ES2325584T3 - Purificacion de variantes de her-2. - Google Patents
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Abstract
Un método para purificación de una variante de HER-2 humana que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2, residuos 17-677, produciéndose dicha variante recombinantemente en un cultivo de células de insecto y siendo una que es adecuada para purificación por medio de cromatografía de afinidad de metales inmovilizados, comprendiendo el método la obtención, a partir de dicho cultivo de células de insecto, de una muestra sustancialmente exenta de células que contiene dicha variante, seguida por el enriquecimiento en dicha variante por medio de pasos subsiguientes de - diafiltración e cambio del medio de cultivo con tampón, seguido por - cromatografía de afinidad sobre metales inmovilizados (IMAC), seguido por - cromatografía de exclusión de tamaños (SEC), seguido por - cromatografía de cambio aniónico (AIE).
Description
Purificación de variantes de
HER-2.
La presente invención se refiere a esquemas de
purificación específicos adecuados para variantes de proteínas
marcadas con histidina derivadas del antígeno HER-2
asociado al cáncer.
Adicionalmente, la presente invención se refiere
a una variante inmunógena de HER-2 humano que es
capaz de generar una respuesta inmune en humanos, y que está
direccionada también a la molécula HER-2 humana
nativa.
La proteína de membrana HER-2
asociada al cáncer es un miembro de la familia de proteínas EGFR.
Esta proteína particular ha hecho concebir esperanzas como
inmunógeno en inmunoterapia activa específica de ciertos cánceres,
particularmente cáncer de mama y cáncer colorrectal.
El cesionario de la presente solicitud de
patente ha presentado con anterioridad solicitudes de patente
relativas a la vacunación activa contra el antígeno
HER-2, véase WO 00/20027. Investigaciones ulteriores
en este campo han identificado ahora variantes de
HER-2 preferidas para tales vacunas, pero un
problema general en la química de las proteínas estriba en idear
medios mejorados para la obtención de rendimientos satisfactorios de
proteína recombinante con un alto grado de pureza.
La cromatografía de afinidad de iones metálicos
inmovilizados (IMAC) fue introducida por primera vez por Porath
(Porath, J., J. Carlsson, I. Olsson, G. Belfrage [1975] Nature
258:598:599) bajo el término cromatografía de quelatos metálicos y
ha sido revisada previamente en varios artículos (Porath, J. [1992]
Protein Purification and Expression 3:263-281; y
artículos citados en dicho lugar). El proceso de purificación IMAC
está basado en el empleo de una matriz formadora de quelatos
cargada con iones metálicos blandos tales como Cu^{2+} y
Ni^{2+}. Grupos donantes de electrones en la superficie de las
proteínas, especialmente la cadena lateral imidazol de la
histidina, pueden fijarse a los sitios no coordinados del metal
cargado. La interacción entre el grupo donante de electrones con el
metal puede hacerse reversible por disminución del pH o por
desplazamiento con imidazol. De este modo, puede purificarse una
proteína que posea grupos donantes de electrones tales como
histidina por interacciones reversibles complejo
metálico/proteína.
En 1991, Ford et al. (Ford, C., I.
Suominen, C. Glatz [1991] Protein Expression and Purification
2:95-107) describieron la purificación de proteínas
utilizando tecnología IMAC (ligando Ni-NTA) aplicada
a proteínas recombinantes que tienen colas con residuos histidina
(proteínas recombinantes polihistidina, "proteínas marcadas con
His"). Este método aprovecha la ventaja del hecho de que dos o
más residuos histidina pueden cooperar para formar complejos de
iones metálicos muy fuertes.
Existen numerosas variantes de esta tecnología,
donde los residuos histidina se fijan como "marcadores" a la
proteína recombinante pertinente en diversas combinaciones, v.g. con
inclusión de sitios de reconocimiento para proteasas específicas de
tal modo que el marcador his puede eliminarse con posterioridad
enzimáticamente.
La expresión de proteínas en células de insecto
requiere el uso de diversos medios de cultivo especializados e
implica también contaminación de la proteína recombinante con
diversos constituyentes derivados de células de insecto que no se
encuentran en bacterias, hondos y células de mamífero. Esquemas de
purificación ideados para proteínas recombinantes producidas en
bacterias, hongos, o células de mamífero no son por tanto
necesariamente la elección óptima cuando una proteína producida en
células de insecto precisa ser purificada.
Existe por consiguiente una necesidad continua
de mejoras en la purificación de proteínas a fin de obtener
proteína de grado farmacéutico derivada de producción recombinante
en células de insecto.
Es un objeto de la invención proporcionar un
método mejorado para purificar variantes de HER-2
recombinante expresadas en células de insecto. Es un objeto
adicional de la invención proporcionar una variante inmunógena de
proteína HER-2 que es útil v.g. en el tratamiento
del cáncer por medio de inmunoterapia activa específica.
Los autores de la presente invención han ideado
un nuevo método para purificar proteína HER-2
variante hasta un grado de pureza que es aceptable para uso
farmacéutico, particularmente para uso como agentes de vacuna.
Por tanto, en un aspecto, la presente invención
se refiere a un método para purificación de una variante de la
proteína HER-2 humana que comprende la secuencia de
aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2, residuos
17-677, produciéndose dicha variante
recombinantemente en un cultivo de células de insecto y siendo una
que es adecuada para purificación por medio de cromatografía de
afinidad de metales inmovilizados, comprendiendo el método la
obtención, a partir de dicho cultivo de células de insecto, de una
muestra sustancialmente exenta de células que contiene dicha
variante, seguida por el enriquecimiento en dicha variante por medio
de pasos subsiguientes de
- -
- diafiltración e cambio del medio de cultivo con tampón, seguido por
- -
- cromatografía de afinidad sobre metales inmovilizados (IMAC), seguido por
- -
- cromatografía de exclusión de tamaños (SEC), seguido por
- -
- cromatografía de cambio aniónico (AIE).
Otro aspecto de la invención se refiere a una
variante inmunógena de la proteína HER-2 que
comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2,
residuos 17-677.
Laroche-Traineau J et
al., Journal of Chromatography, Biomedical Applications,
Elsevier, Amsterdam, Países Bajos, volumen 737, No.
1-2 enero 2000, páginas 107-117,
describen un método para purificación de una proteína bacteriana
recombinante, comprendiendo el método diálisis, cromatografía de
afinidad de metales, cromatografía de exclusión de tamaños y
cromatografía de cambio aniónico.
WO 97/24438 describe composiciones terapéuticas
que comprenden células presentadoras de antígeno, que han sido
estimuladas in vitro con una proteína de fijación de células
dendríticas (v.g. GMCSF) y un antígeno polipeptídico. Un antígeno
polipeptídico de este tipo es HER-2.
Fig. 1: Perfil cromatográfico de la IMAC.
La flecha indica el pico de 104.1
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 2: Perfil cromatográfico de la SEC.
La flecha indica el pico de monómero.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 3: Perfil cromatográfico de la AIE.
La flecha indica el pico de 104.1.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 4: Mapa del plásmido vector p992,
pMT/hHER2MA5-5DUniHis. hHER2MA5-5D:
Gen codificante de la proteína hHER2MA5-5DUH
(nucleótidos 3604-5592).
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Epítope P2: Secuencia codificante del epítope P2 en la proteína hHER2MA5-5DUH (nucleótidos 4357-4401).
- \quad
- Epítope P30: Secuencia codificante del epítope P30 en la proteína hHER2MA5-5DUH (nucleótidos 5500-5562).
- \quad
- Sitio de poliadenilación tardío de SV40: Señal poliA (nucleótidos 263-268).
- \quad
- ColE1: Origen de replicación para replicación en E. coli (nucleótidos 701-1434).
Gen de resistencia a la ampicilina: gen que
confiere resistencia a la ampicilina en bacterias (nucleótidos
1579-2439).
Promotor metalotioneína: Promotor que puede ser
inducido con cierto número de compuestos (v.g. cadmio (nucleótidos
3050-3415). Secuencia semejante a Kozak: Sitio de
fijación de ribosoma (nucleótidos 3493-3501)).
Secuencia señal BiP: Secuencia señal que dirige
la proteína variante HER-2 a secreción en el
compartimiento extracelular (nucleótidos
3502-3555).
Secuencia UniHis: secuencia que codifica el
marcador UniHis utilizada para purificación de la proteína AutoVac
de HER-2 (nucleótidos
3556-3597).
Secuencia de parada de dipeptidasa: Utilizada si
el marcador UniHis debe escindirse de la proteína AutoVac
HER-2 (nucleótidos 3598-3603).
En lo que sigue se definirán cierto número de
términos y expresiones en el contexto de la presente invención.
"Una proteína derivada de la familia EGFR"
designa una proteína que es homóloga o idéntica a EGFR humana (o
ErbB-1); HER-2 humana/neu
(ErbB-2); HER-3
(ErbB-3); o HER-4
(ErbB-4).
Una proteína "autóloga" de la familia EGFR
debe entenderse en la presente memoria descriptiva y en las
reivindicaciones que designa un polipéptido de la familia EGFR de
un animal que va a ser vacunado contra su propia proteína de la
familia EGFR. Dicho de otro modo, el término es pertinente
únicamente cuando se considera la relación con el animal que va a
ser vacunado.
Los términos "linfocito T" y "célula
T" se utilizarán de modo intercambiable para linfocitos de origen
tímico que son responsables de diversas respuestas inmunitarias
mediadas por células así como de funciones efectoras tales como
actividad adyuvante en la respuesta inmunitaria humoral.
Análogamente, los términos "linfocito B" y "célula B" se
utilizarán de modo intercambiable para linfocitos productores de
anticuerpos.
Una "célula presentadora de antígeno" (APC)
es una célula que presenta epítopes a las células T. Las células
típicas presentadores de antígeno son macrófagos, células
dendríticas y otras células fagocíticas y pinocíticas. Debe
indicarse que las células B funcionan también como APCs por
presentar epítopes T_{H} fijados por moléculas del MCH clase II a
las células T_{H}, pero cuando se utiliza generalmente el término
APC en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones debe
entenderse que se hace referencia a las células fagocíticas y
pinocíticas arriba mencionadas.
"Linfocitos T adyuvantes" o "células
T_{H}" denota células T CD4 positivas, que proporcionan ayuda a
las células B y las células T citotóxicas por la vía del
reconocimiento de epítopes T_{H} fijados a las moléculas del MHC
clase II en las células presentadores de antígeno.
El término "linfocito T citotóxico" (CTL)
se utilizará para células T CD8 positivas, que requieren la
asistencia de células T_{H} a fin de poder activarse.
En el presente contexto debe entenderse que una
respuesta inmunitaria "específica" denota una respuesta
inmunitaria policlonal dirigida predominantemente contra una
molécula o un grupo de moléculas cuasi-idénticas o,
alternativamente, contra células que presentan epítopes CTL de la
molécula o del grupo de moléculas
cuasi-idénticas.
En el presente contexto debe entenderse el
término "polipéptido" que significa tanto péptidos cortos de 2
a 10 residuos aminoácidos, como oligopéptidos de 11 a 100 residuos
de aminoácidos, y polipéptidos de más de 100 residuos de
aminoácidos. Adicionalmente, debe entenderse que el término incluye
también proteínas, es decir biomoléculas funcionales que comprenden
al menos un polipéptido; cuando están comprendidos al menos dos
polipéptidos, estos pueden formar complejos, estar enlazados
covalentemente, o pueden estar enlazados de modo no covalente. El o
los polipéptidos en una proteína puede(n) estar glicosilados
y/o lipidados y/o comprender grupos prostéticos.
El término "subsecuencia" significa
cualquier tramo consecutivo de al menos 3 aminoácidos o, cuando es
pertinente, de al menos 3 nucleótidos, derivados directamente de
una secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico
existente naturalmente, respectivamente.
Por el término "regulación decreciente de una
proteína de familia EGFR autóloga" debe entenderse en esta
memoria una reducción en el organismo vivo de la cantidad y/o
actividad de la proteína de la familia EGFR relevante. La
regulación decreciente puede obtenerse por medio de varios
mecanismos que incluyen eliminación del CEA por células de barrido
(tales como los macrófagos y otras células fagocíticas) y, lo que es
aún más importante, que las células que llevan o albergan el
antígeno son destruidas por los CTLs en el animal.
El término "inmunógeno" debe entenderse que
denota una sustancia capaz de inducir una respuesta inmunitaria en
cierto animal. Por esta razón, debe entenderse que una proteína de
familia EGFR autóloga no es un inmunógeno en el hospedador autólogo
- es necesario utilizar o bien un adyuvante fuerte y/o
co-presentar epítopes adyuvantes T con la proteína
autóloga a fin de montar una respuesta inmunitaria contra la
proteína autóloga y en tal caso el inmunógeno es la composición de
materia que es capaz de romper la autotolerancia.
El término "cantidad inmunógenamente
eficaz" tiene su significado usual en la técnica, es decir, una
cantidad de un inmunógeno, que es capaz de inducir una respuesta
inmunitaria, que combate significativamente los agentes patógenos,
que comparten característicos inmunológicas con el inmunógeno.
El término "farmacéuticamente aceptable"
tiene su significado usual en la técnica, es decir se utiliza para
una sustancia que puede ser aceptada como parte de un medicamento
para uso humano cuando se trata la enfermedad en cuestión, y por
tanto el término excluye de modo eficaz el uso de sustancias
altamente tóxicas que podrían empeorar más en lugar de mejorar la
condición del o de los individuos tratados.
Un "epítope de células T extraño", es un
péptido que es capaz de fijarse a una molécula del MHC y que
estimula las células T en una especie animal. Epítopes extraños
preferidos son epítopes "promiscuos", es decir epítopes que se
fijan a una fracción sustancial de moléculas del MHC clase II en una
especie de población animal. Un término, que se utiliza a menudo de
modo intercambiable en la técnica, es el término "epítopes
universales de las células T" para esta clase de epítopes. Se
conoce sólo un número muy limitado de tales epítopes promiscuo de
las células T, y los mismos se expondrán en detalle más adelante.
Debe indicarse que a fin de que los inmunógenos que se utilizan de
acuerdo con la presente invención sean eficaces en una fracción tan
grande de una población animal como sea posible, puede ser
necesario 1) insertar varios epítopes extraños de células T en el
mismo análogo o 2) preparar varios análogos en donde cada análogo
tiene un epítope promiscuo diferente insertado. Debe indicarse que
el concepto de epítopes extraños de células T abarca también el uso
de epítopes de células T crípticos, es decir epítopes que se
derivan de una autoproteína y que ejercen únicamente comportamiento
inmunógeno cuando se encuentren en forma aislada sin formar parte de
la autoproteína en cuestión.
Un "epítope de linfocitos T adyuvantes
extraño" (un epítope T_{H} extraño) es un epítope de células T
extraño, que se fija a una molécula del MHC clase II y puede
presentarse en la superficie de una célula presentadora de antígeno
(APC) fijada a la molécula del NHC clase II. Es importante también
añadir que la característica "carácter extraño" tiene por
tanto dos aspectos: un epítope T_{H} extraño 1) es presentado en
el contexto del MHC clase II por el animal en cuestión y 2) el
epítope extraño no se deriva del mismo polipéptido que el antígeno
diana para la inmunización - el epítope es por consiguiente extraño
también para el antígeno diana.
Un "epítope CTL" es un péptido, que es
capaz de fijarse a una molécula del MHC clase I.
El término "adyuvante" tiene su significado
usual en la técnica de la tecnología de vacunas, es decir es una
sustancia o una composición de materia que 1) no es capaz por sí
misma de preparar una respuesta inmunitaria específica contra el
inmunógeno de la vacuna, pero que 2) sin embargo, es capaz de
mejorar la respuesta inmunitaria contra el inmunógeno. O bien,
dicho de otro modo, la vacunación con el adyuvante solo no
proporciona una respuesta inmunitaria contra el inmunógeno, de tal
modo que la vacunación con el inmunógeno puede dar lugar o no a una
respuesta inmunitaria contra el inmunógeno, pero la vacunación
combinada con inmunógeno y adyuvante induce una respuesta
inmunitaria contra el inmunógeno que es más fuerte que la inducida
por el inmunógeno exclusivamente.
"Diafiltración" es una técnica que utiliza
membranas de ultrafiltración para eliminar sal o disolvente,
intercambiar tampones, o fraccionar biomoléculas de diferente
tamaño en soluciones macromoleculares. Las macromoléculas retenidas
por la membrana de ultrafiltración se concentran mientras que el
disolvente y las especies de peso molecular inferior se eliminan.
Sin embargo, una simple concentración de la muestra macromolecular
no eliminará por completo las especies más pequeñas. Por esta
razón, las especies más pequeñas deben ser "lavadas" de la
muestra utilizando volúmenes de lavado múltiples (diafiltración).
Después del proceso de diafiltración, la muestra puede concentrarse
para análisis o purificación ulterior. Esto representa una ventaja
comparado con la filtración con gel o la diálisis en la que la
muestra puede diluirse durante el proceso de separación,
requiriendo un paso de concentración adicional. No existe pérdida o
contaminación alguna cuando se utiliza la diafiltración, como podía
ocurrir con el proceso en dos pasos.
"Cromatografía de afinidad con metales
inmovilizados" (IMAC) es una técnica cromatográfica en la cual
las proteínas se purifican como consecuencia de su afinidad para
ciertos iones metálicos divalentes, véase la descripción en
"Antecedentes de la Invención".
"Cromatografía de exclusión de tamaños"
(SEC) es una técnica cromatográfica, en la cual las proteínas y
otras macromoléculas se fraccionan de acuerdo con su tamaño físico.
Las moléculas pequeñas son retenidas en los poros de la matriz y se
eluyen por tanto lentamente, mientras que las moléculas mayores se
excluyen y por consiguiente se eluyen prontamente de la matriz.
"Cromatografía de Intercambio de Aniones"
(AIE) es una técnica cromatográfica en la cual las moléculas que
tienen una carga negativa neta se retienen en la matriz de la
columna y se eluyen subsiguientemente por desplazamiento con el
anión del tampón de elución o por cambio de la carga neta de la
proteína.
La presente invención se refiere a un proceso de
purificación que está adaptado especialmente para la purificación
de variantes de HER-2 que se han producido por
recombinación en células de insecto. La presente invención se ideó
en conexión con los esfuerzos que han conducido a la preparación de
variantes inmunógenas del antígeno HER-2 asociado
al cáncer humano - estas variantes se producen en el sistema de
expresión DES®, un sistema de expresión propiedad de
GlaxoSmithKline y comercializado por Invitrogen, entre otros. El
sistema utiliza células S2 de Drosophila y vectores especializados.
El uso de células S2 como células hospedadoras para la producción
recombinante ha planteado, sin embargo, su propia serie de problemas
a resolver frente a la variante de HER-2 en
cuestión, y estos problemas han sido resueltos por utilización del
método de inventiva (entre otros, problemas con proteínas
comigratorias que se derivan de las células S2).
La proteína particular que se utiliza en los
ejemplos es una variante de HER-2 humana, que es
inmunógena en humanos - la variante incluye la secuencia de
aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 2, residuos
17-677. Sin embargo, dado que esta secuencia de
aminoácidos no es sí misma adecuada para IMAC, contiene un marcador
histidina N-terminal (residuos de aminoácidos
1-14 en SEQ ID NO: 1) que puede ser escindido por
una aminodipeptidasa (dipeptidil-peptidasa I, DPPI,
véase Pedersen J et al., 1999, Protein Expression and
Purification 15, 389-400). La secuencia de parada
para la diaminopeptidasa está constituida por los residuos 15 y 16
en SEQ ID NO: 2.
Por esta razón, en general el presente método de
purificación es especialmente adecuado para aquellas variantes de
HER-2 que incluyen una secuencia heteróloga de
aminoácidos que facilita la purificación por medio de IMAC. Esta
secuencia es una secuencia de aminoácidos heteróloga (es decir no
asociada naturalmente con la proteína derivada de la familia EGFR).
Las secuencias de aminoácidos preferidas para este propósito son
ricas en residuos histidina (v.g. el marcador His_{6} y otras
secuencias de aminoácidos con varios residuos histidina
consecutivos). La secuencia de aminoácidos heteróloga más preferida
que facilita la purificación por IMAC es aquélla que comprende los
residuos 1-14 de SEQ ID NO: 2.
Como se ha mencionado arriba, el proceso de
inventiva ha sido ideado en conexión con el trabajo sobre la
producción recombinante de ciertas variantes del antígeno
HER-2 humano. Estas variantes son características en
el sentido de que incluyen epítopes adyuvantes T extraños
promiscuos que se introducen en la secuencia de aminoácidos del
dominio extracelular de HER-2 humano. Las variantes
de HER-2 humano incluyen los epítopes P2 del toxoide
del tétanos (residuos 269-282 de SEQ ID NO: 2) y
P30 (residuos 649-669 de SEQ ID NO: 2) y la variante
más preferida tiene una secuencia de aminoácidos que está
constituida por los residuos 1-677 de SEQ ID NO:
2.
El paso de diafiltración/cambio de tampón se
realiza a una temperatura de aproximadamente 2 a aproximadamente
25ºC. Sin embargo, se utilizan con preferencia temperaturas en la
parte inferior del campo, v.g. temperaturas inferiores a 20ºC,
tales como inferiores a 15ºC o inferiores a 10ºC. Las temperaturas
más preferidas se encuentran en el intervalo comprendido entre 2 y
9ºC, por ejemplo en el intervalo entre aproximadamente 3ºC y
aproximadamente 9ºC, con un intervalo de temperatura muy preferido
de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 y especialmente preferido
de 4 a aproximadamente 6ºC. A temperaturas superiores (v.g. más allá
de 10ºC), existe tendencia a que la proteína se agregue, y esto
puede contrarrestarse por adición de un detergente, tal como un
detergente del tipo Tween.
Normalmente, la diafiltración se realiza en dos
tandas a fin de concentrar inicialmente los compuestos
macromoleculares en la muestra del medio de cultivo y después de
ello intercambiar el medio de cultivo con tampón. Estos
procedimientos se realizan siguiendo protocolos estándar en la
técnica, véanse también los ejemplos. Se prefiere que el paso de
concentración dé como resultado una concentración comprendida entre
2 y 25 veces la de los compuestos macromoleculares, tal como una
concentración entre 2 y 20 veces, 3 y 15 veces, entre 3 y 10 veces.
La concentración preferida de compuestos macromoleculares se
encuentra en el intervalo comprendido entre 4 y 8 veces, y la
concentración más preferida es aproximadamente 5 veces o hasta una
concentración total de proteínas del medio que no excede de 3
mg/ml, o con preferencia que no excede de 2 mg/ml.
El cambio de tampón se realiza típicamente en
dos pasos subsiguientes, el primero de los cuales tiene lugar a un
pH de al menos 6,5 y como máximo 7,2, y el segundo de los cuales
tiene lugar a un pH de al menos 7,0 y como máximo 8,0. No obstante,
es posible realizar ambos pasos al mismo pH en la parte solapante de
los dos intervalos. Típicamente, el cambio de tampón se realiza
utilizando un tampón de fosfato.
Una vez completado el cambio de tampón, la
severidad de los pasos siguientes se aumenta con preferencia por
adición de un agente a la muestra que competirá por la fijación a la
matriz cromatográfica en el paso IMAC a fin de reducir la cantidad
de fijación no significativa por constituyentes contaminantes. Por
ejemplo, la adición de imidazol, histidina o un tampón de alta
concentración de sal al diafiltrado y el tampón puede hacerse
aumentando la severidad. Con preferencia, cuando se utiliza
imidazol, se añade el mismo de tal modo que se alcance una
concentración en el intervalo entre aproximadamente 0,05 y
aproximadamente 20 mM, con preferencia en el intervalo de
aproximadamente 0,5 a aproximadamente 15 mM, por ejemplo en el
intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mM. Se prefiere
especialmente una concentración de imidazol comprendida en el
intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 9 mM, tal como una
concentración de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 mM, siendo
muy preferida una concentración de imidazol de aproximadamente 4 a
aproximadamente 6 mM, tal como una concentración de aproximadamente
5 mM. Cuando se utiliza un tampón con alta concentración de sal (a
menudo NaCl), la concentración está comprendida en el intervalo de
100 mM hasta aproximadamente 1 M.
Se prefiere también añadir un detergente a la
muestra diafiltrada y que ha sufrido cambio de tampón antes del
paso IMAC. El detergente se seleccionará normalmente de un éster de
ácido graso de polioxietilen-sorbitán tal como
Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, y Tween 85, un
alquilaril-poliéter-alcohol tal como
Triton X100, un detergente no iónico, y un detergente basado en
carbohidrato tal como octilglicosido. El detergente se añade
ventajosamente para alcanzar una concentración comprendida entre
aproximadamente 0,05% (v/v) y 10% (v/v), tal como aproximadamente
0,1% (v/v).
El paso IMAC implica la carga de un medio
cromatográfico con un ión metálico divalente antes de la aplicación
al mismo de la muestra que ha sufrido cambio de tampón. Típicamente,
el ión metálico divalente se selecciona del grupo constituido por
Ni^{2+}, Cu^{2+}, Zn^{2+}, Co^{2+} y Fe^{2+}. Con
preferencia, el ión metálico divalente es Zn^{2+}.
La elución del medio cromatográfico en la IMAC
se realiza por aplicación de imidazol, histidina, un tampón con
alta concentración de sal, o un cambio de pH en el medio
cromatográfico (típicamente en una columna cromatográfica). Por
ejemplo, cuando se utiliza imidazol para elución, esto se realiza
ventajosamente por aplicación del imidazol en un solo paso a una
concentración comprendida entre aproximadamente 50 mM y
aproximadamente 500 mM (tal como entre 100 y 400 mM), con
preferencia a una concentración de aproximadamente 200 mM.
Alternativamente, cuando se utiliza histidina, esto se hace por
aplicación de la histidina en un solo paso a una concentración
comprendida entre aproximadamente 20 mM y 400 mM (tal como entre 50
y 200 mM), con preferencia aproximadamente 100 mM. El tampón con
alta concentración de sal contiene usualmente NaCl en
concentraciones de hasta aproximadamente 1 o incluso 2 M.
\vskip1.000000\baselineskip
El tamaño medio de poro de la matriz SEC es con
preferencia uno que separa las proteínas globulares entre 10 kDa y
600 kDa.
Después de haber aplicado la muestra a la
matriz, se realiza la elución con un tampón de fosfato o TRIS o,
alternativamente, con un tampón biológico tal como HEPES. El tampón
preferido es un tampón TRIS.
El pH se mantiene en el intervalo de
aproximadamente 7 a aproximadamente 8 durante la SEC, y con
preferencia el pH se mantiene a aproximadamente 7,5.
En caso relevante y necesario (es decir cuando
se utiliza un tampón de fosfato en el paso SEC), la muestra que
contiene la proteína derivada de la familia EGFR obtenida de la SEC,
se diluye antes del paso AIE, a fin de ajustar la concentración de
fosfato a un valor inferior a 15 mM, tal como en el intervalo entre
10 y 12,5 mM. Sin embargo, es totalmente sorprendente que la AIE
pueda realizarse utilizando dicha concentración de tampón de
fosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
El paso final en el procedimiento de
purificación de la invención es al menos un paso AIE, uno de los
cuales se realiza utilizando una matriz de cambio de aniones
fuertes - en realizaciones preferidas, existe también un paso
precedente que implica el uso de una matriz de cambio de aniones
débiles. Esto implica con preferencia la carga de la muestra que
contiene la proteína derivada de la familia EGFR obtenida después de
SEC en una matriz de cambio de aniones fuertes o débiles.
Típicamente, la elución se realiza con una solución de NaCl
tamponada (tampón de fosfato, TRIS o un tampón biológico tal como
HEPES) a un pH entre 7 y 8, con preferencia aproximadamente pH
7,5.
La proteína obtenida en el material eluido
después de estos pasos tiene una pureza de grado clínico y está
sustancialmente exenta de contaminantes derivados del cultivo de
células de insecto.
Se contempla que un paso AIE que utilice una
matriz de cambio de aniones débiles será aplicable como un paso
entre los pasos IMAC y SEC, en lugar de incluir el mismo como parte
del paso AIE concluyente.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la diafiltración es ventajoso incluir
un paso de aclaramiento de virus (v.g. con Tween 20 al 2% y TnBP al
0,3%) y es ventajoso adicionalmente incluir un paso de filtración de
virus después de la AIE (v.g. utilizando un filtro Planova 15N o un
filtro similar), donde ambos pasos se incluyen a fin de asegurar que
el producto resultante esté exento de contaminantes clínicamente
inaceptables. En cambio, en el caso de que se emplee un sistema
exento de virus, estos dos pasos no son esenciales.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha mencionado arriba, el presente método
de inventiva se ha concebido cuando se purificaba una variante del
antígeno tumoral HER-2 humano. Esta variante
particular ha demostrado ser especialmente adecuada como agente de
vacunación para inducir reacciones inmunológicas contra
HER-2 autólogo, por lo que esta variante particular
forma también parte de la presente invención.
En general, el uso específico, la formulación,
la producción recombinante, vectores adecuados y células
hospedadoras así como otros detalles concernientes a esta variante
HER-2 específica pueden encontrarse en la
descripción del documento WO 00/20027. Por tanto, en lo que sigue
se proporciona solamente una breve exposición que se refiere
específicamente a la variante. Así pues, la descripción del
documento WO 00/20027 proporciona la doctrina necesaria
concerniente a la inmunización con variantes de
HER-2 y los métodos generales para producir éstas y
su formulación. Asimismo, es relevante la descripción hecha en WO
00/20027 en lo que respecta a la vacunación con ácido nucleico
contra el HER-2 autólogo.
Como se ha mencionado arriba, otro aspecto de la
presente invención se refiere a una variante inmunógena de la
proteína HER-2 que comprende la secuencia de
aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 2, residuos
17-677. Se prefiere que esta variante sea un
polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos presentada
en SEQ ID NO: 2, residuos 1-677, es decir una
variante que incluye también un marcador de purificación rico en
histidinilo, constituido por los residuos 1-14 de
SEQ ID NO: 2, y una secuencia de parada de aminopeptidasa
constituida por los residuos 15 y 16 en SEQ ID NO: 2.
Se incluye también en la presente invención un
fragmento de ácido nucleico que codifica esta variante inmunógena
de la proteína HER-2, tal como un fragmento de DNA.
Un fragmento de DNA especialmente preferido tiene la variante de
HER-2 que codifica la secuencia presentada en SEQ ID
NO: 1.
Herramientas útiles en la producción recombínate
de variantes de HER-2 son vectores que llevan el
fragmento de ácido nucleico de la invención. Es especialmente
preferido un vector capaz de replicación autónoma. Típicamente, el
vector se selecciona del grupo constituido por un plásmido, un fago,
un cósmido, un mini-cromosoma, y un virus.
Son especialmente preferidos los vectores de
expresión. Un vector de expresión típico de la invención comprende,
en la dirección 5' \rightarrow 3' y en enlace operativo, un
promotor para dirigir la expresión del fragmento de ácido nucleico
de la invención, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que
codifica un péptido conductor que permite la secreción de o la
integración en la membrana del fragmento polipeptídico, el fragmento
de ácido nucleico de la invención, y opcionalmente una secuencia de
ácido nucleico que codifica un terminador.
Para producción recombinante, se prefiere
especialmente una célula hospedadora transformada con el vector de
la invención. Una célula hospedadora particularmente interesante es
una célula de insecto, siendo muy preferida una célula hospedadora
derivada de Drosophila tal como una célula S2.
Forma también parte de la invención una línea de
células estable que lleva el vector de la invención y que expresa
el fragmento de ácido nucleico de la invención, y que secreta o
lleva opcionalmente en su superficie la variante inmunógena de la
proteína HER-2 de la invención.
Adicionalmente, la invención proporciona también
una composición inmunógena para inmunización contra la proteína
HER-2 en un humano, que comprende la variante
inmunógena de la proteína HER-2 arriba descrita en
mezcla con un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable y
opcionalmente un adyuvante. Detalles de formulaciones adecuadas
pueden encontrarse en WO 00/20027.
Alternativamente, la vacuna puede encontrarse en
la forma de una vacuna de ácido nucleico (para detalles
concernientes a esta tecnología, véase WO 00/20027). Así, forma
parte también de la invención una composición inmunógena para
inmunización contra la proteína HER-2 en un humano
que comprende el vector arriba descrito en mezcla con un portador o
vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un
adyuvante.
Está abarcado también dentro del alcance de la
presente invención un método para inmunizar un humano contra
HER-2 autóloga, comprendiendo el método administrar,
al ser humano, una cantidad inmunógenamente eficaz de
- -
- la variante inmunógena de la proteína HER-2 descrita en esta memoria o una composición inmunógena que comprende la variante, o
- -
- el vector descrito en esta memoria o una composición inmunógena que comprende dicho vector.
- Se prefiere especialmente que este método de inmunización (así como los diferentes medios de inmunización descritos en esta memoria) se utilice para tratamiento o mejora del cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos que siguen utilizan la "molécula
104.1" (véase SEQ ID NO: 2) que es un análogo inmunógeno de la
proteína HER-2 asociada al cáncer. No obstante, será
comprendido por las personas expertas en la técnica que la doctrina
general de la presente invención es aplicable para otras proteínas
marcadas con His, especialmente las producidas recombinantemente en
sistemas de células de insecto.
El proceso de purificación consta de los 4 pasos
de purificación generales siguientes:
1. Diafiltración con cambio de tampón del
sobrenadante de la fermentación.
2. Cromatografía de Afinidad con Metales
Inmovilizados (IMAC)
3. Filtración con gel/Cromatografía de Exclusión
de Tamaños (SEC)
4. Cromatografía de Intercambio de Anión
(AIE).
Existen adicionalmente dos pasos de aclaramiento
de virus incluidos en el proceso actualmente preferido, un paso de
desactivación de virus y un paso de filtración de virus.
\vskip1.000000\baselineskip
La diafiltración sirve para tres propósitos: 1)
para concentrar la sustancia "104.1"; 2) para eliminar del
medio de fermentación sustancias de peso molecular bajo que podrían
interferir con el paso de captura subsiguiente, tales como iones
metálicos, y 3) para cambiar el tampón por un tampón más adecuado
para la cromatografía de quelatos metálicos (IMAC). El cambio de
tampón tiene lugar en uno o dos pasos. El primer paso se efectúa en
tampón de fosfato 50 mM de pH 7,0; el segundo paso, en tampón de
fosfato 50 mM de pH 7,5, es opcional. Si la diafiltración se
realiza a pH 7,5, esta secuencia de pH parece ser crítica dado que
el paso directo a pH 7,5 conduce a la precipitación de componentes
no identificados del medio de fermentación de células de insecto.
La concentración se efectúa principalmente para reducir el tipo de
carga en la IMAC subsiguiente y reducir el consumo de tampón en el
paso de cambio de tampón, y no se ha encontrado esencial para el
proceso, dado que la IMAC subsiguiente es por naturaleza un paso de
proceso concentrador. La escala de concentración es en la
actualidad aproximadamente 5 veces o hasta una concentración total
de proteínas del medio que no exceda de 3 mg/ml (con preferencia
que no exceda de 2 mg/ml), pero experimentos que utilizan una
concentración 10 veces mayor parecen funcionar también cuando el
nivel de proteínas no llega a ser tan alto y se espera que sea
posible ir más allá, tal como 20 o incluso 25 veces. La
concentración ulterior hasta más de las 5 veces descritas en el
protocolo puede mejorar el proceso, dado que podría reducir el
tiempo de carga en la columna IMAC subsiguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
El diafiltrado puede prepararse antes de la
aplicación a la columna IMAC por adición de imidazol a una
concentración final de 0-10 mM, cuando se utiliza
imidazol en el tampón eluyente; si no se añade cantidad alguna de
imidazol (o una sustancia similar), se ha experimentado la
co-purificación de otras proteínas de las células de
insecto con 104.1.
Por el contrario, cuando la elución se realiza
con L-histidina, se añade en su lugar sal al tampón
de elución. Adicionalmente, se añade Tween 20 (después de la
filtración) a una concentración final de 0,1% (v/v). Puede
aplicarse hasta 5% para el paso IMAC, y una concentración mayor que
0,1% conducirá a menos formación de dímero. Se espera también que
sean útiles otros detergentes, obviamente otros detergentes Tween
(Tween 40, 60, 80 y 85).
\vskip1.000000\baselineskip
La sustancia 104.1 tiene un denominado marcador
His en el término N que tiene afinidad para iones metálicos
divalentes complejados en la matriz de la columna. Los parámetros
críticos son la elección de ión metálico divalente y la elección
del agente/método de elución. Ni^{2+}, Cu^{2+} y Zn^{2+}
pueden utilizarse todos ellos como el ión metálico formador de
quelatos. Sin embargo, Zn^{2+} ha proporcionado una recuperación
satisfactoria y menos impurezas. Para la elución de la 104.1
capturada pueden utilizarse varias estrategias: 1) Aplicación de
imidazol a la columna, 2) aplicación de histidina a la columna, 3)
aplicación de tampón con concentración elevada de sal a la columna,
y 4) cambio del pH de la columna.
El proceso actualmente preferido utiliza elución
por aplicación de L-histidina 100 mM en un solo
paso. No obstante, puede utilizarse disminución hasta 50 mM, pero
el resultado es 104.1 menos concentrada y menor recuperación.
Asimismo, es posible utilizar imidazol (aplicado como una solución
200 mM), y éste puede utilizarse también a concentraciones menores
(hasta 50 mM) con el mismo efecto sobre la recuperación.
\vskip1.000000\baselineskip
El ejemplo que sigue describe que la SEC se
realiza en tampón TRIS. No obstante, el fosfato parece funcionar
también satisfactoriamente, si bien TRIS es más adecuado para la AIE
subsiguiente que el fosfato. Cuando se utiliza fosfato o un tampón
TRIS que contiene sal, la dilución del material eluido SEC es
necesaria antes de aplicación a la columna AIE a fin de reducir la
concentración de fosfato, y esto no será necesario con un tampón
TRIS solo.
Si la IMAC se ha efectuado en una concentración
de Tween-20 mayor que 0,4%) la misma debe ajustarse
a < 0,4% en la SEC, dado que la proteína 104.1 no se fija a la
columna AIE si la concentración de Tween-20 es
mayor que 0,2%. Esto puede diferir cuando la AIE se lleva a cabo en
otros sistemas tampón.
\vskip1.000000\baselineskip
Las fracciones relevantes de SEC se diluyen en
agua, 1 volumen de material eluido + 3 volúmenes de agua, a fin de
reducir la concentración de fosfato cuando se pasan en fosfato, dado
que éste interfiere con la cromatografía AIE. Este problema se
discute también en el párrafo SEC.
\vskip1.000000\baselineskip
Los parámetros críticos son el pH y la fuerza
iónica de la muestra y los sistemas tampón.
Si la SEC se ha efectuado en TRIS, la
preparación de la muestra (dilución en agua) puede evitarse y el
volumen de carga (y el tiempo de carga) se reducirán. Cuando la AIE
se efectúa en tampón TRIS que incluye sal, la AIE se diluye en
tampón TRIS hasta que se alcanza una fuerza iónica inferior a 3
mS/cm.
El producto global final se analiza por
SDS-PAGE, transferencia Western (WB), ELISA, HPLC,
inspección visual, DO_{280}, pH, Lisado de Amebocitos de Limulus
(LAL) y análisis de aminoácidos. Los productos intermedios se
analizan por SDS-PAGE, WB ELISA y DO_{280}.
Como será evidente, la AIE se realiza con
preferencia como dos pasos consecutivos, donde un primer paso
utiliza una matriz de cambio de aniones débiles y un segundo paso
utiliza una matriz de cambio de aniones fuertes. Se contempla, no
obstante, que el paso que utiliza una matriz AIE débil puede
desplazarse, a fin de ser intercalado entre los pasos IMAC y
SEC.
\vskip1.000000\baselineskip
Un cultivo policlonal de células S2 de
Drosophila melanogaster se transfectó con un vector pMT (sistema
DES®, Invitrogen) que contenía el gen codificante de la variante
104.1 de HER-2; la secuencia de ácido nucleico
entera de este vector pMT se expone en SEQ ID NO: 1. Las células se
transfectaron en paralelo con un plásmido que llevaba un gen que
confería resistencia a la higromicina permitiendo el uso de
higromicina para la selección de células transfectadas.
Se utilizó una técnica de dilución limitada para
aislamiento de clones celulares simples y se produjo un Banco de
Células Maestras (MCB) a partir de la línea de células
seleccionada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se resucita un vial del MCB en un matraz T y se
propaga en matraces de sacudidas que contienen medio ExCell 420
(JRH) a 25ºC para obtener biomasa suficiente para la inoculación de
un biorreactor. Se diluye un total de 45 x 10^{9} células en 3000
ml con ExCell 420 suplementado con glutamina 4 mM, Pluronic F68 al
0,1%, y 0,5 ml/l de antiespumante PD30. Los 3000 ml se utilizan
para inocular un biorreactor Applikon (volumen de trabajo 7 l)
donde el cultivo se deja crecer durante 3 días a 25ºC, dO_{2} =
50% (100% = saturación de aire), pH = 6,5 \pm 0,1 (ajustado con
H_{3}PO_{4} al 5% y NaOH 0,5 M), y se agita a 170 rpm.
Este cultivo se diluye con ExCell 420
suplementado con glutamina 4 mM, Pluronic F68 al 0,1%, y 0,5 ml/l de
antiespumante PD30 hasta una concentración total de células de 15 x
10^{6} células/ml, y se utiliza para inoculación de un
biorreactor Applikon de 15 l de volumen de trabajo que se mantiene a
25ºC, dO_{2} = 50% (borboteo con oxígeno puro), pH = 6,5 \pm
0,1 (ajustado con H_{3}PO_{4} al 5% y NaOH 0,5 M), y se agita a
142 rpm. El cultivo se diluye continuamente con ExCell 420
suplementado con glutamina 4 mM y Pluronic F68 al 0,1% hasta que se
alcanza un volumen total de 10 l. La tasa de dilución se ajusta
diariamente para prevenir que el número de células descienda por
debajo de 15 x 106 células/ml. Se añade manualmente el antiespumante
PD30 al cultivo a fin de mantener una concentración total de 0,5
ml/l.
Una vez completada la carga, se inicia la
perfusión a 1 RV/día (volúmenes de reactor por día) utilizando el
dispositivo acústico de retención de células BioSep (AppliSens) para
prevenir la pérdida de células con el medio eliminado. A una
concentración de células de 30 x 10^{6} células/l), se introduce
el cultivo por adición de un total de CdCl_{2} 2 \muM (stock 10
mM) al cultivo y al depósito de medio.
Se recoge el medio de fermentación, se
centrifuga para obtener un sobrenadante exento de células, y se
filtra a través de un filtro PALL de 0,8/0,22 \mum. El
sobrenadante estéril resultante se guarda a -80ºC hasta su
utilización (el almacenamiento hasta 3 meses a -80ºC no ha producido
problema alguno detectable de estabilidad) o se guarda a 4ºC sin
(sic) hasta una semana (asimismo sin degradación detectable alguna
de la proteína).
El cultivo se da por terminado 10 días después
de la inducción y el medio de cultivo residual en el reactor se
desecha.
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de su utilización, si el sobrenadante de
la fermentación del Ejemplo 1 se ha mantenido a -80ºC, se descongela
lentamente a 4ºC durante una noche (las últimas 3 a 4 horas pueden
realizarse en agua fría), y se guarda después de ello durante un
máximo de 3 días a 4ºC. En caso contrario, se utiliza directamente
el sobrenadante de la fermentación.
El sobrenadante de la fermentación se centrifuga
en una centrífuga Sorvall RE5C Plus en tubos SCA3000 a 10.000 rpm
durante 15 min, a 4ºC.
La diafiltración se efectúa en una sala fría a 5
\pm 3ºC en un ProFlux M12 (Millipore) con un filtro de Casete
Pellicon 2 30 K de 0,5 m^{2} (Millipore, Cat # P2B030A05). El
filtro se guarda antes de su utilización en NaOH 0,1 M. Antes de la
diafiltración, el filtro se lava por tanto concienzuda y
completamente con agua Milli-Q. El depósito
estándar se llena con agua Milli-Q (3 l) y se lava
con agua a través del filtro hasta que quedan en el depósito 200
ml. Este procedimiento se repite 3 veces hasta que se ha pasado un
total de 12 litros a través del filtro. A continuación, puede
iniciarse la diafiltración:
- \quad
- Un máximo de 15 l de sobrenadante de fermentación se concentra aproximadamente 5 veces o hasta una concentración total de proteínas del medio que no excede de 2 mg/ml, como se mide por un método calorimétrico.
Se pone en marcha la bomba de recirculación. La
válvula de contrapresión debe estar parcialmente cerrada, a fin de
proporcionar una presión de salida que exhiba contrapresión (v.g.
0,2 bar). La velocidad de la bomba se ajusta a
30-50%. La diferencia de presión debería mostrar
0,7-1,2 bar, dado que éste es valor cuando se
utiliza la capacidad máxima del filtro y el flujo a través del
filtro corresponde a 3-4 l/min (v.g. P de salida =
0,2 bar, P de entrada = 1,0 bar, \DeltaP = 0,8). La presión de
entrada debe exhibir un valor máximo de 1,4 bar, considerando la
vida de los tubos y la eficiencia. Si se desea una presión de
entrada mayor, la presión de la bomba de recirculación puede
elevarse (%) o podría aumentarse la presión mecánica en los tubos
por aplicación de una presión mayor en éstos (escala
0-5). Cuando la válvula de contrapresión se cierra,
se recibe una presión mayor de entrada y de salida. La válvula de
contrapresión no debería estar nunca totalmente cerrada.
Subsiguientemente, el sobrenadante concentrado
de la fermentación se somete a cambio de tampón en uno o dos pasos,
utilizando primeramente 10 volúmenes de
Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 7,0, y a continuación,
en el segundo paso opcional, con 10 volúmenes
Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 7,5: El depósito
estándar en el aparato Millipore ProFlux M12 se llena con tampón
hasta un volumen total de 3 l, llenándose asimismo con tampón el
depósito lateral. El ajuste del aparato es el mismo que en el caso
de concentración de la muestra.
Se mide el volumen de la muestra que ha sufrido
cambio de tampón (Vb), y se toma una muestra para
SDS-PAGE (Sb). La muestra concentrada que ha
sufrido cambio de tampón se divide en lotes de 11 ml y 50 ml y se
congela rápidamente a -80ºC.
Se miden el pH y la fuerza iónica para asegurar
la eficiencia del cambio de tampón.
La concentración total de proteína se estima
espectrofotométricamente a 280 nm en una cubeta de 1 cm. Se utiliza
como referencia una muestra diluida 10 veces (diluida en tampón de
fosfato de sodio 50 mM de pH 7,5) con tampón de fosfato de sodio 50
mM de pH 7,5 (utilizando la aproximación Abs_{280} de 1 = 1 mg/ml
de proteína total). La concentración total de proteína puede
medirse adicionalmente por un método calorimétrico de Bradford
(BioRad). La concentración específica de la variante 104.1 se mide
por ELISA y el diafiltrado se analiza ulteriormente por
SDS-PAGE, tinción con plata y detección por
WP-ECL.
Es importante iniciar el cambio de tampón a pH
inferior a 7,1 antes de cambiar a pH 7,5. En caso contrario, los
componentes residuales del medio de fermentación precipitan.
Se han guardado a -80ºC durante varios meses
muestras diafiltradas sin cambio de eficiencia en el ELISA
cuantitativo de HER-2. No obstante, cuando se
descongelan, incluso una breve exposición a 37ºC y 54ºC hace
descender espectacularmente la eficiencia del diafiltrado en el
mismo ELISA. Cuando se mantiene a 0ºC (hielo/agua) y 4ºC después de
descongelación desde -80ºC, la eficiencia en el ELISA del
diafiltrado se mantiene estable durante 4 horas como mínimo.
Después de la diafiltración, es conveniente
desactivar cualquier virus que pudiera estar presente en el
diafiltrado. Para hacer esto, las muestras se descongelan a
2-8ºC y se reúnen, se filtran subsiguientemente a
través de filtros de 1,0/0,45/0,2 \mum, después de lo cual se
añaden Tween-20 al 50% y TnBP a una concentración
final de 2% y 0,3%, respectivamente. La solución se mantiene a
2-8ºC durante 16-20 horas mientras
se agita suavemente. La solución se filtra luego hasta 0,2 \mum
antes del paso subsiguiente de cromatografía IMAC (Ejemplo 3).
Un principio cromatográfico general para la IMAC
es la afinidad entre un "marcador" en la proteína y un complejo
quelato con ión metálico en la matriz de la columna. La matriz
cromatográfica es POROS 20MC o, con preferencia, 50MC (ambas de
Applied Biosystems) y el ión metálico formador del quelato es
Zn^{2+}. La molécula 104.1 se provee de un marcador His y el
sistema tampón para la fijación de His a la columna matriz es
Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 50 mM, 0,1% Tween 20, pH
7,5.
Se cargan 2-4 mg de 104.1 por ml
de material de la columna y se eluyen subsiguientemente utilizando
L-histidina 100 mM,
Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 7,5, y 0,1% Tween 20.
Alternativamente, cuando se eluye con imidazol 200 mM, el sistema
tampón para la fijación contiene también imidazol 5 mM.
Instrumento: VISION Work Station (Applied
Biosystems).
Software: Software de análisis de datos para
Vision, BioCAD 700E, software de la serie Version 3, Perseptive
Biosystems.
Detección: absorbancia UV para \lambda = 280 y
220 nm.
Conductividad: 0-200 mS
pH calibrado a: 7,0 y 10
Temperatura: El procedimiento se realizó con
tampones y columna a la temperatura ambiente
(20-24ºC) con carga de la muestra en hielo y
recogida de las fracciones a 10ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añade imidazol 800 mM al diafiltrado que
contiene la molécula 104.1 a una concentración final de imidazol 5
mM cuando se utiliza un tampón que contiene imidazol para la elución
en la IMAC, añadiéndose en cambio Tween-20 a una
concentración final de 0,1% (v/v) cuando se utiliza
L-histidina para la dilución en la IMAC.
Inmediatamente antes de la aplicación a la columna, la muestra se
filtra a vacío a través de un filtro de 0,22 \mum. Se mantiene la
muestra a 5 \pm 3ºC (con preferencia 4ºC) hasta la aplicación a la
columna, manteniéndola en hielo mientras se aplica. El tiempo de
manipulación a la temperatura ambiente debería minimizarse.
\vskip1.000000\baselineskip
POROS 20 MC o 50 MC (preferida) en una columna
PEEK de 16 x 100 mm (20,1 ml) (Applied Biosystems) empaquetada a
2000-2500 psi (140-175 kg/cm^{2})
- dependiendo de la escala del procedimiento de purificación, son
igualmente útiles otras columnas.
\vskip1.000000\baselineskip
Flujo: 10 ml/min.
- 1.
- 5 CV de NaPO_{4} 50 mM (abreviatura para NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4}) pH 7,5, 0,1% Tween-20 (limpio).
- 2.
- 5 CV H_{2}O (Milli-Q).
- 3.
- 40 CV ZnCl_{2} 100 mM; pH 4,5.
- 4.
- 40 CV H_{2}O (Milli-Q).
- 5.
- 20 CV NaPO_{4} 50 mM, pH 7,5, 0,1% Tween-20.
\vskip1.000000\baselineskip
La columna debería cargarse antes de cada
operación.
\vskip1.000000\baselineskip
Caudal 30 ml/min, carga 5 ml/min.
Tamaño de recogida de fracciones 9 ml, y 5 ml en
el pico de elución con L-histidina 100 mM (o, en
caso aplicable, en el pico de elución con imidazol 200 mM).
Recogida en un colector de fracciones refrigerado (10ºC).
La solución que contiene el diafiltrado,
desactivado de virus se carga en la columna a 4ºC y se lava con 20
CV de NaPO_{4} 50 mM de pH 7,5, 0,1% Tween 20, NaCl 0,5 M seguido
por 5 CV de NaPO_{4} 50 mM de pH 7,5, 0,1% Tween 20 antes de la
elución con NaPO_{4} 50 mM de pH 7,5, 0,1% Tween 20, histidina 100
mM.
Se agrupan las fracciones procedentes del pico
eluido del cromatograma (véase Fig. 1). Se comienza agrupando en el
comienzo del pico y se recoge un total de 50 ml (o 1,5 volúmenes de
columna) o se agrupan las fracciones basadas en los resultados de
SDS-PAGE/WB o ELISA hasta un total de 50 ml. Este
conjunto puede recogerse durante una noche a 5 \pm 3ºC o llevarse
inmediatamente a la SEC. Se ha demostrado que el almacenamiento del
conjunto hasta 7 días a 5 \pm 3ºC, -20ºC y a temperatura inferior
a -70ºC no da lugar a pérdida alguna en proteína total después de
filtración a través de un filtro de 0,22 \mum cuando se analiza en
SDS-PAGE y WB-ECL.
\vskip1.000000\baselineskip
Se lava la columna con 5 CV de NaOH 1 M, NaCl 2
M, seguido por 10 CV de agua. Si se necesita esterilización
adicional, véase el RSP del fabricante. La columna se guarda en EtOH
al 30% a 5-30ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El material de partida, el paso directo y las
fracciones eluidas se analizan por WB-ECL y
SDS-PAGE/con tinción con plata.
\vskip1.000000\baselineskip
El conjunto se analiza por
WB-ECL y SDS-PAGE/con tinción con
plata, HPLC y DO_{280} nm (sobre una muestra diluida 10 veces).
La concentración específica de 104.1 se determina por ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
El paso de filtración con gel se efectúa en Tris
mM, 0,1% Tween-20, pH 7,5, pero
Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 50 mM puede sustituir al Tris
como sistema tampón. Se cargan 50 ml de la IMAC del Ejemplo 3 por
Superloop (Pharmacia) en una matriz Superdex 200 de grado prep.
Instrumento: BioCAD 700E Work Station para
Cromatografía de Perfusión equipado con una célula de flujo
semi-preparativa para reducir la contrapresión en
la columna.
Software: Software de análisis de datos para
Vision, BioCAD 700E, software de la serie Version 3, Perseptive
Biosystems.
Detección: absorbancia UV a \lambda = 280 y
220 nm.
Conductividad: 0-200 mS.
pH calibrado a: 7,0 y 10
Temperatura: los tampones en la columna se
encuentran a la temperatura ambiente (20-24ºC) y la
muestra se carga directamente desde 4ºC. Las fracciones que
contienen el monómero 104.1 deberían cambiarse a 4ºC inmediatamente
después de la recogida si el colecto no está refrigerado.
\vskip1.000000\baselineskip
El conjunto procedente de IMAC en tampón,
Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 50 mM, 0,1% Tween 20,
L-histidina 100 mM (o imidazol 200 mM), pH 7,5, no
requiere preparación especial alguna. La muestra debe mantenerse
fría (5 \pm 3ºC) hasta la carga.
\newpage
Superdex 200 de grado prep, empaquetada en
columna Pharmacia XK 50 x 960 mm (1884 ml) a 15 ml/min como caudal
final. Carga máxima 50 ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Caudal general 8 ml/min, carga 5 ml/min.
Tamaño de las fracciones 9,0 ml.
- 1.
- Equilibración, 1,5 CV Tris 20 mM, 0,1% Tween-20, pH 7,5
- 2.
- Carga: por vía de Super Loop 50 ml, 5 ml/min
- 3.
- Elución 1,2 CV Tris 20 mM, 0,1% Tween-20, pH 7,5.
Las fracciones del pico de monómero (véase Fig.
2) se agrupan por comparación del gel y/o los resultados
SE/RP-HPLC a fin de obtener un producto puro
(aproximadamente 130 ml). Este conjunto puede recogerse durante una
noche a 5 \pm 3ºC o llevarse directamente a la cromatografía AIE
del Ejemplo 5. Se ha demostrado que el almacenamiento del conjunto
hasta 7 días a 5 \pm 3ºC, -20ºC y temperatura inferior a -70ºC no
da lugar a pérdida alguna de proteína total después de filtración a
través de un filtro de 0,22 \mum cuando se analiza por
SDS-PAGE y WB-ECL.
\vskip1.000000\baselineskip
La columna se limpia pasando NaOH 0,5 (sic) en
la dirección de flujo invertido durante 1-2 h a 6,5
ml/min (20 cm/h) seguido por 3 volúmenes de lecho de tampón. Para
la esterilización se hace pasar 0,5-1,0 NaOH en
dirección de flujo invertido, 13 ml/min (40 cm/h) durante
30-60 min seguidos por 3-5 volúmenes
de lecho de tampón estéril. La columna se guarda en etanol al 20% a
4-8ºC. Para información adicional se remite al
manual de los fabricantes.
\vskip1.000000\baselineskip
El material de partida y las fracciones eluidas
se analizan por WB-ECL,
SDS-PAGE/tinción con plata y
SE/RP-HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
El conjunto se analiza por
WB-ECL y SDS-PAGE/tinción con plata,
HPLC y DO_{280} nm. La concentración específica de 104.1 se
determina por ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Debe garantizarse que la muestra se mantiene a 5
\pm 3ºC entre IMAC y la carga de la Superloop.
Si el colector de fracciones no está refrigerado
(10ºC), debe garantizarse que las fracciones se cambian a una sala
fría/frigorífico inmediatamente después de la recogida.
Cuando la columna se utiliza frecuentemente, se
aplica a la columna un flujo constante (0,2 ml/min) de Tris 20 mM,
pH 7,5, 0,1% Tween-20 (alternativamente
Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 50 mM) en lugar de Tris 20 mM
y, si es éste el caso, se utiliza Tween-20 al
0,5%).
\vskip1.000000\baselineskip
La Cromatografía de Intercambio Aniónico se
realiza opcionalmente en primer lugar en una matriz Poros 50PI. La
columna se equilibra con Tris-HCl 20 mM, 0,1%
Tween-20 a pH 7,5. Después de la equilibración, se
retiene una muestra para testado de la carga biológica.
\newpage
El material eluido en la SEC se carga en la
columna a 4ºC y la columna se lava con 20 CV de Tris.HCl 20 mM,
0,1% Tween-20 a pH 7,5, seguido por elución del
producto con Tris.HCl 20 mM, NaCl 250 mM, 0,1%
Tween-20, pH 7,5. El producto agrupado se filtra a
través de 0,2 \mum, se analiza por DO_{280} nm, ELISA de 104.1,
RP-HPLC y SE-HPLC, y se guarda a
2-8ºC durante 3 días.
La columna Poros 50PI se lava abundantemente con
agua (Milli-Q) y se purga con 10 CV de NaCl 2 M,
NaOH 1 M antes de guardarla en NaOH 20 mM. La misma se esteriliza
con 5 CV de NaOH 0,5 M y se purga con H_{2}O
(Milli-Q) antes de la equilibración y la
reutilización subsiguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
La cromatografía de cambio aniónico se realiza a
pH 7,5 (TRIS 20 mM), con preferencia sobre una matriz de perfusión
de cambio de aniones fuertes POROS 50HQ (Applied Biosystems) en una
columna PEEK de 4,6 x 100 mm (1,662 ml). 104.1 se eluye en NaCl 200
mM.
Instrumento: VISION Work Station para
Cromatografía de Perfusión. Software: software de análisis de datos
para Vision BioCAD 700E, software de la serie Version 3, Perseptive
Biosystems.
Detección: absorbancia UV a \lambda = 280 y
220 nm.
Conductividad: 0-200 mS.
pH calibrado a: 7,0 y 10
Temperatura: el procedimiento se realizó con
tampones y columna a la temperatura ambiente
(20-24ºC) y carga de la muestra desde hielo. El
colector de fracciones estaba enfriado a 10ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Si se omite el primer paso opcional AI, el
compuesto intermedio de SEC puede diluirse en proporción 1 + 3 (al
25%) en agua que contiene 0,1% de Tween-20 bajo
agitación magnética moderada. En caso contrario, el material eluido
de POROS 50PI se diluye en 15 volúmenes de Tris.HCl 20 mM, 0,1%
Tween-20 a pH 7,5 para reducir la conductividad. La
muestra debería mantenerse fría (5 \pm 3ºC) hasta y durante la
carga.
\vskip1.000000\baselineskip
Se empaqueta POROS 50HQ en una columna PEEK de
4,6 x 100 mm (1,662 ml) (Applied Biosystems) a
2000-2500 psi (140-175
kg/cm^{2}).
\vskip1.000000\baselineskip
Caudal general 10 ml/min, muestra de carga (sic)
5 ml/min.
Tamaño de fracción: 9 ml durante la carga de la
muestra, 1 ml durante el primer paso de elución, y 5 ml durante el
segundo paso de elución.
La Cromatografía de Intercambio Aniónico se
realiza en una columna matriz Poros 50HQ a 4ºC. La columna se
equilibra con Tris.HCl 20 mM, 0,1% Tween-20 a pH
7,5. Después de la equilibración, se retiene una muestra para test
de la carga biológica.
La muestra se carga en la columna y la columna
se lava con 10 CV de Tris.HCl 20 mM, 0,1% Tween-20 a
pH 7,5 y 10 CV de Tris.HCl 20 mM, NaCl 20 mM, 0,1%
Tween-20 a pH 7,5 seguido por elución del producto
con Tris.HCl 20 mM, NaCl 200 mM, 0,1% Tween-20 a pH
7,5.
Las fracciones del pico de elución (véase Fig.
3) se agrupan por comparación de los resultados en gel a fin de
obtener una concentración mayor que 2,5 mg/ml o DO_{280} nm mayor
que 2,5. Las fracciones pueden guardarse durante una noche a 5
\pm 3ºC antes de agruparse. El almacenamiento del conjunto hasta 7
días a 5 \pm 3ºC -20ºC y temperatura inferior a -70ºC ha
demostrado la ausencia de pérdidas en proteína total después de
filtración a través de un filtro de 0,22 \mum cuando se analizó
por SDS-PAGE y WB-ECL.
\newpage
Se lava la columna con 10 volúmenes de columna
(CV) de NaOH 1 M, NaCl 2 M, seguido por 20 CV de agua. Si es
necesaria esterilización adicional, se remite al manual del
fabricante. La columna se guarda en etanol al 30% a
5-30ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El material de partida, el flujo directo y las
fracciones eluidas se analizan por WB-ECL y
SDS-PAGE/con tinción de plata.
\vskip1.000000\baselineskip
El conjunto se analiza por
WB-ECL y SDS-PAGE/con tinción con
plata, aspecto y descripción, pH, HPLC, LAL y DO_{280} nm (se
utiliza una muestra diluida 3 veces). La concentración específica de
104.1 se determina por ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Si el compuesto intermedio de la SEC se diluye
menos de 1 + 3 (25%), se detecta 104.1 en el flujo directo de la
AIE debido a interferencia del tampón de fosfato.
Se han aplicado hasta 25 mg de 104.1 a la
columna AIE sin cantidades detectables de 104.1 en el flujo
directo.
\vskip1.000000\baselineskip
La filtración de virus y la dilución y el
llenado subsiguientes de la sustancia fármaco tienen lugar en un
ambiente de Clase 100. Los volúmenes purificados antes de la
filtración de una o más operaciones en Poros 50HQ se retiran del
almacenamiento congelado y se descongelan a 2-8ºC.
Los mismos se filtran luego a través de 0,1 \mum y se pasan por
una membrana de filtración de virus Planova 20N. El filtro se
retiene para comprobación de la integridad. El material filtrado de
virus se ajusta a una concentración de 2,5-3,0 mg/ml
por medida de DO_{280} nm.
\vskip1.000000\baselineskip
El producto a granel final se guarda a
temperaturas inferiores a -70ºC en un recipiente de polipropileno o
vial CZ después de filtración a través de un filtro de 0,22
\mum.
El producto así obtenido tiene una pureza que es
adecuada para uso clínico.
<120> PURIFICACIÓN DE VARIANTES DE
HER-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P1020DK00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5661
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido de expresión recombinante
derivado de pMT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Señal poliA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (263)..(268)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de poliadenilación tardío de
SV40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1579)..(2439)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen de resistencia a la ampicilina,
codificado por cadena complementaria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3050)..(3415)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor metalotioneína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> RBS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3493)..(3501)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia semejante a Kozak
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3502)..(5592)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA codificante de variante
inmunógena marcada con his de HER-2 humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Péptido señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3502)..(3555)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia señal BiP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3556)..(3597)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Marcador histidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Péptido mat
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3556)..(5589)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3598)..(3603)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de parada de
dipeptidasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222>(3604)..(5589)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen codificante de la proteína
hHER2MA5-5DUH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4357)..(4401)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Epítope P2 del toxoide de la
difteria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5500)..(5562)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Epítope P30 del toxoide de la
difteria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 696
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido de expresión recombinante
derivado de pSI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (41)
1. Un método para purificación de una variante
de HER-2 humana que comprende la secuencia de
aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2, residuos
17-677, produciéndose dicha variante
recombinantemente en un cultivo de células de insecto y siendo una
que es adecuada para purificación por medio de cromatografía de
afinidad de metales inmovilizados, comprendiendo el método la
obtención, a partir de dicho cultivo de células de insecto, de una
muestra sustancialmente exenta de células que contiene dicha
variante, seguida por el enriquecimiento en dicha variante por
medio de pasos subsiguientes de
- -
- diafiltración e cambio del medio de cultivo con tampón, seguido por
- -
- cromatografía de afinidad sobre metales inmovilizados (IMAC), seguido por
- -
- cromatografía de exclusión de tamaños (SEC), seguido por
- -
- cromatografía de cambio aniónico (AIE).
2. El método de la reivindicación 1, en donde
la variante incluye una secuencia de aminoácidos heteróloga que
facilita la purificación por medio de IMAC.
3. El método de la reivindicación 2, en donde
la secuencia de aminoácidos heteróloga es rica en residuos
histidina.
4. El método de acuerdo con la reivindicación
3, en donde la secuencia de aminoácidos heteróloga comprende
residuos 1-14 de SEQ ID NO: 2.
5. El método de acuerdo con la reivindicación
1, en donde la secuencia de aminoácidos de la variante de
HER-2 humana está constituida por los residuos
1-677 de SEQ ID NO: 2.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde el paso de
diafiltración/cambio de tampón se realiza a una temperatura de
aproximadamente 2 a aproximadamente 25ºC, con preferencia a una
temperatura de aproximadamente 3 a aproximadamente 8ºC,
opcionalmente con la adición de un detergente tal como Tween cuando
la temperatura está más allá de 10ºC.
7. El método de acuerdo con la reivindicación
6, en donde la diafiltración se realiza en dos tandas a fin de
concentrar inicialmente los compuestos macromoleculares en la
muestra del medio de cultivo y después de ello intercambiar el
medio de cultivo con tampón.
8. El método de acuerdo con la reivindicación
7, en donde los compuestos macromoleculares se concentran entre
aproximadamente 2 y aproximadamente 25 veces.
9. El método de acuerdo con la reivindicación
8, en donde los compuestos macromoleculares se concentran
aproximadamente 3-5 veces.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 6-9, en donde el cambio de
tampón se realiza en uno o dos pasos subsiguientes de los cuales el
primero tiene lugar a un pH de al menos 6,5 y como máximo 7,2 y el
segundo paso opcional de los cuales tiene lugar a un pH de al menos
7,0 y como máximo 8,0.
11. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 6-10, en donde se utiliza un
tampón de fosfato para el cambio de tampón.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde se añade imidazol,
histidina o un tampón con alta concentración de sal a la muestra
diafiltrada y que ha sufrido cambio de tampón o en donde la muestra
que ha sufrido cambio de tampón se mantiene sustancialmente
inalterada.
13. El método de acuerdo con la reivindicación
12, en donde en el caso de adición de imidazol, se añade éste hasta
alcanzar una concentración comprendida entre aproximadamente 0,05 y
aproximadamente 20 mM.
14. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que un detergente
seleccionado de un éster de ácido graso de
polioxietilen-sorbitán tal como
Tween-20, Tween-40,
Tween-60, Tween-80,
Tween-85, un
alquilaril-poliéter-alcohol tal como
Triton X100, un detergente no iónico, y un detergente basado en
carbohidrato tal como octilglicosido, se añade a la muestra
diafiltrada y que ha sufrido cambio de tampón hasta alcanzar una
concentración comprendida entre aproximadamente 0,05% (v/v) y 10%
(v/v), tal como aproximadamente 0,1% (v/v).
15. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde el paso IMAC implica la
carga de un medio cromatográfico con un ión metálico divalente antes
de la aplicación de la muestra que ha sufrido cambio de tampón.
16. El método de acuerdo con la reivindicación
15, en donde el ión metálico divalente se selecciona del grupo
constituido por Ni^{2+}, Cu^{2+}, Zn^{2+}, Co^{2+},
Fe^{2+}, con preferencia Zn^{2+}.
17. El método de acuerdo con la reivindicación
15 ó 16, en donde la elución del medio cromatográfico se efectúa
por aplicación de imidazol, histidina, un tampón con alta
concentración de sal, o un cambio de pH en el medio
cromatográfico.
18. El método de acuerdo con la reivindicación
17, en donde la elución del medio cromatográfico se efectúa por
aplicación de imidazol en un solo paso a una concentración
comprendida entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 500 mM,
con preferencia a una concentración de aproximadamente 200 mM, o en
donde la elución se efectúa por aplicación de histidina en un solo
paso a una concentración entre aproximadamente 20 mM y 400 mM, con
preferencia aproximadamente 100 mM.
19. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde el paso SEC implica
elución con un tampón de fosfato o TRIS o un tampón biológico, tal
como HEPES.
20. El método de acuerdo con la reivindicación
19, en donde el pH se mantiene a aproximadamente
7-8, con preferencia aproximadamente 7,5.
21. El método de acuerdo con la reivindicación
19 ó 20, en donde el tamaño medio de poro de la matriz SEC separa
proteínas globulares entre 10 kDa y 600 kDa.
22. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde las muestras que contienen la
variante obtenida de SEC, en caso necesario, se diluyen antes del
paso AIE a fin de ajustar una concentración de fosfato a un valor
inferior a 15 mM, tal como en el intervalo comprendido entre 10 y
12,5 mM.
23. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde el paso AIE implica la
carga de la muestra que contiene la variante obtenida después de SEC
en una matriz de cambio de aniones fuertes o débiles, o de ambas
clases.
24. El método de acuerdo con la reivindicación
23, en donde la elución se realiza con una solución tamponada de
NaCl a un pH entre 7 y 8.
25. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde se intercala un paso de
desactivación de virus entre los pasos de diafiltración/cambio de
tampón e IMAC.
26. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde el paso AIE va seguido
por un paso de filtración de virus.
27. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde se intercala un paso AIE
que utiliza una columna de cambio de aniones débiles entre los pasos
IMAC y SEC.
28. Una variante inmunógena de la proteína
HER-2 que comprende la secuencia de aminoácidos
indicada en SEQ ID NO: 2, residuos 17-677.
29. La variante inmunógena de la proteína
HER-2 de acuerdo con la reivindicación 28, que está
constituida por la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID
NO: 2, residuos 1-677.
30. Un fragmento de ácido nucleico que
codifica la variante inmunógena de la proteína HER-2
de acuerdo con la reivindicación 28 ó 29.
31. El fragmento de ácido nucleico de acuerdo
con la reivindicación 30, que es un fragmento de DNA.
32. Un vector que lleva el fragmento de ácido
nucleico de acuerdo con la reivindicación 30 ó 31.
33. El vector de acuerdo con la reivindicación
32, que es capaz de replicación autónoma.
34. El vector de acuerdo con la reivindicación
32 ó 33, que se selecciona del grupo constituido por un plásmido,
un fago, un cósmido, un mini-cromosoma, y un
virus.
35. El vector de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 32-34, que es un vector de
expresión.
36. El vector de acuerdo con la reivindicación
35, que comprende en la dirección 5' \rightarrow 3' y en enlace
operativo, un promotor para dirigir la expresión del fragmento de
ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 30 ó 31,
opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica un
péptido conductor que permite la secreción de o la integración en
la membrana del fragmento polipeptídico, el fragmento de ácido
nucleico de acuerdo con la reivindicación 30 ó 31, y opcionalmente
una secuencia de ácido nucleico que codifica un terminador.
37. Una célula hospedadora transformada que
lleva el vector de una cualquiera de las reivindicaciones
32-36.
38. Una línea de células estable que lleva el
vector de acuerdo con la reivindicación 35 ó 36 y que expresa el
fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 30 ó
31, y que secreta o lleva opcionalmente la variante inmunógena de
la proteína HER-2 de acuerdo con la reivindicación
28 ó 29 en su superficie.
39. Una composición inmunógena para
inmunización contra la proteína HER-2 en un humano,
que comprende la variante inmunógena de la proteína
HER-2 de acuerdo con la reivindicación 28 ó 29 en
mezcla con un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable y
opcionalmente un adyuvante.
40. Una composición inmunógena para
inmunización contra la proteína HER-2 en un humano,
que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 35 ó 36 en
mezcla con un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable y
opcionalmente un adyuvante.
41. Uso de
- -
- la variante inmunógena de la proteína HER-2 de acuerdo con la reivindicación 28 ó 29, o
- -
- la composición inmunógena de acuerdo con la reivindicación 39, o
- -
- el vector de acuerdo con la reivindicación 35 ó 36, o
- -
- la composición inmunógena de acuerdo con la reivindicación 40, en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención del cáncer.
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