ES2744676T3 - Procedimiento novedoso y composiciones - Google Patents

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GlaxoSmithKline Biologicals SA
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Abstract

Uno o más primeros polipéptidos inmunógenos para su uso en un procedimiento de generación de una respuesta inmunológica frente a Mycobacterium spp., en los que los uno o más primeros polipéptidos inmunógenos se administran de manera concomitante con (i) uno o más vectores adenovirales que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más segundos polipéptidos inmunógenos y (ii) un adyuvante que comprende QS21 y 3D-MPL, en el que los uno o más primeros y segundos polipéptidos comprenden los restos 4- 725 de la SEQ ID NO: 10, y en los que la expresión "de manera concomitante" significa que los uno o más polipéptidos inmunógenos, los uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran dentro de un período de no más de 12 horas, por ejemplo, dentro de un período de no más de 1 hora, normalmente en una ocasión, por ejemplo, en el trascurso de la misma visita al profesional sanitario, por ejemplo, los uno o más polipéptidos inmunógenos, los uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran de manera secuencial o de manera simultánea.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento novedoso y composiciones
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones de vacunas novedosas y a su uso en la estimulación de respuestas inmunitarias en mamíferos, especialmente en seres humanos, y en particular para la prevención y el tratamiento de la infección por patógenos, específicamente Mycobacterium spp. En particular, se refiere a composiciones que pueden inducir respuestas de linfocitos T CD4+ y CD8+, además de respuestas de anticuerpos en sujetos sin recurrir a complejos programas de dosis de sensibilización-refuerzo.
Antecedentes a la invención
Los organismos completos inactivados se han usado en la vacunación satisfactoria desde finales del siglo diecinueve. En tiempos más recientes se han empleado vacunas que implican la administración de extractos, subunidades, toxoides y polisacáridos capsulares. Desde que están disponibles las técnicas de ingeniería genética, el uso de proteínas recombinantes ha sido una estrategia favorecida, obviándose muchos de los riesgos asociados al uso de proteínas purificadas a partir de fuentes naturales.
Las soluciones tempranas de vacunas se basaron en la administración de proteínas que estimulaban algún aspecto de la respuesta inmunitaria in vivo. Posteriormente se apreció que las respuestas inmunitarias también podrían fomentarse mediante la administración de ADN que podría transcribirse y ser traducido por el huésped en una proteína inmunógena.
La respuesta inmunitaria de los mamíferos tiene dos componentes clave: la respuesta humoral y la respuesta mediada por células. La respuesta humoral implica la generación de anticuerpos circulantes que se unirán al antígeno para el que son específicos, neutralizando así el antígeno y favoreciendo su posterior eliminación mediante un procedimiento que implica otras células que son o citotóxicas o fagocíticas. Los linfocitos B son responsables de la generación de anticuerpos (linfocitos B del plasma), además de conservar la memoria humoral inmunológica (linfocitos B de memoria), es decir, la capacidad para reconocer un antígeno algunos años después de la primera exposición a él, por ejemplo mediante vacunación. La respuesta mediada por células implica la interacción de numerosos tipos diferentes de células, entre los que están los linfocitos T. Los linfocitos T se dividen en varios subconjuntos diferentes, principalmente en linfocitos T CD4+ y CD8+.
Las células presentadoras de antígeno (CPA) tales como macrófagos y células dendríticas actúan como centinelas del sistema inmunitario, examinando el cuerpo con respecto a xenoantígenos. Si las CPA detectan xenoantígenos extracelulares, estos antígenos son fagocitados (envueltos) dentro de las CPA, en donde se transformarán en péptidos más pequeños. Estos péptidos se presentan posteriormente en moléculas de la clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC II) en la superficie de las CPA, en las que pueden ser reconocidos por linfocitos T específicos para antígenos que expresan las moléculas superficiales de CD4 (linfocitos T CD4+). Si los linfocitos T CD4+ reconocen el antígeno para el que son específicos en moléculas de MHC II en presencia de señales coestimuladoras adecuadas adicionales, estas se activan y secretan una colección de citocinas que posteriormente activan los otros brazos del sistema inmunitario. En general, los linfocitos T CD4+ se clasifican en el subconjunto 1 de linfocitos T colaboradores (Th1) o 2 de linfocitos T colaboradores (Th2) dependiendo del tipo de respuesta que generan tras el reconocimiento del antígeno. Con el reconocimiento de un complejo péptido-MHC II, los linfocitos T CD4+ Th1 secretan interleucinas y citocinas tales como interferón gamma, activándose así los macrófagos para que liberen productos químicos tóxicos tales como óxido nítrico y especies reactivas de oxígeno/nitrógeno. IL-2 y TNF-alfa también se catalogan comúnmente como citocinas Th1. A diferencia, los linfocitos T CD4+ Th2 secretan generalmente interleucinas tales como IL-4, IL-5 o IL-13.
Otras funciones de los linfocitos T CD4+ de linfocitos T colaboradores incluyen ayudar a activar los linfocitos B para producir y liberar anticuerpos. También pueden participar en la activación de los linfocitos T CD8+ específicos para antígenos, el otro gran subconjunto de linfocitos T junto con los linfocitos T CD4+.
Los linfocitos T CD8+ reconocen el péptido para el que son específicos cuando está presente en la superficie de una célula huésped mediante moléculas de la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC I) en presencia de señales coestimuladoras apropiadas. Con el fin de estar presente en moléculas de MHC I, un xenoantígeno necesita acceder directamente dentro de la célula (el citosol o núcleo), tal como es el caso cuando un virus o bacterias intracelulares penetran directamente en una célula huésped o después de vacunación con ADN. Dentro de la célula, el antígeno se transforma en pequeños péptidos que se cargarán en moléculas de MHC I que se redirigen a la superficie de la célula. Con la activación, los linfocitos T CD8+ secretan una colección de citocinas tales como interferón gamma que activa macrófagos y otras células. En particular, un subconjunto de estos linfocitos T CD8+ secreta moléculas líticas y citotóxicas (por ejemplo, granzima, perforina) con la activación. Tales linfocitos T CD8+ se denominan en lo sucesivo linfocitos T citotóxicos.
Más recientemente se ha descrito una ruta alternativa de presentación del antígeno que implica la carga de antígenos extracelulares o fragmentos de los mismos en complejos de MHC I y se ha denominado “presentación cruzada”.
La naturaleza de la respuesta de los linfocitos T también está influenciada por la composición del adyuvante usado en una vacuna. Por ejemplo, se ha mostrado que los adyuvantes que contienen MPL y QS21 activan linfocitos T CD4+ Th1 para que secreten IFN-gamma (Stewart y col. Vaccine. 2006, 24 (42-43):6483-92).
Mientras que los adyuvantes son muy conocidos por tener valor en la mejora de las respuestas inmunitarias frente a antígenos de proteínas, generalmente no se han usado conjuntamente con vacunación con ADN o con vectores basados en ADN. Hay varias hipótesis en cuanto a por qué no se han usado los adyuvantes conjuntamente con vacunas basadas en vectores de ADN. De hecho, las interferencias entre el adyuvante y el vector pueden tener un impacto en su estabilidad. Además, podría esperarse que la adición de un adyuvante a un vector atenuado aumentara la reactogenicidad inducida por tal producto. Finalmente, el aumentar la inmunogenicidad de una vacuna basada en vectores de ADN puede conducir a una respuesta inmunitaria neutralizadora mejorada frente al propio vector, descartándose así cualquier efecto de refuerzo de inyecciones posteriores de la misma vacuna basada en vectores. De hecho, en un protocolo de vacunación dirigido a la protección contra la infección por P. falciparum, Jones y col. (2001, J Infect Diseases 183, 303-312) han notificado un resultado adverso después de combinar ADN, proteína recombinante y adyuvante como una composición de refuerzo tras una dosis de sensibilización de ADN. De hecho, los niveles de parasitemia fueron significativamente inferiores en un grupo en el que la composición de refuerzo solo contenía proteína y adyuvante. Se concluyó que el uso de la combinación de ADN, proteína recombinante y adyuvante en este protocolo afectaron adversamente el resultado sobre parasitemia, además de respuestas de anticuerpos.
Por otra parte, hay una notificación de mejora de la eficacia de una vacuna de vectores basados en ADN con adyuvante (Ganne y col. Vaccine (1994) 12(13) 1190-1196). En particular, la eficacia mejorada de una vacuna con vector de adenovirus defectuoso en la replicación mediante la adición de adyuvantes de aceite guardó relación con mayores niveles de anticuerpos, pero no se notificó el impacto en las respuestas de linfocitos T CD4 y CD8.
En el documento WO2007/016715 se ha descrito el uso de un virus apatógeno como adyuvante. No se mencionó que dicho virus podría contener cualquier polinucleótido heterólogo.
Generalmente se cree que se necesita la estimulación de los linfocitos tanto CD4+ como CD8+ para una inmunidad protectora óptima, especialmente en ciertas enfermedades tales como infección por VIH/SIDA. Se desea la estimulación de los linfocitos tanto CD4+ como CD8+ con el fin de inducir una respuesta inmunitaria óptima bien profiláctica o terapéuticamente. Este es uno de los objetivos principales de las estrategias de vacunación de “dosis de sensibilización-refuerzo”, en las que la administración alterna de vacunas basadas en proteínas (que inducen principalmente linfocitos T CD4+) con vacunas basadas en vectores de ADN, es decir, ADN desnudo, vectores virales o vectores bacterianos intracelulares tales como listeria (que inducen principalmente linfocitos T CD8+) o viceversa, activa más probablemente las respuestas de tanto linfocitos T CD4+ como CD8+.
Sin embargo, aunque las estrategias de vacunas de dosis de sensibilización-refuerzo pueden dar lugar generalmente a una respuesta mayor o más equilibrada, la necesidad de vacunar en más de una ocasión y desde luego en más de dos ocasiones puede ser gravoso o incluso inviable, especialmente en los programas de inmunización masiva para el mundo en vías de desarrollo.
Además, como ya se ha mencionado anteriormente, frecuentemente no es posible reforzar el componente del vector viral debido a la inmunidad que haya podido fomentarse frente al propio vector.
Por tanto, los objetos de la invención incluyen uno o más de los siguientes: (a) proporcionar un protocolo de vacunación completo y una composición de vacuna que estimule la producción de células CD4+ y/o CD8+ y/o anticuerpos y en particular que evite o mitigue la necesidad de inmunizaciones repetidas; (b) proporcionar un protocolo de vacunación y una composición de vacuna que estimule mejor la producción de células CD4+ y/o células CD8+ y/o anticuerpos con respecto a composiciones de vacunas que contienen un polipéptido inmunógeno solo o un polinucleótido solo o respecto a un protocolo de sensibilización-refuerzo convencional que implica la administración separada de polipéptido y polinucleótido inmunógenos; (c) proporcionar una composición de vacuna que estimule o estimule mejor respuestas de Th1; (d) proporcionar una composición de vacuna y protocolo de vacunación en el que se minimicen las dosis requeridas de componentes, especialmente vectores virales; y (e) proporcionar más generalmente una composición de vacuna útil y protocolo de vacunación para el tratamiento o la prevención de enfermedades producidas por patógenos. Por “estimule mejor” se indica que se potencia la intensidad y/o persistencia de la respuesta.
Sumario de la invención
Por lo tanto, de acuerdo con la invención, se proporciona uno o más primeros polipéptidos inmunógenos para su uso en un procedimiento de fomento de una respuesta inmunitaria frente a Mycobacterium spp. en el que los uno o más primeros polipéptidos inmunógenos se administran de manera concomitante con (i) uno o más vectores adenovirales que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más segundos polipéptidos inmunógenos y (ii) un adyuvante que comprende QS21 y 3D-MPL, en el que los uno o más primeros y segundos polipéptidos inmunógenos comprenden los restos 4-725 de la SEQ ID NO: 10, y en el que la expresión “de manera concomitante” se refiere a que los uno o más primeros y segundos polipéptidos inmunógenos, el uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran dentro de n período de no más de 12 horas, por ejemplo, dentro de un período de no más de 1 hora, normalmente en una ocasión, por ejemplo, en el trascurso de la misma visita al profesional sanitario, por ejemplo, los uno o más primeros y segundos polipéptidos inmunógenos, los uno más vectores adenovirales y el adyuvante se administran de manera secuencial o de manera simultánea.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona uno o más vectores adenovirales que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más segundos polipéptidos inmunógenos derivados de Mycobacterium spp. para su uso en un procedimiento de generar una respuesta inmunológica frente a dicho Mycobacterium spp. en la que los uno o más vectores adenovirales se administran de manera concomitante con (i) uno o más primeros polipéptidos inmunógenos derivados de dicho Mycobacterium spp. y (ii) un adyuvante que comprende QS21 y 3D-MPL, en el que los uno o más primeros y segundos polipéptidos comprenden los restos 4­ 725 de la SEQ ID NO: 10, y en donde la expresión “de manera concomitante” se refiere a que los uno o más primeros y segundos polipéptidos inmunógenos, los uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran dentro de un período de no más de 12 horas, por ejemplo, dentro de un período de no más de 1 hora, normalmente en una ocasión, por ejemplo, en el trascurso de la misma visita al profesional sanitario, por ejemplo, los uno o más primeros y segundos polipéptidos, los uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran de manera secuencial o simultánea. De acuerdo con otro aspecto específico de la invención, se proporciona una composición de vacuna que comprende (i) uno o más primeros polipéptidos inmunógenos; (ii) uno o más vectores adenovirales que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más segundos polipéptidos inmunógenos; y (iii) un adyuvante que comprende QS21 y 3D-MPL, en el que los uno o más primeros y segundos polipéptidos comprenden los restos 4-725 de la SEQ ID NO: 10.
También se desvela una composición inmunógena que comprende (i) uno o más primeros polipéptidos inmunógenos derivados de un patógeno; (ii) uno o más vectores adenovirales que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más segundos polipéptidos inmunógenos derivados de dicho patógeno; y (iii) un adyuvante.
Dichas vacunas y composiciones inmunógenas estimulan adecuadamente la producción de linfocitos T CD4+ y/o linfocitos T CD8+ y/o anticuerpos, específicos para patógenos.
Por “linfocitos T CD4+ y/o linfocitos T CD8+ y/o anticuerpos, específicos para patógenos” se indican linfocitos T CD4+ y/o linfocitos T CD8+ y/o anticuerpos que reconocen específicamente todo el patógeno o una parte (por ejemplo una subunidad inmunógena) del mismo. Por “reconocen específicamente” se indica que los linfocitos T CD4+ y/o linfocitos T CD8+ y/o anticuerpos reconocen de un modo inmunoespecífico en vez de un modo no específico dicho patógeno (o parte del mismo).
También se desvela un procedimiento de estímulo de una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende administrar a un sujeto una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición tal.
También se proporciona el uso de una composición tal en la preparación de un medicamento para estimular una respuesta inmunitaria en un mamífero.
También se proporciona una composición tal para uso en la estimulación de una respuesta inmunitaria en un mamífero.
También se desvela un procedimiento de estímulo de la producción de linfocitos T CD4+ y/o linfocitos T CD8+ y/o anticuerpos específicos para patógenos en mamíferos que comprende administrar a dicho mamífero (i) uno o más primeros polipéptidos inmunógenos derivados de un patógeno; (ii) uno o más vectores adenovirales que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más segundos polipéptidos inmunógenos derivados de dicho patógeno; y (iii) un adyuvante; en el que el uno o más primeros polipéptidos inmunógenos, el uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran simultáneamente, por ejemplo mediante administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición anteriormente dicha.
También se proporciona el uso de las composiciones anteriormente dichas en la preparación de un medicamento para estimular la producción de células CD4+ y/o CD8+ y/o anticuerpos específicos para patógenos en mamíferos. Por ejemplo, se estimula la producción de linfocitos T CD4+ o linfocitos T CD8+ o anticuerpos.
Adecuadamente se estimula producción de 2 y especialmente 3 de linfocitos T CD4+ y/o linfocitos T CD8+ y/o anticuerpos.
Adecuadamente se estimula la producción de linfocitos T CD8+. Adecuadamente se estimula la producción de linfocitos T CD4+ y CD8+. Adecuadamente se estimula la producción de linfocitos T CD4+ y CD8+ y anticuerpos. Alternativamente, adecuadamente se estimula la producción de linfocitos T CD4+. Adecuadamente se estimula la producción de CD4+ y anticuerpos.
Alternativamente, adecuadamente se estimula la producción de anticuerpos.
Los procedimientos de la divulgación están previstos adecuadamente para proporcionar las etapas adecuadas para un procedimiento completo para fomentar una respuesta inmunitaria (aunque, si se desea, el procedimiento puede repetirse). Por tanto, adecuadamente, los procedimientos desvelados no implican el uso de una dosis de sensibilización de cualquier polipéptido o polinucleótido inmunógeno (por ejemplo, en forma de un vector tal como un vector adenoviral) que codifique cualquier polipéptido inmunógeno.
Por ejemplo, se desvela un procedimiento de fomento de una respuesta inmunitaria frente a un patógeno que está constituido por (a) administrar (i) uno o más primeros polipéptidos inmunógenos derivados de dicho patógeno; (ii) uno o más vectores adenovirales que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más segundos polipéptidos inmunógenos derivados de dicho patógeno; y (iii) un adyuvante; en el que el uno o más polipéptidos inmunógenos, el uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran simultáneamente; y (b) opcionalmente repetir las etapas de (a).
Las etapas del procedimiento pueden repetirse (por ejemplo, repetirse una vez) si una repetición da lugar a una respuesta inmunitaria mejorada. Puede obtenerse una respuesta adecuada, al menos en lo que se refiere a una respuesta de linfocitos T, sin necesidad de repetición.
También se desvela un procedimiento de fomento de una respuesta inmunitaria frente a un patógeno que comprende (a) administrar (i) uno o más primeros polipéptidos inmunógenos derivados de dicho patógeno; (ii) uno o más vectores adenovirales que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más segundos polipéptidos inmunógenos derivados de dicho patógeno; y (iii) un adyuvante; en el que el uno o más primeros polipéptidos inmunógenos, el uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran simultáneamente; y en el que el procedimiento no implica administrar una dosis de sensibilización de polipéptido o polinucleótido inmunógenos que codifique polipéptido inmunógeno.
También se proporciona un kit que comprende (i) uno o más primeros polipéptidos inmunógenos derivados de Mycobacterium spp; (ii) uno o más vectores adenovirales que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más segundos polipéptidos inmunógenos derivados de Mycobacterium spp; y (iii) un adyuvante que comprende QS21 y 3D-MPL, en el que los uno o más primeros y segundos polipéptidos comprenden los restos 4-725 de la SEQ ID NO: 10, y en el que los uno o más primeros y segundos polipéptidos inmunógenos, los uno o más vectores adenovirales y el adyuvante son para la administración de manera concomitante, en la que la expresión “de manera concomitante” se refiere a que los uno o más primeros y segundos polipéeptidos inmunógenos, los uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran dentro de un período de no más de 12 horas, por ejemplo, dentro de un período de no más de 1 hora, normalmente en una ocasión, por ejemplo, en el trascurso de la misma visita al profesional sanitario, por ejemplo los uno o más primeros y segundos polipéptidos inmunógenos, los uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran de manera secuencial o de manera simultánea.
Las composiciones y procedimientos de la invención pueden ser útiles para la prevención de infección por patógenos en sujetos sin tratamiento previo, o la prevención de que se vuelvan a infectar sujetos que previamente se habían infectado por patógenos o el tratamiento de sujetos que se han infectado por patógenos.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra una representación gráfica de la construcción del plásmido p73i-Tgrn
Las Figuras 2-8 muestran los resultados de experimentos tratados en el Ejemplo 1, específicamente:
Las Figuras 2a, 2b, 3a, 3b: respuestas de linfocitos T CD4+ y CD8+ en respuesta a reestimulación por mezclas de péptidos derivados de p24, RT, Nef y p17 tras diversos protocolos de inmunización y en diferentes momentos;
Figura 4: respuestas de anticuerpos frente a F4;
Las Figuras 5-8 respuestas de anticuerpos frente a componentes de F4 p24, RT, p17 y Nef, respectivamente; La Figura 9 muestra los resultados de experimentos tratados en el Ejemplo 2, específicamente: respuestas de linfocitos T CD4+ en respuesta a reestimulación por mezclas de péptidos derivados de p24 y RT tras diversos protocolos de inmunización;
Las Figuras 10-12 muestran los resultados de experimentos tratados en el Ejemplo 3, específicamente:
La Figura 10 muestra la respuesta linfoproliferativa de CMSP de conejo frente a mezclas de péptidos que incluyen la secuencia de F4;
La Figura 11 muestra la evolución temporal de respuestas de anticuerpos frente a F4;
Las Figuras 12a y 12b muestra respuestas de anticuerpos (en el día 77) frente a componentes de F4 p24 y RT, respectivamente;
La Figura 13 muestra la cuantificación de linfocitos T CD4 específicos para VIH-1;
La Figura 14 muestra distribución de la frecuencia de linfocitos T CD4 específicos para F47 días después de dos inmunizaciones;
La Figura 15 muestra la producción de citocinas de linfocitos T CD4 específicos para F47 días después de dos inmunizaciones;
La Figura 16 muestra la cuantificación de linfocitos T CD8 específicos para VIH-1;
La Figura 17 muestra la producción de citocinas de linfocitos T CD8 específicos para F47 días después de dos inmunizaciones;
La Figura 18 muestra la cuantificación de linfocitos T CD4 específicos para CSP;
La Figura 19 muestra la cuantificación de linfocitos T CD8 específicos para CSP;
La Figura 20 muestra la cuantificación de linfocitos T CD4 específicos para (el extremo N de) CSP;
La Figura 21 muestra la cuantificación de linfocitos T CD4 específicos para (el extremo C de) CSP;
La Figura 22 muestra la cuantificación de linfocitos T CD8 específicos para (el extremo N de) CSP;
La Figura 23 muestra la cuantificación de linfocitos T CD8 específicos para (el extremo C de) CSP;
La Figura 24 muestra la cuantificación de títulos de anticuerpos específicos para CSP.
Resumen de los listados de secuencias
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Las secuencias anteriormente enumeradas 9 y 10 pueden emplearse como polipéptidos o polinucleótidos que codifican polipéptidos útiles en aspectos a modo de ejemplo de la invención. Dichos polipéptidos pueden estar constituidos por o comprender las secuencias anteriormente mencionadas. Los restos de Met iniciales son opcionales. Los restos de His del extremo N (que incluyen restos de His que siguen inmediatamente a una Met inicial, como en SEQ ID No 9) son opcionales o puede emplearse una marca de His del extremo N de una longitud diferente (por ejemplo, normalmente pueden emplearse hasta 6 restos de His para facilitar el aislamiento de la proteína). Pueden emplearse proteínas análogas que tienen identidad de secuencias significativa, por ejemplo superior al 80 %, por ejemplo superior al 90 %, por ejemplo superior al 95 %, por ejemplo superior al 99 %, de identidad de secuencia respecto a la longitud total de la secuencia de referencia, especialmente cuando la proteína análoga tiene una función similar y particularmente cuando la proteína análoga es similarmente inmunógena. Pueden tolerarse, por ejemplo, hasta 20, por ejemplo hasta 10, por ejemplo 1-5 sustituciones (por ejemplo sustituciones conservativas). Pueden emplearse ácidos nucleicos que se diferencian de aquellos enumerados anteriormente que codifican las mismas proteínas, o las proteínas análogas anteriormente mencionadas. La identidad de secuencias puede determinarse mediante medios convencionales, por ejemplo usando BLAST. En una variante específica de SEQ ID No 16 que puede mencionarse, el resto 398 es Ser y no Cys.
Descripción detallada de la invención.
Como se usa en el presente documento, el término “simultáneamente” significa que el uno o más polipéptidos inmunógenos, el uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran dentro de un periodo no superior a 12 horas, por ejemplo dentro de un periodo no superior a 1 hora, normalmente en una ocasión, por ejemplo en el transcurso de la misma visita al profesional sanitario, por ejemplo, el uno o más polipéptidos inmunógenos, el uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran secuencialmente o simultáneamente.
Como se usa en el presente documento, el término “epítopo” se refiere a una secuencia de aminoácidos inmunógenas. Un epítopo puede referirse a una secuencia mínima de aminoácidos de normalmente 6-8 aminoácidos cuya secuencia mínima es inmunógena cuando se retira de su contexto natural, por ejemplo cuando se trasplanta a un polipéptido heterólogo. Un epítopo también puede referirse a esa parte de una proteína que es inmunógena, en la que el polipéptido que contiene el epítopo se denomina el antígeno (o algunas veces “antígeno de polipéptido”). Un polipéptido o antígeno puede contener uno o más epítopos distintos (por ejemplo 2 o 3 o más).
El término “epítopo” engloba epítopos de linfocitos B y linfocitos T. El término “epítopo de linfocitos T” engloba epítopos de linfocitos T CD4+ y epítopos de linfocitos T CD8+ (algunas veces también se denominan en lo sucesivo epítopos CTL).
El término “polipéptido inmunógeno” se refiere a un polipéptido que es inmunógeno, es decir, que puede provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero, y por tanto contiene uno o más epítopos (por ejemplo epítopos de linfocitos T y/o linfocitos B). Los polipéptidos inmunógenos pueden contener uno o más antígenos de polipéptidos, por ejemplo en una disposición no natural tal como en una proteína de fusión.
Los polipéptidos inmunógenos serán normalmente proteínas recombinantes producidas, por ejemplo, mediante expresión en un huésped heterólogo tal como un huésped bacteriano, en levadura o en células cultivadas de mamíferos.
El término “polipéptido derivado de un patógeno” significa un polipéptido que contiene parcialmente o completamente secuencias (es decir, antígenos) que se producen naturalmente en patógenos o poseen un alto grado de identidad de secuencias al mismo (por ejemplo superior al 95% de identidad respecto a un tramo de al menos 10, por ejemplo al menos 20 aminoácidos).
Los polipéptidos inmunógenos pueden contener uno o más (por ejemplo 1, 2, 3 o 4) antígenos de polipéptidos.
A menos que se especifique lo contrario, una “respuesta inmunitaria” puede ser una respuesta celular y/o una humoral.
En una realización de la invención, uno o más de dichos uno o más primeros polipéptidos inmunógenos es sustancialmente el mismo que uno o más de dichos uno o más segundos polipéptidos inmunógenos. Por ejemplo, uno del al menos un primer polipéptido inmunógeno y uno del al menos un segundo polipéptido inmunógeno pueden tener una identidad de secuencias global del 90 % o más, por ejemplo del 95 % o más, por ejemplo del 98 % o 99 % o más respecto a la longitud de uno u otro polipéptido inmunógeno.
En otra realización de la invención, uno o más de dichos uno o más primeros polipéptidos inmunógenos contiene al menos un antígeno que es sustancialmente el mismo que un antígeno contenido en uno o más de dichos uno o más segundos polipéptidos inmunógenos. Por ejemplo, uno del al menos un primer polipéptido inmunógeno y uno del al menos un segundo polipéptido inmunógeno pueden tener una identidad de secuencias global del 90 % o más, por ejemplo del 95 % o más, por ejemplo del 98 % o 99 % o más respecto a un tramo de 20 aminoácidos o más, por ejemplo 40 aminoácidos o más, por ejemplo 60 aminoácidos o más.
Adecuadamente, uno o más primeros polipéptidos inmunógenos comprenden al menos un epítopo de linfocitos T.
Adecuadamente, uno o más segundos polipéptidos inmunógenos comprenden al menos un epítopo de linfocitos T.
Adecuadamente, el uno o más primeros polipéptidos inmunógenos comprende al menos un epítopo de linfocitos B.
Adecuadamente, el uno o más segundos polipéptidos inmunógenos comprende al menos un epítopo de linfocitos B.
En otra realización de la invención, uno o más de dichos uno o más primeros polipéptidos inmunógenos y uno o más de dichos uno o más segundos polipéptidos inmunógenos comparten uno o más epítopos idénticos de linfocitos B y/o linfocitos T. Adecuadamente comparten una o más secuencias idénticas de aminoácidos de 10 aminoácidos de longitud o más, por ejemplo 15 aminoácidos o más, por ejemplo 25 aminoácidos o más.
También se desvelan ejemplos en los que ninguno del uno o más de dichos uno o más primeros polipéptidos inmunógenos es sustancialmente el mismo que o contiene algún antígeno en común con uno o más de dichos uno o más segundos polipéptidos inmunógenos, por ejemplo pueden tener una identidad de secuencias global inferior al 90 % durante un tramo de 20 aminoácidos o más, por ejemplo 40 aminoácidos o más, por ejemplo 60 aminoácidos o más.
Por tanto, pueden no compartir ningún epítopo de linfocitos B o linfocitos T. Por ejemplo, pueden no compartir ninguna secuencia idéntica de aminoácidos de 10 aminoácidos de longitud o más, por ejemplo 15 aminoácidos o más, por ejemplo 25 aminoácidos o más.
En una realización específica de la invención, un primer polipéptido inmunógeno y un segundo polipéptido inmunógeno contienen los mismos antígenos en la misma disposición o en una disposición diferente (por ejemplo en una disposición diferente). Por “disposición diferente” se indica que pueden estar dispuestos en un orden diferente y/o pueden estar divididos. En otra realización específica de la invención, un primer polipéptido inmunógeno y un segundo polipéptido inmunógeno son el mismo.
La composición según la invención puede contener un primer polipéptido inmunógeno como el único polipéptido inmunógeno en la composición. Alternativamente, la composición según la invención puede contener más de un primer polipéptido inmunógeno, por ejemplo 2 o 3 o 4 o más polipéptidos inmunógenos.
La composición según la invención puede comprender un vector adenoviral. Alternativamente puede comprender más de un vector adenoviral, por ejemplo 2 vectores adenovirales.
En composiciones según la invención, un vector adenoviral puede comprender un polinucleótido heterólogo que codifica un segundo polipéptido inmunógeno o puede comprender más de un polinucleótido heterólogo que juntos codifican más de un segundo polipéptido inmunógeno bajo el control de más de un promotor.
Además de para la vacunación profiláctica, las composiciones de la invención también pueden usarse en individuos que ya están infectados con el patógeno, y dan como resultado un control inmunológico mejorado de la infección establecida.
Antígenos
Antígenos útiles según la invención son derivados de patógenos, más específicamente Mycobacterium spp. Los patógenos incluyen virus, bacterias, protozoos y otros organismos parásitos perjudiciales para los mamíferos, incluyendo el hombre.
Los antígenos de polipéptidos adecuados que van a administrarse como polipéptido o polinucleótido que codifican el polipéptido de acuerdo con la presente divulgación incluyen antígenos derivados de VIH (por ejemplo VIH-1), virus del herpes humano (tales como gH, gL gM gB gC gK gE o gD o derivados de los mismos o proteína inmediata temprana tal como ICP27, ICP 47, ICP4, ICP36 de VHS1 o VHS2), citomegalovirus, especialmente humano (tal como gB o derivados del mismo), virus de Epstein Barr (tal como gp350 o derivados del mismo), virus de la varicela zóster (tal como gpl, II, III y IE63) o de un virus de la hepatitis tal como virus de la hepatitis B (por ejemplo, antígeno superficial de la hepatitis B, PreS1, PreS2 y proteínas env superficiales, antígeno del núcleo de la hepatitis B o Pol), virus de la hepatitis C (por ejemplo Core, E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y B) y antígeno del virus de la hepatitis E, o de otros patógenos virales tales como paramixovirus: virus respiratorio sincitial (tal como proteínas F y G o derivados de las mismas), o antígenos del virus paragripal, virus del sarampión, virus de la parotiditis, virus del papiloma humano (por ejemplo VPH6, 11, 16, 18, por ejemplo L1, L2, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7), flavivirus (por ejemplo virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus de la encefalitis japonesa) o virus de la gripe (tal como hemaglutina, nucleoproteína, NA o proteínas M o combinaciones de las mismas), o antígenos derivados de patógenos bacterianos tales como Neisseria spp., incluyendo N. gonorrhea y N. meningitidis, por ejemplo, proteínas de unión a transferrina, proteínas de unión a lactoferrina, PilC, adhesinas); S. pyogenes (por ejemplo proteínas M o fragmentos de las mismas, proteasa C5A, S. agalactiae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp., incluyendo M catarrhalis, también conocida como Branhamella catarrhalis (por ejemplo adhesinas e invasinas de alto y bajo peso molecular); Bordetella spp., incluyendo B. pertussis (por ejemplo pertactina, toxina pertussis o derivados de las mismas, hemaglutinina filamentosa, adenilato-ciclasa, fimbrias), B. parapertussis y B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., incluyendo M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp., incluyendo L. pneumophila; Escherichia spp., incluyendo E. coli enterotóxica (por ejemplo factores de colonización, toxina lábil al calor o derivados de la misma, toxina estable al calor o derivados de la misma), E. coli enterohemorrágica, E. coli enteropatógena (por ejemplo toxina similar a toxina shiga o derivados de la misma); Vibrio spp., incluyendo V. cholera (por ejemplo toxina del cólera o derivados de la misma); Shigella spp., incluyendo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp., incluyendo Y. enterocolitica (por ejemplo una proteína Yop), Y pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp., incluyendo C. jejuni (por ejemplo toxinas, adhesinas e invasinas) y C. coli; Salmonella spp., incluyendo S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., incluyendo L. monocytogenes; Helicobacter spp., incluyendo H. pylori (por ejemplo ureasa, catalasa, toxina vacuolizante); Pseudomonas spp., incluyendo P. aeruginosa; Staphylococcus spp., incluyendo S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., incluyendo E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., incluyendo C. tetani (por ejemplo toxina tetánica y derivado de la misma), C. botulinum (por ejemplo toxina botulínica y derivado de la misma), C. difficile (por ejemplo toxinas A o B de clostridium y derivados de las mismas); Bacillus spp., incluyendo B. anthracis (por ejemplo toxina botulínica y derivados de la misma); Corynebacterium spp., incluyendo C. diphtheriae (por ejemplo toxina de la difteria y derivados de la misma); Borrelia spp., incluyendo B.
burgdorferi (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., incluyendo E. equi y el agente de la ehrliquiosis granulocítica humana; Rickettsia spp., incluyendo R. rickettsii; Chlamydia spp., incluyendo C. trachomatis, C. pneumoniae, C. psittaci; Leptospira spp., incluyendo L. interrogans; Treponema spp., incluyendo T. pallidum (por ejemplo las proteínas raras de la membrana externa), T. denticola, T. hyodysenteriae; o derivados de parásitos tales como Plasmodium spp., incluyendo P. falciparum y P. vivax; Toxoplasma spp., incluyendo T. gondii (por ejemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., incluyendo E. histolytica; Babesia spp., incluyendo B. microti; Trypanosoma spp., incluyendo T. cruzi; Giardia spp., incluyendo G. lamblia; leishmania spp., incluyendo L. major; Pneumocystis spp., incluyendo P. carinii; Trichomonas spp., incluyendo T. vaginalis; Schisostoma spp., incluyendo S. mansoni, o derivados de levadura tales como Candida spp., incluyendo C. albicans; Cryptococcus spp., incluyendo C. neoformans.
Otros antígenos bacterianos incluyen antígenos derivados de Streptococcus spp., incluyendo S. pneumoniae (PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas de unión a colina) y el antígeno de proteína neumolisina (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins y col., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342) y derivados purificados mutantes de los mismos (documentos WO90/06951; WO99/03884). Otros antígenos bacterianos incluyen antígenos derivados de Haemophilus spp., incluyendo H. influenzae tipo B (por ejemplo PRP y conjugados del mismo), H. influenzae no clasificable, por ejemplo OMP26, adhesinas de alto peso molecular, P5, P6, proteína D y lipoproteína D, y fimbrina y péptidos derivados de fimbrina (documento US5.843.464) o variantes de copias múltiples o proteínas de fusión de los mismos.
Los procedimientos o composiciones de la presente invención se usan para proteger contra o tratar enfermedades bacterianas tales como aquellas producidas por Mycobacterium tuberculosis (TB).
Antígenos de TB
En la presente invención, el patógeno es Mycobacterium tuberculosis.
Antígenos a modo de ejemplo derivados de M. tuberculosis son, por ejemplo alfa-cristalina (HspX), HBHA, Rv1753, Rv2386, Rv2707, Rv2557, Rv2558, RPFs: Rv0837c, Rv1884c, Rv2389c, Rv2450, Rv1009, aceA (Rv0467), ESAT6, Tb38-1, Ag85A, -B o-C, MPT 44, MPT59, MPT45, HSP10, HSP65, HSP70, HSP75, HSP90, PPD 19kDa [Rv3763], PPD, 38kDa [Rv0934]), PstS1, (Rv0932), SodA (Rv3846), Rv2031c, 16kDa, Ra12, TbH9, Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, DPPD, mTCC1, mTCC2, hTCC1 (documento WO99/51748) y hTCC2, y especialmente Mtb32a, Ra35, Ra12, DPV, MSL, MTI, Tb38-1, mTCC1, TbH9 (Mtb39a), hTCC1, mTCC2 y DPPD. Antígenos derivados de M. tuberculosis también incluyen proteínas de fusión y variantes de las mismas en las que al menos dos o, por ejemplo, tres polipéptidos de M. tuberculosis, se fusionan en una proteína mayor. Tales fusiones pueden comprender o están constituidas por Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (documento WO99/51748), Ra12-Tbh9-Ra35-Ag85B y Ra12-Tbh9-Ra35-mTCC2. SEQ ID No 6 del documento WO2006/117240 define una secuencia de Ra12-Tbh9-Ra35 particular que puede mencionarse junto con variantes en las que Ser 704 de esa secuencia se muta por otro aminoácido distinto de serina, por ejemplo por Ala, y derivados de la misma que incorporan una marca de His en el extremo N de una longitud apropiada (por ejemplo s Eq ID No 2 o 4 del documento WO2006/117240). Véase también SEQ ID No 10, que es una secuencia que contiene una marca M de iniciación opcional y una de His-His en el extremo N opcional (posiciones 2 y 3) y en la que la Ala mutada respecto a Ser de tipo salvaje está en la posición 706.
Antígenos de Chlamydia
En otros ejemplos, el patógeno puede ser, por ejemplo, una Chlamydia sp., por ejemplo C. trachomatis.
Antígenos a modo de ejemplo derivados de Chlamydia sp, por ejemplo C. trachomatis, se seleccionan de CT858, CT089, CT875, MOMP, CT622, PmpD, PmpG y fragmentos de los mismos, SWIB y fragmentos inmunógenos de uno cualquiera de los mismos (tales como PmpDpd y PmpGpd) y combinaciones de los mismos. Combinaciones preferidas de antígenos incluyen CT858, CT089 y CT875. Las secuencias y combinaciones específicas que pueden emplearse se describen en el documento WO2006/104890.
Antígenos de Plasmodium
En otros ejemplos, el patógeno puede ser, por ejemplo, un parásito que produce malaria tal como Plasmodium sp., por ejemplo P. falciparum o P. vivax.
Por ejemplo, los antígenos derivados de P. falciparum incluyen proteína del circumsporozoíto (proteína CS), PfEMP-1, antígeno Pfs 16, MSP-1, MSP-3, LSA-1, LsA-3, AMA-1 y TRAP. Un antígeno híbrido particular que puede mencionarse es RTS. RTS es una proteína híbrida que comprende sustancialmente toda la parte del extremo C de la proteína del circumsporozoíto (CS) de P. falciparum unida mediante cuatro aminoácidos de la parte preS2 del antígeno superficial de la hepatitis B al antígeno superficial (S) del virus de la hepatitis B. Cuando se expresa en levadura, RTS se produce como una partícula de lipoproteína, y cuando se coexpresa con el antígeno S de VHB produce una partícula mixta conocida como RTS,S. La estructura de RTS y RTS,S se describen en el documento WO93/10152. Los antígenos TRAP se describen en el documento WO90/01496. Otros antígenos de Plasmodium incluyen EBA de P. falciparum, GLURP, RAP1, RAP2, secuestrina, Pf332, STARP, SALSA, PfEXPI, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230 y sus análogos en otras Plasmodium spp. Un ejemplo desvelado en el presente documento es una composición que comprende RTS,S o proteína CS o un fragmento de los mismos como la parte de CS de RTS,S en combinación con uno o más antígenos palúdicos adicionales que pueden seleccionarse, por ejemplo, del grupo que está constituido por MSP-1, MSP-3, AMA-1, Pfs 16, LSA-1 o lSa -3. Antígenos posibles de P. vivax incluyen proteína del circumsporozoíto (proteína CS) y proteína de unión al antígeno Duffy y fragmentos inmunógenos de las mismas, tales como PvRII (véase, por ejemplo, el documento WO02/12292).
En este ejemplo, el primer y segundo polipéptido inmunógeno se pueden seleccionar de antígenos derivados de Plasmodium falciparum y/o Plasmodium vivax.
Por ejemplo, el primer y/o segundo polipéptido inmunógeno se seleccionan de antígenos derivados de Plasmodium falciparum y/o Plasmodium vivax se seleccionan de RTS (por ejemplo como RTS,S), proteína del circumsporozoíto (CS), MSP-1, MSP-3, AMA-1, LSA-1, LSA-3 y derivados inmunógenos de los mismos o fragmentos inmunógenos de los mismos.
Un derivado específico que puede mencionarse es la proteína híbrida conocida como RTS, especialmente cuando se presenta en forma de una partícula mixta conocida como RTS,S.
En SEQ ID No 14 se muestra una secuencia de RTS a modo de ejemplo.
En SEQ ID No 12 se muestra un antígeno derivado de proteína CS de P. falciparum a modo de ejemplo. Esta secuencia particular se corresponde con la secuencia de CSP de P. falciparum (cepa 3D7), que también contiene una inserción de 19 aa procedente de la cepa 7G8 (81-100).
En otro ejemplo, un primer polipéptido inmunógeno es RTS,S y un segundo polipéptido inmunógeno es la proteína CS de Plasmodium falciparum o un fragmento inmunógeno de la misma.
Antígenos de VPH
En otros ejemplos, el patógeno puede ser, por ejemplo, un virus del papiloma humano.
Por tanto, antígenos de uso pueden, por ejemplo, derivar del virus del papiloma humano (VPH) considerado responsable de condiloma acuminado (VPH6 o VPH11 y otros) y/o los virus VPH responsables del cáncer de cuello uterino (VPH16, VPH18, VPH33, VPH51, VPH56, VPH31, VPH45, VPH58, VPH52 y otros). En un ejemplo, las formas de las composiciones profilácticas, o terapéuticas, de condiloma acuminado comprenden partículas L1 o capsómeros y proteínas de fusión que comprenden uno o más antígenos seleccionados de las proteínas del VPH E1, E2, E5 E6, E7, L1 y L2. Las formas de la proteína de fusión pueden ser: L2E7 como se describe en el documento WO96/26277 y proteína D (1/3)-E7 descrita en el documento PCT/EP98/05285.
Una composición profiláctica o terapéutica preferida para infección o cáncer del cuello uterino por VPH puede comprender antígenos de VPH 16 o 18. Por ejemplo, monómeros del antígeno L1 o L2 o antígenos L1 o L2 presentados juntos como una partícula similar a virus (VLP) o la proteína L1 sola presentada sola en una VLP o estructura de capsómero. Tales antígenos, partículas similares a virus y capsómeros son conocidos en sí. Véanse, por ejemplo, los documentos WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792 y WO93/02184. Pueden incluirse proteínas tempranas adicionales solas o como proteínas de fusión tales como E7, E2 o preferentemente E5, por ejemplo, la divulgación particularmente preferida de éstas incluye una VLP que comprende proteínas de fusión L1E7 (documento WO96/11272). En un ejemplo, los antígenos de VPH 16 comprenden las proteínas tempranas E6 o E7 fusionadas con un soporte de proteína D para formar fusiones de proteína D - E6 o E7 procedentes de VPH 16, o combinaciones de las mismas; o combinaciones de E6 o E7 con L2 (documento WO96/26277). Alternativamente, las proteínas tempranas de VPH 16 o 18 E6 y E7 pueden presentarse en una única molécula, preferentemente una proteína D-fusión E6/E7. Una composición tal puede proporcionar opcionalmente cualquiera o ambas proteínas E6 y E7 de VPH 18, preferentemente en forma de una proteína de fusión proteína D - E6 o proteína D - E7 o proteína de fusión proteína D E6/E7. Adicionalmente pueden emplearse antígenos de otras cepas de VPH, preferentemente de cepas Vp H 31 o 33.
Antígenos de VIH
En otros ejemplos, el patógeno puede ser, por ejemplo VIH, por ejemplo VIH-1.
Por tanto, los antígenos pueden seleccionarse de antígenos derivados de VIH, particularmente antígenos derivados de VIH-1.
Las proteínas Tat y Nef de VIH son proteínas tempranas, es decir, se expresan pronto en la infección y en ausencia de proteína estructural.
El gen Nef codifica una proteína de VIH accesoria temprana que se ha mostrado que posee varias actividades. Por ejemplo, se sabe que la proteína Nef produce la retirada de CD4, el receptor de VIH, de la superficie celular, aunque se discute la importancia biológica de esta función. Adicionalmente, Nef interactúa con la ruta de señalización de linfocitos T e induce un estado activo, que a su vez puede promover una expresión génica más eficaz. Algunos aislados de VIH tienen mutaciones o deleciones en esta región que producen que no codifiquen la proteína funcional y están gravemente comprometidos en su replicación y patogénesis in vivo.
El gen Gag se traduce a partir del ARN de longitud completa para dar una poliproteína precursora que posteriormente se escinde en 3 -5 proteínas de la cápside; la proteína de la matriz p17, proteína de la cápside p24 y proteína de unión a ácido nucleico (Fundamental Virology, Fields BN, Knipe DM y Howley M, 19962. Fields Virology vol 21996).
El gen Gag da lugar a la proteína precursora Gag de 55 kilodalton (Kd), también llamada p55, que se expresa a partir del ARNm viral sin cortar y empalmar. Durante la traducción, el extremo N de p55 se miristoíla, provocando su asociación con la cara citoplásmica de membranas celulares. La poliproteína Gag asociada a la membrana incorpora dos copias del ARN genómico viral junto con otras proteínas virales y celulares que provocan la gemación de la partícula viral a partir de la superficie de una célula infectada. Después de la gemación, la proteasa viralmente codificada (un producto del gen Pol) escinde p55 durante el procedimiento de maduración viral en cuatro proteínas más pequeñas designadas MA (matriz [p17]), CA (cápside [p24]), NC (nucleocápside [p9]) y p6.(4).
Además de las 3 proteínas Gag importantes (p17, p24 y p9), todos los precursores de Gag contienen varias regiones distintas que se escinden y permanecen en el virión como péptidos de diversos tamaños. Estas proteínas tienen funciones diferentes, por ejemplo, la proteína p2 tiene una función propuesta en la regulación de la actividad de la proteasa y contribuye a la correcta sincronización de la transformación proteolítica.
El polipéptido MA se deriva del extremo miristoilado N-terminal de p55. La mayoría de las moléculas de MA permanecen unidas a la superficie interna de la bicapa lipídica del virión, estabilizando la partícula. Un subconjunto de MA se incorpora dentro de las capas más profundas del virión, en las que llega a ser parte del complejo que conduce el ADN viral al núcleo. Estas moléculas de MA facilitan el transporte nuclear del genoma viral debido a que la maquinaria de importación nuclear celular reconoce una señal cariófila en MA. Este fenómeno permite que el VIH infecte células que no están en división, una propiedad poco común para un retrovirus.
La proteína p24 (CA) forma el núcleo cónico de partículas virales. Se ha demostrado que la ciclofilina A interactúa con la región p24 de p55, llevando a su incorporación en partículas de VIH. La interacción entre Gag y ciclofilina A es esencial debido a que la interrupción de esta interacción por ciclosporina inhibe la replicación viral.
La región NC de Gag es responsable de reconocer específicamente la denominada señal de encapsidación de VIH. La señal de encapsidación está constituida por cuatro estructuras en horquilla localizadas próximas al extremo 5' del ARN viral y es suficiente para intervenir en la incorporación de un ARN heterólogo en viriones de VIH-1. NC se une a la señal de encapsidación mediante interacciones mediadas por dos motivos de dedos de cinc. NC también facilita la transcripción inversa.
La región del polipéptido p6 interviene en las interacciones entre Gag p55 y la proteína accesoria Vpr, llevando a la incorporación de Vpr en viriones de ensamblaje. La región de p6 también contiene un denominado dominio tardío que se requiere para la liberación eficaz de viriones de gemación a partir de una célula infectada.
El gen Pol codifica tres proteínas que tienen las actividades que necesita el virus en la infección temprana, la proteína transcriptasa inversa RT, proteasa e integrasa necesarias para la integración del ADN viral en ADN celular. La proteasa del virión escinde el producto principal de Pol para dar el péptido de RT del extremo amino que contiene actividades necesarias para la síntesis de ADN (ADN polimerasa dirigida por ARN y ADN, ribonucleasa H) y proteína integrasa del extremo carboxi. La RT de VIH es un heterodímero de RT de longitud completa (p66) y un producto de escisión (p51) que carece del dominio de la RNasa H del extremo carboxi.
RT es una de las proteínas más sumamente conservadas codificada por el genoma retroviral. Dos actividades importantes de RT son Pol de ADN y ribonucleasa H. La actividad de Pol de ADN de RT usa ARN y ADN como moldes intercambiables y, como todas las polimerasas de ADN conocidas, no puede iniciar la síntesis de ADN de nuevo, sino que requiere una molécula preexistente que sirva como cebador (ARN).
La actividad de RNasa H inherente en todas las proteínas RT desempeña pronto el papel esencial en la replicación de eliminar el genoma de ARN a medida que progresa la síntesis de ADN. Degrada selectivamente el ARN de todas las moléculas híbridas de ARN - ADN. Estructuralmente, la polimerasa y ribo H ocupan dominios separados que no se solapan dentro de Pol, cubriendo los dos tercios del amino de Pol.
La subunidad catalítica p66 se pliega en 5 subdominios distintos. El extremo amino 23 de éstos tiene la parte con actividad de RT. El extremo carboxi a éstos es el dominio RNasa H.
Después de la infección de la célula huésped, la transcriptasa inversa que está presente en la partícula infectante copia el genoma de ARN retroviral en ADN bicatenario lineal. La integrasa (revisado en Skalka AM '99 Adv en Virus Res 52271-273) reconoce los extremos del ADN viral, los recorta y acompaña al ADN viral a un sitio cromosómico huésped para catalizar la integración. Muchos sitios en el ADN huésped pueden ser dianas para la integración. Aunque la integrasa es suficiente para catalizar la integración in vitro, no es la única proteína asociada al ADN viral in vivo - el gran complejo proteína - ADN viral aislado a partir de células infectadas se ha denominado el complejo de pre-integración. Éste facilita la adquisición de los genes de la célula huésped por genomas virales de la descendencia.
La integrasa está constituida por 3 dominios distintos, el dominio del extremo N, el núcleo catalítico y el dominio del extremo C. El dominio del núcleo catalítico contiene todos los requisitos para la química de transferencia de polinucleotidilos.
Por tanto, los antígenos derivados de VIH-1 pueden seleccionarse, por ejemplo, de Gag (por ejemplo Gag de longitud completa), p17 (una parte de Gag), p24 (otra parte de Gag), p41, p40, Pol (por ejemplo Pol de longitud completa), RT (una parte de Pol), p51 (una parte de RT), integrasa (una parte de Pol), proteasa (una parte de Pol), Env, gp120, gp140 o gp160, gp41, Nef, Vif, Vpr, Vpu, Rev, Tat y derivados inmunógenos de los mismos y fragmentos inmunógenos de los mismos, particularmente Env, Gag, Nef y Pol y derivados inmunógenos de los mismos y fragmentos inmunógenos de los mismos que incluyen p17, p24, rT e integrasa. Las vacunas contra el VIH pueden comprender polipéptidos y/o polinucleótidos que codifican polipéptidos correspondientes a múltiples antígenos de VIH diferentes, por ejemplo 2 o 3 o 4 o más antígenos de v Ih que pueden seleccionarse de la lista anterior. Varios antígenos diferentes pueden estar comprendidos, por ejemplo, en una única proteína de fusión. Puede emplearse más de un primer polipéptido inmunógeno y/o más de un segundo polipéptido inmunógeno, siendo cada uno un antígeno de VIH o una fusión de más de un antígeno.
Por ejemplo, un antígeno puede comprender Gag o un derivado inmunógeno o fragmento inmunógeno del mismo, fusionado a RT o un derivado inmunógeno o fragmento inmunógeno de la misma, fusionado a Nef o un derivado inmunógeno o fragmento inmunógeno de la misma, en el que la parte de Gag de la proteína de fusión está presente en el extremo 5' del polipéptido.
Una secuencia de Gag puede excluir la secuencia que codifica el polipéptido p6 de Gag. Un ejemplo particular de una secuencia de Gag comprende secuencias que codifican p17 y/o p24.
Una secuencia de RT puede contener una mutación para inactivar sustancialmente cualquier actividad de la transcriptasa inversa (véase el documento WO03/025003).
El gen de RT es un componente del mayor gen pol en el genoma de VIH. Se entenderá que la secuencia de RT empleada según la presente divulgación puede estar presente en el contexto de Pol, o un fragmento de Pol que se corresponde al menos con RT. Tales fragmentos de Pol retienen epítopos CTL muy importantes de Pol. En un ejemplo específico, RT está incluida como precisamente el fragmento de p51 o precisamente el fragmento de p66 de RT.
El componente de RT de la proteína de fusión o composición comprende opcionalmente una mutación para eliminar un sitio que sirve como sitio interno de iniciación en sistemas de expresión procariota.
Opcionalmente, la secuencia de Nef se trunca para eliminar la secuencia que codifica la región del extremo N, es decir, la eliminación de 30 a 85 aminoácidos, por ejemplo de 60 a 85 aminoácidos, particularmente los 65 aminoácidos del extremo N (este último truncamiento se denomina en el presente documento Neftr). Alternativamente o adicionalmente, Nef puede modificarse para eliminar el sitio de miristilación. Por ejemplo, el sitio de miristilación de Gly 2 puede eliminarse mediante deleción o sustitución. Alternativamente o adicionalmente, Nef puede modificarse para alterar el motivo de dileucina de Leu 174 y Leu 175 mediante deleción o sustitución de una o ambas leucinas. La importancia del motivo de dileucina en la regulación por disminución de CD4 se describe, por ejemplo, en Bresnahan P.A. y col. (1998) Current Biology, 8(22): 1235-8.
El antígeno de Env puede estar presente en su longitud completa como gp160 o truncado como gp140 o más corto (opcionalmente con una mutación adecuada para destruir el motivo del sitio de escisión entre gp120 y gp41). El antígeno de Env también puede estar presente en su forma transformada de procedencia natural como gp120 y gp41. Estos dos derivados de gp160 pueden usarse individualmente o juntos como una combinación. Los antígenos de Env anteriormente mencionados pueden presentar adicionalmente deleciones (en particular de bucles variables) y truncamientos. También pueden usarse fragmentos de Env.
Una secuencia de gp120 a modo de ejemplo se muestra en SEQ ID No 8. Una secuencia de gp140 a modo de ejemplo se muestra en SEQ ID No 6.
Los polipéptidos inmunógenos según la divulgación puede comprender Gag, Pol, Env y Nef, en los que al menos están presentes el 75 %, o al menos el 90 % o al menos el 95 %, por ejemplo el 96 %, de los epítopos CTL de estos antígenos nativos.
En polipéptidos inmunógenos según la divulgación que comprenden p17/p24 Gag, p66 RT y Nef truncado como se define anteriormente, el 96 % de los epítopos CTL de los antígenos nativos de Gag, Pol y Nef está presente adecuadamente.
Un ejemplo proporciona un polipéptido inmunógeno que contiene p17, p24 Gag, p66 RT, Nef truncado (carece de nucleótidos que codifican los aminoácidos terminales 1-85 - “Neftr”) en el orden Gag, RT, Nef. En los polinucleótidos que codifican polipéptidos inmunógenos, P24 Gag y P66 RT son adecuadamente de codón optimizado.
Construcciones específicas de polinucleótidos y antígenos de polipéptidos correspondientes según la presente divulgación incluyen:
1. p17, p24 (de codón optimizado) Gag - p66 RT (de codón optimizado) - Nef truncado;
2. Nef truncado - p66 RT (de codón optimizado) - p17, p24 (de codón optimizado) Gag;
3. Nef truncado - p17, p24 (de codón optimizado) Gag - p66 RT (de codón optimizado);
4. p66 RT (de codón optimizado) - p17, p24 (de codón optimizado) Gag - Nef truncado;
5. p66 RT (de codón optimizado) - Nef truncado - p17, p24 (de codón optimizado) Gag;
6. p17, p24 (de codón optimizado) Gag - Nef truncado - p66 RT (de codón optimizado).
Una fusión a modo de ejemplo es una fusión de Gag, RT y Nef particularmente en el orden Gag-RT-Nef (véase, por ejemplo, SEQ ID No 2). Otra fusión a modo de ejemplo es una fusión de p17, p24, RT y Nef particularmente en el orden p24-RT-Nef-p17 (véase, por ejemplo, SEQ ID No 16, mencionada en otras partes en el presente documento como “F4”).
En un ejemplo, un polipéptido inmunógeno contiene Gag, RT, integrasa y Nef, especialmente en el orden Gag-RT-integrasa-Nef (véase, por ejemplo, SEQ ID No 4).
En otros ejemplos, el antígeno de VIH puede ser un polipéptido de fusión que comprende Nef o un derivado inmunógeno del mismo o un fragmento inmunógeno del mismo, y p17 Gag y/o p24 Gag o derivados inmunógenos de los mismos o fragmentos inmunógenos de los mismos en los que, cuando tanto p17 Gag como p24 Gag están presentes, entre ellos hay al menos un antígeno de VIH o fragmento inmunógeno.
Por ejemplo, Nef es adecuadamente Nef de longitud completa.
Por ejemplo, p17 Gag y p24 Gag son adecuadamente p17 y p24 de longitud completa, respectivamente.
En un ejemplo, un polipéptido inmunógeno comprende tanto p17 Gag como p24 Gag o fragmentos inmunógenos de los mismos. En una construcción tal, el componente de p24 Gag y el componente de p17 Gag están separados por al menos otro antígeno de VIH adicional o fragmento inmunógeno tal como Nef y/o RT o derivados inmunógenos de los mismos o fragmentos inmunógenos de los mismos. Para más detalles véase el documento WO2006/013106.
En proteínas de fusión que comprenden p24 y RT puede preferirse que p24 preceda a RT en la construcción porque se observa mejor expresión de p24 que de rT cuando los antígenos se expresan solos en E. coli.
Algunas construcciones ejemplares según la divulgación incluyen las siguientes:
1. p24 -RT -Nef -p17
2. p24 -RT* -Nef -p17
3. p24 - p51RT -Nef -p17
4. p24 - p51RT* -Nef -p17
5. p17 - p51RT -Nef
6. p17 - p51RT* -Nef
7. Nef - p17
8. Nef - p17 con conector
9. p17 -Nef
10. p17 - Nef con conector
* representa la mutación de metionina592 de RT a lisina
También se desvela una proteína de fusión de antígenos de VIH que comprende al menos cuatro antígenos de VIH o fragmentos inmunógenos, en la que los cuatro antígenos o fragmentos son o se derivan de Nef, Pol y Gag. Preferentemente, Gag está presente como dos componentes separados que están separados por al menos otro antígeno en la fusión. Preferentemente, Nef es Nef de longitud completa. Preferentemente, Pol es p66 o p51RT. Preferentemente, Gag es p17 Gag y p24 Gag. Otros rasgos y propiedades preferidos de los componentes de antígeno de la fusión son como se describen en el presente documento.
Ejemplos preferidos de este aspecto de la divulgación son las fusiones de cuatro componentes que ya se enumeran anteriormente:
1. p24 -RT -Nef -p17
2. p24 -RT* -Nef -p17
3. p24 - p51RT -Nef -p17
4. p24 - p51RT* -Nef -p17
Los polipéptidos inmunógenos de la presente divulgación pueden tener secuencias de conectores presentes entre las secuencias correspondientes a antígenos particulares tales como Gag, RT y Nef. Tales secuencias de conectores pueden ser, por ejemplo, de hasta 20 aminoácidos de longitud. En un ejemplo particular pueden ser de 1 a 10 aminoácidos, o de 1 a 6 aminoácidos, por ejemplo 4-6 aminoácidos.
La descripción adicional de tales antígenos de VIH adecuados puede encontrarse en el documento WO03/025003. Los antígenos de VIH de la presente divulgación pueden derivarse de cualquier subtipo de VIH, por ejemplo subtipo A, subtipo B o subtipo C. Por ejemplo, los antígenos de VIH pueden derivarse del subtipo A o B, especialmente B. En un ejemplo específico de la invención, un primer polipéptido inmunógeno es un polipéptido que comprende Gag y/o Pol y/o Nef o un fragmento o derivado de cualquiera de ellos (por ejemplo p24-RT-Nef-p17). En un ejemplo específico, un segundo polipéptido inmunógeno es un polipéptido que comprende Gap y/o Pol y/o Nef o un fragmento o derivado de cualquiera de ellos (por ejemplo Gag-RT-Nef o Gag-RT-integrasa-Nef).
Por tanto, en un ejemplo específico, un polipéptido que comprende Gap y/o Pol y/o Nef o un fragmento o derivado de cualquiera de ellos (por ejemplo p24-RT-Nef-p17) es un primer polipéptido inmunógeno y un polipéptido que comprende Gap y/o Pol y/o Nef o un fragmento o derivado de cualquiera de ellos (por ejemplo Gag-RT-Nef o Gag-RT-integrasa-Nef) es un segundo polipéptido inmunógeno.
En otro ejemplo específico, un primer polipéptido inmunógeno es Env o un fragmento o derivado del mismo, por ejemplo gp120, gp140 o gp160 (especialmente gp120). En un ejemplo específico, un segundo polipéptido inmunógeno es un polipéptido que comprende Gag y/o Pol y/o Nef o un fragmento o derivado de cualquiera de ellos (por ejemplo p24-RT-Nef-p17).
Por tanto, en un ejemplo específico, Env o un fragmento o derivado del mismo, por ejemplo gp120, gp140 o gp160 (especialmente gp120), es un primer polipéptido inmunógeno y un polipéptido que comprende Gag y/o Pol y/o Nef o un fragmento o derivado de cualquiera de ellos (por ejemplo p24-RT-Nef-p17) es un segundo polipéptido inmunógeno.
En otro ejemplo específico, un primer polipéptido inmunógeno es un polipéptido que comprende Gag y/o Pol y/o Nef o un fragmento o derivado de cualquiera de ellos (por ejemplo p24-RT-Nef-p17). En un ejemplo específico, un segundo polipéptido inmunógeno es Env o un fragmento o derivado del mismo, por ejemplo gp120, gp140 o gp160 (especialmente gp120).
Por tanto, en un ejemplo específico, un polipéptido que comprende Gag y/o Pol y/o Nef o un fragmento o derivado de cualquiera de ellos (por ejemplo p24-RT-Nef-p17) es un primer polipéptido inmunógeno y Env o un fragmento o derivado del mismo, por ejemplo gp120, gp140 o gp160 (especialmente gp120), es un segundo polipéptido inmunógeno.
Derivados inmunógenos y fragmentos inmunógenos de antígenos
Los antígenos anteriormente mencionados pueden emplearse en forma de derivados inmunógenos o fragmentos inmunógenos de los mismos en vez del antígeno completo.
Como se usa en el presente documento, el término “derivado inmunógeno” en relación con un antígeno de origen nativo se refiere a un antígeno que se ha modificado en un modo limitado respecto a sus homólogos nativos. Por ejemplo, puede incluir una mutación puntual que puede cambiar las propiedades de la proteína mejorando, por ejemplo, la expresión en sistemas procariotas o eliminando actividad no deseada, por ejemplo actividad enzimática. Sin embargo, los derivados inmunógenos serán suficientemente similares a los antígenos nativos de forma que retengan sus propiedades antigénicas y sigan siendo capaces de fomentar una respuesta inmunitaria frente al antígeno nativo. El hecho de que un derivado dado fomente dicha respuesta inmunitaria o no puede medirse mediante un ensayo adecuadamente inmunológico tal como un ELISA (para respuestas de anticuerpos) o citometría de flujo usando tinción adecuada para marcadores celulares (para respuestas celulares).
Los fragmentos inmunógenos son fragmentos que codifican al menos un epítopo, por ejemplo un epítopo CTL, normalmente un péptido de al menos 8 aminoácidos. Los fragmentos de al menos 8, por ejemplo, 8-10 aminoácidos o hasta 20, 50, 60, 70, 100, 150 o 200 aminoácidos de longitud se consideran que están dentro del alcance de la divulgación siempre que el polipéptido demuestre antigenicidad, es decir, que el polipéptido retenga los epítopos importantes (por ejemplo epítopos CTL).
Adenovirus
Los vectores adenovirales de la presente invención comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos (ADN) que codifican uno o más polipéptidos inmunógenos.
Vectores adenovirales útiles en la presente invención pueden derivarse de una serie de huéspedes mamíferos. Los adenovirus (en el presente documento se denominan “Ad” o “Adv”) tienen una morfología característica con una cápside icosaédrica constituida por tres proteínas muy importantes, hexona (II), base de pentona (III) y una fibra abultada (IV), junto con varias otras proteínas secundarias, VI, VIII, IX, IlIa y IVa2 (Russell W.C. 2000, Gen Viriol, 81:2573-2604). El genoma del virus es un ADN bicatenario lineal con una proteína terminal unida covalentemente al extremo 5', que tiene repeticiones terminales invertidas (ITR). El ADN del virus está íntimamente asociado a la proteína VII sumamente básica y un péptido pequeño llamado mu. Otra proteína, V, está encapsidada con este complejo ADN-proteína y proporciona un enlace estructural a la cápside mediante la proteína VI. El virus también contiene una proteasa codificada por virus que es necesaria para transformar algunas de las proteínas estructurales para producir virus infecciosos maduros.
Se han aislado más de 100 serotipos distintos de adenovirus que infectan diversas especies de mamíferos, de los que 51 son de origen humano. Por tanto, uno o más de los vectores adenovirales pueden derivarse de un adenovirus humano. Ejemplos de tales adenovirus derivados de humanos son Ad1, Ad2, Ad4, Ad5, Ad6, Ad11, Ad 24, Ad34, Ad35, particularmente Ad5, Ad11 y Ad35. Los serotipos humanos se han clasificado en seis subgéneros (A-F) basados en varios criterios biológicos, químicos, inmunológicos y estructurales.
Aunque los vectores basados en Ad5 se han usado ampliamente en varios ensayos de terapia génica, puede haber limitaciones en el uso de Ad5 y otros vectores adenovirales del grupo C debido a la inmunidad preexistente en la población general debido a la infección natural. Ad5 y otros miembros del grupo C tienden a estar entre los serotipos más seroprevalentes. La inmunidad a vectores existentes puede desarrollarse como resultado de exposición al vector durante el tratamiento. Estos tipos de inmunidad preexistente o desarrollada a vectores seroprevalentes pueden limitar la eficacia de la terapia génica o esfuerzos de vacunación. Por tanto, los serotipos de adenovirus alternativos constituyen dianas muy importantes en la persecución de sistemas de liberación génica que puedan eludir la respuesta inmunitaria del huésped.
Un área tal de serotipos alternativos son aquellos derivados de primates no humanos, especialmente adenovirus de chimpancé. Véase la patente de los EE.UU. 6.083.716 que describe el genoma de dos adenovirus de chimpancé. Se ha mostrado que los vectores adenovirales de chimpancé (“Pan” o “C”) inducen fuertes respuestas inmunitarias a productos transgénicos tan eficazmente como vectores adenovirales humanos (Fitzgerald y col. J. Immunol.
170:1416).
Los adenovirus de primates no humanos pueden aislarse de los ganglios linfáticos mesentéricos de chimpancés. Los adenovirus de chimpancé son suficientemente similares al subtipo C de adenovirus humanos para permitir la replicación del virus con E1eliminado en células HEK 293. Aunque los adenovirus de chimpancé son filogenéticamente distintos de los serotipos humanos más comunes (Ad2 y Ad5). Pan 6 no está tan estrechamente relacionado y es serológicamente distinto de Pan 5, 7 y 9.
Por tanto, uno o más de los vectores adenovirales puede derivarse de un adenovirus de primate no humano, por ejemplo un adenovirus de chimpancé, tal como uno seleccionado de los serotipos Pan5, Pan6, Pan7 y Pan9.
Los vectores adenovirales también pueden derivarse de más de un serotipo de adenovirus, y cada serotipo puede proceder de la misma fuente o fuente diferente. Por ejemplo, pueden derivarse de más de un serotipo humano y/o más de un serotipo de primate no humano. Los procedimientos para construir vectores adenovirales quiméricos se describen en el documento WO2005/001103.
Hay ciertas restricciones de tamaño asociadas a la inserción de ADN heterólogo en adenovirus. Los adenovirus humanos tienen la capacidad de encapsidar hasta el 105% de la longitud del genoma de tipo salvaje (Bett y col.
1993, J Virol 67 (10), 5911-21). Se ha mostrado que el límite inferior de encapsidación para adenovirus humanos es del 75 % de la longitud del genoma de tipo salvaje (Parks y col. 1995, J Virol 71(4), 3293-8).
Un ejemplo de adenovirus útiles en la presente invención son adenovirus que son distintos de los serotipos de procedencia natural prevalentes en la población humana tales como Ad2 y Ad5. Esto evita la inducción de potentes respuestas inmunitarias frente al vector que limita la eficacia de administraciones posteriores del mismo serotipo bloqueándose la captación de vectores mediante neutralización del anticuerpo e influenciando en la toxicidad.
Por tanto, el adenovirus puede ser un adenovirus que no sea un serotipo de virus humano de procedencia natural prevalente. Los adenovirus aislados de animales tienen componentes de cápside, hexona, pentona y fibra inmunológicamente distintos, pero filogenéticamente están estrechamente relacionados. Específicamente, el virus puede ser un adenovirus no humano, tal como un adenovirus de simio y en particular un adenovirus de chimpancé tal como Pan 5, 6, 7 o 9. Ejemplos de tales cepas se describen en el documento WO03/000283 y están disponibles de la Colección americana de cultivos tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, y otras fuentes. Las cepas deseables de adenovirus de chimpancé son Pan 5 [ATCC VR-591], Pan 6 [ATCC VR-592] y Pan 7 [ATCC VR-593].
Se cree que el uso de adenovirus de chimpancé es ventajoso respecto al uso de serotipos de adenovirus humano debido a la falta de inmunidad preexistente, en particular a la falta de anticuerpos de neutralización cruzada, a adenovirus en la población diana. La reacción cruzada de los adenovirus de chimpancé con respuestas de anticuerpos neutralizadores preexistentes solo está presente en el 2 % de la población diana en comparación con el 35 % en el caso de ciertos vectores candidatos de adenovirus humano. Los adenovirus de chimpancé son distintos de los subtipos humanos más comunes Ad2 y Ad5, pero están más estrechamente relacionados con Ad4 humano del subgrupo E, que no es un subtipo prevalente. Pan 6 está menos estrechamente relacionado con Pan 5, 7 y 9. El adenovirus de la invención puede tener replicación defectuosa. Esto significa que tiene una capacidad reducida para replicarse en células no complementarias en comparación con el virus de tipo salvaje. Esto puede provocarse mutando el virus, por ejemplo eliminando un gen implicado en la replicación, por ejemplo deleción del gen de E1a, E1b, E3 o E4.
Los vectores adenovirales según la presente invención pueden derivarse de adenovirus de replicación defectuosa que comprenden una deleción de E1 funcional. Por tanto, los vectores adenovirales según la invención pueden tener replicación defectuosa debido a la ausencia de la capacidad para expresar E1a y E1b adenoviral, es decir, están funcionalmente eliminados en E1a y E1b. Los adenovirus recombinantes también pueden llevar deleciones funcionales en otros genes [véase el documento WO03/000283], por ejemplo, deleciones en genes de E3 o E4. El gen E3 temprano retrasado del adenovirus puede eliminarse de la secuencia de adenovirus que forma parte del virus recombinante. La función de E3 no es necesaria la producción de la partícula de adenovirus recombinante. Por tanto, es innecesario reemplazar la función de este producto génico con el fin de encapsidar un adenovirus recombinante útil en la invención. En una realización particular, los adenovirus recombinantes tienen los genes de E1 y E3 funcionalmente eliminados. La construcción de tales vectores se describe en Roy y col., Human Gene Therapy 15:519-530, 2004.
Los adenovirus recombinantes también pueden construirse teniendo una deleción funcional del gen de E4, aunque puede desearse que retengan la función ORF6 de E4. Los vectores de adenovirus según la invención también pueden contener una deleción en el gen E2a temprano retrasado. Las deleciones también pueden hacerse en cualquiera de los genes tardíos L1 a L5 del genoma del adenovirus. Similarmente, pueden ser útiles deleciones en los genes intermedios IX y IVa.
Pueden hacerse otras deleciones en los otros genes de adenovirus estructurales o no estructurales. Las deleciones anteriores pueden usarse individualmente, es decir, una secuencia de adenovirus para uso en la presente invención puede contener deleciones de E1 solamente. Alternativamente, las deleciones de genes completos o partes de los mismos eficaces para destruir su actividad biológica pueden usarse en cualquier combinación. Por ejemplo, en un vector a modo de ejemplo, las secuencias de adenovirus pueden tener deleciones de los genes de E1 y el gen de E4, o de los genes de E1, E2a y E3, o de los genes de E1 y E3 (tales como deleciones funcionales en E1a y E1b, y una deleción de al menos parte de E3), o de los genes de E1, E2a y E4, con o sin deleción de E3, etc. Tales deleciones pueden ser deleciones parciales o completas de estos genes y pueden usarse en combinación con otras mutaciones, tales como mutaciones sensibles a la temperatura, para lograr un resultado deseado.
Los vectores adenovirales pueden producirse en cualquier línea celular adecuada en la que pueda replicarse el virus. En particular pueden usarse líneas celulares complementarias que proporcionan los factores que faltan del vector viral que dan como resultado sus características de replicación alteradas (tales como E1 y/o E4). Sin limitación, una línea celular tal puede ser HeLa [N.° de acceso a ATCC CCL 2], A549 [N.° de acceso a ATCC CCL 185], HEK 293, KB [CCL 17], Detroit [por ejemplo, Detroit 510, CCL 72] y células WI-38 [CCL 75], entre otros. Todas estas líneas celulares están disponibles de la Colección americana de cultivos tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209. Otras líneas celulares originales adecuadas pueden obtenerse de otras fuentes tales como células PER.C6©, como se representa por las células depositadas bajo el N.° de ECACC N.° 96022940 en la Colección europea de cultivos celulares animales (ECACC) en el Centro de Microbiología Aplicada e Investigación (CAMR, Ru ) o células Her 96 (Crucell).
Las secuencias de polinucleótidos que codifican polipéptidos inmunógenos pueden ser de codón optimizado para células de mamíferos. Tal optimización de codones se describe en detalle en el documento WO05/025614. La optimización de codones para ciertas secuencias de VIH se describe adicionalmente en el documento WO03/025003.
En una realización de la presente invención, las construcciones de polinucleótidos comprenden una secuencia conductora en el extremo N. La secuencia de señalización, el dominio transmembranario y el dominio citoplásmico están todos individualmente opcionalmente presentes o eliminados. En una realización de la presente invención todas estas regiones están presentes, pero modificadas.
Un promotor para uso en el vector adenoviral según la invención puede ser el promotor del gen IE de HCMV, por ejemplo, en el que la región sin traducir de 5' del gen IE de HCMV que comprende el exón 1 está incluida y el intrón A se excluye completamente o parcialmente como se describe en el documento WO02/36792.
Si se fusionan varios antígenos en una proteína de fusión, tal proteína estaría codificada por un polinucleótido bajo el control de un único promotor.
En una realización alternativa de la invención, varios antígenos pueden expresarse por separado mediante promotores individuales, pudiendo ser cada uno de dichos promotores iguales o diferentes. En todavía otra realización de la invención, algunos de los antígenos pueden formar una fusión, ligada a un primer promotor, y otro(s) antígeno (s) pueden ligarse a un segundo promotor, que puede ser igual o diferente del primer promotor.
Por tanto, el vector adenoviral puede comprender uno o más casetes de expresión, codificando cada uno un antígeno bajo el control de un promotor. Alternativamente o adicionalmente puede comprender uno o más casetes de expresión, codificando cada uno más de un antígeno bajo el control de un promotor, cuyos antígenos se expresan así como una fusión. Cada casete de expresión puede estar presente en más de un locus en el vector adenoviral.
El polinucleótido o polinucleótidos que codifican polipéptidos inmunógenos que van a expresarse pueden insertarse en cualquiera de las regiones eliminadas del adenovirus, por ejemplo en la región de eliminación de E1.
Aunque dos o más polinucleótidos que codifican polipéptidos inmunógenos pueden ligarse como una fusión, la proteína resultante puede expresarse como una proteína de fusión, o puede expresarse como productos de proteínas separados, o puede expresarse como una proteína de fusión y luego descomponerse posteriormente en subunidades más pequeñas.
Adyuvante
Los adyuvantes se describen en general en Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Approach, por ejemplo, Powell y Newman, Plenum Press, Nueva York, 1995.
Adyuvantes pueden incluir una sal de aluminio tal como hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, pero también puede ser una sal de calcio, hierro o cinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, polisacáridos catiónica o aniónicamente derivatizados o polifosfacenos.
En la formulación de la invención se prefiere que la composición adyuvante induzca preferentemente una respuesta de Th1. Sin embargo, se entenderá que no se excluyen otras respuestas, incluyendo otras respuestas humorales. Se sabe que ciertos adyuvantes de vacunas son particularmente aptos para la estimulación de respuestas de citocinas tanto del tipo Th1 como Th2. Tradicionalmente, los mejores indicadores del equilibrio Th1:Th2 de la respuesta inmunitaria después de una vacunación o infección incluyen la medición directa de la producción de citocinas Th1 o Th2 por linfocitos T in vitro después de la reestimulación con antígeno, y/o la medición de la relación lgG1:lgG2a de respuestas de anticuerpos específicos para antígenos.
Por tanto, un adyuvante del tipo Th1 es uno que estimula poblaciones de linfocitos T aisladas para producir altos niveles de citocinas del tipo Th1 in vivo (como se mide en el suero) o ex vivo (citocinas que se miden cuando las células se vuelven a estimular con antígeno in vitro) e induce respuestas de inmunoglobulinas específicas para antígenos asociadas al isotipo del tipo Th1.
Inmunoestimulantes del tipo Th1 preferidos que pueden formularse para producir adyuvantes adecuados para uso en la presente invención incluyen los siguientes:
Los ligandos del receptor similar a Toll (TLR)4, especialmente un agonista tal como un derivado de lípido A, particularmente monofosforil lípido A o más particularmente monofosforil lípido A 3-desacilado (3D-MPL).
3D-MPL se comercializa bajo la marca registrada MPL® por GlaxoSmithKline y promueve principalmente las respuestas de linfocitos T CD4+ caracterizadas por la producción de IFN-g (células Th1, es decir, linfocitos T colaboradores CD4 con un fenotipo del tipo 1). Puede producirse según los procedimientos descritos en el documento GB 2220 211 A. Químicamente es una mezcla de monofosforil lípido A 3-desacilado con 3, 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Preferentemente, en las composiciones de la presente invención se usa 3D-MPL de partículas pequeñas. 3D-MPL de partículas pequeñas tiene un tamaño de partícula de forma que puede filtrarse estéril a través de un filtro de 0,22 |im. Tales preparaciones se describen en la solicitud de patente internacional N.° WO94/21292. Los derivados sintéticos del lípido A son conocidos y se cree que son agonistas de TLR4 que incluyen, pero no se limitan a:
OM174 (2-desoxi-6-o-[2-desoxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetra-decanoilamino]-4-o-fosfono-P-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]- a-D-glucopiranosildihidrogenofosfato), (documento WO95/14026)
Om 294 DP (3S,9R)-3-[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9(RH(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decano-1,10-diol,1,10-bis(dihidrogenofosfato) (documentos WO99/64301 y WO00/0462)
OM 197 m P-Ac DP 10-(6-aminohexanoato) de (3S,9R)-3-[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decano-1,10-diol,1-dihidrogenofosfato (documento WO01/46127)
Otros ligandos de TLR4 son fosfatos de alquilglucosaminida (AGP) tales como aquellos descritos en los documentos WO9850399 o US6303347 (también se describen procedimientos para la preparación de AGP) o sales farmacéuticamente aceptables de AGP como se describen en el documento US6764840. Algunos AGP son agonistas de TLR4, y algunos son antagonistas de TLR4. Se cree que ambos son útiles como adyuvantes.
Las saponinas también son inmunoestimulantes de Th1 preferidos según la invención. Las saponinas son adyuvantes muy conocidos y se enseñan en: Lacaille-Dubois, M y Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2, pág. 363-386). Por ejemplo, Quil A (derivado de la corteza del árbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina) y fracciones del mismo, se describen en el documento US5.057.540 y “Saponins as vaccine adjuvants”, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55; y el documento EP0362279B1. Las saponinas hemolíticas QS21 y QS17 (fracciones de Quil A purificadas por HPLC) se han descrito como potentes adyuvantes sistémicos y el procedimiento de su producción se describe en la patente de los EE.UU. N.° 5.057.540 y el documento EP0362279B1. En estas referencias también se describe el uso de QS7 (una fracción no hemolítica de Quil A) que actúa como un potente adyuvante para vacunas sistémicas. El uso de QS21 se describe adicionalmente en Kensil y col. (1991. J. Immunology vol 146, 431-437). También se conocen combinaciones de QS21 y polisorbato o ciclodextrina (documento WO99/10008). Los sistemas de adyuvantes en partículas que comprenden fracciones de QuilA, tales como QS21 y QS7, se describen en los documentos WO96/33739 y WO96/11711. Un sistema tal se conoce como un ISCOM y puede contener una o más saponinas.
El adyuvante de la presente invención puede comprender en particular un ligando del receptor similar a Toll (TLR)4, especialmente 3D-MPL, en combinación con un derivado de saponina, especialmente QS21.
En otros ejemplos, los adyuvantes incluyen ligandos TLR 9 (agonistas). Por tanto, otro inmunoestimulante preferido es un oligonucleótido inmunoestimulante que contiene dinucleótidos CpG sin metilar (“CpG”). CpG es una abreviatura de motivos dinucleótido citosina-guanosina presentes en el ADN. CpG se conoce en la técnica como un adyuvante cuando se administra por vías tanto sistémicas como mucosas (documentos WO96/02555, EP468520, Davis y col., J. Immunol, 1998, 160(2):870-876; McCluskie y Davis, J. Immunol., 1998, 161(9):4463-6). Históricamente se observó que la fracción de ADN de BCG podría ejercer un efecto antitumoral. En otros estudios, los oligonucleótidos sintéticos derivados de secuencias de genes de BCG mostraron que podían inducir efectos inmunoestimulantes (tanto in vitro como in vivo). Los autores de estos estudios concluyeron que ciertas secuencias palindrómicas, incluyendo un motivo CG central, llevaban esta actividad. El papel principal del motivo CG en la inmunoestimulación se aclaró más tarde en una publicación de Krieg, Nature 374, p. 546 1995. El análisis detallado ha mostrado que el motivo CG tiene que estar en un cierto contexto de secuencias y que tales secuencias son comunes en ADN bacteriano, pero son raras en ADN de vertebrado. La secuencia inmunoestimulante es frecuentemente: purina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina; en la que el motivo CG no está metilado, pero se sabe que otras secuencias de CpG sin metilar son inmunoestimulantes y pueden usarse en la presente divulgación. En ciertas combinaciones de los seis nucleótidos se presenta una secuencia palindrómica. En el mismo oligonucleótido pueden estar presentes varios de estos motivos, como repeticiones de un motivo o una combinación de diferentes motivos. La presencia de una o más de estas secuencias inmunoestimulantes que contienen oligonucleótidos puede activar diversos subconjuntos inmunológicos, incluyendo células asesinas naturales (que producen interferón y y tienen actividad citolítica) y macrófagos (Wooldrige y col. vol 89 (N.° 8), 1977). Ahora también se ha mostrado que otras secuencias que contienen CpG sin metilar que no tienen esta secuencia consenso son inmunomoduladoras.
CpG, cuando se formula en vacunas, se administra generalmente en disolución libre junto con antígeno libre (documento WO96/02555; McCluskie y Davis, como arriba) o covalentemente conjugado a un antígeno (documento WO98/16247) o se formula con un soporte tal como hidróxido de aluminio ((antígeno superficial de la hepatitis) Davis y col. como arriba; Brazolot-Millan y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 1998, 95(26), 15553-8).
En otros ejemplos, otros agonistas de TLR9 de interés potencial incluyen oligonucleótidos que contienen el motivo CpR inmunoestimulante y oligonucleótidos que contienen el motivo YpG (Idera).
Tales inmunoestimulantes como se describen anteriormente pueden formularse junto con soportes, tales como por ejemplo liposomas, emulsiones aceite en agua y o sales metálicas que incluyen sales de aluminio (tales como hidróxido de aluminio). Por ejemplo, 3D-MPL puede formularse con hidróxido de aluminio (documento EP0689454) o emulsiones aceite en agua (documento WO95/17210); QS21 puede formularse ventajosamente con liposomas que contienen colesterol (documento WO96/33739), emulsiones aceite en agua (documento WO95/17210) o alumbre (documento WO98/15287); CpG puede formularse con alumbre (Davis y col. como antes; Brazolot-Millan como antes) o con otros soportes catiónicos.
También se prefieren combinaciones de inmunoestimulantes, en particular una combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina (documentos WO94/00153; WO95/17210; WO96/33739; WO98/56414; WO99/12565; WO99/11241), más particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describe en el documento WO94/00153. Como alternativa, una combinación de CpG más una saponina tal como QS21 también forma un potente adyuvante para uso en la presente divulgación. Alternativamente, la saponina puede formularse en un liposoma o en un ISCOM y combinarse con un oligonucleótido inmunoestimulante.
Por tanto, sistemas de adyuvantes incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferentemente 3D-MPL, junto con una sal de aluminio (por ejemplo como se describe en el documento WO00/23105).
Un sistema mejorado implica la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describe en el documento WO94/00153, o una composición menos reactogénica en la que QS21 se inactiva en liposomas que contienen colesterol (DQ) como se describe en el documento WO96/33739. Esta combinación puede comprender adicionalmente un oligonucleótido inmunoestimulante.
Por tanto, un ejemplo de adyuvante comprende QS21 y MPL.
Una formulación de adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión aceite en agua se describe en el documento WO95/17210 y es otra formulación preferida para uso en la invención. Otra formulación preferida comprende un oligonucleótido CpG solo o junto con una sal de aluminio.
En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un procedimiento de preparación de una formulación de vacuna como se describe en el presente documento, en el que el procedimiento comprende mezclar uno o más primeros polipéptidos inmunógenos según la invención con un adyuvante adecuado.
Adyuvantes particularmente preferidos para uso en las formulaciones según la invención son los siguientes:
i) 3D-MPL QS21 en un liposoma (véase, por ejemplo, el adyuvante B más adelante)
ii) Alumbre QS21 en un liposoma 3D-MPL
iii) 3D-MPL QS21 emulsión aceite en agua
iv) 3D-MPL QS21 (por ejemplo en un liposoma) CpG
Los adyuvantes particularmente preferidos para su uso en las formulaciones según la divulgación son los siguientes: v) Alumbre 3D-MPL
vi) Alumbre CpG
vii) CpG
viii) QS21+CpG.
Preferentemente, el adyuvante se presenta en forma de un liposoma, ISCOM o una emulsión aceite en agua. En un ejemplo de realización de la invención, el adyuvante comprende una emulsión aceite en agua. En otro ejemplo de realización de la invención, el adyuvante comprende liposomas.
Adecuadamente, el componente adyuvante no contiene ningún virus. Por tanto, adecuadamente, las composiciones para uso según la invención no contienen ningún virus distinto del uno o más vectores adenovirales que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más segundos polipéptidos inmunógenos derivados de un patógeno.
Composiciones, dosificación y administración
En los procedimientos de la divulgación, el (los) polipéptido(s) inmunógeno(s), el (los) vector(es) adenoviral(es) y el adyuvante se administran simultáneamente.
Normalmente, el adyuvante se formulará conjuntamente con un polipéptido inmunógeno. Adecuadamente, el adyuvante también se formulará conjuntamente con cualquier otro polipéptido inmunógeno que va a administrarse. Un procedimiento de fomento de una respuesta inmunitaria comprende administrar (i) uno o más primeros polipéptidos inmunógenos formulados conjuntamente con un adyuvante; y (ii) uno o más vectores adenovirales que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más segundos polipéptidos inmunógenos; en el que uno o más primeros polipéptidos inmunógenos y adyuvante, y uno o más vectores adenovirales se administran simultáneamente.
Por “formular conjuntamente” se indica que el primer polipéptido inmunógeno y el adyuvante están contenidos dentro de la misma composición, por ejemplo una composición farmacéutica.
Normalmente, el vector adenoviral está contenido en una composición, por ejemplo una composición farmacéutica. Alternativamente, el uno o más primeros polipéptidos inmunógenos, el uno o más vectores adenovirales y un adyuvante se formulan conjuntamente.
Por tanto, se proporcionan composiciones según la invención que comprenden uno o más polipéptidos inmunógenos, uno o más vectores adenovirales y un adyuvante.
Las composiciones y procedimientos según la divulgación pueden implicar el uso de más de un polipéptido inmunógeno y/o más de un vector adenoviral. El uso de múltiples antígenos es especialmente ventajoso para fomentar respuestas inmunitarias protectoras frente a ciertos patógenos, tales como VIH, M. tuberculosis y Plasmodium sp. Las composiciones según la invención pueden comprender más de un adyuvante.
Las composiciones y procedimientos empleados según la divulgación pueden comprender normalmente un soporte, por ejemplo un soporte acuoso tamponado. Pueden incluirse componentes protectores tales como azúcares.
Las composiciones deberían administrarse en cantidades suficientes para transducir las células diana y para proporcionar niveles suficientes de transferencia y expresión génica y para permitir que se desarrollen respuestas inmunitarias específicas de un patógenos para así proporcionar un beneficio profiláctico o terapéutico sin efectos adversos indebidos o con efectos fisiológicos médicamente aceptables, que puede determinarse por aquellos expertos en las artes médicas. Vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, administración directa a la retina y otros procedimientos de administración intraocular, administración directa al hígado, inhalación, vía intranasal, intravenosa, intramuscular, intratraqueal, subcutánea, intradérmica, epidérmica, rectal, oral y otras vías parenterales de administración. Las vías de administración pueden combinarse, si se desean, o ajustarse dependiendo del producto génico o la afección. La vía de administración dependerá principalmente de la naturaleza de la afección que está tratándose. De manera más adecuada, la vía es intramuscular, intradérmica o epidérmica.
Tejidos preferidos para elegir como diana son músculo, piel y membranas mucosas. La piel y las membranas mucosas son los sitios fisiológicos en los que se encuentran normalmente la mayoría de los antígenos infecciosos. Si el primer polipéptido inmunógeno, adyuvante y vector adenoviral no están formulados conjuntamente, las diferentes formulaciones (por ejemplo formulaciones de polipéptido/adyuvante y vector adenoviral) pueden administrarse por la misma vía de administración o por diferentes vías de administración.
Las dosificaciones de composiciones en los procedimientos dependerán principalmente de factores tales como la afección que está tratándose, la edad, peso y salud del sujeto y, por tanto, puede variar entre sujetos. Por ejemplo, una dosificación humana para adultos o veterinaria terapéuticamente eficaz está generalmente en el intervalo de aproximadamente 100 |jl a aproximadamente 100 ml de un soporte que contiene concentraciones de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1015 partículas, aproximadamente de 1 x 1011 a 1 x 1013 partículas, o aproximadamente de 1 x 109 a 1 x 1012 partículas de virus junto con aproximadamente 1-1000 ug, o aproximadamente 2-100 ug, por ejemplo aproximadamente 4-40 ug de polipéptido inmunógeno. Las dosificaciones oscilarán dependiendo del tamaño del animal y la vía de administración. Por ejemplo, una dosificación humana o veterinaria adecuada (para aproximadamente un animal de 80 kg) para inyección intramuscular está en el intervalo de aproximadamente 1 x 109 a aproximadamente 5 x 1012 partículas de virus y 4-40 ug de proteína por ml, para un único sitio. Un experto en la materia puede ajustar estas dosis dependiendo de la vía de administración y la aplicación terapéutica o vacunal para la que se emplea la composición.
La cantidad de adyuvante dependerá de la naturaleza del adyuvante y el polipéptido inmunógeno, de la afección que está tratándose y la edad, peso y salud del sujeto. Normalmente, para administración humana puede ser adecuada una cantidad de adyuvante de 1-100 ug, por ejemplo 10-50 ug por dosis.
Adecuadamente, una respuesta inmunitaria adecuada se logra mediante una única administración simultánea de la composición o composiciones de la invención en procedimientos de la invención. Sin embargo, si la respuesta inmunitaria mejora adicionalmente por la administración de otra dosis del primer polipéptido inmunógeno, adyuvante y vector adenoviral en una segunda ocasión u ocasión posterior (por ejemplo después de un mes o dos meses), entonces la invención engloba un protocolo tal.
Se ha descubierto que normalmente pueden fomentarse buenas respuestas de los linfocitos T CD4+ y/o CD8+ específicos de patógeno después de una única administración simultánea de la composición o composiciones de la invención en procedimientos de la invención. Sin embargo, se ha descubierto que las buenas respuestas de anticuerpos específicos para patógenos pueden requerir una segunda administración simultánea o adicional de la composición o composiciones de la invención.
Los componentes de la invención pueden combinarse o formularse con cualquier excipiente farmacéutico adecuado tal como agua, tampones y similares.
Ejemplos
Preparaciones de adyuvantes
1) La preparación de la emulsión aceite en agua siguió el protocolo como se expone en el documento WO95/17210.
La emulsión contiene: 42,72 mg/ml de escualeno, 47,44 mg/ml de tocoferol, 19,4 mg/ml de Tween 80. Las gotitas de aceite resultantes tienen un tamaño de aproximadamente 180 nm.
Se disolvió Tween 80 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para dar una disolución al 2 % en PBS. Para proporcionar un concentrado 2x de 100 ml, se agitaron con vórtex una emulsión de 5 g de DL alfa tocoferol y 5 ml de escualeno hasta que se mezclaron bien. Se añadieron 90 ml de disolución PBS/Tween y se mezclaron bien. Entonces, la emulsión resultante se pasó a través de una jeringa y finalmente se microfluidizó usando una máquina de microfluídica M110S. Las gotitas de aceite resultantes tienen un tamaño de aproximadamente 180 nm.
2) Preparación de la emulsión aceite en agua con QS21 y MPL
Se añadió una emulsión de cargar estéril PBS para alcanzar una concentración final de 500 |jl de emulsión por ml (v/v). Luego se añadió 3D-MPL. Luego se añadió QS21. Entre cada adición de componente, el producto intermedio se agitó durante 5 minutos. Quince minutos después se comprobó el pH y, si fue necesario, se ajustó a 6,8 /- 0,1 con NaOH o HCI. La concentración final de 3D-MPL y QS21 fue de 100 jg por ml para cada uno.
3) Preparación de MPL liposomal
Una mezcla de lípido (tal como fosfatidilcolina de yema de huevo o sintética) y colesterol y 3D-MPL en disolvente orgánico se secó a vacío (o alternativamente bajo una corriente de gas inerte). Entonces se añadió una disolución acuosa (tal como solución salina tamponada con fosfato) y el recipiente se agitó hasta que todo el lípido estuvo en suspensión. Entonces, esta suspensión se microfluidizó hasta que el tamaño del liposoma se redujo a aproximadamente 100 nm y luego se filtró estéril a través de un filtro de 0,2 |im. La extrusión o sonicación podría reemplazar esta etapa. Normalmente, la relación colesterol: fosfatidilcolina fue 1:4 (p/p) y la disolución acuosa se añadió para dar una concentración final de colesterol de 10 mg/ml.
La concentración final de MPL es 2 mg/ml.
Los liposomas tienen un tamaño de aproximadamente 100 nm y se denominan SUV (de vesículas unilaminares pequeñas). Los liposomas son estables por sí mismos con el tiempo y no tienen capacidad fusogénica.
4) Preparación del adyuvante B (“ady B”)
Se añadió una cantidad estéril de SUV a PBS. La composición de PBS era Na2HPO4: 9 mM; KH2PO4: 48 mM; NaCI: 100 mM pH 6,1. Se añadió QS21 en disolución acuosa a SUV. La concentración final de 3D-MPL y QS21 fue de 100 jg por ml para cada uno. Esta mezcla se denomina adyuvante B. Entre cada adición de componente, el producto intermedio se agitó durante 5 minutos. El pH se comprobó y se ajustó, si fue necesario, a 6,1 /- 0,1 con NaOH o HCI.
Preparación de la proteína p24-RT-Nef-P17 (“F4”)
F4 se preparó como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO2006/013106, procedimiento de de codón optimizado.
Preparación del transgén Gag-RT-Nef que contiene adenovirus Pan7 de chimpancé (“Pan7GRN”) Construcción del plásmido de Gag, RT, Nef.
Plásmido p73i-Tgrn
La secuencia completa del inserto del plásmido Tgrn se facilita en SEQ ID No 1 y la construcción del plásmido se muestra gráficamente en la Fig. 1. Éste contiene p17 p24 (de codón optimizado) Gag, p66 RT (de codón optimizado e inactivado) y Nef truncado.
El plásmido P73i-Tgrn se preparó como se describe en los Ejemplos 1-13 del documento WO03/025003.
Construcción del adenovirus Pan 7 con E1/E3 eliminados
El adenovirus Pan 7 con E1/E3 eliminados se preparó como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO2006/120034.
Otros serotipos de vectores pueden construirse de un modo similar. En el documento WO03/0046124 se facilita una descripción completa de la construcción de las deleciones E1, E3 y E4 en éste y otros serotipos de adenovirus Pan. También hay más información disponible en Human Gene Therapy 15:519-530.
Inserción de la secuencia de Gag, RT, Nef en el adenovirus
Usando el plásmido P73i-Tgrn, el casete de expresión de GRN se insertó en el adenovirus Pan 7 con E1/E3 eliminados para producir C7-GRNc como se describe en el Ejemplo 3 del documento WO2006/120034. C7-GRNc es el componente del adenovirus Pan7GRN usado en los ejemplos explicados en el presente documento.
Ejemplo 1
Estudio de inmunogenicidad en ratones inmunizados con componente de adenovirus (Pan7GRN) y componente de proteína (F4/adyuvante B) por separado o con ambos componentes de adenovirus y proteína formulados conjuntamente
La cepa de ratón usada fue CB6F1 y para cada momento se usaron 3 ratones. Para la inmunización con F4/adyuvante B (P) se inyectó 1/10 de la dosis humana, es decir, 9 ug de proteína F4 en 50 ul de adyuvante B. Para la inmunización con Pan7GRN (A) se usaron 10 x 108 partículas de virus en 50 ul de solución salina (agua con NaCl al 0,9 % para disolución de inyección). El adenovirus de chimpancé Pan7GRN lleva los genes que codifican Gag (G), RT (R) y Nef (N).
El programa de vacunación fue del siguiente modo:
Figure imgf000022_0001
Por tanto, puede verse que en los grupos 1 y 2 los ratones se inmunizaron con 2 inyecciones de proteína (PP) o adenovirus (AA), respectivamente. Los ratones de los grupos 3 y 4 recibieron un programa convencional de dosis de sensibilización-refuerzo: proteína luego adenovirus (PPAA) o al revés (AAPP), mientras que en los grupos 5 y 6 los ratones recibieron una o dos inyecciones de una combinación (combo) de proteína y adenovirus conjuntamente según la invención. Los ratones del grupo 7 solo recibieron control de adyuvante, mientras que los ratones del grupo 6 no recibieron tratamiento previo.
Se realizaron las siguientes lecturas:
Respuestas de anticuerpos (se realizaron ELISA en los sueros de cada animal individual de cada grupo):
- respuesta de anticuerpos frente a F4 (Figura 4)
- respuesta de anticuerpos frente a componentes de F4 p24, RT, Nef y p17 (Figura 5-8)
Respuestas celulares (Figuras 2-3):
- medidas por citometría de flujo tras la tinción de citocinas superficiales e intracelulares después de reestimulación durante la noche de células del bazo con mezclas de péptidos de p24, RT, Nef o p17. Para el análisis, las células del bazo de 3 ratones se mezclaron para cada momento y por grupo.
Para los grupos 1 y 2, las muestras se tomaron para la medición 21 días después de la inmunización final correspondiente. Para los grupos restantes, las mediciones se tomaron 21 días, 56 días y 112 días después de la inmunización final correspondiente.
Resultados:
Los resultados se muestran en las Figuras 2-8.
Las marcas del eje X se corresponden del siguiente modo:
PP - Animales del grupo 1 tras la segunda inmunización
AA - Animales del grupo 2 tras la segunda inmunización
PPAA - Animales del grupo 3 tras la cuarta inmunización
AAPP - Animales del grupo 4 tras la cuarta inmunización
Combo - Animales del grupo 5 tras la inmunización
Combo x 2 - Animales del grupo 6 tras la segunda inmunización
Los momentos de medición (21, 56 o 112 días después de la última inmunización) se indican entre paréntesis. Respuestas celulares (Figura 2-3):
En los momentos analizados, los datos muestran que las respuestas de linfocitos T CD4+ se observaron principalmente frente a p24, RT y Nef.
Como se muestra en las Figuras 2a y 2b (paneles izquierdos), 21 días después de la última inmunización, las mayores respuestas de linfocitos T c D4+ se observan con dos inmunizaciones de adenovirus seguidas por dos inmunizaciones de proteína/adyuvante (animales del grupo 4). Una inyección de la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante induce mayores niveles de linfocitos T CD4+ que dos inyecciones de proteína/adyuvante tras la reestimulación con péptidos de p24, RT o Nef.
Para la reestimulación por RT y Nef, dos inmunizaciones con la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante induce una respuesta de linfocitos T CD4+ ligeramente superior que una inmunización con la combinación, mientras que las respuestas con una o dos inmunizaciones fueron idénticas para p24.
En los momentos analizados, las respuestas de linfocitos T CD8+ se observan principalmente frente a los péptidos de p24 y RT, y no se detectaron números significativos de linfocitos T CD8+ específicos para Nef o p17. Como se muestra en las Figuras 2a y 2b (paneles derechos), 21 días después de la última inmunización las respuestas de linfocitos T CD8+ fueron similares después de una o dos inmunizaciones con la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante. Las respuestas de CD8 frente a p24 observadas en grupos inmunizados o (i) dos veces con adenovirus o (ii) dos veces con adenovirus seguido por dos veces con proteína o (iii) una vez o dos veces con la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante fueron comparables entre sí y ligeramente inferiores a las del grupo inmunizado dos veces con proteína seguida por dos veces con adenovirus. Las respuestas de CD8 frente a RT observadas en grupos inmunizados una vez o dos veces con la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante fueron comparables y ligeramente inferiores a las de grupos inmunizados o (i) dos veces con adenovirus o (ii) dos veces con adenovirus seguido por dos veces con proteína o (iii) dos veces con proteína seguida por dos veces con adenovirus.
Las respuestas de linfocitos T CD4 y CD8 también se analizaron en momentos posteriores (56 y 112 días después de la última inmunización) cuando puede determinarse la persistencia de las respuestas (Figuras 3a y 3b). Las respuestas de CD4 (Fig. 3a y 3b, paneles izquierdos) se observan principalmente frente a p24, RT y Nef. En estos momentos, las mayores respuestas de CD4 se observan en los animales inmunizados dos veces con adenovirus seguido por dos veces con proteína. Las respuestas de CD4 en ratones inmunizados una vez o dos veces con la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante fueron comparables entre sí y generalmente mayores que las respuestas observadas en grupos inmunizados dos veces con proteína seguida por dos veces con adenovirus. En los últimos momentos, la respuesta de CD8 frente a p24 es la mayor en el grupo inmunizado una vez con la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante (Fig. 3b, panel derecho). Es comparable a la de animales inmunizados dos veces con proteína seguida por dos veces con adenovirus y ligeramente mayor que la de los animales inmunizados o (i) dos veces con la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante o (ii) dos veces con adenovirus seguido por dos veces con proteína. Estas dos últimas son comparables entre sí. La respuesta de CD8 frente a RT es la mayor y similar en grupos inmunizados (i) dos veces con la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante o (ii) dos veces con adenovirus seguido por dos veces con proteína. Las respuestas de CD8 frente a RT de grupos inmunizados (i) dos veces con la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante o (ii) dos veces con proteína seguida por dos veces con adenovirus fueron ligeramente inferiores, pero comparables entre sí (Figura 3). Como se muestra en la Figura 3a (panel derecho), no se detectaron números significativos de linfocitos T CD8+ específicos para Nef o p17.
Respuestas de anticuerpos:
Como se muestra en las Figuras 4 a 8, las respuestas de anticuerpos detectados están principalmente dirigidas contra p24 (Fig. 5), RT (Fig. 6) y Nef (Fig. 8). La respuesta anti-F4 (Fig. 4) imita generalmente la respuesta observada frente a cada uno de los componentes p24, RT o Nef y puede caracterizarse del siguiente modo:
- Se detecta una respuesta de anticuerpos baja o nula, en grupos inmunizados (i) dos veces con adenovirus o (ii) una vez con la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante;
- Las mayores respuestas de anticuerpos se detectaron normalmente en el grupo inmunizado dos veces con la proteína 21 días después de la inmunización. Sin embargo, en este grupo también se observa la mayor variabilidad entre individuos. Además, para la serología de anti-Nef, parece que el grupo inmunizado dos veces con adenovirus seguido por dos veces con proteína muestra la mayor respuesta, cuando se compara con los otros grupos;
- Las respuestas observadas en grupos inmunizados (i)) dos veces con la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante o (ii) dos veces con proteína seguida por dos veces con adenovirus o (iii) dos veces con adenovirus seguido por dos veces con proteína son comparables, valor máximo 21 días después de la última inmunización y luego disminuyen ligeramente con el tiempo.
Las respuestas de anticuerpos frente a p17 (Fig. 7) fueron de muy bajas a indetectables en todos los grupos.
Conclusión:
En general, la mayor respuesta inmunitaria mediada por células específicas para antígenos se observa en el grupo de tratamiento con AAPP después de 4 inmunizaciones. Sin embargo, cuando se comparan grupos después de 2 inmunizaciones (es decir, grupos de AA, PP y 2 x combo), la inducción de ambas respuestas de linfocitos T CD4 y CD8 específicos para antígenos solo se observa en el grupo inmunizado dos veces con la combinación de proteína/adenovirus/adyuvante. Además, pueden alcanzarse niveles similares de respuestas de linfocitos T CD4 y CD8 después de una única inyección de la combinación de proteína/adenovirus/adyuvante. Además, en términos de persistencia, las respuestas de linfocitos T específicos para antígenos observadas 112 días después de la 2a inmunización con la combinación de proteína/adenovirus/adyuvante son comparables a las observadas 112 días después de la 4a inmunización en el grupo de tratamiento con AAPP. Finalmente, parece que se necesitan 2 inmunizaciones con la combinación de proteína/adenovirus/adyuvante para obtener una respuesta de anticuerpos comparable a la obtenida en el grupo inmunizado dos veces con la proteína con adyuvante, grupo que en general proporcionó las mayores respuestas de anticuerpos.
Ejemplo 2
Estudio de inmunogenicidad en ratones inmunizados con adenovirus Pan7GRN y proteína F4 /adyuvante B formulados conjuntamente
La cepa de ratón usada fue CB6F1 con 9 ratones por grupo. Los ratones se inmunizaron una vez con una formulación conjunta de la proteína F4 (se inyectó 1/10 de la dosis humana, es decir, 9 ug) junto con 10 x 108 partículas de virus (vp) de Pan7GRN, en 50 ul de adyuvante B o una dilución de este último (1/2, 1/4 o 1/10). Las respuestas celulares de CD4 y CD8 frente a una mezcla de péptidos Nef, p17, p24 o RT se determinaron 21 días después de la inmunización (3 mezclas de 3 bazos para cada grupo).
Se realizó la siguiente lectura:
Respuestas celulares (Figura 9):
- medidas por citometría de flujo tras la tinción de citocinas superficiales e intracelulares después de reestimulación durante la noche de células del bazo con mezclas de péptidos de p24, RT, Nef o p17. Para el análisis se mezclaron las células del bazo (3 mezclas de 3 bazos por grupo).
Resultados:
Los resultados mostrados en la Figura 9 representan las respuestas celulares observadas después de la reestimulación con una mezcla de péptidos de p24 o RT.
Las marcas del eje X se corresponden del siguiente modo:
Ady B - Ratones inmunizados con 9 |jg de F4/ 108 vp de Pan7GRN/ adyuvante B sin diluir
1/2 Ady B - Ratones inmunizados con 9 jg de F4/ 108 vp de Pan7GRN/ adyuvante B diluido 1/2
1/4 Ady B - Ratones inmunizados con 9 jg de F4/ 108 vp de Pan7GRN/ adyuvante B diluido 1/4
1/10 Ady B - Ratones inmunizados con 9 jg de F4/ 108 vp de Pan7GRN/ adyuvante B diluido 1/10
Sin tratamiento previo - Ratones sin tratamiento previo (sin inmunización)
Los resultados indican que las respuestas de CD4 (Figura 9, panel izquierdo) y CD8 (Figura 9, panel derecho) se observan principalmente frente a p24 y RT, siendo la respuesta de linfocitos T CD8 específicos para RT inferior a los específicos para p24. Además, los resultados indican que las respuestas de CD4 frente a p24 y RT 21 días después de las inmunizaciones en los grupos inmunizados con el adyuvante B sin diluir o una dilución de 1/2 del mismo son similares. Estas respuestas de CD4 tienden a disminuir cuando el adyuvante se diluye 1/4. Si el adyuvante B se diluye 1/10, las respuestas de CD4 observadas son similares a las de los grupos inmunizados con la dilución de 1/4 del adyuvante B. Las respuestas anti-CD8 frente a p24 son comparables tanto si el adyuvante se diluye 1/2 como si no. Sin embargo, la respuesta disminuye cuando el adyuvante B se diluye 1/4 e incluso tanto más si se diluye 1/10. A diferencia, tales tendencias no se ven para las respuestas de CD8 anti-RT en las que no hay un efecto del intervalo de dosis real de la dosis de adyuvante usada.
Conclusión:
Se indujeron células CD4+ y células CD8+ frente a los componentes de F4 mediante una única administración de una composición que contenía un polipéptido inmunógeno, un vector adenoviral que contenía un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido inmunógeno y un adyuvante, aún cuando éste último se diluyó. El impacto de la dilución del adyuvante fue distinto dependiendo de las respuestas de CD4 o CD8 específicos para antígenos de interés. En particular, las mayores respuestas observadas fueron frente a p24 y las respuestas de linfocitos T CD4 y CD8 anti-p24 muestran un efecto del intervalo de dosis que guarda relación con la dosis de adyuvante usada en la vacuna de la combinación. Aunque puede observarse el mismo efecto para la respuesta de linfocitos T CD4 anti-RT, el efecto del intervalo de dosis de la dosis de adyuvante usada en el combo es menos clara para la respuesta de linfocitos T CD8 anti-RT. Finalmente, puede observarse un intervalo de dosis si se consideran las respuestas globales de linfocitos T CD4 y CD8 específicos para antígenos y se suman las respuestas frente a los 4 antígenos.
Ejemplo 3:
Estudio de inmunogenicidad en conejos blancos Nueva Zelanda inmunizados con Pan7GRN o F4/adyuvante B secuencialmente o con ambos componentes de adenovirus y proteína formulados conjuntamente
Para la inmunización con F4/adyuvante B se inyectó la dosis humana, es decir, 90 ug de proteína F4, en 500 ul de adyuvante B. Para la inmunización con Pan7GRN se usaron 10 x 1010 o 10 x 1012 partículas de virus (vp) en 500 ul de solución salina. Para la inmunización con tanto los componentes de adenovirus como de proteína formulados conjuntamente se usaron 90 |jg de proteína F4, 10 x 1011 partículas de virus (vp) de Pan7GRN en 500 ul de adyuvante B.
El programa de vacunación fue del siguiente modo:
Figure imgf000025_0001
Hubo 3 conejos por grupo, excepto el grupo 1 que solo incluyó 2 conejos.
Se realizaron las siguientes lecturas:
Respuestas de anticuerpos (se realizaron ELISA en los sueros de cada animal individual de cada grupo):
- respuesta de anticuerpos frente a F4
- respuesta de anticuerpos frente a componentes de F4 p24, RT, Nef y p17
Respuestas linfoproliferativas:
La linfoproliferación se determinó por la captación de timidina tritiada por células mononucleares de la sangre periférica (aisladas a partir de sangre completa después de un gradiente de densidad) reestimuladas in vitro con mezclas de péptidos de Nef, p17, p24 y/o RT durante 88 horas en presencia de timidina tritiada durante las 16 últimas horas de la incubación.
Resultados:
Respuesta linfoproliferativa:
Como se muestra en la Figura 10, las mayores respuestas linfoproliferativas se observan en el grupo inmunizado dos veces con proteína. La respuesta linfoproliferativa de animales inmunizados dos veces con la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante se observó en todos los conejos del grupo. En realidad alcanzó el valor máximo después de una inyección y podría haberse recordado adicionalmente (a niveles similares a después de la 1a inyección) tras una tercera inyección de la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante, sugiriendo que las dos primeras inyecciones no indujeron una respuesta neutralizadora que inhibiera cualquier respuesta a otra inyección similar. En su intensidad, la respuesta proliferativa observada en conejos inmunizados con la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante fue comparable a la observada en animales inmunizados una vez o dos veces con 1012 partículas virales (vp) de adenovirus y pareció mayor que la de animales inmunizados una vez o dos veces con 1010 partículas virales (vp) de adenovirus. En general, esto sugiere que el uso de la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante podría disminuir la dosis de adenovirus a usar. Finalmente, después de una tercera inyección de la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante, la respuesta observada en el grupo 4 fue similar a la de animales inmunizados 3 veces con la proteína (grupo 1).
Serología:
Como se muestra en la Figura 11, la cinética de la respuesta de anticuerpos anti-F4 observada en los animales inmunizados dos veces con la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante es similar a la de animales inmunizados dos veces con la proteína: ya se ha detectado 7 días después de la 2a inyección y luego disminuye con el tiempo. Sin embargo, en términos de intensidad, la respuesta anti-F4 de animales inmunizados dos veces con la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante permanece mayor en los últimos momentos (21 y 63 días después de la 2a inmunización) cuando se compara con la respuesta anti-F4 de animales inmunizados dos veces con la proteína. No se observa respuesta de anticuerpos anti-F4 en conejos inmunizados una vez con 1010 partículas virales de adenovirus. En conejos inmunizados una vez con 1012 partículas virales de adenovirus solo se detecta una respuesta anti-F4 21 y 63 días después de la inmunización. En ese grupo, la alta variabilidad de la respuesta observada en el día 63 después de la inmunización (d 77) resulta el hecho de que un único animal (de los 3) muestra mayores títulos frente a los diferentes componentes de F4, especialmente p24 y RT como se muestra en las Figuras 12a y 12b, respectivamente. La respuesta de anticuerpos anti-F4 se compone principalmente de anticuerpos que eligen como diana p24 y RT y en mucha menor medida Nef y p17.
Conclusión:
Las respuestas linfoproliferativas y de anticuerpos podrían inducirse en conejos después de dos inyecciones de una composición que contiene un polipéptido inmunógeno, un vector adenoviral que contiene un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido inmunógeno y un adyuvante. Además, hay pruebas de que una respuesta linfoproliferativa puede recordarse después de una tercera inyección de tal composición. Finalmente, la mejor respuesta de anticuerpos (en intensidad y persistencia) se observa con la combinación de adenovirus/proteína/adyuvante.
Ejemplo 4
Inmunogenicidad de F4 (de codón optimizado)/adyuvante B y C7-GRN cuando se administra como una combinación en ratones CB6F1.
Diseño experimental
Ratones CB6F1 se inmunizaron dos veces (días 0 y 21) con diferentes combinaciones enumeradas más adelante. Se usó F4co/adyuvante B a 9 |jg de F4co/animal en 50 |jl de adyuvante B (1/10 de la dosis humana) y el virus C7-GRN a 108 partículas virales/animal. F4co en el ejemplo 4 es f4 preparado como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO2006/013106, procedimiento de de codón optimizado.
Combinaciones
C7-GRN
C7-GRN/ adyuvante B
C7-GRN/ F4co
C7-GRN/ F4co/ adyuvante B
F4co
F4co/ adyuvante B
adyuvante B
C7 vacío
C7 vacío/ adyuvante B
C7 vacío/ F4co
C7 vacío/ F4co/ adyuvante B
Programa de inmunizaciones y análisis de respuestas inmunitarias
Las inmunizaciones se llevaron a cabo en el día 0 y día 21. La tinción de citocinas intracelulares (ICS) se llevó a cabo a 21 días, 28 días (7 días después de la inmunización 2), 42 días (21 días después de la inmunización 2) y 77 días (56 días después de la inmunización 2).
Resultados
Respuestas de linfocitos T CD4 específicos para VIH
Los resultados se muestran en las siguientes figuras:
Figura 13. Cuantificación de linfocitos T CD4 específicos para VIH-1. Para cada protocolo de inmunización se representa el % de linfocitos T CD3 CD4 que secretan IFN-y y/o IL-2 en cuatro momentos. Se estimularon linfocitos de la sangre periférica (PBL) ex vivo (2 horas antes de la adición de la brefeldina, luego durante la noche) con una mezcla de péptidos que incluía la secuencia de F4 y la producción de citocinas se midió mediante ICS. Cada valor es la media geométrica de 5 mezclas de 3 ratones.
Figura 14. Distribución de la frecuencia de linfocitos T CD4 específicos para F4 7 días después de dos inmunizaciones. Para cada protocolo se representa la frecuencia de linfocitos T CD4 circulantes específicos para F4 7 días después de dos inmunizaciones. Cada punto representa el valor obtenido para una mezcla de 3 ratones.
Figura 15. Producción de citocinas de linfocitos T CD4 específicos para F4 7 días después de dos inmunizaciones. El % de linfocitos T CD4 específicos para F4 que secretan IL-2 y/o IFN-y se representa para 5 mezclas de 3 ratones. Se presentan los resultados de la inmunización con F4co/ adyuvante B (A), F4co/ adyuvante B /C7 vacío (B) y F4co/ adyuvante B /C7-GRN (C).
La frecuencia de linfocitos T CD4 circulantes específicos para F4 alcanza el 2,82 % 21 días después de dos inmunizaciones con la combinación F4co/ adyuvante B y desciende hasta el 0,91 % 56 días después de la inmunización (Figura 13). Dos dosis del virus C7-GRN en solitario dan como resultado el 0,52 % de linfocitos T CD4 circulantes específicos para F421 días después de la última inmunización y la presencia del adyuvante adyuvante B no altera esta respuesta.
La presencia del vector C7 vacío o el virus C7-GRN recombinante, además de la mezcla F4co/ adyuvante B, no aumenta ni interfiere con la frecuencia de respuesta de linfocitos T CD4 específicos para F4 (3,58% y 2,82% respectivamente, 21 días después de la última inmunización). Aunque no se han realizado análisis estadísticos, la distribución de poblaciones sugiere que la intensidad de las respuestas de linfocitos T CD4 específicos para F4 no es diferente entre los tres protocolos F4co/ adyuvante B, F4co/ adyuvante B /C7 vacío y F4co/ adyuvante B /C7-GRN (Figura 14). Como es de esperar, la administración de F4co sin adyuvante B no induce linfocitos T CD4 específicos para F4 significativas.
El perfil de la producción de citocinas muestra que después de la inmunización con F4co/ adyuvante B, los linfocitos T CD4 específicos para F4 secretan tanto IFN-y como IL-2. La adición de C7 vacío o C7-GRN en el protocolo de inmunización no altera este perfil.
Como resultado, estos datos sugieren que la mayor respuesta de linfocitos T CD4 específicos para F4 se obtiene después de la inmunización con la combinación de F4co/ adyuvante B y que la presencia del virus C7-GRN no mejora ni altera esta respuesta.
Respuestas de linfocitos T CD8 específicos para antígenos
Los resultados se muestran en las siguientes figuras
Figura 16. Cuantificación de linfocitos T CD8 específicos para VIH-1. Para cada protocolo de inmunización se representa el % de linfocitos T CD3 CD8 que secretan IFN-y y/o IL-2 en cuatro momentos. Se estimularon linfocitos de la sangre periférica (PBL) ex vivo (2 horas antes de la adición de la brefeldina, luego durante la noche) con una mezcla de péptidos que incluía F4 y la producción de citocinas se midió mediante ICS. Cada valor es la media geométrica de 5 mezclas de 3 ratones.
Figura 17. Producción de citocinas de linfocitos T CD8 específicos para F4 7 días después de dos inmunizaciones. El % de linfocitos T CD8 específicos para F4 que secretan IL-2 y/o IFN-y se representa para 5 mezclas de 3 ratones. Se presentan los resultados de la inmunización con C7-GRN (A), C7-GRN/ adyuvante B (B) y C7-GRN+F4co/ adyuvante B (C).
Después de una inyección, el vector recombinante C7-GRN induce una alta frecuencia de linfocitos T CD8 circulantes específicos para F4 (9,70 % de los linfocitos T CD8 totales, 21 días después de la inmunización) (Figura 4). Una segunda inyección no refuerza la respuesta de linfocitos T CD8 específicos para F4. La combinación de F4co/ adyuvante B induce linfocitos T CD8 específicos para F4 de bajas a indetectables y añadiendo esta combinación a C7-GRN no se mejora o altera la respuesta de linfocitos T CD8 específicos para F4.
La respuesta de linfocitos T CD8 específicos para F4 se retrasa cuando el adyuvante B se añade a C7-GRN, pero alcanza el mismo nivel que con C7-GRN solo o la combinación de C7-GRN/F4co/ adyuvante B 21 días después de la segunda inmunización.
Los linfocitos T CD8 específicos para F4 secretan principalmente IFN-y tanto si el vector de C7-GRN se inyecta solo como si se inyecta en combinación con F4co/ adyuvante B (Figura 17).
Curiosamente, la respuesta de linfocitos T CD8 específicos para F4 persiste sin decaer hasta 56 días después de la última inmunización, sugiriendo que el vector de C7 provoca linfocitos T CD8 altos y persistentes.
Conclusiones
La vacuna de F4co/adyuvante B induce una alta frecuencia de linfocitos T CD4 específicos para VIH polifuncional, pero no linfocitos T CD8 específicos para VIH en ratones CB6F1. En el mismo modelo animal, el adenovirus recombinante C7 que expresa Gag, RT y Nef (Ad C7-GRN) induce una alta respuesta de linfocitos T CD8 específicos para antígenos y linfocitos T CD4 específicos para antígenos de bajas a indetectables. Una combinación de F4/ adyuvante B y Ad C7-GRN provoca al mismo tiempo tanto linfocitos T CD4 como CD8 específicos para antígenos. Una combinación de los tres componentes, F4co, adyuvante B y C7-GRN provoca al mismo tiempo los mayores niveles de tanto linfocitos T CD4 como CD8 específicos para antígenos.
La combinación de F4/ adyuvante B y Ad C7-GRN tiene un efecto aditivo en lo referente a la intensidad de ambos brazos de la respuesta inmunitaria celular. En este modelo queda por determinar el efecto de la respuesta de linfocitos T CD4 específicos para antígenos en la funcionalidad de la respuesta de linfocitos T CD8 específicos para antígenos.
Ejemplo de referencia 5
Inmunogenicidad del adenovirus C7 de chimpancé que expresa la construcción CS2 de la proteína CSP a partir de Plasmodium falciparum (C7-CS2) cuando se administra solo
Diseño experimental:
Ratones CB6F1 se inmunizaron una vez intramuscularmente con un intervalo de dosis (1010, 109 y 108 partículas virales) del adenovirus C7 de chimpancé que expresa el antígeno de la malaria CSP, y las respuestas de linfocitos T CD4 y CD8 específicos para CSP (extremo C y extremo N) se determinaron 21, 28 y 35 días después de la inyección por ICS (tinción de citocinas intracelulares).
Respuestas de linfocitos T CD4 específicos para CSP
Los resultados se muestran en las siguientes figuras:
Figura 18. Cuantificación de linfocitos T CD4 específicos para CSP. Para cada protocolo de inmunización se representa el % de linfocitos T CD4 que secretan IFN-y y/o IL-2 en tres momentos. Se estimularon ex vivo linfocitos de la sangre periférica (PBL) (2 horas antes de la adición de la brefeldina, luego durante la noche) con una mezcla de péptidos que incluía las secuencias del extremo N de CSP o del extremo C de CSP y la producción de citocinas se midió mediante ICS. Se sumaron las respuestas a las mezclas de péptidos del extremo C y extremo N y cada valor es el promedio de 5 mezclas de 4 ratones.
Figura 19. Cuantificación de linfocitos T CD8 específicos para CSP. Para cada protocolo de inmunización se representa el % de linfocitos T CD8 que secretan IFN-y y/o IL-2 en tres momentos. Se estimularon ex vivo linfocitos de la sangre periférica (PBL) (2 horas antes de la adición de la brefeldina, luego durante la noche) con una mezcla de péptidos que incluía las secuencias del extremo N de CSP o del extremo C de CSP y la producción de citocinas se midió mediante ICS. Se sumaron las respuestas a las mezclas de péptidos del extremo C y extremo N y cada valor es el promedio de 5 mezclas de 4 ratones.
Estos resultados indican que tanto las dosis de 1010 como de 109 de C7-CS2 provocan niveles similares de respuestas de linfocitos T CD4 específicos para CSP (valor máximo del 0,5 %) y niveles similares de respuestas de linfocitos T CD8 específicos para CSP (valor máximo del 8 %). La dosis de 1010 de C7-CS2 se eligió en experimentos posteriores en los que se probó la inmunogenicidad de C7-CS2 en combinación con RTS,S (véase más adelante).
Ejemplo de referencia 6
Inmunogenicidad de C7-CS2 y RTS,S cuando se administran como una combinación en ratones CB6F1 Diseño experimental:
Ratones CB6F1 se inmunizaron tres veces intramuscularmente (día 0, 14 y 28) con o una combinación del candidato a la vacuna de la malaria RTS,S (5 |jg) en 50 |jl de adyuvante B (denominado P-P-P en las figuras de más adelante) o una combinación de RTS,S (5 jg ) y C7-CS2 (1010 partículas virales) en 50 j l de adyuvante B (denominado C-C-C en las figuras de más adelante). Las respuestas de linfocitos T CD4 y CD8 específicos para CSP (extremo C y extremo N) se determinaron en los siguientes momentos:
- 7 días después de 2 inmunizaciones
- 7, 21, 35 y 49 días después de 3 inmunizaciones
Las respuestas de linfocitos T específicos para CSP se determinaron mediante ICS (tinción de citocinas intracelulares).
Las respuestas de anticuerpos específicos para CSP en los sueros de animales inmunizados también se determinaron mediante ELISA 14 y 42 días después de la 3a inmunización.
Respuestas de linfocitos T CD4 específicos para CSP
Los resultados se muestran en las siguientes figuras:
Figura 20. Cuantificación de linfocitos T CD4 específicos para (el extremo N de) CSP. Para cada protocolo de inmunización se representa el % de los linfocitos T CD4 que secretan IFN-y y/o IL-2 en cinco momentos. Se estimularon ex vivo linfocitos de la sangre periférica (PBL) (2 horas antes de la adición de la brefeldina, luego durante la noche) con una mezcla de péptidos que incluía la secuencia del extremo N de CSP y la producción de citocinas (IFNg y/o IL-2) se midió mediante ICS. Cada valor es el promedio de 4 mezclas de 7 ratones.
Figura 21. Cuantificación de linfocitos T CD4 específicos para (el extremo C de) CSP. Para cada protocolo de inmunización se representa el % de los linfocitos T CD4 que secretan IFN-y y/o IL-2 en cinco momentos. Se estimularon ex vivo linfocitos de la sangre periférica (PBL) (2 horas antes de la adición de la brefeldina, luego durante la noche) con una mezcla de péptidos que incluía la secuencia del extremo C de CSP y la producción de citocinas (IFNg y/o IL-2) se midió mediante ICS. Cada valor es el promedio de 4 mezclas de 7 ratones.
Estos resultados indican que los ratones inmunizados con 3 inyecciones de la combinación [RTS,S C7-CS21010 adyuvante B] muestran mayores respuestas de linfocitos T c D4 específicos para antígenos (tanto frente a la parte del extremo C como del extremo N de CSP) que los ratones inmunizados con 3 inyecciones de RTS,S adyuvante B.
Respuestas de linfocitos T CD8 específicos para CSP
Los resultados se muestran en las siguientes figuras:
Figura 22. Cuantificación de linfocitos T CD8 específicos para (el extremo N de) CSP. Para cada protocolo de inmunización se representa el % de linfocitos T CD8 que secretan IFN-y y/o IL-2 en cinco momentos. Se estimularon ex vivo linfocitos de la sangre periférica (PBL) (2 horas antes de la adición de la brefeldina, luego durante la noche) con una mezcla de péptidos que incluía la secuencia del extremo N de CSP y la producción de citocinas (IFNg y/o IL-2) se midió mediante ICS. Cada valor es el promedio de 4 mezclas de 7 ratones.
Figura 23. Cuantificación de linfocitos T CD8 específicos para (el extremo C de) CSP. Para cada protocolo de inmunización se representa el % de linfocitos T CD8 que secretan IFN-y y/o IL-2 en cinco momentos. Se estimularon ex vivo linfocitos de la sangre periférica (PBL) (2 horas antes de la adición de la brefeldina, luego durante la noche) con una mezcla de péptidos que incluía la secuencia del extremo C de CSP y la producción de citocinas (IFNg y/o IL-2) se midió mediante ICS. Cada valor es el promedio de 4 mezclas de 7 ratones.
Estos resultados indican que los ratones inmunizados con 3 inyecciones de la combinación [RTS,S C7-CS21010 adyuvante B] muestran mayores respuestas de linfocitos T c D8 específicos para antígenos (tanto frente a la parte del extremo C como del extremo N de CSP) que los ratones inmunizados con 3 inyecciones de RTS,S adyuvante B.
Respuestas de anticuerpos específicos para CSP
Los resultados se muestran en la siguiente figura:
Figura 24. Cuantificación de títulos de anticuerpos específicos para CSP. Los sueros de los ratones se recogieron 14 y 42 días después de la 3a inmunización. Los títulos de anticuerpos anti-CSP se midieron en cada uno de estos sueros individuales mediante ELISA. Los datos mostrados es la media geométrica de títulos de anticuerpos intervalo de confianza del 95 %.
Estos resultados indican que los ratones inmunizados con 3 inyecciones de la combinación [RTS,S C7-CS21010 adyuvante B] muestran títulos de anticuerpos específicos para CSP similares a los de los ratones inmunizados con 3 inyecciones de RTS,S adyuvante B.
Conclusiones
La vacuna de RTS,S/adyuvante B induce una alta frecuencia de linfocitos T CD4 específicos para el extremo C de CSP, pero no de linfocitos T CD4 específicos para el extremo N de CSP. Además, la vacuna de RTS,S/adyuvante B induce linfocitos T CD8 específicos para el extremo C y N de CSP de bajas a indetectables. En el mismo modelo animal, el adenovirus recombinante C7 que expresa c Sp induce altas respuestas de linfocitos T CD8 específicos para (el extremo C y el extremo N de) CSP e inferiores respuestas de linfocitos T CD4 específicos para (el extremo C y el extremo N de) CSP. Una combinación de RTS,S/ adyuvante B y Ad C7-CS2 provoca al mismo tiempo altos niveles de tanto linfocitos T CD4 como CD8 específicos para (el extremo C y el extremo N de) CSP. La combinación de RTS,S/ adyuvante B y Ad C7-CS2 tiene un efecto aditivo en lo referente a la intensidad de ambos brazos de la respuesta de linfocitos T. Finalmente, la combinación de RTS,S/ adyuvante B y Ad C7-CS2 provoca altos niveles de respuestas de anticuerpos específicos para CSP que son comparables a las inducidas por RTS,S/adyuvante B. SECUENCIAS SEQ ID No 1:

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Uno o más primeros polipéptidos inmunógenos para su uso en un procedimiento de generación de una respuesta inmunológica frente a Mycobacterium spp., en los que los uno o más primeros polipéptidos inmunógenos se administran de manera concomitante con (i) uno o más vectores adenovirales que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más segundos polipéptidos inmunógenos y (ii) un adyuvante que comprende QS21 y 3D-MPL, en el que los uno o más primeros y segundos polipéptidos comprenden los restos 4­ 725 de la SEQ ID NO: 10, y en los que la expresión “de manera concomitante” significa que los uno o más polipéptidos inmunógenos, los uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran dentro de un período de no más de 12 horas, por ejemplo, dentro de un período de no más de 1 hora, normalmente en una ocasión, por ejemplo, en el trascurso de la misma visita al profesional sanitario, por ejemplo, los uno o más polipéptidos inmunógenos, los uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran de manera secuencial o de manera simultánea.
2. Uno o más vectores adenovirales que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más segundos polipéptidos inmunógenos derivados de Mycobacterium spp. para su uso en un procedimiento de generación de una respuesta inmunológica frente a dicho Mycobacterium spp. en los que los uno o más vectores adenovirales se administran de manera concomitante con (i) uno o más primeros polipéptidos inmunógenos derivados de dicha Mycobacterium spp. y (ii) un adyuvante que comprende QS21 y 2D-MPL, en el que los uno o más primeros y segundos polipéptidos comprenden los restos 4-725 de la SEQ ID NO: 10, y en el que la expresión “de manera concomitante” significa que los uno o más polipéptidos inmunógenos, los uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran dentro de un período de no más de 12 horas, por ejemplo, dentro de un período de no más de 1 hora, normalmente en una ocasión, por ejemplo, en el trascurso de la misma visita al profesional sanitario, por ejemplo, los uno o más polipéptidos inmunógenos, los uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran de manera secuencial o de manera simultánea.
3. Los uno o más primeros polipéptidos inmunógenos para su uso, o los uno o más vectores adenovirales para su uso, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 , en los que los uno o más primeros polipéptidos inmunógenos se formulan conjuntamente con el adyuvante.
4. Los uno o más primeros polipéptidos inmunógenos para su uso, o los uno o más vectores adenovirales para su uso, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en los que el procedimiento de generación de una respuesta inmunológica frente a Mycobacterium spp. consiste en (a) administrar de manera concomitante (i) dichos uno o más primeros polipéptidos inmunógenos; (ii) dichos uno o más vectores adenovirales; y (iii) un adyuvante; y (b) repetir de manera opcional las etapas de (a) en una segunda ocasión, y en la que la expresión “de manera concomitante” significa que los uno o más polipéptidos inmunógenos, los uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran dentro de un período de tiempo de no más de 12 horas, por ejemplo, dentro de un período de no más de 1 hora, normalmente en una ocasión, por ejemplo, en el trascurso de la misma visita al profesional sanitario, por ejemplo, los uno o más polipéptidos inmunógenos, los uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran de manera secuencial o de manera simultánea.
5. Los uno o más primeros polipéptidos inmunógenos para su uso, o los uno o más vectores adenovirales para su uso, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en los que el procedimiento de generación de una respuesta inmunológica frente a Mycobacterium spp. no implica administrar ninguna dosis de sensibilización de polipéptido inmunógeno o de polinucleótido que codifica el polipéptido inmunógeno.
6. Los uno o más primeros polipéptidos inmunógenos para su uso, o los uno o más vectores adenovirales para su uso, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en los que los uno o más primeros polipéptidos inmunógenos, los uno o más vectores adenovirales y un adyuvante se formulan conjuntamente.
7. Los uno o más primeros polipéptidos inmunógenos para su uso, o los uno o más vectores adenovirales para su uso, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en los que los uno o más primeros polipéptidos inmunógenos, los uno o más vectores adenovirales y el adyuvante no se formulan conjuntamente y se administran mediante diferentes vías de administración.
8. Una composición de vacuna que comprende (i) uno o más primeros polipéptidos inmunógenos derivados de Mycobacterium spp.; (ii) uno o más vectores adenovirales que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más segundos polipéptidos inmunógenos derivados de Mycobacterium spp.; y (iii) un adyuvante que comprende QS21 y 3D-MPL, en la que los uno o más primeros y segundos polipéptidos comprenden los restos 4-725 de la SEQ ID NO: 10.
9. Un kit que comprende (i) uno o más primeros polipéptidos inmunógenos derivados de Mycobacterium spp.; (ii) uno o más vectores adenovirales que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más segundos polipéptidos inmunógenos derivados de dicha Mycobacterium spp.; y (iii) un adyuvante que comprende QS21 y 3D-MPL, en el que los uno o más primeros y segundos polipéptidos comprenden los restos 4-725 de la SEQ ID NO: 10, y en el que los uno o más polipéptidos inmunógenos, los uno o más vectores adenovirales y el adyuvante son para la administración de manera concomitante, en la que la expresión “de manera concomitante” significa que los uno o más polipéptidos inmunógenos, los uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran dentro de un período de no más de 12 horas, por ejemplo, en un período de no más de 1 hora, normalmente en una ocasión, por ejemplo, en el trascurso de la misma visita al profesional sanitario, por ejemplo, los uno o más polipéptidos inmunógenos, los uno o más vectores adenovirales y el adyuvante se administran de manera secuencial o de manera simultánea.
10. Los uno o más primeros polipéptidos inmunógenos para su uso, los uno o más vectores adenovirales para su uso, la composición de vacuna o el kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en los que la Mycobacterium spp. es Mycobacterium tuberculosis.
11. Los uno o más primeros polipéptidos inmunógenos para su uso, los uno o más vectores adenovirales para su uso, la composición de vacuna o el kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en los que uno o más de los vectores adenovirales deriva de un adenovirus de primate no humano.
12. Los uno o más primeros polipéptidos inmunógenos para su uso, los uno o más vectores adenovirales para su uso, la composición de vacuna o el kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en los que el adyuvante contiene liposomas.
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