos de colesterol-CpG en un modelo II de cáncer de ratón singénico
Se realizó un estudio similar al estudio del ejemplo 2 con nuevas preparaciones de cargómeros. Los animales se dividieron en cinco grupos de tratamiento de la siguiente manera:
La figura 11A y la figura 11B muestran los pesos corporales y los pesos corporales corregidos al inicio para los animales del ejemplo 4 durante el transcurso del estudio. La figura 12 muestra el volumen tumoral para los diferentes grupos de tratamiento y la figura 13 muestra los pesos de los tumores para los animales de cada grupo.
El ejemplo 4 confirma que los cargómeros pueden inducir una respuesta inmunitaria que previene el crecimiento tumoral. Se encontró que el cargómero 1:4 fue el más potente y no requirió inhibición de puntos de control para su eficacia.
8.5. Ejemplo 5: Estudio de cargómeros cargados con péptidos de antígenos tumorales y oligonucleótidos de colesterol-CpG en un modelo III de cáncer de ratón singénico
Se está realizando un estudio similar al estudio del ejemplo 2 con nuevas preparaciones de cargómeros. El volumen tumoral para los diferentes grupos de tratamiento hasta el día 18 del estudio se muestra en la figura 14 y la figura 15. Los resultados del estudio hasta el día 18 son consistentes con el ejemplo 2.
8.6. Ejemplo 6: Cargómeros con carga de ácido nucleico
Los cargómeros se prepararon con los siguientes restos de carga de ácido nucleico: un oligonucleótido antisentido anti-STAT3; un ARNip anti-KRAS; un ARNip anti-EGFR; y CpG, un adyuvante. En la figura 16 se muestran los cromatogramas de exclusión por tamaño que muestran los cargómeros y los componentes de los cargómeros que contienen oligonucleótido antisentido anti-STAT3. En la figura 17 se muestran los cromatogramas de exclusión por tamaño que muestran los cargómeros y los componentes de los cargómeros que contienen ARNip anti-KRAS. En la figura 18 se muestran los cromatogramas de exclusión por tamaño que muestran los cargómeros y los componentes de los cargómeros que contienen ARNip anti-EGFR. En la figura 19 se muestran los cromatogramas de exclusión por tamaño que muestran los cargómeros y los componentes de los cargómeros que contienen CpG.
La eficacia de los cargómeros que contienen un oligonucleótido antisentido anti-STAT3, los cargómeros que contienen un ARNip anti-KRAS y los cargómeros que contienen un ARNip anti-EGFR para silenciar sus respectivas dianas se probó en un ensayoin vitromediante el uso de células PANC-1. Las transferencias western del ensayo se muestran en la figura 20. Se observó que los cargómeros que contienen ARNip reducen los niveles de proteína diana.
8.7. Ejemplo 7: Cargómeros con carga peptídica
Los cargómeros del tipo usado en los ejemplos 2 a 4 se prepararon con los siguientes restos de carga peptídicos: M27, M30 y TRP2. En la figura 21, figura 22, figura 23 y figura 24 se muestran los cromatogramas de exclusión por tamaño que muestran los cargómeros y los componentes de los cargómeros que contienen los péptidos.
Una forma elegante y sencilla de evaluar la unión de un péptido a un cargómero es aumentar la temperatura para observar la disociación de los componentes porque a medida que se aumenta la temperatura, el equilibrio disociaciónasociación se desplaza a favor de la forma monomérica de ApoA-I, como se muestra en la figura 23.
La figura 25 muestra las micrografías electrónicas de ApoA-I (figura 25A), CER-001 (figura 25B), cargómeros ApoA-I:M27 (1:2) (figura 2C) y cargómeros ApoA-I:M27 (1:2) y CER-001 (figura 25D). CER-001 es un complejo de lipoproteínas discoidales que comprende ApoA-I, esfingomielina (SM) y DPPG en una relación de peso de lipoproteína:fosfolípido total de 1:2,7 con una relación de peso:peso de SM:DPPG de 97:3. Ver, ejemplo 4 del documento WO 2012/109162. La figura 25 muestra que los cargómeros ilustrativos son pequeños y no discoidales.
8.8. Ejemplo 8: Estudio de cargómeros cargados con ARNip u oligonucleótidos antisentido en un modelo de cáncer de páncreas
El propósito de este estudio es evaluar la eficacia de cargómeros cargados con ARNip u oligonucleótido antisentido en un modelo de cáncer de páncreas.
La inducción tumoral se realizó mediante la implantación de 2*106 células de adenocarcinoma de páncreas humano PANC1 mediante inyección subcutánea en el flanco derecho de ratones hembras desnudos BALB/c.
Los cargómeros cargados con ARNip de direccionamiento a KRASG12D, ARNip de direccionamiento a EGFR u oligonucleótidos antisentido (ASO) de direccionamiento a STAT3 se administraron a los animales de acuerdo con el siguiente protocolo:
Los cargómeros cargados con ARNip de direccionamiento a KRASG12D, ARNip de direccionamiento a EGFR o el oligonucleótido antisentido (ASO) de direccionamiento a STAT3 reducen el crecimiento tumoral y prolongan la supervivencia de los ratones portadores de tumores.
8.9. Ejemplo 9: Análisis de los cargómeros de col-CpG.
Se mezclaron la ApoA-I y esfingomielina para proporcionar una mezcla de ApoA-I y SM a 120 j M y 240 j M, respectivamente, en PBS, pH 7,4, la ApoA-I es multimérica bajo estas condiciones. Se añadió colesterol-CpG (ver ejemplo 2) a la mezcla para proporcionar una concentración final de 12<j>M y una relación molar de ApoA-I:SM:Col-CpG de 1:2:0,1. La mezcla se incubó entre 2-8 horas a 37 °C para permitir la formación de los cargómeros. Por separado, se incubó una muestra de CER-001 con col-CpG en una relación molar de 1:0,5.
Se realizó un análisis por HPLC en los cargómeros, los componentes que se usaron para fabricar los cargómeros, CER-001 y CER-001:CpG mediante el uso de un Superdex® columna 20010/300 GL (L * I.D 30 cm * 10 mm, tamaño de partícula promedio de 13 jm ) (GE Healthcare, Ref.17-5175-01). El tampón que se usó para la HPLC fue un tampón fosfato 10 mM, pH 7,4. Los cromatogramas se muestran en la figura 26A-G, con la excepción del cromatograma para el tampón fosfato 10 mM, que no mostró absorbancia significativa a 260 nm o 280 nm.
Como se esperaba, la ApoA-I multimérica más pequeña (ApoA-I sola) eluyó más tarde que CER-001 (figura 26A y figura 26B, respectivamente). La muestra particular de CER-001 que se usó en este estudio mostró un pico principal que eluyó aproximadamente a los 22 minutos y un pico secundario más pequeño que eluyó aproximadamente a los 14 minutos. Es posible que el pico secundario correspondiera a proApoA-I o material agregado. El pico de A280 que se observó para la muestra de cargómero ApoA-I:SM:col-CpG (figura 26D) es aproximadamente igual a la suma de los picos de A280 que se observaron en los cromatogramas de ApoA-I (figura 26A) y col-CpG (figura 26C), lo que indica un alto grado de carga en los cargómeros. En ausencia de SM, se observó un pico adicional de A260 (figura 26E), lo que sugiere una formación de complejos incompleta de ApoA-I y col-CpG. En ausencia de ApoA-I, SM y col-CpG juntos eluyeron en un tiempo diferente (figura 26F) en comparación con los cargómeros ApoA-I:SM:col-CpG. Bajo las condiciones de este estudio, CER-001 pareció unirse pobremente a col-CpG (figura 26G). En consecuencia, en este estudio, se encontró que los cargómeros fueron superiores al CER-001 para unir col-CpG.
9. Listado de secuencias

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un cargómero que comprende:
(a) 1-8 moléculas de apolipoproteína;
(b) uno o más restos de carga;
(c) una cantidad de moléculas anfipáticas suficiente para solubilizar las moléculas de apolipoproteína, en donde uno o más de los restos de carga de (b) y una o más de las moléculas anfipáticas de (c) pueden ser la(s) misma(s) molécula(s) en el cargómero;
(d) opcionalmente, uno o más anclajes que acoplan de forma no covalente uno o más restos de carga a las moléculas de apolipoproteína; y
(e) opcionalmente, uno o más enlazadores que acoplan covalentemente uno o más restos de carga a una o más moléculas de apolipoproteína, una o más moléculas anfipáticas o uno o más anclajes, en donde (i) las moléculas anfipáticas, los restos de carga y, si están presentes, los anclajes y/o enlazadores juntos contribuyen con una carga neta de al menos 1 o -1 por molécula de apolipoproteína en el cargómero; y (ii) la relación molar de apolipoproteína a molécula anfipática varía de 8:1 a 1:15.
2. El cargómero de acuerdo con la reivindicación 1, que no es una partícula discoide.
3. El cargómero de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende de 1 a 25 restos de carga.
4. El cargómero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde al menos una molécula anfipática es también un resto de carga.
5. El cargómero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde al menos un resto de carga está acoplado a un anclaje, opcionalmente en donde el anclaje es una molécula anfipática, además opcionalmente en donde el anclaje comprende:
(a) un fosfolípido, que es opcionalmente un fosfolípido cargado negativamente; o
(b) colesterol.
6. El cargómero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el resto de carga está acoplado al anclaje mediante un enlace directo, o en donde el resto de carga está acoplado al anclaje mediante un enlazador, opcionalmente en donde al menos un resto de carga está acoplado a una molécula de apolipoproteína.
7. El cargómero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde las moléculas anfipáticas comprenden un fosfolípido, un detergente, un ácido graso, un resto apolar o esterol unido covalentemente a un azúcar, o una de sus combinaciones, opcionalmente en donde las moléculas anfipáticas comprenden o consisten en moléculas de fosfolípidos, que son opcionalmente fosfolípidos cargados negativamente, fosfolípidos neutros o una de sus combinaciones.
8. El cargómero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende 1, 2, 4 u 8 moléculas de apolipoproteína.
9. El cargómero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde las moléculas de apolipoproteína comprenden o consisten en moléculas de apolipoproteína A-I (ApoA-I).
10. El cargómero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde uno o más restos de carga comprenden un agente terapéutico, un agente de diagnóstico o un inmunógeno, opcionalmente en donde:
(a) el uno o más restos de carga comprenden un agente terapéutico, que es opcionalmente un agente inmunoinhibidor, un agente inmunoestimulante, un agente anticancerígeno, un agente antiinfeccioso, un fármaco de ácido nucleico, un agente antiinflamatorio, un agente para el tratamiento de trastornos cardiovasculares, un inhibidor de caspasa o un agente bioactivo,
(b) el uno o más restos de carga comprenden un inmunógeno, que es opcionalmente un antígeno o un ácido nucleico que codifica un antígeno, opcionalmente en donde el antígeno es un antígeno alérgico, un autoantígeno o un antígeno tumoral, opcionalmente en donde el antígeno tumoral es un neoantígeno o un antígeno compartido; o
(c) el uno o más restos de carga comprenden un agente de diagnóstico, que es opcionalmente un agente de formación de imágenes.
11. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de los cargómeros de acuerdo con la reivindicación 10(a) y uno o más portadores, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables, o una composición de vacuna que comprende una cantidad efectiva de los cargómeros de acuerdo con la reivindicación 10(b) y uno o más portadores, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables, o una composición de diagnóstico que comprende una cantidad efectiva de los cargómeros de acuerdo con la reivindicación 10(c) y uno o más portadores, diluyentes y/o excipientes adecuados para uso diagnóstico.
12. La composición de acuerdo con la reivindicación 11, en la que no más del 20 %, no más del 10 %, no más del 5 % o no más del 2 % de las moléculas anfipáticas están en forma no complejada, opcionalmente en donde los cargómeros en la composición son al menos 75 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % homogéneos.
13. El cargómero de acuerdo con la reivindicación 10(a) o la reivindicación 10(b) para el uso como medicamento, opcionalmente en donde el cargómero tiene forma de una composición farmacéutica que comprende uno o más portadores, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
14. El cargómero de acuerdo con la reivindicación 10(c) para el usoin vivocomo agente de diagnóstico, que opcionalmente tiene forma de una composición de diagnóstico que comprende uno o más portadores, diluyentes y/o excipientes adecuados para uso diagnóstico.
15. El cargómero de acuerdo con la reivindicación 10(a) o la reivindicación 10(b) para el uso en el tratamiento del cáncer.
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