ES2893114T3 - Métodos para seleccionar moléculas terapéuticas - Google Patents

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Anja Mølhart Høg
Niels Nielsen
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Marianne Jensen
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Abstract

Un método de ensayo o de determinación de la neurotoxicidad aguda in vivo de una molécula que comprende medir las oscilaciones de calcio in vitro en células neuronales que están en contacto con la molécula, en donde la molécula comprende un polinucleótido que tiene una puntuación de secuencia mayor o igual a 0,2, en donde el polinucleótido se refiere a dos o más nucleótidos unidos en secuencia, y en donde la puntuación de secuencia se calcula por la fórmula (I): (número de nucleótidos C o análogos de los mismos en el polinucleótido - número de nucleótidos G o análogos de los mismos en el polinucleótido) / longitud nucleotídica total (número) del polinucleótido (I), y en donde la molécula tiene neurotoxicidad aguda in vivo tolerable cuando las células neuronales en contacto con la molécula presentan oscilaciones de calcio a un nivel de un 30 % menor o mayor que el de las células de control vehículo, o a un nivel mayor que el de las células de control vehículo.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para seleccionar moléculas terapéuticas
Referencia a solicitudes anteriormente presentadas
Esta solicitud es una solicitud PCT que reivindica el beneficio de la solicitud provisional de los Estados Unidos. N.° 62/112.058, presentada el 4 de febrero de 2015, la solicitud provisional de los Estados Unidos N.° 62/156.684, presentada el 4 de mayo de 2015, y la solicitud provisional de los Estados Unidos N.° 62/279.610, presentada el 15 de enero de 2016.
Referencia al listado de secuencias presentado
ELECTRÓNICAMENTE VÍA EFS-WEB
El contenido del listado de secuencias presentado electrónicamente (Nombre: 3338.035PC03 SL.txt, Tamaño: 339.610 bytes; y Fecha de Creación: 4 de febrero de 2016 ) presentado en esta solicitud se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para seleccionar moléculas terapéuticas que tengan efectos secundarios tóxicos reducidos. Los métodos pueden usarse in vitro o in silico para cribar moléculas antes de la administración a animales de laboratorio o los métodos pueden usarse in vivo en animales de laboratorio.
Antecedentes
En el campo de los productos terapéuticos específicamente dirigidos, algunas moléculas terapéuticas causan efectos secundarios tóxicos, por ejemplo, al interactuar no específicamente con proteínas, al estimular una respuesta inmunitaria indeseada o al acumularse en tejidos. Una preocupación principal cuando se administra moléculas terapéuticas a un sujeto es la potencial neurotoxicidad de las moléculas. La exposición a moléculas neurotóxicas puede conducir a daño cerebral y del sistema nervioso periférico, lo que causa problemas fisiológicos a largo plazo. Por lo tanto, es importante que las moléculas terapéuticas no solo sean eficaces en el tratamiento de una enfermedad o trastorno deseado, sino también que tengan toxicidad aceptable, por ejemplo, neurotoxicidad, cuando se administran.
La determinación de las moléculas terapéuticas más eficaces usualmente implica sintetizar un gran número de moléculas diseñadas para actuar sobre un factor en una célula y ensayar ese gran número de moléculas para su actividad y su toxicidad. Aunque para determinar la toxicidad pueden realizarse estudios con animales, no es ni ética ni económicamente deseable realizar estudios con animales cuando un gran número de animales mueren debido a que un gran número de las moléculas a ensayar tienen propiedades tóxicas. Por tanto, se necesitan modos mejorados para determinar la toxicidad, tal como la neurotoxicidad, de una molécula terapéutica que no requieran el ensayo en animales. Cao et al. (Toxicological Sciences, 2012, pp. 362-372) describe un método de ensayo o determinación in vivo de la neurotoxicidad aguda de una molécula. Boehmerle et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006, pp. 18.356-18.361) describe los ensayos de la oscilación de calcio que implican paclitaxel.
Sumario de la invención
La presente divulgación proporciona un método de ensayo o determinación in vivo de la neurotoxicidad aguda de una molécula que comprende medir las oscilaciones en la concentración del calcio libre intracelular ("oscilaciones de calcio") in vitro en células neuronales que están en contacto con la molécula.
La presente divulgación también proporciona un método para seleccionar una molécula que tenga neurotoxicidad aguda in vivo tolerable que comprende medir las oscilaciones de calcio in vitro en células neuronales in vitro que están en contacto con la molécula, en donde la molécula presenta un nivel de oscilación de calcio comparable con un control. Los métodos anteriores de la presente divulgación que implican medir las oscilaciones de calcio además pueden comprender el cálculo de una puntuación de secuencia de la molécula, por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos, en donde la puntuación de secuencia se calcula por la fórmula (I):
(número de nucleótidos C o análogos de los mismos en la secuencia de nucleótidos - número de nucleótidos G o análogos de los mismos en la secuencia de nucleótidos) / longitud nucleotídica total de la secuencia de nucleótidos (I).
La presente invención proporciona un método de ensayo o determinación in vivo de la neurotoxicidad aguda de una molécula que comprende medir las oscilaciones de calcio in vitro en células neuronales que están en contacto con la molécula, en donde la molécula comprende un polinucleótido que tiene una puntuación de secuencia mayor o igual que 0,2, en donde el polinucleótido se refiere a dos o más nucleótidos unidos en secuencia, y en donde la puntuación
de secuencia se calcula por la fórmula (I):
(número de nucleótidos C o análogos de los mismos en el polinucleótido - número de nucleótidos G o análogos
de los mismos en el polinucleótido) / longitud nucleotídica total (número) del polinucleótido (I),
y en donde la molécula tiene neurotoxicidad aguda in vivo tolerable cuando las células neuronales en contacto con la molécula presentan oscilaciones de calcio a un nivel tanto como un 30 % menor o mayor que el de las células control vehículo, o a un nivel mayor que el de las células control vehículo.
La presente invención también proporciona un método para seleccionar o identificar una molécula que tenga neurotoxicidad aguda in vivo tolerable que comprende medir las oscilaciones de calcio in vitro en células neuronales que están en contacto con la molécula, en donde la molécula se selecciona o identifica como que tiene neurotoxicidad
aguda in vivo tolerable cuando las células neuronales en contacto con la molécula presentan oscilaciones de calcio a un nivel tanto como un 30 % menor o mayor que el de las células control vehículo, o a un nivel mayor que el de las células control vehículo, en donde la molécula comprende un polinucleótido que tiene una puntuación de secuencia mayor o igual que 0,2, en donde el polinucleótido se refiere a dos o más nucleótidos unidos en secuencia, y en donde
la puntuación de secuencia se calcula por la fórmula (I):
(número de nucleótidos C o análogos de los mismos en el polinucleótido - número de nucleótidos G o análogos
de los mismos en el polinucleótido) / longitud nucleotídica total (número) del polinucleótido (I).
En otras realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para seleccionar una molécula que tenga neurotoxicidad aguda in vivo tolerable que comprende medir la tolerabilidad in vivo. La presente invención proporciona métodos donde la tolerabilidad in vivo se clasifica en una de las cinco categorías de tolerabilidad. La presente invención también dispone que las categorías de tolerabilidad pueden ser 1) hiperactividad; 2) actividad disminuida y arousal; 3) disfunción motora y/o ataxia; 4) postura y respiración anormal; y 5) temblores y/o convulsiones. En una realización, la tolerabilidad in vivo puede medirse inyectando una molécula en un cerebro de un mamífero y clasificando la tolerabilidad del mamífero en una categoría de tolerabilidad en una escala de 0 a 20.
Los métodos anteriores de la presente invención además pueden comprender la medición de la intensidad de tubulina
en un cultivo de células neuronales, la expresión de una proteína diana, o el comportamiento de la molécula.
La presente invención también proporcionar métodos para administrar una molécula que se ha ensayado de acuerdo
con los métodos anteriores a un sujeto en necesidad de tratamiento de una enfermedad o afección.
En determinadas realizaciones, la molécula comprende una proteína, un péptido, una molécula pequeña, un polinucleótido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido), o cualquier combinación de los mismos. En las realizaciones de la invención, la molécula comprende un polinucleótido, en donde el polinucleótido se refiere a dos o más nucleótidos unidos en secuencia.
REALIZACIONES
En algunas realizaciones de la invención, las oscilaciones de calcio en las células neuronales que están en contacto
con la molécula son de aproximadamente un 70 % o más, aproximadamente un 75 % o más, aproximadamente un
80 % o más, aproximadamente un 85 % o más, aproximadamente un 90 % o más, aproximadamente un 95 % o más, aproximadamente un 96 % o más, aproximadamente un 97 % o más, aproximadamente un 98 % o más aproximadamente un 99% o más, aproximadamente un 10
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más, aproximadamente un 120% o más aproximadamente un 140% o más, aproximadamente un 160% o más, aproximadamente un 180% o más aproximadamente un 200 % o más, aproximadamente un 220 % o más, aproximadamente un 240 % o más, o aproximadamente un 250 % o más en comparación con las oscilaciones de calcio en las células control vehículo.
En algunas realizaciones de la invención, las células neuronales se preparan a partir de neuronas corticales primarias de mamífero.
En algunas realizaciones, la proteína comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, una proteína de fusión, una citocina, un receptor de superficie celular, una hormona, un factor de crecimiento o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones de la invención, las oscilaciones de calcio son oscilaciones de calcio dependientes del receptor AMPA.
En algunas realizaciones de la invención, las oscilaciones de calcio se miden en presencia de iones Mg2+.
En algunas realizaciones de la invención, la concentración del ion Mg2+ es de al menos aproximadamente 0,5 mM, al
menos aproximadamente 0,6 mM, al menos aproximadamente 0,7 mM, al menos aproximadamente 0,8 mM, al menos aproximadamente 0,9 mM, al menos aproximadamente 1 mM, al menos aproximadamente 1,5 mM, al menos aproximadamente 2,0 mM, al menos aproximadamente 2,5 mM, al menos aproximadamente 3,0 mM, al menos aproximadamente 4 mM, al menos aproximadamente 5 mM o al menos aproximadamente 10 mM.
En algunas realizaciones de la invención, las oscilaciones de calcio se determinan midiendo la fluorescencia de un colorante de calcio.
En algunas realizaciones de la invención, la puntuación de secuencia es mayor o igual que 0,2, mayor o igual que 0,25, mayor o igual que 0,3, mayor o igual que 0,35, mayor o igual que 0,4, mayor o igual que 0,45, mayor o igual que 0,5, mayor o igual que 0,55, mayor o igual que 0,6, mayor o igual que 0,65, mayor o igual que 0,7, mayor o igual que 0,75, mayor o igual que 0,8, mayor o igual que 0,85, mayor o igual que 0,9, mayor o igual que 0,95, mayor o igual que 1,0, mayor o igual que 1,5, mayor o igual que 2,0, mayor o igual que 3,0, o mayor o igual que 4,0.
En algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido comprende ADN o ARN.
En algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido es monocatenario.
En algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido es un oligonucleótido (es decir, oligómero) antisentido de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido antisentido modula una expresión de una proteína diana.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido antisentido se dirige a un ARNm de la proteína diana.
En algunas realizaciones, el ARNm es pre-ARNm o ARNm maduro.
En algunas realizaciones, el ARNm se expresa en una célula.
En algunas realizaciones, el ARNm se expresa en una célula neuronal.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido antisentido modula la expresión del ARNm del gen diana en el cultivo de células neuronales.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido antisentido modula la expresión proteica codificada por la proteína diana en el cultivo de las células neuronales.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido antisentido es complementario a un ARNm o un pre-ARNm del gen diana. En algunas realizaciones de la invención, el método además comprende medir la reducción de la expresión in vitro de una proteína diana de la molécula.
En algunas realizaciones de la invención, el método además comprende medir una tolerabilidad in vivo de la molécula en un animal de laboratorio.
En algunas realizaciones, la tolerabilidad in vivo se mide administrando la molécula a un mamífero y clasificando la tolerabilidad del mamífero en una categoría de tolerabilidad.
En algunas realizaciones, la molécula se administra al cerebro del mamífero.
En algunas realizaciones, la categoría de tolerabilidad se selecciona del grupo que consiste en: 1) hiperactividad; 2) actividad disminuida y arousal; 3) disfunción motora y/o ataxia; 4) postura y respiración anormal; 5) temblores y/o convulsiones, y dos o más combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, la molécula presenta una puntuación de tolerabilidad in vivo de 0 a 4 en cada una de las categorías de tolerabilidad.
En algunas realizaciones, la molécula presenta una suma de las puntuaciones de tolerabilidad in vivo entre 0 y 8. En algunas realizaciones, la molécula presenta una suma de las puntuaciones de tolerabilidad in vivo entre 0 y 6, entre 0 y 5, entre 0 y 4, entre 0 y 3, entre 0 y 2 o entre 0 y 1.
En algunas realizaciones de la invención, el método además comprende medir una puntuación de la prueba conductual de la molécula en un animal de laboratorio.
En algunas realizaciones, la puntuación de la prueba conductual se mide administrando la molécula a un mamífero y clasificando el comportamiento del mamífero.
En algunas realizaciones, la prueba conductual es una prueba de memoria a corto plazo, una prueba de aprendizaje y memoria espacial, un prueba de análisis de los andares, o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones de la invención, el método además comprende medir la intensidad de tubulina de la molécula en un cultivo de células neuronales.
En algunas realizaciones, la intensidad de tubulina de la molécula se compara con la intensidad de tubulina en células neuronales no expuestas a la molécula.
En algunas realizaciones, la molécula reduce menos de aproximadamente un 25 %, menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 15 %, menos de aproximadamente un 10 %, menos de aproximadamente un 5 % o menos de aproximadamente un 1 % de la intensidad de tubulina en el cultivo de las células neuronales.
En algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido es un oligonucleótido antisentido.
En algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido comprende al menos un análogo de nucleótido.
En algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, o al menos diez análogos de nucleótido.
En algunas realizaciones, el análogo o análogos de nucleótido son Ácido Nucleico Bloqueado (LNA), 2'-O-alquil-ARN; 2'-amino-ADN, 2'-fluoro-ADN; ácido arabino nucleico (ANA), 2'-fluoro-ANA, ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico intercalante (INA), etil nucleósido restringido (cEt), ácido 2'-O-metil nucleico (2'-OMe), ácido 2'-O-metoxietil nucleico (2'-MOE), o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones de la invención, el oligonucleótido antisentido comprende un enlace internucleósidos seleccionado de: un enlace fosfodiéster, un enlace fosfotriéster, un enlace metilfosfonato, un enlace fosforamidato, un enlace fosforotioato, y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones de la invención, el oligonucleótido antisentido es un gapmer, un blockmer, un mixmer, o un wingmer.
En algunas realizaciones de la invención, cuando la molécula se administra a animales de laboratorio, más de un 20 % de los animales sobreviven.
En algunas realizaciones de la invención, cuando la molécula se administra a animales de laboratorio, más de un 50 % de los animales sobreviven.
En algunas realizaciones de la invención, cuando la molécula se administra a animales de laboratorio, más de un 85 % de los animales sobreviven.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Gráfica que demuestra las oscilaciones espontáneas de calcio neuronales primarias. Las oscilaciones espontáneas de calcio neuronales primarias se midieron como se ha descrito previamente (Murphy et.al., 1992, J. Neurosa. 12:4.834-4.845). La adición del antagonista del receptor de ácido a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA), 6-Ciano-7-nitroquinoxalin-2,3-diona (CNQX; 3 j M), redujo las oscilaciones de calcio en un 20 % que representa la respuesta total de AMPA en el ensayo (barra etiquetada AMPA mostrada). Las oscilaciones de calcio se redujeron más, en aproximadamente un 80 %, cuando se bloqueó la función del receptor de N-metil-D-aspartato (NMdA) por MgCh 1 mM (barra etiquetada NMDA mostrada).
Figura 2: Gráfica que muestra la inhibición de las oscilaciones de calcio mediadas por AMPA por oligómeros antisentido como un indicio de la alteración de la actividad de la red neuronal. La inhibición del oligómero antisentido de las oscilaciones espontáneas de calcio mediadas por NMDA o AMPA se evaluó en presencia o ausencia de MgCh 1 mM (que representa el 100 % del control en cada caso). La adición de oligómeros antisentido 25 j M (TGTgatgcaggaGTT) (SEQ ID NO: 304) (ASO-00007) inhibió las oscilaciones mediadas por el receptor AMPA pero no el receptor NMDA. Se demostró que el ASO y otros oligómeros que se comportaron igualmente, impactaron de manera negativa en la actividad de la red del sistema nervioso central (SNC) in vivo y en la actividad neuronal espontánea electrofisiológica in vitro (datos no mostrados).
Figura 3: Análisis de correlación de la puntuación de secuencia frente a la puntuación de tolerabilidad in vivo. La puntuación de secuencia para cada oligómero se calculó insertando los números apropiados en la fórmula: ((número de nucleótidos C o los análogos - número de nucleótidos G)/longitud nucleotídica (número) en el oligómero). Las puntuaciones de tolerabilidad in vivo se calcularon basándose en las observaciones tras una administración intracerebroventricular (ICV) única de 100 jg de oligómeros en ratones o una administración intratecal (IT) de 900 jg de oligómeros o hasta 1.500 jg en ratas. Los roedores se observaron bajo cinco categorías: 1) hiperactividad; 2) actividad disminuida y arousal; 3) disfunción motora y/o ataxia; 4) postura y respiración anormal; y 5) temblores y/o convulsiones. La puntuación de tolerabilidad in vivo total es la suma de las cinco puntuaciones unitarias; cada una de las puntuaciones unitarias se miden en una escala de 0-4. Por lo tanto, la puntuación total de la tolerabilidad in vivo puede oscilar de 0 a 20. La puntuación de secuencia calculada por la fórmula está sobre el eje X, y la puntuación de tolerabilidad in vivo está sobre el eje Y.
Figura 4: muestra el impacto del oligonucleótido antisentido de Tau sobre las oscilaciones espontáneas de calcio en neuronas primarias. La Figura 4 enumera el nombre del oligómero, el número de identificación del ASO, la secuencia del ASO, SEQ ID NO, las posiciones de inicio y final diana en la secuencia del pre-ARNm de MAPT, y los datos de oscilación de calcio como un porcentaje del control (como se analiza en el Ejemplo 2 más adelante). En la Figura 4 se proporcionan ejemplos de oligómeros con bases mal emparejadas como "mm". Los pares de bases mal emparejados específicos están en negrita, subrayados, en cursiva y resaltados.
Figura 5: muestra la tolerabilidad in vivo de los oligonucleótidos antisentido ilustrativos. La Figura 5 enumera el número de identificación del ASO, la secuencia del ASO, SEQ ID NO, las posiciones de inicio y final diana sobre la secuencia de pre-ARNm de MAPT, la puntuación de tolerabilidad aguda in vivo (como se analiza en el Ejemplo 6 más adelante) y el porcentaje de ARNm de MAPT cerebral restante después de la administración (como también se analiza en el Ejemplo 6 más adelante).
Figura 6: muestra la reducción de la proteína Tau mediante oligonucleótidos antisentido ilustrativos. La Figura 6 enumera SEQ ID NO, el nombre del oligómero, el número de identificación del ASO, la secuencia del ASO, las posiciones de inicio y final diana sobre la secuencia de pre-ARNm de MAPT, el inicio diana sobre la secuencia de ARNm maduro y los valores de la inmunocitoquímica de Tau/Tuj-1 y Tuj-1 normalizados (como se analiza en el Ejemplo 7 más adelante). En la Figura 7 se proporcionan ejemplos de oligómeros con bases mal emparejadas como "mm". Los pares de bases mal emparejados específicos están en negrita, subrayados, en cursiva y resaltados.
Descripción detallada de la invención
I. Definiciones
Cabe señalar que el término "un" o "uno/a" se refiere a uno o más de esa entidad; por ejemplo, "una molécula", se entiende que representa una o más moléculas. Por lo tanto, las expresiones "un" (o "uno/a"), "uno/a o más" y "al menos uno" pueden usarse indistintamente en el presente documento.
Además, cuando se usa en el presente documento, "y/o" debe interpretarse como la divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados, con o sin el otro. Por tanto, la expresión "y/o" como se usa en una expresión tal como "A y/o B" del presente documento pretende incluir "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B" (solo). Asimismo, la expresión "y/o" como se usa en una expresión tal como "A, B y/o C" pretende abarcar cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).
Se entiende que dondequiera que se describa en el presente documento aspectos con el lenguaje "que comprende", se proporcionan también aspectos análogos de otro modo descritos en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia con la que se relaciona la presente divulgación. Por ejemplo, el "Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology", Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; "The Dictionary of Cell and Molecular Biology", 3a ed., 1999, Academic Press; y el "Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology", Revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan al experto un diccionario general de muchos de los términos usados en la presente divulgación.
Las unidades, los prefijos, y los símbolos están indicados en su forma aceptada del Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de nucleótidos están escritas de izquierda a derecha en orientación 5' a 3'. Las secuencias de aminoácidos están escritas de izquierda a derecha en orientación amino a carboxi. Los títulos proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diferentes aspectos de la divulgación, que se pueden obtener por referencia a la memoria descriptiva en su conjunto. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen con más detalle por referencia a la memoria descriptiva en su totalidad.
El término "aproximadamente" como se usa en el presente documento significa alrededor de, más o menos, en torno a, o en las regiones de. Cuando el término "aproximadamente" se usa junto con un intervalo numérico, modifica ese intervalo al extender los límites por encima y por debajo de los valores numéricos establecidos. En general, el término "aproximadamente" puede modificar un valor numérico por encima y por debajo del valor indicado en una variación de, por ejemplo, 10 por ciento, hacia arriba o hacia abajo (mayor o menor). Por ejemplo, aproximadamente un 70 % puede incluir 70 % - 7 % a 70 % 7 %, es decir, de 63 % a 77 %.
La expresión "molécula terapéutica" se refiere a cualquier compuesto que tenga un efecto terapéutico in vivo para el tratamiento de una enfermedad o afección. Ejemplos no limitantes de las moléculas terapéuticas incluyen oligómeros, uno o más nucleótidos, uno o más nucleósidos, uno o más aminoácidos, polinucleótidos, péptidos, proteínas, polipéptidos, o compuestos de molécula pequeña que son de origen natural, modificados, producidos mediante recombinación, o químicamente sintetizados. Las proteínas que son moléculas terapéuticas incluyen, pero sin limitación, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, proteínas de fusión, citocinas, receptores de superficie celular, hormonas, factores de crecimiento o cualquier combinación de los mismos.
La expresión "oligómero" en el contexto de la presente invención, se refiere a una molécula formada por enlace covalente de dos o más nucleótidos (es decir, un oligonucleótido). El oligómero comprende una secuencia de nucleótidos contigua de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, tal como, 10 - 20, 16 - 20, 10 - 30, 10 - 35, 10 -40, o 10 - 45 nucleótidos de longitud. Las expresiones "oligómero antisentido", "oligonucleótido antisentido", y "ASO" como se usan en el presente documento son intercambiables con el término "oligómero". En diversas realizaciones, el oligómero de la invención no comprende ARN (unidades). En algunas realizaciones, el oligómero comprende una o más unidades de ADN. En una realización, el oligómero de acuerdo con la invención es una molécula lineal o está sintetizada como una molécula lineal. En algunas realizaciones, el oligómero es una molécula monocatenaria, y no comprende regiones cortas de, por ejemplo, al menos 3, 4 o 5 nucleótidos contiguos, que sean complementarias a las regiones equivalentes dentro del mismo oligómero (es decir, dúplex) - a este respecto, el oligómero no es (prácticamente) bicatenario. En algunas realizaciones, el oligómero es prácticamente no bicatenario. En algunas realizaciones, el oligómero no es un ARNip. En diversas realizaciones, el oligómero de la invención consiste completamente en la región nucleotídica contigua. Por tanto, en algunas realizaciones el oligómero no es sustancialmente autocomplementario.
La expresión "ácidos nucleicos", "nucleótidos", "secuencia de nucleótidos", o "secuencia de ácido nucleico" pretende abarca ácidos nucleicos plurales (por ejemplo, dos o más, tres o más, etc.). La expresión "ácido nucleico" o "nucleósido" se refiere a un segmento del ácido nucleico único, por ejemplo, un ADN, un ARN o un análogo de los mismos, presente en un polinucleótido. En algunas realizaciones, los términos "nucleótido", "unidad" y "monómero" se usan indistintamente. Se reconocerá que cuando se hace referencia a una secuencia de nucleótidos o monómeros, a lo que se hace referencia es a la secuencia de bases, tales como A, T, G, C o U, y análogos de las mismas. La expresión "secuencia de nucleótidos" se refiere a una molécula que comprende al menos dos nucleótidos conectados entre sí.
El término "nucleótido", como se usa en el presente documento, se refiere a un glucósido que comprende una fracción azúcar, una fracción base y un grupo covalentemente unido (grupo enlace), tal como un grupo enlace internucleótidos fosfato o fosforotioato, y cubre tanto los nucleótidos de origen natural, tal como ADN o ARN, como los nucleótidos de no origen natural que comprenden las fracciones azúcar y/o base modificadas, lo cuales también se denominan "análogos de nucleótido" en el presente documento. En el presente documento, un nucleótido único (unidad) también se denomina monómero o unidad de ácido nucleico. En determinadas realizaciones, la expresión "análogos de nucleótido" se refiere a nucleótidos que tienen las fracciones azúcar modificadas. Ejemplos no limitantes de los nucleótidos que tienen las fracciones azúcar modificadas (por ejemplo, LNA) se divulgan en cualquier otro sitio en el presente documento, por ejemplo, 2'-O-metilo, 2'-fluoro (2'-F), 2'-O-metoxietilo (2'-MOE), y 2'-O-etilo 2',4'-restringido (cEt). En otras realizaciones, la expresión "análogos de nucleótido" se refiere a nucleótidos que tienen las fracciones base modificadas. Los nucleótidos que tiene las fracciones base modificadas incluyen, pero sin limitación, 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracilo, 5-propiluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina, o 2-cloro-6-aminopurina. En determinadas realizaciones cuando se hace referencia a la a la fórmula de la puntuación de secuencia divulgada en el presente documento, el análogo de nucleótido de citosina es 5-metil citosina.
El término "polinucleótido" como se usa en el presente documento se refiere a dos o más nucleótidos unidos en secuencia. Polinucleótidos ilustrativos pueden comprender una secuencia de nucleótidos que tiene dos nucleótidos, tres nucleótidos, cuatro nucleótidos, cinco nucleótidos, seis nucleótidos, siete nucleótidos, ocho nucleótidos, nueve nucleótidos, diez nucleótidos, oligonucleótidos, 50 nucleótidos, 51 nucleótidos o más. En algunas realizaciones, los polinucleótidos comprenden una secuencia de nucleótidos de más de 10 nucleótidos, 11 nucleótidos, 12 nucleótidos, 13 nucleótidos, 14 nucleótidos, 15 nucleótidos, 16 nucleótidos, 17 nucleótidos, 18 nucleótidos, 19 nucleótidos, 20 nucleótidos, 21 nucleótidos, 22 nucleótidos, 23 nucleótidos, 24 nucleótidos, 26 nucleótidos, 27 nucleótidos, 28 nucleótidos, 29 nucleótidos, 30 nucleótidos. En otras realizaciones, los polinucleótidos comprenden un oligómero (por ejemplo, oligonucleótido antisentido). En incluso otras realizaciones, los polinucleótidos comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o polipéptido. En otras realizaciones más, los polinucleótidos comprenden una secuencia de nucleótidos de más de 100 nucleótidos, de más de 200 nucleótidos, de más de 300 nucleótidos, de más de 400 nucleótidos, de más de 500 nucleótidos, de más de 1.000 nucleótidos, de más de 1.500 nucleótidos, de más de 2.000 nucleótidos, de más de 3.000 nucleótidos, de más de 4.000 nucleótidos, o de más de 5.000 nucleótidos.
El término "nucleósido" como se usa en el presente documento se usa para referirse a un glucósido que comprende una fracción azúcar y una fracción base y, por lo tanto, puede usarse cuando se hace referencia a las unidades de nucleótido, que están covalentemente unidas por los enlaces internucleótidos entre los nucleótidos del oligómero. En el campo de la biotecnología, el término "nucleótido" se usa con frecuencia para referirse a un monómero o unidad de ácido nucleico y, por lo tanto, en el contexto de un oligonucleótido puede referirse a la base - tal como la "secuencia de nucleótidos", normalmente para referirse a la secuencia de nucleobases (es decir, la presencia de la cadena principal de azúcar y los enlaces intemucleósidos están implícitos). Asimismo, particularmente en el caso de los oligonucleótidos donde uno o más de los grupos enlace intemucleósidos están modificados, el término "nucleótido" puede referirse a un "nucleósido", por ejemplo, se puede usar el término "nucleótido", incluso cuando se especifica la presencia o la naturaleza de los enlaces entre los nucleósidos.
El término "longitud nucleotídica" como se usa en el presente documento significa el número total de los nucleótidos (monómeros) en una secuencia dada. Por ejemplo, la secuencia de AAAgatgaaatttgctcTTA (SEQ ID NO: 4) tiene 20 nucleótidos; por tanto, la longitud nucleotídica de la secuencia es de 20. La expresión "longitud nucleotídica" se usa en el presente documento indistintamente con "número de nucleótidos".
El término "transcrito" como se usa en el presente documento puede referirse a un transcrito primario que se sintetiza mediante transcripción de ADN y llega a ser un ARN mensajero (ARNm) después del procesamiento, es decir, una ARN mensajero precursor (pre-ARNm), y el propio ARNm procesado. El término "transcrito" puede usarse indistintamente con "pre-ARNm" y "ARNm". Después de que las cadenas de ADN se someten a transcripción para obtener transcritos primarios, los nuevos transcritos primarios sintetizados se modifican de varias maneras para convertirse en sus formas funcionales maduras para producir diferentes proteínas y ARN tales como ARNm, ARNt, ARNr, ARNlnc, ARNim y otros. Por tanto, el término "transcrito" puede incluir exones, intrones, 5' UTR, y 3' UTR.
El término "expresión" como se usa en el presente documento se refiere a un proceso por el cual un polinucleótido produce un producto génico, por ejemplo, un ARN o un polipéptido. Incluye, sin limitación, la transcripción del polinucleótido en ARN mensajero (ARNm) y la traducción de un ARNm en un polipéptido. La expresión produce un "producto génico". Como se usa en el presente documento, un producto génico puede ser un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN mensajero producido por transcripción de un gen, o un polipéptido que se traduce a partir de un transcrito. Los productos génicos descritos en el presente documento además incluyen ácidos nucleicos con modificaciones postraduccionales, por ejemplo, poliadenilación o corte y empalme, o polipéptidos con modificaciones postraduccionales, por ejemplo, metilación, glucosilación, la adición de lípidos, asociación con otras subunidades proteicas, o escisión proteolítica.
En la determinación del grado de "complementariedad" entre los oligómeros de la invención (o regiones de los mismos) y la región diana del ácido nucleico que codifica el gen mamífero, tal como los divulgados en el presente documento, el grado de complementariedad (también "homología" o "identidad") se expresa como el porcentaje de identidad (o porcentaje de homología) entre la secuencia del oligómero (o región de la misma) y la secuencia de la región diana (o el complemento inverso de la región diana) que mejor se alinea con la misma. El porcentaje se calcula contando el número de bases alineadas que son idénticas entre las dos secuencias, dividiendo por el número total de monómeros contiguos en el oligómero, y multiplicando por 100. En tal comparación, si existen huecos, es preferible que tales huecos sean simplemente mal emparejamientos en lugar de áreas donde el número de monómeros dentro del hueco difiere entre el oligómero de la invención y la región diana.
El término "complemento" como se usa en el presente documento indica una secuencia que es complementaria a una secuencia de referencia. Es bien conocido que la complementariedad es el principio base de la replicación y la transcripción del ADN ya que es una propiedad compartida entre dos secuencias de ADN o ARN, de modo que cuando se alinean de forma antiparalela una a otra, las bases nucleotídicas en cada posición en las secuencias serán complementarias, muy parecido a mirar en el espejo y ver el reverso de las cosas. Por lo tanto, por ejemplo, el complemento de una secuencia de 5'"ATGC"3' se puede escribir como 3'"TACG"5' o 5'"GCAT"3'. Las expresiones "complemento inverso", "complementario inverso" y "complementariedad inversa" como se usa en el presente documento son intercambiables con los términos "complemento", "complementario" y "complementariedad".
La expresión "comparable con" se usa en el presente documento para significar un valor que es tanto como un 30 % menor o mayor que el valor de referencia con el que se está comparando. Como ejemplo, si el valor es tanto como un 30 % menor que el valor de referencia, entonces, el valor se considera "comparable con" el valor de referencia: por ejemplo, 70 es comparable con 100, 80 es comparable con 100, 90 es comparable con 100, 100 es comparable con 100, 110 es comparable con 100, 120 es comparable con 100, y 130 es comparable con 100. Un nivel de oscilación de calcio de una molécula que es comparable con el nivel de oscilación de calcio de un control significa que el nivel de oscilación de calcio de la molécula es de ±30 %, ±20 %, ±10 %, o ±5 % del nivel de oscilación de calcio del control.
La expresión "diseño" o "diseño del oligómero" o "secuencia del ASO" como se usa en el presente documento se refiere a un modelo de nucleótidos (por ejemplo, ADN) y análogos de nucleótido (por ejemplo, LNA) en una secuencia dada. Como se usa en el presente documento, el diseño de un oligómero es mostrado por una combinación de letras mayúsculas y letras minúsculas. Por ejemplo, una secuencia de oligómero de tatttccaaattcactttta (SEQ ID NO: 573) puede tener diseños de oligómero de As O-002350 (TAtTTccaaattcactTTTA), ASO-002374 (TAtTTccaaattcacTtTTA), ASO-002386 (TATTtccaaattcaCTttTA), ASO-002227 (TATtTccaaattcactTTTA), ASO-002245 (TAttTCcaaattcactTTTA), ASO-002261 (TATtTccaaattcacTTtTA), ASO-002276 (ATttCcaaattcactTTTA), ASO-002228 (TATTtccaaattcaCtTtTA), ASO-002255 (TATTtccaaattcactTTTA), ASO-002285 (TATTtccaaattcacTTtTA), ASO-002230 (TATTtccaaattcacTtTTA), ASO-002256 (TATTtccaaattcAcTttTA), o ASO-002279 (TATTtccaaattcActTtTA), en donde la letra mayúscula indica un análogo de nucleótido (por ejemplo, LNA) y la letra minúscula indica un nucleótido (por ejemplo, ADN)
La expresión "estructura química" de un oligómero como se usa en el presente documento se refiere a una descripción detallada de los componentes de los oligómeros, por ejemplo, nucleótidos (por ejemplo, ADN), análogos de nucleótido (por ejemplo, beta-D-oxi-LNA), base nucleotídica (por ejemplo, A, T, G, C, U o MC) y la estructura de la cadena principal (por ejemplo, fosforotioato o fosforodiéster). Por ejemplo, una estructura química de ASO-002350 pude ser OxyTs OxyAs DNAts OxyTs OxyTs DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas DNAcs DNAts OxyTs OxyTs OxyTs OxyAs. Las Figuras 2, 16B y 20B enumeran ejemplos no limitantes de estructuras químicas que pueden aplicarse a uno cualquiera de los oligómeros divulgados en el presente documento.
La "Potencia" normalmente se expresa como un valor de CI50 o EC50, en nM o pM a menos que se especifique lo contrario. CI50 es la concentración inhibidora media de una molécula terapéutica. CE50 es la concentración eficaz media de una molécula terapéutica en relación con un vehículo o solución salina control. En ensayos funcionales, CI50 es la concentración que reduce una respuesta biológica, por ejemplo, la transcripción de ARNm o la expresión proteica, en un 50 % de la respuesta biológica que se consigue sin la molécula terapéutica. En ensayos funcionales, CE50 es la concentración de una molécula terapéutica que produce un 50 % de la respuesta biológica, por ejemplo, la transcripción de ARNm o la expresión proteica. CI50 o EC50 se pueden calcular por cualquier número de medios conocidos en la técnica.
Por "efecto secundario tóxico" se entiende un efecto que causa debilitación de un sujeto vivo, incluyendo, pero sin limitación, muerte, dolor, temblores, convulsiones, crisis, una inhibición del movimiento, o pérdida de memoria. Un compuesto "tóxico" puede causar efectos secundarios tóxicos cuando un sujeto se expone al compuesto tóxico, tal como por inyección, ingestión, inhalación u otras vías, y no es adecuado para la administración en mamíferos, por ejemplo, roedores. En una realización, el efecto secundario tóxico incluye neurotoxicidad in vivo. En otra realización, el efecto secundario tóxico es neurotoxicidad aguda in vivo. Un compuesto "neurotóxico" puede alterar la actividad normal del sistema nervioso de tal manera que causa daño al tejido nervioso, incluido el tejido cerebral, tal como neuronas, y el tejido nervioso periférico.
Por "tolerable" se entiende una molécula que es bien tolerada por un sujeto vivo, por ejemplo, una molécula que, cuando se administra, no causa efectos dañinos que sean visibles o se puedan analizar usando la cualidad general de los ensayos de su vida útil o midiendo las puntuaciones de tolerabilidad in vivo como se describe en el presente documento.
Por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero", se entiende cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para el cual se desea diagnóstico, pronóstico o terapia. Los sujetos mamíferos incluyen seres humanos, animales domésticos, animales de granja, animales para el deporte, y animales de zoológico entre los que se incluyen, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, osos y demás.
Una "cantidad eficaz" de una molécula terapéutica como se divulga en el presente documento es una cantidad suficiente para llevar a cabo un fin específicamente indicado. Una "cantidad eficaz" puede determinarse empíricamente y de una manera rutinaria, con respecto al fin indicado.
Expresiones tales como "que trata" o "tratamiento" o "tratar" o "que alivia" o "aliviar" se refieren tanto a (1) medidas terapéuticas que curan, ralentizan, alivian los síntomas de, y/o paran la progresión de una afección o trastorno patológico diagnosticado como a (2) medidas profilácticas o preventivas que previenen y/o frenan el desarrollo de una afección o trastorno patológico indicado. Por tanto, aquellos que necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno; los propensos a tener el trastorno; y aquellos en los que se va a prevenir el trastorno. En determinadas realizaciones, un sujeto es "tratado" con éxito para una enfermedad o afección divulgada en cualquier otro sitio en el presente documento de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento si el paciente muestra, por ejemplo, alivio total, parcial o transitorio o eliminación de los síntomas asociados a la enfermedad o trastorno.
II. Métodos de uso de los ensayos de la oscilación de calcio para determinar la neurotoxicidad in vivo
La presente divulgación proporciona métodos de ensayo o determinación de la toxicidad (por ejemplo, la neurotoxicidad aguda in vivo) de una molécula midiendo determinadas características de la molécula. La presente divulgación también proporciona métodos para seleccionar una molécula que tenga efectos secundarios tóxicos reducidos. Tales métodos son útiles para reducir el sacrificio innecesario de animales durante el ensayo de la toxicidad de la molécula y/o para aumentar las posibilidades de que las moléculas serán seguras para la administración in vivo. Los presentes métodos también pueden mejorar la eficacia (es decir, acortar) el periodo de evaluación de las moléculas candidatas reduciendo el periodo de cribado para la selección de las moléculas que no presentan neurotoxicidad aguda in vivo. Los presentes métodos comprenden identificar moléculas que tengan menor toxicidad o reducida. Por ejemplo, las moléculas se pueden analizar para determinar si tienen baja toxicidad (por ejemplo, neurotoxicidad aguda in vivo), y si se encuentra que tienen baja toxicidad, las moléculas se seleccionan para su uso en ensayos adicionales o la administración a un sujeto tal como un mamífero. En algunas realizaciones, si se encuentra que la molécula tiene baja toxicidad, se administra a un animal de laboratorio para ensayo adicional de la molécula.
Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, la presente divulgación identifica (i) una correlación entre las oscilaciones de calcio de una molécula in vitro en células neuronales y la puntuación de secuencia de la molécula (por ejemplo, polinucleótido que comprende una secuencia), (ii) una correlación entre las oscilaciones de calcio de una molécula y la neurotoxicidad in vivo de la molécula, (iii) una correlación entre la puntuación de secuencia de una molécula (por ejemplo, polinucleótido que comprende una secuencia) y la neurotoxicidad in vivo de la molécula, o (iv) cualquier combinación de los mismos. En una realización, la divulgación demuestra que una molécula que presenta oscilaciones de calcio en células neuronales comparables con (es decir, menores o mayores que un 30 %) las oscilaciones de calcio en células neuronales no expuestas a la molécula muestra menos neurotoxicidad in vivo cuando se administra a un mamífero in vivo. En otra realización, la divulgación demuestra que una molécula que presenta oscilaciones de calcio en células neuronales comparables con (es decir, menores o mayores que un 30 %) las oscilaciones de calcio en células neuronales no expuestas a la molécula tiene una puntuación de secuencia igual o mayor que 0,2. En otras realizaciones, la divulgación demuestra que una molécula que tiene una puntuación de secuencia igual o mayor que 0,2 presenta menos neurotoxicidad in vivo cuando la molécula se administra a un mamífero in vivo. Por lo tanto, la identificación de las correlaciones entre el ensayo de la oscilación de calcio, la puntuación de secuencia y la neurotoxicidad in vivo permite predecir la neurotoxicidad in vivo basándose en el ensayo de la oscilación de calcio in vitro y la puntuación de secuencia. En una realización adicional, la presente invención permite predecir la neurotoxicidad in vivo basándose en el ensayo de la oscilación de calcio in vitro, la puntuación de secuencia y el cambio en la intensidad de tubulina en una célula como se analiza además supra.
En un aspecto, la divulgación explica un ensayo de la oscilación de calcio como una manera de medir o predecir la toxicidad de una molécula. En otro aspecto, la divulgación proporciona un método de puntuación de secuencia para medir o predecir la toxicidad de una molécula. En otros aspectos, la divulgación proporciona un método combinado de uso de un ensayo de la oscilación de calcio y un método de puntuación de secuencia. La divulgación también proporciona un ensayo de la tolerabilidad in vivo que puede usarse por separado o combinado con el ensayo de la oscilación de calcio y/o el método de puntuación de secuencia. Algunos otros métodos divulgados en esta solicitud y/o conocidos en la técnica además pueden combinarse con el ensayo de la oscilación de calcio y/o el método de puntuación de secuencia.
II.A. Ensayos de la oscilación de calcio
En una realización, la toxicidad, por ejemplo, la neurotoxicidad aguda in vivo, de la molécula se ensaya midiendo las oscilaciones del calcio libre intracelular (oscilaciones de calcio) in vitro en células neuronales que están en contacto o han estado en contacto con la molécula. Ejemplos de ensayos que miden las oscilaciones de calcio se analizan con más detalle más adelante. En algunas realizaciones, se considera que la molécula tiene una toxicidad aceptable (por ejemplo, neurotoxicidad aguda in vivo) si la molécula no reduce significativamente las oscilaciones de calcio en una célula expuesta a la molécula en comparación con las oscilaciones de calcio en una célula control. En algunas realizaciones, la célula control es una célula que no se ha expuesto a la molécula de prueba, pero por otro lado está bajo la misma condición que las células expuestas a la molécula de prueba. En algunas realizaciones, el ensayo de la oscilación de calcio puede incluir una célula control positiva (es decir, una célula expuesta a una molécula que se sabe que reduce las oscilaciones de calcio hasta un nivel intolerable) o una célula de control negativo (es decir, una célula expuesta a una molécula que se sabe que afecta a las oscilaciones de calcio en la célula). En otra realización, la célula control está expuesta a un medio que lleva la molécula de prueba al cultivo de las células neuronales, por ejemplo, agua, tampón, o solución salina, sin la molécula de prueba (es decir, vehículo control).
En una realización, la divulgación proporciona un método para ensayar, identificar, o determinar la neurotoxicidad aguda in vivo de una molécula que comprende medir las oscilaciones de calcio in vitro en células neuronales que están en contacto o han estado en contacto con la molécula. En otra realización, la divulgación incluye un método para ensayar, identificar, o determinar la neurotoxicidad aguda in vivo de una molécula que comprende (1) añadir la molécula a un cultivo de células neuronales y (2) medir las oscilaciones de calcio in vitro en las células neuronales. En otra realización, la divulgación proporciona un método para predecir la neurotoxicidad aguda in vivo de una molécula que comprende una etapa de (1) añadir la molécula a un cultivo de células neuronales y (2) medir las oscilaciones de calcio in vitro en las células neuronales.
En determinadas realizaciones, la divulgación proporciona un método para ensayar, identificar o determinar la neurotoxicidad aguda in vivo de una molécula o seleccionar o identificar una molécula que tenga neurotoxicidad aguda in vivo tolerable que comprende (i) medir las oscilaciones de calcio in vitro en células neuronales después de añadir la molécula en un cultivo de las células neuronales, en donde las oscilaciones de calcio en las células neuronales son comparables con o mayores que las oscilaciones de calcio de los controles vehículo y (ii) administrar la molécula a un ser humano en necesidad de la misma (no reivindicado).
En otras realizaciones, la divulgación incluye un método para seleccionar o identificar una molécula que tenga neurotoxicidad aguda in vivo tolerable que comprende medir las oscilaciones de calcio in vitro en células neuronales que están en contacto con la molécula, en donde las células neuronales contactadas presentan oscilaciones de calcio a un nivel comparable con o mayor que las de las células control. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para seleccionar o identificar una molécula que tenga neurotoxicidad aguda in vivo tolerable que comprende una etapa de (i) añadir una molécula a un cultivo de células neuronales y (ii) medir las oscilaciones de calcio in vitro en las células neuronales, en donde las células neuronales con la molécula presentan oscilaciones de calcio a un nivel comparable con o mayor que las de las células control.
Las oscilaciones de calcio son importantes para las funciones apropiadas de las células neuronales. Se ha demostrado que las redes de neuronas corticales se someten a oscilaciones espontáneas de calcio dando como resultado la liberación del glutamato neurotransmisor. Las oscilaciones de calcio también pueden regular las interacciones de las neuronas con glía asociada, además de otras neuronas asociadas en la red, para liberar otros neurotransmisores además del glutamato. Las oscilaciones de calcio reguladas son requeridas para la homeostasis de las redes neuronales para la función cerebral normal. (Véanse, Shashank et al., Brain Research, 1006(1): 8-17 (2004); Rose et al., Nature Neurosa., 4:773-774 (2001); Zonta et al., J. Physiol Paris., 96(3-4): 193-8 (2002); Pasti et al., J. Neurosa., 21(2): 477-484 (2001).) El glutamato también activa dos canales iónicos distintos, receptores ácido a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA) y receptores N-metil-D-aspartato (NMDA).
En algunas realizaciones, las oscilaciones de calcio medidas en los presentes métodos son oscilaciones de calcio dependientes de AMPA. En algunas realizaciones, las oscilaciones de calcio son oscilaciones de calcio dependientes de NMDA. En algunas realizaciones, las oscilaciones de calcio son oscilaciones de calcio dependientes del ácido gamma-aminobutírico (GABA). En algunas realizaciones, las oscilaciones de calcio pueden ser una combinación de dos o más oscilaciones de calcio dependientes de AMPA, dependientes de NMDA o dependientes de GABA.
En determinadas realizaciones, las oscilaciones de calcio medidas en los presentes métodos son oscilaciones de calcio dependientes de AMPA. Para medir las oscilaciones de calcio dependientes de AMPA, las oscilaciones de calcio se pueden medir en presencia de iones Mg2+ (por ejemplo, MgCh). En determinadas realizaciones, el método además comprende añadir iones Mg2+ (por ejemplo, MgCh) a una cantidad que permite la detección de las oscilaciones de calcio dependientes de AMPA. En algunas realizaciones, la concentración iónica eficaz que permite la detección de las oscilaciones de calcio dependientes de AMPA es de al menos aproximadamente 0,5 mM. En otras realizaciones, la concentración iónica eficaz de iones Mg2+ (por ejemplo, MgCh) para inducir oscilaciones de calcio dependientes de AMPA es de al menos aproximadamente 0,6 mM, al menos aproximadamente 0,7 mM, al menos aproximadamente 0,8 mM, al menos aproximadamente 0,9 mM, al menos aproximadamente 1 mM, al menos aproximadamente 1,5 mM, al menos aproximadamente 2,0 mM, al menos aproximadamente 2,5 mM, al menos aproximadamente 3,0 mM, al menos aproximadamente 4 mM, al menos aproximadamente 5 mM, al menos aproximadamente 6 mM, al menos aproximadamente 7 mM, al menos aproximadamente 8 mM, al menos aproximadamente 9 mM o al menos aproximadamente 10 mM. En una realización particular, la concentración de iones Mg2+ útil para los métodos es de 1 mM. En determinadas realizaciones, la concentración de iones Mg2+ (por ejemplo, MgCh) útil para los presentes métodos es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM, aproximadamente 1 mM a aproximadamente 15 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM, o de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 25 mM. Los iones Mg2+ pueden ser añadidos por la adición de sales de magnesio, tales como carbonato de magnesio, cloruro de magnesio, citrato de magnesio, hidróxido de magnesio, óxido de magnesio, sulfato de magnesio y sulfato de magnesio heptahidratado.
En algunas realizaciones, las oscilaciones de calcio se miden en el presente método a través del uso de sondas fluorescentes que detectan las fluctuaciones de los niveles de calcio intracelular. Por ejemplo, la detección del flujo del calcio intracelular puede conseguirse tiñendo las células con colorantes fluorescentes que se unen a los iones de calcio (conocidos como indicadores de calcio fluorescentes) con un cambio detectable resultante en la fluorescencia (por ejemplo, colorantes Fluo-4 AM y Fura Red AM comercializados por Molecular Probes. Eugene, OR, Estados Unidos de América).
Los colorantes fluorescentes útiles para el ensayo de la oscilación de calcio proporcionan con frecuencia la detección radiométrica sobre el flujo del calcio intracelular calibrando las intensidades de fluorescencia medidas como una longitud de onda. En algunas realizaciones, la fluorescencia de las células teñidas (incluidas las células individuales teñidas) puede medirse por microscopía de fluorescencia confocal, o convencional, opcionalmente en varios momentos o continuamente (por ejemplo, tiempo real) para proporcionar, por ejemplo, mediciones a intervalos regulares. Los expertos en la materia apreciarán que puede haber otros métodos adecuados para medir el flujo del calcio intracelular, por ejemplo, mediante transducción vírica de indicadores de calcio genéticamente codificados, etc.
En una realización, las oscilaciones de calcio medidas en los presentes métodos son el incremento acumulativo en las oscilaciones de calcio dentro de un cultivo de células neuronales, de modo que el tiempo para conseguir la señal de fluorescencia máxima constituye la magnitud de la respuesta de calcio. Las mediciones fluorescentes pueden analizarse para identificar las oscilaciones en el flujo del calcio intracelular y/o un "umbral" que representa un punto en el cual el flujo del calcio intracelular de una oscilación dada está progresando o bien hacia un máximo o un mínimo. En otra realización, las oscilaciones de calcio medidas en los presentes métodos son la frecuencia de las oscilaciones de calcio. La expresión "frecuencia de oscilación" se refiere al tiempo entre oscilaciones. En una realización, la frecuencia de oscilación puede determinarse por un intervalo de tiempo desde el comienzo de una primera oscilación en el flujo del calcio intracelular hasta el comienzo de una segunda oscilación en el flujo del calcio intracelular. En otras realizaciones, las oscilaciones de calcio medidas en los presentes métodos son la combinación de la frecuencia de oscilación y la magnitud.
En algunas realizaciones, las oscilaciones de calcio se midieron usando cualquier método conocido en la técnica. En determinadas realizaciones, las oscilaciones de calcio pueden medirse por un lector de placa fluorescente, por ejemplo, el lector de placa Flexstation 2 y 3 o FLIPR™ (de sus siglas en inglés "Fluorescence Imaging Plate Reader"). En otras realizaciones, las oscilaciones de calcio pueden medirse como se muestra en Murphy et al., J. Neurosa. 12, 4.834-4.845 (1992).
Las células neuronales útiles para la invención pueden aislarse de células neuronales de mamífero, por ejemplo, células neuronales de ratón, células neuronales de rata, células neuronales humanas u otras células neuronales. En determinadas realizaciones, las células neuronales no expresan un transcrito endógeno que codifica una proteína, por ejemplo, si una proteína humana es modificada en una célula de ratón, la célula de ratón tiene la versión endógena del transcrito sometido a deleción de su genoma. En determinadas realizaciones, las neuronas primarias pueden generarse mediante digestión de papaína de acuerdo con el protocolo del fabricante (Worthington Biochemical Corporation, LK0031050). En una realización, los cerebros anteriores se preparan mediante el siguiente ejemplo. Los cerebros anteriores pueden ser diseccionados de embriones E18 BAC-Tg de ratón hTau que expresan el gen diana entero en un trasfondo genético nulo para MAPTmurino y pueden incubarse a 37 °C durante 30-45 minutos en solución de papaína/ADNasa/solución salina equilibrada de Earle (EBSS). Después de la trituración y la centrifugación del sedimento celular, la reacción se para mediante la incubación con EBSS que contiene inhibidores de proteasa, albúmina de suero bovino (BSA) y ADNasa. Las células se pueden triturar y lavar con Neurobasal (NB, Invitrogen) suplementado con B-27 al 2 %, 100 pg/ml de penicilina, 85 pg/ml de estreptomicina, glutamina 0,5 mM. Las células se siembran en medio NB suplementado sobre placas de obtención de imágenes ópticas de 96 pocillos recubiertas con poli-D-lisina (BD Biosciences) a 15.000 células/pocillo.
En algunas realizaciones, las oscilaciones de calcio para una molécula que tiene neurotoxicidad aguda in vivo tolerable se comparan con las oscilaciones de calcio en una célula no expuesta a la molécula. En algunas realizaciones, las oscilaciones de calcio para una molécula con toxicidad aguda in vivo tolerable son mayores o iguales que aproximadamente un 250 %, mayores o iguales que aproximadamente un 240 %, mayores iguales que aproximadamente un 230 %, mayores o iguales que aproximadamente un 220 %, mayores iguales que aproximadamente un 210%, mayores o iguales que aproximadamente 200 %, mayores iguales que aproximadamente 190%, mayores o iguales que aproximadamente un 180%, mayores iguales que aproximadamente un 170%, mayores o iguales que aproximadamente un 160%, mayores iguales que aproximadamente un 150%, mayores o iguales que aproximadamente un 140%, mayores iguales que aproximadamente un 130%, mayores o iguales que aproximadamente un 120%, mayores iguales que aproximadamente un 110%, mayores o iguales que aproximadamente un 100%, mayores iguales que aproximadamente un 99 %, mayores o iguales que aproximadamente un 98 %, mayores iguales que aproximadamente un 97 %, mayores o iguales que aproximadamente un 96 %, mayores iguales que aproximadamente un 95 %, mayores o iguales que aproximadamente un 90 %, mayores iguales que aproximadamente un 85 %, mayores o iguales que aproximadamente un 80 %, mayores iguales que aproximadamente un 75 %, o mayores o iguales que aproximadamente un 70 % de las oscilaciones de calcio en una célula control vehículo (por ejemplo, agua o solución salina). Como se usa en el presente documento, la expresión "mayor o igual que" puede usarse indistintamente con "al menos". En otras realizaciones, las oscilaciones de calcio con toxicidad aguda in vivo tolerable son mayores o iguales que el 100 % de las oscilaciones de calcio en las células control vehículo. En determinadas realizaciones, las oscilaciones de calcio con toxicidad aguda in vivo tolerable son mayores o iguales que aproximadamente un 70 % de las oscilaciones de calcio en las células control vehículo. En determinadas realizaciones, las oscilaciones de calcio con toxicidad aguda in vivo tolerable son mayores o iguales que aproximadamente un 75 % de las oscilaciones de calcio en las células control vehículo. En otras realizaciones, las oscilaciones de calcio con toxicidad aguda in vivo tolerable son de aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 250 %, de aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 200 %, de aproximadamente un 75 % a aproximadamente un 200 %, de aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 180 %, de aproximadamente un 75% a aproximadamente un 150%, de aproximadamente un 80% a aproximadamente un 200 %, de aproximadamente un 90% a aproximadamente un 200 %, de aproximadamente un 100% a aproximadamente un 200 %, o de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 250 % de las oscilaciones de calcio en las células control vehículo.
En algunas realizaciones, las oscilaciones de calcio en una célula expuesta a una molécula que tiene una neurotoxicidad aguda in vivo tolerable presenta menos de aproximadamente un 25 %, menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 15 %, menos de aproximadamente un 10 %, menos de aproximadamente un 5 %, o menos de aproximadamente un 1 % de reducción en comparación con las oscilaciones de calcio en una célula control vehículo. En otras realizaciones, las oscilaciones de calcio en una célula expuesta a una molécula que tiene neurotoxicidad aguda in vivo tolerable se reducen en menos de aproximadamente un 30 %, menos de aproximadamente un 25%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 15%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 4 %, aproximadamente un 3 %, aproximadamente un 2 % o aproximadamente un 1 % en comparación con las oscilaciones de calcio en la células control vehículo.
En determinadas realizaciones, las moléculas que causan más de las reducciones deseadas en las oscilaciones de calcio se consideran que son moléculas que tienen neurotoxicidad inaceptable. En estas realizaciones, las moléculas que causan una reducción mayor de la deseada en las oscilaciones de calcio se consideran que tienen un riesgo de efectos secundarios tóxicos si se administran a un sujeto. En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para identificar o determinar una molécula que tenga neurotoxicidad in vivo intolerable que comprende medir las oscilaciones de calcio in vitro en células neuronales que están en contacto con la molécula en las células neuronales. En algunas realizaciones, las oscilaciones de calcio de una molécula que tiene neurotoxicidad aguda in vivo intolerable son menores que aproximadamente un 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % de las oscilaciones de calcio en una célula control vehículo. En determinadas realizaciones, la presente divulgación incluye un método para identificar o determinar una molécula que tenga neurotoxicidad in vivo intolerable que comprende medir las oscilaciones de calcio in vitro en células neuronales después de estar en contacto con la molécula en las células neuronales, en donde las oscilaciones de calcio de la molécula son iguales o menores que un 50 % de las oscilaciones de calcio en una célula control vehículo.
En algunas realizaciones, la molécula es una molécula terapéutica. En otras realizaciones, la molécula comprende una molécula pequeña, un polinucleótido, una proteína, un péptido, o cualquier combinación de los mismos. Ejemplos no limitantes de las moléculas se describen en cualquier otro sitio en el presente documento.
II.B. Métodos de puntuación de secuencia
La presente divulgación también se dirige a un método de ensayo o determinación de la neurotoxicidad in vivo de una molécula (por ejemplo, polinucleótido) que comprende una secuencia de nucleótidos. En algunas realizaciones, el método comprende medir una puntuación de secuencia calculada por la fórmula (I):
n.° de nucleótidos C y análogos de los mismos - n.° de nucleótidos G y análogos de los mismos (I)
Longitud nucleotídica total (número).
En otras realizaciones, el oligómero de la invención tiene una puntuación de secuencia mayor o igual que 0,2.
En algunas realizaciones, el método comprende medir una secuencia calculada por la fórmula (IA):
n.° de nucleótidos C y nucleótidos de 5-metilcitosina - n.° de nucleótidos C (IA)
Longitud nucleotídica total.
En otras realizaciones, el oligómero de la invención tiene una puntuación de secuencia mayor o igual que 0,2.
En estas realizaciones, una puntuación de secuencia mayor o igual que un valor de corte corresponde a una neurotoxicidad reducida del oligómero.
Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos de ATGCATGCATGCATGC (SEQ ID NO: 3) tiene una puntuación de secuencia de 0 ((4C - 4G)/16). La secuencia de GTGCGTGCGTGCGTGC (SEQ ID NO: 732) tiene una puntuación de secuencia de -0,25 ((4C - 8g )/16). La secuencia de CTGCCTGCCTGCCt Gc (SEQ ID NO: 733) tiene una puntuación de secuencia de 0,25 ((8C - 4G)/16). En determinadas realizaciones, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, un oligómero) se considera que tiene una neurotoxicidad aceptable si tiene una puntuación de secuencia mayor o igual que aproximadamente 0,2, mayor o igual que aproximadamente 0,25, mayor o igual que aproximadamente 0,3, mayor o igual que aproximadamente 0,35, mayor o igual que aproximadamente 0,4, mayor o igual que aproximadamente 0,45, mayor o igual que aproximadamente 0,5, mayor o igual que aproximadamente 0,55, mayor o igual que aproximadamente 0,6, mayor o igual que aproximadamente 0,65, mayor o igual que aproximadamente 0,7, mayor o igual que aproximadamente 0,75, mayor o igual que aproximadamente 0,8, mayor o igual que aproximadamente 0,85, mayor o igual que aproximadamente 0,9, mayor o igual que aproximadamente 0,95, mayor o igual que aproximadamente 1,0, mayor o igual que aproximadamente 1,5, mayor o igual que aproximadamente 2,0, mayor o igual que 3,0, o mayor o igual que aproximadamente 4,0. En determinadas realizaciones, un polinucleótido se considera que tiene una neurotoxicidad aceptable si tiene una puntuación de secuencia mayor o igual que 0,2, mayor o igual que 0,25, mayor o igual que 0,3, mayor o igual que 0,35, mayor o igual que 0,4, mayor o igual que 0,45, mayor o igual que 0,5, mayor o igual que 0,55, mayor o igual que 0,6, mayor o igual que 0,65, mayor o igual que 0,7, mayor o igual que 0,75, mayor o igual que 0,8, mayor o igual que 0,85, mayor o igual que 0,9, mayor o igual que 0,95, mayor o igual que 1,0, mayor o igual que 1,5, mayor o igual que 2,0, mayor o igual que 3,0 o mayor o igual que 4,0. En algunas realizaciones, la puntuación de secuencia de un polinucleótido con neurotoxicidad aceptable es igual o mayor que 0,2.
En determinadas realizaciones, las moléculas que comprenden secuencias de nucleótidos que tienen una puntuación de secuencia por debajo de los umbrales establecidos se consideran que son moléculas que tienen neurotoxicidad inaceptable. En estas realizaciones, las moléculas que tienen una puntuación de secuencia por debajo de los umbrales establecidos se consideran que tienen un riesgo de efectos secundarios tóxicos si se administran a un sujeto.
En determinadas realizaciones, cualquiera de los anteriores métodos para seleccionar una molécula pueden usarse en combinación. Cuando se usan en combinación, si la molécula se selecciona como una molécula con la neurotoxicidad aceptable para más de un método, entonces, la molécula se considera que tiene una mayor oportunidad de tener neurotoxicidad aceptable cuando se administra a un sujeto o paciente de ensayo.
En determinadas realizaciones, la presente divulgación incluye un método para seleccionar un polinucleótido que tenga una neurotoxicidad aguda in vivo tolerable que comprende (i) realizar un ensayo de la oscilación de calcio divulgado en el presente documento y (ii) calcular una puntuación de secuencia divulgada en el presente documento, en donde las oscilaciones de calcio del polinucleótido son iguales o mayores que un 75 % de las oscilaciones de calcio en una célula vehículo y la puntuación de secuencia del polinucleótido es mayor o igual que 0,25. En algunas realizaciones, el ensayo de la oscilación de calcio y/o el método de puntuación de secuencia son suficientes para predecir, identificar o determinar la neurotoxicidad aguda in vivo de una molécula y no requieren de estudios de tolerabilidad in vivo adicionales. El ensayo de la oscilación de calcio y/o el método de puntuación de secuencia pueden ser especialmente útiles para el cribado de numerosas moléculas candidatas para determinar sus neurotoxicidades in vivo.
II. C. Ensayos de tolerabilidad in vivo
En otras realizaciones, la presente invención también está dirigida a un método para seleccionar o identificar una molécula que tenga neurotoxicidad in vivo tolerable mediante la realización de estudios de tolerabilidad in vivo. Cuando el número de moléculas candidatas es pequeño, un estudio de tolerabilidad in vivo puede proporcionar un indicio directo de la neurotoxicidad in vivo. En otras realizaciones, un estudio de tolerabilidad in vivo que puede usarse junto con el ensayo de la oscilación de calcio y/o el método de puntuación de secuencia. El estudio de tolerabilidad in vivo también puede usarse después de la selección de un pequeño número de moléculas candidatas después de realizar el ensayo de la oscilación de calcio y/o el cálculo de la puntuación de secuencia. En algunas realizaciones, la puntuación de tolerabilidad in vivo se mide administrando la molécula a un mamífero no humano, por ejemplo, al cerebro del mamífero, por ejemplo, por administración intracerebroventricular (ICV) o administración intratecal (IT).
Por ejemplo, las moléculas pueden inyectarse en un animal de laboratorio por ICV o IT. El animal de laboratorio puede ser un roedor, tal como un ratón, una rata, una cobaya o un hámster, pero también puede ser otro animal normalmente usado en los ensayos en laboratorio. En determinadas realizaciones, los animales se observan a 0,5 hora, 1 hora, I , 5 horas, 2 horas, 2,5 horas, 3 horas, 3,5 horas, 4 horas, 4,5 horas o 5 horas tras la inyección de una molécula. Se observan los efectos secundarios conductuales de los animales y se puntúan según la gravedad de los efectos secundarios en una escala de cero (no efectos secundarios) a 20 (convulsiones que dan como resultado la eutanasia). La escala de tolerabilidad puede estar dividida en al menos una de las siguientes categorías neuroconductuales: 1) hiperactividad 2) actividad disminuida y arousal 3) disfunción motora/ataxia 4) postura y respiración anormal y 5) temblores/convulsiones. En algunas realizaciones, la escala de tolerabilidad comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco categorías neuroconductuales. Cada categoría se puntúa en una escala de 0-4, con la peor puntuación total posible de 20 y la mejor puntuación total posible de 0. Se observan los cambios en el comportamiento en los animales, por ejemplo en la jaula, pero se pueden observar en otros ambientes. En algunas realizaciones, los animales se sacan de la jaula para observaciones más detalladas que incluyen la medición de la fuerza de presión y el reflejo de enderezamiento.
En determinadas realizaciones, un umbral de tolerabilidad acumulativa in vivo tras una inyección de una molécula está establecido en 4. Por ejemplo, el análisis de correlación en la Figura 3 muestra que las moléculas que tienen tolerabilidad in vivo por debajo de 4 tienden a tener una puntuación de secuencia igual o mayor que 0,2.
En otras realizaciones, la divulgación incluye un método para identificar o seleccionar una molécula que tenga neurotoxicidad in vivo tolerable que comprende (i) realizar un ensayo de la oscilación de calcio, (ii) calcular la puntuación de secuencia, (iii) realizar un estudio de tolerabilidad in vivo y (iv) administrar la molécula a un mamífero en necesidad de tratamiento de una enfermedad o afección.
II. D. Ensayos de la intensidad de tubulina
En determinadas realizaciones, los métodos de la divulgación además comprenden medir las toxicidades in vivo a largo plazo de una molécula. Por ejemplo, las toxicidades a largo plazo pueden determinarse midiendo el cambio en la intensidad de tubulina en una célula por la molécula cuando la célula se pone en contacto con una molécula. En determinadas realizaciones, el cambio en la intensidad de tubulina se mide junto con uno o ambos cambios en la oscilación de calcio, la puntuación de secuencia, y/o el ensayo de tolerabilidad in vivo. Más adelante, se proporcionan ejemplos de ensayos que miden el cambio en la intensidad de tubulina en una célula. En algunas realizaciones, la molécula presenta intensidad de tubulina en una célula mayor o igual que un 99 %, mayor o igual que un 98 %, mayor o igual que un 97 %, mayor o igual que un 96 %, mayor o igual que un 95 %, mayor o igual que un 90 %, mayor o igual que un 85 %, mayor o igual que un 80 %, mayor o igual que un 75 %, o mayor o igual que un 70 % de la intensidad de tubulina en una célula que no está expuesta a la molécula, es decir, una célula control, como se ha definido anteriormente. En algunas realizaciones, la intensidad de tubulina en una célula que no está expuesta a la molécula ensayada se denomina la intensidad de tubulina en una célula control. En algunas realizaciones, la molécula reduce menos de aproximadamente un 30 %, menos de aproximadamente un 25 %, menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 15 %, menos de aproximadamente un 10 %, menos de aproximadamente un 5 % o menos de aproximadamente un 1 % de la intensidad de tubulina en una célula control vehículo.
II.E. Prueba conductual
Los presentes métodos además pueden comprender medir un comportamiento de un animal por una molécula. En una realización, el método comprende una puntuación de la prueba conductual, que se puede medir administrando la molécula a un mamífero y clasificando el comportamiento del mamífero. En determinadas realizaciones, la prueba conductual es una prueba de memoria a corto plazo, una prueba de aprendizaje y memoria espacial, un prueba de análisis de los andares, o cualquier combinación de las mismas. En una realización, el comportamiento se mide inyectando la molécula a un mamífero, por ejemplo, un cerebro de un mamífero, por ejemplo, por administración intracerebroventricular (ICV) o intratecal (IT), y clasificando el comportamiento de un mamífero en una escala de 0 a 4. En determinadas realizaciones, la puntuación conductual es menor o igual que la puntuación total de 3, la puntuación total de 2, la puntuación total de 1,o la puntuación total de 0. En algunas realizaciones, la puntuación conductual se determina como se describe en el Ejemplo 5.
En algunas realizaciones, la puntuación conductual se mide mediante los siguientes métodos, que incluyen una prueba de rechazo de objeto novedoso, un prueba de laberinto acuático, un prueba de análisis de los andares, y/o cualquier combinación de las mismas. Las moléculas terapéuticas se inyectan en un animal de laboratorio por ICV o IT. El animal de laboratorio puede ser un mamífero, por ejemplo, un roedor, tal como un ratón, una rata, una cobaya o un hámster, pero también puede ser otro animal normalmente usado en los ensayos en laboratorio. En determinadas realizaciones, los animales se observan a aproximadamente 0,5 hora, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 1,5 horas, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 2,5 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 3,5 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 4,5 horas o aproximadamente 5 horas tras la inyección de la molécula.
En una realización, una puntuación conductual se obtiene con una prueba de reconocimiento de objeto novedoso. La memoria de reconocimiento a corto plazo puede medirse usando la tarea de reconocimiento de objeto novedoso (NOR). La prueba NOR se basa en el comportamiento espontáneo de los roedores para explorar un objeto novedoso más que uno familiar (Dodart et. al., Neuroreport (1997) 8(5): 1173-8; Ennaceur and Delacour, Behav. Brain Res. (1988) 31 (1):47-59). La prueba NOR puede usarse igual que el ensayo mostrado en el Ejemplo 5 o puede modificarse como sea necesario.
En una realización, una puntuación conductual se obtiene con una prueba de laberinto acuático, tal como el Laberinto Acuático de Morris. El aprendizaje y la memoria espacial se pueden evaluar basándose en una prueba de Laberinto Acuático de Morris como se muestra en Morris J. Neurosa. (1984) 11(1):47-60) o el ensayo mostrado en el Ejemplo 5 en el presente documento. En otra realización, un ensayo del aprendizaje y la memoria espacial puede evaluarse mediante una prueba de Laberinto Acuático de Morris como sea necesario.
En una realización, una puntuación conductual se obtiene con una prueba de análisis de los andares, tal como la Pasarela ("Catwalk"). La Pasarela (Noldus, Holanda) es una técnica para el análisis de los andares automatizada y computerizada que permite la cuantificación objetiva de los múltiples parámetros estáticos y dinámicos de los andares. La prueba del análisis de los andares puede medirse por el ensayo de Pasarela mostrado en el Ejemplo 5 o un ensayo de Pasarela modificado como sea necesario.
El análisis estadístico de los datos de la prueba conductual puede analizarse usando métodos de análisis estadístico conocidos por los expertos en la materia. En algunas realizaciones, los análisis estadísticos para las pruebas conductuales se llevan a cabo usando GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Para NOR, los datos se analizan usando o bien una prueba t pareada para los análisis dentro del grupo o por un ANOVA seguido de una prueba post-hoc de Dunnett para los análisis entre grupo. Para el laberinto acuático de Morris (MWM), se usa un ANOVA de MWM repetido para analizar la fase de adquisición y un ANOVA unidireccional seguido de post-hoc de Dunnett para los análisis del ensayo de prueba.
Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, la molécula con menos reducción (70 % o más) en las oscilaciones de calcio en comparación con un control (por ejemplo, solución salina) tiene una puntuación de secuencia mayor (por ejemplo, mayor que 0,2). También, sin desear quedar ligado a ninguna teoría, la molécula con menos reducción (70 % o más) en las oscilaciones de calcio en comparación con un control y una mayor puntuación de secuencia (mayor que 0,2) tiene una menor puntuación conductual in vivo (por ejemplo, menor que 4). En otras realizaciones, la molécula con menos reducción (70 % o más) en las oscilaciones de calcio en comparación con un control y una mayor puntuación de secuencia (mayor que 0,2) tiene neurotoxicidad aguda in vivo tolerable.
II.F. Métodos de diagnóstico o terapéuticos
Las moléculas seleccionadas de acuerdo con los presentes métodos pueden utilizarse como reactivos de investigación para, por ejemplo, diagnósticos, terapias y profilaxis. En determinadas realizaciones, la invención proporciona un método para tanto seleccionar una molécula como, a continuación, utilizar la molécula.
En otras realizaciones, las moléculas seleccionadas de acuerdo con los presentes métodos son moléculas terapéuticas. En otras realizaciones más, el método que comprende un ensayo de la oscilación de calcio, un método de puntuación de secuencia, y/o el ensayo de tolerabilidad in vivo además pueden comprender administrar la molécula seleccionada a un sujeto en necesidad de la misma.
Por lo tanto, para productos terapéuticos, un animal o un ser humano, que se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno puede ser tratado administrando las moléculas de acuerdo con esta divulgación. Además se proporcionan métodos para tratar un mamífero, tal como tratar un ser humano, que se sospecha que tiene o es propenso a tener una enfermedad o afección administrando una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una o más de las moléculas de la divulgación. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar un mamífero, por ejemplo, un ser humano, que comprende (1) seleccionar una molécula que tenga neurotoxicidad aguda in vivo tolerable como se describe en cualquier otro sitio en el presente documento (por ejemplo, ensayo de la oscilación de calcio, cálculo de la puntuación de secuencia, y/o estudio de tolerabilidad in vivo) y (2) administrar la molécula al mamífero. Las moléculas, un conjugado o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención se administran normalmente en una cantidad eficaz. En algunas realizaciones, las moléculas o conjugado de la invención se usan en terapia.
La divulgación también proporciona un método para administrar una molécula a un sujeto para el tratamiento de una enfermedad o afección neurológica. En determinadas realizaciones, el trastorno neurológico es un trastorno neurodegenerativo, un trastorno epiléptico, un trastorno epiléptico adulto idiopático, o cualquier combinación de los mismos. En otras realizaciones, la enfermedad o afección es un trastorno neurodegenerativo con tauopatía (es decir, una enfermedad neurodegenerativa que implica la acumulación de proteína tau en el cerebro), un trastorno epiléptico con tauopatía (un trastorno epiléptico que implica la acumulación de proteína tau en el cerebro), un trastorno epiléptico sin tauopatía (un trastorno epiléptico que no implica la acumulación de proteína tau en el cerebro), un trastorno epiléptico adulto idiopático sin tauopatía (un trastorno epiléptico adulto idiopático que no implica la acumulación de proteína tau en el cerebro), o cualquier combinación de los mismos. En otras realizaciones determinadas, la enfermedad o afección para el tratamiento o la profilaxis es una enfermedad neurodegenerativa con tauopatía.
En determinadas realizaciones, la enfermedad o afección es parálisis supranuclear progresiva, síndrome de Down, demencia pugilística (encefalopatía traumática crónica y otra lesión cerebral traumática), demencia frontotemporal con parkinsonismo vinculado al cromosoma 17 (DFTP-17), enfermedad de Lytico-Bodig (complejo de Parkinson-demencia de Guam), demencia predominante de ovillo, ganglioglioma, gangliocitoma, meningioangiomatosis, panencefalitis esclerosante subaguda, encefalopatía plúmbica, hemimegalencefalia, esclerosis tuberosa, enfermedad de Hallervorden-Spatz, enfermedad de Pick, degeneración corticobasal gangliónica, enfermedad de granos argirófilos, degeneración corticobasal, lipofuscinosis, demencia frontotemporal, parálisis supranuclear, y degeneración lobular frontotemporal, una enfermedad de la disfunción de la red cerebral (por ejemplo, todas las formas de epilepsia y depresión), síndrome de Dravet, un trastorno de la médula espinal, una neuropatía periférica, un trastorno del nervio craneal (por ejemplo, neuralgia trigeminal), un trastorno del sistema nervioso autónomo (por ejemplo, disautonomía o atrofia del sistema múltiple), un trastorno del movimiento de un sistema nervioso central y periférico (por ejemplo, la enfermedad de Parkinson, temblor esencial, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de Tourette, esclerosis múltiple o diferentes tipos de neuropatía periférica), un trastorno del sueño (por ejemplo, narcolepsia), migraña u otros tipos de cefaleas (por ejemplo, cefaleas en racimo y cefaleas tensionales), dolor de la espalda baja y cuello, neuropatía central, una enfermedad neuropsiquiátrica, trastorno por déficit de atención con hiperactividad, autismo, enfermedad de Huntington, síndrome de Rett, síndrome de Angelman, psicosis orgánica, una infección del cerebro o la médula espinal (incluida meningitis), o una enfermedad priónica), anemia, cáncer, leucemia, una afección inflamatoria o una enfermedad autoinmunitaria (por ejemplo, artritis, psoriasis, lupus eritematoso, esclerosis múltiple), una infección bacteriana y cualquier combinación de los mismos.
En otras realizaciones determinadas, la enfermedad o afección es una enfermedad neurodegenerativa con tauopatía, por ejemplo, parálisis supranuclear progresiva, demencia frontotemporal-tau (DFT-tau), demencia frontotemporal y parkinsonismo vinculado al cromosoma 17 (DFTP-17), degeneración corticobasal (DCB), lesión cerebral traumática, encefalopatía traumática crónica, enfermedades neurocognitivas asociadas a VIH, enfermedad de granos argirófilos, síndrome de Down-enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitiva leve amnésica-enfermedad de Alzheimer, demencia asociada a la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Hallervorden-Spatz (neurodegeneración asociada a pantotenato cinasa), enfermedad de Niemann Pick tipo C, distrofia miotónica, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson o enfermedad de Huntington. En determinadas realizaciones, la enfermedad o afección es un trastorno epiléptico con tauopatía, por ejemplo, hemimegalencefalia, complejo de esclerosis tuberosa, displasia cortical focal tipo 2b o tumores celulares de ganglio. En determinadas realizaciones, la enfermedad o afección es un trastorno epiléptico sin tauopatía, por ejemplo, síndrome de Dravet (epilepsia mioclónica grave del lactante), epilepsia lobular temporal, síndrome de Ohtahara (encefalopatía epiléptica infantil temprana con estallidos de supresión), enfermedad corporal de lafora, epilepsia generalizada con crisis febriles, espamos infantiles (síndrome de West), síndrome de Lennox Gastaut, síndrome de Angelman, síndrome de Rett o síndrome de Landau Kleffner. En determinadas realizaciones, la enfermedad o afección es un trastorno epiléptico adulto idiopático sin tauopatía, por ejemplo, crisis focales, crisis focales simples (no pérdida de conciencia), crisis focal discognitiva (deterioro de la conciencia), crisis focal que evoluciona hasta convulsiones generalizadas tónicas-clónicas (GTC), crisis generalizadas (convulsivas o no convulsivas con descargas bilaterales que implican las estructuras corticales), crisis de ausencia, crisis mioclónicas, crisis clónicas, crisis tónicas, crisis tónicas-clónicas o crisis atónicas. En determinadas realizaciones, la enfermedad o afección es un trastorno autístico, un trastorno del espectro del autismo (por ejemplo, como se define en el "Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders V (DSM-V)"), un trastorno de Asperge o un trastorno del desarrollo generalizado.
La invención además proporciona una molécula de acuerdo con la invención, para su uso para el tratamiento de una o más de las enfermedades asociadas a las células neuronales o referidas en el presente documento, tal como una enfermedad seleccionada entre la enfermedad de Alzheimer, parálisis supranuclear progresiva, síndrome de Down, demencia pugilística (encefalopatía traumática crónica y otra lesión cerebral traumática), demencia frontotemporal con parkinsonismo vinculado al cromosoma 17 (DFTP-17), enfermedad de Lytico-Bodig (complejo de Parkinson-demencia de Guam), demencia predominante de ovillo, ganglioglioma, gangliocitoma, meningioangiomatosis, panencefalitis esclerosante subaguda, encefalopatía plúmbica, hemimegalencefalia, esclerosis tuberosa, enfermedad de Hallervorden-Spatz, enfermedad de Pick, degeneración corticobasal gangliónica, enfermedad de granos argirófilos, degeneración corticobasal, lipofuscinosis, demencia frontotemporal, parálisis supranuclear, y degeneración lobular frontotemporal (revisado en Frost et al., Trends Cell Biol. (2015) 25: 216-53; Dyment et. al., Neurobiol. Aging (2014) 6 de septiembre: S0197-4580; Moussaud et. al., Mol. Neurodeg. (2014) 29:43 Ross et. al., South Med. J. (2014) 107: 715-21), enfermedad de Huntington, síndrome de Rett, y síndrome de Angelman. Adicionalmente, la invención proporciona el uso de molécula terapéutica para el tratamiento de enfermedades de la disfunción de la red cerebral que incluyen todas las formas de epilepsia y depresión (Inoue et. al., Epilepsy (2012) 102: 8-12; Xi et. al., Med. Hypotheses (2011) 76: 897-900; Hou et. al., Can. J. Psychiatry (2004) 3: 164-71).
La divulgación también proporciona el uso de las moléculas o conjugados de la invención como se describe para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno como se refiere en el presente documento, o un método del tratamiento de una trastorno como se refiere en el presente documento. También se proporciona una composición para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno como se refiere en el presente documento.
III. Moléculas (por ejemplo, moléculas terapéuticas)
Las moléculas a cribar o seleccionar de acuerdo con la presente invención incluyen moléculas terapéuticas. En una realización, una molécula terapéutica comprende una proteína, un péptido, un polinucleótido (por ejemplo, un oligómero), un sacárido, un lípido, un liposoma y una partícula, un biomaterial, un producto farmacéutico, una vitamina, un ácido nucleico, un aminoácido, un polipéptido, un cofactor enzimático, un esteroide, un hidrato de carbono, heparina, un agente que contiene metal, un antagonista del receptor, un agonista del receptor, un receptor o una porción de un receptor, una proteína de la matriz extracelular, una molécula de la superficie celular, un antígeno, un hapteno, una molécula pequeña, o una combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, una molécula terapéutica es una proteína que comprende citocinas, enzimas, factores de crecimiento, anticuerpo monoclonal, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de cadena sencilla, albúmina, inmunoglobulinas, factores de coagulación, somatropina, amilasa, lipasa, proteasa, celulosa, uroquinasa, galactosidasa, estafiloquinasa, hialuronidasa, activador del plasminógeno tisular o cualquier combinación de los mismos.
En una realización, una molécula de la invención comprende al menos una de una molécula terapéutica que es un sitio de unión a antígeno (por ejemplo, un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, variante de anticuerpo o fragmento de anticuerpo), una porción de unión a receptor del ligando, o un porción de unión a ligando de un receptor.
En otra realización, una molécula de la invención se dirige a una o más proteínas o péptidos endógenamente producidos in vivo, uno o más ARNm o pre-ARNm que codifican las proteínas o péptidos, uno o más genes que codifican las proteínas o péptidos. En algunas realizaciones, la molécula comprende un polinucleótido (por ejemplo, oligómero), un nucleótido, o una molécula pequeña.
Una molécula pequeña también puede comprender cualquier molécula pequeña terapéutica o fármaco como la molécula terapéutica útil para los métodos divulgados en el presente documento. Las moléculas pequeñas pueden comprender cualquier molécula terapéutica que no sea un péptido, un polipéptido, una proteína, y un polinucleótido. La molécula pequeña puede incluir un único nucleótido o nucleósido, por ejemplo, ARN o ADN.
En una realización, la molécula terapéutica modula la activación o la inhibición celular (por ejemplo, uniéndose a un receptor de superficie celular y dando como resultado la transmisión de una señal activadora o inhibidora). En una realización, la molécula terapéutica es capaz de iniciar la transducción de una señal que da como resultado la muerte celular (por ejemplo, mediante una vía inducida por la señal celular, mediante fijación del complemento o exposición a una carga (por ejemplo, una carga tóxica) presente sobre la molécula de unión), o que modula una enfermedad o trastorno en un sujeto (por ejemplo, mediando o fomentando la muerte celular, o modulando la cantidad de una sustancia que está biodisponible (por ejemplo, aumentando o reduciendo la cantidad de un ligando tal como TNFa en un sujeto)). En otra realización, las moléculas de la invención tienen al menos un sitio de unión específico para un antígeno al que se dirige para su reducción o eliminación, por ejemplo, un antígeno de superficie celular o un antígeno soluble.
En otra realización, la unión de una molécula terapéutica de la invención a una molécula diana (por ejemplo, antígeno) da como resultado la reducción o eliminación de la molécula diana o una expresión celular de la molécula diana, por ejemplo, desde un tejido o la circulación. En otra realización, la molécula terapéutica tiene al menos un sitio de unión específico para una molécula diana que puede usarse para detectar la presencia de la molécula diana (por ejemplo, para detectar un contaminante o diagnosticar una afección o trastorno). A continuación, se analizan más las moléculas terapéuticas ilustrativas.
III.A. Porciones de unión a antígeno
En determinadas realizaciones, una molécula útil para la divulgación comprende al menos una molécula terapéutica que es un sitio de unión, por ejemplo, una porción de unión a antígeno de un anticuerpo. En una realización, la molécula para los métodos desvelados en el presente documento es un polipéptido.
En otras realizaciones, un sitio de unión de una molécula de la invención comprende una porción de unión a antígeno de un anticuerpo. La expresión "porción de unión a antígeno" se refiere a un fragmento polipeptídico de una inmunoglobulina, un anticuerpo o una variante de anticuerpo que se unen al antígeno o compiten con el anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del cual se derivan) para la unión a antígeno (es decir, la unión específica). Por ejemplo, las porciones de unión a antígeno pueden derivarse de cualquiera de los anticuerpos o variantes de anticuerpos conocidos en la técnica. La porciones de unión a antígeno pueden producirse por métodos recombinantes o bioquímicos que son bien conocidos en la técnica. Fragmentos de unión a antígeno ilustrativos incluyen las regiones VH y VL, Fv, Fab, Fab' y (Fab')2.
En otras realizaciones, una molécula terapéutica de la invención comprende un sitio de unión de una molécula de unión de cadena sencilla (por ejemplo, una región variable de cadena sencilla o scFv). Las técnicas descritas para la producción de los anticuerpos de cadena sencilla (patente de los Estados Unidos N.° 4.694.778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5.879-5.883 (1988); y Ward et al., Nature 334:544-554 (1989)) se pueden adaptar para producir moléculas de cadena sencilla. Los anticuerpos de cadena sencilla se forman uniendo los fragmentos de la cadena pesada y ligera de la región Fv mediante un puente de aminoácidos, dando como resultado un anticuerpo de cadena sencilla. También pueden usarse técnicas para el ensamblaje de los fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra et al., Science 242:1.038-1.041 (1988)).
Los polipéptidos útiles para la divulgación pueden comprender una región o porción variable de los mismos (por ejemplo, un dominio VL y/o VH) derivada de un anticuerpo usando los protocolos reconocidos en la técnica o pueden obtenerse de un anticuerpo reconocido en la técnica usando técnicas de biología molecular convencionales.
En una realización, una molécula útil para la invención se une a una molécula que es útil en el tratamiento del cáncer.
En otras realizaciones más, una molécula útil para la invención se une a una molécula que es útil en el tratamiento de una enfermedad o trastorno autoinmunitario o inflamatorio.
Por ejemplo, una molécula, por ejemplo, un polipéptido, puede unirse a un antígeno presente sobre una célula inmunitaria (por ejemplo, un linfocito B o T) o un autoantígeno responsable de una enfermedad o trastorno autoinmunitario. Ejemplos de enfermedades autoinmunitarias que se pueden diagnosticar, prevenir o tratar por los métodos y las composiciones de la presente invención incluyen, pero sin limitación, enfermedad de Crohn; enfermedad inflamatoria intestinal (EII); lupus eritematoso sistémico; colitis ulcerosa; artritis reumatoide; síndrome de Goodpasture; enfermedad de Graves; tiroiditis de Hashimoto; pénfigo vulgar; miastenia grave; esclerodermia; anemia hemolítica autoinmunitaria; púrpura trombocitopénica autoinmunitaria; polimiositis y dermatomiositis; anemia perniciosa; síndrome de Sjogren; espondilitis anquilosante; vasculitis; diabetes mellitus de tipo I; trastornos neurológicos, esclerosis múltiple, y enfermedades secundarias causadas como resultado de las enfermedades autoinmunitarias.
En otras realizaciones, una molécula terapéutica de la invención que se une a una molécula diana asociada a una enfermedad o trastorno inflamatorio. Como se usa en el presente documento la expresión "enfermedad o trastorno inflamatorio" incluye enfermedades o trastornos que están causados, al menos en parte, o exacerbados por inflamación, por ejemplo, flujo sanguíneo incrementado, edema, activación de las células inmunitarias (por ejemplo, proliferación, producción de citocina, o fagocitosis aumentada). Por ejemplo, una molécula de la invención puede unirse a un factor inflamatorio (por ejemplo, una metaloproteinasa de la matriz (MMP), TNFa, una interleucina, una proteína plasmática, una citocina, un metabolito lipídico, una proteasa, un radical tóxico, una proteína mitocondrial, una proteína apoptótica, una molécula de adhesión, etc.) implicadas o presentes en un área en las cantidades aberrantes, por ejemplo, en cantidades que pueden ser ventajosas para alterar, por ejemplo, beneficiar al sujeto. El proceso inflamatorio es la respuesta del tejido vivo al daño. La causa de la inflamación puede deberse a daño físico, sustancias químicas, microorganismos, necrosis tisular, cáncer u otros agentes. La inflamación aguda es de corta duración, por ejemplo, y dura solo unos pocos días. Sin embargo, si es de mayor duración, entonces, se puede denominar inflamación crónica.
Los trastornos inflamatorios incluyen trastornos inflamatorios agudos, trastornos inflamatorios crónicos, y trastornos inflamatorios recurrentes. Los trastornos inflamatorios agudos generalmente son de duración relativamente corta, y duran de aproximadamente unos pocos minutos a aproximadamente uno o dos días, aunque pueden durar varias semanas. Las características principales de los trastornos inflamatorios agudos incluyen flujo sanguíneo incrementado, exudación de las proteínas del fluido y el plasma (edema) y emigración de leucocitos, tales como neutrófilos. Los trastornos inflamatorios crónicos, generalmente, son de mayor duración, por ejemplo, semanas a meses a años o incluso más, y están histológicamente asociados a la presencia de linfocitos y macrófagos y con la proliferación de vasos sanguíneos y tejido conectivo. Los trastornos inflamatorios recurrentes incluyen trastornos que vuelven a producirse después de un periodo de tiempo o que tienen episodios periódicos. Ejemplos de trastornos inflamatorios recurrentes incluyen asma y esclerosis múltiple. Algunos trastornos pueden caer dentro de una o más categorías. Los trastornos inflamatorios generalmente se caracterizan por calor, enrojecimiento, hinchazón, dolor y pérdida de la función. Ejemplos de causas de trastornos inflamatorios incluyen, pero sin limitación, infecciones microbianas (por ejemplo, infecciones bacterianas, víricas y fúngicas), agentes físicos (por ejemplo, quemaduras, radiación y traumatismo), agentes químicos (por ejemplo, toxinas y sustancias cáusticas), necrosis tisular y diferentes tipos de reacciones inmunológicas. Ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen, pero sin limitación, osteoartritis, artritis reumatoide, infecciones agudas y crónicas (bacterianas, víricas y fúngicas); bronquitis aguda y crónica, sinusitis y otras infecciones respiratorias, incluido el resfriado común; gastroenteritis aguda y crónica y colitis; cistitis aguda y crónica y uretritis; síndrome de la dificultad respiratoria aguda; fibrosis quística; dermatitis aguda y crónica; conjuntivitis aguda y crónica; serositis aguda y crónica (pericarditis, peritonitis, sinovitis, pleuritis y tendinitis); pericarditis urémica; colecistitis aguda y crónica; vaginitis aguda y crónica; uveítis aguda y crónica; reacciones farmacológicas; y quemaduras (térmicas, químicas y eléctricas).
En incluso otras realizaciones, una molécula terapéutica de la invención se une a una molécula que es útil en el tratamiento de una enfermedad o trastorno neurológico. Por ejemplo, un polipéptido puede unirse a un antígeno presente sobre una célula neuronal (por ejemplo, una neurona o una célula glial). En determinadas realizaciones, el antígeno asociado a un trastorno neurológico puede ser un trastorno autoinmunitario o inflamatorio descrito supra. Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad o trastorno neurológico" incluye trastornos o afecciones en un sujeto en donde el sistema nervioso se degenera (por ejemplo, trastornos neurodegenerativos, así como trastornos en donde el sistema nervioso falla en desarrollarse apropiadamente o falla en regenerarse tras la lesión, por ejemplo, lesión de la médula espinal. Ejemplos de trastornos neurológicos que se pueden diagnosticar, prevenir o tratar por los métodos y las composiciones de la presente invención incluyen, pero sin limitación, esclerosis múltiple, enfermedad de Huntington, síndrome de Rett, síndrome de Angelman, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, parálisis supranuclear progresiva, epilepsia, síndrome de Dravet, dolor neuropático, lesión cerebral traumática, síndrome de Guillain-Barré y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC).
En otros aspectos, la molécula terapéutica de la invención comprende sitios de unión a antígeno, o porciones de los mismos, derivados de las formas modificadas de los anticuerpos. Ejemplos de tales formas incluyen, por ejemplo, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, nanocuerpos, camélidos, Dab, anticuerpos tetravalentes, intradiacuerpos (por ejemplo, Jendreyko et al. 2003. J. Biol. Chem. 278:47.813), proteínas de fusión (por ejemplo, proteínas de fusión de citocina a anticuerpo, proteínas fusionadas a al menos una porción de un receptor de Fc), y anticuerpos biespecíficos.
III.B. Moléculas de unión no inmunoglobulina
En otras realizaciones determinadas, una molécula terapéutica de la invención comprende uno o más sitios de unión derivados de una molécula de unión no inmunoglobulina. Como se usa en el presente documento, la expresión "moléculas de unión no inmunoglobulina" son moléculas de unión cuyos sitios de unión comprenden una porción (por ejemplo, un armazón o marco) que se deriva de un polipéptido distinto de una inmunoglobulina, pero que puede modificarse por ingeniería genética (por ejemplo, mutarse) para conferir una especificidad de unión deseada.
Otros ejemplos de moléculas terapéuticas no derivadas de moléculas de anticuerpo incluyen sitios de unión a receptor y sitios de unión a ligando que se analizan con más detalle infra.
Las fracciones terapéuticas no inmunoglobulinas pueden comprender porciones del sitio de unión que se derivan de un miembro de la superfamilia de la inmunoglobulina que no es una inmunoglobulina (por ejemplo, un receptor de linfocitos T o una proteína de adhesión a célula (por ejemplo, CTLA-4, N-CAM, teloquina)). Tales moléculas de unión comprenden una porción del sitio de unión que conserva la conformación de un pliegue de inmunoglobulina y es capaz de unirse específicamente a un epítopo IGF1-R. En otras realizaciones, las moléculas de unión no inmunoglobulina de la invención también comprenden un sitio de unión con una topología proteica que no se basa en el pliegue de inmunoglobulina (por ejemplo, tal como proteínas con repeticiones de anquirina o fibronectinas) pero que no obstante son capaces de unirse específicamente a una diana (por ejemplo, un epítopo IGF-1R).
En una realización, se deriva una fracción terapéutica de una molécula de unión a fibronectina. Las moléculas de unión a fibronectina (por ejemplo, moléculas que comprenden los dominios de Fibronectina tipo I, II o III) muestran bucles tipo CDR que, a diferencia de las inmunoglobulinas, no dependen de los puentes disulfuro intracadena. En una realización ilustrativa, el polipéptido de fibronectina es AdNectin® (Adnexus Therpaeutics, Waltham, MA).
En otra realización, una molécula terapéutica de la invención comprende un sitio de unión de una Affibody® (Abcam, Cambridge, MA). En otra realización, una molécula terapéutica de la invención comprende un sitio de unión de una Anticalin® (Pieris AG, Friesing, Alemania). En otra realización, una molécula terapéutica de la invención comprende un sitio de unión de un polipéptido rico en cisteína. En otras realizaciones, una molécula terapéutica de la invención comprende un sitio de unión de una proteína con repeticiones. Otros sitios de unión no inmunoglobulina que pueden emplearse en las moléculas de la invención incluyen sitios de unión derivados de dominios de homología Src (por ejemplo, dominios SH2 o SH3), dominios PDZ, beta-lactamasa, inhibidores de proteasa de alta afinidad, o pequeños armazones de la proteína de unión a disulfuro tales como toxinas de escorpiones.
III.C. Porciones de unión de receptores o ligandos
En otros aspectos, una molécula de la invención comprende un sitio de unión a ligando de un receptor y/o una porción de unión a receptor de un ligando. A continuación, se exponen porciones de unión ilustrativas de los receptores o ligandos que pueden estar presentes en una molécula de la invención:
III.C.1. Citoánas y receptores de atocinas
Las citocinas tienen efectos pleiotrópicos sobre la proliferación, la diferenciación y la activación funcional de los linfocitos. Se pueden utilizar diferentes citocinas, o porciones de unión a receptor de las mismas, en las proteínas de fusión de la invención como moléculas terapéuticas, sitios de unión y/o dominios. Citocinas ilustrativas incluyen las interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13 y IL-18), los factores estimulantes de colonias (CSF) (por ejemplo, CSF de granulocitos (G-CSF), CSF de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), y CSF de monocitos y macrófagos (M-CSF)), factor de necrosis tumoral (TNF) alfa y beta, antígeno 4 asociado a linfocito T citotóxico (CTLA-4), e interferones tales como el interferón-a, p, o y (Patente de los Estados Unidos N.° 4.925.793 y 4.929.554).
Los receptores de citocina normalmente consisten en una cadena alfa específica a ligando y una cadena beta común. Receptores de citocina ilustrativos incluyen aquellos para GM-CSF, IL-3 (Patente de los Estados Unidos N.° 5.639.605), IL-4 (Patente de los Estados Unidos N.° 5.599.905), IL-5 (Patente de los Estados Unidos N.° 5.453.49l), receptor de IL10, IFNy (EP0240975), y la familia de receptores de TNF (por ejemplo, TNFa (por ejemplo, TNf R-1 (documento EP 417.563), TNFR-2 (documento EP 417.014) receptor de linfotoxina beta).
III.C.2. Proteínas de adhesión
Las moléculas de adhesión son proteínas unidas a membrana que permiten que las células interactúen unas con otras. Diferentes proteínas de adhesión, entre las que se incluyen los receptores de retorno leucocítico dirigido y moléculas de adhesión celular, o porciones de unión a receptor de las mismas, pueden incorporarse en una proteína de fusión de la invención como moléculas terapéuticas, sitios de unión y/o dominios. Los receptores de retorno leucocítico dirigido se expresan sobre las superficies celulares de los leucocitos durante la inflamación e incluyen las integrinas p-1 (por ejemplo, VLA-1, 2, 3, 4, 5, y 6) que median la unión a los componentes de la matriz extracelular, y las integrinas p2 (por ejemplo, LFA-1, LPAM-1, CR3 y CR4) que unen moléculas de adhesión celular (CAM) sobre el endotelio vascular. Ca M ilustrativas incluyen ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1 y MAdCAM-1. Otras CAM incluyen aquellas de la familia de la selectina que incluye E-selectina, L-selectina y P-selectina.
III.C.3. Quimiocinas
Las quimiocinas, proteínas quimiotácticas que estimulan la migración de los leucocitos hacia un sitio de infección, también pueden incorporarse en una proteína de fusión de la invención. Quimiocinas ilustrativas incluyen proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP-1-a y MIP-1-p), factor quimiotáctico de neutrófilos, y RANTES (regulada en la activación normalmente expresada y secretada por linfocito T).
III.C.4. Hormonas
Hormonas de crecimiento ilustrativas para su uso como fracciones terapéuticas en las proteínas de fusión de la invención incluyen renina, hormona del crecimiento humano (HGH; Patente de los Estados Unidos N.° 5.834.598), hormona del crecimiento humano de N-metionilo; hormona del crecimiento bovino; factor de liberación de la hormona del crecimiento; hormona paratiroidea (PTH); hormona estimulante tiroidea (TSH); tiroxina; proinsulina e insulina (Patentes de los Estados Unidos N.° 5.157.021 y 6.576.608); hormona folículo estimulante (FSH); calcitonina, hormona luteinizante (LH), leptina, glucagón; bombesina; somatropina; sustancia inhibidora de mulleriana; relaxina y prorelaxina; péptido asociado a gonadotropina; prolactina; lactógeno placentario; proteína OB; o sustancia inhibidora de mulleriana.
III.C.5. Receptores y ligandos
En una realización, un péptido de la invención combina el sitio o los sitios de unión del ligando o el receptor (por ejemplo, el dominio extracelular (ECD) de un receptor) con al menos una región Fc genéticamente fusionada (es decir, la región scFc). En determinadas realizaciones, la porción de unión a ligando de un receptor se deriva de un receptor seleccionado entre un receptor de la superfamilia de la inmunoglobulina (Ig) (por ejemplo, un receptor de linfocito T soluble, por ejemplo, mTCR® (Medigene AG, Munich, Alemania)), un receptor de la superfamilia de receptores de TNF descrita supra (por ejemplo, un receptor de TNFa soluble de una inmunoadhesina), un receptor de la familia de receptores del factor neurotrófico derivado de célula glial (GDNF) (por ejemplo, GFRa3), un receptor de las superfamilia de receptores acoplados a proteína G (GPCR), un receptor de la superfamilia de receptores de la tirosina cinasa (TK), un receptor de la superfamilia regulado por ligando (LG), un receptor de la superfamilia de receptores de la quimiocina, superfamilia de receptores tipo IL-1/Toll (TLR), y una superfamilia de receptores de citocina.
En otras realizaciones, el sitio de unión o dominio de la porción de unión a receptor de un ligando se deriva de un ligando unido por un anticuerpo o variante de anticuerpo descrito supra. Por ejemplo, el ligando puede unirse a un receptor seleccionado del grupo que consiste en un receptor de la superfamilia de la Inmunoglobulina (Ig), un receptor de la superfamilia de receptores de TNF, un receptor de la superfamilia de receptores acoplados a proteína G (GPCR), un receptor de la superfamilia de receptores de la tirosina cinasa (TK), un receptor de la superfamilia regulado por ligando (LG), un receptor de la superfamilia de receptores de la quimiocina, superfamilia de receptores tipo IL-1/Toll (TLR), y una superfamilia de receptores de citocina. En una realización ilustrativa, el sitio de unión de la porción de unión a receptor de un ligando se deriva de un ligando que pertenece a la superfamilia de ligandos TNF descrita supra (por ejemplo, CD40L).
En las proteínas de fusión de la invención pueden incorporarse factores de crecimiento o sus receptores (o las porciones de unión a receptor o unión a ligando de los mismos). Factores de crecimiento ilustrativos incluyen el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y sus isoformas (Patente de los Estados Unidos N.° 5.194.596); factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), que incluyen aFGF y bFGF; factor natriurético atrial (ANF); factores de crecimiento hepático (HGF; Patentes de los Estados Unidos N.° 5.227.158 y 6.099.841), factores neurotróficos tales como el factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF), ligandos del factor neurotrófico derivado de célula glial (por ejemplo, GDNF, neuturina, artemina, y persefina), neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6), o un factor de crecimiento del nervio tal como NGF-p factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (Patente de los Estados Unidos N.° 4.889.919, 4.845.075, 5.910.574 y 5.877.016); factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta (documento WO 90/14359), factores osteoinductivos entre los que se incluyen la proteína morfogenética ósea (BMP); factores de crecimiento tipo insulina I y II (IGF-I y IGF-II; Patentes de los Estados Unidos N.° 6.403.764 y 6.506.874); eritropoyetina (EPO); trombopoyetina (TPO; factor de célula madre (SCF), trombopoyetina (TPO, ligando c-MpI), y los polipéptidos Wnt (patente de los Estados Unidos N.° 6.159.462).
Receptores del factor de crecimiento ilustrativos que se pueden usar como fracciones terapéuticas de la invención incluyen receptores de EGF; receptores de VEGF (por ejemplo, Flt1 o Flk1/KDR), receptores de PDGF (documento WO 90/14425); receptores de HGF (patentes de los Estados Unidos N.° 5.648.273 y 5.686.292) y receptores neurotróficos entre los que incluyen el receptor de baja afinidad (LNGFR), también denominado p75NTR o p75, que une NGF, BDNF y NT-3 y los receptores de alta afinidad que son miembros de la familia trk de las tirosina cinasas receptoras (por ejemplo, trkA, trkB (documento EP 455.460), trkC (documento EP 522.530)).
III.C.6. Receptores heterodiméricos
En una realización, los antagonistas a las citocinas que utilizan un componente determinante de la especificidad p que, cuando se combinan con la citocina, se unen a un primer componente de transducción de la señal p para formar un intermediario no funcional que, a continuación, se une a un segundo componente de transducción de la señal p provocando la dimerización del receptor p y la consiguiente transducción de la señal puede realizarse usando los métodos de la invención. Tales moléculas están descritas en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N.° 6.927.044). En un ejemplo, un componente determinante de la especificidad soluble del receptor y el dominio extracelular del primer componente de la transducción de la seña p del receptor de citocina se combinan para formar un heterodímero que se une a la citocina para formar un complejo no funcional. Citocinas ilustrativas que pueden inhibirse usando tales receptores heterodiméricos incluyen: IL1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-3, IL-4, IL-5, IL-11, IL-15, GMCSF, LIF, INFa y TGFp.
III.D. Molécula que comprende un polinucleótido
Una molécula para la divulgación también puede comprender un polinucleótido (por ejemplo, oligómeros). En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos codifica cualquier polipéptido anteriormente divulgado en las Secciones III.A, III.B y NI.C.1-NI.C.5. En determinadas realizaciones, la secuencia de nucleótidos se une o hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos (ADN o ARN, por ejemplo, pre-ARNm o ARNm) que codifica uno o más polipéptidos anteriormente divulgados en las Secciones III.A, III.B., y NI.C.1-NI.C.5. La expresión "secuencia de nucleótidos" en el presente documento significa la molécula en la que más de dos nucleótidos están conectados entre sí como una secuencia. En una realización, la secuencia de nucleótidos para la presente divulgación es ADN. En otra realización, la secuencia de nucleótidos para la presente divulgación es ARN. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos para la presente divulgación es una combinación de ADN y ARN. En otras realizaciones más, la secuencia de nucleótidos para la divulgación comprende uno o más nucleótidos químicamente modificados. En incluso otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos comprende al menos dos nucleótidos, al menos tres nucleótidos, al menos cuatro nucleótidos, al menos cinco nucleótidos, al menos seis nucleótidos, al menos siete nucleótidos, al menos ocho nucleótidos, al menos nueve nucleótidos, al menos 10 nucleótidos, o al menos 11 nucleótidos de longitud. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos comprende al menos 15 nucleótidos, al menos 20 nucleótidos, al menos 25 nucleótidos, al menos 30 nucleótidos, al menos 35 nucleótidos, al menos 40 nucleótidos, al menos 45 nucleótidos, al menos 50 nucleótidos, al menos 55 nucleótidos, al menos 60 nucleótidos, al menos 65 nucleótidos, al menos 70 nucleótidos, al menos 80 nucleótidos, al menos 90 nucleótidos, al menos 100 nucleótidos, al menos 150 nucleótidos, al menos 200 nucleótidos, al menos 300 nucleótidos, al menos 400 nucleótidos, al menos 500 nucleótidos, al menos 600 nucleótidos, al menos 700 nucleótidos, al menos 800 nucleótidos, al menos 900 nucleótidos, al menos 1.000 nucleótidos, al menos 2.000 nucleótidos, al menos 3.000 nucleótidos, o al menos 4.000 nucleótidos. En este sentido, la secuencia de nucleótidos de la invención puede afectar a la inhibición indirecta de la proteína a través de una reducción en los niveles de ARNm, normalmente en una célula de mamífero, tal como una célula de ser humano, tal como una neurona. Las secuencias de nucleótidos de cualquier tipo pueden analizarse usando los métodos de la presente invención. En determinadas realizaciones, las secuencias de nucleótidos que se dirigen a pre-ARNm o ARNm que se expresan principalmente en neuronas como proteínas se analizan para las características seleccionadas como las analizadas en cualquier otro sitio en el presente documento. Ejemplos de genes sobre los que pueden actuar las secuencias de nucleótidos seleccionadas por los métodos de la presente invención incluyen, pero sin limitación, la proteína asociada a microtúbulos tau (codificada por el gen MAPT), la proteína soluble ácida de cerebro 1 (codificada por el gen BASP1), o la proteína precursora amiloide (codificada por el gen APP). En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos para los presentes métodos es un oligómero.
III.D.1. Oligómeros (Oligonucleótido antisentido)
En determinadas realizaciones, la molécula terapéutica útil para la invención es un oligómero. Los oligómeros tienen una secuencia de nucleótidos de 10 - 50, tal como de 10 - 30 nucleótidos de longitud que comprende una secuencia de nucleótidos contigua de un total de 10 - 30 nucleótidos.
En determinadas realizaciones, los oligómeros se dirigen a la proteína asociada a microtúbulos tau (MAPT). En un estado patológico asociado a la enfermedad, MAPT también se conoce como proteína del ovillo neurofibrilar o filamento helicoidal emparejado-tau (PHF-tau). La secuencia para el gen de MAPT puede encontrarse bajo el número de acceso públicamente disponible NC_000017.11 y la secuencia para el transcrito del pre-ARNm de MAPT puede encontrarse bajo el número de acceso públicamente disponible NG_007398. La secuencia para la proteína Tau puede encontrarse bajo los números de acceso públicamente disponibles: P10636, P18518, Q14799, Q15549, Q15550, Q15551, Q1RMF6, Q53YB1, Q5CZI7, Q5XWF0, Q6QT54, Q9UDJ3, Q9UMH0 y Q9UQ96. Se conocen variantes naturales del producto génico de MAPT. Por ejemplo, las variantes naturales de la proteína Tau pueden contener una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas de: R5H, R5L, D285N, V289A, K574T, L583V, G589V, N596K, N613H, P618L, P618S, G620V, S622N, K634M, S637F, V654M, E659V, K686I, G706R, R723W o cualquier combinación de las mismas. Por lo tanto, los oligómeros de la presente invención pueden estar diseñados para reducir o inhibir la expresión de las variantes naturales de la proteína Tau. La secuencia de la proteína Tau se proporciona como SEQ ID NO: 1, y una secuencia de nucleótidos se proporciona como SEQ ID NO: 2.
En determinadas realizaciones, los oligómeros se dirigen a un pre-ARNm o ARNm que codifica la proteína soluble ácida de cerebro 1 (BASP1). BASP1 también es conocida como proteína ácida enriquecida de tejido neuronal de 22 kDa, proteína de membrana axonal neuronal NAP-22, NAP22, CAP-23, NAP-22, CAP23, o proteína ácida enriquecida de tejido neuronal. El gen de BASP1 codifica una proteína unida a membrana con varios sitios de fosforilación transitorios y motivos PEST. La conservación de las proteínas con secuencias PEST entre diferentes especies soporta su importancia funcional. Las secuencias PEST normalmente se dan en proteínas con altas tasas de renovación. Las características inmunológicas de esta proteína son específicas a especies. La proteína también se somete a miristoilación N-terminal.
Otro ejemplo de una secuencia de ácido nucleico diana de los oligómeros es pre-ARNm de BASP1 o ARNm de BASP1. El ADNc de BASP1 que corresponde al ARNm de BASP1 se conoce como el número de acceso GenBank NM_006317.4.
En determinadas realizaciones, las moléculas terapéuticas (por ejemplo, oligómeros) se dirigen a un pre-ARNm que codifica una proteína precursora amiloide. La proteína precursora amiloide (APP) es una proteína de membrana integral expresada en muchos tejidos y concentrada en las sinapsis de las neuronas. Su función ha estado implicada como un regulador de la formación sináptica, la plasticidad neural y la exportación de hierro. La APP es mejor conocida como la molécula precursora cuya proteolisis genera beta amiloide (Ap), un péptido de 37 a 49 aminoácidos cuya forma fibrilar amiloide es el componente primario de las placas amiloides encontradas en los cerebros de pacientes con la enfermedad de Alzheimer.
En los seres humanos, el gen para APP está localizado en el cromosoma 21 y contiene 18 exones que abarcan 290 kilobases. En los seres humanos se han observado varias isoformas de corte y empalme alternativas de APP, que oscilan en longitud de 365 a 770 aminoácidos, con determinadas isoformas preferentemente expresadas en neuronas; los cambios en la proporción neuronal de estas isoformas se han asociado a la enfermedad de Alzheimer. Las mutaciones en las regiones críticas de la proteína precursora amiloide, incluida la región que genera la beta amiloide (Ap), provocan susceptibilidad hereditaria a la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, se ha encontrado que varias mutaciones fuera de la región Ap asociadas al Alzheimer hereditario incrementa drásticamente la producción de Ap.
Un ejemplo adicional de una secuencia de ácido nucleico diana de los oligómeros es pre-ARNm de APP o ARNm de APP. El ADNc de APP que corresponde a ARNm de APP se conoce como el número de acceso GenBank Y00264.
En algunas realizaciones, el presente método se utiliza para seleccionar cualquier molécula terapéutica que comprenda una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, oligómeros) que hibrida con una región dentro de un transcrito de MAPT, por ejemplo, SEQ ID NO: 2 (s Eq ID NO: 2 puede ser ARNm si "t" se reemplaza por "u"), un transcrito de BASP1 o un transcrito de APP.
En una realización, se preparan moléculas terapéuticas aleatorias que comprenden las secuencias de nucleótidos (por ejemplo, oligómeros) que se dirigen a determinadas regiones de pre-ARNm o ARNm que codifican MAPT, BASP1 o APP para ensayar sus toxicidades. A continuación, las moléculas terapéuticas que comprenden las secuencias de nucleótidos pueden someterse a los métodos de la presente invención descritos en cualquier otro sitio en el presente documento. En determinadas realizaciones, ejemplos de oligómeros (es decir, oligonucleótidos antisentido) incluyen, pero sin limitación, los oligómeros enumerados en las Figuras 4 y 5.
Los oligómeros pueden incluir cualquier diseño de oligómero, por ejemplo, un modelo de las modificaciones del azúcar del nucleósido. En una realización, el oligómero comprende al menos 1 nucleósido modificado, tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o al menos 16 nucleósidos modificados.
En una realización, el oligómero de la invención comprende modificaciones, que se seleccionan independientemente de estos tres tipos de modificaciones (azúcar modificado, nucleobase modificada y enlace internucleósidos modificado) o una combinación de los mismos.
En una realización adicional el oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleósidos modificado. En otras realizaciones, los enlaces internucleósidos dentro de la secuencia de nucleótidos contigua son enlaces internucleósidos fosforotioato o boranofosfato.
En algunas realizaciones, el oligómero de la invención comprende al menos una unidad de LNA o al menos un nucleósido modificado 2' sustituido.
El oligómero de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos que comprende tanto nucleótidos y análogos de nucleótido y puede estar en forma de un gapmer, blockmer, mixmer, headmer, tailmer o totalmer. Ejemplos de configuraciones de un gapmer, blockmer, mixmer, headmer, tailmer o totalmer que pueden usarse con el oligómero de la invención se describen en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos N.° 2012/0322851.
Los nucleótidos del oligómero de la invención o la secuencia de nucleótidos contigua del mismo pueden acoplarse por grupos enlace. Adecuadamente cada nucleótido está unido al nucleótido 3' adyacente por un grupo enlace. Enlaces internucleósidos adecuados incluyen aquellos enumerados dentro del documento WO2007/031091, por ejemplo, los enlaces internucleósidos enumerados en el primer párrafo de la página 34 del documento WO2007/031091.
La publicación de los Estados Unidos N.° 2011/0130441, que se publicó el 2 de junio de 2011, se refiere a compuestos oligoméricos que tienen al menos un nucleósido bicíclico unido a los extremos 3' y 5' por un enlace internucleósidos neutro. Por lo tanto, los oligómeros de la invención pueden tener al menos un nucleósido bicíclico unido a los extremos 3' y 5' por un enlace internucleósidos neutro, tal como uno o más fosfotriéster, metilfosfonato, MMI, amida-3, formacetal o tioformacetal. Los enlaces restantes pueden ser fosforotioato.
En el contexto el término "conjugado" pretende indicar una molécula heterogénea formada por la unión covalente o no covalente ("conjugación") del oligómero como se describe en el presente documento a una o más fracciones no nucleotídicas o no polinucleotídicas. Ejemplos de fracciones no nucleotídicas o no polinucleotídicas incluyen agentes macromoleculares tales como proteínas, cadenas de ácidos grasos, restos azúcares, glucoproteínas, polímeros o combinaciones de los mismos. Normalmente las proteínas pueden ser anticuerpos para una proteína diana. En algunas realizaciones, los polímeros típicos son polietilenglicol.
Por lo tanto, en diversas realizaciones, el oligómero de la invención comprende tanto una región de polinucleótido que normalmente consiste en una secuencia contigua de nucleótidos, y una región no nucleotídica adicional. Cuando se hace referencia al oligómero de la invención que comprende una secuencia de nucleótidos contigua, el compuesto puede comprender componentes no nucleotídicos, tales como un componente conjugado.
La invención también proporciona un conjugado que comprende el oligómero de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento y al menos una fracción no nucleotídica o no polinucleotídica covalentemente unida a dicho oligómero. Por lo tanto, en diferentes realizaciones donde el oligómero de la invención comprende un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos específicos, como se divulga en el presente documento, el compuesto también puede comprender al menos una fracción no nucleotídica o no polinucleotídica (por ejemplo, que no comprende uno o más nucleótidos o análogos de nucleótido) covalentemente unida a dicho oligómero.
La conjugación (a una fracción conjugado) puede aumentar la actividad, la distribución celular o la absorción celular del oligómero de la invención. Tales fracciones incluyen, pero sin limitación, anticuerpos, polipéptidos, fracciones lipídicas tales como fracciones de colesterol, ácido cólico, un tioéter.
Los oligómeros de la invención también pueden conjugarse a sustancias farmacéuticas activas, por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, una sulfonamida, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.
En determinadas realizaciones la fracción conjugada es un esterol, tal como colesterol.
IV. Composición farmacéutica y vías de administración
Las moléculas terapéuticas de la invención pueden usarse en formulaciones y composiciones farmacéuticas. Convenientemente, tales composiciones comprenden un diluyente farmacéuticamente aceptable, vehículo, sal o adyuvante.
Las moléculas terapéuticas de la invención pueden incluirse en una formulación única tal como un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptables en una cantidad suficiente para administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz sin causar efectos secundarios serios en el paciente tratado. Sin embargo, en algunas formas de terapia, pueden aceptarse efectos secundarios serios desde el punto de vista de asegurar un resultado positivo para el tratamiento terapéutico.
El fármaco formulado puede comprender agentes de unión y adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Las cápsulas, comprimidos o píldoras pueden contener, por ejemplo, los siguientes compuestos: celulosa microcristalina, resina o gelatina como aglutinantes; almidón o lactosa como excipientes; estearatos como lubricantes; diferentes agentes edulcorantes o aromatizantes. Para las cápsulas la unidad de dosificación puede contener un vehículo líquido tipo aceites grasos. Asimismo, pueden formar parte de la unidad de dosificación, recubrimientos de azúcares o agentes entéricos. Las formulaciones de molécula terapéutica también pueden ser emulsiones de los ingredientes farmacéuticos activos y un lípido que forma una emulsión micelar.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de varias maneras dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área a tratar. La administración puede ser (a) oral, (b) pulmonar, por ejemplo, mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo mediante nebulizador; intratraqueal, intranasal, (c) tópica incluyendo epidérmica, transdérmica, oftálmica, y a las membranas mucosas incluyendo la administración vaginal y rectal, o (d) parenteral incluyendo intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o administración intracraneal, por ejemplo, intratecal, intracerebroventricular, o intraventricular. En una realización la molécula terapéutica se administra IV, IP, por vía oral, tópica o como una inyección en bolo o administrada directamente en el órgano diana. En otra realización, la molécula terapéutica se administra por vía intratecal o intracerebroventricular como una inyección en bolo.
Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, pulverizadores, supositorios, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, acuosos, en polvo u oleosos, espesantes y similares. Ejemplos de formulaciones tópicas incluyen aquellas en las que el oligómero de la invención se mezcla con un agente de administración tópica tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Las composiciones y formulaciones para la administración oral incluyen, pero sin limitación, polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Las composiciones y formulaciones para la administración parenteral, intratecal, intracerebroventricular o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero sin limitación, potenciadores de la penetración, compuestos vehículo y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero sin limitación, soluciones, emulsiones, y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones pueden generarse a partir de varios componentes que incluyen, pero sin limitación, líquidos preformados, sólidos de autoemulsión y semisólidos de autoemulsión. La administración del fármaco al tejido diana puede aumentarse mediante la administración mediada por vehículo que incluye, pero sin limitación, liposomas catiónicos, ciclodextrinas, derivados de porfirina, dendrímeros de cadena ramificada, polímeros de polietilenimina, nanopartículas y microesferas (Dass CR. J. Pharm. Pharmacol 2002; 54(l):3-27).
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que pueden presentarse convenientemente en forma de dosis unitaria, pueden prepararse de acuerdo con las técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de asociar los principios activos con los vehículos o excipientes farmacéuticos. En general las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima los principios activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y a continuación, si fuera necesario, dando forma al producto.
Para la administración parenteral, subcutánea, intradérmica o tópica la formulación puede incluir un diluyente estéril, tampones, reguladores de la tonicidad y antibacterianos. Las moléculas terapéuticas pueden prepararse con vehículos que protegen frente a la degradación o la eliminación inmediata del cuerpo, entre los que se incluyen implantes o microcápsulas con propiedades de liberación controlada. Para la administración intravenosa los vehículos pueden ser solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato. La publicación internacional N.° WO2007/031091 (A2) publicada el 22 de marzo de 2007, además proporciona diluyente, vehículo y adyuvantes farmacéuticamente aceptables y adecuados.
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que se encuentran entre las técnicas de la materia. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., ed. (1989) "Molecular Cloning A Laboratory Manual" (2° ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) "DNA Cloning", Volúmenes I y II; Gait, ed. (1984) "Oligonucleotide Synthesis"; Mullis et al. patente de los Estados Unidos N.° 4.683.195; Hames and Higgins, eds. (1984) "Nucleic Acid Hybridization"; Hames and Higgins, eds. (1984) "Transcription And Translation"; Freshney (1987) "Culture Of Animal Cells" (Alan R. Liss, Inc.); "Immobilized Cells And Enzymes" (IRL Press) (1986); Perbal (1984) "A Practical Guide To Molecular Cloning"; el tratado, "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) "Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells", (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., "Methods In Enzymology", Vols. 154 y 155; Mayer and Walker, eds. (1987) "Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology" (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) "Handbook Of Experimental Immunology", Volúmenes I-IV; "Manipulating the Mouse Embryo", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); Crooks, "Antisense drug Technology: Principles, strategies and applications", 2° Ed. CRC Press (2007) y en Ausubel et al. (1989) "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
Ejemplos
Ejemplo 1: Construcción de moléculas
Se diseñaron varias moléculas (por ejemplo, oligómeros) para dirigirse a la 3' UTR del pre-ARNm de MAPT. Por ejemplo, los oligómeros se construyeron para dirigirse a los nucleótidos 134.821-138.940 y 72.802-73.072 de SEQ ID NO: 2. Las secuencias ilustrativas de los oligómeros se describen en las Figuras 4, 5 y 6. En algunas realizaciones, los oligómeros se diseñaron para ser gapmer o mixmer. Pueden aplicarse los mismos métodos a cualquier otras secuencias divulgadas en el presente documento. Los gapmer se construyeron para contener lNa (letras mayúsculas), por ejemplo, Beta-deoxi LNA en el extremo 5' y el extremo 3' y contener una cadena principal de fosforotioato, pero los LNA pueden sustituirse por cualquier otro análogo de nucleótido y la cadena principal puede ser otro tipo de cadena principal (por ejemplo, un enlace fosfodiéster, un enlace fosfotriéster, un enlace metilfosfonato, un enlace fosforamidato, o combinaciones de los mismos).
Los oligómeros se sintetizaron usando métodos bien conocidos en la técnica. Métodos ilustrativos para preparar tales oligómeros se describen en Barciszewski et al., Capítulo 10 - "Locked Nucleic Acid Aptamers" en "Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols", vol. 535, Gunter Mayer (ed.) (2009).
Ejemplo 2: Medición de la oscilación espontánea de calcio de oligonucleótidos antisentido
Para medir la oscilación espontánea de calcio neuronal cortical primaria, se prepararon neuronas corticales primarias de rata a partir de embriones de rata Sprague-Dawley (E19). Se sembraron 25.000 células/pocillo en placas FLIPR recubiertas por poli-D-lisina de 384 pocillos (Greiner Bio-One) en 25 pl/pocillo de medio neurobasal que contenía suplemento B27 y glutamina 2 mM (día 1in vitro DIV1). Las células se cultivaron durante 11 días a 37 °C en CO2 al 5 % y se alimentaron con 25 pl de medio adicional el día 4 in vitro ("DIV04") y el día 8 in vitro ("DIV08") para su uso el día 11 in vitro ("DIV11"). El día del experimento, se retiró el medio de la placa y las células se lavaron una vez con 50 pl/pocillo de tampón de ensayo a 37 °C (solución salina equilibrada de Hank con CaCh 2 mM y Hopes 10 mM pH 7,4).
Las oscilaciones se ensayaron en presencia y ausencia de MgCh 1 mM (Figura 1). Las células se cargaron con un colorante de calcio fluorescente permanente celular, fluo-4 AM (Life Technologies). Fluo-4 AM se preparó a 2,5 mm en DMSO que contenía F-127 plutónico al 20 %, a continuación, se diluyó 1:1.000 en tampón de ensayo. Las células se incubaron 1 h con 20 pl de fluo-4 AM 2,5 pM a 37 °C en CO2 al 5 %. Después de 1 h se añadió 20 pl de tampón de ensayo a temperatura ambiente y se dejó que las células se equilibraran hasta temperatura ambiente durante 10 minutos adicionales y se colocaron en el lector de placa de obtención de imágenes fluorescentes (FLIPR). Se leyó la señal de referencia (medida del calcio intracelular) durante 100 segundos (1 lectura/segundo) antes de la adición de los oligómeros antisentido. Los oligómeros se añadieron con un cabezal de 384 pocilios en el FLIPR en 20 |jl de tampón de ensayo a 75 jM para una concentración final de 25 jM . Se leyó la señal del FLIPR durante unos 200 segundos adicionales (1 lectura/segundo) después de la adición del oligómero. Se llevó a cabo una segunda lectura de placa después de la adición de 5 minutos (300 puntos de un segundo) en el FLIPR para permitir la captura de datos adicionales. Los datos brutos de la lectura de 5 minutos se exportaron y, usando Excel, se calcularon la amplitud pico y la frecuencia. Los cálculos se realizaron midiendo la señal media de FLIPR durante la lectura de 300 segundos para los pocillos control (no tratados). Para los pocillos tratados, se desarrolló un sistema de puntuación en donde una puntuación de 1 era dada a cada lectura de 1 segundo donde el incremento de la señal era mayor de un 50 % del valor control medio (calculado anteriormente). Una puntuación de 0 era dada a cada lectura de 1 segundo que incrementa menos de un 50 % del valor control medio. Para cada tratamiento se calculó una puntuación total y se convirtió en porcentaje del control para fines gráficos. Si el oligómero antisentido producía una respuesta de oscilación de calcio mayor que la de la célula no tratada, el porcentaje del control se expresa como mayor que 100 % (Figura 4).
El efecto de los oligómeros sobre las oscilaciones espontáneas de calcio neuronales primarias se midió bajo dos condiciones, en presencia y ausencia de MgCh 1 mM como se ha descrito anteriormente. (Murphy et al,, 1992, J. Neurosa. 12:4.834-4.845). Esto se hizo para oscilaciones de calcio mediadas por receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) y ácido a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA) aislados. Los datos presentados en la Figura 1 muestran que, la adición del antagonista del receptor AMPA, 6-Ciano-7-nitroquinoxalin-2,3-diona (CNQX; 3 jM ), redujo las oscilaciones de calcio en un 20 % lo que representa la respuesta total de AMPA en el ensayo (Figura 1 barra marcada AMPA mostrada). Las oscilaciones de calcio se redujeron más, en aproximadamente un 80 %, cuando se bloqueó la función del receptor (NMDA) por MgCh 1 mM (Figura 1 barra marcada NMDA mostrada).
La inhibición del oligómero antisentido de las oscilaciones espontáneas de calcio mediadas por NMDA o AMPA se evaluó en presencia o ausencia de MgCh 1 mM (que representa el 100 % del control en cada caso; Figura 2). La adición de oligómeros (ASO) antisentido 25 jM inhibió las oscilaciones mediadas por el receptor AMPA pero no por el receptor NMDA (Figura 2). Se demostró que los ASO y otros oligómeros que se comportaron igualmente, impactaron de manera negativa en la actividad de la red del sistema nervioso central (SNC) in vivo y en la actividad neuronal espontánea electrofisiológica in vitro (datos no mostrados). El impacto del oligonucleótido antisentido Tau sobre las oscilaciones espontáneas de calcio en neuronas primarias se resume en la Figura 4. Véase Murphy et al., J. Neurosa.
12, 4.834-4.845 (1992).
Se midió la reducción de la oscilación de calcio en las células neuronales para los oligómeros de la invención y se comparó con la de las células control (es decir, las oscilaciones de calcio en las células neuronales que no están tratadas con los oligómeros). El impacto del oligonucleótido antisentido Tau sobre las oscilaciones espontáneas de calcio en neuronas primarias se muestra en la Figura 4. Los oligómeros en las células neuronales que mostraban oscilaciones mediadas por AMPA que eran iguales o mayores que un 75 % de las oscilaciones de calcio en las células control no tratadas se seleccionaron para análisis adicional.
Ejemplo 3: Medición de la oscilación de calcio usando moléculas pequeñas
El efecto de las moléculas pequeñas sobre las oscilaciones de calcio se medirá usando básicamente el mismo método proporcionado en el Ejemplo 2. Para medir la oscilación espontánea de calcio neuronal cortical primaria, se prepararán neuronas corticales primarias de rata. Las células se sembrarán en placa y se cultivarán para su uso en la fecha adecuada. Como se analiza en el Ejemplo 2, el efecto de las moléculas pequeñas sobre las oscilaciones espontáneas de calcio neuronales primarias se medirán bajo dos condiciones, en presencia y ausencia de MgCh 1 mM como se ha descrito anteriormente. (Murphy et al,, 1992, J. Neurosa. 12:4.834-4.845). Las células se cargarán con un colorante de calcio fluorescente permanente celular. Las células se incubarán y se dejarán que se equilibren hasta temperatura ambiente para medir la intensidad fluorescente. Los datos brutos se exportarán, y se calcularán la amplitud pico y la frecuencia.
Se evaluará la inhibición por la molécula pequeña de las oscilaciones espontáneas de calcio mediadas por o bien NMDA o AMPA. La adición de molécula pequeña inhibirá las oscilaciones mediadas por el receptor AMPA. Se esperará que las moléculas pequeñas que reducen las oscilaciones de calcio hasta niveles por debajo de un 70 % del control impacten de manera negativa sobre la actividad de la red del SNC in vivo y la actividad neuronal espontánea electrofisiológica in vitro.
Ejemplo 4: Medición de la oscilación de calcio usando proteínas terapéuticas
El efecto de las proteínas terapéuticas, tales como anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, proteínas de fusión, citocinas, receptores de superficie celular, hormonas o factores de crecimiento, sobre las oscilaciones de calcio se medirán usando básicamente el mismo método proporcionado en el Ejemplo 2. Para medir la oscilación espontánea de calcio neuronal cortical primaria, se prepararán neuronas corticales primarias de rata. Las células se sembrarán en placa y se cultivarán para su uso en la fecha adecuada. Como se analiza en el Ejemplo 2, el efecto de las proteínas terapéuticas sobre las oscilaciones espontáneas de calcio neuronales primarias se medirán bajo dos condiciones, en presencia y ausencia de MgCh 1 mM como se ha descrito anteriormente. (Murphy et al,, 1992, J. Neurosa. 12:4.834-4.845). Las células se cargarán con un colorante de calcio fluorescente permanente celular. Las células se incubarán y se dejarán que se equilibren hasta temperatura ambiente para medir la intensidad fluorescente. Los datos brutos se exportarán, y se calcularán la amplitud pico y la frecuencia.
Se evaluará la inhibición por la proteína terapéutica de las oscilaciones espontáneas de calcio mediadas por o bien NMDA o AMPA. La adición de proteína terapéutica inhibirá las oscilaciones mediadas por el receptor AMPA. Se esperará que las proteínas terapéuticas que reducen las oscilaciones de calcio a niveles por debajo de un 70 % del control impacten de manera negativa sobre la actividad de la red del SNC in vivo y la actividad neuronal espontánea electrofisiológica in vitro.
Ejemplo 5: Cálculo de la puntuación de secuencia
La puntuación de secuencia de cada oligómero se calculó para predecir la idoneidad de los oligómeros. La puntuación de secuencia es un cálculo matemático determinado por todos los oligómeros y se basa en el porcentaje de nucleótidos G y C, o análogos de los mismos, dentro de una secuencia de oligómero dada. Para calcular la puntuación de secuencia se aplicó a todos los oligómeros la siguiente fórmula:
número de nucleótidos C o análogos de los mismos - número de nucleótidos G o análogos de los mismos (I) longitud nucleotídica
Un cálculo de ejemplo es dado para el oligómero ASO-000013 (SEQ ID NO: 686; puntuación de secuencia 0,25): ATTtccaaattcaCTT: 4-0/16 = puntuación de secuencia de 0,25.
Se calculó la puntuación de secuencia de los oligómeros seleccionados para estudios adicionales. Para determinar el valor de corte para la puntuación de secuencia, se realizó un estudio de tolerabilidad in vivo como se muestra en el Ejemplo 6.
Ejemplo 6: Tolerabilidad in vivo
La tolerabilidad in vivo de los oligómeros se ensayó para ver cómo se toleraba el oligómero cuando se inyectaba en un animal.
Sujeto
La tolerabilidad in vivo de los oligómeros se ensayó en ratones y ratas. Los animales para la qPCR de Tau y los estudios del comportamiento eran ratones hembra C57Bl/6J, adultos (20-30 g; Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) guardados en 3-4 por jaula. Los animales se guardaron en bioterios mantenidos a temperatura constante (21 ± 2 °C) y humedad (50 ± 10 %) e iluminados durante 12 horas por día (luces encendidas a las 0600 horas). En algunos casos, se usaron ratones transgénicos machos y hembras (30-40 g) que expresaban un transgén de tau derivado de una PAC humana, haplotipo H1 conducido por el promotor de tau (Polydoro et. al., J. Neurosci. (2009) 29(34): 10.741-9), y en los que el gen de Tau de ratón nativo estaba sometido a deleción, para valorar las variables de interés farmacodinámicas y las concentraciones de fármaco en tejido. Para los estudios de la infusión intratecal, se guardaron individualmente ratas Sprague Dawley hembras (180-225 g en el ensayo; Harlan) en bioterios mantenidos a temperatura constante (21 ± 2 °C) y humedad (50 ± 10 %) e iluminados durante 12 horas por día (luces encendidas a las 0600 horas). Todos los animales tenían acceso ad libitum a la comida y al agua durante todo los estudios. Los estudios del comportamiento se llevaron a cabo entre las 0700 y las 1500 horas. Los animales se mantuvieron de acuerdo con las directrices de el "Animal Care and Use Committee of the Bristol-Myers Squibb Company", y la "Guide for Care and Use of Laboratory Animals" publicada por los "National Institutes of Health". Los protocolos de investigación fueron aprobados por el "Bristol-Myers Squibb Company Animal Care and Use Committee".
Vías de administración -Inyecciones intracerebroventriculares o intratecales.
Los oligómeros se administraron a ratones o bien por inyección intracerebroventricular(ICV) o inyección intratecal. Las inyecciones intracerebroventriculares se realizaron usando una micro jeringa Hamilton equipada con una aguja de calibre 27 o 30, de acuerdo con el método de Haley and McCormick. La aguja estaba equipada con una guardia de polietileno a 2,5 mm desde la punta con el fin de limitar su penetración en el cerebro. Los ratones se anestesiaron usando anestesia de isoflurano (1,5-4 %). El ratón a inyectar, que pesaba 20-30 g, se agarró por la piel floja en la parte de atrás del cuello con el pulgar y los primeros dedos de una mano. A continuación, aplicando presión leve pero firme, se inmovilizó la cabeza del animal presionando frente a una superficie plana firme. A continuación, se insertó la punta de la aguja a través del cuero cabelludo y el cráneo, aproximadamente 1 mm lateral y 1 mm caudal hasta el bregma. Una vez que se colocó la aguja, se pasó el oligonucleótido antisentido en un volumen de 5 microlitros en vehículo de solución salina y se inyectó en el ventrículo lateral derecho (o izquierdo) durante 20-30 segundos. La aguja se dejó en el lugar durante 10 segundos antes de retirar. Este procedimiento no requiso de cirugía o incisión. Los animales se calentaron sobre almohadillas térmicas hasta que se recuperaron del procedimiento. Se recolectó tejido cerebral (región cortical frontal, derecha) sobre hielo seco o RNAlater para el análisis de la concentración de fármaco y qPCR de Tau respectivamente en múltiples momentos tras la dosis, por ejemplo, 1 semana a 16 semanas después de la dosis.
Para las inyecciones intratecales (IT) de ratones, los animales se mantuvieron bajo ligera anestesia de isoflurano (1,5­ 5 %). El ratón se agarró con seguridad con una mano por la cintura pélvica, insertando una aguja de 1/2 pulgadas 30G conectada a una jeringa Hamilton dentro del tejido entre la cara dorsal de L5 y L6, perpendicular a la columna vertebral. Cuando la aguja entró en el espacio subaracnoideo, se observó un repentino movimiento lateral de la cola. Este reflejo se usó como indicador de la colocación con éxito de la aguja para la administración IT. Se inyectó un volumen de 5­ 10 |jl de oligonucleótido antisentido lentamente (durante aproximadamente 60 segundos) en el espacio subaracnoideo.
Para las inyecciones intratecales en ratas, se implantaron quirúrgicamente catéteres intratecales usando métodos descritos por Yaksh and Rudy, Physiol. Behav. (1976) 17(6): 1.031-6. La rata se montó a un marco esterotáxico con anestesia de isoflurano mantenida a través de una fosa nasal. Se realizó una incisión en la piel comenzando aproximadamente en la línea de unión de las orejas y extendiéndose caudalmente aproximadamente 3 cm a lo largo de la linea media. El músculo en donde se unía la cresta occipital del cráneo se cortó aproximadamente 3 mm lateral sobre ambos lados de la línea media muscular. Usando retractores o forces, se despegó caudalmente el músculo para exponer la membrana cisternal en la base del cráneo. Se retiraron con cuidado de la membrana la fascia y el tejido. Se usó el extremo biselado doblado de una aguja de calibre 16-22 para hacer una incisión lateral de 1-2 mm en la membrana cisternal. Se insertó un catéter IT esterilizado, hecho de tubo de polietileno (tubo PE10 estirado hasta aproximadamente un diámetro exterior de 1,3 mm), a través de la incisión y se avanzó con cuidado caudalmente a través del espacio subaracnoideo mientras se giraba entre el pulgar y el índice y mientras se tiraba suavemente de la base de la cola para alinear la médula espinal usando la otra mano. Si se encontraba alguna resistencia, el catéter se retraía ligeramente, y de nuevo se avanzaba lentamente. Una vez que el catéter había avanzado al área deseada, se lavó con 20 j l de solución salina estéril y el final craneal se pasó a través de la piel usando una aguja de calibre 19 aproximadamente 1 cm desde la incisión. El catéter se introdujo con un pasador. A las ratas se les dio antibióticos orales durante 5 días tras la cirugía. Al menos cinco días después de la cirugía, se diluyó una inyección de oligonucleótido antisentido única en agua y se administró por una bomba de infusión programable (Knopf) a una velocidad de 10 jl/minuto en un volumen de 10 a 50 j l . Se pasó una breve descarga de solución salina de 5 ul justo antes de la administración del oligonucleótido antisentido y se pasó una descarga de 10 j l de solución salina justo después de la administración del oligonucleótido a una velocidad de 10 jl/minuto para cubrir el volumen muerto del catéter (6-7 jl). También se pasó una descarga de solución salina de 20 ul a los animales 1-2X/semana hasta que fueron usados para un experimento.
Evaluaciones conductuales de la tolerabilidad aguda
Durante una hora tras la inyección única de oligonucleótido antisentido ICV o IT, se observaron los efectos secundarios conductuales en los animales y se puntuaron según la gravedad de los efectos secundarios en una escala de cero (no efectos secundarios) a 20 (convulsiones que dan como resultado la eutanasia). La escala de tolerabilidad estaba dividida en 5 categorías conductuales: 1) hiperactividad 2) actividad disminuida y arousal 3) disfunción motora/ataxia 4) postura y respiración anormal y 5) temblores/convulsiones. Cada categoría se puntuó sobre una escala de 0-4, con la peor puntuación total posible de 20. Se observaron los cambios en el comportamiento en la jaula de los animales y, a continuación, se sacaron de la jaula para observaciones más detalladas que incluían la medición de la fuerza de presión y el reflejo de enderezamiento.
Reconocimiento de objeto novedoso
La memoria de reconocimiento a corto plazo se midió usando la tarea de reconocimiento de objeto novedoso (NOR). La prueba NOR se basó en el comportamiento espontáneo de los roedores para explorar un objeto novedoso más que uno familiar (Dodart et. al., Neuroreport (1997) 8(5): 1173-8; Ennaceur and Delacour, Behav. Brain Res. (1988) 31 (1):47-59). Después de un intervalo de retención de una hora entre las sesiones de entrenamiento (T1) y de ensayo (T2), los ratones que recuerdan los objetos desde la sesión de entrenamiento mostrarán una preferencia por el objeto novedoso en la sesión de ensayo. Para estos experimentos, los animales se manejaron durante 3 días y se habituaron a la cámara (48 cm * 38 cm * 20 cm) el día antes de la sesión de ensayo. La cámara estaba hecha de polietileno y revestida con suelo de vinilo. El día del ensayo, los animales se colocaron en la cámara de ensayo rectangular y se dejaron que explorarse dos objetos idénticos (7,6 cm de alto x 5,1 cm de ancho) durante un periodo de entrenamiento de 15 minutos. Una hora más tarde, los ratones se colocaron de nuevo en la cámara de ensayo durante un periodo de ensayo de 10 minutos, este tiempo con un objeto que habían observado durante el entrenamiento y un objeto novedoso. Los objetos se limpiaron concienzudamente con etanol al 25 % entre las sesiones de entrenamiento y de ensayo y entre sujetos, y se limpiaron de nuevo al final del día con detergente suave. Únicamente se consideraba exploración del objeto cuando el hocico del animal se dirigía al objeto. La exploración se registró usando el programa informático de rastreo ObjectScan (Cleversys, Reston, VA). Los datos se registraron como porcentaje del tiempo gastado explorando los objetos (es decir, tiempo nuevo/tiempo nuevo+familiar *100).
Laberinto acuático de Morris
El aprendizaje y la memoria espacial se evaluó en el ensayo de Laberinto Acuático de Morris (Morris J. Neurosa. (1984) 11(1):47-60). El laberinto acuático representa una piscina con 120 cm de diámetro. El agua se volvió opaca usando tempera no tóxica blanca (20 °C ± 1). La piscina estaba rodeada de distintas entradas extras al laberinto.
Antes del entrenamiento de la plataforma escondida, todos los ratones se expusieron a la piscina del laberinto acuático dejándolos bucear por el conducto rectangular durante 2 pruebas de entrenamiento previas. La plataforma de escape estaba colocada en el medio del conducto. Si un ratón no era capaz de encontrar y montarse en la plataforma durante una prueba de 60 s, era guiado a la misma y se dejaba que se sentara durante hasta 10 s. Después del entrenamiento previo, los ratones se sometieron al entrenamiento de la plataforma escondida, durante el cual una plataforma de 10x10 cm estaba sumergida 1,5 cm por debajo de la superficie. La ubicación de la plataforma permanecía la misma a lo largo de todo el entrenamiento mientras que el punto de suelta variaba aleatoriamente entre las cuatro pruebas diarias así como a través de los 4 días de entrenamiento. Los ratones recibieron 2 sesiones por día durante 4 días consecutivos. Cada sesión consistía en 2 pruebas con un intervalo inter prueba de 10 min. El tiempo máximo permitido por prueba era de 60 s. Si un ratón no encontraba o se montaba en la plataforma, era guiado a la plataforma por el experimentador. A todos los ratones se les permitió sentarse sobre la plataforma durante 10 s después de cada prueba de entrenamiento.
Para los ensayos de prueba, se retiró la plataforma y a cada ratón se le dejó nadar durante 60 s. El punto de suelta para los ensayos de prueba era 180° desde la ubicación de la plataforma usada durante el entrenamiento de la plataforma escondida. Después de 60 s, los ratones fueron guiados a la ubicación de la plataforma antes de rescatarlos de la piscina. Para la memoria temprana los ratones rescatados se probaron durante 2 h después del último entrenamiento de la plataforma escondida; el recuerdo de la memoria a largo plazo se evaluó 16 h tras el último entrenamiento de la plataforma escondida. 2 h tras el ensayo de prueba de 16 h, todos los ratones se sometieron a entrenamiento de plataforma visible, donde la entrada local (piscina construida usando legos) estaba ubicada por encima de la plataforma escondida. A los ratones se les presentó 2 pruebas entrenamiento. Se registraron todos los comportamientos con un sistema de rastreo por video (Cleversys Inc). Se registraron automáticamente las latencias de escape, la distancia recorrida, la rutas de nado, la velocidades de nado, y cruces de la plataforma para análisis posterior.
Pasarela
La Pasarela (Noldus, Holanda) es una técnica para el análisis de los andares automatizada y computerizada que permite la cuantificación objetiva de los múltiples parámetros estáticos y dinámicos de los andares. Se colocaron los ratones en un extremo de la pasarela y se dejaron que exploraran libremente durante 3 min o hasta que tuvieran 5 pruebas completas, lo que suceda primero. Los datos se exportaron y se clasificaron usando el programa informático Catwalk. Se usó una media de las pruebas clasificadas para el análisis de datos. Las medidas de interés incluyen, pero sin limitación: posición de la huella o la distancia entre la posición de la pata trasera y la colocación previa de la pata delantera ipsilateral, posturas duales iniciales y finales, velocidad de balanceo de la pata, y parada de la pata o la duración del contacto de la pata con la placa de cristal en un ciclo de una etapa.
Estadísticas del comportamiento
Los análisis estadísticos para todas las pruebas conductuales se llevaron a cabo usando GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Para NOR, los datos se analizaron usando o bien una prueba t pareada para los análisis dentro del grupo o por un ANOVA por una prueba post-hoc de Dunnett para los análisis entre grupo. Para MWM, se usó un ANOVA de MWM repetida para analizar la fase de adquisición y un ANOVA unidireccional seguida de posthoc de Dunnett para los análisis del ensayo de prueba.
Resultados
La tolerabilidad aguda in vivo para los oligómeros determinada basándose en los anteriores ensayos se muestra en la Figura 5. El umbral de tolerabilidad acumulativa in vivo tras una inyección ICV de 100 |jg de un oligómero se estableció en 4.
Además, se estudió la correlación entre la puntuación de secuencia de cada oligómero y la tolerabilidad aguda in vivo del oligómero. El análisis de correlación muestra que los oligómeros que tienen tolerabilidad in vivo por debajo de 4 tienden a tener una puntuación de secuencia igual a o mayor que 0,2. Véase la Figura 3. Por lo tanto, La Figura 3 indica que la puntuación de secuencia de los oligómeros puede usarse para predecir la tolerabilidad in vivo de los oligómeros.
Ejemplo 7: Reducción in vitro en la proteína Tau
Para cada uno de los oligómeros que se dirigen a la 3' UTR de un transcrito de MAPT se investigó su capacidad de disminuir la proteína Tau en neuronas primarias de ratón que expresaban el gen MAPT humano entero como un bácmido que contenía transgén (C57-bl6 BAC-Tg hTau; Polydoro et. al., J. Neurosa. (2009) 29 (34): 10747-9). Los cultivos de neuronas de cerebro anterior embrionario de ratón hTau primarias no expresaban tau de ratón endógena ya que el tau de ratón estaba desactivado. Las neuronas primarias se generaron por digestión de papaína de acuerdo con el protocolo del fabricante (Worthington Biochemical Corporation, LK0031050). Brevemente, se diseccionaron los cerebros anteriores de embriones E18 BAC-Tg de ratón hTau que expresaban el gen de la proteína asociada a microtúbulo Tau (MAPT) humano entero en un trasfondo genético nulo para MAPTmurino y pueden incubarse a 37 °C durante 30-45 minutos en solución de papaína/ADNasa/solución salina equilibrada de Earle (EBSS). Después de la trituración y la centrifugación del sedimento celular, la reacción se paró mediante incubación con EBSS que contenía inhibidores de proteasa, albúmina de suero bovino (BSA) y ADNasa. Las células se trituraron y lavaron con Neurobasal (NB, Invitrogen) suplementado con B-27 al 2 %, 100 pg/ml de penicilina, 85 pg/ml de estreptomicina y glutamina 0,5 mM. Las células se sembraron en medio NB suplementado sobre placas de obtención de imágenes ópticas de 96 pocillos recubiertas por poli-D-lisina (BD Biosciences) a 15.000 células/pocillo.
Después de obtener los cultivos de neuronas de cerebro anterior embrionarios de ratón hTau primarias que expresaban un gen MAPT humano, los cultivos se trataron con oligómeros para inhibir el ARNm de Tau y la expresión proteica. A continuación, los cultivos se sometieron a inmunocitoquímica y obtención de imágenes para medir la inhibición. Un día después de la siembra (DIV 1), se retiró la mitad del medio neurobasal (NB) suplementado en los cultivos de neuronas de cerebro anterior embrionarios de ratón hTau primarias y se reemplazó por medio NB suplementado que contenía diferentes concentraciones de oligómeros LNA. Los cultivos de neuronas de hTau primarias se cultivaron con oligómeros LNA hasta 13 días después de la siembra en placa (DIV 13). El DIV 13, se aclararon los cultivos con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que carecía de calcio y magnesio (DPBS, Invitrogen) y se fijaron en paraformaldehído al 4 %/sacarosa al 4 %/DPBS durante 15 min. Los cultivos se aclararon y, a continuación, se bloquearon y permeabilizaron en DPBS más Tritón X-100 al 0,1 % (TX-100) y BSA al 3 % durante una hora a temperatura ambiente. Los cultivos se aclararon y, a continuación, se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente con anticuerpo primario 1:500, anticuerpo Tau5 para medir la proteína Tau, Invitrogen AHB0042; y 1:500, anticuerpo p-III tubulina (TuJ-1) para medir el área de neurita, Abcam ab41489) en DPBS más BSA al 3 % y TX-100 al 0,1 %. Los cultivos se aclararon y se incubaron con colorante nuclear Hoeschst 33342 (1:800, Invitrogen) y anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia AlexaFluor (Invitrogen, 1:500) en DPBS más BSA al 3 % y TX-100 al 0,1 % durante una hora a temperatura ambiente. Los cultivos se aclararon abundantemente y se almacenaron en DPBS hasta la obtención de imágenes. La obtención de imágenes se llevó a cabo usando el sistema de obtención de imágenes por inmunofluorescencia automatizado Cellomics VTi. En resumen, usando pocillos no tratados, se establecieron los niveles de saturación para cada canal de fluoróforo en un 70 %. A continuación, se adquirieron 12 imágenes secuenciales de cada pocillo, y se calcularon la intensidad de fluorescencia total y el área de fluorescencia total para tanto las proteínas Tau como TuJ-1 usando el programa informático de análisis de imagen Cellomics VTi SpotDetector (versión 4). Para evaluar la reducción de la proteína Tau resultante del tratamiento con oligómero, se creó una relación de la intensidad de fluorescencia total de Tau5 y el área de fluorescencia total de Tuj-1 (Tau/TuJ-1) para cada pocillo y, a continuación, todos los datos se normalizaron a la relación media de Tau/Tuj-1 de los pocillos no tratados. La intensidad de Tuj-1 actúa como un patrón interno para cada muestra. Para evaluar la toxicidad neurita/neuronal del tratamiento con oligómero, el área de fluorescencia total de Tuj-1 de cada pocillo se normalizó al área media de la fluorescencia total de Tuj-1 de los pocillos no tratados. Los recuentos de núcleos de cada pocillo también se adquirieron como una medida alternativa de la toxicidad asociada al tratamiento con oligómero LNA. Los datos se expresan como media ± S.D. Para la inmunocitoquímica, los puntos de datos representan la media ± S.D. de pocillos tratados por triplicado. Los valores de potencia se generaron usando pocillos tratados con una amplio intervalo de concentración de oligómero LNA, del cual los valores de Tau/Tuj-1 y Tuj-1 normalizados resultantes se analizaron en comparación con los valores normalizados de muestras control con solución salina. El análisis se hizo usando regresión no lineal con valores superiores e inferiores establecidos en valores fijos de 100 % y 0 %, respectivamente, en donde la inhibición del 100 % representa una reducción completa de la señal en comparación con la muestra control (Figura 3). Para la qPCR, los datos se analizaron usando un ANOVA unidireccional con un ensayo de comparación múltiple de Dunnett para comparar los grupos tratados con solución salina y oligómero LNA. La significación estadística estaba establecida a un valor de p<0,05.
La reducción de la proteína Tau por cada oligómero se comparó con la solución salina. Los resultados de la reducción de la proteína Tau en comparación con la solución salina se muestran en la Figura 6. Si el nivel de la proteína Tau en neuronas tratadas con oligonucleótido antisentido era igual o mayor que en las células control, la inhibición en porcentaje se expresa como inhibición cero. Si está presente, "N.D." indica "no determinado" y "TBD" indica "a determinar".
Ejemplo 8: Priorización de oligómero
Las propiedades de los oligómeros seleccionados pueden describirse como se muestra en la Tabla 1. Basándose en estos criterios, se seleccionaron determinados oligómeros para el ensayo de respuesta a dosis adicional in vitro e in vivo.
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Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un método de ensayo o de determinación de la neurotoxicidad aguda in vivo de una molécula que comprende medir las oscilaciones de calcio in vitro en células neuronales que están en contacto con la molécula, en donde la molécula comprende un polinucleótido que tiene una puntuación de secuencia mayor o igual a 0,2, en donde el polinucleótido se refiere a dos o más nucleótidos unidos en secuencia, y en donde la puntuación de secuencia se calcula por la fórmula (I):
(número de nucleótidos C o análogos de los mismos en el polinucleótido - número de nucleótidos G o análogos de los mismos en el polinucleótido) / longitud nucleotídica total (número) del polinucleótido (I),
y en donde la molécula tiene neurotoxicidad aguda in vivo tolerable cuando las células neuronales en contacto con la molécula presentan oscilaciones de calcio a un nivel de un 30 % menor o mayor que el de las células de control vehículo, o a un nivel mayor que el de las células de control vehículo.
2. Un método para seleccionar o identificar una molécula que tenga neurotoxicidad aguda in vivo tolerable que comprende medir las oscilaciones de calcio in vitro en células neuronales que están en contacto con la molécula, en donde la molécula se selecciona o identifica como que tiene neurotoxicidad aguda in vivo tolerable cuando las células neuronales en contacto con la molécula presentan oscilaciones de calcio a un nivel de un 30 % menor o mayor que el de las células de control vehículo, o a un nivel mayor que el de las células de control vehículo, en donde la molécula comprende un polinucleótido que tiene una puntuación de secuencia mayor o igual a 0,2, en donde el polinucleótido se refiere a dos o más nucleótidos unidos en secuencia, y en donde la puntuación de secuencia se calcula por la fórmula (I):
(número de nucleótidos C o análogos de los mismos en el polinucleótido - número de nucleótidos G o análogos de los mismos en el polinucleótido) / longitud nucleotídica total (número) del polinucleótido (I).
3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde las oscilaciones de calcio en las células neuronales que han estado en contacto con la molécula son de aproximadamente un 70 % o más, aproximadamente un 75 % o más, aproximadamente un 80 % o más, aproximadamente un 85 % o más, aproximadamente un 90 % o más, aproximadamente un 95 % o más, aproximadamente un 96 % o más, aproximadamente un 97 % o más, aproximadamente un 98% o más, aproximadamente un 99% o más, aproximadamente un 100% o más, aproximadamente un 120% o más, aproximadamente un 140% o más, aproximadamente un 160% o más, aproximadamente un 180% o más, aproximadamente un 200 % o más, aproximadamente un 220% o más, aproximadamente un 240 % o más, o aproximadamente un 250 % o más en comparación con las oscilaciones de calcio en las células de control vehículo.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las oscilaciones de calcio son oscilaciones de calcio dependientes del receptor AMPA.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las oscilaciones de calcio se miden en presencia de iones Mg2+.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además medir la intensidad de tubulina de la molécula en un cultivo de células neuronales.
7. El método de la reivindicación 6, en donde la molécula reduce menos de aproximadamente un 25 %, menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 15 %, menos de aproximadamente un 10 %, menos de aproximadamente un 5 % o menos de aproximadamente un 1 % de la intensidad de tubulina en el cultivo de las células neuronales.
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