ES2402036B1 - Haptenos conjugados y anticuerpos para el fungicida ciprodinil. - Google Patents
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Abstract
Haptenos, conjugados y anticuerpos para el fungicida ciprodinil.#La presente invención se refiere a haptenos, conjugados, derivados marcados y anticuerpos para ciprodinil. Así mismo, la presente invención también se refiere al uso de conjugados de ciprodinil como antígenos de ensayo o inmunógenos para obtener anticuerpos de este fungicida; y al uso de los derivados marcados de ciprodinil como antígenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a un método de análisis de ciprodinil utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados. Esta invención también proporciona un kit para analizar ciprodinil que comprende anticuerpos de este fungicida, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados.
Description
La presente invención se refiere a haptenos, conjugados, derivados marcados y anticuerpos para ciprodinil. Así mismo, la presente invención
también se refiere al uso de conjugados de ciprodinil como antigenos de ensayo o inmunógenos para obtener anticuerpos de este fungicida; y al uso de los derivados marcados de ciprodinil como antigenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a un método de análisis de ciprodinil utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antigenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados. Esta invención también proporciona un kit para analizar ciprodinil que comprende anticuerpos de este
fungicida, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados.
Los fungicidas son el grupo de plaguicidas que con mayor frecuencia aparece en los programas de vigilancia y control. Esto es asi no sólo por su elevado uso, sino principalmente porque estos productos de protección vegetal se emplean para combatir las infecciones causadas por hongos en momentos muy próximos a la cosecha o incluso con posterioridad (fungicidas postcosecha). Este hecho incrementa considerablemente la probabilidad de que residuos de dichos tratamientos permanezcan cuando el alimento llegue al consumidor, lo que obliga a los organismos de regulación y control a estar más vigilantes e idealmente a aumentar los controles. Los ataques por hongos en frutos almacenados constituyen uno de los motivos principales de pérdidas económicas en agricultura. El uso intensivo de fungicidas convencionales, como el tiabendazol o el imazalil, ha llevado en los últimos Mos a la aparición de cepas resistentes y por tanto a una menor eficacia de los tratamientos con estos productos. Ante esta circunstancia, las empresas agroqufmicas pusieron en marcha programas de 1+0 encaminados a desarrollar nuevos productos que presentaran mecanismos de acción innovadores y que permitieran combatir de forma eficaz las infecciones fúngicas, al tiempo que fueran seguros y compatibles con los programas de gestión integrada de plagas. Estos
productos están comenzando a sustituir progresivamente a los productos más
antiguos, que resultan menos aceptables desde un punto de vista toxicológico y medioambiental.
Entre los fungicidas más relevantes desarrollados en la última década destaca et ciprodinil [4-ciclopropil-6-metil-N-fenilpirimidin-2-amina]. Este plaguicida pertenece a la familia de las anilinopirirnidinas cuyo modo bioquimico de acción es común y diferente al del resto de fungicidas. El ciprodinil, desarrollado por NovartisCropProtection (actualmente Syngenta AG), se incluyó en el Anexo I de la UE en 2006 y actualmente se comercializa bajo los nombres Unix y Vangard. Pero sin duda su aplicación agronómica de mayor impacto deriva de su comercialización bajo la denominación Switch, en la que se formula conjuntamente con fludioxonil, otro fungicida pero con un modo de acción diferente. Entre los cultivos para los que la UE ha establecido limites máximos de residuos de forma explicita para ciprodinil se encuentran el trigo
(0.5 ppm), frutas de pepita (1 ppm), frutas de hueso (0.5-2.0 ppm), uva (5 ppm), fresas (5 ppm), solanáceas (0.5-1.0 ppm), cucurbitáceas (0.5 ppm), apionabos
(0.3 ppm) y espinacas (8 ppm), además de una gran variedad de hortalizas de hoja ancha (10 ppm).
Las metodologias analiticas empleadas para el análisis de estos fungicidas son fundamentalmente de tipo instrumental, en especial cromatografla de gases (GC) y cromatografla liquida de alta resolución (HPLC), acopladas a diferentes detectores según el tipo de compuesto a analizar y la sensibilidad requerida. Estas técnicas se caracterizan por su capacidad para analizar simultáneamente varios residuos con una elevada precisión y exactitud . Sin embargo, pese a que resultan imprescindibles en muchas circunstancias, con frecuencia implican la utilización de metodologias laboriosas y de elevado coste, que deben realizarse por personal altamente cualificado en laboratorios centralizados bien equipados y habitualmente alejados de las zonas de producción. Estas limitaciones condicionan la idoneidad de estas técnicas para
acometer el análisis de grandes números de muestras y para obtener resultados en breve plazo, dos aspectos que contribuirian a garantizar la
seguridad de los alimentos comercializados y a la realización de estudios más exhaustivos sobre la exposición de los consumidores a estos fungicidas a través de los alimentos.
Los inmunoensayos son técnicas bioanalíticas basadas en la interacción de un antígeno (el analito) con un anticuerpo que lo reconoce específicamente. No obstante, un plaguicida es una molécula orgánica pequeña que constituye un único sitio de unión al anticuerpo, por lo que en este tipo de técnicas analíticas la interacción entre el analito y el anticuerpo se realiza por desplazamiento de la unión entre el anticuerpo y un análogo marcado del analito. De este modo, en presencia del analito se establece una competencia entre éste y el análogo marcado por la unión al anticuerpo. Habitualmente, el marcaje se realiza con una actividad enzimática, dando asI lugar a los enzimoinmunoensayos. Cuando además uno de los participantes en la reacción se encuentra inmovilizado sobre un soporte sólido, la técnica se denomina ELlSA (del inglés EnzymeLinked Immunosorbenl Assay). Los primeros inmunoensayos enzimáticos para plaguicidas se desarrollaron durante la primera mitad de los años 80. Desde entonces hasta la actualidad el número de plaguicidas para los cuales se han desarrollado inmunoensayos ha aumentado espectacularmente, suponiendo varias decenas y cubriendo los principales grupos de compuestos: insecticidas, herbicidas y fungicidas. De hecho, un gran número de estos ensayos están disponibles comercialmente en forma de kits con diferentes formatos. La creciente aceptación de los inmunoensayos como técnicas complementarias a las cromatográficas para el análisis de pequeñas moléculas orgánicas se debe a que se trata de una metodología sencilla, rápida y de bajo coste, exhibiendo al mismo tiempo una elevada sensibilidad y especificidad. Los inmunoensayos permiten detectar específicamente el analito diana en mezclas muy complejas, simplificando considerablemente los laboriosos procedimientos de preparación
de la muestra, lo que a su vez redunda en un aumento en la capacidad de muestreo. Además, los inmunoensayos pueden realizarse en fonmatos portátiles, lo que los independiza de los laboratorios centralizados y los convierte en idóneos para el análisis en los puntos de producción. Las 5 excelencias analíticas atribuidas a los inmunoensayos ya han sido demostradas en muchas aplicaciones prácticas, donde han competido favorablemente con las técnicas cromatográficas [M.C. Hennion, Ana/ysis 1998, 26,149-155; A. Abad et al., J. Chromatogr. A1999, 833, 3-12; A. Abad et al., J. Agric. Food Chem.2001 , 49, 1707-1712; N.A. Lee y I.R. Kennedy, J. AOAC Inl.
10 2001 , 84, 1393-1406; F.A. Esteve-Turrillas et al. , Ana/. Chim. Acta 2010, 682, 93-103].
Sin embargo, hasta la fecha no se ha descrito la utilización de la tecnología
de inmunoensayo para analizar el contenido del fungicida ciprodinil en una muestra.
15 Por lo tanto, existe una necesidad, en particular en la industria alimentaria
y/o agrícola, de desarrollar un método analítico que penmita la determinación o detección mediante la tecnología de inmunoensayo de ciprodinil, fungicida
ampliamente utilizado en la actualidad, preferentemente mediante la utilización
de un kit que comprenda al menos un anticuerpo de ciprodinil.
La presente invención proporciona haptenos de ciprodinil, compuestos de fónmula (1), que presentan una funcionalización adecuada, en diferentes posiciones de la molécula, para la obtención de conjugados de ciprodinil o
derivados marcados de ciprodinil.
25 Los conjugados de ciprodinil, compuestos de fórmula (11), pueden actuar
como inmunógenos para la obtención de anticuerpos para ciprodinil o como
antlgenos de ensayo útiles para detectar este fungicida mediante ínmunoensayos competitivos. Los conjugados de ciprodinil funcionalizados en diferentes posiciones presentan caracteristicas diferentes, así los inventores han encontrado que no todas las posiciones reactivas de la molécula de ciprodinil son adecuadas para la obtención de conjugados con buenas propiedades inmunogénicas.
La presente invención también proporciona derivados marcados de
5 ciprodinil, compuestos de fórmula (111), útiles como antígenos de ensayo en
inmunoensayos competitivos.
La presente invención también se refiere a anticuerpos con elevada afinidad y selectividad hacia ciprodinil, así como a un método de análisis de ciprodinil utilizando dichos anticuerpos, en ocasiones junto a conjugados o derivados
10 marcados como antlgenos de ensayo.
Finalmente, la presente invención también proporciona un kit para analizar ciprodinil que comprende anticuerpos de este fungicida, opcionalmente, junto a
conjugados o derivados marcados como antígenos de ensayo.
Un primer aspecto de la presente invención describe un compuesto de 15 fórmula (1):
(1)
caracterizado porque
T se selecciona del grupo que consiste en R-I, R-II, R-III, R-IV Y R-V;
lT Ny NJí"l
/. N V
R-V
donde R-I se selecciona del grupo que consiste en [2-«4-ciciopropil-6-metilpirimidin-2il)amino)fenilo], [3-«4-ciciopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-«4ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; R-II es [4-ciclopropil-6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo]; R-III se selecciona del grupo que consiste en [2-«4-ciclopropilpirimidin-2il)amino)fenilo], [3-«4-ciclopropilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-«4ciclopropilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; R-IV se selecciona del grupo que consiste en [6-ciclopropil-2(fenilamino)pirimidin-4-ilo] y [4-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo]; y R-V es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada de 1 a 40 átomos de carbono, donde la
cadena es lineal o ramificada, saturada o ¡nsaturada, y dicha cadena
hidrocarbonada comprende entre O y 10 heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en S, O YN;
Y es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en: -COOH,
- -
- NH" -N" -CH,CI, -CH,Br, -CH,I, -CHO, -SH, -SO,H, -OSO,Ph, -NH-NH" -OSO,Ar y -C:=CH;
con la condición de que:
a) cuando T es [3-«4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo], el fragmento-L-Y es diferente de -SCH,CHNH,COOH; b) cuando T es [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo] y L es -CH,-, y es diferente a -NH,; y c) cuando T es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino], L es una cadena hidrocarbonada de 1 a 40 átomos de carbono, lineal o ramificada, saturada o insaturada, con la condición de que dicha cadena hidrocarbonada no
comprende ningún heteroátomo.
En la presente solicitud de patente se entiende por arilo (-Ar) un grupo
carbocíclico aromático con un único anillo, por ejemplo tenilo, múltiples anillos, por ejemplo bifenilo, o múltiples anillos condensados donde al menos uno de ellos es aromático, por ejemplo 1,2,3,4-tetrahidronaftilo, 1-naftilo, 2-naftilo. El grupo arilo puede estar sustituido o no. Preferentemente, el grupo arilo es 4metilfenilo.
Según una realización preferida, el compuesto de fórmula (1) se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono. Preferentemente, dicha cadena hidrocarbonada lineal comprende entre 2 y 8
átomos de carbono.
Según otra realización preferida adicional, el compuesto de fórmula (1) de la
presente invención se caracteriza porque Y se selecciona del grupo que
consiste en -COOH, -CHO, -NH, y -SH. Preferentemente, el compuesto de fórmula (1) objeto de la presente invención se caracteriza porque Y es -COOH.
Según otra realización preferida, el compuesto de formula (1) tal como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque T es [3-« 4cic1opropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o ]4-(4-cic1opropil-6-metilpirimidin2-il)amino)fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; e Y se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH, y -SH. Preferentemente, el compuesto de fórmula (1) de la presente invención se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono.
Según una realización aún más preferida, el compuesto de fórmula (1) de
esta invención se selecciona del grupo que consiste en
H
yNYY(CH,)5CO'H
I ~N V
y
~
Según otra realización preferida adicional, el compuesto de formula (1) tal
como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque T es [6
cic1opropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal
de 1 a 20 átomos de carbono; e Y se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH, y -SH. Preferentemente, el compuesto de fórmula (1) de
la presente invención se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada
lineal de 2 a 8 átomos de carbono.
5 Según una realización aún más preferida, el compuesto de fórmula (1) de
esta invención es
Según otra realización preferida adicional, el compuesto de formula (1) tal como se describe en esta solicitud de patente se caracteriza porque T es [(4
10 ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; e Y se selecciona del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH, y -SH. Preferentemente, el compuesto de fórmula (1) de la presente invención se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono.
15 Según una realización aún más preferida, el compuesto de fórmula (1) de
esta invención es
Un segundo aspecto de la presente invención describe un compuesto de
fórmula (11):
[T-L-Z).-P
(11)
caracterizado porque
T se selecciona del grupo que consiste en R-I, R-II, R-III, R-IV y R-V;
H H
/.N V! \ /.N V
R·I R·II
H T
NyN~NyN~
/. N V ¡ /-N V R-III
ll
R-V
donde R-I se selecciona del grupo que consiste en [2-«4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2il)amino)fenilo], [3-«4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-«4ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; R-II es [4-ciclopropil-6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo]; R-III se selecciona del grupo que consiste en [2-«4-ciclopropilpirimidin-2il)amino )fenilo], [3-( (4-ciclopropilpirimidin-2-il)amino )fenilo] y [4-«4ciclopropilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; R-IV se selecciona del grupo que consiste en [6-ciclopropil-2(fenilamino)pirimidin-4-ilo] y [4-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo]; y R-V es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada de 1 a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 10 heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en S, O Y N;
Z es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NHCONH-, -NHCSNH-, -OCONH-, -NHOCO-, -OCSNH-, -SCONH-, -S-, -S-S-, -NH(C=NH)-, -OCO-, -CO-, -CHOH-, -N=N-, -NH-, -NR-, P es un polipéptido natural o sintético de peso molecular mayor de 2000
5 daltons; y n es un número con un valor entre 1 y 500; con la condición de que: a) cuando T es [3-«4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo], el fragmento -L-Z-es diferente de -SCH,CHNH,COO-, -SCH,CHNH,-CO-NH-o
10 -SCH, CH(COOH)NHCO-; b) cuando T es [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo] y L es -CH,-, Z es diferente a -NHCO-; y c) cuando T es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino], L es una cadena hidrocarbonada de 1 a 40 átomos de carbono, lineal o ramificada, saturada o
15 insaturada, con la condición de que dicha cadena hidrocarbonada no
comprende ningún heteroátomo.
El valor de n indica el grado de conjugación, es decir la relación molar entre la fracción derivada del compuesto de fórmula (1) y P, el polipéptido natural o sintético de peso molecular mayor de 2000 daltons en el compuesto de fórmula
20 (11) resultante.
El compuesto de fórmula (11) de la presente invención puede utilizarse como inmunógeno para la producción de anticuerpos o como antígeno de ensayo, junto con un anticuerpo de ciprodinil, para determinar o detectar este fungicida
en una muestra mediante la tecnología de inmunoensayo competitivo.
25 Según una realización preferida, el compuesto de fórmula (11) se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono. Preferentemente, dicha cadena hidrocarbonada lineal comprende entre 2 y 8
átomos de carbono.
Según otra realización preferida adicional, el compuesto de fórmula (11) de la
presente invención se caracteriza porque Z se selecciona del grupo que
consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-/s~O
~N
O
5 Preferentemente, el compuesto de fórmula (11) objeto de la presente invención se caracteriza porque Z es -CONH-.
Según otra realización preferida de la presente invención, el compuesto de fórmula (11) descrito en esta solicitud de patente se caracteriza porque P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, 13
10 galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa. Preferentemente, cuando P es albúmina, es albúmina de huevo o albúmina sérica.
Según otra realización preferida, el compuesto de formula (11) de la presente
invención se caracteriza porque
T es [3-«4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo) o [4-(4-ciclopropil-6
15 metilpirimidin-2-il)amino )fenilo); L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en-CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
/s~O
~N
O P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, f3-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa.
Según una realización aún más preferida, el compuesto de formula (11) de la presente invención se caracteriza porque T es [3-«4-ciclopropil-6-metilpirimidin25 2-il)amino)fenilo) o [4-«4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo); L es una cadena hidrocarbonada lineal de 5 átomos de carbono; Z es -CONH-; P se
selecciona del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor
seleccionado entre 1 y 50.
Según otra realización preferida, el compuesto de formula (11) de la presente
invención se caracteriza porque
Tes [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono;
Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
o
P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, tl-galactosidasa, peroxidasa, fosfalasa y oxidasa.
Según una realización aún más preferida, el compuesto de formula (11) de la presente invención se caracteriza porque T es [6-ciclopropil-2
(fenilamino)pirirnidin-4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos
de carbono; Z es -CONH-; P se selecciona del grupo que consiste en
Según otra realización preferida, el compuesto de formula (11) de la presente
invención se caracteriza porque
T es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono;
Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
;y
P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina,
hemocianina, f3-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa.
Según una realización aún más preferida, el compuesto de formula (11) de la presente invención se caracteriza porque T es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2il)(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de carbono; Z es -CONH-; P se selecciona del grupo que consiste en albúmina y
peroxidasa; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.
Un tercer aspecto de la presente invención describe un compuesto de fórmula (111):
[T-L-Z]m-Q
(111)
caracterizado porque T, L Y Z tienen el mismo significado definido anteriormente para el compuesto de fórmula (11); Q es un marcador no isotópico; y m es un número entero con un valor entero entre 1 y 1000.
En la presente invención se entiende por marcador cualquier molécula o fragmento que dé lugar a una señal medible por cualqUier tipo de técnica analítica. En la presente invención, Q del compuesto de fórmula (111) identifica un fragmento o una molécula química detectora, marcadora o trazadora.
Este compuesto de fórmula (111) puede utilizarse como antigeno de ensayo junto con un anticuerpo de ciprodinil para determinar o detectar este fungicida en una muestra mediante la tecnología de inmunoensayo competitivo.
Según una realización preferida, el compuesto de fórmula (111) se caracteriza porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono. Preferentemente, L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de
carbono.
Según otra realización preferida adicional, el compuesto de fórmula (111) de
la presente invención se caracteriza porque Z se selecciona del grupo que
consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, , S--,-I<° y
O
Preferentemente, el compuesto de fórmula (111) se caracteriza porque Z es -CONH-.
Según otra realización preferida adicional, el compuesto de fórmula (111) de
la presente invención se caracteriza porque Q es biotina, un compuesto
luminiscente, un fluoróforo, un marcador acoplado a un sistema de detección indirecta, micro o nanopartículas u otros.
Preferentemente, Q se selecciona del grupo que consiste en biotina,
f1uoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un
fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro-o nanoparticulas de oro coloidal, de carbón o de látex.
Según otra realización preferida, el compuesto de formula (111) de la presente
invención se caracteriza porque
T es [3-«4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-«4-ciclopropil-6metilpirimidin-2-il)amino)fenilo];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono;
Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -8-,
/ s-,--'(o y ;y
~N
o
cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno
cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro-o nanoparticulas de
oro coloidal, de carbón o de látex.
Según otra realización preferida, el compuesto de formula (111) de la presente
invención se caracteriza porque
Tes [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo];
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, y
Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, f1uoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un f1uoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un f1uoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno
cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro-o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex.
Según otra realización preferida, el compuesto de formula (111) de la presente
invención se caracteriza porque
T es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino);
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1a 20 átomos de carbono;
Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
O
Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, f1uoresceina o uno cualquiera de sus derivados, un f1uoróforo de cianina, un f1uoróforo de rodamina, un f1uoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno
cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro-o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex.
Un cuarto aspecto de la presente invención describe un anticuerpo
generado en respuesta a un compuesto de fórmula (11) tal como se describe en
esta solicitud de patente.
Según una realización preferida de la invención, el compuesto de fórmula (11) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente se
caracteriza porque
T es [3-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-((4-ciclopropil-6metilpirimidin-2-il)amino)fenilo);
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono;
Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
s y
P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina y 10 hemocianina.
Preferentemente, el compuesto de formula (11) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente, se caracteriza porque T es [3((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo) o [4-(4-ciclopropil-6metilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 5
15 átomos de carbono; Z es-CONH-; P es albumina; y n es un valor seleccionado
entre 1 y 50.
Según otra realización preferida adicional de la invención, el compuesto de fórmula (11) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de
patente se caracteriza porque
20 Tes [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
;y
,/8-,-1<0
~N
2S
O
P se selecciona dentro del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina y
hemocianina.
Preferentemente, el compuesto de formula (11) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente, se caracteriza porque T es [6ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo); L es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de carbono; Z es-CONH-; P es albúmina; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.
fórmula (11) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de
patente se caracteriza porque
Tes [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino);
L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono;
Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,
/s~:_ y~N/;Y
O
P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina y
hemocianina.
Preferentemente, el compuesto de formula (11) que genera un anticuerpo tal como se describe en esta solicitud de patente, se caracteriza porque T es [(4ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino); L es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de carbono; Z es -CONH-; P es albúmina; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.
Un quinto aspecto de la presente invención se refiere a un método in vitro de
análisis de ciprodinil en una muestra que comprende las siguientes etapas:
a. poner en contacto una muestra con un anticuerpo generado tal como
se describe en esta solicitud de patente;
b. incubar la muestra y el anticuerpo del paso (a) durante un periodo de tiempo adecuado para que tenga lugar una reacción inmunoquimica; y
,.
c. determinar la existencia de reacción inmunoquímica tras la incubación del paso (b).
El método de la presente invención pennite la detenninación cuantitativa o análisis cualitativo del contenido del fungicida ciprodinil en una muestra.
Según una realización preferida, la detenninación de la reacción inmunoquímica en el paso (e) se realiza mediante un inmunoensayo competitivo, usando como competidor un antlgeno de ensayo que es un compuesto de fórmula (11) tal como se describe en esta solicitud de patente. Preferentemente, el inmunoensayo competitivo es de tipo EUSA.
Según otra realización preferida, la determinación de la reacción inmunoquímica en el paso (e) se realiza mediante un inmunoensayo competitivo, usando como competidor un antígeno de ensayo que es un compuesto de fórmula (111) tal como se describe en esta solicitud de patente. Preferentemente, el inmunoensayo competitivo es de tipo EUSA.
El ténnino inmunoensayo hace referencia a un ensayo analitico en el que ocurre una reacción inmunoquímica para la detección o cuantificación de un analito. Los inmunoensayos competitivos son aquellos en los que el analito compite con el antfgeno de ensayo por la unión con el anticuerpo.
El término antígeno en esta solicitud de patente se refiere a una molécula capaz de interaccionar especificamente con un anticuerpo. La interacción o reacción inmunoquímica consiste en la unión específica y no covalente entre un anticuerpo y un antígeno, pudiendo ser éste el analito o un antígeno de ensayo. En la presente memoria el término antígeno de ensayo, antígeno enzimático o trazador se refiere a un compuesto de fónnula (1) acoplado a una molécula portadora o marcadora que se utiliza en el ensayo competitivo.
Un sexto aspecto de la presente invención también se refiere a un kit de detección de ciprodinil que utiliza al menos un anticuerpo generado tal como se describe en esta solicitud de patente. Adicionalmente, el kit de detección de ciprodinil puede comprender un antigeno de ensayo que es un compuesto de fórmula (11) o un compuesto de fórmula (111) tal como se describen en la presente solicitud de patente.
El compuesto de fórmula (11) de la presente invención se puede obtener por un procedimiento que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (1) con P, un polipéptido natural o sintético de peso molecular mayor a 2000 daltons, por métodos ampliamente conocidos en la técnica.
El procedimiento de obtención del compuesto de fórmula (11) también puede comprender, de ser necesario, una etapa adicional de activación del grupo funcional Y.
Por otro lado, el compuesto de fórmula (111) de la presente invención se
puede obtener por un procedimiento que comprende hacer reaccionar un
compuesto de fórmula (1) con Q, un marcador quimico no isotópico, por métodos ampliamente conocidos en la técnica.
El procedimiento de obtención del compuesto de fórmula (111) también puede comprender, de ser necesario, una etapa adicional de activación del grupo funcional Y.
Cuando el compuesto de fórmula (1) se caracteriza porque Y es un grupo
carboxílico, la activación mencionada anteriormente puede tener lugar
haciendo reaccionar el compuesto de fórmula (1) con N,N'
disuccinimidilcarbonato. Este procedimiento de activación puede tener lugar en
un disolvente orgánico como por ejemplo acetonitrilo, propanonitrilo, diclorometano, cloroformo, tetrahidrofurano, benceno o tolueno; en presencia de una base como por ejemplotrietilamina, triisopropilamina, piridina, 4-N,Ndimetilaminopiridina, picolina o diazo(1,3)biciclo-[5.4.0]undecano; en un intervalo de temperatura entre O y 30 oC.
Así mismo, la obtención de anticuerpos a partir de compuestos de fórmula
(II) también puede tener lugar por métodos de inmunización ampliamente
conocidos en la técnica.
Los términos inmunógeno e inmunogénico tal como se utilizan en la presente
5 invención se refieren a una sustancia que es reconocida como extraña al organismo vivo y por lo tanto es capaz de producir o de generar una respuesta inmune en un huésped.
El término anticuerpo se refiere a una molécula que presenta afinidad de unión específica para el ana lito, excluyendo esencialmente otras sustancias no 10 relacionadas. El término incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos
monoclonales, anticuerpos recombinantes y fragmentos de anticuerpo.
El término analito se refiere a una sustancia o grupo de sustancias cuya presencia o concentración se quiere determinar en la muestra. En el caso de la
presente invención, el analito es el fungicida ciprodinil.
15 A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas
y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y
en parte de la práctica de la invención.
20 Para preparar anticuerpos frente a ciprodinil se requiere la preparación de derivados funcional izados de dicho fungicida, es decir, análogos estructurales de ciprodinil que incorporan un grupo funcional susceptible de ser utilizado para la conjugación a un portador P o marcador Q. Este grupo funcional está separado del esqueleto de la molécula de ciprodinil por un espaciador L. La
25 posición de incorporación del grupo funcional a la estructura de ciprodinil para la conjugación no es un aspecto obvio y puede ser detemninante para la viabilidad de los inmunógenos como inductores de la producción de anticuerpos de afinidad y selectividad adecuadas frente a ciprodinil e incluso de conjugados de ensayo que permitan el desarrollo de un inmunoensayo sensible y específico para dicho fungicida, objeto último de la presente invención.
A continuación se ilustra con algunos ejemplos y dibujos la forma en que puede efectuarse la preparación de varios derivados de ciprodinil que son 5 compuestos de fórmula (1) y los correspondientes compuestos de fórmula (11)
inmunogénicos, que no pretenden que sean limitativos de la presente invención, y que sirven para mostrar no solo la forma en que puede efectuarse
la preparación de los mismos sino también la importancia que puede tener la naturaleza estructural del ínmunógeno para la producción de anticuerpos de 10 afinidad adecuada hacía el analito, aptos para el desarrollo de un buen
inmunoensayo.
Figura 1. Esquema de la síntesis del compuesto de fórmula (1) CDm6.
Figura 2. Esquema de la síntesis del compuesto de fórmula (1) CDp6.
15 Figura 3. Esquema de la síntesis del compuesto de fórmula (1) CDb5.
Figura 4. Esquema de la síntesis del compuesto de fórmula (1) CDn5.
Figura 5. Esquema de la preparación de un compuesto de fórmula (11) a partir del correspondiente compuesto de fórmula (1).
Figura 6. Señales obtenidas frente a 0.1 ~g de compuesto de fórmula (11) 20 antigénico homólogo inmovilizado con los antisueros anti-ciprodinil a diluciones de lxl0· (negro), 3xl0' (gris claro) y l xl0' (gris oscuro).
Figura 7. Curvas estándar para ciprodinil en diferentes formatos de ELlSA competitivo.
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados
por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad de los compuestos de fónnula (11) como inmunógenos para la obtención de
anticuerpos anti-ciprodinil. En los siguientes ejemplos los números en negrita hacen referencia a la correspondiente estructura que se muestra en los
esquemas de las Figuras 1 a 4. Estos ejemplos se presentan a modo de
demostración pero de ningún modo pueden suponer un límite a la invención.
1. Preparación de compuestos de fórmula (11)
1.1. Sintesis de compuestos de fórmula (1)
Ejemplo 1. Sin tesis de COm6 [radical del tipo T= R-I)
La sintesis del compuesto COm6 (5) se describe en la Figura 1 e implica la
elaboración del anillo de pirimidina a través de una reacción de condensación
en medio básico de la 1-ciclopropilbutano-l ,3·diona (1) con una aril-guanidina, tal como 3, que incorpora la cadena hidrocarbonada de seis átomos de carbono que constituye el espaciador en la posición adecuada del anillo fenilico. Esta aril-guanidina se prepara previamente en fonna de nitrato por reacción del éster metilico del ácido 6-(3-aminofenil)hexanóico (E. Moreauet al., Bioorg. Med. Chem. 2008, 16, 1206-1217) con cianamida en medio etanólico ácido. La slntesis del compuesto COm6 (5) se completa mediante una reacción de hidrólisis del éster metllico obtenido (4) en medio básico. A continuación se
ilustran los detalles de la preparación y caracterización de este compuesto de
fórmula (1) y los intermedios de su sintesis.
i) Preparación del nitrato de 6-(3-guanidinofenil)hexanoato de metilo(3).
Una mezcla de 6-(3-aminofenil)hexanoato de metilo (2, 188 mg, 0.850 mmol), disolución acuosa de cianamida al 50% (132 ~L, 1.70 mmol, 2 equiv.) y HNO, concentrado (70% plv, 84 ~L, 1.13 mmol, 1.3 equiv.) en EtOH (1 .6 mL) se introdujo en una ampolla topacio bajo nitrógeno. La ampolla se cerró a vacío y se calentó con agitación a 78 oC durante toda la noche. El contenido de la ampolla se transfirió a un matraz con la ayuda de EtOH, se concentró a sequedad bajo vacio y el residuo se purificó por cromatografia, usando CHCI,-MeOH 9:1 como eluyente, para dar el nitrato de la arilguanidina 3 (242 mg, 87%). 'H NMR (300 MHz, CDC!,) ~ (ppm) 9.62 (1 H, s, NH-C(NH)-NH,), 7.92 (2H, s ancho, NH-C(NH)-NH,), 6.60 (1 H, s ancho, NH-C(NH)-NH,), 7.33 (1 H, dd , J = 8.0, 8.0 Hz, H-5 Ph), 7.14 (IH, d, J = 7.5 Hz, H-4 Ph), 7.07 (2H, m, H-2 y H-6 Ph), 3.64 (3H, s, CO,Me), 2.62 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-6), 2.30 (2H, t, J =
7.4 Hz, H-2), 1.64 (4H, m, H-3 y H-5), 1.35 (2H, m, H-4); RMN de 13C (75 MHz, CDCI,) ~ (ppm) 174.3 (CO,Me), 156.4 (NH-C(NH)-NH,), 145.1 (C-3 Ph), 134.0 (C-l Ph), 130.0 (C-5 Ph), 128.0 (C-4 Ph), 125.2 (C-6 Ph), 122.5 (C-2 Ph), 51 .5 (CO,Me), 35.3 (C-6), 33.8 (C-2), 30.6 (C-3), 28.5 (C-5), 24.5 (C-4); IR (NaCI) vma,/cm-' 3338, 3200, 2940, 1724, 1674, 1600, 1352, 1267, 736; EM (IE)mlz (%) 263 (M·, 100), 262 (13), 246 (4), 233 (3), 232 (18), 221 (17), 190 (5), 170 (12), 148 (8), 132 (38); EMAR miz calculado para C14H21N,O, 263.16338, encontrado 263.16271 .
ii) Preparación del 6-(3-«4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenil)hexanoato de metilo (4).
Una mezcla del nitrato de arilguanidina 3 (143.1 mg, 0.438 mmol), 1ciclopropilbutano-l,3-diona (1,110.5 mg, 0.876 mmol, 3 equiv.), Na,CO, (23.2 mg, 0.219 mmol, 0.5 equiv.) y MeOH (1 mL) contenida en una ampolla de vidrio cerrada a vacio se calentó con agitación a 78°C durante 48 h. La ampolla se abrió y el disolvente se evaporó a presión reducida para dar un residuo que fue purificado por cromatografia de columna, usando CHC!, como eluyente, para obtener el derivado pirimidinico 4 (96.5 mg, 62%) como un aceite. RMN de 'H (300 MHz, CDC!,) ~ (ppm) 7.50 (1 H, dd, J = 1.6, 1.6 Hz, H-2 Ph), 7.39 (1 H, ddd, J= 7.7,1.8,1.6 Hz, H-4 Ph), 7.19 (IH, dd, J= 7.7, 7.7 Hz, H-5 Ph), 6.96 (IH, s ancho, H-NH), 6.80 (IH, ddd, J = 7.7, 1.6, 1.6 Hz, H-6 Ph), 6.51 (IH, s, H-5 Pirim), 3.66 (3H, s, CO,Me), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-6), 2.34 (3H, s, Me), 2.31
(2H, t, J ~ 7.7 Hz, H-2), 1.85 (lH, m, CH-ciclopropilo), 1.67 (4H, m, H-3 yH-5),
1.39 (2H, m, H-4), 1.15 Y 0.99 (2H cada uno m, CH,CH,-ciclopropilo); RMN de 13C (75 MHz, CDCI3) ~ (ppm) 174.2 (CO,Me), 172.4 (C-2 Pirim), 166.6 (C-6 Pirim), 159.8 (C-4 Pirim), 143.1 (C-3 Ph), 140.1 (C-1 Ph), 128.6 (C-5 Ph), 121.9 5 (C-4 Ph), 118.6 (C-6 Ph), 116.0 (C-2 Ph), 110.0 (C-5 Pirim), 51 .4 (CO,Me), 35.9 (C-6), 34.0 (C-2), 31 .0 (C-3), 28.7 (C-5), 24.8 (C-4), 23.8 (Me), 16.8 (CH-ciclopropilo), 10.3 (CH, CH,-cic1opropilo); IR (NaCI) vm.,Icm-' 3356, 3009, 2932,2850, 1736, 1588,1541, 1445, 1171, 789,695; EM (IE)m/z (%) 353 (M', 97), 352 (28), 323 (49), 322 (15), 294 (12), 280 (17), 266 (11), 252 (51), 250
10 (87), 240 (17), 239 (100), 238 (23), 221 (20); EMAR miz calculado para C2 ,H" N302 353.21033, encontrado 353.21022.
iii) Preparación del ácido 6-(3-((4-cic/opropil-6-metilpyrimidin-2-il)amino)fenil) hexanoico (5, compuesto CDm6).
Una mezcla del éster metílico 4 (82.3 mg, 0.233 mmol) en una mezcla de
15 MeOH (2 mL) y una disolución acuosa 2M de NaOH (0.47 mL, 0.932 mmol, 4 equiv.) se calentó a reflujo con agitación durante 2 h. Después de eliminar el disolvente a presión reducida, el residuo sólido obtenido se disolvió en la mlnima cantidad de ácido fórmico y la disolución resultante se agitó a la vez que se añadía agua, gota a gota, hasta la aparicíón de un sólido blanco. La
20 suspensión blanquecina se dejo enfriando en la nevera durante varias horas y
se filtró. Los cristales se lavaron con agua fría y se secaron durante toda la
noche en un desecador a vacío, para obtener el compuesto CDm6 (5, 57.7 mg, 73%) como un sólido, prácticamente puro por análisis de 'H RMN . PI. 170-173 oC (cristalizado de DMSO-H, O); 'H NMR (300 MHz, DMSO-d.) ~ (ppm) 11.98 25 (1 H, s ancho, CO,H), 9.26 (lH, s, NH), 7.69 (lH, s ancho, H-2 Ph), 7.45 (lH, d ancho, J= 8.0 Hz, H-4 Ph), 7.11 (lH, dd, J~ 7.7, 7.7 Hz, H-5 Ph), 6.71 (lH, d ancho, J = 7.7 Hz, H-6 Ph), 6.66 (lH, s, H-5 Pirim), 2.28 (3H, s, Me), 2.56 (2H, t, J =7.5 Hz, H-6), 2.20 (2H, t, J ~ 7.3 Hz, H-2), 1.94 (lH, m, CH-ciclopropilo),
1.56 (4H, m, H-3 yH-5), 1.31 (2H, m, H-4), 1.01 (4H, m, CH,CH,-ciclopropilo); 30 13C NMR (75 MHz, DMSO-d.) ~ (ppm) 174.4 (CO,H), 171.4 (C-2 Pirim), 166.2
(C-6 Pirim), 159.8 (C-4 Pirim), 142.1 (C-3 Ph), 140.8 (C-l Ph), 128.1 (C-5 Ph),
120.9 (C-4 Ph), 118.2 (C-6 Ph), 115.8 (C-2 Ph), 109.4 (C-5 Pirim), 35.3 (C-6),
33.5 (C-2), 30.5 (C-5), 28.2 (C-4), 24.3 (C-3), 23.3 (Me), 16.2 (CH-ciclopropilo),
9.8 (CH,CH,-ciclopropilo); IR (KSr) vm.,lcm-' 3292, 3213, 3101, 3014, 2932, 2853, 1700, 1633, 1604, 1558, 1487, 1452, 1404, 1264,960, 784; EMAR (TOF EM ES+) miz calculado para C20H25N30,Na[M+Naj' 362.18445, encontrado 362.18380.
Ejemplo 2. Síntesis de COp6 (9) [radical del tipo T= R-I]
La síntesis del compuesto COp6 (9) se descríbe en la Figura 2. Su síntesís parte de la l-ciclopropilbutano-l ,3-diona (1) e implica una secuencia de transformaciones idéntica a la descrita en el ejemplo 1 para la preparación del compuesto COm6 (5), pero utilizando en este caso la aril-guanidina 7, preparada a partir de la reacción del éster metílico del ácido 6-(4-aminofenil)hexanóico (6) (C. Suárez-Pantale6n et al., J.Agric. FoodChem. 2008, 56, 11122-11131) con cianamida en medio etanólico ácido.
A continuación se ilustran los detalles de la preparación y caracterización de este compuesto de fórmula (1) y los intermedios de su síntesis.
i) Preparación del nitrato de 6-(4-guanidinofenil)hexanoato de metilo (7)
Una mezcla de 6-(4-aminofenil)hexanoato de metilo (6, 115 mg, 0.515 mmol), disolución acuosa al 50% de cianamida (75 IlL, 0.780 mmol, 1.5 equiv.) y HN03 concentrado (70% p/v, 40 IlL, 0.517 mmol, 1 equiv.) en EtOH (1 mL) se calentó en una ampolla cerrada con agitación a 78 OC por 22 h. El contenido de la ampolla se concentró a vacío y el aceile anaranjado obtenido se purificó por cromatografía de columna sobre gel de silice, usando CHCI3-MeOH 9:1 como eluyente, para obtener la aril-guanidina 7 (134.5 mg, 79%), en forma de nitrato, como un sólido blanco. Pf 119-121 oC (cristalizado de CHCI3-EtOAc); RMN de 'H (300 MHz, COCI,) ¡; (ppm) 9.54 (1 H, s, NH-C(NH)-NH, ), 7.80 (3H, sa, NH-C(NH)-NH2), 7.20 (2H , aparente d, parte AA' de un sistema AA'SS', J = 8.1 Hz, H-2/H-6 Ph), 7.13 (2H, aparente d, parte SS' de un sistema AA'SS', J = 8.1
- Hz, H-3/H-5 Ph), 3.64 (3H, s, CO,Me), 2.60 (2H, 1, J = 7.5 Hz, H-6), 2.28 (2H, 1,
- J = 7.5 Hz, H-2), 1.61 (4H, m, H-3 y H-5), 1.34 (2H, m, H-4); RMN de 13C (75
- MHz, CDCh) (j (ppm) 174.1 (CO,Me), 156.6 (NH-C(NH)-NH, ), 142.7 (C-l Ph),
- 131 .6 (C-4 Ph), 130.1 (C-2/C-6 Ph), 125.5 (C-3/C-5 Ph), 51 .5 (CO, Me), 35.1
- 5
- (C-6), 33.8 (C-2), 30.8 (C-3), 28.5 (C-5), 24.6 (C-4); EM (IE)m/z (%) 263(M', 8),
- 247 (1), 246 (7), 221 (10), 170 (25), 148 (15),132 (10), 131 (59), 106 (26), 106
- (100); EMAR miz calculado para C,.H21 N30, 263.16338, encontrado
- 263.16446.
- ¡j) Preparación del 6-(4-((4-cic/opropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenil)
- 1 O
- hexanoato de metilo (8)
- Una mezcla de la arilguanidina 7 (116 mg, 0.355 mmol), 1-ciclopropilbutano
- 1,3-diona (1 , 134.5 mg, 1.066 mmol, 3 equiv.), Na,C03 (18.8 mg, 0.177 mmol,
- 0.5 equiv.) y MeOH (1 mL) contenida en una ampolla cerrada a vacío se
- calentó con agitación a 78 oC durante 50 h. El contenido de la ampolla se
- 15
- concentró a presión reducida y se cromatografió en gel de sHice, usando CHCI3
- como eluyente, para obtener el derivado pirimidilico 8 (95 mg, 76%) como un
- aceite viscoso. RMN de 'H (300 MHz, CDCh) (j (ppm) 7.51 (2H, aparente d,
- parte AA' de un sistema AA'BB', J =8.4 Hz, H-3/H-5 Ph), 7.09 (2H, aparente d,
- parte BB' de un sistema AA'BB', J = 8.4 Hz, H-2/H-6 Ph) , 6.94 (lH, sa, H-NH),
- 20
- 6.48 (lH, s, H-5 Pirim), 3.66 (3H, s, CO,Me), 2.56 (2H, t, J =7.5 Hz, H-6), 2.30
- (2H , t, J =7.6 Hz, H-2), 1.84 (IH, m, CH-ciclopropilo), 1.62 (4H, m, H-3 yH-5),
- 1.36 (2H, m, H-4), 1.13 Y 0.98 (2H cada uno, cada uno m, CH,CH,-ciclopropilo);
- RMN de 13C (75 MHz, CDCh) (j (ppm) 174.2 (CO,Me), 172.4 (C-2 Pirim), 166.5
- (C-6 Pirim), 159.9 (C-4 Pirim), 137.8 (C-l Ph), 135.8 (C-4 Ph), 128.6 (C-2/C-6
- 25
- Ph), 118.6 (C-3/C-5 Ph), 109.7 (C-5 Pirim), 51.4 (CO,Me) , 35.0 (C-6), 34.0 (C
- 2), 31.1 (C-3), 28.7 (C-5), 24.8 (C-4), 23.8 (Me), 16.8 (CH-ciclopropilo), 10.2
- (CH,CH,-ciclopropilo); IR (KBr) vm"/cm-' 3361,3273,3192,3008, 2930,2855,
- 1736, 1595, 1530, 1463, 1405, 1364, 1290, 1248, 959, 818, 757; EM (IE)m/z
- (%) 353 (M', 81), 352 (12), 323 (2), 322 (7), 252 (5), 239 (21), 238 (lOO), 221
(6), 187 (6), 106 (58); EMAR miz calculado para C21H27N30, 353.21033, encontrado 353.21057.
Hi) Preparación del ácido 6-(4-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenil) hexanoico (9, compuesto CDp6)
Una disolución del éster metílico 8 (128.5 mg, 0.364 mmol) en una mezcla de MeOH (4 mL) y NaOH acuoso 2M (0.73 mL, 1.46 mmol, 4 equiv.) se agitó a 60 oC durante 2.5 h. La mezcla de reacción amarillenta formada se transfirió a un matraz y la mayoría del disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo pardusco semisólido obtenido se disolvió en ácido fórmico (aproximadamente
0.5 mL), se diluyó con agua y se extrajo con CHCI,. Los extractos orgánicos
reunidos se lavaron con disolución saturada de NaCI y se secaron sobre
MgSO, anhidro. La filtración y evaporación del disolvente a vacío proporcionó el compuesto COp6 (9, 104.5 mg, 85%) como un sólido blanco y que por análisis de RMN de 'H y cromatografía de capa fina mostró ser prácticamente puro. Pf 146-147 oC (cristalizado deMeOH); 'H RMN de (300 MHz, OMSO-d6) Ii (ppm) 11.97 (1 H, s, COOH), 9.22 (1 H, s, NH), 7.62 (2H, aparente d, parte AA' de un sistema AA'SS', J =8.5 Hz, H-3/H-5 Ph), 7.04 (2H, aparente d, parte SS' de un sistema AA'SS', J = 8.5 Hz, H-2/H-6 Ph), 6.62 (1 H, s, H-5 Pirim), 2.48 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-6), 2.19 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-2), 1.92 (1 H, m, CHciclopropílo), 1.52 (4H, m, H-3 yH-5), 1.27 (2H, m, H-4), 0.99 (4H, m, CH,CH,ciclopropilo); 13C RMN de (75 MHz, OMSO-d.) Ii (ppm) 174.4 (CO,Me), 171.4 (C-2 Pirim), 166.1 (C-6 Pirim), 159.8 (C-4 Pirim), 138.6 (C-l Ph), 134.4(C-4 Ph),
128.0 (C-2/C-6 Ph), 118.4 (C-3/C-5 Ph), 109.0 (C-5 Pirim), 34.3 (C-6), 33.5 (C2), 30.8 (C-5), 28.1 (C-4), 24.3 (C-3), 23.3 (Me), 16.3 (CH-ciclopropilo), 9.8 (CH,CH,-ciclopropilo); IR (KSr) vm.,1cm-' 3306, 3209, 3006, 2968, 2928, 2848, 1684, 1592, 1559, 1517, 1406, 964, 807; EM (IE)mlz (%) 339 (M+, 75), 338 (12), 252 (6), 250 (2), 240 (2), 239 (20), 238 (100), 237 (2), 236 (2), 224 (2), 222 (2), 131 (4); EMAR miz calculado para C20H25N30, 339.19468, encontrado 339.19430.
Ejemplo 3. Sintesis de CDb5 (18) [radical del tipo T= R-IV]
La slntesis del compuesto de fórmula (1) que incorpora el espaciador por el anílio de pirimidina se basa en la preparación previa de un compuesto 1,3
dicarbonílico que incorpora en la posición adecuada la cadena hidrocarbonada
carboxilada que constituye el espaciador del compuesto de fórmula (1) en cuestión. Una vez preparado este intermedio se completa la elaboración del
anillo de pirimidina a través de una reacción de condensación de los grupos carbonilo con los grupos amino de la fenilguanidina. Tal como se ilustra en la Figura 3, la preparación del compuesto 1,3-dicarbonilico (15) se lleva a cabo a través de la reacción de acilación del 3-ciclopropil-3-oxopropanoato de alilo (12), obtenido vía condensación de Claisen de la ciclopropilmetilcetona (10) con carbonato de dialilo (11) en medio básico, con el 6-cloro-6-oxohexanoato de metilo (13), seguido de reacción de desalilación-descarboxilativa catalizada por Pd(O). La condensación de la 1,3-dicetona (15), que existe en un equilibrio
tautomérico en el que básicamente predomina la forma enólica, con el nitrato
de la fenilguanidina (16) en medio básico genera el esqueleto completo del hapteno cuya sintesis finaliza con la hidrólisis del éster metílico de (17) en medio básico acuoso. A continuación se ilustran los detalles de la preparación y caracterización de este compuesto (18) y todos los intermedios de su sintesis.
i) Preparación deI3-ciclopropil-3-oxopropanoafo de alilo (12)
Carbonato de dialilo (11, 1.0 g, 2.55 mL, 17.82 mmol, 1.5 equiv.) y 1-ciclopropiletanona (10, 1.17 mL, 11.88 mmol, 1 equiv.) se añadieron sucesivamente a una suspensión agitada de HNa (dispersión al 60% en aceite mineral, 1.19 g, 29.75 mmol, 2.5 equiv.) en benceno anhidro (5 mL) a temperatura ambiente bajo nitrógeno y la mezcla se refluyó durante 5 h. La mezcla de reacción se enfrió a O oC, se trató cuidadosamente con disolución acuosa de HCI 3 M hasta pH ácido y se extrajo con CH,CI,. Los extractos orgánicos se lavaron con disolución saturada de NaCI, se secaron con MgS04 anhidro y se concentraron a sequedad. El residuo obtenido se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, usando hexano-Et,O 9: 1 como eluyente, para proporcionar el {l-cetoéster 12 (1 .36 g, 60%) como un aceite. RMN de 'H (CDCI,) li (ppm) 5.88 (1H , ddt, J =17.2, 10.4, 5.7 Hz, H-2 alilo), 5.32 (1H, ddt, J = 17.2, 1.5, 1.5 Hz, H-3 alilo), 5.23 (1 H, ddt, J = 10.4, 1.5, 1.4 Hz, H'-3 alilo),
4.62 (2H, dt, J = 5.7, 1.4 Hz, H-1 alilo), 3.58 (2H, s, H-2), 2.02 (lH, 11, J = 4.5,
4.4 Hz, CH-ciclopropilo), 1.09 y 0.95 (2H cada uno, cada uno m, CH,CH,ciclopropilo); RMN de 13C (CDCI,) li (ppm) 202.4 (C-1), 166.6 (C-3), 131.5 (C-2 alilo), 118.4 (C-3 alilo), 65.6 (C-l alilo), 49.6 (C-2), 20.6 (CH-ciclopropilo), 11.5 (CH,CH,-ciclopropilo); IR (NaCI) vm~/cm-'3088, 3012, 2943, 1736, 1707, 1649, 1442, 1385, 1312, 1271 , 1151,1074,992, 933,735.
ii) Preparación del (E)-2-(cic/opropanocarbonil)-3-hidroxioct-2-enodioato de l-alil-B-metilo (14)
El {3-cetoéster 12 (288.3 mg, 1.5 mmol) se añadió sobre una suspensión agitada de MgCl, (142.8 mg, 1.5 mmol) en CH,CI, seco (2 mL) a temperatura ambiente bajo nitrógeno. La mezcla de reacción se enfrió a O oC, se añadió piridina seca (243 ~L, 3 mmol) y la mezcla resultante se agitó a esta temperatura durante 15 mino A continuación se añadió cloruro de adipoilo (13, 234 ~L, 1.5 mmol) y se agitó a O oC durante 15 min y luego a temperatura ambiente durante 1 h. Después de adicionar HCI 6 M (3 mL) a la suspensión blanquecina formada, la mezcla se extrajo con Et,O, los extractos orgánicos se lavaron con disolución saturada de NaCI y se secaron sobre MgSO. anhidro. La purificación cromatográfica del residuo obtenido, utilizando hexano-EtOAc
9: 1 como eluyente, proporcionó un aceite amarillento correspondiente a la
,B-dicetona esperada, la cual existe exclusivamente en la forma tautomérica ceto-enólica 14 (457.5 mg, 98%). RMN de 'H (CDCI,) li (ppm) 5.98 (lH, ddl, J =17.2, 10.4, 5.9 Hz, H-2 alilo), 5.32 (lH, ddt, J = 17.2, 1.5, 1.5 Hz, H-3 alilo),
5.23 (lH, ddt, J = 10.4, 1.3, 1.3 Hz, H'-3 alilo), 4.72 (2H, dt, J= 5.9, 1.3 Hz, H-1 alilo), 2.60 (2H, m, H-7), 2.31 (3H, m, H4yCH-ciclopropilo), 1.66 (4H, m, H5yH-6), 1.22 yO.99 (2H cada uno, cada uno m, CH,CH,-ciclopropilo). RMN de 13C (CDCI,) li (ppm) 199.2 (CO-ciclopropilo), 195.0 (C-3), 173.8 (CO,Me), 167.4 (C-1), 131.7 (C-2 alilo), 119.1 (C-3 alilo), 108.6 (C-2), 65.7 (C-l alilo), 51 .5
(CO,Me), 36.6 (C-4), 33.7 (C-7), 25.4 (C-6), 24.5 (C-5), 16.6 (CH-ciclopropilo),
12.1 (CH,CH,-ciclopropilo); IR (NaCI) vm""/cm-'3087 , 3014, 2952, 2873, 1735, 1560, 1437, 1271,1208,1101, 1062, 936, 737; EM (lE) mlz(%) 310 (M', 0.7), 282 (0.6), 252 (1), 253 (0.5), 251 (0.4),226 (2.5), 220 (0.4), 195 (4), 143 (604),
5 126 (10), 111 (30),69 (100); EMAR mIz calculado para C,. H" O. 310.14164, encontrado 310.14148.
iii) Preparación de (Z)-B-ciclopropil-6-hidroxi-B-oxooct-6-enoato de metilo (15)
Sobre una disolución del éster aUlico 14 (431 mg, 1.388 mm 01) en THF (5.8 mL) se añadieron Pd(PPh3). (105.6 mg, 0.091 mmol, 0.06 equiv.) y morfolina 10 (254 ~L, 2.916 mmol, 2 equiv.) gota a gota. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó a esta temperatura durante 40 mino El disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografia sobre gel de silice, usando hexano-Et,O 9:1 como eluyente, para dar el ceto-enol15 (285.8 mg, 91%), que existe en equilibrio con
15 la forma tautomérica 6,8-dicet6nica [aproximadamente una mezcla 4: 1 de la forma ceto-enol 15 y el tautómero 6,8-dicetónico]. RMN de 'H (CDCI3) 6 (ppm)
15.63 (0.8H, s, OH, forma ceto-enol), 5.60 (0.8H, s, H-7 forma ceto-enol), 3.67 (3H, s, CO,Me formas ceto-enol + diceto), 3.66 (O.4H, s, H-7 forma diceto), 2.51 (OAH, m, H-5 forma ceto), 2.34 (2H, t, J = 7.1 Hz, H-2 formas ceto-enot + 20 diceto), 2.26 (1 .6H, t, J = 7.1 Hz, H-5 forma ceto-enol), 2.0 (0.2H, m, CHciclopropilo forma diceto), 1.55-1.51 (4.8H, m, H-3 y H-4 formas ceto-enot + diceto y CH-ciclopropilo forma ceto-enol), 1.09 yO.92 (2H cada uno, cada uno m, CH,CH, -ciclopropilo formas ceto-enol + diceto); RMN de 13C (CDCI,) (solo se dan las señales del tautómero ceto-enol mayoritario 15) 6 (ppm) 199.0 (C-8),
25 187.3 (C-6), 173.7 (CO,Me), 98.8 (C-7), 51.5 (CO,Me) 36.3 (C-5), 33.6 (C-2),
25.3 (C-3), 24.3 (C-4) , 18.5 (CH-ciclopropilo), 10.2 (CH, CH,-ciclopropilo); IR (NaCI) vm"/cm-' 3008, 2945, 2863, 1735,1609, 1440, 1377,932, 777.
iv) Preparación de 5-(6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-il)pentanoato de metilo (17)
Una mezcla del nitrato de la fenilguanidina 16 (289.1 mg, 1.459 mmol, 1.6 equiv.), Na,CO, (76.3 mg, 0.72 mmol, 0.8 equiv.) y el ceto-enol 15 (203.6 mg,
0.90 mmol) en MeOH (2.5 ml) se calentó a 80 oC con agitación en una ampolla cerrada durante 24 h. la mezcla de reacción se vertió sobre agua y se extrajo
5 con EtOAc. los extractos orgánicos se lavaron con disolución acuosa saturada de NaCl, se secó sobre Na,S04 anhidro y se concentraron para dar un residuo aceitoso que se purificó cromatográficamente sobre gel de sílice, usando hexan~tOAc 9: 1 como eluyente, proporcionando el derivado pirimidinico 17
(231.3 mg, 79%) como un aceite. RMN de 'H (CDCI,) 1i (ppm) 7.62 (2H, 10 aparente dd, parte AA' de un sistema AA'SS'C, J= 7.5, 0.9 Hz, H-2/H-6 Ph),
7.30 (2H, aparente t, parte SS' de un sistema AA'SS'C, J =7.5 Hz, H-3/H-5 Ph),
7.01 (lH, sa, NH), 6.97 (1 H, aparente ti, parte C de un sistema AA'SS'C, J = 7.5,0.9 Hz, H-4 Ph), 6.49 (lH, s, H-5 Pirim), 3.67 (3H, s, CO,Me), 2.59 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-5), 2.36 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-2), 1.86 (lH, m, CH-ciclopropilo), 1.72
15 (4H, m, H-3 yH-4), 1.15 Y 0.98 (2H cada uno, cada uno m, CH,CH,ciclopropilo); RMN de 13C (CDCI,) 1i (ppm) 173.9 (CO,Me), 172.5 (C-4 Pirim),
169.8 (C-2 Pirim), 159.8 (C-6 Pirim), 140.1 (C-l Ph), 128.7 (C-3/C-5 Ph), 121.6 (C-4 Ph), 118.4 (C-2/C-6 Ph), 109.5 (C-5 Pirim), 51 .5 (CO,Me), 37.1 (C-5), 33.8 (C-2), 27.9 (C-4), 24.5 (C-3), 16.8 (CH-ciclopropilo), 10.3 (CH,CH,-ciclopropilo);
20 IR (NaCI)vm"/cm-'3356, 3002, 2939, 2856, 1730, 1584,1443, 1249,1026,754; EM (lE) mlz(%) 325 (M', 17), 324 (4), 295 (2), 294 (8), 266 (4), 252 (13), 226 (16), 225 (100), 224 (11), 178 (3); EMAR miz calculado para C'9H23N30, 325.17903, encontrado 325.17933.
v) Preparación del ácido 5-(6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-il) pentanoico 25 (18, compuesto de fórmula (1) CDb5)
Una disolución del éster metllico 17 (159 mg, 0.488 mmol) en una mezcla de MeOH (5.3 ml) y disolución acuosa de NaOH 2 M (0.98 ml, 1.96 mmol, 4 equiv.) se agitó a 60 oC durante 1.5 h. la mayor parte del disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo resultante se disolvió en la mlnima cantidad de
30 ácido fórmico y la disolución resultante se concentró de nuevo a vacío. El
residuo sólido blanco obtenido se purificó por cromatografia sobre gel de silice, usando CHCh-EtOAc 9: 1 como eluyente, para dar el compuesto CDb5 (18,
129.3 mg, 85%) como un sólido blanco, prácticamente puro por análisis de RMN de 'H y cromatografía de capa fina. Pf 158-160 oC (cristalizado de benceno); RMN de 'H (DMSO-d,) Ó (ppm) 12.02 (1 H, s, COOH), 9.32 (1 H, s, NH), 7.74 (2H, aparente dd, parte AA' de un sistema AA'SS'C, J: 7.7, 0.9 Hz, H-2/H-6 Ph), 7.23 (2H, aparente t, parte SS' de un sistema AA'SS'C, J: 7.7 Hz, H-3/H-5 Ph), 6.88 (IH, aparente 11, parte C de un sistema AA'SS'C, J: 7.3, 0.9 Hz, H-4 Ph), 6.67 (IH, s, H-5 Pirim), 2.54 (2H, t, J: 7.3 Hz, H-5), 2.25 (2H, t, J : 7.2 Hz, H-2), 1.95 (IH, m, CH-ciclopropilo), 1.67 (2H, m, H-4), 1.54 (2H, m, H-3), 1.03-0.97 (4H , m, CH,CH,-ciclopropilo); RMN de 13C (DMSO-d.) ó (ppm)
174.3 (CO,H), 171.6 (C-4 Pirim), 169.7 (C-2 Pirim), 159.8 (C-6 Pirim), 140.9 (C1 Ph), 128.3 (C-3/C-5 Ph), 120.7 (C-4 Ph), 118.3 (C-2/C-6 Ph), 108.8 (C-5 Pirim), 36.4 (C-5), 33.4 (C-2), 27.5 (C-4), 24.1 (C-3), 16.4 (CH-ciclopropilo), 9.9 (CH,CH,-ciclopropilo); IR (KSr) vmax/cm-' 3290, 3138, 2936, 2360, 1684, 1590, 1558, 1499, 1386, 1250, 970, 756, 689; EM (lE) mlz(%) 311 (M', 24), 310(4), 309 (2), 266 (4), 265 (6), 264 (14), 250 (4), 238 (11), 226 (14), 224 (16), 225 (100), 210 (4.5); EMAR miz calculado para C,.H21N30, 311.16338, encontrado 311 .16254.
Ejemplo 4. Sintesis de CDn5 (21) [radical del tipo T: R-V]
La slntesis del compuesto de fónmula (1) que incorpora el espaciador por el
nitrógeno amínico de ciprodinil se lleva a cabo a través de una reacción de
alquilación del anión amiduro derivado del mismo con el w-bromo éster de longitud de cadena adecuada, seguido de hidrólisis básica del grupo éster al correspondiente ácido carboxílico, tal como se ilustra en la Figura 4 y se detalla
a continuación.
i) Preparación del 5-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-i/) (feni/)amino)pentanoato de metilo (20)
Una disolución de ciprodinil (170 mg, 0,754 mmol) en DMF anhidra (3 mL) se añadió gota a gota sobre una disolución agitada de NaOH (60% dispersión en aceite mineral, 36.9 mg, 0.925 mmol, 1.2 equiv., prelavado con pentano seco) en DMF (2 mL) a Ooc bajo nitrógeno. Después de 30 min de agitación a esta temperatura la mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 15 min adicionales. A continuación se añadió 5bromoisovalerato de metilo (19, 0.224 mL, 1.51 mmol, 2 equiv.) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 72 h. Transcurrido este tiempo la mezcla de reacción se vertió sobre agua y se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se lavaron sucesivamente con disoluciones acuosas saturadas de LiCI y Na, se secaron sobre Na,SO, y se concentraron a vacío. El residuo obtenido se cromatografió sobre gel de sílice, usando hexano-EtOAc
9:1 como eluyente, obteniéndose una mezcla aproximadamente 7:3 (basado en
el análisis de RMN de 'H) del éster y el material de partida no reaccionado que no pudo separarse por las técnicas cromatográficas convencionales (203.4 mg).
¡j) Preparación del ácido 5-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino) pentanoico (21, compuesto de fórmula (1) CDn5)
Se añadió LiOH·H,O (158.4 mg, 3.80 mmol) a una disolución de la mezcla previamente obtenida (200 mg, ca. 0.41 mmol de 20) en THF (3.3 mL) yagua
(1.5 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 hy
el THF se eliminó a presión reducida en un rotavapor. El residuo obtenido se
diluyó con agua (4 mL), se acidificó por la adición de KHSO, sólido hasta pH 34 Y se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na,SO, anhidro y se concentraron para obtener un residuo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, usando CHCI,-MeOH 9: 1 como
eluyente, para proporcionar, en orden de elución, ciprodinil de partida no
reaccionado (53 mg) y el compuesto deseado CDn5 (21, 132.6 mg, 54% a partir de ciprodinil) como un sólido. Pf 118-121 oC (cristalizado de hexanobenceno). RMN de 'H (300 MHz, CDCI,) o (ppm) 10.0 (IH, sa, COOH), 7.37-7.17 (5H, m, Ph), 6.37 (lH, s, H-5 Pirim), 3.99 (2H, 1, J = 6.9 Hz, H-5), 2.37 (2H, t, J = 6.9 Hz, H-2), 1.67 (4H, m, H-3 y H-4), 1.75 (1 H, m, CH-ciclopropilo),
0.96 y 0.87 (2H cada uno, cada uno m, CH,CH,-ciclopropilo); RMN de 13C (75 MHz, CDCJ,) 1) (ppm) 179.2 (C-l), 171.4 (C-2 Pirim), 166.2 (C-4 Pirim), 161.6 (C-6 Pirim), 144.6 (C-l Ph), 128.6 (C-3/C-5 Ph), 127.4 (C-2/C-6 Ph), 125.1 (C-4 Ph), 108.5 (C-5 Pirim), 49.6 (C-5), 33.7 (C-2), 27.4 (C-4), 23.9 (Me), 21.9 (C-3),
16.5 (CH-ciclopropilo), 9.8 (CH,CH,-ciclopropilo); IR (KBr) vm.'¡cm-' 34002600, 3009, 2940,2861,1698, 1574,1558, 1473,1398, 1307, 1236, 1100, 959, 819,702; EM (IE)mlz (%) 325 (M·, 25), 324 (11), 310 (2), 253 (6), 252 (33), 250
(2.5), 239 (19), 238 (100), 225 (19), 224 (21), 222 (3), 210 (2), 163 (6); EMAR miz calculado para C'9H23N30, 325.17903, encontrado 325.17857.
1.2. Activación de los compuestos de fórmula (11
Los ejemplos de compuestos de fórmula (1) aquí presentados contienen un grupo carboxilo como grupo químico funcional para su conjugación a proteínas portadoras, concretamente por reacción con los grupos amino libres de la proteína. El grupo carboxilo se activó según el esquema de la Figura 5, utilizando carbonato de N,N'-disuccinimidilo(DSC) siguiendo protocolos previamente publicados [FA Esteve-Turrillas et al. , Anal. Chim. Acta2010, 682, 93-103). En concreto, se disolvió 0.082 mmol del correspondiente compuesto de fórmula (1) de ciprodinil y 0.14 mmol de DSC en 0.8 mL de acetonilrilo seco en atmósfera de nitrógeno. A continuación, se añadió 0.31 mmol de trietilamina y se agitó a temperatura ambiente hasta la desaparición del material de partida (análisis por cromatografia de capa fina). La disolución se diluyó en cloroformo, se lavó con una disolución saturada de NaHC03 y salmuera y se secó con Na,SO. anhidro. Después de evaporar el disolvente, el residuo restante se
purificó por cromatografía en columna, usando cloroformo como eluyente,
obteniéndose el éster de N-hidroxisuccinimida del compuesto de fórmula (1) de
Tampones y disoluciones:
PB: Tampón fosfato sódico 100 mM,pH 7.4;
PBS: Tampón fosfato sódico 10 mM, pH 7.4 con NaCI 140 mM;
PBST: Tampón PBS conteniendo 0.05% (v/v) de polioxietilen (20) sorbitanmonolaurato (conocido como Tween 20); CB: Tampón carbonato sódico 50 mM, pH 9.6; Disolución de lavado:NaCl150mM conteniendo 0.05% (v/v) de Tween 20.
Los anal itas se disolvieron en N,N-dimetilformamida (DMF) anhidra y se
almacenaron a -20 oC.
Los compuestos de fórmula (11) se prepararon como se esquematiza en la Figura 5, según los procedimientos siguientes.
1.3.1.lnmunógeno
A 2.0 mL de una disolución de 15 mg/mL de proteina albúmina de suero bovino (BSA) en tampón CB se añadió gota a gota 200 ~L de una disolución 50 mM de compuesto de fórmula (1) activado, obtenido tal como se indica en el apartado 1.2, en DMF. La reacción se llevó a cabo durante 4 h a temperatura ambiente con agitación suave y a continuación, el conjugado se purificó por cromatografía de exclusión molecular usando tampón PB como eluyente. El grado de conjugación, n tal como se describe en el compuesto de fórmula (11), medido especlrofotométricamente fue de 11 , 11, 14 Y 14 para CDm6, CDp6, CDb5 y CDn5, respectivamente.
1.3.2. Compuesto de fórmula (11) como antígeno de ensayo
A 2.0 mL de una disolución de 15 mg/mL de proteina albúmina de huevo (OVA) en tampón CB se añadió gota a gota 100 ~L de una disolución 100 mM de compuesto de fórmula (1) activado, obtenido tal como se indica en el apartado 1.2, en DMF. La reacción se llevó a cabo durante 2.5 h a temperatura
- S
- ambiente con agnación suave y a continuación , el compuesto de fórmula (11) se purificó por cromatografía de exclusión molecular usando tampón PB como eluyente. El grado de conjugación , n tal como se describe en el compuesto de fórmula (11), medido espectrofotométricamente fue de 8, 8, 8 Y 9 para CDm6, COp6, CDb5 y CDn5, respectivamente.
- 1.3.3. Trazador o antígeno enzimático
- 10 15
- A 1.0 ml de una disolución de 2.2 mg/ml de proteína peroxidasa de rábano picante (HRP) en tampón CB se añadió gota a gota 100 ~l de una disolución 10 mM (ó 5 mM) de compuesto de fórmula (1) activado, obtenido tal como se indica en el apartado 1.2, en OMF. la reacción se llevó a cabo durante 4 h a temperatura ambiente con agitación suave y a continuación , el conjugado se purificó por cromatografía de exclusión molecular usando tampón PB como eluyente. El grado de conjugación, n tal como se describe en el compuesto de fórmula (11) , medido espectrofotométricamente fue de 4, 6, 5 Y 3 para COm6, COp6, COb5 y CDn5, respectivamente.
- 2. Inmunización de conejos
- 20 25
- Se inmunizaron, siguiendo protocolos estandarizados, 2 hembras de conejo blancas de la raza New Zealand con cada inmunógeno que son compuestos de fórmula (11) donde P es BSA obtenidos tal como se describe en el apartado 1.3.1. IC. Suárez-Pantaleón et al., J. Agric. Food Chem.2010, 58, 8502-8511]. Cada animal recibió 0.3 mg de uno de los inmunógenos disuelto en 1 ml de una mezcla 1:1 de tampón PB y adyuvante de Freund completo. la inmunización prosiguió con la inoculación de una dosis de recuerdo cada 21 días con la misma cantidad de inmunógeno pero empleando adyuvante de Freund incompleto. Diez días después de la cuarta inyección, los animales fueron desangrados y la sangre obtenida se dejó coagular a 4 oC durante toda la noche. Al día siguiente, se recuperaron los sueros por centrffugación, se diluyeron a Y2 con PBS frío y se les anadió un volumen de una disolución saturada de sulfato amónico. El precipitado proteico resultante de cada suero
se recogió por centrifugación y se redisolvió en tampón PBS frio. Finalmente,
las proteínas se reprecipitaron como anteriormente y se almacenaron en este
estado a 4°C. Este precipitado contiene una mezcla indeterminada de proteinas
que denominamos antisuero, anticuerpo policlonal o simplemente anticuerpo.
Se obtuvieron dos antisueros de cada inmunógeno, identificados como #1 y #2 .
3. Procedimiento ELlSA
Se emplearon placas de poliestireno de 96 pocillos. Cada antisuero se evaluó en los dos formatos clásicos de ELlSA competitivo (el de antígeno o conjugado inmovilizado con detección indirecta y el de anticuerpo inmovilizado con detección directa) usando tanto antígenos de ensayo homólogos, es decir un antigeno de ensayo a partir del mismo compuesto de fórmula (1) que el utilizado para obtener el inmunógeno; como antlgenos de ensayo heterólogos, es decir obtenidos a partir de un compuesto de fórmula (1) diferente al empleado para obtener el inmunógeno. Se emplearon pipetas electrónicas de 8 canales para la dispensación rápida y precisa de los inmunorreactivos. Después de cada etapa de incubación, las placas se lavaron cuatro veces con una disolución de lavado, usando un lavador de 96 canales ELx405 (Biotek Instruments, Winooski, USA). La actividad peroxidasa usada como marcador se reveló con 100 ~L por pocillo de una disolución 2 mg/mL de o-fenilendiamina en tampón 25 mM citrato sódico, 62 mM fosfato sódico, pH 5.4 conteniendo 0.012% (v/v) de H,O,. Este revelado se desarrolló durante 10 min a temperatura ambiente y se paró usando 100 ~L por pocillo de H,SO, 2.5 M. Al finalizar los ensayos, la absorbancia de cada pocillo se leyó a 492 nm usando una longitud de onda de referencia de 650 nm en un lector de microplacas PowerWave HT (Biotek Instruments, Winooski, USA). Las curvas patrón sigmoideas obtenidas al representar la absorbancia frente a la concentración de analito se ajustaron a una ecuación logística de cuatro parámetros usando el paquete informático SigmaPlot de SPSS (Chicago, USA). El titulo del antisuero se definió como el recíproco de la dilución del antisuero que proporciona una señal máxima (A",,,) de 1.0 en ausencia de analito libre en
3.
ensayo de ELlSA competitivo en el formato de conjugado inmovilizado homólogo a 0.1 mg/mL con detección indirecta. La afinidad del anticuerpo (leso) se estimó como la concentración de ana lito libre capaz de reducir a la mitad la
señal máxima.
3.1. Ensayos ELISA competitivos en formato de antígeno o conjugado
inmovilizado con detección indirecta (ensayo indirecto)
Las placas se tapizaron con 100 ~L por pocillo de una disolución de antigeno de ensayo que es un compuesto de fórmula (11) donde P es OVA a 0.01 o a 0.1 ~g/mL en tampón eB por incubación durante toda la noche a temperatura ambiente. Después de lavar las placas. en cada columna se dispensó 50 ~L por pocillo de una curva estándar completa delanalito en PBS seguido de 50 ~L por pocillo de una dilución concreta de un determinado antisuero en PBST. La misma distribución de reactivos se repitió para cada placa con un conjugado diferente. La reacción inmunoquímica se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente y después se lavaron las placas. A continuación, cada pocillo recibió 100 ~L de una dilución 1/10000 de GAR-HRP en PBST conteniendo 10% de suero bovino fetal. Esta reacción se dejó a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar las placas, se reveló la actividad peroxidasa retenida y se leyó la absorbancia a 492 nm como se ha descrito anteriormente.
3.2. Ensayos ELISA competitivos en formato de anticuerpo inmovilizado con detección directa (ensayo directo)
Las placas se tapizaron con 100 ~L por pocillo de una dilución de antisuero en tampón eB por incubación durante toda la noche a temperatura ambiente. Después de lavar las placas, en cada columna se dispensó 50 ~L por pocillo de una curva estándar completa del analito en PBS seguido de 50 ~L por pocillO de una dilución concreta de un trazador enzimático determinado en PBST. La
misma distribución de reactivos se repitió para cada placa con un antisuero
diferente. La reacción inmunoquimica se llevó a cabo durante 1 h a
temperatura ambiente y después se lavaron las placas. Finalmente, se reveló la actividad peroxidasa retenida y se leyó la absorbancia a 492 nm como se ha
descrito.
4. Resultados
4.1. Respuesta inmune
Los cuatro inmunógenos de ciprodinil produjeron respuestas inmunes semejantes y equivalentes con títulos cercanos a 3x105. En la Figura 6 se muestran las señales obtenidas con los diferentes antisueros en ensayos con antígeno de ensayo homólogo para diferentes diluciones del antisuero.
4.1.1 . Determinación de la afinidad de los anticuerpos
ensayo homólogo usando el ensayo de tipo ELlSA competitivo, tanto en
formato de ensayo de antígeno inmovilizado con detección indirecta como en el formato de anticuerpo inmovilizado con detección directa. Se ensayaron
diferentes concentraciones de antlgeno de ensayo frente a diferentes
concentraciones de antisuero en ensayo competitivo utilizando como
competidor diferentes concentraciones de ciprodinil preparadas por dilución seriada. Solamente a partir de tres de los compuestos de fórmula (1) sintetizados, CDm6, CDp6 y CDb5, se obtuvieron anticuerpos capaces de reconocer al ciprodinil con elevada afinidad. Este resultado confirma que dichas
estructuras son idóneas para el objetivo que se persigue y demuestra la
dificultad para predecir la posición óptima de funcionalización de los compuestos de fórmula (1). Los valores de la señal máxima, la IC50 y de la
pendiente de la curva de inhibición resultante para cada anticuerpo con su
antígeno de ensayo homólogo se han incluido en las Tablas 1 (a-d) y las Tablas 2 (a-d).
Resultado de los ensayos en formato ELlSA competitivo de conjugado
inmovilizado con detección indirecta:
Tabla1a
OVA COm6
Antisuero Conjugado Titulo As. Amax Pendiente leso (nM) (J.lg/mL) (xl0')
CDm6#1 0.01 10 0.85 0.40 89.2
0.1 300 0.84 0.48 60.1 CDm6#2 0.01 10 1.04 0.55 36.9
0.1 300 0.96 0.52 25.5
Tabla 1b
OVA-COp6
Antisuero Conjugado Título As. Amax Pendiente IC!rQ (nM)
(~gfmL) (xl 0')
CDp6#1 0.01 10 0.93 0.58 17.2
0.1 100 1.27 0.47 25.8 COp6#2 0.01 10 1. 10 0.64 15.1
0.1 100 1.24 0.45 23.8
Tabla 1c
QVA-CDb5
Antisuero Conjugado Título As. Amax Pendiente leso (nM) (J.lg/mL) (xl0')
CDb5#1 0.01 10 0.85 0.66 25.4
0.1 300 0.73 0.58 15.8 CDb5#2 0.01 10 1.04 0.63 31.5
0.1 300 0.89 0.58 15.8
Tabla id
OVA-CDnS
Antisuero Conjugado Titulo As. Amax Pendiente IGso (nM) (¡Jg/mL) (xl O')
COn5#1 0.01 100 0.97 0.39 3356.7
0.1 300 1.15 0.44 9555.8 CDn5#2 0.01 100 0.95
0.1 300 1.21 0.95 6465.3
Resultado de los ensayos en formato ELlSA competitivo de anticuerpo inmovilizado con detección directa:
Tabla 2a
Antisuero Trazador Título As. Amax Pendiente leso (nM) (~g/mL) (xI 0')
- CDm6#1
- 3 10 1.18 0.47 19.8
- 3
- 30 0.73 0.40 4.8
- CDm6#2
- 3 10 1.19 0.64 31.0
- 3
- 30 0.81 0.62 8.9
Tabla 2b
HRP-CDp6
Antisuero Trazador Título As. Amax Pendiente leso (nM) (~glmL) (xI0')
- COp6#1
- 3 10 1.22 0.44 29.6
- 3
- 30 0.74 0.55 9.9
- COp6#2
- 3 10 1.26 0.49 27.3
- 3
- 30 0.92 0.64 7.8
HRP-CDb5
(~g1mL) (xI0')
- COb5#1
- 3 10 1.25 0.66 5.8
- 3
- 30 0.97 0.72 4.2
- CDb5#2
- 10 1.15 0.76 3.9
- 3
- 30 0.73 0.65 2.3
HRP-COnS
Antisuero Trazador Titulo As. Amax Pendiente !Gro (nM) (~g1mL) (x103)
- CDn5#1
- 3 10 0.94 0.50 1035.5
- 10
- 30 1.30 0.59 261 .5
- COn5#2
- 3 10 0.91 0.53 1556.0
- 10
- 30 1.23 0.69 278.5
En la Figura 7 se muestran las curvas de inhibición obtenidas con el fonmato de antígeno de ensayo inmovilizado con detección indirecta y con el fonmato de anticuerpo inmovilizado con detección directa. Para el ensayo indirecto se
empleó 100 ~L por pocillo del compuesto de fórmula (11) OVA-CDp6 a 0.1 ~g/mL y el antisuero CDp6#1 a una dilución en ensayo de 1/3xl04• En el caso del ensayo con formato directo, el pocillo se tapizó con 1 00 ~L de una dilución del antisuero CDb5#1 a 1/3x104 y en la etapa compelitiva se usó 0.3 ng de
5 trazador enzimático homólogo.
Como se desprende de los resultados obtenidos en los ejemplos ilustrados,
los inmunógenos en los que el compuesto de fórmula (1) contenía el espaciador situado sobre cualquiera de los dos anillos aromáticos proporcionaron
anticuerpos de elevada afinidad para ciprodinil. Por el contrario, el inmunógeno
10 con el espaciador sobre el nitrógeno amínico que une los dos anillos aromáticos proporcionó anticuerpos de baja afinidad hacia dicho fungicida.
Claims (27)
- REIVINDICACIONES1. Un compuesto de fónnula (1):T-L-Y(1) caracterizado porque T se selecciona del grupo que consiste en R-I, R-II, R-III, R-IV y R-V;H HNyNl("¡-~ >iNy Nl("¡~N V ~ \: ~N VR-I R-II H H TI I lNy N N~N N'O y Nl("¡1""-1 1-4 J: e~N ~ /. N ~1lR-III R-IV R-Vdonde R-I se selecciona del grupo que consiste en [2-«4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2il)amino)fenilo], [3-«4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-«4ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; R-II es [4-ciclopropil-6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo]; R-III se selecciona del grupo que consiste en [2-«4-ciclopropilpirimidin-2il)amino)fenilo], [3-«4-ciclopropilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-«4ciclopropilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; R-IV se selecciona del grupo que consiste en [6-ciclopropil-2(fenilamino)pirimidin-4-ilo] y [4-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo]; y R-V es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada de 1 a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre Oy 10 heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en S, O Y N; Y es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en: -COOH, -NH" -N" -CH,CI, -CH,Br, -CH,I, -CHO, -SH, -SO,H, -OSO,Ph, -NH-NH" -OSO,Ar y -C:::CH; con la condición de que: a) cuando T es [3-«4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo], el fragmento-L-Y es diferente de -SCH,CHNH,COOH; b) cuando T es [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo] y L es -CH,-, y es diferente a -NH,; y c) cuando T es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino], L es una cadena hidrocarbonada de 1 a 40 átomos de carbono, lineal o ramificada, saturada o insaturada, con la condición de que dicha cadena hidrocarbonada nocomprende ningún heteroátomo.2, Un compuesto de fórmula (1) según la reivindicación 1, caracterizado porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono,3, Un compuesto de fórmula (1) según una cualquiera de las reivindicacionesanteriores, caracterizado porque Y se selecciona del grupo que consiste en
- -
- COOH, -CHO, -NH, y -SH,
4, Un compuesto de fórmula (1) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque T es [3-«4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2il)amino)fenilo] o [4-(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono; e Y se selecciona dentro del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH, y -SH, - 5. Un compuesto de fórmula (1) según la reivindicación 4, caracterizado porque se selecciona dentro del grupo que consiste enyN'¡(yICH,),CO,HH '1 ~üI/-N V I Y I '"/-N ¿. ICH,),CO,Hy
-
- 6.
- Un compuesto de fórmula (1) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque T es [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono; e Y se selecciona dentro del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH, y -SH.
-
- 7.
- Un compuesto de fórmula (1) según la reivindicación 6, caracterizado porque es
-
- 8.
- Un compuesto de fórmula (1) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque T es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono; e Y se selecciona dentro del grupo que consiste en -COOH, -CHO, -NH, y -SH.
-
- 9.
- Un compuesto de fórmula (1) según la reivindicación 8, caracterizado porque es
-
- 10.
- Un compuesto de fórmula (11):
[T-L-Z)"-P(11) caracterizado porqueT se selecciona del grupo que consiste en R-I, R-I!, R-III, R-IV y R-V;H HNyNl("1~ liNyNl("1/-N V ~ \: /-N VR-I R-IIH TNyNl("1~ Ny Nl("1/-N V ¡ /-N V R-IIIllR-Vdonde R-I se selecciona del grupo que consiste en [2-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2il)amino)fenilo], [3-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-((4ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; R-I! es [4-ciclopropil-6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo]; R-III se selecciona del grupo que consiste en [2-((4-ciclopropilpirimidin-2il)amino )fenilo], [3-(( 4-ciclopropilpirimidin-2-il)ami no)fenilo] y [4-((4ciclopropilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; R-IV se selecciona del grupo que consiste en [6-ciclopropil-2(fenilamino)pirimidin-4-ilo] y [4-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo]; y R-V es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada de 1 a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadenahidrocarbonada comprende entre O y 10 heteroátomos que se seleccionan delgrupo que consiste en S, O Y N; Z es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NHCONH-, -NHCSNH-, -OCONH-, -NHOCO-, -OCSNH-, -SCONH-, -S-, -S-S-, -NH(C=NH)-, -OCO-, -CO-, -CHOH-, -N=N-, -NH-, -NR-, yP es un polipéptido natural o sintético de peso molecular mayor de 2000 daltons; yn es un número con un valor entre 1 y 500; con la condición de que:a) cuando T es [3-«4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo], el fragmento -L-Z-es diferente de -SCH2CHNH2COO-, -SCH2CHNH2-CO-NH-o -SCH2CH(COOH)NHCO-; b) cuando T es [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo] y L es -CH2-, Z es diferente a -NHCO-; y c) cuando T es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino], L es una cadena hidrocarbonada de 1 a 40 átomos de carbono, lineal o ramificada, saturada o insaturada, con la condición de que dicha cadena hidrocarbonada no comprende ningún heteroátomo. -
- 11.
- Un compuesto de fórmula (11) según la reivindicación 10, caracterizado porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono.
-
- 12.
- Un compuesto de fórmula (ll) según una cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11 , caracterizado porque Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, / S--,-f<0 Y N" N' N/
~N-)=lO - 13. Un compuesto de fórmula (ll) según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque P se selecciona del grupo que consiste enalbúmina, tiroglobulina, hemocianina, f3-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa yoxidasa.
- 14. Un compuesto de fórmula (ll) según una cualquiera de las reivindicaciones lOa 13, caracterizado porque T es [3-«4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-(4-ciclopropil-6metilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono;
- 4.Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, / Syl<° y ;y~NoP se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, ¡¡-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa.
- 15. Un compuesto de fonmula (11) según la reivindicación 14, caracterizado porque T es [3-«4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-«4ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 5 átomos de carbono; Z es -CONH-; P se selecciona del grupo queconsiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.
- 16. Un compuesto de fórmula (11) según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque Tes [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,/s~:_oP se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, ¡¡-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa.
- 17. Un compuesto de fonmula (11) según la reivindicación 16, caracterizado porque T es [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de carbono; Z es -CONH-; P se seleccionadel grupo que consiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor seleccionadoentre 1 y 50.
- 18. Un compuesto de fónmula (11) según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque T es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino];
- 5
- L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-, /S-,-I<° ~Ny O P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, ¡3-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa.
- lO
- 19. Un compuesto de formula (U) según la reivindicación 18, caracterizado porque T es [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de carbono; Z es -CONH-; P se selecciona del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.
- 15
- 20. Un compuesto de fórmula (111): [T-L-Zlm-Q (111) caracterizado porque T se selecciona del grupo que consiste en R-I, R-U, R-III, R-IV y R-V;
- 20
- H H lNyN~->iNyN~ ~ N V ¡ \ ~N V R-I R-II
- 25 30
- H T lNyN~~N V ¡ R-III lNyN~ /. N V R-V donde R-I se selecciona del grupo que consiste en [2-«4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2iI)amino)fenilo], [3-«4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-«4ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo];
- 50
R-l1 es [4-ciclopropil-6-metil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo]: R-ttt se selecciona del grupo que consiste en [2-« 4-ciclopropilpirimidin-2il)amino)fenilo], [3-«4-ciclopropilpirimidin-2-il)amino)fenilo] y [4-«4ciclopropilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; R-IV se selecciona del grupo que consiste en [6-ciclopropil-2(fenilamino)pirimidin-4-ilo] y [4-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-5-ilo]; y R-V es [(4-ciclopropil--6-metilpirimidin-2-il)(Tenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada de 1 a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre O y 10 heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en S, O Y N; Z es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NHCONH-, -NHCSNH-, -OCONH-, -NHOCO-, -OCSNH-, -SCONH-, -S-, -S-S-, -NH(C=NH)-, -OCO-, -CO-, -CHOH-, -N=N-,-NH-, -NR-, ./s~:_ y ;:('O Q es un marcador no isotópico; ym es un número entero con un valor entero entre 1 y 1000. - 21 . Un compuesto de fórmula (ttt) según la reivindicación 20, caracterizadoporque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono.
- 22. Un compuesto de fórmula (ttt) según una cualquiera de las reivindicaciones 20 o 21 , caracterizado porque Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH--NHCO--NH--S-O y "N, /', , , ' S¡---'Z N N ./ ~N-)=f O
- 23. Un compuesto de fórmula (111) según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizado porque Q se selecciona del grupo que consiste enbiotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un f1uoróforo decianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro-o nanoparticulas de oro coloidal, de carbón o de látex.
- 24. Un compuesto de fórmula (111) según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque5 T es [3-((4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)amino)fenilo] o [4-((4-ciclopropil-6metilpirimidin-2-il)amino)fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,y ;yQ se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceina o unocualquiera de sus derivados, un f1uoróforo de cianina, un f1uoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno 15 cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro-o nanoparticulas deoro coloidal, de carbón o de látex.
- 25. Un compuesto de fórmula (111) según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque Tes [6-ciclopropil-2-(fenilamino)pirimidin-4-ilo];20 L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,/S-,--f<°'---(.NO 25 Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o unocualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un f1uoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, ludferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro-o nanopartículas deoro coloidal, de carbón o de látex.
- 26. Un compuesto de fórmula (111) según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque Tes [(4-ciclopropil-6-metilpirimidin-2-il)(fenil)amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S-,/ Syi<° ;y~NOQ se selecciona del grupo que consiste en biotina, f1uoresceína o unocualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un lIuoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o unocualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro o nanopartículas deoro coloidal, de carbón o de látex.
- 27. Un anticuerpo generado en respuesta a un compuesto de fónnula (11) talcomo se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19.
- 28. Método de análisis in vitro de ciprodinil en una muestra que comprende lassiguientes etapas:a. poner en contacto una muestra con un anticuerpo generado talcomo se describe en la reivindicación 27;b. incubar la muestra y el anticuerpo del paso (a) durante un periodo de tiempo adecuado para que tenga lugar una reaccióninmunoquímica; yc. determinar la existencia de reacción inmunoquímica tras laincubación del paso (b).
- 29. Método de análisis de ciprodinil según la reivindicación 28, caracterizado porque la detenninación de la reacción inmunoquimica en el paso (c) se realizamediante un inmunoensayo competitivo, usando como competidor un antígenode ensayo que es un compuesto de fonmula (11) tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19.
- 30. Método de análisis de ciprodinil según la reivindicación 28, caracterizado porque la detenminación de la reacción inmunoqulmica en el paso (c) se realiza5 mediante un inmunoensayo competitivo. usando como competidor un antígenode ensayo que es un compuesto de fonmula (111) tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26.
- 31 . Kit de detección de ciprodinil, que comprende al menos un anticuerpo generado tal como se define en la reivindicación 27 junto con un compuesto de10 fórmula (11) generado tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19 o un compuesto de fórmula (111) tal como se define en cualquiera de lasreivindicaciones 20 a 26.
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