ES2378040B1 - Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal y cultivos puros de las cepas denominadas n11, sr11 y alo1, contenidas en el mismo. - Google Patents
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Abstract
Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal y cultivos puros de las cepas denominadas N{sub,11}, SR{sub,11} y ALo{sub,1}, contenidas en el mismo.#Esta invención se refiere a un nuevo producto nematicida para el control biológico de nematodos fitopatógenos que contiene tres nuevos aislados de Bacillus thuringiensis cepa N{sub,11}, Bacillus mojavensis cepa SR{sub,11} y Azospirillum brasilense cepa ALo{sub,1}, depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con las denominaciones CECT-7665, CECT-7666 y CECT-5856 respectivamente, las cuales poseen una elevada capacidad antagonista frente a este tipo de patógenos, así como la propiedad de estimular el crecimiento vegetal por diferentes mecanismos. La invención también se refiere a los formulados líquido y sólido del producto que poseen una buena estabilidad a temperatura ambiente y que resultan efectivos en el control biológico de nematodos fitopatógenos y para la estimulación del crecimiento de plantas.
Description
Un preparado biológico bionematicidayestimuladordel crecimientovegetalycultivos purosdelas cepas denominadasN11,SR11yALo1, contenidas enel mismo.
Objeto de la invención
El objetodela presenteinvención es un preparado biológico, líquidoo sólido, que presenta una potente actividad nematicidayque posee además capacidad parala biofertilizaciónyla estimulacióndel crecimientovegetalyel enraizamiento, tanto en semilleros, como enviveros,invernaderosyproducciónvegetal en general.También constituye objeto de esta invención, los nuevos aislados de los microorganismos componentes del preparado, Bacillus thuringiensis cepaN11, Bacillus subtilis cepa SR11yAzospirillum brasilense cepa ALo1, así como el procedimiento de producción de los formulados.
Estado actual de la técnica
Desde hace años,ha sido reconocidala necesidade importanciade desarrollaryampliar los procedimientosde Producción Integradayde Agricultura Ecológica, como alternativa al uso indiscriminado de productos químicos en la agricultura, para reducir los efectos nocivos de estos últimos. El uso de biopreparados microbianos, tanto para el controlbiológico de plagasyenfermedades como para la fertilización de cultivos de interés comercial, se presenta como una de las alternativas más prometedoras dentro de este contexto. Además, estos biopreparados desempeñan un importante papel en los modelos de agricultura sostenible debido a la posibilidad de producirse a partir de recursos renovables (Altieri, 1997).
Los nematodos parásitos de plantas atacan las raíces o la parte aérea de la mayoría de los cultivos, de modo que es prácticamente imposible mantener una agricultura, económicamente viable, sin algún tipo de control sobre estos organismos. Muchos de ellos desarrollan su ciclo de vida en la zona de las raíces, y se alimentan de éstas, encontrándose en general en asociación con las plantas. Algunos son endoparásitos, es decir queviveny se alimentan en el interior de las raíces, los tubérculos, los brotes, las semillas etc. Otros son ectoparásitosy se alimentan de las paredes de las plantas. Unas pocas especies son sumamente específicas del hospedero, como en el caso de Heterodera glycinis en la sojay Globodera rostochiensis en la patata, pero en general tienen un amplio rango de hospederos (Guerena, 2006).
Entre los nematodos endoparásitos que se alimentan de las raíces, que constituyen plagas de gran importancia económica, se hallan los formadores de nódulos (especies de Meloidogyne), los formadores de quistes (especies de Heterodera),y losde lesiones radicales (especies de Pratylenchus). Mientras que entre los ectoparásitos de mayor importancia económica que se alimentan de las raíces se encuentran especies de los géneros Paratrichodorus, Trichodorus, Xiphinema, Longidorus, Paralongidorus, Criconemella, Tylenchorhynchus, Merlinius, Pratylenchus, Helicotylenchus, Rotylenchus yScutellonema entre otros (Guerena, 2006).
El controlde nematodosfitopatógenosesen sentidogeneralunaactividad,preventiva.Portalrazón,lamejorvía para abordar este problema es mediante la combinación de diferentes estrategias complementarias entre sí. Bridge (1996), propone cuatro estrategias para el manejo de nematodos fitopatógenos basado en el uso no directo de agroquímicos, métodos culturalesyfísicos, uso del control biológicoymantenimiento de la biodiversidad de los múltiples cultivosycultivaresqueincrementanla resistenciao toleranciadelos nematodos.Este mismo autor reconocequea pesar de todos los estudios relacionados con este tema, aún no se tienen todas las respuestas en la práctica para el control de nematodos en sistemas agrícolas sustentables.
Los nematodos fitopatógenos coexisten en la rizosfera con gran diversidad de microorganismos, muchos de los cuales son antagonistas de estos, ya que ejercen algún tipo de control biológico (Sikora 1992). El control biológico de nematodos abarca una gran diversidad de organismos que viven en el suelo, que incluyen virus, rickettsias, bacterias, hongos nematófagos, protozoosytardígrados, también depredadores como turbelarios, nematodos, enchitridos, ácaros, collembolosyotros insectos(Kerry, 1995). Dentrode ellos,los hongosylas bacterias muestranlas mayores potencialidades como agentes de control biológico (ACB) (Spiegel et al, 2005). Según Mahdy, M., 2002 Entre los hongos encontramos especies tales como Arthrobotrys, Paecilomyces,y Verticillium(o Lecanicillium)(JP11246323, DE202005020816, CN1663394 entre muchas otras), mientras que entre las bacterias se destaca Pasteuria penetran (EP0217378, EP1967068), varias cepas de Bacillus (EP1922931, EP1967068, US6004774, US5651965, US5378460, US5350577 Sela et al. 1998, Giannakou, et al. 2004, Guo et al. 2008)y Tsukamurella paurometabolum con posibilidades de ser empleadas como eficaces bioplaguicidas (EP2154121, Mena, 2002).
Un gran número de bacterias han sido utilizadas como agentes de control biológico en diversos cultivosytienen granpotencial parael controlde nematodos. Durante años,el usode plaguicidasa basede Bacillus thuringiensis (Bt) estuvo limitado a combatir plagas producidas por un estrecho rango de insectos lepidópteros. Sin embargo, enlos últimos años se ha puesto en evidencia que estos plaguicidas son muy efectivos para un rango mucho más amplio de plagas.Tal es el caso de especies como B. thuringiensis subsp. israelensis, B. thuringiensis subsp. morrisoni,y otras, que son utilizadas en la actualidad para el control de insectos dípteros y coleópteros respectivamente. Más recientementeseha informadoquelas proteínasCry, aunque específicasy dadasuvariedad, resultan tóxicas aun espectro mucho más amplio de insectos. En la actualidad se sabe que las diferentes cepas de Bt son capaces de producir másde 550 toxinasdiferentes,de las cuales, algunas poseen actividad nematicida (Crickmorey et al. 2009).
Una estrategia muy utilizada para el control biológico de nematodos es el empleo de organismos que colonizan la rizosferay en particular las bacterias. Estos microorganismos pueden crecer en la rizosfera por lo que constituyen una barrera defensiva para las raíces contra el ataque de patógenos, por lo que en general resultan muy efectivos como organismos de control biológico (Weller, 1988). Las rizobacterias tienen la habilidad de colonizar las raíces de las plantas (SchrothyHancock,1982)ytienen también un efecto positivo sobreel crecimientode las plantas.
Sikora (1992) señaló que entre el7yel 10% de los aislados bacterianos de la rizosfera de remolacha azucarera, patataytomate posee actividad antagonista contra nematodos formadores de quistesynódulos. SikorayHoffmann-Hergarten (1993) señalaron que las rizobacterias promotoras delcrecimiento vegetal (PGPR, por sus siglas en inglés) poseenuna importante influencia enla relacióníntimaquese estableceentrelos nematodos parásitosy sus plantas hospederas, regulandoelcomportamientode los nematodos durantelafase más tempranade penetración del parásito en la raíz, lo cual es extremadamente importante para el rendimiento de la cosecha.
Sikora en 1988 encontró que un aisladode Bacillus subtilis resultó efectivo en el control de Meloidogyne incognita en algodónyremolacha azucarera, M. arenaria en cacahuetesy Rotylenchulus reniformis en algodón. Smith en 1994 informó que Bacillus sp. Cepa23a redujo la densidad de M. javanica en tomate. Pseudomonas fluorescens cepa Pf1 reduceel númerode nódulosyhuevosde M. incognita en raícesde tomate (SanthiySivakumar,1995).Tambiénla cepa S18 de Bacillus cereus disminuye la densidad de M. incognita en tomate (Keuken, 1996). Por otra parte Giannakou, et al, 2004yTerefe et al., 2009, demostraron que el producto Bionem, a base de Bacillus firmus, posee una elevada actividad en el control de Meloidogyne spp.En condicionesde laboratorio, macetaycampo.
Otro de los grupos de elevada importancia entre los organismos causantes de enfermedades de las plantas son los hongos fitopatógenos, que incluye especies de los géneros Botrytis, Pythium, Rhizoctonia, Alternaria, Fusarium, Phytophthora, Thielaviopsis yBotryosphaeria entre muchos otros, los cuales pueden sobrevivir durante muchos años en el suelo.
Diversos mecanismos han sido descritos para explicar el fenómeno de control biológico de estos patógenos, tales como parasitismo, protección cruzada, antibiosis, competición e inducción de resistencia, entre otros (Shoda, 2000, Walshycol.. 2001).
Uno de los nichos ecológicos (posición relacional de una especie en un ecosistema) más estudiados ha sido la rizosfera, porlas relaciones que aquí se establecen entre plantasyotros organismos(Warrior, 2000). Desdela década de los 80 se ha venido estudiando los microorganismos de la rizosfera, como posibles sustitutos de los plaguicidas químicos para controlar una ampliagamade plagasyenfermedades. Debidoa suabundante distribuciónen suelo,su capacidadde colonizarlas raícesdelas plantas,yde producirunagranvariedadde compuestos beneficiosos,asícomo antagonistas de un elevado número de patógenos, estos organismos resultan muy adecuados para el control biológico de plagasy enfermedades. (Anjaiahy col., 1998; Hilly col., 1994; Maurhofery col.,1991; Rodríguez,y Pfender. 1997; Rossycol., 2000yThomashowycol., 1997).
Entre los grupos microbianos de la rizosfera, que han sido ampliamente estudiados como agentes de control biológico de plagasyenfermedades producidas por los microorganismos, se encuentra el constituido por los hongos.El mismohasidoempleadoconéxitoenel controldehongos patógenos pertenecientesalosgéneros Botrytis, Fusarium, Pythium, Phytophthora, Rhizoctonia, Sclerotinia, Penicillium,y Macrophomina yotros (WhippsyLumsden, 2001, McQuilkenycol., 2001, JonesyWhipps, 2002, entre otros). Dado su metabolismo tandiverso, este grupo microbiano es capazde producir una granvariedadde sustancias útiles parael control biológico. Por estas razones,el númerode cepasyproductosa basede hongos para este fin es cadavez más amplioyvariado (Cookycol., 1996, Whipps, 1997, Fravelycol., 1998,EPAUSA 2006.US 6,306,386yUS 6,890,530 entre otros).
El de las PGPRpara el control biológico de plagasyenfermedades ha sido también ampliamente estudiado. La particularidad fundamental de este tipo de agentes es que además de su efecto protector, poseen una amplia capacidad de colonizarlasraícesdelasplantasy ungranpoder estimuladordel crecimientovegetal,loqueunealefectoprotector una mejora general de la sanidad de los cultivosyde estaforma, la planta es también más resistente al ataque de los patógenos. Este grupo de agentes ha sido empleado en enfermedades producidas por hongos fitopatógenos pertenecientes a los géneros Rhizoctonia, Fusarium, Pythium, Thielaviopsis, Penicillium, Alternaria yBotrytis entre otros (Emmertyhandelsman, 1999, Ligon,ycol., 2000,Cavaglieri,ycol., 2004yRoberts,ycol., 2005,US 7,118,739,ES 2306600,WO2008/113873, entre otros).
El género Pseudomonas hasidoobjetode numerosos estudiosalolargodeañosporserunodelos agentesmás activosydominantes en la rizosfera (GeelsySchippers, 1983, de FreitasyGermida 1991, de la Cruzycol., 1992, Ligon,y col., 2000, US 7,087,424). Miembros del género producen diferentes antibióticos que están íntimamente relacionados con la reducciónysupresión de enfermedadesde plantas. Otrofactor que juega un papel fundamental eneste fenómenoesla producciónde sideróforos,locual contribuye además,al crecimientodelasplantasporlavía del suministro de hierro. Esta habilidad está muy extendida en miembros del género Pseudomonas. Sin embargo, la incapacidad del género para producir estructuras de resistencia durante su crecimiento, limita en alguna medidala estabilidadyefectividadde los biopreparados obtenidos con cepasde este género.
El género Bacillus también ha sido ampliamente estudiado, por presentar grandes potencialidades en este sentido. Este tiene como características principales el hecho de estar prácticamente omnipresente en todo tipo de suelos, a lo cual une una elevada tolerancia térmica, un rápido crecimiento en medios líquidosyla formación de esporasde resistenciaquele permite sobrevivir durantelargos periodosde tiempo.Todo estole confierealas cepasdel géneroun gran potencial como agentes de biocontrol. La Agencia Norteamericana de Protección del Medioambiente (EPA) tiene registradas másde diez cepasde diferentes especiesde este género como bioplaguicidasyen particular biofungicidas (EPA 2006). Los principales mecanismos asociados al biocontrol de hongos fitopatógenos mediante cepas de este género, también incluyen la producción de antibióticos, sideróforos, surfactantesyenzimas hidrolíticos tales como quitinasas entre otros (Utkhede, 1984, Aceaycol., 1988, StanghelliniyMiller 1996, Shoda 2000, Banatycol., 2000, Zhang,y col., 2001, Ruiz-Garcíay col., 2005, US 7,087,424y EP1647188, ES 2306600,WO 2008/113873, entre otros).
Otros géneros bacterianos han sido también estudiados como agentes para el biocontrol, entre los que se encuentran los géneros, Enterobacter, Alcaligenes, Stenotrophomonas yStreptomyces (McClure,y col., 1998, Brewstery col., 1997, Sabaratnam andTraquair, 2002,Cavaglieriycol., 2004yotros).
Por otra parte, esbien conocida la importancia que tienen los microorganismos en el ciclo de los nutrientes en el sueloy su papel en la nutrición de las plantas. Su participación activa en la descomposiciónymineralización de la materiaorgánica,así comoenla fijaciónyliberaciónde nutrientesdel suelo,es crucialparael mantenimientode la productividad de las plantas. Las interacciones que se establecen entre los microorganismos del sueloylas raíces de las plantas, satisfacen importantes requerimientos nutricionales para ambos. Las raíces están directamente influidas porla composiciónydensidaddela comunidad microbianaqueen ellasse desarrolla, conociéndose esto como “Efecto Rizosfera”(Atlas,R.M.yBartha,R.,1993)Laprácticadelainoculacióndeplantascon microorganismospromotores del crecimientovegetal esbien conocida desde hace muchos años (US.570,813).
Un grupo de microorganismos que tiene una notable importancia en estefenómeno es aquel que participa en la solubilización del fósforo de fuentes que de otra forma serían inaccesibles para las plantas. (Kucey y col, 1989). Muchos microorganismos son capacesde asimilarel fósforo insoluble del suelo, liberando una partede este en forma de fosfatos solubles que a su vez pueden ser utilizados por las plantas, contribuyendo de esta forma a la nutrición vegetal (Chabot y col, 1993). En general es aceptado que la solubilización de fosfatos en el suelo es debida a la producciónde ácidosorgánicosy oxo ácidos quelantes,a partirde azúcares(Leyvaland Barthelin 1989, Deubely Gransee1996,YadavyDadarwal, 1997.Enla actualidad existen procedimientosque empleanlos microorganismos solubilizadoresde fosfatos enla fertilización (US. 5,912,398,ES 2234417,WO2009/027544, entre otras).
Los géneros EnterobacteryPantoea han sido utilizados enla agricultura comosolubilizadoresde fosfatoypara la protección contra enfermedadesde las plantas(Gyaneshwarycol, 1999, EP1116632yEP1174030,ES 2149131, ES 2234417,WO2009/027544, entre otras). El género Bacillus también ha sido frecuentemente utilizado en la estimulaciónde crecimientovegetalyla solubilizaciónde fosfatos(RO120556,CN 101439993,WO2009/070966, entre otras).
Otro aspecto que en la práctica ocupa un lugar muy importante es el empleo de los microorganismos de la rizosfera fijadores de nitrógeno atmosférico. Esta práctica es también conocida desde hace muchos años (US. 1,212,196). Numerosos microorganismos han sido utilizados para esta función entre los que se encuentran bacterias de los géneros Rhizobium, Azotobacter yAzospirillum (ES 2093559; US 5,951,978, ES 2234417,WO2009/027544),yhongos de los géneros Saccharomyces, Hansenula (US 6,596,273)y Aspergillus (US 4,670,037) entre otros.
En los años70variosexperimentos realizados en Brasil determinaronla significativa contribución delN2 fijado para las plantas por diferentes microorganismos, encontrándose Azospirillum entre los géneros principales. (DöbereineryDay, 1976;NeyrayDöbereiner, 1977 entre muchos otros). Estudios posterioresde cuantificacióndela fijación biológica del nitrógeno (FBN) en cañade azúcar en estepaís, demostraron que prácticamenteel 65% del total delN2 acumuladofuederivadodelaFBN,loque representa alrededorde150kgN2xha-1xaño-1,deloquesederivólarecomendacióndereduciral mínimoel usodelos fertilizantes nitrogenados,(Döbereiner, 1989; UrquiagayDöbereiner, 1990).
Bashanycol(1990) demostraronquenoessoloel nitrógenoelprincipal elementoinvolucradoenla relación Azospirillum-planta, sino que también el fósforoyel potasio juegan un papel fundamental en esta relación, concluyendo que en dependencia de la cepa utilizada, existirá un cambio cuantitativo en la toma de los minerales por la planta, aumentado significativamente algunas cosechas.
Hay que destacar que muchos autores coinciden en señalar que los efectos beneficiosos por la inoculación con microorganismos sobre el crecimiento vegetal, no son solo debidos a la solubilización de fosfatos o a la fijación biológica del nitrógeno. Existen mecanismos tales comola producciónde fitohormonasysideróforosola actividad de la enzima 1-aminociclopropano 1-carboxilato desaminasa entre otros, que contribuyen notablemente en este efecto (Dattaycol, 1992, Chabotycol, 1993, Deubel and Gransee 1995, Frietasycol, 1997, El-Khawasycol, 1998; Cassán ycol 2001 entre otros).
El desarrollo asociativo de los géneros Azospirillum yBacillus ha sido llevado a cabo exitosamente en la fijación biológicade nitrógenoyla solubilizaciónde fosfatos, demostrándosequenoexistenincompatibilidades entreambos génerosy que al mostrar diferentes los mecanismos de regulación metabólica pueden realizar diferentes funciones en un ecosistema dado (Sukumar, 2001, El-Komy, H.M. 2005,Tabrizi, et al. 2008). Los cultivos mixtos de microorganismos del suelo, con diferentes capacidades metabólicas pueden desarrollar relaciones de cooperación entre sí yconlas plantasque hacenmás eficientela adsorciónde nutrientespor éstasy además pueden producir sustancias estimuladorasdel crecimientovegetal, aumentandola productividaddelas cosechasyprotegiéndolas contralosmicroorganismos patógenos.Tambiénsehallevadoacaboconéxitola obtencióndecepasde Azospirillum queexpresan toxinas de Bacillus intentando obtener los beneficios de ambos microorganismos (Goundera and Rajendrana 2001), aunque las limitaciones actuales de la legislación sobre liberación de organismos genéticamente modificados (GMOs), no ha permitido una introducción masiva de este tipo de cepas.
Las tendencias actuales en la inoculación de plantas con microorganismos se orientan en el sentido de utilizar cultivos mixtos (llamados también consorcios)que potencien fenómenos tales como la protección contra enfermedades producidaspororganismos patógenos,el incrementodela eficienciadela absorcióndel fósforoporlas raíces,la fijación biológica del nitrógeno, la estimulación del crecimiento vegetal por la producción de sustancias reguladoras del crecimiento vegetal, así como sideróforos entre otros (ES 2093559; EP1166632; US 5,147,441; US 6,277,167 yUS 6,596,273WO 00/51435). Esta práctica se ha revelado como la más efectiva en la biofertilización. Otros antecedentes aparecen en US 5,071,4623, US 5,578,486,WO93/19604,WO00/73244,WO00/64837,WO02/20431, WO02/070436.Por otro lado cepas delBacillus thuringiensis con actividad bionematicida aparece descritas en los documentosUS 5,378,460yWO99/09819.
Un aspecto muy importante a tener en cuenta en el control biológico es el empleo de mezclas o combinaciones de diversos agentes de control, particularmente si éstos poseen diferentes mecanismos de acción, los cuales pueden llegara ser complementarios.Dehecho,enla práctica, esteesel fenómenoquese presentaenla naturaleza,porlo que su uso puede resultar muy beneficioso. Estas combinaciones de microorganismos, han demostrado en general una mayor eficacia, combinando efectosde nutriciónypromocióndel crecimientovegetal conelde inhibicióno supresión de diferentes plagasyenfermedades porlo que se presentan como una alternativade gran potencial para su uso enla agricultura.Sinembargo,esmuyimportantetenerencuentaparala elaboracióndeestetipode productos,queningún componentedela mezclatengaalguna acción inhibitoriasobrelosdemásopueda interferirexcesivamente conla microbiota normal del ecosistema (Whipps, 2000). Uno de los problemas más importantes en la producción de este tipo de biopreparados esel lograruna tecnología asequible desdeel puntode vista prácticode producciónyformulación.
Breve descripción de la invención
El objeto de la presente invención es un preparado biológico, líquido o sólido, que presenta una potente actividad nematicidayque posee además capacidad biofertilizanteypotenciadoradel crecimientoyel enraizamiento tantoen semilleros, como enviveros,invernaderosyproducciónvegetal en general.El producto consiste en un preparado microbiano que contiene células de nuevos aislados de Bacillus thuringiensis cepaN11, Bacillus mojavensis cepa SR11 yAzospirillum brasilense cepaALo1quelosautoresdela presenteinvenciónhan logrado aislar.Dichos microorganismos han sido depositados en la Colección Española de CultivosTipo (CECT) que les ha asignado los números de depósito CECT-7665, CECT-7666yCECT-5856 respectivamente. Lasbacterias fueron identificadas por los autoresy se solicitó ademásla identificación enla CECTverificándose su identidad.El citado preparado consiste en un producto líquidoo sólido, compuesto por las células bacterianasyque contiene además los componentes necesarios paragarantizar su supervivencia duranteel almacenamiento, así como enel ambiente, despuésde su aplicaciónen el tratamiento de las plantas. Dicho preparado es un consorcio microbiano formado por Bacillus thuringiensis N11 con una gran capacidad antagonista de nematodos fitopatógenos, Bacillus mojavensis cepa SR11 con acción sinérgica en la actividad antagonista de nematodos fitopatógenosy gran eficiencia para la solubilización de fosfatosy otros minerales del suelo, así como capacidadde producir sustancias estimuladoras del crecimientovegetalyque contiene además Azospirillum brasilense cepa ALo1 fijadorade nitrógeno atmosférico con una elevada capacidad para producir sustancias promotoras del crecimientovegetal. Dicho consorcio posee una elevada capacidad nematicidaypresenta ademásactividad, promotoradel crecimientovegetal,el enraizamiento,y esunexcelente potenciadordela saludde las plantas.
El microorganismo Bacillus thuringiensis N11 CECT-7665 constituye igualmente objeto de esta invención. El mismo fue obtenido utilizando un procedimiento quecombinaelaislamiento en medio sólidoyla selección medianteun proceso de tamizado secuencial, de crecimiento en medios agarizados para la determinación de diferentes actividades enzimáticas. Posteriorse determinósucapacidadnematicidaen bioensayos frenteala raza2de Meloidogyne incognita en basea su poderovicida en placasypara inhibirla formaciónde nódulos en plántulasde pepino in vitro. La cepaN11 posee ademásla capacidaddede solubilizar fosfatosy otros minerales del suelolo cual fue demostradoa travésde su cultivoen medio sólidoyla determinación delPO43− solubilizado en medio líquido agitados, empleando en ambos casos Ca3PO4 como única fuente de fósforo. Quedó demostrado mediante análisis por HPLCybioensayo en insectos que Bacillus thuringiensis cepaN11 no produce β-exotoxinas. Dicha cepa capaz de degradar la lecitina así como el colágeno.
Asimismo constituye objeto de la presente invención el microorganismo Bacillus mojavensis SR11 CECT-7666. El mismo fue obtenido utilizando un procedimiento que combina el aislamiento en medios agarizados con tampón TrisHCl1NpH8,por zonasde aclaramientodelagar (Gyaneshwarycol1999)yselección mediante determinación del PO43− solubilizado en medios líquidos agitados (Nautiyal 1999), empleando en ambos casos Ca3PO4 como única fuente de fósforo. La capacidad para fijar nitrógeno atmosférico se estableció cultivando dicha cepa en medioNFb semi-sólido (KreigyDöbereiner, 1984), librede nitrógeno.La presencia del enzima1-aminociclopropano1-carboxilato desaminasa se comprobóa través del crecimiento en medio sólido con ácido1-aminociclopropano1-carboxílico (ACC) como única fuente de nitrógeno (Penrose 2001).
El microorganismo Azospirillum brasilense ALo1 CECT 5856y es también motivo de la presente invención. El mismo fue obtenido mediante un procedimiento que combina el aislamiento en medio NFb semi-sólido (Kreig y Döbereiner, 1984)y la selección a través su capacidad para estimular el crecimiento vegetaly producir auxinasy otras fitohormonas.Lacapacidad para estimularel crecimientovegetal.Se comprobó, mediante estos bioensayosque la cepa ALo1 posee un potente efecto estimulador del crecimiento vegetal, muy superior en comparación con los otros aislados ensayados.La producciónde ácido3 indol acético (AIA) fueverificada por métodos colorimétricos (PiletyChollet1970)yHPLC(Olivellaycol2001),así comose detectólapresenciade otras fitohormonasdeltipo citoquininas. En la producción de AIA, en con 200 mg x L-1de triptófano, se logran concentraciones de 100-180 mg x mL-1y un por cientode transformaciónde hastael 90%de este aminoácido.Se comprobó tambiénla actividad del enzima1-aminociclopropano1-carboxilato desaminasa presente en esta cepa,a través del crecimiento en medioscon ácido 1-aminociclopropano1-carboxílico(ACC) como única fuentede nitrógeno (Penrose 2001).
La capacidad del bionematicida para estimular el crecimiento vegetal fue comprobada mediante bioensayos de laboratorioeinvernadero,segúnlos métodos descritospor Bashanycol1986, Fernández1995yBashan 1998.
También constituye objeto de esta patente de invención el procedimiento de producción de las cepasylos caldos de cultivo utilizados en el citado preparado, el cual consta de cuatro pasos:
- •
- Propagación de la cepaN11 en cultivo sumergido, en un medio específico que estimula la esporulacióny la capacidad para producir enzimas proteolíticasyquitinolíticasyque al final de la fermentación contiene en su composición una elevada actividad plaguicida.
- •
- Propagación de la cepa SR11 en un medio de cultivo que estimula la esporulaciónyla capacidad de producir sustancias surfactantes y que al final de la fermentación contiene en su composición actividad fungicida y capacidad para estimularelcrecimientovegetalyel enraizamiento.
- •
- PropagacióndelacepaALo1enunmedioabasede sustancias naturalesysales mineralesenelcualseproduce además una elevada concentraciónde sustancias promotorasde crecimientovegetalydelenraizamiento.
- •
- Mezcla final de esto tres caldos fermentados en partes proporcionales, lo que da como resultado un líquido con una elevada concentración celular, mayorde109 unidades formadorasde colonias (UFC)xmL-1y una potente actividad plaguicidafrentea nematodos fitopatógenos, asícomo una notable capacidad para estimular el crecimientoyel enraizamientovegetalycontribuir en eficazmenteala nutricióny ala saludde las plantas.
De igual manera son objetos de esta invención los procedimientos de obtención de los formulados, los cuales constan de los siguientes pasos:
Formulado líquido:
• Al líquido obtenido por el procedimiento anterior se le añade una solución quitosano en una proporción tal que quedeauna concentraciónfinaldel0,1-1%y seagitahasta disolución total.El productoasíformuladotiene una estabilidada temperatura ambiente no menorde6meses.
Inmovilización celular en formulado sólido:
- •
- Al líquido obtenido medianteelprocedimientode produccióndelas cepasylos caldosde cultivo,seleañade los siguientes componentes agitando continuamente:
- •
- Se continúa con la agitación durante una hora para permitir la interacción entre los diferentes componentesy luego se procede a alimentar un secador por aspersión (Spray Dryer) para llevar a cabo el proceso de secado hasta una humedad final de 4-6%.
- Leche descremada
- 1-3%
- Sacarosa
- 2-4%
- Maltodextrina
- 3-5%
El procesode encapsulacióndela composición desarrollada mediantesecadopor aspersión,ha permitidogarantizar la estabilidaddelpreparadopornomenosdeunañoyfacilitarsuaplicación.Estos procedimientoshansidousadoscon éxito por los autores enla realizaciónde otros preparados microbianos parael control biológicoyla biofertilización.
Breve descripción de los dibujos
La Fig.1muestra un bioensayo en cultivo gnotobióticode plántulasde pepino.
La Fig.2ilustra un bioensayoen bandejasde plantasde tomate en cámarade cultivo.
Las Figs.3y4muestran ejemplosdevaloracionesrealizadasa partirdeplantasde sandía tratadas conel bioplaguicida(Fig.3)yde plantastestigosin tratar(Fig.4).
LasFig.5y6ilustranejemplosdevaloraciones visuales realizadasapartirde ensayosdeplantasde tomate tratadas conel bioplaguicida (Fig.5)yde plantas testigo sin tratar (Fig.6).
Las Figs. 7 y 8 ilustran ejemplos de valoraciones visuales realizadas a partir de ensayos de plantas de pepino tratadas conel bioplaguicida (Fig.7)yde plantas testigo sin tratar (Fig.8).
Las Figs.9y10 muestran ejemplosdevaloraciones visuales realizadasa partirde ensayosdeplantasde coliflor tratadas conel bioplaguicida (Fig.9)yde plantas tratadas con Vydate (Fig. 10).
LaFig.11 muestraun diagrama tridimensionalque muestrala comparacióndelas mediasdelos diferentes tratamientos explicados.
Descripción detallada y Modo de realización de la invención
El producto líquido obtenido fue sometido a diferentes evaluaciones mediante bioensayos in vitro, así como ensayosdeinvernaderoexperimentaly en campo en condicionesde producción. Los resultadosde dichasevaluaciones se presentan a continuación.
En primer lugar se realizaron ensayos in vitro,para determinarla capacidad antagonistade éstas frenteanematodos parásitos del género Meloidogyne para lo cual se llevó a cabo un bioensayo utilizando el cultivo gnotobiótico de plántulas de pepino en agar, (Fernández 2004). La metodología resumida es como sigue:
Preparación del bioensayo
Se sumergen semillas comerciales de pepino variedad Marketmore.76 en una disolución de hipoclorito de sodio al5% durante3 min. Posteriormente sonlavadas conabundante agua destilada estéril.A continuación se ponena germinar durante72h encámarahúmeda.Las semillas germinadasse trasplantana tubos plásticosde fondocónico de 60 mL (3x9 cm), conteniendo 30 mL de agar-solución nutritiva (Hoffland, et al. 1989)y se colocan en cámara de cultivoa 25ºC,80%dehumedadcon ciclosde iluminaciónde16hdeluzy8de oscuridad.Unavezque aparecela primera hoja verdadera, las plantas son sometidas a los tratamientos con el producto a ensayar.
Tratamientos
Se realizaron dos tipos de tratamientos: infectar las plantas mediante un inoculo mixto de huevos, juveniles y adultos de Meloidogyne sp.yposteriormente tratar con el productoyviceversa, primero tratar las plantasydespués infectarlas con los nematodos.En ambos tratamientos se deja un intervalode24hentre una inoculaciónyla otra.
Preparaciónde los inóculosinfectivos
Se preparó un inoculo infectivo mixto con el objetivo de llevar a cabo la selección basándose en su capacidad antagonista frentealos diferentes estadiosdel ciclo biológicodelpatógeno.Apartirde plantasde tomate infectadas con la raza 2 de Meloidogyne incognita que presentan abundantes síntomas de la enfermedad, se toman trozos de raícesy sevanextrayendolos nódulosque sonlavados conagua corrientey a continuación se rompen suavemente con una batidora manual de cuchilla en la menor cantidad de agua posible. Esta suspensión, con los diferentes estadios fisiológicos del patógeno es utilizada para infectar las plantas.El ensayo se realiza con5tubos por tratamiento como mínimo.
Determinación de la capacidadantagonista
Alos10díasde incubaciónseevalúala formaciónde nódulosenlas raícesdelasplántulas infectadas, tratadascon el productoylos controlessin tratar.Se consideraqueha habidoactividad nematicida cuandoexiste una reducción mínima del 50% de los tubos infectados con respecto al control. El producto ensayado tuvo una efectividad del 80100% en la inhibición de la formación de nódulos en las múltiples repeticiones que se llevaron a cabo.
Enla figura1 se presentan las fotosde las plántulasde pepino duranteel bioensayo.Enla imagen inferior, centro de esta figura, se pueden observar los nódulos formados en las raíces.
Bioensayo de cultivo gnotobiótico de plantas en agar
A continuación se llevó a cabo un bioensayo in vitro en bandejas, usando plantas de tomate provenientes de semillero. Este paso se realiza paraconfirmar los resultados obtenidos enel bioensayo anterior, pero en otro cultivoy en condiciones más reales. Este bioensayo consiste en lo siguiente:
Preparación del bioensayo
Se toman plantasde tomatevariedadRaf, procedentesdel semilleroyse sumergenlas raícesenel inoculo infectivo durantetodalanoche.Acontinuaciónson trasplantadasabandejasde 44x27x7cm,lascuales contienencomo sustrato vermiculita previamente esterilizada ala que seha añadido una solución nutritivade Hoagland (HoaglandyArnon 1950). Posteriormente son tratadas con el inoculo bacteriano, el cual es añadido a la bandeja mediante riego. Las plantas son entonces colocadas en cámarade cultivoa 25ºC, 80%de humedady con ciclosde iluminaciónde16hde luzy8de oscuridad durante15 días.
Preparaciónde los inóculosinfectivos
Como en el bioensayo en tubos, se preparó un inoculo infectivo mixto con el objetivo de llevar a cabo la selección basándose en su capacidad antagonista frente a los diferentes estadios fisiológicos del ciclo biológico del patógeno. Apartir de plantas de tomate infectadas con la raza2deMeloidogyne incognita que presentan abundantes síntomas dela enfermedad,se toman trozosde raícesy sevanextrayendolosnódulosquesonlavados conaguacorrientey se rompen suavemente con unabatidora manualde cuchilla enla menor cantidadde aguaposible.
Determinación de la capacidad antagonista
Alos15días seevalúael númerode nódulos formados en las raícesde las plantas infectadasytratadas con los diferentes aislados, así como los controles sin tratar. Se considera que ha habido actividad nematicida cuando existe una reducción mínima del 50% con respecto al control.
Como se puede apreciar en la figura 2, el cultivo en bandejas, permite un mejor desarrollo de la plaga, lo cual posibilita una mayor formaciónde nódulosy unaevaluación más precisadela actividad nematicidade los aisladosy los productos elaborados.
Bioensayo de plantas en bandejas usando vermiculita como sustrato
Al final del proceso de tamizado, se seleccionó, una mezcla de dos cepas del género Bacillus,N11ySR11, dadoque produjo mejores resultadosque cualquierade los aislados individualmente.
Alproductoasí elaboradoseleañadiólacepaALo1dadosupotenteactividad estimuladoradel crecimientovegetal conelobjetivodemejorarnotablementelasaluddelasplantasyreforzarsu resistenciafrentealataquedeorganismos patógenos.
Bioensayos de estimulación del crecimiento vegetal
Para determinar la capacidad estimuladora del crecimiento vegetal, se llevaron a cabo bioensayos en invernadero experimental, encaminados a determinar los efectos de los productos sobre diferentes cultivos de interés comercial. Este tipode ensayo se realizó en macetasyjardinerasde diferentesvolúmenes.
Como criteriodeevaluación se determinó elpeso fresco del tejidoverdeo parte aérea, así comoel peso frescode la raíz.
Los resultados de estos bioensayos resultaron en general muy positivos en cuanto a la capacidad de estimulación del crecimiento vegetalyel enraizamientode los productos elaborados.Enel Diagrama1 se presentan los resultados obtenidos en el cultivo de lechugas para el formulado bionematicida líquido. Como puede observarse, todos los tratamientos estimularonel crecimientovegetalyel enraizamiento con respectoal control.De todoslos tratamientos ensayados, el que mejores resultados dio fue el producto bionematicida. Estos resultados se repitieron en los diferentes cultivos ensayados.
Resultados
Ensayo 01
De lasvaloraciones realizadas se pudo observar (figuras3y4) que hubo una diferencia notable entre las dos tesis, enlaparcelatestigoseaprecióunapérdidadevigorycolorenlasplantas,asícomouna menormasafoliar,adiferencia de las plantasa lasque se aplicóel BIOPLAGUICIDA, dondeel crecimientofue mayoryel colorverde más intenso. Esto demuestra en general el carácter estimulador del crecimiento vegetal del producto.
TABLA1
Resumen de los resultados de los análisis hematológicos
TABLA2
Diferencias entra las dos tesis
De las tablas1y2 se puede inferir que hubo una reducción drástica del númerode nematodosen generalyparticularmente de los fitopatógenos, manteniéndose la plaga controlada en todo momento. Esto se corresponde también con el aspecto general de las plantas. El producto ha demostrado que no solo es un bionematicida eficaz, sino que porlavíadela estimulacióndel crecimientovegetal,hacealas plantasmás saludablesyresistentesal ataquedelos patógenos.
Ensayo 02
De lasvaloraciones visuales se pudo observar (figuras5y6) que hubo una diferencia notable entre las dos tesis, enlos controlesse apreció una perdidadevigory colorenlas plantas,así como una menor masa foliar,a diferencia delasplantasenlasqueseaplicóelBIOPLAGUICIDA,dondeel crecimientofuemayoryelcolorverdemásintenso. Aquí también se demuestra la capacidad del producto para estimular el crecimiento vegetal.
TABLA3
Resumen de los resultados de los análisis
En este ensayo también se observó una elevada reducción de las poblaciones de nematodos, así como unabuena estimulación del crecimiento vegetal, resultando muy eficaz en el control de la plaga todo lo cual se puede comprobar en las tablas 3.
Ensayo 03
De las valoraciones visuales se pudo observar, como en los casos anteriores, una diferencia notable entre las dos tesis (figuras7y8). Las plantas tratadas conel BIOPLAGUICIDA presentan una masa foliar mucho mayory su aspecto en general es más saludable que las plantas testigo. El sistema radicular en estas últimas está mucho menos desarrolladoyenlafoto6seobservaclaramenteelataquede nemátodosadiferenciadelasplantastratadasqueposeen una masa radicular mucho mayory unaelevada presenciade raíces secundariasypelos absorbentesloque corrobora el carácter nematicidayestimulador del crecimientovegetal del producto.
Aquí también se pudo observar,como en losensayos anteriores, una reducción notable de los nematodos en general y de los fitopatógenos en particular, lo que ratifica la capacidad nematicida del producto BIOPLAGUICIDA. En particular en este ensayo, dadala presencia del género Meloidogyne,además de los análisis nematológicos, en la figura 7sepuede comprobarla ausenciade nódulos característicosdela infecciónpor estegénero,a diferenciadelafigura 8donde se observan claramente éstos en las plantas sin tratar, lo que demuestra la capacidad del BIOPLAGUICIDA para el control de nematodos fitopatógenos.
TABLA4
Resumen de los resultados de los análisis
Evaluación, descripciónymétodos:Se toman muestrasde suelo para determinarlaevolucióndelas poblaciones de nematodosysevalorael aspecto generalde las plantasde las diferentes tesis.
Resultados
Como se puede observar en la tabla 5, después de haber aplicado los 30 litros por hectárea del BIOPLAGUICIDA, vemos una reducción en el contenido de nematodos superior al 80%en todos los casos con respecto al análisis inicial, mientras que con la aplicación de Vydate se logran reducciones de más del 60%. Esto demuestra que el BIOPLAGUI-CIDApresenta unaelevada eficaciaenel controlde nematodoseincluso superioral producto químicode referencia conlo cual queda establecido que, enel cultivo utilizadoy en las condiciones del ensayo,el producto líquido elaboradoa basede las cepas autóctonasN11,SR11yALo1 resultó muy efectivo enel controlde nematodos fitopatógenos,al menos de los géneros presentes.
TABLA5
Resumen de los resultados de los análisis nematológicos
Por otra parte se llevaron a cabo valoraciones visuales de las diferentes tesis constatándose diferencias entre las distintas tesis. Enla parcela testigo se apreció una notable diferencia de vigory color, así como una menor masa foliar,en relaciónconlasplantastratadasconelBIOPLAGUICIDA,lascualessonsimilaresalasplantas tratadascon VIDATE. En estas dos últimas parcelas el crecimiento de las plantas fue mayory su aspecto mucho mejor en cuanto a colory masa foliar. Como se puede observar en las fotos figuras9y10, no hubo una diferencia significativa entre estos tratamientos.
El día de la recolección se procedió a pesar 50 piezas de coliflor por tesis, para ver las posibles diferencias en cuanto a peso. El resultado se presenta en la figura 11.
Como se aprecia enla figura11existen diferenciasimportantes en cuantoa producción donde sehan aplicado los nematicidas, con respecto a la parcela testigo.
También se realizaron valoraciones de Fitotoxicidad en todos los ensayos realizados:
Lavaloraciónsehizo sobrela totalidaddela superficie ocupadaporcada tesis apuntandola posibletoxicidaddel formulado sobre las plantas después de la aplicación.
Se miró con especial interés las tesis de los formulados.
Se observanlas plantas anotando cualquier modificaciónenel desarrollodel ciclo (inhibiciónofalloenel crecimiento, modificación fenológica,fallos en floracióno frutos,la no apariciónde ciertosórganos, etc.).
Se observósiexistían modificacionesenla cantidado calidaddelcultivo tanto cualitativa como cuantitativamente.
Se intentó detectar las deformaciones morfológicas(enrollamientos, atrofias, elongaciones, cambios enla tallao volumen de copa, marchitamientos, etc.).
Escala%de toxicidad
Resultados
No hubo ningún síntoma de fitotoxicidad en las plantas tratadas en ninguno de los ensayos realizados.
Conclusiones
En las pruebas de eficacia realizadas con el bioplaguicida de la invención, en los diferentes cultivos ensayados, aplicados en riego por goteo e inundación, a la dosis de 30 L/ha, quedó demostrado que el producto es capaz de controlarlos nemátodos fitopatógenos, produciendo una reducción importantedesu concentraciónenel sueloyraíces delas plantas,del ordendel 70-90%, con respectoalos testigossintratarysuperioral producto químicode referencia utilizado en el caso del ensayo de coliflor. En este último ensayo se pudo apreciar la presencia de agallas en las plantas testigo,a diferenciade lastesis donde se aplicaron los nematicidas.
En las valoraciones visuales se pudo observar una diferencia notable entre las dos tesis, en los controles se apreció una perdida de vigor y color en las plantas testigo, así como una menor masa foliar y el sistema radicular estaba menos desarrolladoloque demuestrala actividadde nematodos fitopatógenos,a diferenciadelas plantasenlasquese aplicaronlosnematicidasyparticularmenteelBIOPLAGUICIDAdonde,pocosdíasdespuésdelaprimera aplicación, yase observóqueel crecimientofue mayoryel colorverdemásintensoloquese mantuvoalolargodetodoel ensayo, en cada caso. Esto demuestra en general el carácter estimulador del crecimiento vegetal del producto.
No se observó fitotoxicidad en ninguno de los ensayos realizados, por el contrario los efectos del producto están relacionados con una mejorageneraldela saludde las plantas.
Claims (15)
- REIVINDICACIONES1.Un cultivo purodela cepa denominadaN11dela especie Bacillus thuringiensis, caracterizada por poseer una elevada actividad nematicida, así como actividad colagenasa, no producir β-exotoxinayque posee la capacidad para solubilizar fosfatos, depositada enla Colección Españolade CultivosTipo (CECT)conel número CECT-7665.
-
- 2.
- Un cultivo puro de la cepa denominada SR11 de la especie Bacillus mojavensis, caracterizada por su capacidad para solubilizar fosfatos del sueloyestimularel crecimientovegetal, siendo capazde producir ácido indol-3-acéticoy crecer en ácido 1-aminociclopropano 1-carboxílico (ACC) como única fuente de nitrógeno, habiendo sido depositada dicha cepa en la CECT con el número CECT-7666.
-
- 3.
- Un cultivo puro de la cepa denominada ALo1 de la especie Azospirillum brasilense,caracterizada por producir, ácido3indol acéticoconunporcientodeconversiónde entre70-90%deltriptófano añadidoenelmediodecultivo, sideróforos y otras sustancias reguladoras del crecimiento vegetal, así como de fijar nitrógeno atmosférico y con capacidadpara creceren ácido1-aminociclopropano 1-carboxílico(ACC) como única fuentede nitrógeno, depositada enla Colección Españolade CultivosTipo (CECT) conel número CECT-5856.
- 4.Un preparado biológico bionematicidayestimulador del crecimiento vegetal caracterizado por contener Bacillus thuringiensis cepaN11 (CECT-7665), Bacillus mojavensis cepa SR11 (CECT-7666)y Azospirillum brasilense cepa ALo1 (CECT-5856).
- 5.Un preparadobiológicobionematicidayestimuladordelcrecimientovegetalsegúnlareivindicación4, caracterizado porque las células microbianas son obtenidas mediante uno o varios procesos de fermentación sumergida en la cual se alcanzan concentraciones celulares mayores de 109 UFC/mL.
- 6.Unpreparadobiológicobionematicidayestimuladordel crecimientovegetalsegúnlareivindicación4ó5 caracterizado por contener células vivas de dichas tres bacterias en proporciones adecuadas para alcanzar una concentración final total mayor de 109 UFC x mL-1, en una formulación líquida.
- 7.Un preparado biológico bionematicidayestimuladordelcrecimientovegetal según reivindicación4ó5, caracterizado por contener células vivas de estas tres bacterias en proporciones adecuadas para alcanzar una concentración final total mayor de 1010 UFC x mL-1, en una formulación sólida.
- 8.Un preparado biológico bionematicidayestimuladordel crecimientovegetalsegún una cualquieradelasreivindicaciones4 a 7, caracterizado por contener ademásde las células viables,materia orgánicayotrassustancias con actividad plaguicidayreguladoras del crecimientode plantas.
- 9.Un preparado biológico bionematicidayestimulador del crecimientovegetal segúnla reivindicación6 caracterizado que presenta una estabilidad de hasta seis meses a temperatura ambiente.
- 10.Un preparado biológico bionematicidayestimulador del crecimientovegetal según reivindicación9, caracterizado porquela estabilidad esgarantizada medianteel empleode sustancias inhibidoras del crecimiento microbiano.
- 11.Un preparado biológico bionematicidayestimulador del crecimientovegetal segúnla reivindicación7 caracterizado que presenta una estabilidad de hasta un año a temperatura ambiente.
- 12.Un preparado biológico bionematicidayestimuladordel crecimiento vegetalsegúnlareivindicación11, caracterizado porque la estabilidad esgarantizada mediante un proceso de secadopor aspersión utilizando sustancias protectoras de la viabilidad celular.
- 13. Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal según una cualquiera de las reivindicaciones 7, 11 ó 12, caracterizado porque las sustancias protectoras de la viabilidad celular son la leche descremada en polvo,la Maltodextrinayla sacarosa,yla estabilidad esgarantizadamediante unprocesode secado por aspersión utilizando sustancias protectoras de la viabilidad celular.
- 14.Unpreparado biológico bionematicidayestimuladordel crecimientovegetalsegún una cualquieradelasreivindicaciones7, 11ó12, caracterizado porque las concentraciones de las sustancias protectoras son: leche descremada en polvo es usada entre el1-3%, Maltodextrina3-5%y sacarosa2-4%.yla estabilidad esgarantizada mediante un proceso de secado por aspersión utilizando sustancias protectoras de la viabilidad celular.
- 15.Un preparado biológico bionematicidayestimulador del crecimientovegetal según unade las reivindicaciones4 a 14 caracterizado porque presenta una elevada actividad al ser aplicado tanto en riego por goteo como por inundación.
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