ES2610408T3

ES2610408T3 - Péptidos de penetración a células y su uso fusionados a biomoléculas con acción terapéutica

Info

Publication number: ES2610408T3
Application number: ES08784156.5T
Authority: ES
Inventors: Isis Del Carmen Torrens Madrazo; Maribel Guerra Vallespi; Milaid Granadillo Rodriguez; Osvaldo Reyes Acosta; Boris Ernesto Acevedo Castro
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Priority date: 2007-07-31
Filing date: 2008-07-31
Publication date: 2017-04-27
Anticipated expiration: 2028-07-31
Also published as: AR068329A1; US8673313B2; CU23674A1; BRPI0814452A2; EP2186526A1; KR20100045498A; CA2694735C; CN101808658A; KR101515445B1; ZA201001337B; EP2186526B1; CN101808658B; US20120135021A1; CA2694735A1; WO2009021468A1

Abstract

La presente invención se refiere al uso de nuevos péptidos penetradores a células (PPC) y en particular a la región 32-51 de la proteína Limulus antilipopolisacárido (LALF) y sus análogos. Esta invención se refiere a composiciones que contienen estos péptidosasociados a biomoléculas con propiedades terapéuticas. Esta invención consiste en composiciones que contienen la fusión covalentede biomoléculas, entre ellas antígenos del virus de papiloma humano (VPH), a estos PPC, para inducir una potente respuesta inmunecelular contra el VPH y contra células que expongan antígenos delVPH incluyendo tumores asociados al VPH. Las composiciones referidas son aplicables en la industria farmacéutica como vacunas para uso terapéutico en humano.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Se lavaron 3 g de precipitado con 30 mL de la solución reguladora 50 mM de Tris-HCl; 3 mM de EDTA; 0.8 M de NaCl;

0.01 M de MgCl2; 0.1 % de NP40 y se hizo la homogeneización en un Polytron a una velocidad de rotación de 9500 × 1 minuto. El homogeneizado fue centrifugado a 10 000 rpm por 20 minutos a 4 °C. El sobrenadante fue eliminado de la centrifugación y la fracción insoluble fue suspendida en los 30 mL de la solución reguladora 50 mM de NaH2PO4; 0,3 M de NaCL; pH 8 y la homogeneización se realizó tal como se describió previamente. El homogeneizado fue centrifugado a 10 000 rpm por 20 minutos 4 °C. Con el fin de hacer la extracción de la proteína de la fracción insoluble se suspendió 1 g de la proteína en 100 ml de urea de 4 M en la solución reguladora 50 mM de NaH2PO4; 0.3 M de NaCl, pH 8. La homogeneización fue hecha con un Polytron a una velocidad de rotación de 9.500 por 1 minuto. Después de que la extracción fue centrifugada a 10 000 rpm por 20 minutos a 4°C. La fracción soluble fue separada de la extracción que contenía la proteína de interés. Esta fracción fue aplicada a una columna de Ni-NTA (His-Select ™ Nickel Affinity Gel, Sigma) equilibrada con 4 M en solución reguladora 50 mM de NaH2PO4; 0.3 M de NaCL; pH 8 y 5 mM de imidazol. La columna fue lavada con el mismo regulador de equilibrio y 40 mM de imidazol y se realizó la elución de proteína con 250 mM de imidazol. La proteína purificada se sometió a diálisis con el regulador de pH Tris 1x pH 8.4 utilizando una membrana de 10 µm de diámetro. Finalmente la proteína fue esterilizada mediante filtración a través de un filtro de 0.22 µm.

Estos resultados son similares cuando en lugar de PPC LALF se utilizó cualquiera de sus análogos L-2, L-8, L-12 y L

20.

Ejemplo 5. Demostración mediante microscopía de fluorescencia de que PPC LALF o sus análogos internalizan la proteína cargo E7 en la célula

Las células J774 se cultivaron sobre cubre objetos estériles de vidrio de 22 mm por una noche a 37° C y 5% de CO2 con RPMI 1640, 10% de suero fetal bovino inactivado y 2 mM de glutamina. Luego fueron incubados diferentes cubre objetos de vidrio con 1.66 µM de proteína de fusión LALF-E7, 1.66 µm de proteína E7 y PBS (como control negativo) a 37°C por 30 min, 1 hora y 2 horas. Las células CasKi (células humanas que expresan VPH 16) se cultivaron como control positivo en las mismas condiciones experimentales.

Después de la incubación se lavaron las células brevemente con PBS y se fijaron mediante 4% de paraformaldehído por 20 min temperatura ambiente. Se realizaron tres lavados con PBS. Se realizó la permeabilización de las células con 0.5% de Tritón X-100 por 15 min a temperatura ambiente. Se realizaron tres lavados con PBS. Después las células se incubaron por 1 hora en SBF de bloqueo de 1% en PBS a temperatura ambiente. Se realizaron tres lavados con PBS. Las células fueron incubadas con anticuerpo policlonal anti E7/VPH 16 de IgG de cabra (Santa Cruz) diluido en PBS

1:50. Se lavó extensivamente con PBS. Se incubó con anticuerpo policlonal IgG anti-cabra-fluoresceína (Santa Cruz) diluido en PBS 1:50 por 45 minutos en una cámara oscura. Se lavó extensivamente con PBS. Se montaron cubre objetos con medio de montaje acuoso. Se examinó utilizando microscopio de fluorescencia con filtros apropiados.

Los resultados mostraron (Figura 4) células fluorescentes sólo en el caso de incubación de las células J774 con la fusión LALF-E7 y en las células CasKi. Se obtuvieron resultados negativos con la incubación de J774 con E7 y PBS. Estos resultados muestran que la proteína E7 alcanza su internalización dentro de la célula sólo en el caso cuando se fusiona con LALF.

Estos resultados son similares cuando en lugar de PPC LALF fue utilizado cualquiera de sus análogos L-2, L-8, L-12 y L-20.

Ejemplo 6. Demostración por medio de Western blot de que el PPC LALF o sus análogos internalizan la proteína cargo en la célula

Las células J774 fueron cultivadas por toda una noche a 37° C y 5% de CO2 con RPMI 1640, 10% de suero fetal bovino inactivado y 2 mM de glutamina. Después las células se separaron en alícuotas en tubos con 5x106 células cada uno y se incubaron con 25 µM de proteína de fusión LALF-E7, 25 µM de proteína E7 y PBS durante 4 horas a 37°C. La sedimentación de las células se hizo por medio de una centrifugación a 1000 rpm durante 10 minutos. La pella se lavó tres veces con PBS. Las células se rompieron en 100 µl de regulador RIPA (Promega) se mezclaron en vórtex durante 10 segundos y 2 minutos en hielo. La sedimentación de las células rotas se hizo mediante centrifugación a 12000 rpm durante 15 minutos. Se determinó la concentración de proteína para separar el extracto celular y se aplicaron 10 µg de proteína total en un gel de poliacrilamida al 15%. A continuación, el gel fue transferido a una membrana de nitrocelulosa. La membrana fue incubada por 2 horas a temperatura ambiente con un anticuerpo policlonal de cabra IgG anti-E7 VPH 16 (Santa Cruz) diluido en PBS (1:100). Se realizaron tres lavados con PBS. A continuación la membrana fue incubada por 45 minutos a temperatura ambiente y y en una cámara oscura con un conjugado de peroxidasa anti-cabra IgG (Sigma) diluida en PBS (1:5000). Se realizaron tres lavados con PBS. Finalmente se utilizó el sistema ECL de Amersham Pharmacia Biotech. Tal como se muestra en la figura 5 pudieron extraerse cantidades suficientes de la proteína de fusión (LALF-E7) dentro de las células J774 después de un tiempo breve de incubación in vitro de las células con la proteína, la cual fue reconocida por el anticuerpo anti-E7. Sin embargo no fue detectado ningún reconocimiento en el carril donde se aplicó el extracto de las células incubadas con la proteína E7 y PBS.

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Estos resultados son similares cuando en lugar del PPC LALF se utilizó cualquiera de sus análogos L-2, L-8, L-12 y L

20.

Ejemplo 7. Demostración por microscopía de fluorescencia que el PPC LALF o sus análogos internalizan la proteína cargo GFP en las células

La proteína producida en E. coli a partir de la fusión recombinante LALF-GFP (GFP-del inglés green fluorescence protein) fue utilizada para verificar que el PPC LALF o sus análogos podían internalizar la proteína cargo. La GFP (GenBank Accession # U55762) fue obtenida utilizando la reacción en cadena de la polimerasa a partir del plásmido pEGFP-N1 de Clontech utilizando oligonucleótidos con SEQ ID N0. 11 y 12. Ambos oligonucleótidos tienen sitios de restricción utilizados para clonación (Hindlll-con sentido y BamHI-con el antisentido).

Para la construcción del fragmento recombinante, LALF sintético y el gen de GFP obtenido mediante PCR fueron insertados con la ligasa T4 en el vector pM238, de manera similar que en el ejemplo III. El clon recombinante se identifica con las SEQ ID N0. 13 y 14.

Con la proteína LALF-GFP recombinante y purificada se realizó un experimento similar al del ejemplo V, pero en este caso las células J774 fueron incubadas con LALF-GFP, LALF biotinilado, GFP y PBS.

Los resultados obtenidos (Figura 6) mostraron células fluorescentes cuando las células J774 fueron incubadas con la fusión LALF-GFP, similares a aquellas obtenidas mediante LALF-biotinilado. No se observaron células fluorescentes con la incubación de J774 con GFP y PBS.

Estos resultados muestran que la proteína cargo, en este caso la GFP, alcanza su internalización hacia la célula solamente cuando se fusiona al LALF.

20.

Ejemplo 8. Tratamiento de tumores establecidos en ratones con la fusión de proteínas de PPC LALF o sus análogos con E7 (LALF+E7)

A fin de observar la regresión de tumores establecidos a partir del tratamiento con la fusión proteica LALF-E7 recombinante, se utilizó la línea celular tumoral TC-1.

La línea celular tumoral TC-1 que expresa la proteína E7 de VPH16 E7 fue derivada de células primarias de pulmón de ratones C57BI/6 a través de la inmortalización y transformación de las células con los genes VPH16 E6 y E7 y un gen humano activado C-Ha-ras tal como se describió en Lin et al. (1996)) Treatment of established tumors with a novel vaccine that enhances major histocompatibility class II presentation of tumor antigen. Cancer Res. 56:21-26. Para la inoculación de los tumores, las célulasTC-1, suministradas por el Dr. T.-C. Wu (The Johns Hopkins Medical institutions, Baltimore, Md.), Fueron cultivadas hasta 60-70% de confluencia en medio RPMI1640 suplementado con suero fetal bovino al 10% (Hyclone, Logan, Utah), aminoácidos no esenciales, glutamina, piruvato, gentamicina, betamercaptoetanol y 0.4 mg/mL de Geneticin a 37°C. Las células se cosecharon mediante tripsinización y se resuspendieron en una solución reguladora de Hank a 2,5x105 células/mL.

Se inocularon ratones C57BL/6 con 2x105 células mediante inyección subcutánea en la pata derecha en volúmenes de

0.2 mL. A los 10 días cuando todos los animales habían desarrollado tumores palpables, los animales fueron asignados arbitrariamente a cuatro grupos de tratamiento. Cada grupo incluía 10 animales. Se realizaron dos inmunizaciones, cada 14 días. El grupo 1 fue inmunizado con la proteína recombinante LALF-E7; el grupo 2 con la proteína E7 recombinante; el grupo 3 con el péptido sintético LALF y el grupo 4 con PBS. La cinética humoral en los diferentes grupos fue seguida por el volumen tumoral que se determinó usando un pie de rey digital y tomando las medidas en dos dimensiones ortogonales. Los volúmenes tumorales (mm³) se calcularon a partir de esta medición utilizando la fórmula de conversión (longitud x anchura2)/2. El volumen promedio de cada grupo +/-la desviación estándar a los 30 días está representado en la figura 7.

Los resultados demuestran que el tratamiento con LALF-E7 da lugar a una inhibición completa del crecimiento de los tumores establecidos. Estos resultados son estadísticamente significativos en comparación con los resultados obtenidos con otros tratamientos con E7, LALF y PBS (p<0,01). Se obtienen resultados similares con la proteína de fusión de E7 con análogos de LALF PPC como L2, L-8, L-12 y L-20.

Ejemplo 9. Tratamiento de tumores establecidos en ratones con proteínas de fusión de PPC LALF o sus análogos con E7 (LALF-E7) y la mezcla de PPC LALF o sus análogos con E7 (LALF+E7)

Para estudiar si el efecto antitumoral de LALF-E7 estaba asociado con el enlace covalente de ambas moléculas se realizaron experimentos en los cuales se trataron ratones con LALF y E7, que se mezclaron en el momento previo a su

9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

uso y en cantidades equimolares que permitieran una comparación con los ratones que recibieron la proteína de fusión LALF-E7.

En esta realización fueron inoculados ratones C57BL/6 con 2x105 células mediante inyección subcutánea en la pata derecha, en volúmenes de 0.2 mL. A los 10 días, cuando todos los animales habían desarrollado tumores palpables, los animales fueron asignados arbitrariamente a cinco grupos de tratamiento. Cada grupo incluía 10 animales.

Se realizaron dos inmunizaciones cada 14 días. El grupo 1 fue inmunizado con la proteína recombinante LALF-E7; el grupo 2 con la mezcla LALF+E7: proteína recombinante E7; el grupo 3 con el péptido sintético LALF; el grupo 4 con la proteína recombinante E7 y el grupo 5 con PBS. La cinética tumoral en los diferentes grupos fue seguida tal como se ha descrito previamente en el ejemplo 8. El volumen promedio de cada grupo +/-la desviación estándar a los 30 días está representado en la figura 8.

Los resultados mostraron que los efectos al reducir el volumen de los tumores puede verse solo con el tratamiento de ratones con la fusión covalente LALF-E7, cuyos resultados fueron estadísticamente significativos al compararse con los volúmenes que resultaron del tratamiento con la mezcla de LALF + E7, LALF, E7 y PBS (p<0,01). Estos resultados son similares cuando en lugar de PPC LALF se utilizó cualquiera de sus análogos L-2, L-8, L-12 y L-20.

Ejemplo 10. Comparación de la capacidad de las preparaciones farmacéuticas para inducir respuestas inmunes celulares.

Para evaluar la respuesta inmune celular contra el antígeno E7 de VPH-16, 4 grupos de 3 ratones hembras C57BL/6, DE 6 a 8 semanas de nacidos, recibieron 2 dosis de inmunógenos. El grupo 1 fue inmunizado con 30 µg de la proteína recombinante LALF-E7; el grupo 2 con 30 µg de la proteína recombinante E7; el grupo 3 con 8 µg del péptido sintético LALF y el grupo 4 con PBS.

Las inmunizaciones se realizaron por vía subcutánea en el flanco del animal con volúmenes de 0.2 mL y sin adyuvante. Cada 14 días se administraron dos dosis. Siete días después de la segunda inmunización, los ratones fueron sacrificados mediante dislocación de la cervical y los esplenocitos fueron retirados de modo aséptico para su análisis posterior en un ensayo de ELISPOT anti-gamma interferón (anti-IFN-γ). Las suspensiones celulares de los animales por cada grupo se combinaron y se homogeneizaron suavemente. Los esplenocitos se lavaron y los eritrocitos se lisaron con una solución de NH4Cl al 0.83%. Más tarde se lavaron y finalmente se suspendieron en un medio fresco de RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 10 U/mL de IL-2 humana (hIL-2). Fueron utilizadas células de ratón EL4 (H-2b), que no expresan epítopes de E7 de VPH-16 como células dianas, las cuales fueron pulsadas previamente a una concentración de 10 µM con el péptido 49RAHYNIVTF57 correspondiente al epítope CTL de ratón C57BL/6, H-2b (Feltkamp M.C. et al. (1993) Vaccination with cytotoxic T lymphocyte epitope containing peptide protects against a tumor induced by human papillomavirus type 16-transformed cells. Eur. J. Immunol. 23:2242-2249). Más tarde fueron suspendidas las células en RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y hIL-2, y se usaron como células presentadoras de antígeno. Las células EL4 no pulsadas también fueron incluidas para la determinación del fondo de células escritoras de IFN-γ.

El ensayo para la determinación de secreción de IFN-γ se realizó tal como se ha descrito previamente (Vazquez-Blomquist D. et al. (2002) Induction of a strong HIV-specific CD8+ T cell response in mice using a fowlpox virus vector expressing an HIV-1 multi-CTL-epitope polypeptide. Viral Immunol. 5(2):337-356). Las placas de 96 pozos con el fondo recubierto con papel de nitrocelulosa se recubrieron con 100 µL de 5 µg/mL del Ab de captura y se incubaron durante toda una noche a 4 °C después de los tres lavados con PBS las placas se bloquearon con RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% durante una hora a 37 °C. Los esplenocitos (106, 2x105 y 4x104 células por pozo) y las células EL4 (105 por pozo) fueron añadidas respectivamente en un volumen final de 0.2 mL y fueron co-incubadas en duplicado a 37 °C por ciento del CO2 durante 17 horas. Después de la incubación se realizó un ensayo de ELISPOT estándar (Vazquez-Blomquist D. et al. (2002) Induction of to strong HIV-specific CD8+ T cell response in mice using to fowlpox virus vector expressing an Hiv-1 multi-CTL-epitope polypeptide. Viral Immunol. 5(2):337-356). Para las determinaciones de linfocitos re-estimulados in vitro se incubaron 2,8x107 de células de esplenocitos de cada condición con células EL4 cargadas con el péptido y con hIL-2, durante 7 días a 37°C, en una atmósfera húmeda con 5% de CO2. Después de este tiempo se contaron las células supervivientes se utilizaron para determinaciones de ELISPOT en las mismas condiciones.

Los resultados fueron expresados como el número de células formadoras de puntos (SFC) por 106 esplenocitos. El número de SFC fue obtenido a partir del conteo de los puntos por medio de un estereoscopio y la frecuencia se obtiene al relacionar su número con el número de células cinco balas en cada pozo.

Se consideraron positivos aquellos valores que fueron el doble del control negativo (EL4 sin péptido) más 10 SFC.

Tal como se muestra en la figura 9, el número de células efectoras secretoras de γ-IFN, es decir el número de SFC, fue superior a aproximadamente hasta 8 veces en los grupos inmunizados con LALF-E7 respecto de los grupos inmunizados con VSSP y PBS.

10

Claims

imagen1