ES2231103T3 - Vehiculos de transferencia de genes derivados de adenovirus que comprenden al menos un elemento de adenovirus tipo 35. - Google Patents

Vehiculos de transferencia de genes derivados de adenovirus que comprenden al menos un elemento de adenovirus tipo 35.

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ES2231103T3 ES00201738T ES00201738T ES2231103T3 ES 2231103 T3 ES2231103 T3 ES 2231103T3 ES 00201738 T ES00201738 T ES 00201738T ES 00201738 T ES00201738 T ES 00201738T ES 2231103 T3 ES2231103 T3 ES 2231103T3
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Abstract

Un vehículo de liberación génica que comprende un gen de interés, una fibra de adenovirus de serotipo 35 y un pentón o hexón del adenovirus de serotipo 35.

Description

Vehículos de transferencia de genes derivados de adenovirus que comprenden al menos un elemento de adenovirus tipo 35.
La presente invención se refiere al campo de la terapia génica, en particular a la terapia génica que implica elementos derivados de virus, más concretamente elementos de adenovirus. Los adenovirus han sido propuestos como vehículos adecuados para liberar genes en el huésped.
Existen numerosos rasgos de los adenovirus que los hacen particularmente útiles para el desarrollo de vectores de transferencia génica para la terapia génica en humanos:
El genoma de adenovirus está bien caracterizado. Consta de una molécula de ADN de doble hebra lineal de aproximadamente 36.000 pares de bases. El ADN de adenovirus contiene Repeticiones Terminales Invertidas (ITR) idénticas de aproximadamente 90-140 pares de bases con una longitud exacta dependiendo del serotipo. Los orígenes de replicación virales están en las ITR exactamente en los extremos del genoma;
La biología de los adenovirus está caracterizada en detalle; el adenovirus no está asociado con una patología humana grave en individuos inmunocompetentes;
El virus es extremadamente eficaz al introducir su ADN en la célula huésped; el virus puede infectar una amplia variedad de células y tiene una amplia gama de huéspedes;
El virus puede ser producido a elevados títulos de virus en grandes cantidades;
El virus se puede volver de replicación deficiente mediante la deleción de la región temprana 1 (E1) del genoma adenoviral (Brody y col., 1994). La mayoría de los vectores adenovirales utilizados en la actualidad en la terapia génica tienen una deleción en la región E1, en la que se puede introducir la información genética deseada.
Basándose en estas características, los métodos preferidos para la trasferencia génica in vivo en células diana humanas, hacen uso de vectores adenovirales como vehículos de liberación de genes.
No obstante, todavía existen desventajas asociadas con el uso terapéutico de vectores adenovirales en humanos. Una desventaja principal es la existencia de una inmunidad preexistente muy difundida entre la población contra los adenovirus. La exposición a adenovirus de tipo salvaje es muy común en humanos, como ya se ha documentado ampliamente [revisado en Wadell, 1984]. Esta exposición ha dado como resultado respuestas inmunes contra la mayor parte de los tipos de adenovirus, no sólo contra los adenovirus a los cuales han sido expuestos los individuos realmente, si no también contra los adenovirus que tienen epítopos similares (neutralizantes). Este fenómeno de los anticuerpos preexistentes en humanos, combinado con una fuerte respuesta inmune humoral y celular secundaria contra el virus, puede afectar seriamente la transferencia génica utilizando vectores adenovirales recombinantes.
Hasta la fecha, se han propuesto seis subgrupos diferentes de adenovirus humanos que en total abarcan 51 serotipos de adenovirus distintos (ver la Tabla 1). Un serotipo se define basándose en su carácter distintivo inmunológico determinado por la neutralización cuantitativa con antisueros animales (caballo, conejo). Si la neutralización muestra cierto grado de reacción cruzada entre dos virus, se supone el carácter distintivo de serotipo si A) las hemaglutininas no están relacionadas, como muestra la carencia de reacción cruzada en la inhibición de la hemaglutinación, o B) existen diferencias biofísicas/bioquímicas sustanciales en el ADN (Francki y col., 1991). Los nueve serotipos identificados finalmente (42-51) fueron aislados por primera vez de pacientes infectados con VIH (Hierholzer y col. 1988; Schnurr y col., 1993). Por razones no bien comprendidas, la mayoría de los pacientes inmuno-comprometidos desprendían adenovirus raramente o jamás aislados de individuos inmunocompetentes (Hierholzer y col., 1988, 1992; Khoo y col., 1995, De Jong y col., 1998).
La inmensa mayoría de individuos habían sido expuestos previamente a adenovirus, especialmente a los serotipos de adenovirus 5 y de tipo 2 (Ad5 y Ad2) bien investigados o a serotipos inmunológicamente relacionados. Importantemente, estos dos serotipos también son los más ampliamente estudiados para su uso en terapia génica en
humanos.
El vehículo de liberación de genes según la invención también puede comprender elementos de otros (adeno)virus, con tal que se reemplace un elemento que pudiera conducir a la inmunidad contra semejante vehículo de liberación génica por un elemento de adenovirus 35 o un homólogo funcional del mismo, que tenga reducida semejante desventaja y preferiblemente que evite semejante desventaja, donde dicho homólogo funcional se selecciona del grupo formado por los adenovirus 11, 26, 34, 48 y 49. En la presente invención un vehículo de liberación génica es cualquier vehículo que sea capaz de liberar un ácido nucleico de interés en una célula huésped. Este debe, según la invención comprender un elemento de adenovirus 35 o un equivalente funcional de semejante elemento, que debe tener un efecto beneficioso en lo referente a la respuesta inmune contra semejante vehículo y donde dicho equivalente funcional se selecciona del grupo formado por los adenovirus de serotipo 11, 26, 34, 48 y 49. Básicamente todos los demás elementos que constituyen el vehículo pueden ser cualquiera de los elementos conocidos en la técnica o desarrollados en la técnica, con tal que juntos sean capaces liberar dicho ácido nucleico de interés. En principio el experto en la técnica puede utilizar y/o producir cualquiera de los productos adenovirales o sistemas de producción que puedan o hayan sido aplicados en el campo de los adenovirus. Típicamente los productos de la invención pueden ser elaborados en células de empaquetamiento utilizables v.g. para adenovirus 5, típicamente los vectores basados en adenovirus 35 pueden ser producidos y/o utilizados de la misma manera que los de los otros adenovirus v.g. adenovirus 2 y/o 5. Una buena visión de conjunto de las posibilidades de los vectores mínimos, los sistemas de empaquetamiento, la amplificación intracelular, los sistemas basados en vectores y plásmidos puede ser encontrada en las solicitudes co-pendientes de los autores de la presente solicitud (PCT/NL99/00235 y PCT/NL96/00244). Los sistemas de liberación no virales también pueden ser proporcionados con elementos según la invención como lo pueden los sistemas de liberación virales. Ambas clases de sistemas son bien conocidas en la técnica en muchas estructuras diferentes y por lo tanto no necesitan ninguna explicación adicional aquí. Una revisión de los muchos sistemas diferentes y de sus propiedades se puede encontrar en Robbins y Ghivizzani (1998) y en Prince (1998).
Los vehículos de liberación génica contienen típicamente un ácido nucleico de interés. Un ácido nucleico de interés puede ser un gen o una porción funcional de un gen (donde un gen es cualquier ácido nucleico que pueda ser expresado) o un precursor de un gen o un gen transcrito en cualquier nivel de ácido nucleico (ADN y/o ARN; de hebra doble o sencilla). Los genes de interés son bien conocidos en la técnica e incluyen típicamente aquellos que codifican proteínas terapéuticas tales como TPA, EPO, citoquinas, anticuerpos o derivados de los mismos, etc. Una visión de conjunto de las proteínas terapéuticas que se van a aplicar en terapia génica se enumera más abajo.
Factores inmunoestimuladores como los antígenos específicos de tumores, las citoquinas, etc.;
Ejemplos no limitantes de factores anti-angiogénicos, endostatina, angiostatina, ATF-BPTI CDT-6, mutantes
VEGF negativos dominantes, etc.;
Ejemplos no limitantes de factores angiogénicos, VEGF, Factores de crecimiento de fibroblastos, Oxido nítrico sintetasas, Péptidos natriuréticos de tipo C, etc.;
Proteínas inhibidoras de la inflamación como CD40 soluble, FasL, IL-12, IL-10, IL-4, IL-13 y anticuerpos de cadena sencilla excretados para CD4, CD5, CD7, CD52, IL-2, IL-1, IL-6, TNF, etc. o anticuerpos de cadena sencilla excretados para el receptor de las células T en células T autorreactivas. También se pueden utilizar mutantes negativos dominantes de PML para inhibir la respuesta inmune.
Además, se pueden utilizar antagonistas de las citoquinas promotoras de la inflamación, por ejemplo la IL-1RA (antagonista de receptor) y de los receptores solubles como sIL-1RI, sIL-1RII, sTNFRI y sTNFRII. Asimismo se pueden utilizar genes inhibidores del crecimiento y/o la respuesta inmune tales como ceNOS, Bcl3, cactus e I\kappa\beta\alpha, \beta o \gamma y las proteínas que inducen la apoptosis como la proteína VP3 del virus de la anemia de pollo. Además, se pueden utilizar genes suicidas como HSV-TK, citosina desaminasa, nitrorreductasa y linamerasa.
Un ácido nucleico de interés también puede ser un ácido nucleico que puede hibridar con una secuencia de ácido nucleico presente en la célula huésped inhibiendo de ese modo la expresión o transcripción o traducción de dicho ácido nucleico. También puede bloquear por medio de la co-supresión. En resumen un ácido nucleico de interés es cualquier ácido nucleico que se pueda desear proporcionar a una célula con el fin de inducir una respuesta por esa célula, cuya respuesta puede ser la producción de una proteína, la inhibición de semejante producción, la apoptosis, la necrosis, la proliferación, la diferenciación etc. La presente invención es la primera en describir el adenovirus 35 para uso terapéutico, para esto la invención también proporciona un adenovirus de serotipo 35 o un virus quimérico derivado de él, o un vehículo de liberación génica basado en dicho virus o su quimera para su uso como fármaco. El propio serotipo de la presente invención, el adenovirus de tipo 35, es conocido en la técnica. Es un adenovirus del grupo B poco común que fue aislado de pacientes con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida y otras alteraciones de imunodeficiencia (Flomenberg y col., 1987; De Jong y col., 1983). Se ha demostrado que el Ad 35 difiere del subgrupo C caracterizado más completamente (incluyendo Ad2 y Ad5) con respecto a las propiedades patogénicas (Basler y col., 1996). Se ha sugerido que esta diferencia puede tener correlación con las diferencias en la región E3 del genoma de Ad35 (Basler y col., 1996). El ADN de Ad35 ha sido parcialmente clonado y mapeado (Kang y col., 1989a y b; Valderrama-Leon y col., 1985).
Los serotipos de adenovirus de tipo B tales como 34 y 35 tienen una región E3 diferente de la de los otros serotipos. Típicamente esta región está implicada en la supresión de la respuesta inmune hacia los productos adenovirales. Por lo tanto esta invención proporciona un vehículo de liberación génica según la invención por medio del cual dichos elementos implicados en la evitación o disminución de la respuesta inmune comprenden los productos de expresión de E3 de adenovirus 35 o los genes que los codifican.
Otra porción de los adenovirus implicados en la respuesta inmune es la cápsida, en particular las proteínas pentónicas y/o hexónicas. Por lo tanto la invención también proporciona un vehículo de liberación génica según la invención por medio del cual los elementos comprenden al menos una proteína de la cápsida del adenovirus 35 o una porción funcional de la misma, tal como las proteínas de la fibra, pentónicas y/o hexónicas o un gen que codifique al menos una de ellas. No es necesario que una proteína completa relevante para la respuesta inmune tenga su origen en el adenovirus 35. Es perfectamente posible insertar una porción de una proteína de la fibra, pentónica o hexónica de adenovirus en otra fibra, pentón o hexón. De ese modo se obtienen proteínas quiméricas.
Asimismo es posible tener un pentón de cierto adenovirus, un hexón de otro y una fibra o una región E3 de otro adenovirus más. Según la invención al menos una de las proteínas o genes que las codifican debe comprender un elemento de adenovirus 35 o un homólogo funcional del mismo, con lo que dicho elemento tiene un efecto sobre la respuesta inmune del huésped, y donde dicho homólogo funcional se selecciona del grupo formado por adenovirus de los serotipos 11, 26, 34, 48 y 49. Así la invención proporciona una liberación génica según la invención, que es una quimera de adenovirus 35 con otro adenovirus como mínimo. De este modo también se puede modificar el virus resultante en otros aspectos en lugar de sólo la respuesta inmune. Se puede intensificar su eficacia de infección con los elementos responsables de la misma; se puede intensificar su replicación en una célula de empaquetamiento, o se puede cambiar su tropismo.
De este modo la invención proporciona v.g. un vehículo de liberación génica según la invención que tiene un tropismo diferente al del adenovirus 35. Por supuesto el tropismo debe ser alterado preferiblemente de manera que el vehículo de liberación génica sea liberado preferentemente en un subgrupo de células del huésped, es decir en las células diana. Los cambios en el tropismo y los otros cambios que también pueden ser aplicados en la presente invención de vehículos de liberación génica adenovirales o de otros genes se describen en las solicitudes co-pendientes de los autores de la presente solicitud (Núms. 98204482.8, 99200624.7 y 98202297.2). Por supuesto la presente solicitud también proporciona todos y cada uno de los elementos estructurales necesarios y/o útiles para obtener los vehículos de liberación génica y/o las quimeras, etc. de la presente invención. Esto incluye las células de empaquetamiento tales como PER.C6 (número de consigna en la ECACC 96022940) o las células basadas en ellas, pero adaptadas para Ad35; también se incluyen cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican las porciones funcionales del adenovirus 35, tales como los constructos coadyuvantes, y los constructos de empaquetamiento, así como los vectores que comprenden los genes de interés y v.g. una ITR, etc.; Típicamente los autores de la presente solicitud (PCT/NL96/00244) describen los elementos necesarios y útiles para lograr los vehículos de liberación génica de la invención. Así la invención también proporciona un ácido nucleico que codifica al menos una porción funcional de un vehículo de liberación génica según la invención, o un virus, o una quimera del mismo según la invención. Según la invención, tales elementos, que codifican funciones que terminarán en el vehículo de liberación génica resultante deben comprender o ser codificados por un ácido nucleico que codifique al menos uno de los elementos del adenovirus de serotipo 35 o un equivalente funcional del mismo, responsable de evitar o disminuir la actividad neutralizadora contra los elementos adenovirales del huésped en el cual se ha liberado el gen, donde dicho equivalente funcional de dicho elemento es de un serotipo seleccionado del grupo formado por los adenovirus de serotipo 11, 26, 34, 48 y 49. Típicamente el gen de interés estará presente en el mismo ácido nucleico lo que significa que semejante ácido nucleico tiene semejante gen o que tiene un sitio para introducir un gen de interés allí.
Típicamente semejante ácido nucleico también comprende al menos una ITR y si es un ácido nucleico que va a ser empaquetado también una señal de empaquetamiento. Sin embargo, como se ha mencionado antes todos los elementos necesarios y útiles y/o las unidades estructurales para la presente invención pueden ser encontrados en la solicitud de los autores de la presente solicitud (PCT/NL00244). Un grupo de mejoras adicionales en el campo de la producción de vehículos de liberación génica adenovirales es el sistema plasmídico de los autores de la presente solicitud descrito en PCT/NL99/00235 mencionada aquí antes. Este sistema funciona en una realización como una recombinación homóloga de un plásmido adaptador y un plásmido más largo, comprendiendo juntos todos los elementos del ácido nucleico que va a ser incorporado al vehículo de liberación génica. Estos métodos también pueden ser aplicados a los vehículos de liberación génica inventados en el momento presente y a sus elementos estructurales. De este modo la invención también proporciona un ácido nucleico según la invención que comprende adicionalmente una región de nucleótidos diseñada o utilizable para la recombinación homóloga, preferiblemente como parte de al menos un grupo de dos ácidos nucleicos que comprende un ácido nucleico según la invención, por medio del cual dicho grupo de ácidos nucleicos es susceptible de un evento de recombinación homóloga individual entre sí, que conduce a un ácido nucleico que codifica un vehículo de liberación génica funcional. Se proporcionan tanto las células de empaquetamiento vacías (en las cuales todavía se tiene que introducir o producir el vector que va a ser empaquetado para elaborar un vehículo de liberación génica según la invención) como las células que comprenden un vector según la invención que va a ser empaquetado. De este modo la invención también abarca una célula que comprende un ácido nucleico según la invención o un grupo de ácidos nucleicos según la invención, preferiblemente una célula que complementa los elementos necesarios para la replicación adenoviral que están ausentes del ácido nucleico que va a ser empaquetado, o de un grupo de ácidos nucleicos según la invención. En la presente invención se ha descubierto que los vectores de adenovirus 35 con E1 suprimida, no son susceptibles de replicación en células que proporcionan las proteínas del adenovirus 5 en trans. La invención proporciona por lo tanto adicionalmente una célula capaz de proporcionar las proteínas E1 del adenovirus 35 en trans. Semejante célula es típicamente una célula humana derivada de la retina o del riñón. Se ha demostrado que las células embrionarias tales como los amniocitos, son particularmente adecuadas para la generación de una línea celular complementadora de E1. Por lo tanto en la presente invención se prefieren tales células. La complementación específica del serotipo por las proteínas E1 puede ser debida a una o más proteínas codificadas por la región E1. Por lo tanto es esencial que al menos la proteína de serotipo específico sea proporcionada en trans en la línea celular complementadora. Las proteínas E1 no específicas del serotipo esenciales para la complementación eficaz de un adenovirus con E1 suprimida pueden derivar de otros serotipos de adenovirus. Preferiblemente, se proporciona al menos una proteína E1B del adenovirus 35 en trans para complementar los vectores basados en adenovirus 35 con E1 suprimida. En una realización el ácido nucleico que codifica una o más proteínas E1 específicas del serotipo es introducido en la célula PER.C6 o una célula que se origina a partir de PER.C6 (número de consigna en la ECACC 96022940), o una célula de empaquetamiento similar que complementa con los elementos de Ad 35. Como ya se ha referido la invención también abarca un método para producir un vehículo de liberación génica según la invención, que comprende expresar un ácido nucleico según la invención en una célula según la invención y cosechar el vehículo de liberación génica resultante. Lo anterior hace referencia al relleno de la célula de empaquetamiento vacía con los ácidos nucleicos relevantes. El formato de la célula rellena también es por supuesto parte de la presente invención, que proporciona un método para producir un vehículo deliberación génica según la invención, que comprende cultivar una célula de empaquetamiento rellena (célula productora) según la invención en un medio de cultivo adecuado y cosechar el vehículo de liberación génica resultante.
Los vehículos de liberación génica resultantes obtenibles mediante cualquiera de los métodos según la invención también son por supuesto parte de la presente invención, también concretamente un vehículo de liberación génica según la invención, que deriva de una quimera de un adenovirus y un virus integrador.
Es bien sabido que los vehículos de liberación génica adenovirales no se integran normalmente en el genoma huésped. Para la expresión a largo plazo de los genes en una célula huésped se prefiere por lo tanto preparar quimeras que tengan esa capacidad. Tales quimeras han sido descritas en la solicitud de los autores de la presente invención co-pendiente PCT/NL98/00731. Un ejemplo muy bueno de semejante quimera es un adenovirus y un virus integrador donde dicho virus integrador es un virus adenoasociado. Como se ha tratado aquí antes otras quimeras útiles, que también pueden ser combinadas con las anteriores son las quimeras (sean éstas de proteínas completas intercambiables o de partes de las mismas o ambas) que tienen un tropismo alterado. Un ejemplo muy bueno de la misma es una quimera de Ad 35 y Ad 16, posiblemente con elementos por ejemplo de Ad 2 o Ad 5, donde la porción determinante del tropismo de Ad 16 se utiliza para dirigir el vehículo de liberación génica a sinoviocitos y/o células de la musculatura lisa (ver las solicitudes co-pendientes de los autores de la presente invención Núms. 98204482.8 y 99200624.7). Las células dendríticas (CD) y las células del tallo hematopoyético (CTH) no son fácilmente transducidas con vehículos génicos derivados de Ad2 y Ad5. La presente invención proporciona vehículos de liberación génica que poseen una capacidad de transducción de células CD y CTH incrementada. Tales vehículos de liberación génica comprenden al menos la porción determinante del tropismo del tejido de un adenovirus Ad35. La invención proporciona por lo tanto adicionalmente el uso de una porción determinante del tropismo hacia tejido de una cápsida del adenovirus 35 para transducir células dendríticas y/o células del tallo hematopoyético. Otros adenovirus de tipo B también son adecuados. Una porción determinante del tropismo hacia tejido comprende al menos la protuberancia y/o el eje de una proteína de la fibra. Por supuesto para una persona experta en la técnica es muy posible determinar las secuencias de aminoácidos responsables el tropismo hacia el tejido en la proteína de la fibra. Semejante conocimiento puede ser utilizado para idear proteínas quiméricas que comprendan tales secuencias de aminoácidos. Tales proteínas quiméricas son por lo tanto parte de la invención. Las células CD son células presentadoras de antígenos muy eficaces. Introduciendo el vehículo de liberación génica en tales células el sistema inmune del huésped puede ser disparado hacia antígenos específicos. Tales antígenos pueden estar codificados por ácidos nucleicos liberados en las CD o por las proteínas del propio vehículo de liberación génica. La presente invención también proporciona por lo tanto un vehículo de liberación génica con la capacidad de eludir el sistema inmune del huésped como una vacuna. El vector es capaz de eludir el sistema inmune lo suficiente para encontrar eficazmente células diana y al mismo tiempo es capaz de liberar antígenos específicos para las células presentadoras de antígenos permitiendo de ese modo la inducción y/o la estimulación de respuestas inmunes eficaces hacia el antígeno o los antígenos específicos. Para modular adicionalmente la respuesta inmune, el vehículo de liberación génica puede comprender proteínas y/o ácidos nucleicos que codifican tales proteínas capaces de modular una respuesta inmune. Se encuentran ejemplos no limitantes de tales proteínas entre las interleuquinas, las moléculas adherentes, las proteínas co-estimuladoras, los interferones etc. La invención proporciona por lo tanto adicionalmente una vacuna que comprende un vehículo de liberación génica de la invención. La invención proporciona adicionalmente un vector de adenovirus con la capacidad de transducir eficazmente CD y/o CTH, comprendiendo el vehículo al menos una porción determinante del tropismo hacia el tejido del adenovirus de serotipo 35. La invención proporciona adicionalmente el uso de semejantes vehículos de liberación para la transducción de células CTH y/o CD. Se encontraron tropismos hacia el tejido similares entre otros adenovirus de serotipo B, concretamente en el serotipo 11 y son también parte de la invención. Por supuesto también es posible proporcionar otros vehículos de liberación génica con la porción determinante del tropismo hacia el tejido proporcionando de ese modo a tales vehículos de liberación una capacidad de transducción de CD y/o CTH. Tales vehículos de liberación génica también son por lo tanto parte de la invención.
Los vehículos de liberación génica según la invención pueden ser utilizados para liberar genes o ácidos nucleicos de interés en las células del huésped. Este será típicamente un uso farmacéutico. Semejante utilización está incluida en la presente invención. Las composiciones adecuadas para semejante uso también son parte de la presente invención. La cantidad de vehículo de liberación génica que se necesita que esté presente por dosis o por infección (m.o.i.) dependerá de la afección que se vaya a tratar, de la ruta de administración (típicamente parenteral), del sujeto y de la eficacia de la infección, etc. Los estudios para descubrir la dosis son bien conocidos en la técnica y se pueden utilizar típicamente aquellos ya realizados con otros vehículos de liberación génica (adenovirales) como pautas para encontrar las dosis adecuadas de los vehículos de liberación génica según la invención. Típicamente es aquí donde se pueden encontrar excipientes adecuados, medios de administración adecuados, medios adecuados de prevención de la infección con el vehículo cuando no se desee, etc. Así la invención también proporciona una formulación farmacéutica que comprende un vehículo de liberación génica según la invención y un excipiente adecuado, así como una formulación farmacéutica que comprende un adenovirus o una quimera del mismo según la invención y un excipiente adecuado.
Descripción detallada
Como se ha descrito antes, los serotipos de adenovirus más ampliamente estudiados no son idealmente adecuados para liberar material genético adicional en las células huésped. Esto se debe parcialmente a la inmunidad preexistente entre la población contra estos serotipos. Esta presencia de anticuerpos preexistentes en humanos, combinada con una fuerte respuesta inmune humoral y celular secundaria contra el virus afectarán a la terapia génica viral.
La presente invención proporciona el uso de al menos los elementos de un serotipo de adenovirus que son muy adecuados como vectores de terapia génica. La presente invención también describe un rastreo de alto rendimiento automatizado de todos los serotipos de adenovirus conocidos contra los sueros de muchos individuos. Sorprendentemente, no se encontró capacidad neutralizadora en ninguno de los sueros que se evaluaron frente a un serotipo concreto, el adenovirus 35 (Ad 35). Esto hace extremadamente útil el serotipo de la presente invención como sistema vector para la terapia génica en el hombre. Semejante sistema vector es capaz de transferir eficazmente material genético a una célula humana sin el problema inherente de la inmunidad preexistente.
Típicamente, se produce un virus utilizando un vector adenoviral (típicamente un vector plasmídico, cosmídico o de baculovirus). Tales vectores también son por supuesto parte de la presente invención. La invención también proporciona vectores derivados de adenovirus que se han vuelto de replicación deficiente mediante deleción o inactivación de la región E1. Por supuesto, también se puede insertar un gen de interés por ejemplo en el sitio de la E1 del adenovirus original del cual deriva el vector. En todos los aspectos de la invención los adenovirus pueden contener deleciones en la región E1 e inserciones de genes heterólogos conectados o no a un promotor. Además, los adenovirus pueden contener deleciones en las regiones E2, E3 o E4 e inserciones de genes heterólogos conectados a un promotor. En estos casos, se requieren las líneas celulares complementadoras de E2 y/o E4 para generar adenovirus recombinantes.
Se puede elegir la utilización del propio serotipo Ad35 para la preparación de los adenovirus recombinantes que van a ser utilizados en la terapia génica. Alternativamente, se puede elegir la utilización de elementos derivados del serotipo de la presente invención en tales adenovirus recombinantes. Se puede desarrollar por ejemplo un adenovirus quimérico que combine las propiedades deseables de diferentes serotipos. Algunos serotipos tienen una gama de huésped algo limitada, pero tienen la ventaja de ser menos inmunogénicos, algunos lo contrario. Algunos tienen el problema de ser de virulencia limitada, pero tienen una amplia gama de huésped y/o una inmunogenicidad reducida. Tales adenovirus quiméricos son conocidos en la técnica, y se pretende que estén dentro del alcance de la presente invención. Así en una realización la invención proporciona un adenovirus quimérico que comprende al menos una porción del genoma de adenovirus del presente serotipo, proporcionándole la ausencia de inmunidad preexistente, y al menos una porción del genoma de adenovirus de otro serotipo de adenovirus dando como resultado un adenovirus quimérico. De esta manera el adenovirus quimérico producido es tal que combina la ausencia de inmunidad preexistente del serotipo de la presente invención, con otras características de otro serotipo. Tales características pueden ser la estabilidad frente a la temperatura, el ensamblaje, el anclaje, la infección re-dirigida, el rendimiento de producción, la infección re-dirigida o mejorada, la estabilidad del ADN en la célula diana, etc.
Generalmente se necesitará una célula de empaquetamiento con el fin de producir una cantidad suficiente de adenovirus. Para la producción de adenovirus recombinantes para la terapia génica, se encuentran disponibles numerosas líneas celulares. Entre estas se incluyen pero no están limitadas a las líneas celulares conocidas PER.C6 (número de consigna en la ECACC 96022940), 911, 293, y E1 A549. Un importante rasgo de la presente invención es el método para producir el adenovirus. Típicamente, no se desea que un lote de adenovirus para aplicaciones clínicas contenga adenovirus de replicación competente. En general por lo tanto, se desea omitir numerosos genes (al menos uno) del genoma adenoviral del vector adenoviral y facilitar estos genes al genoma de la célula a la cual se dirige el vector para producir el adenovirus quimérico. Semejante célula es denominada normalmente célula de empaquetamiento. Por tanto la invención también proporciona una célula de empaquetamiento para producir un adenovirus (un vehículo de liberación génica) según la invención, que comprende en trans todos los elementos necesarios para la producción de adenovirus no presentes en el vector adenoviral según la invención. Típicamente el vector y la célula de empaquetamiento deben ser adaptados entre sí ya que tienen todos los elementos necesarios, pero no tienen elementos solapantes que conduzcan a un virus de replicación competente mediante recombinación.
Por tanto, la invención también proporciona un conjunto de piezas que comprende una célula de empaquetamiento según la invención y un vector recombinante según la invención por medio del cual no hay esencialmente secuencia solapante que conduzca a la recombinación dando como resultado la producción de adenovirus de replicación competente entre dicha célula y dicho vector.
Por tanto la presente invención proporciona los métodos para producir adenovirus, que tras la aplicación escapará de la inmunidad humoral preexistente, que comprende proporcionar un vector con elementos derivados de un serotipo de adenovirus contra el cual no existe virtualmente inmunidad natural y transfectar dicho vector a una célula de empaquetamiento según la invención y permitir la producción de partículas virales.
En un aspecto esta invención describe el uso del serotipo de adenovirus de la presente invención para superar la actividad neutralizadora del huésped existente por naturaleza o inducida hacia los adenovirus administrados in vivo para aplicaciones terapéuticas. La necesidad de un nuevo serotipo está acentuada por las observaciones de que 1) la liberación sistémica repetida del adenovirus de serotipo 5 recombinante es infructuosa debido a la formación de elevados títulos de anticuerpos neutralizadores contra el adenovirus de serotipo 5 recombinante (Schulick y col, 1997), y 2) la inmunidad preexistente o humoral está muy difundida en la población.
En otro aspecto la invención proporciona el uso de vehículos de liberación génica de la invención o el uso del serotipo 35 de adenovirus para vacunación. Semejante uso evita al menos en parte las respuestas inmunes no deseadas del huésped. Ejemplos no limitantes de respuestas inmunes no deseadas están evocando una respuesta inmune contra el vehículo de liberación génica o el serotipo 35 de adenovirus y/o reforzando una respuesta inmune contra el vehículo de liberación génica o el serotipo 35 de adenovirus. En otro aspecto de la invención, se realiza un uso alternante de vectores de Ad pertenecientes a diferentes subgrupos. Este aspecto de la invención salva por lo tanto la incapacidad para repetir la administración de un adenovirus con fines de terapia génica.
Ejemplo 1 Análisis de elevado rendimiento para la detección de la actividad neutralizadora en suero humano
Para permitir el rastreo de la presencia de anticuerpos neutralizadores contra todos los serotipos de adenovirus en una gran cantidad de suero humano, se desarrolló un análisis de 96 pocillos automatizado.
Sueros humanos
Se seleccionó un panel de 100 individuos. Los voluntarios (50% hombres, 50% mujeres) eran individuos sanos entre 20 y 60 años de edad sin restricción de raza. Todos los voluntarios firmaron un informe de consentimiento. Se excluyeron las personas implicadas profesionalmente en la investigación de adenovirus.
Se recogieron aproximadamente 60 ml de sangre en tubos secos. En las dos horas posteriores a la toma de muestras, la sangre fue centrifugada a 2.500 rpm durante 10 minutos. Se transfirieron aproximadamente 30 ml de suero a tubos de polipropileno y se almacenaron congelados a -20ºC hasta su uso adicional.
El suero se descongeló y se inactivó con calor a 56ºC durante 10 minutos y después se formaron alícuotas para evitar ciclos repetidos de congelación/-descongelación. Parte se utilizó para realizar cinco etapas de diluciones a la mitad en medio (DMEM, Gibco, BRL) en una cantidad suficiente para llenar aproximadamente 70 placas de 96 pocillos. Las alícuotas de sueros no diluidos y diluidos fueron pipeteadas en placas de pocillos profundos (formato de 96 pocillos) y utilizando un PlateMate programado dispensadas en alícuotas de 100 \mul en placas de 96 pocillos. De este modo las placas fueron cargadas con ocho sueros diferentes por duplicado (100 \mul/pocillo) conforme al siguiente esquema:
3
Donde S1/2 a S8/2 en las columnas 1 y 6 representan sueros diluidos 1x y Sx/4, Sx/8, Sx/16 y Sx/32 las diluciones seriadas a la mitad. Las últimas placas también contenían cuatro pocillos cargados con 100 \mul de suero de ternera fetal como control negativo. Las placas se mantuvieron a -20ºC hasta su uso adicional.
Preparación de soluciones de partida de adenovirus humano
Se inocularon prototipos de todos los adenovirus humanos conocidos en matraces T25 sembrados con células PER.C6 (número de consigna en la ECACC 96022940) (Fallaux y col., 1998) y se cosecharon tras el ECP completo. Tras congelar/descongelar se utilizaron 1-2 ml de productos lisados brutos para inocular un matraz T80 con células PER.C6 (número de consigna en la ECACC 96022940) y el virus fue cosechado a un ECP completo. El marco temporal entre la inoculación y la aparición de ECP así como la cantidad de virus necesaria para re-infectar un nuevo cultivo, diferían entre los serotipos. Las soluciones de partida de adenovirus fueron preparadas mediante congelación/descongelación y se utilizaron para inocular 3-4 matraces de tres capas T175 cm^{2} con células PER.C6 (número de consigna en la ECACC 96022940). Tras la aparición de ECP, las células se cosecharon tapando el matraz, se sedimentaron y el virus se aisló y se purificó mediante un gradiente en CsCl de dos etapas como sigue. Los sedimentos celulares fueron disueltos en 50 ml de tampón NaPO_{4} 10 mM (pH 7,2) y congelados a -20ºC. Después de descongelar a 37ºC, se añadieron 5,6 ml de desoxicolato de sodio (5% p/p). La solución se mezcló suavemente y se incubó durante 5-15 minutos a 37ºC para lisar completamente las células. Después de homogeneizar la solución, se añadieron 1.875 \mul de MgCl_{2} 1M. Tras la adición de 375 \mul de ADNasa (10 mg/ml) la solución se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Los restos celulares se separaron por centrifugación a 1.880 x g durante 30 minutos a la temperatura ambiente sin interrupción. El sobrenadante se purificó con posterioridad de las proteínas mediante extracción con freón (3x). El sobrenadante aclarado se cargó en un gradiente en bloque de cloruro de cesio tamponado con Tris/HCl 1 M (intervalo: 1,2/1,4 g/ml) y se centrifugó a 21.000 rpm durante 2,5 horas a 10ºC. La banda de virus se aísla después de lo cual se realiza una segunda purificación utilizando un gradiente continuo tamponado con Tris/HCl 1M de 1,33 g/ml de cloruro de cesio. El virus fue centrifugado después durante 17 horas a 55.000 rpm a 10ºC. La banda de virus se aísla y se añade sacarosa (50% p/v) a una concentración final del 1%. El exceso de cloruro de cesio se separa mediante diálisis (tres veces 1 hora a la temperatura ambiente) y portas para diálisis (Slide-a-lizer, corte 10.000 kDa, Pierce, USA) frente a 1,5 litros de PBS suplementado con CaCl_{2} (0,9 mM), MgCl_{2} (0,5 mM) y una concentración creciente de sacarosa (1, 2, 5%). Después de la diálisis, el virus es separado del "Slide-a-lizer" después de lo cual se toman alícuotas en porciones de 25 y 100 \mul tras lo cual el virus es almacenado a -85ºC.
Para determinar el número de partículas de virus por mililitro, se hacen pasar 50 \mul del lote de virus por una cromatografía líquida de alta presión (HPLC) como describen Shabram y col. (1997). Los virus se hicieron eluir utilizando un gradiente de NaCl que oscilaba de 0 a 600 mM. Como se representa en la Tabla I, la concentración de NaCl a la cual eluían los virus difería significativamente entre los serotipos.
La mayor parte de los adenovirus humanos replicaban bien en las células PER.C6 (número de consigna en la ECACC 96022940) con pequeñas excepciones. Los adenovirus de tipo 8 y 40 se hicieron crecer en células 911-E4 (He y col., 1998). Las soluciones de partida purificadas contenían entre 5x10^{10} y 5x10^{12} partículas de virus/ml (PV/ml; ver la tabla I).
Titulación de soluciones de partida de adenovirus humano purificado
Los adenovirus fueron titulados en células PER.C6 (número de consigna en la ECACC 96022940) para determinar la cantidad de virus necesaria para obtener un ECP completo en cinco días, la duración del análisis de neutralización. A este fin, se dispensaron 100 \mul de medio a cada pocillo de las placas de 96 pocillos. Se añadieron 25 \mul de soluciones de partida de adenovirus prediluidas 10^{4}, 10^{5}, 10^{6} o 10^{7} veces a la columna 2 de una placa de 96 pocillos y se mezclaron pipeteando arriba y abajo 10 veces. Después se llevaron 25 \mul de la columna 2 a la columna 3 y de nuevo se mezclaron. Esto se repitió hasta la columna 11 después de lo cual se descartaron 25 \mul de la columna 11. De este modo se obtuvieron diluciones seriadas en etapas a la quinta parte partiendo de una solución de partida prediluida. Después se añadieron 3x10^{4} células PER.C6 (número de consigna en la ECACC 96022940) en un volumen de 100 \mul y las placas se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante cinco o seis días. Se controló microscópicamente el ECP. Se utilizó el método de Reed y Muensch para calcular la dosis inhibidora del cultivo celular en un 50% (DICC50).
Análogamente se crearon placas idénticas que fueron analizadas utilizando el análisis MTT (Promega). En este análisis se cuantifican células vivas mediante tinción colorimétrica. A este fin, se añadieron 20 \mul de MTT (7,5 mg/ml en PBS) a los pocillos y se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante dos horas. El sobrenadante fue separado y se añadieron a los pocillos 100 \mul de una solución 20:1 de isopropanol/Triton-X100. Las placas se pusieron en un aparato de sacudimiento de 96 pocillos durante 3-5 minutos para solubilizar la tinción precipitada. Se midió la absorbancia a 540 nm y a 690 nm (fondo). Mediante este análisis se pueden distinguir los pocillos con el ECP en proceso o con el ECP completo.
Análisis de neutralización
Se descongelaron placas de 96 pocillos con muestras de suero humano diluido a 37ºC, CO_{2} al 5%. Se prepararon soluciones de partida de adenovirus diluidas a 200 DICC50 por 50 \mul y se añadieron alícuotas de 50 \mul a las columnas 1-11 de las placas con suero. Las placas fueron incubadas durante 1 hora a 37ºC, CO_{2} al 5%. Después se dispensaron 50 \mul de células PER.C6 (número de consigna en la ECACC 96022940) a 6x10^{5}/ml en todos los pocillos y se incubaron durante 1 día a 37ºC, CO_{2} al 5%. El sobrenadante se separó utilizando puntas de pipeta nuevas para cada fila y se añadieron 200 \mul de medio de nueva aportación a todos los pocillos para evitar los efectos tóxicos del suero. Las placas fueron incubadas durante otros 4 días a 37ºC, CO_{2} al 5%. Además, se establecieron placas de control paralelas por duplicado con sueros de control positivos diluidos generados en conejos y específicos para cada serotipo que se iba a someter a ensayo en las filas A y B y con suero de control negativo (FCS) en las filas C y D. Asimismo, en cada una de las filas E-H se realizó una titulación como se ha descrito antes con etapas de dilución a la quinta parte partiendo de una DICC50 de 200 de cada virus que va a ser sometido a ensayo. El día 5 una de las placas de control fue analizada microscópicamente y con el análisis MTT. Se calculó el título experimental a partir de la placa de titulación de control observada microscópicamente. Si se encontraba que el ECP era completo, es decir la primera dilución en el experimento de titulación de control analizada mediante MTT muestra una clara muerte celular, todas las placas de análisis eran tratadas. Si no, se dejaba continuar el análisis durante uno o más días hasta que el ECP completo era evidente después de lo cual se trataban todas las placas. En la mayoría de los casos el análisis terminaba el día 5. Para Ad1, 5, 33, 39, 42 y 43 el análisis se dejó durante seis días y para Ad2 durante ocho días.
Se considera que una muestra de suero no es neutralizadora cuando a la concentración de suero más elevada se observa una protección máxima del 40% en comparación con los controles sin suero.
Los resultados del análisis de los adenovirus prototipo 44 frente al suero de 100 voluntarios sanos se muestran en la figura 1. Como se esperaba el porcentaje de las muestras de suero que contenían anticuerpos neutralizadores para Ad2 y Ad5 era muy elevado. Esto también se verificaba para la mayor parte de los adenovirus de numeración inferior. Sorprendentemente, ninguna de las muestras de suero contenía anticuerpos neutralizadores para el adenovirus de serotipo 35. Asimismo, el número de individuos con títulos de anticuerpo neutralizadores para los serotipos 26, 34 y 48 era muy bajo.
Por lo tanto, los adenovirus con E1 suprimida basados en Ad35 o uno de los otros serotipos mencionados antes tienen una importante ventaja en comparación con los vectores recombinantes basados en Ad5 respecto al aclaramiento de los virus por los anticuerpos neutralizadores.
Asimismo, los vectores basados en Ad5 que tienen (partes de) las proteínas de la cápsida implicadas en la respuesta inmunogénica del huésped remplazadas por las correspondientes (partes de) proteínas de la cápsida de Ad35 o uno de los otros serotipos serán menos, o incluso no serán, neutralizados por la inmensa mayoría de los sueros humanos.
Como se puede observar en la tabla I la razón PV/DICC50 calculada a partir de las partículas del virus por ml y la DICC50 obtenida para cada virus en los experimentos era muy variable y oscilaba entre 0,4 y 5 log. Esto estaba causado probablemente por las diferentes eficacias de infección de las células PER.C6 (número de consigna en la ECACC 96022940) y por las diferencias en la eficacia de replicación de los virus. Además, pueden desempeñar un papel las diferencias en las calidades de los lotes. Una elevada razón PV/DICC50 representa que se habían puesto más virus en los pocillos para obtener el ECP en 5 días. Como consecuencia el resultado del estudio de neutralización podría estar influido puesto que más partículas de virus (inactivas) podían enmascarar los anticuerpos. Para verificar si este fenómeno había tenido lugar, se trazó la proporción PV/DICC50 frente al porcentaje de las muestras de suero que se había encontrado que eran positivas en el análisis (Figura 2). El gráfico muestra claramente que no hay correlación negativa entre la cantidad de virus del análisis y la neutralización en suero.
Ejemplo 2 Generación de vectores plasmídicos de Ad5 para la producción de virus recombinantes y la fácil manipulación de genes adenovirales PBr/Ad.Bam-rITR (consigna ECACC P97082122)
Con el fin de facilitar la clonación de extremos romos de las secuencias ITR, se trató ADN de adenovirus de tipo 5 humano de tipo salvaje (Ad5) con la enzima de Klenow en presencia de dNTP en exceso. Tras la inactivación de la enzima de Klenow y la purificación mediante extracción con fenol/cloroformo seguida de precipitación con etanol, el ADN fue digerido con BamHI. Esta preparación de ADN fue utilizada sin purificación adicional en una reacción de ligadura con el ADN del vector derivado de pBr322 preparado como sigue: se digirió el ADN de pBr322 con EcoRV y BamHI, se desfosforiló mediante tratamiento con la enzima ISAP (Life Techonologies) y se purificó en gel de agarosa LMP (SeaPlaque GTG). Tras la transformación en E. Coli DH5\alpha competente (Life Technologies) y el análisis de las colonias resistentes a ampicilina, se seleccionó un clon que mostraba un patrón de digestión como se esperaba para un inserto que se extendía desde el sitio BamHI de Ad5 a la ITR derecha.
El análisis de la secuencia del límite de clonación de la ITR derecha revelaba que la mayor parte de los restos G 3' de la ITR se habían perdido, se encontró que el resto de la ITR era correcto. Dicho resto G perdido es complementado por la otra ITR durante la replicación.
PBr/Ad.Sal-rITR (consigna ECACC P97082119)
PBr/Ad.Sal-rITR fue digerido con BamHI y SalI. El fragmento vector que incluía el inserto de adenovirus fue aislado en agarosa LMP (SeaPlaque GTG) y ligado a un fragmento SalI-BamHI de 4,8 kb obtenido a partir de ADN de Ad5 wt y purificado con el estuche de Genclean II (Bio 101, Inc.). Se seleccionó un clon y se determinó la integridad de las secuencias de Ad5 mediante análisis con enzimas de restricción. El clon pBr/Ad.Sal-rITR contiene adenosecuencias de tipo 5 desde el sitio SalI en el pb 16746 hasta e incluyendo la rITR (perdiendo la mayoría de los restos G 3').
PBr/Ad.Cla-Bam (consigna ECACC P97082117)
Se digirió adenoADN de tipo 5 wt con ClaI y BamHI, y se aisló el fragmento de 20,6 kb del gel mediante electro-elución. Se digirió pBr322 con las mismas enzimas y se purificó a partir del gel de agarosa mediante Geneclean. Ambos fragmentos fueron ligados y transformados en DH5\alpha competente. El clon resultante pBr/Ad.Cla-Bam fue analizado mediante digestión con enzimas de restricción y se demostró que contenía un inserto con secuencias de adenovirus desde el pb 919 al 21566.
PBr/Ad.AflII-Bam (consigna ECACC P97082114)
El clon pBr/Ad.Cla-Bam fue linealizado con EcoRI (en pBr322 y digerido parcialmente con AflII. Tras la inactivación con calor de AflII durante 20' a 65ºC los extremos del fragmento fueron rellenados con la enzima de Klenow. Después el ADN fue ligado a un oligoligador de doble hebra de extremos romos que contenía un sito PacI (5'-AATTGTCTTAATTAACCGCTTAA-3'). Este conector fue elaborado recociendo los siguientes dos oligonucleótidos: 5'-AATTGTCTTAATTAACCGC-3' Y 5'-AATTGCGGTTAATTAAGAC-3', seguido de formación de extremos romos con la enzima de Klenow. Tras la precipitación del ADN ligado para cambiar el tampón, las ligaduras fueron digeridas con un exceso de enzima PacI para separar los concatámeros del oligo. El fragmento parcial de 22016 pb que contenía las secuencias de Ad5 desde el pb 3534 hasta el 21566 y las secuencias vectoras, fue aislado en agarosa LMP (SeaPlaque GTG), religado y transformado en DH5\alpha competente. Se seleccionó un clon que se había encontrado que contenía el sitio PacI y que había conservado el fragmento de adeno grande y se secuenció en el extremo 5' para verificar la inserción correcta del conector PacI en el sitio AflII (perdido).
PBr/Ad.Bam-rITRpac#2 (consigna ECACC P97082120) y PBr/Ad.Bam-rITRpac#8 (consigna ECACC P97082121)
Para permitir la inserción de un sitio PacI cerca de la ITR de Ad5 en el clon pBr/Ad.Bam.rITR se separaron aproximadamente 190 nucleótidos entre el sitio ClaI del esqueleto de pBr322 y el inicio de las secuencias ITR. Esto se realizó como sigue: pBr/Ad.Bam-tITR fue digerido con ClaI y tratado con la nucleasa Bal31 durante diferentes intervalos de tiempo (2', 5', 10' y 15'). Se siguió el grado de separación de nucleótidos para separar las reacciones del ADN de pBr322 (también digerido en el sitio ClaI), utilizando tampones y condiciones idénticos. La enzima Bal31 fue inactivada por incubación a 75ºC durante 10', el ADN fue precipitado y resuspendido en un volumen más pequeño de tampón TE. Para asegurar los extremos romos, los ADN se trataron adicionalmente con ADN polimerasa T4 en presencia de dNTP en exceso. Tras la digestión del ADN de pBr322 (control) con SalI, se observó una degradación satisfactoria (150 pb) en la muestra tratada durante 10' o 15'. Las muestras de pBr/Ad.Bam-rITR tratadas 10' o 15' fueron ligadas después a los conectores PacI de extremos romos descritos antes (Ver pBr/Ad.AflII-Bam). Las ligaduras fueron purificadas por precipitación, digeridas con PacI en exceso y separadas de los conectores en gel de agarosa LMP. Tras la religadura, los ADN fueron transformados en DH5\alpha competentes y se analizaron las colonias. Se seleccionaron diez clones que mostraban una deleción de aproximadamente la longitud deseada y estos fueron analizados adicionalmente mediante secuenciación T-track (estuche secuenciador de T7, Pharmacia Biotech). Se encontraron dos clones con el conector PacI insertado inmediatamente curso abajo de la rITR. Tras la digestión con PacI, el clon #2 tiene 28 pb y el clon #8 tiene 27 pb anclados a la ITR.
PWE/Ad.AflII-rITR (consigna ECACC P97082116)
Se utilizó el vector cosmídico pWE15 (Clontech) para clonar insertos de Ad5 más grandes. Primero, se insertó un conector que contenía un sitio PacI único en los sitios EcoRI de pWE15 creando pWE.pac. Con este propósito, se utilizó el oligo PacI de doble hebra descrito para pBr/Ad.AflII-BamHI pero ahora con sus extremos EcoRI salientes. Después se aislaron los siguientes fragmentos mediante electroelución en gel de agarosa: pWE.pac digerido con PacI, pBr/AflII-Bam digerido con PacI y BamHI y pBr/Ad.Bam-rITR#2 digerido con BamHI y PacI. Estos fragmentos fueron ligados entre sí y empaquetados utilizando extractos de empaquetamiento del fago \lambda (Stratagene) según el protocolo del fabricante. Tras la infección en bacterias huésped, se desarrollaron colonias sobre las placas y se analizaron en cuanto a la presencia del inserto completo. PWE/Ad.AflII-rITR contiene todas las secuencias de adenovirus de tipo 5 desde el pb 3534 (sitio AflII) hasta la ITR derecha inclusive (perdiendo la mayoría de los restos G 3').
PBr/Ad.lITR-Sal(9.4) (consigna ECACC P97082115)
Se trató adeno ADN 5 wt tratado con enzima de Klenow en presencia de dNTP en exceso y con posterioridad se digirió con SalI. Dos de los fragmentos resultantes, denominados ITR izquierda-Sal (9.4) y Sal(16.7)-ITR derecha, respectivamente, fueron aislados en agarosa LMP (SeaPlaque GTG). Se digirió ADN de pBr322 con EcoRV y SalI y se trató con fosfatasa (Technologies). El fragmento vector fue aislado utilizando el método Geneclean (BIO 101, Inc.) y ligado a los fragmentos SalI de Ad5. Sólo la ligadura con el fragmento de 9,4 kb producía colonias con un inserto. Tras el análisis y la secuenciación del límite de clonación se seleccionó un clon que contenía la secuencia ITR en toda su longitud y se prolongó hasta el sitio SalI en el pb 9462.
PBr/Ad.lITR-Sal(16.7) (consigna ECACC P97082118)
PBr/Ad.lITR-Sal(9.4) es digerido con SalI y desfosforilado (TSAP, Life Technologies). Para prolongar este clon hasta el tercer sitio SalI de Ad5, se linealizó pBr/Ad.Cla-Bam con BamHI y se digirió parcialmente con SalI. Se aisló un fragmento SalI de 7,3 kb que contenía secuencias de adenovirus desde 9462-16746 en gel de agarosa LMP y se ligó al fragmento vector pBr/Ad.lITR- Sal(9.4) digerido con SalI.
PWE/Ad.AflII-EcoRI
PWE.pac fue digerido con ClaI y los extremos 5' salientes fueron rellenados utilizando la enzima de Klenow. El ADN fue digerido después con PacI y aislado en gel de agarosa. PWE/AflII-rITR fue digerido con EcoRI y tras el tratamiento con la enzima de Klenow fue digerido con PacI. El fragmento grande de 24 kb que contenía las secuencias adenovirales fue aislado en gel de agarosa y ligado al vector pWE.pac de extremos romos y digerido con ClaI utilizando el estuche LigationExpres® de Clontech. Tras la transformación de células Ultracompetent XL10-Gold de Stratagene, se identificó que los clones contenían el inserto esperado. PWE/AflII-EcoRI contiene secuencias de Ad5 de los pb 3534-27336.
Generación de pWE/Ad.AflII-rITRsp
La ITR 3' del vector pWE/Ad.AflII-rITR no incluye el nucleótido G terminal. Además, el sitio PacI está localizado a casi 30 pb de la ITR derecha. Ambas características pueden disminuir la eficacia de la generación de virus debido al inicio ineficaz de la replicación en la ITR 3'. Obsérvese que durante la generación del virus la ITR izquierda del plásmido adaptador está intacta y permite la replicación del ADN del virus tras la recombinación homóloga.
Para mejorar la eficacia de inicio de la replicación en la ITR 3', se modificó pWE/Ad.AflII-rITR como sigue: primero se digirió el constructo pBR/Ad.Bam-rITRpac#2 con PacI y después se digirió parcialmente con AvrII y se aisló el fragmento que contenía el vector de 17,8 pb y se desfosforiló utilizando la enzima SAP (Boehringer Mannheim). Este fragmento carece de las adenosecuencias desde el nucleótido 35464 a la ITR 3'. Utilizando ADN de pWE/Ad.AflII-rITR como molde y los cebadores ITR-EPH:
5'-CGG AAT TCT TAA TTA AGT TAA CAT CAT CAA TAA TAT ACC-3' y
Ad101: 5'-TGA TTC ACA TCG GTC AGT GC-3'
Se generó un fragmento mediante PCR de 630 pb que correspondía a las secuencias 3' de Ad5. Este fragmento de la PCR fue clonado con posterioridad en el vector pCR2.1 (Invitrogen) y se aislaron los clones que contenían el fragmento de la PCR y se secuenciaron para verificar la correcta amplificación del ADN. El clon de la PCR fue digerido después con PacI y AvrII y el inserto de adeno de 0,5 kb fue ligado al fragmento pBr/Ad.Bam-rITRpac#2 digerido con PacI/AvrII parcial generando pBr/Ad.Bam-rITRsp. A continuación se utilizó este constructo para generar un clon cosmídico (como se ha descrito antes) que tiene un inserto correspondiente a las adenosecuencias 3534 a 35938. Este clon fue denominado pWE/AflII-rITRsp.
Generación de pWE/Ad.AflII-rITR\DeltaE2A
La deleción de las secuencias codificadoras de E2A de pWE/Ad.AflII-rITR (consigna ECACC P97082116) ha sido completada como sigue. Las secuencias adenovirales que flanquean la región codificadora de E2A a la izquierda y a la derecha fueron amplificadas a partir del plásmido pBr/Ad.Sal.rITR (consigna ECACC P97982119) en una reacción de PCR con el sistema Expand PCR (Boehringer) según el protocolo del fabricante. Se utilizaron los siguiente cebadores:
Secuencias limítrofes por la derecha (correspondientes a los nucleótidos 24033 a 25180 de Ad5):
\DeltaE2A.SnaBI:
5'-GGC GTA CGT AGC CCT GTC GAA AG-3'
\DeltaE2a.DBP-inicio:
5'-CCA \underline{ATG \ CAT} TCG AAG TAC TTC CTT CTC CTA TAG GC-3'.
El fragmento de ADN amplificado fue digerido con SnaBI y NsiI (el sitio NsiI es generado en el cebador \DeltaE2A.
DBP-inicio, subrayado).
Secuencias limítrofes por la izquierda (correspondientes a los nucleótidos 21557 a 22442 de Ad5):
\DeltaE2A.DBP-terminación:
5'-CCA \underline{ATG \ CAT} ACG GCG CAG ACG G-3'
\DeltaE2a.BamHI:
5'-GAG GTG GAT CCC ATG GAC GAG-3'
El ADN amplificado fue digerido con BamHI y NsiI (el sitio NsiI es generado en el cebador \DeltaE2A.DBP-terminación, subrayado).
Con posterioridad, los fragmentos de ADN digeridos fueron ligados en pBr/Ad.Sal-rITR digerido con SnaBI/
BamHI. La secuenciación confirmaba la reposición exacta de la región codificadora de DBP con un único sitio NsiI en el plásmido pBr/Ad.Sal-rITR\DeltaE2A. Se puede utilizar el único sitio NsiI para introducir una casete de expresión para un gen que va a ser transducido mediante el vector recombinante.
La deleción de las secuencias codificadoras de E2A se realizó de manera que los sitios aceptores del empalme del gen que codifica L4 de 100 K en la posición 24048 en la hebra superior se dejaron intactos. Además, las señales de poliadenilación de los ARN de E2A y los ARN de L3 originales de la izquierda de las secuencias codificadoras se dejaron intactas. Esto asegura la expresión apropiada de los genes de L3 y del gen que codifica la proteína L4 de 100 K durante el ciclo vital del adenovirus.
A continuación, se generó el plásmido pWE/Ad.AflII-rITR\DeltaE2A. El plásmido pBr/Ad.Sal-rITR\DeltaE2A fue digerido con BamHI y SpeI. El fragmento de 3,9 Kb en el que la región codificadora de E2A era remplazada por el único sitio NsiI fue aislado. El pWE/Ad.AflII-rITR fue digerido con BamHI y SpeI. El fragmento de ADN de 35 Kb, del cual se separaba el fragmento BamHI/SpeI que contenía la secuencia codificadora de E2A, fue aislado. Los fragmentos fueron ligados y empaquetados utilizando extractos de empaquetamiento del fago \lambda según el protocolo del fabricante (Stratagene), rindiendo el plásmido pWE/Ad.AflII-rITR\DeltaE2A.
Este clon cosmídico puede ser utilizado para generar vectores adenovirales que tienen E2A suprimida mediante co-transfección de ADN digerido con PacI junto con plásmidos adaptadores digeridos sobre células de empaquetamiento que expresan el producto génico de E2A funcional.
Construcción de plásmidos adaptadores
La ausencia de solapamiento de la secuencia entre el adenovirus recombinante y las secuencias de E1 en la línea celular de empaquetamiento es esencial para la generación libre de ARC segura y la propagación de nuevos virus recombinantes. El plásmido adaptador pMLPI.TK (descrito en PCT/NL96/00244) es un ejemplo de un plásmido adaptador diseñado para su uso según la invención en combinación con las líneas celulares de empaquetamiento mejoradas de la invención. Este plásmido fue utilizado como sustancia de partida para elaborar un nuevo vector en el cual las moléculas de ácido nucleico que comprenden un promotor específico y las secuencias génicas pueden ser fácilmente intercambiadas.
Primero, se generó un fragmento de PCR a partir de ADN molde de pZip\DeltaMo+PyF101(N^{-}) (descrito en PCT/
NL96/00195) con los siguientes cebadores: LTR-1: 5'-CTG TAC GTA CCA GTG CAC TGG CCT AGG CAT GGA AAA ATA CAT AAC TG-3' Y LTR-2: 5'-GCG GAT CCT TCG AAC CAT GGT AAG CTT GGT ACC GCT AGC GTT AAC CGG GCG ACT CAG TCA ATC G-3'. Se utilizó ADN polimerasa de Pwo (Boehringer Manheim) según el protocolo del fabricante con los siguientes ciclos de temperatura: una vez 5' a 95ºC; 3' a 55ºC; y 1' a 72ºC, y 30 ciclos de 1' a 95ºC, 1' a 60ºC, 1' a 72ºC, seguido de una vez 10' a 72ºC. El producto de la PCR fue digerido después con BamHI y ligado en el vector pMLP10 (Levrero y col., 1991) digerido con PvuII y BamHI, generando de ese modo el vector pLTR10. Este vector contiene secuencias adenovirales desde el pb 1 al pb 454 seguido de un promotor que constaba de una parte de la LTR Mo-MuLV cuyas secuencias intensificadoras de tipo salvaje estaban remplazadas por el intensificador de un virus del polioma mutante (PyF101). El fragmento promotor fue denominado L420. A continuación, se insertó la región codificadora del gen HSA murino. Se digirió pLTR10 con BstBI seguido de tratamiento de Klenow y digestión con NcoI. El gen HSA fue obtenido mediante amplificación por PCR en pUC18-HSA (Kay y col., 1990) utilizando los siguientes cebadores: HSA1, 5'-GCG CCA CCA TGG GCA GAG CGA TGG TGG C-3' y HSA2, 5'-GTT AGA TCT AAG CTT GTC GAC ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG ATG TAG AA-3'. El fragmento amplificado de 269 pb fue subclonado en un vector lanzadera utilizando los sitios NcoI y BglII. La secuenciación confirmó la incorporación de la secuencia codificadora correcta del gen HSA, pero con una inserción de TAG extra directamente después del codón de terminación TAG. La región codificadora del gen HSA, incluyendo la duplicación de TAG fue separada después por corte en forma de un fragmento NcoI(cohesivo)-SalI(romo) y clonado en el fragmento NcoI(cohesivo)/BstBI(romo) de 3,5 kb de pLTR10, dando como resultado pLTR-HSA10.
Finalmente, se digirió pLTR-HSA10 con EcoRI y BamHI después de lo cual se insertó el fragmento que contenía la ITR izquierda, la señal de empaquetamiento, el promotor L420 y el gen HSA en el vector pMLP1.TK digerido con las mismas enzimas y remplazando de ese modo el promotor y las secuencias génicas. Esto daba como resultado el nuevo plásmido pAd/L420-HSA adaptador que contiene los sitios de reconocimiento convenientes para diversas enzimas de restricción próximos al promotor y las secuencias génicas. SnaBI y AvrII pueden ser combinados con HpaI, NheI, KpnI, HindIII para intercambiar las secuencias promotoras, mientras los últimos sitios pueden ser combinados con los sitios ClaI o BamHI 3' de la región codificadora de HSA para remplazar los genes de este constructo.
Otro plásmido adaptador que fue diseñado para permitir el fácil intercambio de moléculas de ácido nucleico fue elaborado remplazando las secuencias promotoras, génicas y poli A en pAd/L420-HSA por el promotor de CMV, un sitio de clonación múltiple, un intrón y una señal poli A. Para este fin, se digirió pAd/L420-HSA con AvrII y BglII seguido de tratamiento con Klenow para obtener extremos romos. El fragmento de 5,1 kb con el vector pBr322 y las secuencias adenovirales fue aislado y ligado a un fragmento de 1570 pb romo de pcDNA1/amp (Invitrogen) obtenido mediante digestión con HhaI y AvrII seguido de tratamiento con ADN polimerasa T4. Este plásmido adaptador fue denominado pAd5/CLIP. Para permitir la separación de secuencias vectoras de la ITR izquierda en pAd/Clip, éste plásmido fue parcialmente digerido con EcoRI y el fragmento lineal fue aislado. Se recoció un oligo de la secuencia 5' TTAAGTCGAC-3' consigo mismo dando como resultado un conector con un sitio SalI y EcoRI saliente. El conector fue ligado al vector pAd5/Clip parcialmente digerido y se seleccionaron los clones que tenían el conector insertado en el sitio EcoRI 23 pb curso arriba de la ITR de adenovirus izquierda en pAd/Clip dando como resultado pAd5/Clipsal. Del mismo modo, se ha cambiado el sitio EcoRI de pAd/5/Clip por un sitio PacI mediante inserción de un conector de secuencia 5'-AATTGTCTTAATTAACCGCAATT-3'. El vector pAd5/Clip fue digerido parcialmente con EcoRI, desfosforilado y ligado al conector PacI con EcoRI saliente. La mezcla de ligadura fue digerida con PacI para separar los concatámeros, aislada en gel de agarosa y religada. El vector resultante fue denominado pAd5/Clippac. Estos cambios permiten más flexibilidad para liberar la ITR izquierda de las secuencias vectoras plasmídicas. El vector pAd5/L420-HSA también fue modificado para crear un sitio SalI o PacI curso arriba de la ITR izquierda. A este fin pAd5/L420-HSA fue digerido con EcoRI y ligado al conector PacI descrito antes. La mezcla de ligadura fue digerida con PacI y religada tras el aislamiento del ADN lineal en gel de agarosa para separar los conectores concatamerizados. Esto daba como resultado un plásmido adaptador pAd5/L420-HSApac. Este constructo fue utilizado para generar pAd5/L420-HSAsal como sigue: pAd5/L420-HSApac fue digerido con ScaI y BsrGI y el fragmento vector fue ligado al fragmento de 0,3 kb aislado tras la digestión de pAd5/Clipsal con las mismas enzimas.
Generación de plásmidos adaptadores pAdMire y pAdApt
Para crear un plásmido adaptador que contenga solamente una secuencia poliligadora y no secuencias promotoras o poli A, se digirió pAd5/L420-HSApac con AvrII y BglII. El fragmento vector fue ligado a un oligonucleótido conector digerido con las mismas enzimas de restricción. El conector fue elaborado recociendo oligos de la siguiente secuencia:
\newpage
PLL-1: 5'-GCC ATC CCT AGG AAG CTT GGT ACC GGT GAA TTC GCT AGC GTT AAC GGA TCC TCT AGA CGA GAT CTG G-3' y
PLL-2: 5'-CCA GAT CTC GTC TAG AGG ATC CGT TAA CGC TAG CGA ATT CAC CGG TAC CAA GCT TCC TAG GGA TGG C-3'.
Los conectores recocidos fueron digeridos con AvrII y BglII y separados de los extremos pequeños mediante purificación en columna (estuche de separación de nucleótidos Qiaquick) según las recomendaciones de los fabricantes. El conector fue ligado después al fragmento pAd5/L420-HSApac digerido con AvrII/BglII. Se seleccionó un clon, denominado AdMire, que tenía el conector incorporado y fue secuenciado para verificar la integridad del inserto. El plásmido adaptador AdMire permite la fácil inserción de casetes de expresión completas.
Se construyó un plásmido adaptador que contenía el promotor de CMV humano que media elevados niveles de expresión en células humanas como sigue: pAd5/L420-HSApac fue digerido con AvrII y los extremos salientes 5' fueron rellenados utilizando la enzima de Klenow. Una segunda digestión con HindIII dio como resultado la separación de las secuencias promotoras de L420. El fragmento vector fue aislado y ligado a un fragmento de PCR que contenía la secuencia promotora de CMV. Este fragmento de la PCR fue obtenido tras la amplificación de las secuencias de CMV de pCMVLacI (Stratagene) con los siguientes cebadores:
CMVplus:
5'-GATCGGTACCA\underline{CTGCAG}TGGTCAATATTGGCCATTAGCC-3' y
CMVminA:
5'-GATC\underline{AAGCTT}CCAATGCACCGTTCCCGGC-3'.
El fragmento de la PCR fue digerido primero con PstI (subrayado en CMVplus) después de lo cual los extremos salientes 3' fueron separados mediante tratamiento con ADN polimerasa T4. Después el ADN fue digerido con HindIII (subrayado en CMVminA) y ligado en el fragmento vector pAd5/L420-HSApac descrito antes digerido con AvrII y HindIII. El plásmido resultante fue denominado pAd5/CMV-HSApac. Este plásmido fue digerido después con HindIII y BamHI y el fragmento vector fue aislado y ligado a la secuencia poliligadora obtenida tras la digestión de AdMire con HindIII y BglII. El plásmido resultante fue denominado pAdApt. El plásmido adaptador pAdApt contiene los nucleótidos 735 a +95 del promotor de CMV humano (Boshart y col., 1985). Una segunda versión de este plásmido adaptador que contiene un sitio SalI en lugar del sitio PacI curso arriba de la ITR izquierda fue elaborada insertando el fragmento ScaI-BsrGI de 0,7 kb de pAd5/Clipsal en pAdApt digerido con ScaI y digerido parcialmente con BsrGI. Este clon fue denominado pAdApt.sal.
Generación de adenovirus recombinantes basados en Ad5
Se pueden generar adenovirus recombinantes sin ARC muy eficazmente utilizando los plásmidos adaptadores descritos antes y los constructos pWe/Ad.AflII-rITR o pWe/Ad.AflII-rITRsp. Generalmente, el plásmido adaptador que contiene el transgen deseado en la casete de expresión deseada es digerido con enzimas adecuadas para liberar el inserto de secuencias vectoras en el extremo 3' y/o 5'. Los plásmidos de complementación adenovirales pWE/Ad.AflII-rITR o pWE/Ad.AflII-rITRsp son digeridos con PacI para liberar las adenosecuencias del los plásmidos vectores. Como ejemplo no limitante se describe la generación de AdApt-LacZ. Se generó el plásmido adaptador pAdApt-LacZ como sigue. El gen LacZ de E. Coli fue amplificado a partir del plásmido pMLP.nlsLacZ (EP 95-202.213) mediante PCR con los cebadores 5'-GGGGTGGCCAGGGTACCTCTAGGCTTTTGCAA-3' y 5'-GGGGGGATCCATAAACAAGTTCAGAATCC-3'. La reacción de PCR fue realizada con Ex Taq (Takara) según el protocolo de los proveedores con el siguiente programa de amplificación: 5 minutos a 94ºC, 1 ciclo; 45 segundos a 94ºC y 30 segundos a 60ºC y 2 minutos a 72ºC, 5 ciclos; 45 segundos a 94ºC y 30 segundos a 65ºC y 2 minutos a 72ºC, 25 ciclos; 10 minutos a 72; 45 segundos a 94ºC y 30 segundos a 60ºC y 2 minutos a 72ºC, 5 ciclos, ciclo I. El producto de la PCR fue digerido con posterioridad con KpnI y BamHI y el fragmento de ADN digerido fue ligado en pcDNA3 (Invitrogen) digerido con KpnI/BamHI, dando lugar a pcDNA3.nlsLacZ. El constructo pcDNA3.LacZ fue digerido después con KpnI y BamHI y el fragmento LacZ de 3 kb fue aislado en gel utilizando el estuche Geneclean Spin (Bio 101, Inc.). pAdApt también fue digerido con KpnI y BamHI y el fragmento vector lineal fue aislado en gel como antes. Ambos fragmentos aislados fueron ligados y se seleccionó un clon que contenía el inserto LacZ. El constructo pAdApt-LacZ fue digerido con SalI, purificado mediante el estuche Geneclean Spin y con posterioridad digerido con PacI. PWE/Ad.AflII-rITRsp fue digerido con PacI. Ambas mezclas de digestión fueron tratadas durante 30' a 65ºC para inactivar las enzimas. Las muestras fueron colocadas en gel para estimar la concentración. Se sembraron 2,5x10^{6} células PER.C6 (consigna ECACC 96022940) en matraces T25 en DMEM con FCS al 10% y MgCl 10 mM. Al día siguiente se transfectaron cuatro microgramos de cada plásmido a las células PER.C6 (consigna ECACC 96022940) utilizando el reaccionante de transfección lipofectamina (Life Technologies Inc.) según las instrucciones del fabricante. Al día siguiente el medio fue reemplazado por medio de cultivo de nueva aportación y las células fueron cultivadas adicionalmente a 37ºC, CO_{2} al 10%. De nuevo 24 horas más tarde fueron tratadas con tripsina, sembradas en matraces T80 y cultivadas a 37ºC, CO_{2} al 10%. Se obtuvo un ECP completo 6 días después de la siembra en los matraces T80. Las células fueron cosechadas en el medio y sometidas a un ciclo de congelación/descongelación. El producto lisado bruto obtenido de este modo fue utilizado para purificar en placa la mezcla de virus. Se escogieron diez placas, se desplegaron en una placa de 24 pocillos y se sometieron a ensayo en cuanto a la expresión de LacZ tras la infección de las células A549. Los virus de las diez placas expresaban LacZ.
Ejemplo 3 Generación de adenovirus recombinantes quiméricos Generación de adenovirus basados en Ad5 quiméricos del hexón
Los anticuerpos neutralizadores en suero humano están dirigidos principalmente a la proteína hexónica y en un grado menor a la proteína pentónica. Las proteínas hexónicas de los diferentes serotipos muestran regiones muy variables presentes en bucles que se pronostica que están expuestas en la parte externa del virus (Athappilly y col., 1994; J. Mol. Biol. 242, 430-455). Para estas regiones altamente variables han sido mapeados la mayoría de los epítopos de tipo específico (Toogood y col., 1989; J. Gen Virol. 70, 3203-3214). Así la reposición de (parte de) las secuencias del hexón por las correspondientes secuencias de un serotipo diferente es una estrategia eficaz para evitar los anticuerpos neutralizadores (preexistentes) de Ad5. Las secuencias que codifican el hexón del adenovirus de serotipo 5 están localizadas entre los nucleótidos 18.841 y 21.697. Para facilitar el fácil intercambio de las secuencias que codifican el hexón de los serotipos de adenovirus alternativos en el esqueleto de serotipo 5 de adenovirus, primero se generó un vector lanzadera. Este subclon, codificado por pBr/Ad.Eco-PmeI, fue generado digiriendo primero el plásmido pBr322 con EcoRI y EcoRV e insertando el fragmento PmeI-EcoRI de 14 kb de pWE/Ad.AflII-Eco. En este vector lanzadera se realizó una deleción de un fragmento SanDI de 1.430 pb mediante digestión con SanDI y religadura para dar pBr/Ad.Eco-PmeI \DeltaSanDI. El fragmento separado contiene los únicos sitios SpeI y MunI. De pBr/Ad.Eco-PmeI\DeltaSanDI se suprimió el ADN del serotipo 5 de adenovirus que codificaba el hexón. A este fin, se amplificaron mediante PCR las secuencias que flanqueaban el hexón y se conectaron entre sí generando de ese modo sitios de restricción únicos que remplazaban la región codificadora del hexón. Para estas reacciones de PCR se requerían cuatro oligonucleótidos diferentes: \Deltahex1-\Deltahex4.
\Deltahex1: 5'-CCT GGT GCT GCC AAC AGC-3'
\Deltahex2: 5'-CCG GAT CC A CTA GTG GAA AGC GGG CGC GCG-3'
\Deltahex3: 5'-CCG GAT CC A ATT GAG AAG CAA GCA ACA TCA ACA AC-3'
\Deltahex4: 5'-GAG AAG GGC ATG GAG GCT G-3'.
El ADN amplificado producto de \pm 1.100 pb obtenido con los oligonucleótidos \Deltahex1 y \Deltahex2 fue digerido con BamHI y FseI. El ADN amplificado producto de \pm 1.600 pb obtenido con los oligonucleótidos \Deltahex3 y \Deltahex4 fue digerido con BamHI y SbfI. Estos fragmentos de PCR digeridos fueron purificados con posterioridad en gel de agarosa y en una reacción de ligadura en tres partes utilizando la enzima ligasa T4 conectada a pBr/Ad.Eco-PmeI \DeltaSanDI digerida con FseI y SbfI. El constructo resultante estaba codificado por pBr/Ad.Eco-Pme\DeltaHexón. Este constructo fue secuenciado en parte para confirmar la correcta secuencia de nucleótidos y la presencia de los sitios de restricción únicos MunI y SpeI. PBr/Ad.Eco-Pme\DeltaHexón sirve como vector lanzadera para introducir secuencias hexónicas heterólogas amplificadas a partir de ADN de virus de diferentes serotipos utilizando cebadores que introducen los sitios de restricción únicos MunI y SpeI en los extremos 5' y 3' de las secuencias hexónicas respectivamente. Para generar vectores basados en Ad5 que contengan secuencias hexónicas de los serotipos para los cuales los individuos sanos no tienen, o los tienen muy bajos, títulos de NAB se amplificaron las secuencias hexónicas de Ad35, Ad34, Ad26 y Ad48 utilizando los siguientes cebadores:
Hex-up2: 5'-GACTAGTCAAGATGGCYACCCCHTCGATGATG-3' y
Hex-do2: 5'-GCTGGCCAATTGTTATGTKGTKGCGTTRCCGGC-3'.
Estos cebadores fueron diseñados utilizando las secuencias de las regiones codificadoras hexónicas publicadas (por ejemplo las secuencias hexónicas de Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad7, Ad16, Ad40 y Ad41 pueden ser obtenidas de GenBank). Los nucleótidos degenerados fueron incorporados en las posiciones que muestran variación entre los serotipos.
Los productos de la PCR fueron digeridos con SpeI y MunI y clonados en el constructo pBr/Ad.Eco-Pme\DeltaHexón digerido con las mismas enzimas.
Las secuencias hexónicas modificadas fueron introducidas con posterioridad en el constructo pWE/Ad.AflII-rITR mediante intercambio del fragmento AscI generando pWE/Ad.AflII-rITRHexXX donde XX representa el serotipo utilizado para amplificar las secuencias hexónicas. Los constructos pWE/Ad.AflII-rITRHexXX son utilizados después para elaborar virus de la misma manera que se ha descrito antes para los virus recombinantes de Ad5.
Generación de virus recombinantes basados en Ad5 quiméricos del pentón
El gen del pentón del adenovirus de tipo 5 está localizado entre las secuencias 14.156 y 15.869. La base pentónica es la proteína de la cápsida de adenovirus que media la introducción del virus en la célula diana. Se ha demostrado que al menos ciertos serotipos (tipo C y B) logran esto mediante la interacción de una secuencia RGD del pentón con las integrinas de la superficie celular. Sin embargo, los adenovirus de tipo F no tienen una secuencia RGD y para la mayoría de los virus del grupo A y D no se conoce la secuencia del pentón. Por lo tanto, el pentón puede estar implicado en la especificidad de la célula diana. Además, como proteína de la cápsida, la proteína pentónica está implicada en la inmunogenicidad del adenovirus (Gahery-Segard y col., 1998). Por lo tanto, la reposición de las secuencias pentónicas de Ad5 por las secuencias pentónicas de serotipos para los cuales no existen o son bajos los títulos de NAB además de la reposición de las secuencias hexónicas evitará el aclaramiento del vector adenoviral más eficazmente que la reposición del hexón solo. La reposición de las secuencias pentónicas también puede afectar a la especificidad de infección.
Para poder introducir secuencias pentónicas heterólogas en Ad5 los autores de la presente invención hicieron uso del sistema basado en plásmidos descrito antes. Primero se elaboró un vector lanzadera para las secuencias pentónicas mediante inserción del fragmento NheI-EcoRV de 7,2 kb del constructo pWE/Ad.AflII-EcoRI en pBr322 digerido con las mismas enzimas. El vector resultante fue denominado pBr/XN. De este plásmido se suprimieron las secuencias pentónicas de Ad5 y se reemplazaron por sitios de restricción únicos que se utilizaron después para introducir nuevas secuencias pentónicas de otros serotipos. A este fin, se amplificaron las secuencias limítrofes izquierdas pentónicas en pBr/XN mediante PCR utilizando los siguientes cebadores:
DP5-F:
5'-CTG TTG CTG CTG CTA ATA GC-3' y
DP5-R:
5'-CGC \underline{GGA \ TCC} TGT ACA ACT AAG GGG AAT ACA AG-3'.
DP5-R tiene un sitio BamHI (subrayado) para la ligadura a la secuencia limítrofe derecha y también introduce un sitio BsrGI único (negrita) en el extremo 5' de la primera región pentónica de Ad5.
La secuencia limítrofe derecha fue amplificada utilizando:
DP3-F:
5'-CGC \underline{GGA \ TCC} CTT AAG GCA AGC ATG TCC ATC CTT-3' y
DP3-3R:
5'-AAA ACA CGT TTT ACG CGT CGA CCT TTC-3'.
DP3-F tiene un sitio BamHI (subrayado) para la ligadura a la secuencia limítrofe izquierda y también introduce un sitio AflII único (negrita) en el extremo 3' de la primera región pentónica de Ad5.
Los dos fragmentos resultantes de la PCR fueron digeridos con BamHI y ligados entre sí. Después esta mezcla de ligadura fue digerida con AvrII y BglII. PBr/XN también fue digerido con AvrII y BglII y el fragmento vector fue ligado a los fragmentos de PCR ligados digeridos. El clon resultante fue denominado pBr/Ad.\Deltapentón. Las secuencias codificadoras pentónicas de Ad35, Ad34, Ad26 y Ad48 fueron amplificadas mediante PCR de manera que los extremos 5' y 3' contuvieran los sitios BsrGI y AflII respectivamente. A este fin, se utilizaron los siguientes cebado-
res:
Para Ad34 y Ad35:
P3-for:
5'-GCT CGA TGT ACA ATG AGG AGA CGA GCC GTG CTA-3'
P3-rev:
5'-GCT CGA CTT AAG TTA GAA AGT GCG GCT TGA AAG-3'
Para Ad26 y Ad48:
P17F:
5'-GCT CGA TGT ACA ATG AGG CGT GCG GTG GTG TCT TC-3'
P17R:
5'-GCT CGA CTT AAG TTA GAA GGT GCG ACT GGA AAG C-3'
Los productos de la PCR amplificados fueron digeridos con BfrI y BsrGI y clonados en pBr/Ad.\Deltapentón digerido con las mismas enzimas. La introducción de estas secuencias pentónicas heterólogas en pBr/Ad.\Deltapentón generaban constructos denominados pBr/Ad.pentónXX donde XX representa el número del serotipo correspondiente al serotipo utilizado para amplificar las secuencias pentónicas insertadas. Con posterioridad las nuevas secuencias pentónicas fueron introducidas en el vector pWE/Ad.AflII-rITR que tenía un hexón modificado. Por ejemplo las secuencias pentónicas de Ad35 fueron introducidas en el constructo pWE/Ad.AflII-rITRHex35 mediante intercambio del fragmento FseI común. Asimismo se realizaron otras combinaciones de secuencias pentónicas y hexónicas. Los virus con secuencias hexónicas y pentónicas modificadas fueron elaborados como se ha descrito antes utilizando la co-transfección con un plásmido adaptador en células PER.C6 (número de consigna en la ECACC 96022940). Además, las secuencias pentónicas fueron introducidas en el constructo pWE/Ad.AflII-rITR. Los últimos constructos contienen sólo un pentón modificado y los virus generados a partir de estos constructos serán utilizados para estudiar la contribución de las secuencias pentónicas a la neutralización de adenovirus y también para el análisis de los posibles cambios en la eficacia y la especificidad de la infección.
Generación de virus basados en Ad5 de fibra quimérica
La infección por adenovirus está mediada por dos proteínas de la cápsida fibra y pentón. La unión del virus a las células se logra mediante la interacción de la proteína de la fibra saliente con un receptor de la superficie celular. La introducción tiene lugar tras la interacción de la proteína pentónica con las integrinas de la superficie celular. Se ha demostrado que al menos algunos adenovirus del subgrupo C y B utilizan un receptor diferente para la unión a la célula y por lo tanto tienen eficacias de infección diferentes en los diferentes tipos de células. Así es posible cambiar el espectro de infección de los adenovirus cambiando la fibra de la cápsida. La secuencia codificadora de la fibra del adenovirus de serotipo 5 está localizada entre los nucleótidos 31.042 y 32.787. Para separar el ADN del adenovirus de serotipo 5 que codifica la fibra los autores de la presente invención comenzaron en el constructo pBr/Ad.Bam-rITR. Primero se eliminó un sitio NdeI de este constructo. Para este propósito, el ADN del plásmido pBr322 fue digerido con NdeI después de lo cual los extremos salientes fueron rellenados con enzima de Klenow. Este plásmido pBr322 fue religado después, digerido con NdeI y transformado en E. Coli DH5\alpha. El plásmido pBr/\DeltaNdeI fue digerido con ScaI y SalI y el fragmento vector de 3.198 pb resultante fue ligado al fragmento ScaI-SalI de 15.349 pb derivado de pBr/Ad.BamrITR, dando como resultado el plásmido pBr/Ad.Bam-rITR\DeltaNdeI que contenía por tanto un único sitio NdeI. A continuación se realizó una PCR con los oligonucleótidos
NY-up:
5'-CGA CAT ATG TAG \underline{ATG \ CAT} TAG TTT GTG TTA TGT TTC AAC GTG-3' y
NY-down:
5'-GGA GAC CAC TGC CAT GTT-3'.
Durante la amplificación, se introdujeron ambos sitios de restricción NdeI (negrita) y NsiI (subrayado) para facilitar la clonación de los ADN de la fibra amplificados. La amplificación consistía en 25 ciclos de 45 segundos cada uno a 94ºC, 1 minuto a 60ºC, y 45 segundos a 72ºC. La reacción de PCR contenía 25 pmoles de oligonucleótidos NY-up y NY-down, dNTP 2 mM, tampón para PCR con MgCl_{2} 1,5 mM, y 1 unidad de la polimerasa estable al calor Elongase (Gibco, Países Bajos). Una décima parte del producto de la PCR se hizo circular sobre gel de agarosa lo que demostró que el fragmento de ADN esperado de \pm 2.200 pb estaba amplificado. Este fragmento de la PCR fue purificado con posterioridad utilizando el Geneclean kit system (Bio101 Inc.). Después, tanto el constructo pBr/Ad.Bam-rITR\DeltaNdeI como el producto de la PCR fueron digeridos con las enzimas de restricción NdeI y SbfI. El fragmento de la PCR fue clonado con posterioridad utilizando la enzima ligasa T4 en pBr/Ad.Bam-rITR\DeltaNdeI digerido con NdeI y SbfI, generando pBr/Ad.BamR\DeltaFib. Este plásmido permite la inserción de cualquier secuencia de la fibra amplificada mediante PCR a través de los sitios NdeI y NsiI únicos que están insertados en lugar de la secuencia de la fibra eliminada. Los virus pueden ser generados mediante la recombinación homóloga doble en células de empaquetamiento descrita en la patente Núm. PCT/NL96/00244 utilizando un plásmido adaptador, el constructo pBr/Ad.AflII-EcoRI digerido con PacI y EcoRI y un constructo pBr/Ad.BamR\DeltaFib en el cual se han insertado las secuencias de la fibra heterólogas. Para aumentar la eficacia de la generación de virus, se modificó el constructo pBr/Ad.BamR\DeltaFib para generar un sitio PacI que flanqueaba la ITR derecha. A este fin, se digirió pBr/Ad.BamR\DeltaFib con AvrII y el adenofragmento de 5 kb fue aislado e introducido en el vector pBr/Ad.Bam-rITR.pac#8 descrito antes remplazando el correspondiente fragmento AvrII. El constructo resultante fue denominado pBr/Ad.BamR\Deltafib.pac. Una vez que se ha introducido una secuencia de la fibra heteróloga en pBr/Ad.BamR\DeltaFib.pac, el clon de adenovirus con la fibra modificada a mano derecha es introducido en un gran clon cosmídico como se ha descrito antes para pWE/Ad.AflII-rITR. Semejante clon cosmídico grande permite la generación de adenovirus sólo mediante una recombinación homóloga. Los virus basados en Ad5 con fibras modificadas han sido elaborados y descritos (núms. 98204482.8 y 99200624.7). Además, las secuencias hexónicas y pentónicas de los serotipos de esta invención se combinan con las secuencias de la fibra deseadas para generar virus que infectan las célula diana de elección muy eficazmente. Por ejemplo, las células de la musculatura lisa, las células endoteliales o los sinoviocitos de origen humano son todos muy bien infectados con virus basados en Ad5 con una fibra de los virus del subgrupo B, especialmente adenovirus de tipo 16. Los ejemplos descritos antes en los cuales las secuencias específicas pueden ser suprimidas del esqueleto de Ad5 en los plásmidos y remplazadas por las correspondientes secuencias de otros serotipos muestran claramente la flexibilidad del sistema. Es evidente que mediante los métodos descritos antes se puede elaborar cualquier combinación de genes de la cápsida de diferentes serotipos. Así, se diseñan adenovirus basados en Ad5 quimérico recombinante con las secuencias hexónicas y pentónicas deseadas haciendo menos sensible a la neutralización al virus y con secuencias de la fibra deseadas que permiten una infección eficaz en tejidos diana específicos.
Ejemplo 4 Construcción de un sistema basado en plásmidos para generar virus recombinantes de Ad35
Se han publicado previamente mapas de restricción parciales de Ad35 (Valderrama-Leon y col., 1985; Kang y col., 1989; Li y col. 1991). Un ejemplo de un sistema basado en plásmidos funcional para generar adenovirus recombinantes basados en Ad35 consta de los siguientes elementos:
1.
Un plásmido adaptador que comprende una ITR izquierda y secuencias de empaquetamiento derivadas de Ad35 y al menos un sitio de restricción para la inserción de una casete de expresión heteróloga y que carece de las secuencias de E1. Además, el plásmido adaptador contiene secuencias 3' de Ad35 de E1B que codifican la región que incluye el promotor pIX y secuencias codificadoras suficientes para mediar la recombinación homóloga del plásmido adaptador con un segundo nucleótido.
2.
Un segundo nucleótido que comprende secuencias homólogas para el plásmido adaptador y secuencias de Ad35 necesarias para la replicación y el empaquetamiento del virus recombinante, esto es, genes tempranos, intermedios y tardíos que no están presentes en la célula de empaquetamiento.
3.
Una célula de empaquetamiento que proporciona al menos proteínas E1 funcionales capaces de complementar la función E1 de Ad35.
El ADN de Ad35 fue aislado de un lote de virus purificado como sigue. A 100 \mul de solución de partida de virus (Ad35: 3,26x10^{12} PV/ml) se añadieron 10 \mul de 10x tampón ADNasa (Tris-HCl 130 mM, pH 7,5; CaCl_{2} 1,2 M; MgCl_{2} 50 mM). Tras la adición de 10 \mul de ADNasa I de 10 mg/ml (Roche Diagnostics) la mezcla fue incubada durante 1 hora a 37ºC. Tras la adición de 2,5 \mul de EDTA 0,5 M, 3,2 \mul de SDS al 20% y 1,5 \mul de ProteinaseK (Roche Diagnostics; 20 mg/ml) las muestras fueron incubadas a 50ºC durante 1 hora. A continuación, se aisló el ADN viral utilizando el GeneClean Spin Kit (Bio101 Inc.) según las instrucciones de los fabricantes. El ADN se hizo eluir de la columna de centrifugación con 25 \mul de agua MilliQ estéril. En lo siguiente se utilizarán unos tamaños de fragmentos de ADN y una numeración de fragmentos según Kang y col. (1989). El ADN de Ad35 fue digerido con EcoRI y los tres fragmentos (aproximadamente 22,3 (A), 7,3 (B) y 6 kb (C)) fueron aislados en gel utilizando el estuche GeneClean (Bio 101, Inc.). pBr322 fue digerido con EcoRI o con EcoRI y EcoRV y los fragmentos digeridos fueron aislados en gel y desfosforilados con la enzima Tsap (Gibco BRL). A continuación, se ligó el fragmento C de Ad35 de 6 kb con el fragmento pBr322xEcoRI y el fragmento de Ad35 que contenía la ITR (EcoRI-B) fue ligado al fragmento pBr322xEcoRI/EcoRV. Las ligaduras fueron incubadas a 16ºC durante la noche y transformadas en bacterias DH5\alpha competentes (Life Techn.) Se analizaron minipreps de colonias obtenidas en cuanto a la correcta inserción de los fragmentos de Ad35 mediante análisis de restricción. Se encontró que tanto el fragmento de Ad35 de 6 kb como el de 7,3 kb estaban correctamente insertados pBr322. El fragmento de 6 kb fue aislado en ambas orientaciones pBr/Ad35-Eco6.0^{+} y pBr/Ad35-Eco6.0^{-} representando + la orientación 5' a 3' relativa para pBr322. El clon con el inserto de Ad35 B de 7,3 kb, denominado pBr/Ad35-Eco7.3 fue secuenciado parcialmente para verificar la correcta ligadura de la ITR 3'. Se encontró que la ITR tenía la secuencia 5'-CATCATCAAT...-3' en la hebra inferior. Después se prolongó pBr/Ad35-Eco7.3 en el extremo 5' mediante la inserción del fragmento de Ad35 de 6 kb. A este fin, pBr/Ad35-Eco7.3 fue digerido con EcoRI y desfosforilado. El fragmento fue aislado en gel y ligado al fragmento EcoRI de Ad35 de 6 kb. Tras la transformación los clones fueron sometidos a ensayo en cuanto a la correcta orientación del inserto y se seleccionó un clon, denominado pBr/Ad35-
Eco13.3.
Este clon es prolongado después con el fragmento SalI D de \sim5,4 kb obtenido tras la digestión de Ad35 wt con SalI. A este fin, se elimina el sitio SalI del esqueleto de pBr322 mediante digestión parcial de pBr/Ad35-Eco13.3 con SalI, rellenado de los extremos cohesivos mediante tratamiento de Klenow y religadura. Se selecciona un clon que contiene un único sitio SalI en el inserto adenoviral. Este clon, denominado pBr\Deltasal/Ad35-Eco13.3 es linealizado después con AatII que está presente en el esqueleto de pBr322 y ligado con el conector SalI con los extremos complementarios AatII. El ADN es digerido después con SalI en exceso y el fragmento lineal es aislado y ligado al fragmento SalI de 5,4 kb de Ad35. Se selecciona un clon que contiene el fragmento SalI insertado en la orientación correcta en pBr/Ad35-Eco13.3. El clon resultante, pBr/Ad35.Sal2-rITR contiene los \sim17 kb 3' de Ad35 incluyendo la ITR derecha. Para permitir la liberación de la ITR derecha de las secuencias vectoras en el momento de la generación del virus, se introduce mediante PCR un sitio NotI que flanquea la ITR derecha. El fragmento EcoRI-A de Ad35 de 22,3 kb también fue clonado en pBr322xEcoRI/EcoRV. Se seleccionó un clon, denominado pBr/Ad35-EcoA3', que tenía aparentemente una deleción de aproximadamente 7 kb del extremo 5'. Contenía el sitio SalI a 9,4 kb del ADN wt de Ad35 y a aproximadamente 1,5 kb de las secuencias curso arriba. Utilizando este sitio SalI y el único sitio NdeI del esqueleto de pBr322 se prolonga este clon en el extremo 5' mediante inserción de un fragmento 5' de Ad35 de aproximadamente 5 kb desde el primer SalI de Ad35 de tal manera que se crea un sitio de restricción NotI en el extremo 5' de Ad35 mediante inserción de un conector. Este clon, denominado pBr/Ad35.pIX-EcoA no contiene las secuencias del extremo izquierdo (ITR, secuencias de empaquetamiento y E1) y en el extremo 3' tiene un solapamiento de aproximadamente 3,5 kb con el clon pBr/Ad35.Sal2-
rITR.
Para crear un plásmido adaptador, se digirió Ad35 con SalI y el fragmento B del extremo izquierdo de \sim9,4 kb fue aislado. pBr322 fue digerido con EcoRV y SalI, aislado en gel y desfosforilado con la enzima Tsap. Ambos fragmentos son ligados y los clones con la inserción correcta y la secuencia correcta de la ITR izquierda son seleccionados. Para permitir la liberación de la ITR izquierda de las secuencias vectoras en el momento de la generación del virus, se introduce mediante PCR un sitio NotI que flanquea la ITR izquierda. A partir de este clon se suprimen las secuencias E1 y se reemplazan por una secuencia poliligadora utilizando la PCR. La secuencia poliligadora se utiliza para introducir una casete de expresión para un gen de elección.
Los clones de Ad35 recombinantes son generados mediante transfección de las células PER.C6 con el plásmido adaptador, pBr/Ad35.pIX-EcoA y pBr/Ad35.Sal2-rITR como se muestra en la figura 3. La recombinación homóloga da lugar a virus recombinantes.
Ejemplo 5 La prevalencia de la actividad neutralizadora (AN) para Ad35 es baja en sueros humanos de diferentes localizaciones geográficas
En el ejemplo 1 los autores de la presente invención han descrito el análisis de la actividad neutralizadora (AN) en sueros humanos de una localización en Bélgica. Sorprendentemente, de un panel de 44 serotipos de adenovirus sometidos a ensayo, un serotipo, Ad35, no era neutralizado en ninguno de los 100 sueros analizados. Además, se encontró que unos pocos serotipos, Ad26, Ad34 y Ad48 eran neutralizados en un 8%, o menos, de los sueros sometidos a ensayo. Este análisis fue ampliado adicionalmente a otros serotipos de adenovirus no sometidos a ensayo previamente y, utilizando una selección del primer rastreo, también se amplió a sueros de diferentes localizaciones geográficas.
A este fin, los adenovirus fueron propagados, purificados y sometidos a ensayo en cuanto a la neutralización en el análisis de inhibición de ECP como se describe en el ejemplo 1. Utilizando los sueros del mismo lote que en el ejemplo 1, se sometieron a ensayo para la neutralización los serotipos de adenovirus 7B, 11, 14, 18 y 44/1876. Se encontró que estos virus eran neutralizados respectivamente en el 59, 13, 30, 98 y 54% de los sueros. Así, de esta serie Ad11 es neutralizado con una frecuencia relativamente baja.
Puesto que se sabe que la frecuencia de aislamiento de los serotipos de adenovirus de tejido humano así como la prevalencia de NA para los serotipos de adenovirus pueden diferir en las diferentes localizaciones geográficas, los autores de la presente invención sometieron a ensayo una selección de los serotipos de adenovirus contra sueros de diferentes lugares. Se obtuvieron sueros humanos de dos lugares adicionales en Europa (Bristol, Reino Unido y Leiken, Países Bajos) y de dos lugares en los Estados Unidos (Stanford, CA y Great Neck, NY). Los adenovirus que se encontró que eran neutralizados en el 20% o menos de los sueros del primer rastreo, así como Ad2, Ad5, Ad27, Ad30, Ad38, Ad43, fueron sometidos a ensayo en cuanto a la neutralización en sueros del Reino Unido. Los resultados de estos experimentos se presentan en la Figura 4. Los adenovirus de serotipos 2 y 5 fueron neutralizados de nuevo en un elevado porcentaje de sueros humanos. Además, algunos de los serotipos que eran neutralizados en un bajo porcentaje de sueros en el primer rastreo son neutralizados en un porcentaje mayor de los sueros del Reino Unido, v.g. Ad26 (7% vs. 30%), Ad28 (13% vs. 50%), Ad34 (5% vs. 27%) y Ad48 (8% vs. 32%). La actividad neutralizadora frente a Ad11 y Ad49 que se encontraban en un porcentaje relativamente bajo de sueros en el primer rastreo, se encuentran en un porcentaje incluso menor de sueros en este segundo rastreo (13% vs. 5% y 20% vs. 11%, respectivamente). Se encontró ahora que el serotipo de Ad35 que no era neutralizado en ninguno de los sueros en el primer rastreo, era neutralizado en un bajo porcentaje (8%) de sueros del Reino Unido. La prevalencia de AN en sueros humanos del Reino Unido es la más baja para los serotipos Ad11 y Ad35.
Para un análisis adicional, se obtuvieron sueros de dos localizaciones en los Estados Unidos (Stanford, CA y Great Neck, NY) y de Países Bajos (Leiden). La Figura 5 presenta una visión de conjunto de los datos obtenidos con estos sueros y los datos previos. No todos los virus fueron sometidos a ensayo en todos los sueros, excepto para Ad5, Ad11 y Ad35. La conclusión global de este rastreo comprensivo de sueros humanos es que la prevalencia de actividad neutralizadora para Ad35 es la más baja de todos los serotipos en todos los países del oeste: como media el 7% de los sueros humanos contienen actividad neutralizadora (5 localizaciones diferentes). Otro grupo B de adenovirus, Ad11 también es neutralizado en un bajo porcentaje de sueros humanos (media 11% en sueros de 5 localizaciones diferentes). El adenovirus de tipo 5 es neutralizado en un 56% de los sueros humanos obtenidos de 5 localizaciones diferentes. Aunque no sometidos a ensayo en todos los sueros, el serotipo 49 del grupo D también es neutralizado con una frecuencia relativamente baja en muestras de Europa y de una localización de los Estados Unidos (media 14%).
En los experimentos de neutralización descritos antes se evalúa que un suero no es neutralizador cuando en el pocillo con la concentración de suero más elevada la protección máxima del ECP es del 40% en comparación con los controles sin suero. La protección se calcula como sigue:
% \ \text{protección} = \frac{\text{DO pocillo correspondiente} - \text{DO control virus}}{\text{DO control no infectado} - \text{DO control virus}} \ x \ 100
Como se ha descrito en el ejemplo 1, el suero es cultivado en placa en cinco diluciones diferentes que oscilan entre diluciones por 4 y por 64. Por lo tanto, es posible distinguir entre títulos bajos (es decir neutralización sólo en las concentraciones de suero más elevadas) y títulos elevados de AN (es decir también neutralización en pocillos con la concentración de suero más baja). De los sueros humanos utilizados en el rastreo de los autores de la presente invención que se encontró que contenían actividad neutralizadora para Ad5, resultó que el 70% tenía títulos elevados mientras de los sueros que contenían AN para Ad35, sólo el 15% tenía títulos elevados. De los sueros que eran positivos en cuanto a AN para Ad11 sólo el 8% tenía títulos elevados. Para Ad49 este era del 5%. Por lo tanto, no sólo la frecuencia de AN para Ad35, Ad11 y Ad49 es mucho más baja en comparación con Ad5, si no que de los sueros que contienen AN para estos virus, la inmensa mayoría tiene títulos bajos. Los vectores adenovirales basados en Ad11, Ad35 o Ad49 tienen por lo tanto una clara ventaja sobre los vectores basados en Ad5 cuando se utilizan como vehículos de terapia génica o vectores de vacunación in vivo o en cualquier aplicación en la que la eficacia de infección sea impedida por la actividad neutralizadora.
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En los siguientes ejemplos se describe la construcción de un sistema vector para la generación de vectores basados en Ad35 sin ARC, seguros.
Ejemplo 6 Secuencia del adenovirus humano de tipo 35
Los virus Ad35 fueron propagados en células PER.C6 y el ADN fue aislado como se describe en el ejemplo 4. La secuencia total fue generada por Qiagen Sequence Services (Qiagen GmbH, Alemania). El ADN viral total fue sometido a cizalla mediante sonicación y los extremos del ADN se volvieron romos mediante ADN polimerasa T4. Los fragmentos romos sometidos a cizalla fueron fraccionados por tamaños sobre geles de agarosa y se obtuvieron porciones de gel correspondientes a fragmentos de ADN de 1,8 a 2,2 kb. El ADN fue purificado a partir de las porciones de gel mediante el protocolo de extracción en gel de QIAquick y subclonado en un banco al azar de vectores de clonación del plásmido pUC19. Se utilizó una disposición de los clones en placas de 96 pocillos cubriendo el ADN diana 8 (+/- 2) veces para generar la secuencia total. La secuenciación se realizó en Thermocyclers Perkin-Elmer 9700 utilizando la química de BigDyeTerminator y la ADN polimerasa de AmpliTaq FS seguido de purificación de las reacciones de secuenciación utilizando la tecnología QIAGEN DyeEx 96. Los productos de la reacción de secuenciación fueron sometidos después a separación automatizada y detección de fragmentos en secuenciadores de 96 calles ABI 377 XL. La secuencia inicial, la secuencia contigua y los espacios fueron rellenados mediante lecturas del recorrido con cebadores sobre el ADN diana o mediante secuenciación directa de los productos de la PCR. Los extremos de los virus resultaron estar ausentes en el banco al azar, muy probablemente debido a las dificultades de clonación resultantes de los aminoácidos de pTP que permanecen unidos a las secuencias ITR tras la digestión con proteinasa K del ADN viral. Los recorridos de la secuencia adicionales sobre el ADN viral resolvían la mayor parte de la secuencia de esas regiones, sin embargo era difícil obtener una secuencia clara de los nucleótidos más terminales. En el extremo 5' la secuencia obtenida era 5'-CCAATAATATACCT...-3' mientras en el extremo 3' la secuencia obtenida era 5'-...AGGTATATTATTGATGATGGG-3'. La mayoría de los adenovirus humanos tienen una secuencia terminal 5'-CATCATCAATAATATACC-3'. Además, un clon que representaba el extremo 3' del ADN de Ad35 obtenido tras clonar el fragmento EcoRI de Ad35 de 7 kb en pBr322 (ver el ejemplo 4) también resultó tener la secuencia CATCATCAATAAT...típica. Por lo tanto, Ad35 puede tener la secuencia del extremo típica y las diferencias obtenidas al secuenciar directamente el ADN viral se deben a artefactos correlacionados con recorridos sobre la secuencia vacía y la presencia de aminoácidos residuales de pTP.
La secuencia total de Ad35 con secuencias terminales corregidas se da en la Figura 6. Basándose en la homología de la secuencia con Ad5 (Genbank #M72360) y Ad7 (secuencia parcial Genbank #X03000) y en la localización de los marcos de lectura abiertos, la organización del virus es idéntica a la organización general de la mayoría de los adenovirus humanos, especialmente los virus del subgrupo B. La longitud total del genoma es de 34.794 pares de bases.
Ejemplo 7 Construcción de un sistema vector basado en plásmidos para generar virus basados en Ad35 recombinantes
Un sistema vector basado en plásmidos funcional para generar vectores adenovirales recombinantes comprende los siguientes componentes:
1.
Un plásmido adaptador que comprende una ITR izquierda y secuencias de empaquetamiento derivadas de Ad35 y al menos un sitio de restricción para la inserción de una casete de expresión heteróloga y carente de secuencias E1. Además, el plásmido adaptador contiene las secuencias 3' de Ad35 de la región codificadora de E1B incluyendo el promotor pIX y secuencias codificadoras suficientes para mediar la recombinación homóloga del plásmido adaptador con una segunda molécula de ácido nucleico.
2.
Una segunda molécula de ácido nucleico, que comprende secuencias homólogas al plásmido adaptador, y secuencias de Ad35 necesarias para la replicación y el empaquetamiento del virus recombinante, esto es, genes tempranos, intermedios y tardíos que no están presentes en la célula de empaquetamiento.
3.
Una célula de empaquetamiento que proporciona al menos proteínas E1 capaces de complementar la función E1 de Ad35.
Otros métodos para la generación de adenovirus recombinantes en células de empaquetamiento complementadoras son conocidos en la técnica y pueden ser aplicados a los virus Ad35 sin apartarse de la invención. Como ejemplo, se describe con detalle más abajo un sistema basado en plásmidos, como se ha esbozado antes.
1) Construcción de plásmidos adaptadores de Ad35
A este fin, el plásmido adaptador pAdApt (Figura 7; descrito en el ejemplo 2) fue modificado primero para obtener plásmidos adaptadores que contienen poliligadores ampliados y que tienen los sitios de restricción únicos convenientes flanqueando la ITR izquierda y la secuencia de adenovirus en el extremo 3' para permitir la liberación del inserto de adenovirus de las secuencias del vector plasmídico. La construcción es estos plásmidos se describe más abajo con detalle: El plásmido adaptador pAdApt (Ejemplo 2) fue digerido con SalI y tratado con Shrimp Alkaline Phosphatase para reducir la re-ligadura. Un conector, compuesto por los siguientes dos oligos fosforilados y recocidos: ExSalPacF 5'-TCG ATG GCA AAC AGC TAT TAT GGG TAT TAT GGG TTC GAA TTA ATT AA-3'; y ExSalPacR 5'-TCG ATT AAT TAA TTC GAA CCC ATA ATA CCC ATA ATA GCT GTT TGC CA-3'; fue ligado directamente en el constructo digerido, remplazando de ese modo el sitio de restricción SalI por Pi-PsPI, SwaI y PacI. Este constructo fue denominado conector pADAPT+ExSalPac. Además, parte de la ITR izquierda de pAdApt fue amplificada mediante PCR utilizando los siguientes cebadores: PCLIPMSF: 5'-CCC CAA TTG GTC GAC CAT CAT CAA TAA TAT ACC TTA TTT TGG-3' y pCLIPBSRGI: 5'-GCG AAA ATT GTC ACT TCC TGT G-3'. El fragmento amplificado fue digerido con MunI y BsrGI y clonado en pAd5/Clip (ver Ejemplo 2), que estaba parcialmente digerido con EcoRI y tras la purificación digerido con BsrGI, reinsertado de ese modo la ITR izquierda y la señal de empaquetamiento. Tras el análisis con la enzima de restricción, el constructo fue digerido con ScaI y SgrAI y el fragmento de 800 pb fue aislado en gel y ligado en el conector pADAPT+ExSalPac digerido con ScaI/SgrAI. El constructo resultante, denominado pIPspSalAdapt, fue digerido con SalI, desfosforilado, y ligado al conector de doble hebra ExSalPacF/ExSalPacR fosforilado mencionado antes. Un clon en el que el sitio PacI era el más cercano a la ITR fue identificado mediante análisis de restricción y las secuencias fueron confirmadas mediante análisis de la secuencia. Este constructo pAdApt novedoso, denominado pIPspAdapt (Figura 8) alberga por tanto dos conectores ExSalPac que contienen las secuencias de reconocimiento para PacI, PI-PspI y BstBI, que rodean la porción adenoviral del constructo adaptador adenoviral, y que puede ser utilizados para linealizar el ADN plasmídico antes de la co-transfección con fragmentos coadyuvantes adenovirales.
Con el fin de incrementar adicionalmente las permutaciones de clonación transgénica se construyeron numerosas variantes de poliligadores basadas en pIPspAdapt. Para este fin se digirió primero pIPspAdapt con EcoRI y se desfosforiló. Un conector compuesto por los dos oligos fosforilados y recocidos siguientes: Ecolinker+: 5'-AAT TCG GCG CGC CGT CGA CGA TAT CGA TAG CGG CCG C-3' y Ecolinker-: 5'-AAT TGC GGC CGC TAT CGA TAT CGT CGA CGG CGC GCC G-3' fue ligado en este constructo, creando de este modo sitios de restricción para AscI, SalI, EcoRV, ClaI y NotI. Se obtuvieron ambas orientaciones de este conector y se confirmaron las secuencias mediante análisis de restricción y análisis de la secuencia. El plásmido que contenía el poliligador en el orden 5' HindIII, KpnI, AgeI, EcoRI, AscI, SalI, EcoRV, ClaI, NotI, NheI, HpaI, BamHI y XbaI fue denominado pIPspAdapt1 (Figura 9) mientras el plásmido que contenía el poliligador en el orden HindII, KpnI, AgeI, NotI, ClaI, EcoRV, SalI, AscI, EcoRI, NheI, HpaI, BamHI y XbaI fue denominado pIPspAdapt2.
Para facilitar la clonación de los otros constructos sentido o antisentido, se diseñó un conector compuesto por los dos oligonucleótidos siguientes, para invertir el poliligador del pIPspAdapt: HindXba+ 5'-AGC TCT AGA GGA TCC GTT AAC GCT AGC GAA TTC ACC GGT ACC AAG CTT A-3'; HindXba- 5'-CTA GTA AGC TTG GTA CCG GTG AAT TCG CTA GCG TTA ACG GAT CCT CTA G-3'. Este conector fue ligado en pIPspAdapt digerido con HindIII/XbaI y el constructo correcto fue aislado. La confirmación se realizó mediante análisis con enzimas de restricción y secuenciación. Este nuevo constructo, pIPspAdaptA, fue digerido con EcoRI y el Ecolinker mencionado antes fue ligado en este constructo. Se obtuvieron ambas orientaciones de este conector, dando como resultado pIPspAdapt3 (Figura 10), que contiene el poliligador en el orden XbaI, BamHI, HpaI, NheI, EcoRI, AscI, SalI, EcoRV, ClaI, NotI, AgeI, KpnI y HindIII. Todas las secuencias fueron confirmadas mediante análisis con enzimas de restricción y secuenciación.
Después se construyeron plásmidos adaptadores basados en Ad35 como sigue:
La ITR izquierda y la secuencia de empaquetamiento correspondiente a los nucleótidos 1 a 464 de las secuencias de Ad35 wt (Figura 6) fueron amplificadas mediante PCR sobre ADN wtAd35 utilizando los siguientes cebadores:
Cebador 35F1:
5'-CGG AAT TCT TAA TTA ATC GAC ATC ATC AAT AAT ATA CCT TAT AG-3'
Cebador 35R2:
5'-GGT GGT CCT AGG CTG ACA CCT ACG TAA AAA CAG-3'
La amplificación introduce un sitio PacI en el extremo 5' y un sitio AvrII en el sitio 3' de la secuencia.
Para la amplificación se utilizó la enzima ADN polimerasa Platinum Pfx (LTI) según las instrucciones del fabricante pero con los cebadores a 0,6 \muM con DMSO añadido a una concentración final del 3%. El programa de amplificación fue el siguiente: 2 minutos a 94ºC, (30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 56ºC, 1 minuto a 68ºC) durante 30 ciclos, seguido de 10 minutos a 68ºC. El producto de la PCR fue purificado utilizando un estuche de purificación pcr (LTI) según las instrucciones de fabricante y digerido con PacI y AvrII. El fragmento digerido fue purificado después en gel utilizando el estuche geneclean (Bio 101, Inc.). El plásmido adaptador basado en Ad5 pIPspAdapt-3 (Figura 10) fue digerido con AvrII y después parcialmente con PacI y el fragmento de 5.762 pb fue aislado en una porción de gel de agarosa LMP y ligado con el fragmento de PCR mencionado antes digerido con las mismas enzimas y transformado en células DH10B electrocompetentes (LTI). El clon resultante se denomina pIPspAdapt3-Ad35lITR.
Paralelamente, se amplificó una segunda porción de ADN de Ad35 utilizando los siguientes cebadores:
35F3: 5'-TGG TGG AGA TCT GGT GAG TAT TGG GAA AAC-3'
35R4: 5'-CGG AAT TCT TAA TTA AGG GAA ATG CAA ATC TGT GAG G-3'.
Las secuencias de este fragmento corresponden a los nucl. 3.401 a 4.669 de wtAd35 (Figura 6) y contiene 1,3 kb de secuencias que comienzan directamente 3' desde la secuencia codificadora de E1B 55k. La amplificación y purificación se realizaron como se ha descrito antes para el fragmento que contiene la ITR izquierda y la secuencia de empaquetamiento. El fragmento de PCR fue digerido después con PacI y subclonado en el vector pNEB193 (New England Biolabs) digerido con SmaI y PacI. La integridad de la secuencia del clon resultante fue verificada mediante análisis de la secuencia. Después pNEB/Ad35pF3R4 fue digerido con BglII y PacI y el inserto de Ad35 fue aislado en gel utilizando el estuche QIAExII (Qiagen). PIPspAdapt3-Ad35lITR fue digerido con BglII y después parcialmente con PacI. El fragmento de 3.624 pb (conteniendo secuencias del vector, la ITR de Ad35 y las secuencias de empaquetamiento así como el promotor de CMV, la región de clonación múltiple y la señal poliA), también fue aislado utilizando el estuche QIAExII (Qiagen). Ambos fragmentos fueron ligados y transformados en células DH10B competentes (LTI). El clon resultante, pAdApt35IP3 (Figura 11), tiene la casete de expresión de pIPspAdapt3 pero contiene la ITR izquierda de Ad35 y las secuencias de empaquetamiento y un segundo fragmento correspondiente a los nucl. 3.401 a 4.669 de Ad35. Una segunda versión del plásmido adaptador de Ad35 que tenía el sitio de clonación múltiple en la orientación contraria se elaboró como sigue:
PIPspAdapt1 (Figura 9) fue digerido con NdeI y BglII y la banda de 0,7 kpb que contiene parte del promotor de CMV, MCS y poliA de SV40 fue aislado e insertado en los sitios correspondientes de pAdApt35IP3 generando pAdApt35IPl (Figura 12).
Los plásmidos adaptadores pAdApt35.LacZ y pAdApt35.Luc fueron generados después insertando los transgenes de pcDNA.LacZ (digerido con KpnI y BamHI) en los sitios correspondientes en pAdApt35IPl. La generación de pcDNA.LacZ y pAdApt.Luc se describe en WO99/55132.
2) Construcción del cósmido pWE.Ad35.pXI-rITR
La Figura 13 presenta las diversas etapas acometidas para construir el clon cosmídico que contiene las secuencias de Ad35 de los pb 3.401 a 34.794 (extremo de la ITR derecha) que se describen con detalle más abajo.
Se generó un primer fragmento de PCR (pIX-NdeI) utilizando el siguiente grupo de cebadores:
35F5: 5'-CGG AAT TCG CGG CCG CGG TGA GTA TTG GGA AAA C-3'
35R6: 5'-CGC CAG ATC GTC TAC AGA ACA G-3'
Se utilizó la ADN polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante, pero, con una concentración final de 0,6 \muM de ambos cebadores y utilizando 50 ng de ADN de Ad35 wt como molde. La amplificación se realizó como sigue: 2 minutos a 94ºC, 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 65ºC y 1 minuto 45 segundos a 72ºC, seguido de 8 minutos a 68ºC. Para permitir la clonación en el vector de clonación TA PCR2.1, se realizó una última incubación con 1 unidad de polimerasa superTaq (HT Biotechnology LTD) durante 10 minutos a 72ºC.
El fragmento amplificado de 3.370 pb contiene las secuencias de Ad35 desde el pb 3.401 al 6.772 con un sitio NotI añadido en el extremo 5'. Los fragmentos fueron purificados utilizando el estuche de purificación mediante PCR (LTI).
Se generó un segundo fragmento PCR (NdeI-rITR) utilizando los siguientes cebadores:
35F7: 5'-GAA TGC TGG CTT CAG TTG TAA TC-3'
35R8: 5'-CGG AAT TCG CGG CCG CAT TTA AAT CAT CAT CAA TAA TAT ACC-3'
La amplificación se realizó con ADN polimerasa pfx (LTI) según las instrucciones del fabricante pero con 0,6 \muM de ambos cebadores y DMSO al 3% utilizando 10 ng de ADN de wtAd35 como molde. El programa era el siguiente:
3 minutos a 94ºC y 5 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 45 segundos a 40ºC, 2 minutos 45 segundos a 68ºC seguido de 25 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC, 2 minutos 45 segundos a 68ºC. Para permitir la clonación en el vector de clonación TA PCR2.1, se realizó una última incubación con 1 unidad de polimerasa superTaq durante 10 minutos a 72ºC. El fragmento amplificado de 1,6 kb que oscilaba del nucl. 33.178 al extremo de la ITR derecha de Ad35, fue purificado utilizando el estuche de purificación por PCR (LTI). Ambos fragmentos de PCR purificados fueron ligados en el vector PCR2.1 del estuche de clonación TA (Invitrogen) y transformados en células competentes STBL-2 (LTI). Los clones que contenían el inserto esperado fueron secuenciados para confirmar la amplificación correcta. A continuación, ambos fragmentos fueron separados por corte del vector mediante digestión con NotI y NdeI y purificados en gel utilizando el estuche Geneclean (Bio 101, Inc.). El vector cosmídico pWE15 (Clontech) fue digerido con NotI, desfosforilado y también purificado en gel. Estos tres fragmentos fueron ligados y transformados en células competentes STBL2 (LTI). Uno de los clones correctos que contenía ambos fragmentos de la PCR fue digerido después con NdeI y el fragmento lineal fue purificado en gel utilizando el estuche Geneclean. El ADN de Ad35 wt fue digerido con NdeI y el fragmento de 26,6 kb fue purificado en gel LMP utilizando Agarase Enzym (Roche) según las instrucciones del fabricante. Estos fragmentos fueron ligados entre sí y empaquetados utilizando los extractos de empaquetamiento del fago \lambda (Stratagene) según el protocolo del fabricante. Tras la infección en células STBL-2, las colonias se hicieron crecer sobre placas y se analizaron en cuanto a la presencia del inserto completo. Se seleccionó un clon con el fragmento grande insertado en la orientación correcta y que tiene los patrones de restricción correctos tras las digestiones independientes con tres enzimas (NcoI, PvuII y ScaI). Este clon fue denominado pWE.As35.pIX-eITR. Contiene las secuencias de Ad35 desde el pb 3.401 al extremo y está flanqueado por sitios NotI (Figura 14).
3) Generación de virus recombinantes basados en Ad35 sobre PER.C6
El virus Ad35 de tipo salvaje se puede hacer crecer sobre células de empaquetamiento PER.C6 a títulos muy elevados. No obstante, no se sabe si la región E1 de Ad5 que está presente en PER.C6 es capaz de complementar los virus recombinantes de Ad35 con E1 suprimida. Para someter a ensayo esto, las células PER.C6 fueron co-transfectadas con el plásmido adaptador pAdApt35.LacZ descrito antes y el fragmento del esqueleto grande pWE.Ad35.pIX-rITR. Primero, pAdApt35.LacZ fue digerido con PacI y pWE.Ad35.pIX-rITR fue digerido con NotI. Sin purificación adicional se mezclaron 4 \mug de cada constructo con DMEM (LTI) y se transfectaron en células PER.C6, sembrados a una densidad de 5x10^{6} células en un matraz T25 el día antes, utilizando Lipofectamine (LTI) según las instrucciones del fabricante. Como control positivo, se co-transfectaron 6 \mug de ADN de pWE.Ad35.pIX-rITR digerido con PacI con un fragmento NheI de 6,7 kb aislado de ADN de Ad35 wt que contenía el extremo izquierdo del genoma viral incluyendo la región E1. Al día siguiente se renovó el medio (DMEM con FBS al 10% y MgCl_{2} 10 mM) y las células fueron incubadas adicionalmente. A los 2 días de la transfección, las células fueron tratadas con tripsina y transferidas a matraces T80. El matraz de control positivo mostraba ECP a los cinco días de la transfección, mostrando que el constructo pWE.Ad35.pIX-rITR es funcional al menos en presencia de proteínas E1 de Ad35. La transfección con el plásmido adaptador LacZ de Ad35 y pWE.Ad35.pIX-rITR no daba lugar a ECP. Estas células fueron cosechados en el medio el día 10 y congeladas/descongeladas una vez para liberar el virus de las células. Se añadieron 4 ml del material cosechado a un matraz T80 con las células PER.C6 (a una confluencia del 80%) y se incubaron durante otros cinco días. Esta cosecha/re-infección se repitió dos veces pero no hubo evidencia de ECP asociado a virus. A partir de este experimento parece que las proteínas E1 de Ad5 no son, o no son bastante, capaces de complementar los virus recombinantes de Ad35, sin embargo, puede ser que el solapamiento de la secuencia del plásmido adaptador y el plásmido esqueleto pWE.Ad35.pIX-rITR no sea lo bastante grande para recombinar eficazmente y dar origen a un genoma de virus recombinante. La transfección de control positiva se realizó con un fragmento del extremo izquierdo de 6,7 kb y por lo tanto el solapamiento de la secuencia era de aproximadamente 3,5 kb. El plásmido adaptador y el fragmento pWE.Ad35.pIX-rITR tienen un solapamiento de la secuencia de 1,3 kb. Para verificar si el solapamiento de la secuencia de 1,3 kb es demasiado pequeño para una recombinación homóloga eficaz, se realizó una co-transfección con pWE.Ad35.pIX-rITR digerido con PacI y un fragmento de PCR de ADN wt de Ad35 generado con 35F1 y 35R4 mencionados antes utilizando los mismos procedimientos descritos antes. El fragmento de PCR contiene por tanto las secuencias del extremo izquierdo hasta el pb 4.669 y por lo tanto tiene las mismas secuencias solapantes con pWE.Ad35.pIX-rITR que el plásmido adaptador pAdApt35.LacZ pero tiene secuencias E1 de Ad35. Tras la purificación en columna de PCR, el ADN fue digerido con SalI para separar posibles secuencias molde intactas. Una transfección con el producto de la PCR digerido solo servía como control negativo. Cuatro días después de la transfección, se produjo la ECP en las células transfectadas con el producto de la PCR y el fragmento pIX-rITR de Ad35, y no en el control negativo. Esto muestra que la secuencia solapante de 1,3 kb es suficiente para generar virus en presencia de proteínas E1 de Ad35. A partir de estos experimentos los autores de la presente invención concluyen que la presencia de al menos una de las proteínas E1 de Ad35 es necesaria para generar vectores basados en Ad35 recombinantes a partir de ADN plasmídico en líneas celulares complementadoras de Ad5.
Ejemplo 8 1) Construcción de plásmidos de expresión de Ad35.E1
Puesto que las proteínas E1 de Ad5 en PER.C6 no son capaces de complementar los virus recombinantes de Ad35 eficazmente, las proteínas E1 de Ad35 han de ser expresadas en células complementadoras de Ad5 (v.g. PER.C6) o se ha de crear una nueva línea celular de empaquetamiento que exprese las proteínas E1 de Ad35, partiendo o bien de células humanas primarias diploides o bien de líneas celulares establecidas que no expresen las proteínas E1 de adenovirus. Para estudiar la primera posibilidad, se clonó la región E1 de Ad35 en plásmidos de expresión como se describe más abajo.
Primero, se amplificó la región E1 de Ad35 desde el pb 468 al pb 3.400 a partir de ADN de wtAd35 utilizando el siguiente grupo de cebadores:
35F11: 5'-GGG GTA CCG AAT TCT CGC TAG GGT ATT TAT ACC-3'
35F10: 5'-GCT CTA GAC CTG CAG GTT AGT CAG TTT CTT CTC CAC TG-3'.
Esta PCR introduce un sitio KpnI y EcoRI en el extremo 5' y un sitio SbfI y XbaI en el extremo 3'.
La amplificación en 5 ng de ADN molde se realizo con ADN polimerasa Pwo (Roche) utilizando las instrucciones del fabricante, no obstante, con ambos cebadores a una concentración final de 0,6 \muM. El programa era el siguiente: 2 minutos a 94ºC, 5 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 56ºC y 2 minutos a 72ºC, seguido de 25 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC y 2 minutos a 72ºC, seguido de 10 minutos a 72ºC. El producto de la PCR fue purificado mediante un estuche de purificación de PCR (LTI) y digerido con KpnI y XbaI. El fragmento de la PCR digerido fue ligado después al vector de expresión pRSVhbvNeo (ver más abajo), también digerido con KpnI y XbaI. Las ligaduras fueron transformadas en células STBL-2 competentes (LTI) según las instrucciones del fabricante y las colonias fueron analizadas en cuanto a la correcta inserción de las secuencias E1 de Ad35 en el poliligador entre el promotor de RSV y poliA de HBV. El clon resultante fue denominado pRSV.Ad35-E1 (Figura 15). Las secuencias de Ad35 en pRSV.Ad35-E1 fueron verificadas mediante análisis de la secuencia.
Se generó pRSVhbvNeo como sigue: pRc-RSV (Invitrogen) fue digerido con PvuII, desfosforilado con la enzima TSAP (LTI) y el fragmento vector de 3 kb fue aislado en agarosa de bajo punto de fusión (LMP). El plásmido pPGKNeopA (Figura 16) descrito en WO96/35798, fue digerido con SspI completamente para linealizar el plásmido y facilitar la digestión parcial con PvuII. Tras la digestión parcial con PvuII, los fragmentos resultantes fueron separados en un gel de agarosa LMP y el fragmento PvuII de 2.245 pb, que contenía el promotor de PGK, el gen de resistencia a la neomicina y poliA de HBV, fue aislado. Ambos fragmentos aislados fueron ligados para dar el vector de expresión pRSV-pNeo que ahora tiene la casete de expresión SV40prom-neo-SV40poliA remplazada por la casete PGKprom-neo-HBVpoliA (Figura 17). Este plásmido fue modificado adicionalmente para remplazar BGHpA por HBVpA como sigue: se linealizó pRSVpNeo con ScaI y se digirió adicionalmente con XbaI. El fragmento de 1.145 pb, que contenía parte del gen Amp y las secuencias promotoras de RSV y una secuencia poliligadora, fue aislado en gel utilizando el estuche GeneClean (Bio Inc. 101). A continuación pRSVpNeo fue linealizado con ScaI y adicionalmente digerido con EcoRI parcialmente y el fragmento de 3.704 pb que contenía la casete PGKneo y las secuencias del vector fueron aislados en gel como antes. Un tercer fragmento, que contenía la secuencia poliA de HBV flanqueada por XbaI y EcoRI en el extremo 5' y 3' respectivamente, fue generado después mediante amplificación por PCR en pRSVpNeo utilizando el siguiente grupo de cebadores:
HBV-F: 5'-GGC TCT AGA GAT CCT TCG CGG GAC GTC-3' y
HBV-R: 5'-GGC GAA TTC ACT GCC TTC CAC CAA GC-3'.
La amplificación se realizó con la enzima Elongase (LTI) según las instrucciones del fabricante con las siguientes condiciones: 30 segundos a 94ºC, después 5 ciclos de 45 segundos a 94ºC, minuto a 42ºC y 1 minuto a 68ºC, seguido de 30 ciclos de 45 segundos a 94ºC, 1 minuto a 65ºC y 1 minuto a 68ºC, seguido de 10 minutos a 68ºC. El fragmento de la PCR de 625 pb fue purificado después utilizando el estuche de purificación de PCR Qiaquick, digerido con EcoRI y XbaI y purificado en gel utilizando el estuche GeneClean. Los tres fragmentos aislados y transformados en células DH5\alpha competentes (LTI) para dar el constructo pRSVhbvNeo (Figura 18). En este constructo las regiones reguladoras de la transcripción de la casete de expresión de RSV y el marcador de selección para la neomicina se modifican para reducir el solapamiento con los vectores adenovirales que a menudo contienen secuencias reguladoras de la transcripción de CMV y SV40.
2) Generación de virus recombinantes de Ad35 en células PER.C6 co-transfectadas con un constructo de expresión de Ad35-E1
Se sembraron células PER.C6 a una densidad de 5 x 10^{6} células en un matraz T25 y al día siguiente se transfectaron con una mezcla de ADN que contenía:
- 1 \mug pAdApt35.Lacz digerido con PacI
- 5 \mug pRSV.Ad35E1 no digerido
- 2 \mug pWE.Ad35.pIX-rITR digerido con NotI.
La transfección se realizó utilizando Lipofectamine según las instrucciones del fabricante. Cinco horas después de la adición de la mezcla de transfección a las células, el medio se separó y se remplazó por medio de nueva aportación. Al cabo de dos días las células fueron transferidas a matraces T80 y cultivadas adicionalmente. Una semana después de la transfección se añadió 1 ml del medio a células A549 y al día siguiente las células se tiñeron para la expresión de LacZ. Las células de color azul eran claramente visibles dos horas después de la tinción indicando que se habían producido virus que expresaban LacZ recombinantes. Las células fueron cultivadas adicionalmente pero no se observó una clara aparición de ECP. Sin embargo, al cabo de 12 días aparecían grupos de células en la monocapa y 18 días después de la transfección las células se despegaban. Las células y el medio se cosecharon después, se congelaron-descongelaron una vez y se utilizó 1 ml del producto lisado bruto para infectar células PER.C6 en una placa de 6 pocillos. Dos días después de la infección las células fueron teñidas para la actividad LacZ. Al cabo de dos horas se habían teñido de azul el 15% de las células. Para someter a ensayo la presencia de virus wt y/o de replicación competente, se infectaron células A549 con estos virus y se cultivaron adicionalmente. No se encontraron signos de ECP indicando la ausencia de virus de replicación competente. Estos experimentos muestran que los virus AdApt35.LacZ recombinantes se habían construido en células PER.C6 co-transfectadas con un constructo de expresión Ad35.E1.
3) Los virus recombinantes de Ad35 escapan de la neutralización en suero humano que contiene actividad neutralizadora de los virus Ad35
Después se utilizaron los virus AdApt35.LacZ para investigar la infección en presencia de suero que contiene actividad neutralizadora de virus Ad35. El virus LacZ basado en Ad5 purificado servía como control positivo para la AN. A este fin, se sembraron células PER.C6 en una placa de 24 pocillos a una densidad de 2 x 10^{5} células/pocillo. Al día siguiente se diluyó una muestra de suero humano con una elevada actividad neutralizadora de Ad5 en medio de cultivo en cinco etapas de diluciones a la quinta. Después se mezclaron 0,5 ml de suero diluido con 4x10^{6} partículas de virus AdApt5.LacZ en 0,5 ml de medio y al cabo de 30 minutos de incubación a 37ºC, se añadieron 0,5 ml de la mezcla a células PER.C6 por duplicado. Para los virus AdApt35.LacZ, se mezclaron 0,5 ml de muestras de suero diluido con 0,5 ml del producto lisado bruto conteniendo virus AdApt35.LacZ y tras la incubación se añadieron 0,5 ml de esta mezcla a células PER.C6 por duplicado. Las muestras de virus incubadas en medio sin suero fueron utilizadas como control positivo para la infección. Al cabo de dos horas de infección a 37ºC, se añadió medio para alcanzar un volumen final de 1 ml y las células se incubaron adicionalmente. Dos días después de la infección las células fueron teñidas para la actividad LacZ. Los resultados se muestran en la Tabla II. A partir de estos resultados está claro que mientras los virus AdApt5.LacZ eran eficazmente neutralizados, los virus AdApt35.LacZ se mantenían infecciosos con independencia de la presencia de suero humano. Est demuestra que los virus basados en Ad35 escapan a la neutralización en sueros humanos que contienen AN de virus basados en Ad5.
Ejemplo 9 Un vector quimérico Ad5/fibra 35 con especificidad del tipo de célula para las células del tallo CD34^{+}Lin^{-} hematopoyéticas
En el ejemplo 3 los autores de la presente invención han descrito la generación de un banco de adenovirus basados en Ad5 que albergan proteína de la fibra de otros serotipos. Como ejemplo no limitante para el uso de este banco los autores de la presente invención describen aquí la identificación de adenovirus con la fibra modificada que muestran una infección mejorada de las células del tallo hematopoyético.
Las células aisladas de médula ósea, sangre del cordón umbilical, o sangre periférica movilizada que portan el fenotipo citométrico de flujo de ser positivas para el antígeno CD34 y negativas para los marcadores de diferenciación temprana CD33, CD38 y CD71 (lin^{-}) son referidas comúnmente como células del tallo hematopoyético (CTH). La modificación genética de estas células es de gran interés puesto que todos los linajes hematopoyéticos están derivados de estas células y por lo tanto la CTH es una célula diana para el tratamiento de muchas alteraciones hematopoyéticas humanas adquiridas o congénitas. Entre los ejemplos de las enfermedades que son corregibles por modificación genética de CTH se incluyen, pero no están limitados a, enfermedad de Hurlers, enfermedad de Hunters, enfermedad de Sanfilippos, enfermedad de Morquios, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Farbers, enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Krabe, Leucodistrofia Metacromática, enfermedad de las células I, síndrome de inmunodeficiencia grave, deficiencia de Kak-3, Deficiencia de Fucosidose, talasemia, y porfiria eritropoyética. Además de estas alteraciones hematopoyéticas también las estrategias para prevenir o tratar el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y los cánceres hematopoyéticos están basadas en la modificación genética de CTH o de células derivadas de CTH tales como los linfocitos T CD4 positivos en el caso del SIDA. Los ejemplos enumerados antes pretenden de este modo introducir ADN en la CTH con el fin de complementar a nivel genético una deficiencia de un gen o una proteína. En el caso de las estrategias para el SIDA o el cáncer, el ADN que se va a introducir en las CTH puede ser de genes anti-virales o de genes suicidas.
Además de los ejemplos enumerados antes, existen otras numerosas áreas en las cuales la transducción eficaz de CTH utilizando vectores adenovirales juega un importante papel. Por ejemplo en el caso de las aplicaciones para tejidos. En este área es importante dirigir la diferenciación de CTH a linajes específicos. Algunos ejemplos, no limitantes, son la formación de hueso ex vivo, la formación de cartílago, la formación de piel, así como la generación de precursores de las células T o precursores de las células endoteliales. La generación de hueso, cartílago o piel en biorreactores puede ser utilizada para el transplante tras fracturas óseas o lesiones de la médula espinal o lesiones por quemaduras graves. Naturalmente, las células transducidas también pueden ser re-infundidas directamente en el paciente. La formación de un gran número de precursores de células endoteliales a partir de CTH tiene interés puesto que las células endoteliales pueden regresar, tras la re-infusión, a sitios de lesión cardiovascular tales como la isquemia. Del mismo modo, la formación de un gran número de células T a partir de CTH tiene interés puesto que estos precursores de las células T pueden ser cebados, ex vivo, para erradicar ciertas dianas en el cuerpo humano tras la re-infusión de las células T cebadas. Las dianas preferidas en el cuerpo humano pueden ser tumores o células infectadas con virus.
A partir de los ejemplos descritos antes, se puede concluir que la liberación génica eficaz a CTH tiene un gran interés para el campo de la terapia génica. Por lo tanto, la alteración de la gama de células huésped del adenovirus de serotipo 5 para que sea capaz de dirigirse a CTH in vitro así como in vivo es el principal interés de la invención. Para identificar un adenovirus quimérico con unas características preferidas de infección de CTH humanas, los autores de la presente invención generaron un banco de virus basados en Ad5 que portaban la molécula de la fibra de serotipos alternativos (serotipos 8, 9, 13, 16, 17, 32, 35, 45, 40-L, 51). La generación de este banco con la fibra modificada se describe en el ejemplo 3. Se tomó Ad5 como referencia. Se sometió a ensayo un pequeño panel de este banco en TF-1 humano (leucemia eritroide, ATCC CRL-2003) mientras todos los virus quiméricos generados fueron sometidos a ensayo en células de estromáticas primarias humanas y CTH humanas. Las células TF-1 humanas fueron mantenidas rutinariamente en DMEM suplementado con FCS al 10% y 50 ng/ml de IL-3 (Sandoz, Basel, Suiza). Estroma de tipo fibroblástico primario humano, aislado aspirando médula ósea, se mantiene rutinariamene en DMEM/FCS al 10%. El estroma fue sembrado a una concentración de 1 x 10^{5} células por pocillo de placas de 24 pocillos. Al cabo de 24 horas de la siembra las células fueron expuestas durante 2 horas a 1.000 partículas de virus por célula de Ad5, Ad5.Fib16, Ad5.Fib17, Ad5.Fib35, Ad5.Fib40-L, o Ad5.Fib51 portando todos la proteína fluorescente de color verde (GFP) como marcador. Al cabo de 2 horas las células fueron lavadas con PBS y sembradas de nuevo en medio sin la adición de virus. Las células TF-1 fueron sembradas a una concentración de 2 x 10^{5} células por pocillo de placas de 24 pocillos y también fueron expuestas durante 2 horas a 1.000 partículas de virus de los diferentes adenovirus quiméricos. El virus fue eliminado lavando las células después de 2 horas de exposición. Ambos tipos de células fueron cosechados 48 horas después de la exposición al virus y analizados en cuanto a la expresión de GFP utilizando un citómetro de flujo. Los resultados en las células TF-1, mostrados en la figura 19, demuestran que los adenovirus quiméricos que portan una fibra de los serotipos 16, 35, o 51 (todos derivados del subgrupo B de adenovirus) tienen unas características de infección preferidas en comparación con Ad5 (subgrupo C), Ad5.Fib17 (subgrupo D), o Ad5.Fib40-L (subgrupo F). Se sometió a ensayo estroma primario humano puesto que estas células son utilizadas comúnmente como células "alimentadoras" para permitir la proliferación y el mantenimiento de CTH en condiciones de cultivo ex vivo. En contraste con la transducción de las células TF-1, ninguno de los adenovirus con fibra quiméricos era capaz de transducir eficazmente estroma primario humano (Figura 20). Se observó una infección razonable de estroma primario de tipo fibroblástico humano sólo con Ad5 a pesar de la observación de que ninguna de las moléculas receptoras conocidas son expresadas en estas células (ver la tabla III). La ausencia de infección de estroma humano utilizando los virus quiméricos es ventajosa puesto que en un entorno de cultivo simultáneo, el adenovirus quimérico no será absorbido principalmente por las células "alimentadoras" estromáticas.
Para someter a ensayo la capacidad de transducción de los virus con fibra quiméricos, se utilizó una reserva de sangre de cordón umbilical (3 individuos) para el aislamiento de células del tallo. Las células CD34^{+} fueron aisladas de una preparación de células mononucleares utilizando el sistema de separación de laboratorio MACS (Miltenyi Biotec) utilizando el protocolo proporcionado por el fabricante. De las células CD34^{+}, 2 x 10^{5} se sembraron en un volumen de 150 \mul de DMEM (sin suero; Gibco, Gaithersburg, MD) y se añadieron 10 \mul de adenovirus quimérico (para dar una proporción final de partículas de virus/célula de 1.000). Los adenovirus quiméricos sometidos a ensayo eran Ad5, Ad5.Fib16, Ad5.Fib35, Ad5Fib17, Ad5.Fb51 conteniendo todos la proteína fluorescente de color verde (GFP) como marcador. Las células fueron incubadas durante 2 horas en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 10% a 37ºC. Después de eso, las células fueron lavadas una vez con 500 \mul de DMEM y resuspendidas en 500 \mul de medio StemPro-34 SF (Life Technologies, Grand Island, NY).
Las células fueron cultivadas después durante 5 días en placas de 24 pocillos (Greiner, Frickenhausen, Alemania) en estroma de médula ósea humana pre-establecido (ref 1) irradiado (20 Gy), en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 10% a 37ºC. Al cabo de 5 días, se recogió la población celular completa mediante tripsinización con 100 \mul de Tripsina-EDTA al 0,25% (Gibco). El número de células antes y después de 5 días de cultivo fue determinado utilizando un hematocitómetro. Se calculó el número de células CD34^{+} y CD34^{++}CD33,38,71^{-} en cada muestra a partir del número total de células recuperadas y la frecuencia de las células CD34^{+}CD33,38,71^{-} en la población total como se determina mediante análisis FACS. La eficacia de transducción fue determinada mediante análisis FACS mientras se controlaba en las distintas subpoblaciones la frecuencia de células que expresaban GFP así como la intensidad de GFP por célula individual. Los resultados de este experimento, mostrados en la figura 21, demuestran que el adenovirus de serotipo 5 o el adenovirus quimérico Ad5.Fib17 no infecta las células CD34^{+}Lin^{-} como quedaba demostrado por la ausencia de expresión de GFP. En contraste, con los virus quiméricos que portaban la molécula de fibra de los serotipos 16, 51, o 35 se obtenían elevados porcentajes de células GFP positivas en esta población de células. Se demuestra la especificidad para CD34^{+}Lin^{-} puesto que se observa una escasa expresión de GFP en las células CD34^{+} que también expresan CD33, CD38 y CD71. El subfraccionamiento de las células CD34^{+}Lin^{-} (Figura 22) mostraba que el porcentaje células positivas para GFP disminuía utilizando Ad5.Fib16, Ad5.Fib35, o Ad5.Fib51 cuando las células se volvían más y más positivas para los marcadores de diferenciación temprana CD33 (mieloide), CD71 (eritroide), y CD38 (marcador de diferenciación temprana común). Estos resultados demuestran por tanto la especificidad de los adenovirus quiméricos Ad5.Fib16, Ad5.Fib35, y Ad5.Fib51 para CTH. En la figura 23 se muestra el alineamiento de la fibra de Ad5 con las proteínas de la fibra del grupo B quiméricas derivadas de Ad16, 35 y 51. Determinando el número de células recuperadas tras el procedimiento de transducción se puede determinar la toxicidad de los adenovirus. La recuperación de la cantidad de células CD34^{+} así como la cantidad de CD34^{+}Lin^{-} (Figura 24) demuestra que una exposición de 2 horas a 1.000 partículas de adenovirus no tenía efecto sobre el número de células recuperadas.
Ejemplo 10 Un vector quimérico de Ad5/fibra 35 con especificidad del tipo celular para las células Dendríticas
Las células dendríticas son células presentadoras de antígenos (CPA), especializadas en iniciar una respuesta inmune primaria y capaces de reforzar la memoria del tipo de respuesta inmune. Dependiendo de su estado de desarrollo, las CD despliegan diferentes funciones: las CD inmaduras son muy eficaces en la captación y el procesamiento de antígenos para la presentación por las moléculas de clase I y clase II del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC), mientras las CD maduras, que son menos eficaces en la captura y el procesamiento, funcionan mucho mejor al estimular las células T CD4^{+} y CD8^{+} naturales y de la memoria, debido a la elevada expresión de las moléculas del MHC y las moléculas co-estimuladoras de su superficie celular. Las CD inmaduras maduran in vivo tras la captación de antígenos, viajan a las áreas de las células T de los órganos linfoides, y ceban la activación de las células T.
Puesto que las CD son las células responsables del desencadenamiento de una respuesta inmune ha habido interés desde hace mucho tiempo en cargar las CD con proteínas inmunoestimuladoras, péptidos o genes que codifiquen estas proteínas para disparar el sistema inmune. Las aplicaciones de esta estrategia se encuentran en el campo del tratamiento del cáncer así como en el campo de la vacunación. Hasta aquí, las estrategias anti-cancerosas han estado enfocadas principalmente a una carga ex vivo de las CD con antígenos (proteínas o péptidos). Estos estudios han revelado que este procedimiento daba como resultado la inducción de la actividad de las células T citotóxicas. Los antígenos utilizados para cargar las células son identificados generalmente por ser específicos de los tumores. Algunos ejemplos, no limitantes, de tales antígenos son GP100, Mage, o Mart-1 para el melanoma.
Además del tratamiento del cáncer se están evitando en la actualidad otras muchas enfermedades humanas potenciales a través de la vacunación. En la estrategia de vacunación, se presenta un patógeno "invalidado" al sistema inmune por medio de la acción de las células presentadoras de antígenos, es decir las CD inmaduras. Entre los ejemplos bien conocidos de prevención de enfermedades por medio de estrategias de vacunación se incluyen la Hepatitis A, B, C, la influenza, la rabia, la fiebre amarilla, el sarampión. Además de estos programas de vacunación bien conocidos, se están desarrollando programas de investigación para el tratamiento de la malaria, el ébola, ceguera river, el VIH y otras muchas enfermedades. Muchos de los patógenos mencionados antes son considerados peligrosos para la generación de una vacuna de patógenos "invalidados". Esta última se llama así por el aislamiento y la caracterización de proteínas de cada patógeno que son capaces de armar una respuesta inmune "desplegada completamente" que produce una protección completa tras la sensibilización con el patógeno de tipo salvaje. Para esto la estrategia de cargar las CD con proteínas o péptidos inmunoestimuladores se vuelve factible terapéuticamente. Al menos se deben satisfacer dos criterios distintos 1) el aislamiento de un gran número de CD que puedan ser aisladas, manipuladas, y re-infundidas en un paciente, haciendo autólogo el procedimiento. Hasta la fecha, es posible obtener tales grandes cantidades de CD inmaduras a partir de monocitos de sangre periférica cultivados de cualquier donador dado. 2) un vector que pueda transducir las CD eficazmente de manera que se pueda liberar el ADN que codifica la proteína inmunoestimuladora. Lo último es extremadamente importante puesto que ha quedado claro que el tiempo requerido para que las CD viajen a los órganos linfoides es tal que la mayoría de las proteínas o péptidos ya se han liberado de las CD produciendo un cebado inmune incompleto. Debido a que las CD son células diferenciadas terminalmente y por tanto no están en división, se están considerando los vectores adenovirales recombinantes para liberar el ADN que codifique los antígenos para las CD. Idealmente este adenovirus debe tener una elevada afinidad por las células dendríticas pero además no debe ser reconocido por los anticuerpos neutralizadores del huésped de manera que se pueda completar la transducción in vivo de las CD. Esto último podría omitir la necesidad de manipulaciones ex vivo de las CD pero daría como resultado un procedimiento médico idéntico a los programas de vacunación que están teniendo lugar en la actualidad, es decir predominantemente inyección intramuscular o subcutánea. De este modo, las CD transducidas por los vectores adenovirales que codifican una proteína inmunogénica pueden ser ajustados idealmente para que sirvan como coadyuvantes naturales para la inmunoterapia y la vacunación.
A partir de los ejemplos descritos antes, se puede concluir que la liberación génica eficaz en las CD tiene un gran interés para el campo de la terapia génica. Por lo tanto, la alteración de la gama de célula huésped del adenovirus de serotipo 5 para que sea capaz de dirigirse a las CD in vitro así como in vivo tiene un interés fundamental para la invención. Para identificar un adenovirus quimérico con las características de infección preferidas para las CD humanas, los autores de la presente invención generaron un banco de virus basados en Ad5 que portaban una molécula de fibra de serotipos alternativos (serotipos 8, 9, 13, 16, 17, 32, 35, 45, 40-L, 51). Se tomó Ad5 como referencia. Los autores de la presente invención evaluaron la susceptibilidad de los monocitos humanos derivados de CD inmaduras y maduras a los adenovirus quiméricos recombinantes que expresan diferentes fibras.
Se aislaron PBMC humanos de donadores sanos por medio de centrifugación por densidad en Ficoll-Hypaque. Los monocitos fueron aislados de PBMC mediante enriquecimiento en células CD14^{+} utilizando la tinción con anticuerpo monoclonal anti-CD14 humano marcado con FITC (Becton Dickinson), y columnas de separación de microcuentas FITC y MACS (Miltenyi Biotec.)
Este procedimiento produce normalmente una población de células que son CD14^{+} en menos del 90% como se analizaba mediante FACS. Las células fueron colocadas en cultivo utilizando medio RPMI-1640 (Gibco) conteniendo Suero Bovino Fetal al 10% (Gibco), 200 ng/ml de GM-CSF rhu (R&D/ITK diagnostics), 100 ng/ml de IL-4 rhu (R&D/ITK diagnostics) y cultivadas durante 7 días alimentando los cultivos con medio de nueva aportación conteniendo citoquinas en días alternos. Las CD inmaduras resultantes de este procedimiento al cabo de 7 días expresan un fenotipo CD83^{-}, CD14^{bajo} o CD14^{-}, HLA-DR^{+}, como se demostraba mediante análisis FACS. Las CD inmaduras maduran cultivando las células en medio conteniendo 100 ng/ml de TNF-a durante 3 días, después de lo cual expresaban CD83 en su superficie celular.
En un experimento piloto se sembraron 5\cdot10^{5} CD inmaduras en pocillos de placas de 24 pocillos y se expusieron durante 24 horas a 100 y 1.000 partículas de virus por células de cada virus con fibra recombinante. El virus sometido a ensayo era el adenovirus de serotipo 5 (Ad5), y los virus con fibra quiméricos basados en Ad5: Ad5.Fib12, Ad5.Fib16, Ad5.Fib28, Ad5.Fib32, Ad5.Fib40-L (fibra larga del serotipo 40), Ad5.Fib49, y Ad5.Fib51 (donde Fibxx representa el serotipo del cual deriva la fibra). Estos virus derivan del subgrupo C, A, B, D, D, F, D, y B respectivamente. Al cabo de 24 horas las células fueron lisadas (Triton X-100/PBS al 1%) y la actividad luciferasa fue determinada utilizando el protocolo suministrado por el fabricante (Promega, Madison, WI, USA). Los resultados de este experimento, mostrados en la figura 25, demuestran que Ad5 infecta escasamente las CD inmaduras como quedaba demostrado por el bajo nivel de expresión transgénica. En contraste, Ad5.Fib16 y Ad5.Fib51 (ambos virus con fibra quiméricos del grupo B) y también Ad5.Fib40-L (Subgrupo F) muestran una infección eficaz de las CD inmaduras basándose en la expresión transgénica de la luciferasa.
En un segundo experimento, se infectaron 5\cdot10^{5} CD inmaduras y maduras con 10.000 partículas de virus por célula de Ad5, Ad5.Fib16, Ad5.Fib40-L, y Ad5.Fib51 portando todas el gen LacZ como marcador. La expresión de LacZ fue controlada mediante análisis de citometría de flujo utilizando un sistema de estuches CM-FDG y las instrucciones suministradas por el fabricante (Molecular probes, Leiden, Países Bajos). Los resultados de este experimento, mostrados en la figura 26, se corresponden con el experimento anterior ya que Ad5.Fib16 y Ad5.Fib51 son superiores a Ad5 transduciendo las CD humanas maduras e inmaduras. Asimismo, este experimento muestra que Ad5.Fib40-L no es tan bueno como Ad5.Fib16 y Ad5.Fib51 pero son mejores que Ad5. Basándose en estos resultados los autores de la presente invención sometieron a ensayo otros adenovirus quiméricos que contenían fibras de virus del grupo B v.g. Ad5.Fib11 y Ad5.Fib35 en cuanto a su capacidad para infectar las CD. Los autores de la presente invención se concentraron en las CD inmaduras puesto que estas son las células que transforman un producto transgénico expresado en péptidos presentables de la clase I y II del MHC. Las CD inmaduras fueron sembradas a una densidad celular de 5\cdot10^{5} células/pocillo en placas de 24 pocillos (Costar) e infectadas con 1.000 y 5.000 partículas de virus por célula después de lo cual las células fueron cultivadas durante 48 horas en condiciones para CD inmaduras antes de las mediciones de la lisis celular y la actividad Luciferasa. El resultado de este experimento, mostrado en la figura 27, demuestra que los adenovirus quiméricos basados en Ad5 que contienen fibras de virus del grupo B infectan eficazmente las CD inmaduras. En un cuarto experimento los autores de la presente invención infectaron de nuevo CD inmaduras de una manera idéntica a la descrita en los primeros experimentos pero esta vez se utilizaron Ad5, Ad5.Fib16, y Ad5.Fib35 que portaban la proteína fluorescente de color verde (GFP) como gen marcador. Los resultados de la expresión de GFP medida con el citómetro de flujo 48 horas después de la exposición del virus se muestran en la figura 28 y se corresponden con los datos obtenidos hasta ahora. Así, los resultados hasta aquí son coincidentes con que los vectores basados en Ad5 que portan una fibra de un adenovirus alternativo derivado del subgrupo B predominantemente de 35, 51, 16, y 11 son superiores a Ad5 transduciendo las CD humanas. Los adenovirus descritos aquí también son muy adecuados en la vacunación de animales. Para ilustrar esto, los autores de la presente invención sometieron a ensayo CD derivadas de ratón y chimpancé para identificar si estos virus pueden ser utilizados en estos modelos animales. Esto último en particular ya que el receptor de adenovirus humano derivado del subgrupo B es desconocido hasta la fecha y por lo tanto no se sabe si esta proteína está conservada entre especies. Para ambas especies se sembraron CD inmaduras a una densidad de 10^{5} células por pocillo de placas de 24 pocillos. Las células fueron expuestas con posterioridad durante 48 horas a 1.000 partículas de virus por célula de Ad5, Ad5.Fib16, y Ad5.Fib51 en el caso de CD de ratón y Ad5, Ad5.Fib35 en el caso de CD de chimpancé (ver la figura 29). El experimento con ratón se realizó con virus que portaban luciferasa como marcador y mostraban una actividad luciferasa incrementada aproximadamente 10-50 veces en comparación con Ad5. Las CD de chimpancé fueron infectadas con los virus GFP y fueron analizadas utilizando un citómetro de flujo. Estos resultados, también mostrados en la figura 29, demuestran que Ad5 (3%) transduce las CD de chimpancé muy escasamente en comparación con Ad5.Fib35
(66,5%).
Ejemplo 11 Construcción de un sistema vector basado en plásmidos para generar virus recombinantes basados en Ad11
Los resultados de los experimentos de neutralización descritos en el Ejemplo 5 muestran que Ad11, como Ad35, tampoco era neutralizado en la inmensa mayoría de las muestras de suero humano. Por consiguiente, los adenovirus recombinantes basados en Ad11 son preferidos por encima de los vectores basados en Ad2 y Ad5 utilizados comúnmente para el tratamiento mediante terapia génica y la vacunación. Tanto Ad35 como Ad11 son virus del grupo B y se clasifican como virus pertenecientes a la agrupación 2 de homología del ADN (Wadell, 984). Por lo tanto, los genomas de Ad35 y Ad11 son muy similares. Para generar un sistema basado en plásmidos para la producción de virus recombinantes basados en Ad11 el plásmido adaptador pAdApt35IP1 generado en el Ejemplo 7 es modificado como sigue. El constructo pAdApt35IP1 es digerido con AvrII y después parcialmente con PacI. La mezcla de digestión es separada en gel y el fragmento de 4,4 kb que contiene la casete de expresión y el esqueleto vector es aislado utilizando el estuche de GeneClean (BIO 101, Inc.). Después, se realiza una amplificación mediante PCR en ADN de wtAd11 utilizando los cebadores 35F1 y 35R2 (ver Ejemplo 7) utilizando ADN polimerasa Pwo según las instrucciones del fabricante. El fragmento de PCR obtenido de 0,5 kb es purificado utilizando el estuche de purificación de PCR (LTI) y ligado al fragmento separado antes de pAdApt35IP1. Esto da el constructo pAdApt11-35IP1 en el cual el fragmento 5' del adenovirus es intercambiado por la correspondiente secuencia de Ad11. A continuación, pAdApt11-35IP1 es digerido con BglII y parcialmente con PacI. Los fragmentos obtenidos son separados en gel y el fragmento de 3,6 kb que contiene las secuencias vectoras, el fragmento 5' de adenovirus y la casete de expresión es purificado en gel como antes. A continuación, se genera un fragmento de PCR utilizando los cebadores 35F3 y 35R4 (ver Ejemplo 7) en ADN de wtAd11. La amplificación se realiza como antes y el fragmento de 1,3 kb obtenido se purifica y digiere con BglII y PacI. Los fragmentos aislados son ligados después para dar el constructo pAdApt11IP1. Este plásmido adaptador contiene ahora las secuencias de Ad11 en lugar de las secuencias de Ad35. La correcta amplificación de las secuencias de Ad11 amplificadas mediante PCR es verificada mediante comparación de la secuencia de este clon con la correspondiente secuencia del ADN de Ad11. El último es obtenido mediante secuenciación directa del ADN de Ad11 utilizando los cebadores de PCR indicados. El clon cosmídico grande que contiene el esqueleto de Ad11 es generado como sigue: Primero, se amplifica un fragmento de PCR sobre el ADN de Ad11 utilizando los cebadores 35F5 y 35R6 con ADN polimerasa Pwo como se describe en el Ejemplo 7 para el ADN de Ad35. El fragmento de la PCR es purificado después utilizando el estuche de purificación de PCR (LTI) y digerido con NotI y NdeI. El fragmento de 3,1 kb resultante es aislado en gel utilizando el estuche GeneClean BIO 101, Inc.). Después se genera un segundo fragmento de PCR en ADN de Ad11 utilizando los cebadores 35F7 y 35R8 (ver Ejemplo 7) con ADN polimerasa Pwo según las instrucciones del fabricante y se purifica utilizando el estuche de purificación de PCR (LTI). Este fragmento amplificado también es digerido con NdeI y NotI y el fragmento de 1,6 kb resultante es purificado en gel como antes. Los dos fragmentos de PCR digeridos son ligados después con el vector cosmídico pWE15, previamente digerido con NotI y desfosforilado utilizando la enzima Tsap (LTI) según las instrucciones del fabricante. Se selecciona un clon que tiene insertada una copia de ambos fragmentos. Los clones correctos se seleccionan mediante digestión analítica con NotI que da un fragmento de 4,7 kb. Se obtiene confirmación mediante una reacción PCR utilizando los cebadores 35F5 y 35R8 que da un fragmento del mismo tamaño. Después el clon correcto es linealizado con NdeI y aislado en gel. A continuación, se digiere ADN de wtAd11 con NdeI y el fragmento grande de 27 kb se aísla en gel de agarosa de bajo punto de fusión utilizando la enzima agarasa (Roche) según las instrucciones del fabricante. Ambos fragmentos son ligados después y empaquetados utilizando extractos de empaquetamiento del fago \lambda (Stratagene) según el protocolo del fabricante. Tras la infección en células STBL-2 (LTI) las colonias se hacen crecer sobre placas y se analizan en cuanto a la presencia del inserto completo. La funcionalidad de los clones seleccionados es sometida a ensayo después mediante co-transfección en células PER.C6. A este fin, el ADN es digerido con NotI y 6 \mug son co-transfectados con 2 \mug de un fragmento de PCR generado en ADN de Ad11 con los cebadores 35F1 y 35R4 (ver ejemplo 7). Los clones correctos producen ECP en una semana después de la transfección. El clon correcto es denominado pWE.Ad11.pIX-rITR.
Utilizando el procedimiento descrito antes, se genera un sistema basado en plásmidos que consta de un plásmido adaptador adecuado para la inserción de genes foráneos y un fragmento coadyuvante grande que contiene el esqueleto viral. Los virus basados en Ad11 recombinante se elaboran utilizando los métodos descritos aquí para los virus recombinantes basados en Ad35.
Ejemplo 12 Neutralización de adenovirus en muestras derivadas de pacientes
En los experimentos de neutralización descritos en los Ejemplos 1 y 5, todas las muestras derivaban de voluntarios sanos. Puesto que una de las aplicaciones de los vectores no neutralizados se encuentra en el campo de la terapia génica, es interesante investigar si Ad35 también es neutralizado con una baja frecuencia y con títulos bajos en grupos de pacientes que son candidatos para el tratamiento con terapia génica.
- Pacientes con enfermedades cardiovasculares
Se obtuvieron 26 muestras de suero y fluido pericárdico (FP) emparejadas de pacientes con insuficiencia cardíaca. Estas fueron sometidas a ensayo frente a Ad5 y Ad35 utilizando el análisis de neutralización descrito en el Ejemplo 1. Los resultados confirmaron los datos previos con muestras de voluntarios sanos. El 70% de las muestras de suero contenía AN para Ad5 y el 4% para Ad35. En las muestras de fluido pericárdico los títulos eran inferiores dando como resultado un total del 40% con AN para Ad5 y ninguno para Ad35. Había una buena correlación entre AN en FP y suero es decir no había muestras FP positivas sin AN en la muestra de suero emparejada. Estos resultados muestran que se prefieren los vectores no neutralizados basados en Ad35 sobre los vectores de Ad5 para el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares. Como se verifica para todas las formas de vectores no neutralizados en esta aplicación, el vector puede estar basado en el genoma del serotipo no neutralizado o puede estar basado en Ad5 (u otro serotipo) aunque muestre al menos las principales proteínas de la cápsida (hexónicas, heptónicas y opcionalmente de la fibra) del serotipo no neutralizado.
- Pacientes de Artritis Reumatoide
El determinante molecular subyacente de la artritis todavía no es conocido pero se sabe que tanto la disfunción de las células T como la producción desequilibrada de factor de crecimiento en las articulaciones ocasionan inflamación e hiperplasia del tejido sinovial. Los sinoviocitos comienzan a proliferar e invadir el cartílago y el hueso lo que conduce a la destrucción de estos tejidos. El tratamiento actual comienza (cuando es en la fase temprana) con la administración de fármacos anti-inflamatorios (anti-TNF, Il1-RA, IL-10) y/o fármacos convencionales (v.g. MTX, sulfasalazina). En la fase tardía se realiza la sinovectomía de la AR que se basa en la cirugía, radiación, o intervención química. Una alternativa u opción adicional es el tratamiento por medio de terapia génica en la que un vector adenoviral es liberado directamente en las articulaciones de los pacientes y expresa un fármaco anti-inflamatorio o un gen suicida. Los estudios previos realizados en monos rhesus que padecían artritis inducida por colágeno han demostrado que los vectores basados en Ad5 que portan un gen marcador pueden transducir los sinoviocitos. No se sabe si en la situación humana la liberación adenoviral está impedida por la presencia de AN. Para investigar la presencia de AN en fluido sinovial (FS) de pacientes con AR, se obtuvieron muestras de FS de un panel de 53 pacientes seleccionados al azar que padecían artritis reumatoide (AR). Estos fueron sometidos a ensayo frente a numerosos adenovirus wt utilizando el análisis de neutralización descrito en el Ejemplo 1. Los resultados de este rastreo se presentan en la Tabla III. Se encontró que el adenovirus de tipo 5 era neutralizado en el 72% de las muestras de FS. La mayor parte de estas muestras contienen títulos elevados de AN como también la dilución más elevada de la muestra de FS que se había sometido a ensayo (64x) neutralizaba los virus Ad5. Esto significa que la liberación del vector adenoviral en los sinoviocitos de las articulaciones de los pacientes con AR será muy ineficaz. Por otra parte, puesto que los títulos en FS son tan elevados es dudoso que el lavado de las articulaciones antes de la inyección del vector elimine suficiente AN. De los otros serotipos que se sometieron a ensayo se demostró que Ad35 era neutralizado sólo en el 4% de las muestras. Por lo tanto, estos datos confirman los resultados obtenidos en las muestras de suero de pacientes sanos y muestran que para el tratamiento de la artritis reumatoide los vectores basados en Ad35 o los vectores quiméricos que despliegan al menos alguna de las proteínas de la cápsida de Ad35 son los vectores preferidos.
Ejemplo 13 Modificaciones en el esqueleto de virus basados en Ad35 1) Generación de pBr/Ad35.Pac-rITR y pBr/Ad35.PRn
En el Ejemplo 4 se describe la generación del subclon de Ad35 pBr/Ad35.Eco13.3. Este clon contiene secuencias de Ad35 desde el pb 21.943 al extremo de la ITR derecha clonadas en los sitios EcoRI y EcoRV de pBr322. Para ampliar estas secuencias al sitio PacI localizado en el pb 18.137 de Ad35, pBr/Ad35.Eco13.3 (ver Ejemplo 4) fue digerido con AatII y SnaBI y el fragmento que contenía el vector grande fue aislado en gel utilizando el estuche de extracción en gel QIAEX II (Qiagen). El ADN de Ad35 wt fue digerido con PacI y SnaBI y el fragmento de 4,6 kb fue aislado como antes. Este fragmento fue ligado después a un conector de doble hebra (dh) que contiene un saliente PacI y AatII. Este ligador fue obtenido tras el recocer los siguientes oligonucleótidos:
A-P1: 5'-CTG GTG GTT AAT-3'
A-P2: 5'-TAA CCA CCA GAC GT-3'.
Esta mezcla de ligadura que contenía el ligador de dh y el fragmento PacI-SnaBI de Ad35 fue separado del ligador no ligado en un gel LMP. La banda de 4,6 kb fue cortada del gel, fundida a 65ºC, y después ligada al fragmento vector pBr/Ad35.Eco13.3 digerido con AatII y SnaBI. Las ligaduras fueron transformadas en células DH10B electrocompetentes (Life Technologies Inc.). El clon resultante, pBr/Ad35.Pac-rITR, contenía secuencias de Ad35 desde el sitio PacI en el pb 18.137 hasta la ITR derecha.
A continuación, se introdujo el único sitio de restricción en el extremo 3' de la ITR derecha para poder liberar la ITR de las secuencias del vector. A este fin, se utilizó un fragmento de PCR que cubre las secuencias de Ad35 desde el sitio NdeI en el pb 33.165 a la ITR derecha que tenía los sitios de restricción SwaI, NotI y EcoRI anclados a la rITR. El fragmento de la PCR fue generado utilizando los cebadores 35F7 y 35R8 (descritos en el ejemplo 7). Tras la purificación, el fragmento de la PCR fue clonado en el vector de clonación AT (Invitrogen) y secuenciado para verificar la amplificación correcta. El clon amplificado correcto se digirió después con EcoRI, sus extremos se hicieron romos con la enzima de Klenow y con posterioridad se digirió con NdeI y se aisló el fragmento de la PCR. Paralelamente, el NdeI del vector pBr de pBr/Ad35.Pac-rITR fue separado como sigue: se separó un vector pBr322 del cual se había separado el sitio NdeI por digestión con NdeI, tratamiento de Klenow y religadura, se digirió con AatII y NheI. El fragmento vector fue aislado en gel LMP y ligado al fragmento AatII-NheI de Ad35 de 16,7 kb de pBr/Ad35.Pac-rITR que también se había aislado en gel LMP. Esto generó pBr/Ad35.Pac-rITR.\DeltaNdeI. A continuación pBr/Ad35.Pac-rITR.\DeltaNdeI fue digerido con NheI, los extremos fueron rellenados utilizando la enzima de Klenow y el ADN fue digerido después con NdeI. El fragmento grande que contenía el vector y las secuencias de Ad35 fue aislado. La ligadura de este fragmento vector y el fragmento de la PCR dio como resultado pBr/Ad35.PRn. En este clon las secuencias específicas que codifican la fibra, E2A, E3, E4 o el hexón pueden ser manipuladas. Además, las secuencias promotoras que dirigen por ejemplo las proteínas E4 o E2 pueden ser mutadas o suprimidas e intercambiadas por promotores heterólogos.
2) Generación de virus basados en Ad35 con proteínas de la fibra de diferentes serotipos
Los adenovirus infectan las células humanas con diferentes eficacias. La infección se completa mediante un procedimiento de dos etapas que implica: 1. las proteínas de la fibra que median la unión del virus a los receptores específicos de las células, y 2. las proteínas pentónicas que median la introducción mediante la interacción por ejemplo de la secuencia RGD con las integrinas presentes en la superficie celular. Para los virus del subgrupo B, del cual Ad35 es miembro, no se conoce el receptor celular para la proteína de la fibra. Existen diferencias sorprendentes en la eficacia de infección de las células humanas por los virus del subgrupo B en comparación con los virus del subgrupo C como Ad5 (ver WO 00/03029 y EP 99200624.7). Incluso dentro de un subgrupo las eficacias de infección de ciertas células humanas pueden diferir entre los diversos serotipos. Por ejemplo, la fibra de Ad16, cuando está presente en un virus recombinante basado en Ad5 infecta principalmente las células endoteliales, las células de la musculatura lisa y los sinoviocitos de origen humano y de mono rhesus mejor que los virus quiméricos de Ad5 que portan la fibra de Ad35 o Ad51. De este modo, para obtener elevadas eficacias de infección de virus basados en Ad35, puede ser necesario cambiar la proteína de la fibra por una proteína de la fibra de un serotipo diferente. La tecnología para semejantes quimeras de fibras se describe para los virus basados en Ad5 en el Ejemplo 3, y se ejemplifica más abajo para los virus Ad35.
Primero, la mayor parte de las secuencias de la fibra son suprimidas del esqueleto de Ad35 en el constructo pBr/Ad35.PRn como sigue:
Las secuencias limítrofes izquierdas y parte de la proteína de la fibra de Ad35 que oscilan entre el pb 30.225 curso arriba del único sitio MluI hasta el pb 30.872 (números según la secuencia de Ad35 wt descrita en la Figura 6) en la cola de la fibra son amplificadas utilizando los cebadores:
DF35-1: 5'-CAC TCA CCA CCT CCA ATT CC-3' y
DF35-2: 5'-CGG GAT CCC GTA CGG GTA GAC AGG GTT GAA GG-3'.
Esta amplificación mediante PCR introduce un único sitio BsiWI en la cola del gen de la fibra.
Las secuencias limítrofes derechas que oscilan desde el extremo de la proteína de la fibra en el pb 31.798 hasta el pb 33.199 (numeración según la secuencia de wtAd35, Figura 6), 3' con respecto al único sitio NdeI es amplificada utilizando los cebadores:
DF35-3: 5'-CGG GAT CCG CTA GCT GAA ATA AAG TTT AAG TGT TTT TAT TTA AAA TCA C-3' y
DF35-4: 5'-CCA GTT GCA TTG CTT GGT TGG-3'.
Esta PCR introduce un único sitio NheI en el lugar de las secuencias de la fibra. La amplificación mediante PCR se realiza con ADN polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante. Tras la amplificación los productos de la PCR son purificados utilizando un estuche de purificación y los fragmentos son digeridos con BamHI y ligados entre sí. Los fragmentos ligados de 2 kb son purificados en gel y clonados en el vector PCR Script Amp (Stratagene). La amplificación correcta es verificada mediante secuenciación. El fragmento de PCR es separado después por corte en forma de un fragmento MluI/NdeI y clonado en pBr/Ad35.PRn digerido con las mismas enzimas. Esto genera pBr/Ad35.PR\Deltafib, un vector lanzadera adecuado para introducir secuencias de la fibra de serotipos alternativos. Esta estrategia es análoga a la estrategia de modificación de la fibra para los virus basados en Ad5 descrita en WO00/03029. Los cebadores que se enumeran en la Tabla I de esa solicitud fueron utilizados para amplificar las secuencias de la fibra de diversos subgrupos de adenovirus. Para la amplificación de fibras que están clonadas en pBr/Ad35.PR\Deltafib se pueden utilizar las mismas secuencias (degeneradas) cebadoras, no obstante, el sitio NdeI de los primeros cebadores (oligonucleótidos de la cola A a E) debe ser cambiado por un sitio BsiWI y el sitio NsiI del oligo inverso (oligonucleótido de la protuberancia 1 a 8) debe ser cambiado por un sitio NheI. De este modo se amplifican 16 secuencias de la fibra utilizando los siguientes cebadores degenerados:
5'-CCK GTS TAC CCG TAC GAA GAT GAA AGC-3' y 5'-CCG GCT AGC TCA GTC ATC TTC TCT GAT ATA-3'. Las secuencias amplificadas son digeridas después con BsiWI y NheI y clonadas en pBr/Ad35.PR\Deltafib digerido con las mismas enzimas para generar pBr/Ad35.PRfib16. El último constructo es digerido después con PacI y SwaI y el inserto es aislado en gel. El fragmento de Ad35 PacI/SwaI con la fibra modificada es clonado después en los sitios correspondientes de pWE/Ad35.pIX- rITR para dar pWE/Ad35.pIX-rITR.fib16. Este esqueleto cosmídico puede ser utilizado después con un plásmido adaptador basado en Ad35 para generar virus recombinantes de Ad35 que presentan la fibra de Ad16. Se pueden amplificar otras secuencias de la fibra con los cebadores (degenerados) mencionados antes. Si una de las secuencias de la fibra resulta tener un sitio BsiWI o NheI, el fragmento de la PCR tiene que ser digerido parcialmente con esa enzima.
3) Generación de virus basados en Ad35 con expresión de E4, independiente de E1, inducible
El promotor E4 de adenovirus es activado por la expresión de las proteínas E1. No se sabe ahora si las proteínas E1 de Ad5 son capaces de mediar la activación del promotor E4 de Ad35. Por lo tanto, para permitir la producción de virus recombinantes de Ad35 en células PER.C6, puede ser ventajoso independizar la expresión de E4 de la de E1. Esto se puede lograr remplazando el promotor E4 de Ad35 por secuencias promotoras heterólogas como, pero no limitadas a, el promotor 7xTetO. Se ha demostrado que los vectores basados en Ad5 con E1 suprimida recombinantes tienen una expresión residual de genes virales del esqueleto vector en las células diana, a pesar de la ausencia de expresión de E1. La expresión génica viral aumenta la toxicidad y puede desencadenar la respuesta inmune del huésped a la célula infectada. Para la mayor parte de las aplicaciones de los vectores adenovirales en el campo de la terapia génica y la vacunación se desea reducir o disminuir la expresión de los genes virales del esqueleto. Un modo de lograr esto es suprimir todas las secuencias del esqueleto viral, o tantas como sea posible. Suprimiendo los genes E2A, E2B o E4 y/o las funciones de los genes tardíos, se deben complementar estas funciones durante la producción. Esta complementación puede ser por medio de un virus coadyuvante o por medio de la adición estable de estas funciones, con o sin una regulación de la transcripción inducible, a la célula productora. Los métodos para lograr esto han sido descritos para Ad5 y son conocidos en la técnica. Un método específico es la reposición del promotor E4 con secuencias promotoras que no son activas en las células diana. Las proteínas E4 juegan un papel por ejemplo en la replicación de los adenovirus por medio de la activación del promotor E2 y en la expresión del gen tardío por medio de la regulación del empalme y la exportación nuclear de los transcritos génicos tardíos. Además, al menos algunas de las proteínas E4 son tóxicas para las células. Por lo tanto, la reducción o la eliminación de la expresión de E4 en las células diana mejorará adicionalmente los vectores basados en Ad35. Un modo de lograr esto es remplazar el promotor E4 por un promotor heterólogo que sea inactivo en las células diana. Un ejemplo de sistema promotor/activador heterólogo que es inactivo en las células diana es el sistema TetO inducible por tetraciclina (Gossen y Bujard, 1992). Se pueden utilizar otros sistemas promotor/activador procarióticos o sintéticos. En este ejemplo, el promotor E4 del esqueleto del vector viral es reemplazado por un fragmento de ADN que contiene 7 repeticiones del elemento sensible a la tetraciclina del operón tet (7xTetO). Un potente transactivador de este promotor es una proteína de fusión que contiene el dominio de unión al ADN del represor tet y el dominio de activación de VP16 (proteínas transactivadora de Tet, Tta). La expresión fuerte de E4, independiente de la expresión de E1, puede ser lograda en células PER.C6 que expresan Tta. Las células PER.C6 que expresan Tta han sido generadas y descritas (ver Ejemplo 15). Los virus con E1 suprimida derivados de Ad5 con E4 bajo el control de 7xTetO pueden ser generados y propagados en estas células. Tras la infección en células de origen humano o animal (que no expresan el transactivador Tta), se encontró que la expresión de E4 disminuía enormemente en comparación con los virus que tienen E1 suprimida con el promotor E4 normal.
Más abajo se describe la construcción de pWE/Ad35.pIX-rITR.TetO-E4, un vector coadyuvante cosmídico para producir virus con la reposición del promotor E4.
Primero, se generó un fragmento mediante amplificación PCR en ADN de pBr/Ad35.PRn utilizando los siguientes cebadores:
355ITR: 5'-GAT CCG GAG CTC ACA ACG TCA TTT TCC CAC G-3' y
353ITR: 5'-CGG AAT TCG CGG CCG CAT TTA AAT C-3'.
Este fragmento contiene secuencias entre el pb 34.656 (numeración según wtAd35) y el sitio NotI 3' de la ITR derecha de pBr/Ad35.PRn e introduce un sitio SstI 5' de la secuencia ITR derecha.
Se generó un segundo fragmento de PCR en ADN de pBr/Ad35.PRn utilizando los cebadores:
35DE4: 5'-CCC AAG CTT GCT TGT GTA TAT ATA TTG TGG-3' y
35f7: Ver Ejemplo 7.
Esta PCR amplifica las secuencias de Ad35 entre el pb 33.098 y 34.500 (numeración según wtAd35) e introduce un sitio HindIII curso arriba de la caja Tata de E4. Con estas dos reacciones de PCR se amplificaron las secuencias limítrofes derecha e izquierda del promotor E4. Para la amplificación, se utilizó ADN polimerasa Pwo según las instrucciones del fabricante. Se aisló un tercer fragmento que contenía el promotor 7xTetO del constructo pAAO-E-TATA-7xTetO mediante digestión con SstI y HindIII. La generación de pAAO-E-TATA-7xTetO se describe más abajo. Después el primer fragmento de la PCR (355/353) fue digerido con SstI y NotI y ligado al fragmento 7xTetO. La mezcla de ligadura fue digerida después con HindIII y NotI y el fragmento de 0,5 kb aislada en gel. El segundo fragmento de la PCR (35DE4/35F7) fue digerido con NdeI y HindIII y purificado en gel. Estos dos fragmentos son ligados después en pBr/Ad35.PRn digerido con NdeI y NotI para dar pBr/Ad35.PR.TetOE4. La modificación del promotor E4 es transferida después al clon cosmídico coadyuvante de Ad35 intercambiando el fragmento PacI/SwaI del último por uno de pBr/Ad35.PR.TetOE4 para dar pWE/Ad35.pIX-rITR.TetOE4. pAAO-E-TATA.7xTetO fue generado como sigue. Se sintetizaron dos oligonucleótidos:
TATAplus: 5'-AGC TTT CTT ATA AAT TTT CAG TGT TAG ACT AGT AAA TTG CTT AAG-3' y
TATAmin: 5'-AGC TCT TAA GCA ATT TAC TAG TCT AAC ACT GAA AAT TTA TAA GAA-3'.
(Las secuencias subrayadas forman una caja TATA modificada).
Los oligonucleótidos fueron recocidos para rendir un fragmento de ADN de doble hebra con salientes 5' que son compatibles con ADN digerido con HindIII. El producto de la reacción de recocido fue ligado en pGL3-Enhancer Vector (Promega) digerido con HindIII para rendir pAAO-E-TATA. El clon que tenía el sitio HindIII en el extremo 5' del inserto restaurado fue seleccionado para su clonación adicional.
A continuación, la secuencia del operador tet heptamerizada fue amplificada a partir del plásmido pUHC-13-3 (Gossen y Bujard, 1992) en una reacción de PCR utilizando el sistema de PCR Expand (Roche) según el protocolo del fabricante. Se utilizaron los siguientes cebadores:
Tet3: 5'-CCG GAG CTC CAT GGC CTA ACT CGA GTT TAC CAC TCC C-3'
Tet5: 5'-CCC AAG CTT AGC TCG ACT TTC ACT TTT CTC-3'.
El fragmento amplificado fue digerido con SstI y HindIII (estos sitios están presentes en tet3 y tet5 respectivamente) y clonado en pAAO-E-TATA digerido con SstI/HindIII dando lugar a pAAO-E-TATA-7xtetO.
Para someter a ensayo la funcionalidad del clon cosmídico pWE/Ad35.pIX-rITR.TetOE4 generado, el ADN fue digerido con NotI. El extremo izquierdo del ADN de wtAd35 fue amplificado después utilizando los cebadores 35F1 y 35R4 (ver Ejemplo 7). Tras la amplificación, la mezcla de PCR fue purificada y digerida con SalI para separar el ADN viral intacto. Después 4 g tanto de pWE/Ad35.pIX-rITR.TetOE4 digerido como del fragmento de PCR fueron co-transfectados en células PER.C6-tTA que habían sido sembradas en matraces T25 el día antes. Las células transfectadas fueron transferidas a matraces T80 al cabo de dos días y dos días más tarde se obtuvo ECP, mostrando que el esqueleto cosmídico es funcional.
Ejemplo 14 Generación de líneas celulares capaces de complementar los virus Ad35 con E1 suprimida Generación de pIG135 y pIG270
El constructo pIG.E1A.E1B contiene las secuencias de la región E1 de Ad35 correspondientes a los nucleótidos 459 a 3.510 de la secuencia de Ad5 wt (número de acceso Genbank M72360) conectado operativamente al promotor de la fosfoglicerato quinasa humana (PGK) y a las secuencias poliA del Virus de la Hepatitis B. La generación de este constructo se describe en WO97/00326. Las secuencias E1 de Ad5 fueron remplazadas por las correspondientes secuencias de Ad35 como sigue. PRSV.Ad35-E1 (descrito en el ejemplo 8) fue digerido con EcoRI y Sse8387I y el fragmento de 3 kb correspondiente a las secuencias E1 de Ad35 fue aislado en gel. El constructo pIG.E1A.E1B fue digerido con Sse8387I completamente y parcialmente con EcoRI. El fragmento de 4,2 kb correspondiente a las secuencias vectoras sin la región E1 de Ad5 pero conservando el promotor PGK fue separado de otros fragmentos en gel de agarosa LMP y la banda correcta fue separada cortando del gel. Ambos fragmentos obtenidos fueron ligados dando como resultado pIG.Ad35-E1. Este vector fue modificado adicionalmente en el esqueleto del vector pUC119. A este fin, el vector fue digerido con BsaAI y BstXI y el fragmento grande fue aislado en gel. Se preparó un oligo de doble hebra recociendo los dos oligos siguientes:
BB1: 5'-GTG CCT AGG CCA CGG GG-3' y
BB2: 5'-GTG GCC TAG GCA C-3'.
La ligadura del oligo y el fragmento del vector dio como resultado el constructo pIG135. La inserción correcta del oligo restaura los sitios BsaAI y BstXI e introduce un sitio AvrII único. A continuación, los autores de la presente invención introdujeron un sitio único en el extremo 3' de la casete de expresión Ad35-E1 en pIG135. A este fin, el constructo fue digerido con SapI y los extremos 3' salientes se volvieron romos mediante tratamiento con ADN polimerasa T4. El plásmido lineal tratado de este modo fue digerido adicionalmente con BsrGI y el vector grande que contenía el fragmento fue aislado en gel. Para restaurar el extremo 3' de la secuencia poliA de HBV y para introducir un sitio único, se generó un fragmento de PCR utilizando los siguientes cebadores:
270F: 5'-CAC CTC TGC CTA ATC ATC TC-3' y
270R: 5'-GCT CTA GAA ATT CCA CTG CCT TCC ACC-3'.
La PCR se realizó en el ADN de pIG.Ad35.E1 utilizando la polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante. El producto de la PCR obtenido fue digerido con BsrGI y desfosforilado utilizando la enzima Tsap (LTI), la última para prevenir la dimerización del inserto en el sitio BsrGI. El fragmento de la PCR y el fragmento vector fueron ligados para rendir el constructo pIG270.
Las secuencias de Ad35 son capaces de transformar células primarias de rata
Se sacrificaron ratas WAG/RIJ recién nacidas con 1 semana de gestación y se aislaron los riñones. Tras la cuidadosa eliminación de la cápsula, los riñones fueron disgregados en una sola suspensión celular mediante múltiples ciclos de incubación en tripsina/EDTA (LTI) a 37ºC y recolección de las células flotantes en PBS frío conteniendo FBS al 1%. Cuando la mayor parte del riñón se hubo tratado con tripsina todas las células fueron resuspendidas en DMEM suplementado con FBS al 10% y filtradas a través de cuajo de queso estéril. Las células de Riñón de Cría de Rata (BRK) obtenidas de un riñón fueron cultivadas en 5 placas (Greiner, 6 cm). Cuando se alcanzaba una confluencia del 70-80%, las células eran transfectadas con 1 o 5 \mug de ADN/placa utilizando el estuche de precipitación con CaPO_{4} (LTI) según las instrucciones del fabricante. Los siguientes constructos fueron utilizados en transfecciones separadas: pIG.E1A.E1B (que expresaba la región E1 de Ad5), pRSV.Ad35-E1, pIG.Ad35-E1 y pIG270 (expresando el último la E1 de Ad35). Las células fueron incubadas a 37ºC, CO_{2} al 5% hasta que aparecieron focos de células transformadas. La Tabla IV muestra el número de focos que resultan de diversos experimentos de transfección utilizando ADN circular o lineal. Como se esperaba, la región E1 de Ad5 transformaba eficazmente las células BRK. También aparecían focos en la capa de células transfectadas con E1 de Ad35 aunque con menor eficacia. Los focos transformados con Ad35 aparecían en un momento puntual más tardío: \sim2 semanas después de la transfección en comparación con los 7-10 días para E1 de Ad5. Estos experimentos muestran claramente que los genes E1 del virus del grupo B Ad35 son capaces de transformar células primarias de roedor. Esto demuestra la funcionalidad de los constructos de expresión de E1 de Ad35 y confirma descubrimientos anteriores de la capacidad de transformación de los virus del grupo B Ad3 y Ad7 (Dijkema, 1979). Para someter a ensayo si las células de los focos estaban realmente transformadas se escogieron unos pocos focos y se ampliaron. De los 7 focos elegidos, resultó que al menos 5 crecían en forma de líneas celulares establecidas.
Generación de nuevas células de empaquetamiento derivadas de amniocitos humanos primarios
Se centrifugó fluido amniótico obtenido tras la amniocentesis y las células fueron resuspendidas en medio AmnioMax (LTI) y cultivadas en matraces para el cultivo de tejidos a 37ºC y CO_{2} al 10%. Cuando las células estaban creciendo bien (aproximadamente una división celular/24 horas), el medio fue reemplazado por una mezcla 1:1 de medio completo AmnioMax y medio MDEM con bajo contenido de glucosa (LTI) suplementado con Glutamax I (concentración final 4 mM, LTI) y glucosa (concentración final 4,5 g/litro, LTI) y FBS al 10% (LTI). Para la transfección, se cultivaron en placa \sim5x10^{5} células en placas para el cultivo de tejidos de 10 cm. El día después, las células fueron transfectadas con 20 \mug de pIG270 circular/placa utilizando el estuche de transfección CaPO_{4} (LTI) según las instrucciones del fabricante y las células fueron incubadas durante la noche con el producto precipitado de ADN. Al día siguiente, las células fueron lavadas 4 veces con PBS para separar el producto precipitado e incubadas adicionalmente durante más de tres semanas hasta que aparecieron focos de células transformadas. Una vez a la semana el medio era reemplazado por medio de nueva aportación. Se utilizaron otros agentes de transfección similares, pero no limitados a, Lipofectamine (LTI) o PEI (Polietilenimina, elevado peso molecular, sin agua, Aldrich). De estos tres agentes PEI alcanzaba la mejor eficacia de transfección en amniocitos humanos primarios: \sim1% células azules 48 horas después de la transfección de pAdApt35.LacZ.
Los focos son aislados como sigue. Se separa el medio y se reemplaza por PBS después de lo cual los focos son aislados raspando suavemente las células utilizando una pipeta Gilson de 50-200 \mul con una punta de filtro desechable. Las células contenidas en 10 \mul de PBS se llevaron a una placa de 96 pocillos conteniendo 15 \mul de tripsina/EDTA (LTI) y se obtuvo una única suspensión celular pipeteando arriba y abajo y con una corta incubación a la temperatura ambiente. Tras la adición de 200 \mul de la mezcla 1:1 de medio completo Amniomax y DMEM con suplementos y FBS al 10% descrita antes, las células fueron incubadas adicionalmente. Los clones que continuaban creciendo fueron ampliados y analizados en cuanto a su capacidad para complementar el crecimiento de los vectores adenovirales con E1 suprimida de diferentes subgrupos, específicamente los derivados de virus del grupo B específicamente de Ad35 y Ad11.
Generación de nuevas líneas celulares de empaquetamiento de retinoblastos embriónicos humanos
Se aislaron células de retina humana de los ojos de fetos abortados y se cultivaron en medio DMEM (LTI) suplementado con FBS al 10% (LTI). El día antes de la transfección, se cultivan en placa \sim5x10^{5} células en placas de 6 cm y se cultivan durante la noche a 37ºC y CO_{2} al 10%. La transfección se realiza utilizando el estuche de precipitación con CaPO_{4} (LTI) según las instrucciones del fabricante. Cada placa es transfectada con 8-10 \mug de ADN de pIG270, ya sea en forma de un plásmido circular o en forma de un fragmento purificado. Para obtener el fragmento purificado pIG270 fue digerido con AvrII y XbaI y el fragmento de 4 kb correspondiente a la casete de expresión de E1 de Ad35 fue aislado en gel mediante tratamiento con agarasa (Roche). Al día siguiente, el producto precipitado es lavado cuidadosamente por medio de cuatro lavados con PBS estéril. Después se añade medio de nueva aportación y las células transfectadas son cultivadas adicionalmente hasta que aparecen focos de células transformadas. Cuando son bastante grandes (>100 células) los focos son seleccionados y llevados a 96 pocillos como se ha descrito antes. Los clones de retinoblastos embriónicos humanos transformados que continúan creciendo, son ampliados y sometidos a ensayo en cuanto a su capacidad para complementar el crecimiento de vectores adenovirales con E1 suprimida de diferentes subgrupos específicamente los derivados de los virus del grupo B específicamente de Ad35 o Ad11.
Nuevas líneas celulares de empaquetamiento derivadas de PER.C6
Como se describe en el ejemplo 8, es posible generar y hacer crecer virus con E1 suprimida de Ad35 sobre células PER.C6 con la co-transfección de un constructo de expresión de E1 de Ad35, v.g. pRSV.Ad35.E1. Sin embargo, la producción a gran escala de adenovirus recombinantes utilizando este método es engorrosa debido a que para cada etapa de amplificación se necesita una etapa de transfección del constructo E1 de Ad35. Además, este método aumenta el riesgo de recombinación no homóloga entre el genoma del plásmido y del virus con elevadas posibilidades de generación de virus recombinantes que incorporen secuencias de E1 dando como resultado virus de replicación competente. Para evitar esto, la expresión de proteínas E1 de Ad35 en PER.C6 tiene que estar mediada por copias integradas del plásmido de expresión en el genoma. Puesto que las células PER.C6 ya están transformadas y expresan las proteínas E1 de Ad35, la adición de la expresión de E1 de Ad35 extra puede ser tóxica para las células, no obstante, no es imposible transfectar establemente células transformadas con proteínas E1 puesto que han sido generadas células A549 que expresan E1 de Ad5.
En un intento de generar adenovirus recombinantes derivados del virus del subgrupo B Ad7, Abrahamsen y col. (1997) no fueron capaces de generar virus con E1 suprimida sobre células 293 sin contaminación de Ad7 wt. Se demostró que los virus que fueron escogidos tras la purificación en placa sobre células 293 ORF6 (Brough y col., 1996) tenían incorporadas secuencias E1B de Ad7 mediante recombinación no homóloga. De este modo, la propagación eficaz de virus recombinantes de Ad7 fue demostrada solamente en presencia de la expresión de E1B de Ad7 y de la expresión de ORF6 de E4 de Ad5. Se sabe que las proteínas E1B interaccionan con las proteínas celulares así como virales (Bridge y col., 1993; White, 1995). Posiblemente, el complejo formado entre la proteína E1B de 55 K y ORF6 de E4 que es necesario para incrementar la exportación de ARNm de proteínas virales y para inhibir la exportación de la mayor parte de los ARNm celulares, es crítica y en cierto modo específica del serotipo. Los experimentos anteriores sugieren que las proteínas E1A de Ad5 son capaces de complementar una deleción de E1A de Ad7 y de que la expresión de E1B de Ad7 en células de empaquetamiento de adenovirus como tal no sea suficiente para generar una línea celular complementadora estable. Para someter a ensayo si una o ambas proteínas E1B de Ad35 es o son el factor limitante en la eficaz propagación del vector de Ad35 sobre las células PER.C6, los autores de la presente invención han generado un plásmido adaptador de Ad35 que contiene el promotor de E1B y las secuencias de E1B pero carece del promotor y la región codificadora para E1A. A este fin, el extremo izquierdo del ADN de Ad35 wt fue amplificado utilizando los cebadores 35F1 y 35R4 (ambos descritos en el Ejemplo 7) con ADN polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante. El producto de la PCR de 4,6 kb fue purificado utilizando el estuche de purificación de PCR (LTI) y digerido con las enzimas SnaBI y ApaI. El fragmento de 4,2 kb resultante fue purificado después en gel utilizando el estuche QIAExII (Qiagen). A continuación, pAdApt35Ip1 (Ejemplo 7) fue digerido con SnaBI y ApaI y el fragmento que contiene el vector de 2,6 kb fue aislado en gel utilizando el estuche GeneClean (BIO 101, Inc.). Ambos fragmentos aislados fueron ligados para dar pBr/Ad35.leftITR-pIX. La amplificación correcta durante la PCR fue verificada mediante un ensayo de funcionalidad como sigue: El ADN fue digerido con BstBI para liberar el inserto de Ad35 de las secuencias vectoras y 4 \mug de este ADN fueron cotransfectados con 4 \mug de pWE/Ad35.pIX-rITR digerido con NotI (Ejemplo 7) en células PER.C6. Las células transfectadas se pasaron a matraces T80 el día 2 y de nuevo dos días después se había formado ECP mostrando que el nuevo constructo pBr/Ad35.leftITR-pIX contiene secuencias E1 funcionales. El constructo pBr/Ad35.leftITR-pIX fue modificado después como sigue. El ADN fue digerido con SnaBI y HindIII y el saliente HindIII 5' fue rellenado utilizando la enzima de Klenow. La religadura del ADN digerido y la transformación en células competentes (LTI) produjeron el constructo pBr/Ad35leftITR-pIX\DeltaE1A. Este último constructo contiene el extremo izquierdo de 4,6 kb de Ad35 excepto para las secuencias de E1A entre el pb 450 y 1.341 (numeración según wtAd35, Figura 6) y por tanto carece del promotor E1A y de la mayoría de las secuencias codificadoras de E1A. Después pBr/Ad35.leftITR-pIX\DeltaE1A fue digerido con BstBI y 2 \mug de este constructo fueron co-transfectados con 6 \mug de pWE/Ad35.pIX-rITR (Ejemplo 7) digerido con NotI en células PER.C6. Una semana después de la transfección se había formado un ECP completo en los matraces transfectados.
Este experimento muestra que las proteínas E1A de Ad35 son complementadas funcionalmente por la expresión de e1A de Ad5 en células PER.C6 y que al menos una de las proteínas E1B de Ad35 no puede ser complementada por la expresión de E1 de Ad5 en PER.C6. Adicionalmente muestra que es posible elaborar una línea celular complementadora para los virus con E1 suprimida de Ad35 expresando las proteínas E1B de Ad35 en PER.C6. La expresión estable de las secuencias E1B de Ad35 a partir de copias integradas en el genoma de las células PER.C6 puede ser dirigida por el promotor E1B y terminada mediante una señal de poli-adenilación heteróloga como, pero no limitada a, pA de HBV. La señal pA heteróloga es necesaria para evitar el solapamiento entre el inserto E1B y el vector recombinante, puesto que la terminación de E1B natural está localizada en la unidad de transcripción pIX que tiene que estar presente en el vector adenoviral. Alternativamente, las secuencias de E1B pueden ser dirigidas por un promotor heterólogo como, pero no limitado a, el promotor PGK humano o por un promotor inducible como, pero no limitado a, el promotor 7xtetO (Gossen y Bujard, 1992). También en estos casos la terminación de la transcripción está mediada por una secuencia pA heteróloga, v.g. la pA de HBV. Las secuencias E1B de Ad35 comprenden al menos una de las regiones codificadoras de las proteínas E1B de 21K y E1B de 55K localizadas entre los nucleótidos 1.611 y 3.400 de la secuencia de Ad35 wt. El inserto también puede incluir (parte de) las secuencias E1B de Ad35 entre los nucleótidos 1.550 y 1.611 de la secuencia de Ad35 wt.
Ejemplo 15 Generación de líneas celulares productoras para la producción de vectores adenovirales recombinantes con la región temprana 1 y la región temprana 2A suprimidas Generación de las células PER.C6-tTa
Aquí se describe la generación de líneas celulares para la producción de vectores adenovirales recombinantes que tienen la región temprana 1 (E1) y la región temprana 2A (E2A) suprimidas. Las líneas celulares productoras complementan la deleción de E1 y E2A de los vectores adenovirales recombinantes en trans mediante la expresión constitutiva de ambos genes E1 y E2A. La línea celular de retinoblastos embriónicos humanos transformados con E1 de Ad5 pre-establecida PER.C6 (WO 97/00326) fue equipada adicionalmente con casetes de expresión de E2A.
El gen E2A adenoviral codifica una Proteína de Unión al ADN de 72 kDa que tiene una elevada afinidad por el ADN de hebra sencilla. Debido a esta función, la expresión constitutiva de DBP es tóxica para las células. El mutante ts125E2A codifica una DBP que tiene una sustitución Pro\rightarrowSer del aminoácido 413. Debido a esta mutación, la DBP codificada por ts125E2A es completamente activa a la temperatura permisiva de 32ºC, pero no se une al ADNhs a la temperatura no permisiva de 39ºC. Esto permite la generación de líneas celulares que expresan constitutivamente E2A, que no es funcional y no es tóxica a la temperatura no permisiva de 39ºC. E2A sensible a la temperatura se vuelve funcional gradualmente una vez que la temperatura disminuye y se vuelve completamente funcional a una temperatura de 32ºC, la temperatura permisiva.
A. Generación de plásmidos que expresan el gen E2A de tipo salvaje o ts125E2A sensible a la temperatura
PcDNA3wtE2A: Se amplificó la región codificadora de la región temprana de tipo salvaje completa 2A (E2A) a partir del plásmido pBR/Ad.Bam-rITR (consigna ECACC P97082122) con los cebadores DBPpcr1 y DBPpcr2 utilizando el sistema Expand®Long Template PCR según el protocolo normalizado del proveedor (Boehringer-Mannheim). La PCR fue realizada en un Biometra Trio Thermoblock, utilizando el siguiente programa de amplificación: 94ºC durante 2 minutos, 1 ciclo; 94ºC durante 10 segundos +51ºC durante 30 segundos + 68ºC durante 2 minutos, 1 ciclo; 94ºC durante 10 segundos + 58ºC durante 30 segundos + 68ºC durante 2 minutos, 10 ciclos; 94ºC durante 10 segundos + 58ºC durante 30 segundos + 68ºC durante 2 minutos con 10 segundos de ampliación por ciclo, 20 ciclos; 68ºC durante 5 minutos, 1 ciclo. El cebador DBPpcr1: CGG GAT CC G CCA CC A TGG CCA GTC GGG AAG AGG AG (5' a 3') contiene un único sitio de restricción BamHI (subrayado) 5' con respecto a la secuencia de Kozak (cursiva) y el codón de iniciación de la secuencia codificadora de E2A. El cebador DBPpcr2: CGG AAT TC T TAA AAA TCA AAG GGG TTC TGC CGC (5' a 3') contiene un único sitio de restricción EcoRI (subrayado) 3' del codón de terminación de la secuencia codificadora de E2A. Los caracteres en negrita hacen referencia a secuencias derivadas de la región codificadora de E2A. El fragmento de la PCR fue digerido con BamHI/EcoRI y clonado en pcDNA3 digerido con BamHI/EcoRI (Invitrogen), dando lugar a pcDNA3wtE2A.
PcDNA3tsE2A: La región codificadora completa ts125E2A fue amplificada a partir de ADN aislado del mutante de adenovirus sensible a la temperatura H5ts125. El procedimiento de amplificación por PCR era idéntico al de la amplificación de wtE2A. El fragmento de PCR fue digerido con BamHI/EcoRI y clonado en pcDNA3 digerido con BamHI/EcoRI (Invitrogen), dando lugar a pcDNA3tsE2A. La integridad de la secuencia codificadora de wtE2A y tsE2A fue confirmada mediante secuenciación.
B. Características de crecimiento de células productoras para la producción de vectores adenovirales recombinantes cultivados a 32, 37 y 39ºC
Las células PER.C6 fueron cultivadas en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco BRL) suplementado con Suero Bovino Fetal (FBS, Gibco BRL) al 10% y MgCl_{2} 10 mM en una atmósfera con CO_{2} al 10% a 32ºC, 37ºC o 39ºC. El día 0, se sembraron un total de 1 x 10^{6} células PER.C6 por matraz para el cultivo de tejidos de 25 cm^{2} (Nunc) y las células fueron cultivadas a 32ºC, 37ºC o 39ºC. El día 1-8, se contaron las células. La Figura 30 muestra que la tasa de crecimiento y la densidad celular final del cultivo de PER.C6 a 39ºC son comparables con los de 37ºC. La tasa de crecimiento y la densidad final del cultivo de PER.C6 a 32ºC estaban significativamente reducidos en comparación con los de 37ºC o 39ºC. No se observaba una muerte celular significativa a ninguna de las temperatura de incubación. Por lo tanto PER.C6 funciona muy bien tanto a 32ºC como a 39ºC, la temperatura permisiva y no permisiva para ts125E2A, respectivamente.
C. Transfección de PER.C6 con vectores de expresión de E2A; formación de colonias y generación de líneas celulares
Un día antes de la transfección, se sembraron 2 x 10^{6} células PER.C6 por placa de cultivo de tejidos de 6 cm (Greiner) en DMEM, suplementado con FBS al 10% y MgCl_{2} 10 mM y se incubaron a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 10%. Al día siguiente, las células fueron transfectadas con 3, 5 o 8 \mug de ADN plasmídico de pcDNA3, pcDNA3wtE2A o pcDNA3tsE2A por placa, utilizando el LipofectAMINE PLUS® Reagent Kit según el protocolo normalizado del proveedor (Gibco BRL), excepto que las células fueron transfectadas a 39ºC en una atmósfera de CO_{2} al 10%. Después de la transfección, las células fueron mantenidas constantemente a 39ºC, la temperatura no permisiva para ts125E2A. Tres días más tarde, las células fueron colocadas en DMEM suplementado con FBS al 10%, MgCl_{2} 10 mM y 0,25 mg/ml de G418 (Gibco BRL), y las primeras colonias resistentes a G418 aparecieron 10 días después de la transfección. Como se muestra en la tabla 1, había una diferencia espectacular entre el número total de colonias obtenidas tras la transfección de pcDNA3 (\sim200 colonias) o pcDNA3tsE2A (\sim100 colonias) y pcDNA3wtE2A (sólo 4 colonias). Estos resultados indican que la toxicidad de E2A expresada constitutivamente puede ser superada utilizando un mutante sensible a la temperatura de E2A (ts125E2A) y cultivando las células a una temperatura no permisiva de 39ºC.
De cada transfección, se escogieron numerosas colonias raspando las células de la placa con una pipeta. Las células desprendidas fueron colocadas con posterioridad en placas para el cultivo de tejidos de 24 pocillos (Greiner) y cultivadas adicionalmente a 39ºC en una atmósfera de CO_{2} al 10% en DMEM, suplementado con FBS al 10%, MgCl_{2} 10 mM y 0,25 mg/ml de G418. Como se muestra en la tabla 1, el 100% de las colonias transfectadas con pcDNA3 (4/4) y el 82% de las colonias transfectadas con pcDNA3tsE2A (37/45) fueron establecidas en líneas celulares estables (las 8 colonias transfectadas con pcDNA3tsE2A restantes crecían lentamente y fueron descartadas). En contraste, sólo una colonia transfectada con pcDNA3wtE2A pudo ser establecida. Las otras 3 morían directamente después de seleccionarlas.
A continuación, se determinaron los niveles de expresión de E2A en las diferentes líneas celulares mediante transferencia Western. Las líneas celulares fueron sembradas en placas para el cultivo de tejidos de 6 pocillos y los cultivos subconfluentes fueron lavados dos veces con PBS (NPBI) y lisados y raspados en RIPA (NP-40 1%, desoxicolato de sodio al 0,5% y SDS en PBS al 0,1%, suplementado con fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM y 0,1 mg/ml de inhibidor de tripsina). Al cabo de 15 minutos de incubación en hielo, los productos lisados fueron aclarados mediante centrifugación. Las concentraciones de proteína fueron determinadas mediante el análisis de proteínas de Bio-Rad, según los procedimientos normalizados del proveedor (BioRad). Se fraccionaron cantidades iguales del extracto de células completas mediante SDS-PAGE en gel al 10%. Las proteínas fueron transferidas a membranas Immobilon-P (Millipore) e incubadas con anticuerpo monoclonal \alphaDBP B6. El anticuerpo secundario era anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (BioRad). Se realizaron el procedimiento de transferencia Western y las incubaciones según el protocolo proporcionado por Millipore. Los complejos fueron visualizados con el sistema de detección ECL según el protocolo del fabricante (Amersham). La Figura 31 muestra que todas las líneas celulares derivadas de la transfección con pcDNA3tsE2A expresaban la proteína E2A de 72 kDa (panel izquierdo, calles 4-14; panel central, calles 1-13; panel derecho, calles 1-12). En contraste, la única línea celular derivada de la transfección con pcDNAwtE2A no expresaba la proteína E2A (panel izquierdo, calle 2). No se detectaba proteína E2A en el extracto de una línea celular de la transfección con pcDNA3 (panel izquierdo, calle 1), que servía como control negativo. El extracto de células PER.C6 transfectadas transitoriamente con pcDNA3ts125 (panel izquierdo, calle 3) servía como control positivo para el procedimiento de transferencia Western. Estos datos confirmaban que la expresión constitutiva de wt E2A es tóxica para las células y que utilizando el mutante ts125 de E2A se podría evitar esta toxicidad.
D. Complementación de la deleción de E2A en vectores adenovirales en células PER.C6 que expresan constitutivamente ts125E2A en toda su longitud
El adenovirus Ad5.dl802 es un vector derivado de Ad5 que tiene suprimida la mayor parte de la región codificadora de E2A y no produce DBP funcional. Se utilizó Ad5.dl802 para someter a ensayo la actividad complementadora en trans de E2A de las células PER.C6 que expresan constitutivamente ts125E2A. Las células PER.C6 parentales o el clon PER.C6tsE2A 3-9 fueron cultivadas en DMEM, suplementado con FBS al 10% y MgCl_{2} 10 mM a 39ºC y CO_{2} al 10% en matraces de 25 cm^{2} y o bien infectadas simuladamente o bien infectadas con Ad5.dl802 a un m.o.i. de 5. Con posterioridad las células infectadas fueron cultivadas a 32ºC y las células fueron rastreadas en cuanto a la aparición del efecto citopático (ECP) determinado mediante los cambios en la morfología celular y la separación de las células del matraz. El ECP total aparecía en el clon PER.C6tsE2A 3-9 infectado con Ad5.dl802 en 2 días. No aparecía ECP en las células PER.C6 infectadas con Ad5.dl802 o las células simuladamente infectadas. Estos datos mostraban que las células PER.C6 expresaban constitutivamente ts125E2A complementado en trans para la deleción E2A en el vector Ad5.dl802 a la temperatura permisiva de 32ºC.
E. Cultivo en suspensión sin suero de las líneas celulares PER.C6tsE2A
La producción a gran escala de vectores adenovirales recombinantes para la terapia génica humana requiere un método de cultivo fácil y graduable para la línea celular productora, preferiblemente un cultivo en suspensión en un medio desprovisto de cualquier constituyente humano o animal. Con este propósito, la línea celular PER.C6tsE2A c5-9 (denominada c5-9) fue cultivada a 39ºC y CO_{2} al 10% en un matraz para el cultivo de tejidos de 175 cm^{2} (Nunc) en DMEM, suplementado con FBS al 10% y MgCl_{2} 10 mM. A la sub-confluencia (confluencia del 70-80%), las células fueron lavadas con PBS (NPBI) y el medio fue reemplazado por 25 ml de medio en suspensión libre de suero Ex-cell® 525 (JRH) suplementado con 1 x L-Glutamina (Gibco BRL), denominado en adelante SFM. Dos días más tarde, las células fueron desprendidas del matraz dando golpecitos y las células fueron centrifugadas a 1.000 rpm durante 5 minutos. El sedimento celular fue resuspendido en 5 ml de SFM y se transfirieron 0,5 ml de suspensión celular a un matraz para el cultivo de tejidos de 80 cm^{2} (Nunc), junto con 12 ml de SFM de nueva aportación. Al cabo de 2 días, las células fueron cosechadas (todas las células están en suspensión) y sometidas a recuento en un contador celular Burker. A continuación, las células fueron sembradas en un erlenmeyer para el cultivo de tejidos de 125 ml (Corning) a una densidad de siembra de 3 x 10^{5} células por ml en un volumen total de 20 ml de SFM. Las células fueron cultivadas adicionalmente a 125 rpm en un aparato de sacudimiento orbital (GFL) a 39ºC en atmósfera de CO_{2} al 10%. Las células se contaron el día 1-6 en un contador celular Burker. En la Figura 4, se muestra la curva de crecimiento medio de los 8 cultivos. PER.C6tsE2A c5-9 se comportaba bien en un cultivo en suspensión sin suero. La máxima densidad celular de aproximadamente 2 x 10^{6} células por ml se alcanza a los 5 días de cultivo.
F. Características de crecimiento de PER.C6 y PER.C6/E2A a 37ºC y 39ºC
Se cultivaron células PER.C6 o PER.C6ts125E2A (C8-4) en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco BRL) suplementado con Suero Bovino Fetal (FBS, Gibco BRL) al 10% y MgCl_{2} 10 mM en una atmósfera de CO_{2} al 10% a 37ºC (PER.C6) o a 39ºC (PER.C6ts125E2A c8-4). El día 0, se sembraron un total de 1 x 10^{6} células por matraz para el cultivo de tejidos de 25 cm^{2} (Nunc) y las células fueron cultivadas a las respectivas temperaturas. En los momentos puntuales indicados, se contaron las células. El crecimiento de las células PER.C6 a 37ºC era comparable con el crecimiento de PER.C6ts125E2A c8-4 a 39ºC (Figura 33). Esto muestra que la expresión constitutiva de DBP codificada por ts125E2A no tenía un efecto adverso sobre el crecimiento de las células a la temperatura no permisiva de 39ºC.
G. Estabilidad de PER.C6ts125E2A
Durante varios pases, se cultivó la línea celular PER.C6ts125E2A clon 8-4 a 39ºC y CO_{2} al 10% en un matraz para el cultivo de tejidos de 25 cm^{2} (Nunc) en MDEM, suplementado con FBS al 10% MgCl_{2} 10 mM en ausencia de presión de selección (G418). A la subconfluencia (confluencia del 70-80%), las células fueron lavadas con PBS (NPBI) y lisadas y raspadas en RIPA (NP-40 al 1%, desoxicolato de sodio al 0,5% y SDS en PBS al 0,1%, suplementado con fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM y 0,1 mg/ml de inhibidor de tripsina). Al cabo de 15 minutos de incubación en hielo, los productos lisados fueron aclarados mediante centrifugación. Las concentraciones de proteína fueron determinadas mediante el análisis de proteínas de BioRad, según los procedimientos normalizados del proveedor (BioRad). Se fraccionaron cantidades iguales de extracto de células completas mediante SDS-PAGE en geles al 10%. Las proteínas fueron transferidas a membranas Immobilon-P (Millipore) e incubadas con anticuerpo monoclonal \alphaDBP B6. El anticuerpo secundario era un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (BioRad). El procedimiento de transferencia Western y las incubaciones se realizaron según el protocolo proporcionado por Millipore. Los complejos fueron visualizados con el sistema de detección ECL según el protocolo del fabricante (Amersham). La expresión de DBP codificada por ts125E2A era estable durante al menos 16 pases, lo que equivale a aproximadamente 40 duplicaciones (Figura 34). No se observaba descenso en los niveles de DBP durante este período de cultivo, indicando que la expresión de ts125E2A era estable, incluso en ausencia de presión de selección por G418.
Ejemplo 16 Generación de líneas celulares de empaquetamiento que expresan tTA A. Generación de un plásmido a partir del cual es expresado el gen tTA
PcDNA3.1-tTA: El gen tTA, una fusión de los genes tetR y VP16, fue separado del plásmido pUHD 15-1 (Gossen y Bujard, 1992) mediante digestión utilizando las enzimas de restricción BamHI y EcoRI. Primero, pUHD15-1 fue digerido con EcoRI. El plásmido linealizado fue tratado con la enzima de Klenow en presencia de dNTP para rellenar los extremos cohesivos EcoRI. Después, el plásmido fue digerido con BamHI. El fragmento resultante, de 1.025 pb de longitud, fue purificado en agarosa. Con posterioridad, el fragmento fue utilizado en una reacción de ligadura con pcDNA3 3.1 HYGRO (-) (Invitrogen) digerido con BamHI/EcoRI dando lugar a pcDNA3.1tTA. Tras la transformación en E. Coli DH5\alpha competente (Life Techn.) y el análisis de las colonias resistentes a la ampicilina, se seleccionó un clon que mostraba un patrón de digestión como el esperado para pcDNA3.1-tTA.
B. Transfección de PER.C6 y PER.C6/E2A con el vector de expresión tTA; formación de colonias y generación de líneas celulares
Un día antes de la transfección, se sembraron 2x10^{6} células PER.C6 o PER.C6/E2A por placa de cultivo de tejidos de 60 mm (Greiner) en medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco BRL) suplementado con FBS al 10% (JRH) y MgCl_{2} 10 mM y se incubaron a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 10%. Al día siguiente, las células fueron transfectadas con 4-8 \mug de plásmido pcDNA3.1-tTA utilizando LipofectAMINE PLUS® Reagent Kit según el protocolo normalizado del proveedor (Gibco BRL). Las células fueron incubadas con la mezcla LipofectAMINE PLUS®-DNA durante cuatro horas a 37ºC y CO_{2} al 10%. Después, se añadieron 2 ml de DMEM suplementado con FBS al 20% y MgCl_{2} 10 mM y las células fueron incubadas adicionalmente a 37ºC y CO_{2} al 10%. Al día siguiente, las células fueron lavadas con PBS e incubadas en DMEM de nueva aportación suplementado con FBS al 10%, MgCl_{2} 10 mM a 37ºC (PER.C6) o a 39ºC (Per.C6/E2A) en atmósfera de CO_{2} al 10% durante tres días. Después, los medios fueron intercambiados por medios de selección; las células PER.C6 fueron incubadas con DMEM suplementado con FBS al 10%, MgCl_{2} 10 mM y 50 \mug/ml de higromicina B (GIBCO) mientras las células PER.C6/E2A fueron mantenidas en DMEM suplementado con FBS al 10%, MgCl_{2} 10 mM y 100 \mug/ml de higromicina B. Las colonias de células que resistían la selección aparecían en tres semanas mientras las células no resistentes morían durante este período.
A partir de cada transfección, se escogió un número de colonias celulares resistentes a la higromicina, independientes raspando las células de la placa con una pipeta y se colocaron en placas de 2,5 cm^{2} (Greiner) para un crecimiento adicional en DMEM conteniendo FBS al 10%, MgCl_{2} 10 mM y suplementado con 50 \mug/ml (células PER.C6) o 100 \mug/ml (células PER.C6/E2A) de higromicina en una atmósfera de CO_{2} al 10% y a 37ºC o 39ºC, respectivamente.
A continuación, se determinó si estas colonias celulares resistentes a la higromicina expresaban la proteína tTA funcional. Por lo tanto, los cultivos de las células PER.C6/tTA o PER/E2A/tTA fueron transfectados con el plásmido pUHC 13-3 que contiene el gen informador de la luciferasa bajo el control del promotor 7xtetO (Gossens y Bujard, 1992). Para demostrar que la expresión de luciferasa estaba mediada por tTA, la mitad de los cultivos se mantuvo en medio sin doxiciclina. La otra mitad se mantuvo en medio con 8 \mug/ml de doxiglicina (Sigma). Este ultimo fármaco es un análogo de tetraciclina y se une a tTA e inhibe su actividad. Todas las líneas celulares PER.C6/tTA y PER/E2A/tTA rindieron elevados niveles de luciferasa, indicando que todas las líneas celulares expresaban la proteína tTA (Figura 35). Además, la expresión de la luciferasa resultaba sumamente suprimida cuando las células eran tratadas con doxiciclina. Colectivamente, los datos mostraban que los clones de las células PER.C6 y PER/E2A resistentes a la higromicina aislados y establecidos expresaban todos tTA funcional.
Leyendas de las figuras
Figura 1
Diagrama de barras que muestra el porcentaje de muestras de suero positivas para la neutralización de cada adenovirus wt humano sometido a ensayo (ver ejemplo 1 para la descripción del análisis de neutralización).
Figura 2
Gráfico que muestra la ausencia de correlación entre la razón PV/DICC50 y el porcentaje de neutralización.
Figura 3
Representación esquemática de un mapa de restricción parcial de Ad35 (tomado de Kang y col., 1989) y los clones generados para elaborar virus basados en Ad35 recombinantes.
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Figura 4
Diagrama de barras que presenta el porcentaje de muestras de suero que muestran actividad neutralizadora para una selección de serotipos de adenovirus. Los sueros derivaban de voluntarios sanos de Bélgica y Estados Unidos.
Figura 5
Diagrama de barras que presenta el porcentaje de muestras de suero que muestran actividad neutralizadora para los serotipos de adenovirus 5, 11, 26, 34, 35, 48 y 49. Los sueros derivaban de cinco localizaciones diferentes de Europa y Estados Unidos.
Figura 6
Secuencia de adenovirus humano de tipo 35. Como se explica en el texto la secuencia de nucleótidos de los extremos terminales del virus no se resuelven definitivamente.
Figura 7: Mapa de pAdApt
Figura 8: Mapa de pIPspAdApt
Figura 9: Mapa de pIPspAdApt1
Figura 10: Mapa de pIPspAdApt3
Figura 11: Mapa de pAdApt35IP3
Figura 12: Mapa de pAdApt35IP1
Figura 13: Representación esquemática de las etapas experimentadas para construir pWE.Ad35.pIX-rITR
Figura 14: Mapa de pWE.Ad35.pIX-rITR
Figura 15: Mapa de pRSV.Ad35-E1
Figura 16: Mapa de PGKneopA
Figura 17: Mapa de pRSVpNeo
Figura 18: Mapa de pRSVhbvNeo
Figura 19: Análisis de citometría de flujo sobre la expresión de proteína fluorescente Verde (GFP) en células TF-1 humanas. Las células TF-1 no transducidas fueron utilizadas para ajustar un nivel de fondo del 1%. Se muestra la expresión de GFP en células transducidas con Ad5, Ad5.Fib16. Ad5.Fib17, Ad5.Fib40-L, Ad5.Fib35, y Ad5.Fib51.
Figura 20: Transducción de estroma de tipo fibroblástico humano primario. Las células fueron analizadas 48 horas después de una exposición de dos horas a los diferentes virus con fibra quiméricos. Se muestra el porcentaje de células que se ha encontrado que son positivas para el transgen: proteína fluorescente verde (GFP) utilizando un citómetro de flujo. Las células estromáticas no transducidas fueron utilizadas para ajustar el fondo al 1%. Se muestran los resultados de diferentes experimentos (n=3) \pm la desviación estándar.
Figura 21: Transducción de estroma de tipo fibroblástico humano primario, células CD34^{+} y células CD34^{+}Lin^{-}. Las células fueron analizadas 5 días después de una exposición de dos horas a los diferentes virus con fibra quiméricos. Se muestra el porcentaje de células que se ha encontrado que son positivas para el transgen: proteína fluorescente verde (GFP) utilizando un citómetro de flujo. Las células no transducidas fueron utilizadas para ajustar un fondo al 1%. Asimismo se muestra el número de eventos GFP positivos dividido por el número total de eventos analizados (entre paréntesis).
Figura 22 A): Análisis citométrico de flujo de células GFP positivas tras la transducción de células CD34^{+} con Ad5.Fib51. Todas las células distribuidas en R2-R7 son positivas para CD34 pero difieren en la expresión de los marcadores de diferenciación tempranos CD33, CD38, y CD71 (Lin). Las células en R2 son negativas para CD33, CD38, CD71 mientras las células en R7 son positivas para estos marcadores. Para demostrar la especificidad de Ad5.Fib51 se determinó el porcentaje de células GFP positivas en R2-R7 que se demostró que disminuía a partir del 91% (R2) al 15% (R7). B) Idéntico experimento como se muestra en A (eje de las R2 a R7) pero para los otros virus quiméricos de fibra Ad que muestran que Ad5.Fib35, y Ad5.Fib16 se comportan de un modo similar a Ad5.Fib51.
Figura 23: Alineamiento de las proteínas de la fibra quiméricas de Ad5fib16, Ad5fib35 y Ad5fib51 con la secuencia de fibra de Ad5.
Figura 24: Toxicidad de exposición de Adenovirus a células de médula ósea humana primitiva y células del Tallo. Los cultivos celulares fueron sometidos a recuento inmediatamente antes y 5 días después de la transducción con adenovirus. Se muestra el porcentaje de células de médula ósea humana primitivas (CD34^{+}) y CTH (CD34^{+}Lin^{-}) recuperadas el día 0.
Figura 25: Transducción de CD inmaduras a una dosis de virus de 100 o 1.000 partículas de virus por célula. El virus sometido a ensayo es Ad5 y vectores basados en Ad5 que portan la fibra de serotipo 12 (Ad5.Fib12), 16 (Ad5.Fib16), 28 (Ad5.Fib28), 32 (Ad5.Fib32), la fibra larga de 40 (AD5.Fib40-L), 49 (Ad5.Fib49), 51 (Ad5.Fib51).
La expresión del transgen de la luciferasa es expresada como unidades de luz relativa por microgramo de
proteína.
Figura 26: Análisis citométrico de flujo de la expresión de LacZ sobre CD inmaduras y maduras transducidas con 10.000 partículas de virus por célula de Ad5 o los vectores con fibra quiméricos Ad5.Fib16, Ad5.Fib40-L, o Ad5.Fib51. Los porcentajes de las células que puntuaban como positivas se muestran en la esquina superior izquierda de cada histograma.
Figura 27: Expresión del transgen de la luciferasa en CD inmaduras humanas medida 48 horas después de la transducción con 1.000 o 5.000 partículas de virus por célula. Los virus sometidos a ensayo eran virus con fibra quiméricos que portaban la fibra de los miembros del subgrupo B (serotipos 11, 16, 35, y 51).
Figura 28: Expresión de la proteína fluorescente verde (GFP) en CD humanas inmaduras 48 horas después de la transducción con 1.000 partículas de virus por célula de Ad5, Ad5.Fib16, y Ad5.Fib35. Las células no transducidas fueron utilizadas para ajustar un nivel de fondo de aproximadamente el 1% (-).
Figura 29: Transducción de CD de ratón y chimpancé. La expresión del transgen de la luciferasa medida en CD de ratón 48 horas después de la transducción se expresa como unidades de luz relativa por microgramo de proteína. Las CD de chimpancé fueron medidas 48 horas después de la transducción utilizando un citómetro de flujo. La expresión de GFP demuestra la escasa transducción de Ad (35) en contraste con Ad5.Fib35 (66%).
Figura 30: Crecimiento dependiente de la temperatura de PER.C6. Se cultivaron células PER.C6 en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con Suero Bovino Fetal (FBS, Gibco BRL) al 10% y MgCl_{2} 10 mM en una atmósfera de CO_{2} al 10% a 32ºC, 37ºC o 39ºC. El día 0, se sembraron un total de 1 x 10^{6} células PER.C6 por matraz para el cultivo de tejidos de 25 cm^{2} (Nunc) y las células fueron cultivadas a 32ºC, 37ºC o 39ºC. El día 1-8, se contaron las células. La tasa de crecimiento y la densidad celular final del cultivo de PER.C6 a 39ºC era comparable al de 37ºC. La tasa de crecimiento y la densidad final del cultivo de PER.C6 a 32ºC estaba ligeramente reducido en comparación con el de 37ºC o el de 39ºC.
Las células PER.C6 fueron sembradas a una densidad de 1 x 10^{6} células por matraz para el cultivo de tejidos de 25 cm^{2} y cultivadas a 32, 37, o 39ºC. En los momentos puntuales indicados, las células fueron sometidas a recuento en un contador celular Burker. PER.C6 crece bien tanto a 32, como a 37 y 39ºC.
Figura 31
Niveles de DBP en células PER.C6 transfectadas con pcDNA3, pcDNA3wtE2A o pcDNA3ts125E2A
Se fraccionaron cantidades iguales de extracto de células completas mediante SDS-PAGE sobre geles al 10%. Las proteínas fueron transferidas a membranas Immobilon-P y la proteína DBP fue visualizada utilizando el anticuerpo monoclonal \alphaDBP B6 en un sistema de detección ECL. Todas las líneas celulares derivadas de la transfección con pcDNA3ts125E2A expresan la proteína DBP codificada por E2A de 72 kDa (panel izquierdo, calles 4-14; panel central, calles 1-13; panel derecho, calles 1-12). En contraste, la única línea celular derivada de la transfección con pcDNAwtE2A no expresaba la proteína DBP (panel izquierdo, calle 2). No se detectaba DBP en el extracto de una línea celular derivada de la transfección con pcDNA3 (panel izquierdo, calle 1), que sirve como control negativo. El extracto de células PER.C6 transfectadas transitoriamente con pcDNA3ts125 (panel izquierdo, calle 3) servía como control positivo para el procedimiento de transferencia Western. Estos datos confirman que la expresión constitutiva de wtE2A es tóxica para las células y que utilizando el mutante ts125 de E2A se puede evitar esta
toxicidad.
Figura 32: Crecimiento en suspensión de PER.C6ts125E2A C5-9. La línea que expresa tsE2A PER.C6tsE2A.c5-9 fue cultivada en suspensión en Ex-cell® sin suero. En los momentos puntuales indicados, las células fueron contadas en un contador celular Burker. Se indican los resultados de 8 cultivos independientes. PER.C6tsE2A crece bien en suspensión en medio Ex-cell® sin suero.
Figura 33 Curva de crecimiento PER.C6 y PER.C6tsE2A
Se cultivaron células PER.C6 o PER.C6ts125E2A (c8-4) a 37ºC o 39ºC, respectivamente. El día 0, se sembraron un total de 1 x 10^{6} células por matraz para el cultivo de tejidos de 25 cm^{2}. En los momentos puntuales indicados, se contaron las células. El crecimiento de las células PER.C6 a 37ºC es comparable con el crecimiento de PER.C6ts125E2A c8-4 a 39ºC. Esto muestra que la sobreexpresión constitutiva de ts125E2A no tiene un efecto adverso sobre el crecimiento de las células a la temperatura no permisiva de 39ºC.
Figura 34
Estabilidad de PER.C6ts125E2A.
Durante varios pases, se cultivó la línea celular PER.C6ts125E2A clon 8-4 a 39ºC en medio sin G418. Se fraccionaron cantidades iguales de extracto de células completas mediante SDS-PAGE sobre geles al 10%. Las proteínas fueron transferidas a membranas Immobilon-P y se visualizó la proteína DBP utilizando el anticuerpo monoclonal \alphaDBP B6 en un sistema de detección ECL. La expresión de la proteína DBP codificada por ts125E2A es estable durante al menos 16 pases, lo que equivale a aproximadamente 40 duplicaciones celulares. No se observaban descensos en los niveles de DBP durante este período de cultivo, indicando que la expresión de ts125E2A es estable, incluso en ausencia de la presión de selección con G418.
Figura 35
Actividad tTA en células PER.C6/tTA (A) y PER.C6/E2A/tTA (B) resistentes a higromicina
Se hicieron crecer 16 colonias de células PER.C6/tTA resistentes a higromicina independientes y 23 colonias de células PER.C6/E2A/tTA resistentes a higromicina independientes en pocillos de 10 cm^{3} hasta la subconfluencia y se transfectaron con 2 \mug de pUHC 13-3 (un plásmido que contiene el gen informador de la luciferasa bajo el control del promotor 7xtetO). La mitad de los cultivos se mantuvo en medio que contenía doxiciclina para inhibir la actividad de tTA. Las células fueron cosechadas a las 48 horas de la transfección y se midió la actividad luciferasa. La actividad luciferasa se indica en unidades de luz relativa (RLU) por \mug de proteína.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA I
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TABLA I (continuación)
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Leyenda de la tabla I
Todos los adenovirus humanos utilizados en los experimentos de neutralización fueron producidos en células PER.C6 (número de consigna de la ECACC 96022940) (Fallaux y col., 1998) y purificados en CsCl como se describe en el ejemplo 1. Se muestra la concentración de NaCl a la cual eluían los diferentes serotipos de la columna de HPLC. Las partículas de virus/ml (PV/ml) fueron calculadas a partir de un patrón de Ad5. El título del experimento (DICC50) fue determinado en células PER.C6 (número de consigna ECACC 96022940) como se describe en el ejemplo 1 mediante titulaciones realizadas paralelamente al experimento de neutralización. La DICC50 se muestra para los 44 virus utilizados en este estudio y refleja la dilución del virus necesaria para obtener un ECP en el 50% de los pocillos al cabo de 5 días. La razón de PV/DICC50 se representa como log_{10} y es una medida de la infectividad de los diferentes lotes sobre las células PER.C6 (número de consigna en la ECACC 96022940).
TABLA II Los virus AdApt35.LacZ escapan de la neutralización por el suero humano
4 
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TABLA III Porcentaje de muestras de fluido sinovial que contiene actividad neutralizadora (AN) para adenovirus wt de diferentes serotipos
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TABLA IV Número de focos obtenidos con los diferentes constructos de expresión de E1 en experimentos de transformación en BRK
# Medio de focos/placa:
6
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Claims (17)

1. Un vehículo de liberación génica que comprende un gen de interés, una fibra de adenovirus de serotipo 35 y un pentón o hexón del adenovirus de serotipo 35.
2. Un adenovirus que comprende un gen de interés, para su uso en terapia, profilaxis y/o diagnosis, donde dicho adenovirus se selecciona del grupo formado por: adenovirus de serotipo 11, 26, 34, 35, 48 y 49.
3. Un vehículo de liberación génica según la reivindicación 1, que comprende un pentón y un hexón del adenovirus de serotipo 35.
4. Un vehículo de liberación génica según la reivindicación 1 o 3, donde dicho vehículo de liberación génica es una quimera de adenovirus de serotipo 35 con al menos otro serotipo de adenovirus.
5. Un ácido nucleico que comprende un gen de interés y que codifica una fibra del adenovirus de serotipo 35 y un pentón y/o hexón de adenovirus de serotipo 35.
6. Un ácido nucleico que comprende un gen de interés y que codifica un adenovirus de serotipo 11, 26, 34, 35, 48 o 49.
7. Un ácido nucleico que comprende un gen de interés y que codifica una quimera de adenovirus de serotipo 35 con al menos otro serotipo de adenovirus.
8. Un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, que comprende adicionalmente al menos una ITR.
9. Al menos un grupo de dos ácidos nucleicos que comprende un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, con lo que dicho grupo de ácidos nucleicos es susceptible de un único evento de recombinación homóloga entre sí, que conduce a un ácido nucleico que codifica un vehículo de liberación génica funcional.
10. Una célula que comprende un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, o un grupo de ácidos nucleicos según la reivindicación 9.
11. Una célula según la reivindicación 10, que complementa los elementos necesarios para la replicación adenoviral que están ausentes del ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, o que están ausentes del grupo de ácidos nucleicos según la reivindicación 9.
12. Una célula según la reivindicación 10 u 11, que se origina a partir de una célula PER.C6 (número de consigna de la ECACC 96022940).
13. Un método para producir un vehículo de liberación génica según la reivindicación 1, 3 o 4, que comprende expresar un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8 en una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, y cosechar el vehículo de liberación génica resultante.
14. Un método para producir un vehículo de liberación génica según la reivindicación 1, 3 o 4, que comprende cultivar una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 10-12 en un medio adecuado y cosechar el vehículo de liberación génica resultante.
15. Un vehículo de liberación génica según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 4 para su uso como fármaco.
16. Una formulación farmacéutica que comprende un vehículo de liberación génica según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 4 y un excipiente adecuado.
17. Una formulación farmacéutica que comprende un adenovirus según la reivindicación 2 y un excipiente adecuado.
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