EP1068188A1 - Nouveaux agents de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant et leurs applications - Google Patents

Nouveaux agents de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant et leurs applications

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EP1068188A1
EP1068188A1 EP99910463A EP99910463A EP1068188A1 EP 1068188 A1 EP1068188 A1 EP 1068188A1 EP 99910463 A EP99910463 A EP 99910463A EP 99910463 A EP99910463 A EP 99910463A EP 1068188 A1 EP1068188 A1 EP 1068188A1
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EP
European Patent Office
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group
compound
general formula
nucleic acid
product
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Withdrawn
Application number
EP99910463A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Gerardo Byk
Marc Frederic
Hans Hofland
Daniel Schermann
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Aventis Pharma SA
Original Assignee
Aventis Pharma SA
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1068188A1 publication Critical patent/EP1068188A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07D233/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D233/44—Nitrogen atoms not forming part of a nitro radical
    • C07D233/48—Nitrogen atoms not forming part of a nitro radical with acyclic hydrocarbon or substituted acyclic hydrocarbon radicals, attached to said nitrogen atoms
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to novel compounds useful as nucleic acid transfer agents in cells. These new compounds are more particularly related to the lipopolyamine family, and comprise at least one cyclic amidine function. They are useful for transfection of nucleic acids into different cell types, both in vitro and ex vivo or in vivo.
  • nucleic acids into cells may be the transfer of nucleic acids into cells in vitro, for example for the production of recombinant proteins, or in the laboratory, for the study of the regulation of gene expression, the cloning of genes, or any other manipulation involving DNA. It can also involve the transfer of nucleic acids into cells in vivo, for example for the creation of transgenic animals, the production of vaccines, labeling studies or also therapeutic approaches. It may also involve the transfer of nucleic acids into cells ex vivo, in approaches to bone marrow transplants, immunotherapy or other methods involving the transfer of genes into cells taken from an organism, in particular view of their subsequent re-administration.
  • cationic lipids have interesting properties. These vectors consist of a polar, cationic part, interacting with nucleic acids, and a lipid, hydrophobic part, promoting cell penetration. Particular examples of cationic lipids are in particular monocationic lipids (DOTMA: Lipofectin®), certain cationic detergents (DDAB), lipopolyamines and in particular dioctadecylamidoglycyl spermine (DOGS) or 5-carboxyspermylamide of palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES) preparation has been described for example in patent application EP 394 1 1 1. Another family of lipopolyamines is represented by the compounds as described in patent application WO 97/18185 incorporated herein by reference, and are illustrated in FIG. 1.
  • DOTMA monocationic lipids
  • DDAB certain cationic detergents
  • DOGS dioctadecylamidoglycyl spermine
  • DPES 5-carboxyspermy
  • the compounds according to the invention have the unexpected advantage of having a level of transfection in vivo in the muscle at least equivalent to that obtained with unformulated DNA and in any event a very good level of transfection in other tissues.
  • the association with a compound according to the invention protects the DNA from degradation by nucleases and / or from deterioration during lyophilization, which contributes to significantly improving the stability of the nucleolipid formulations.
  • such an association allows a slow controlled release of nucleic acids.
  • the compounds according to the present invention belong to the family of cationic lipids and carry an original cationic region which gives said compounds improved properties, in particular a reduced cytotoxicity compared to the cationic vectors of the prior art.
  • This cationic part is in fact more precisely represented by one or more particular polyamine (s), carrying one or more cyclic amidine functions which very probably have the effect of "delocalizing" the positive charges, making the compound overall less cationic, with the effects resulting benefits in terms of toxicity.
  • a first subject of the invention relates to new compounds in D, L or DL form, of general formula (I):
  • CD CA represents a cycloamidine group and its mesomeric forms of general formula (II):
  • n are integers independent of each other between 0 and 3 inclusive and such that m + n is greater than or equal to 1,
  • Y represents a carbonyl, amino, methylamino or else methylene group, Y possibly having different meanings within the different groups [( CH 2 ) P -Y], and (*) represents either a hydrogen atom or is the site of bond to the Rep group, it being understood that Ri can be linked to any atom of the general formula (II) , including Z, and that there is a single group Ri in formula (II),
  • X represents a group NR 2 or CHR 2 , R 2 being either a hydrogen atom or the bond to the group Ri as defined above,
  • r is an integer between 0 and 10 inclusive, r can have different meanings within the different groupings -NR4- (CH) r -,
  • R 3 which can have different meanings within the different groups NR 4 - (CH) r R 3 , represents a hydrogen atom, a methyl group, or a group of general formula (VII): - ⁇ iCH ⁇ r- N ⁇ H (VU)
  • R4 is defined in the same way as R 3 or else represents a CA group as defined above, it being understood that the CA groups are independent of each other and may be different, and
  • R is linked to the carbonyl function of the group Rep of general formula (VI), or else if Rep is absent R is linked directly to the group CA, and represents:
  • R ⁇ and R independently of one another represent a hydrogen atom or an aliphatic radical saturated or not, linear or branched, optionally fluorinated, containing 1 to 22 carbon atoms , with at least one of the two substituents R ⁇ or R 7 different from hydrogen and the other containing between 10 and 22 carbon atoms,
  • R 9 is a saturated or unsaturated aliphatic radical, optionally fluorinated, containing 8 to 22 carbon atoms, or a steroid derivative, and the two substituents R ⁇ are, independently one of the other, defined as above, or else Rs represents a group -OR 9 for which R 9 is defined as above.
  • the group Ri is linked either to Z or to V on the one hand and to the group Rep on the other hand via Y.
  • the cycloamidine group CA of formula (II) has 5, 6, 7 or 8 members.
  • Rep is a distributor with 1, 2, or 3 "arms".
  • distributors 1, 2, or 3 "arms”.
  • R 3 represents a hydrogen atom or a methyl and R4 is as defined above, or else R 3 and R 4 present in formula (VI) represent hydrogen atoms, or well R 4 is a hydrogen atom and R 3 is a group of formula (VII) in which R 5 represents a group CA
  • p and q are chosen independently of one another from 2, 3 or 4.
  • the group R contains at least one hydrophobic segment.
  • hydrophobic segment is intended to mean any group of lipid type, promoting cell penetration.
  • the group R contains at least one aliphatic chain or at least one steroid derivative.
  • the group R represents a group of formula NRôR-7, R O and R 7 being defined as above, or represents a group of general formula (VIII) wherein Q represents a group C (O) NReR 7 , R ⁇ and R 7 being defined as above.
  • Re and / or R 7 independently of one another represent a linear saturated or unsaturated aliphatic chain containing 10 to 22 carbon atoms, preferably in 12, 14, 16, 17, 18, or 19 carbon atoms .
  • These are, for example, groups (CH 2 ) ⁇ CH 3 , (CH 2 ), 3 CH 3 , (CH 2 ) ⁇ 5 CH 3 , (CH 2 ) ⁇ 7 CH 3 , oleyl, etc.
  • the groups R ⁇ and R are identical or different and each represents an aliphatic chain, saturated or not, 8
  • R represents a steroid derivative
  • this is advantageously chosen from cholesterol, cholestanol, 3- ⁇ -5-cyclo-5- ⁇ -cholestan-6- ⁇ -ol, cholic acid, cholesteryl formiate, chotestanylformiate, 3 ⁇ , 5-cyclo-5 ⁇ -cholestan- 6 ⁇ -yl formiate, cholesterylamine, 6- (1,5-dimethylhexyl) -3a, 5a-dimethyl-hexadecahydrocyclopenta [a] cyclopropa [2,3] cyclopenta [1, 2-f] naphtha-len-10-ylamine, or cholestanylamine.
  • These new compounds of general formula (I) can be in the form of non-toxic and pharmaceutically acceptable salts.
  • These non-toxic salts include the salts with mineral acids (hydrochloric, sulfuric, hydrobromic, phosphoric, nitric) or with organic acids (acetic, propionic, succinic, maleic, hydroxymaleic, benzoic, fumaric, methanesulfonic or oxalic acids) or with mineral bases (soda, potash, lithine, lime) or even with organic bases (tertiary amines such as triethylamine, piperidine, benzylamine).
  • the compounds of the invention can be prepared in various ways. According to a first method, the compounds of the invention can be obtained by synthesis of analogous lipopolyamines (that is to say the same structure but without cycloamidine group), the cyclization into cycloamidine groups being carried out in a second step. Analogous lipopolyamines can be obtained by any method known to those skilled in the art, and in particular according to the methods described in application WO 97/18185 or by analogous methods. The cyclization of the amidine heads can for example be carried out by reaction between one and / or more primary amines of the lipopolyamine and reagents such as O-methylisourea sulfate hydrogen sulfate [J. Med.
  • the operation is carried out in an aqueous medium in the presence of a hot base [J. Med. Chem., 1985, pp. 694-698 and J. Med. Chem., 1996, pp. 669-672].
  • a hot base mention may be made of water / alcohol mixtures or dimethylformamide.
  • a base triethylamine, N-ethyldiisopropylamine, sodium hydroxide, potassium hydroxide, etc. may be used.
  • the temperature is preferably between 40 ° C. and 60 ° C., and even more preferably, the reaction is carried out. at 50 ° C.
  • Another method consists in carrying out a synthesis of bricks carrying the cycloamidine function which are then grafted on lipids equipped with distributors. This method has the advantage of accessing a large number of products.
  • the term "bricks" means any functional segment of the molecule.
  • the cycloamidine group CA as defined in the general formula (II), Rep or even R constitute bricks which are distinct from one another within the meaning of the invention. 1 1
  • R represents -NP sR- ?
  • R represents -NP sR- ?
  • R represents -NP sR- ?
  • it is commercially available or it can be synthesized according to one of the following methods: • by alkylative reduction between an amine carrying the group R ⁇ s and an aldehyde carrying the group R. It is preferably carried out in a chlorinated solvent (for example dichloromethane, chloroform, dichloro-1,2-ethane, etc. [J. Org. Chem., 1996, pp.
  • a leaving group there may be mentioned the halogen atoms (Br, Cl, I) or the substituents tosyl, mesyl, etc.
  • the operation is preferably carried out in the presence of a basic reagent, for example carbonate sodium, potassium, sodium hydroxide triethylamine etc., in an alcohol (eg ethanol) at reflux [J. Am. Chem. Soc, 1996, pp. 8524-8530]
  • reaction can be carried out in the presence of a non-nucleophilic base in suitable aprotic solvents (such as chloroform, dimethylformamide, methylpyrrolidone, acetonitrile, 12
  • Q is either commercially available, or when Q represents a group C (O) R8 with R8 of formula (IX), it can be synthesized by reaction between a commercial chloroformate (for example cholesteryl chloroformate) or obtained according to the conventional methods known to those skilled in the art from a commercial chloroformate, and a commercial diamine (for example N-ethylenediamine) or obtained according to conventional methods known to those skilled in the art.
  • a commercial chloroformate for example cholesteryl chloroformate
  • a commercial diamine for example N-ethylenediamine
  • the procedure is carried out in a chlorinated solvent (for example dichloromethane, chloroform, dichloro-1,2-ethane etc.) or in any other organic solvent compatible with the reaction such as for example dimethylformamide, dimethylsulfoxide, acetonitrile etc.
  • a chlorinated solvent for example dichloromethane, chloroform, dichloro-1,2-ethane etc.
  • any other organic solvent compatible with the reaction such as for example dimethylformamide, dimethylsulfoxide, acetonitrile etc.
  • the group H- [NH- (CH2) x] y-COOH is a commercial amino acid when y is equal to 1, or is obtained by one or more cyanoethylation reactions according to the methods described below in the synthesis of Rep when y is greater than 1.
  • the Rep group is obtained by cyanoethylation or by dicyanoethylation (depending on whether one wishes to obtain a linear or branched Rep structure) of an amino acid of formula HOOC- (CH 2 ) r -NH 2 then by reduction of the nitrile functions to amines, a) mono- or di-cyanoethylation:
  • the operation is carried out in a basic aqueous medium.
  • the reaction is carried out in solvents such as water, alcohols (for example methanol, ethanol etc.) in the presence of a base such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethylamine etc.
  • solvents such as water, alcohols (for example methanol, ethanol etc.)
  • a base such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethylamine etc.
  • monocyanoethylation work is preferably carried out cold [J. Am. Chem. Soc, 1950, pp. 2599-2603].
  • dicyanoethylation it is preferably carried out hot and with an excess of acrylonitrile [J. Am. Chem. Soc, 1951, pp.
  • b) The reduction of the nitrile functions to amines is carried out by catalytic hydrogenation in basic medium or by any other method known to those skilled in the art.
  • catalytic hydrogenation in basic medium or by any other method known to those skilled in the art.
  • platinum oxide or Raney nickel as a catalyst.
  • the solvent chosen is an alcohol (for example methanol, ethanol etc.) in the presence of a base, for example soda, potash etc.
  • the Rep-R brick is obtained by peptide coupling between the Rep acid and the R amine obtained in the preceding steps.
  • Peptide coupling is carried out according to conventional methods known to those skilled in the art (Bodanski M., Principles and Practices of peptide Synthesis, Ed. Springe-Verlag) or by any known analogous method.
  • the reaction can be carried out in the presence of a non-nucleophilic base in suitable aprotic solvents (such as chloroform, dimethylformamide, methylpyrrolidone, acetonitrile, dichloromethane etc.), at a temperature between 0 and 100 ° C, the pH being adjusted between 9 and 11.
  • suitable aprotic solvents such as chloroform, dimethylformamide, methylpyrrolidone, acetonitrile, dichloromethane etc.
  • CA-Rep-R The compounds according to the invention are obtained according to several possible methods: a) by coupling in basic medium between the terminal amine present on Rep-R obtained in step above, and CA-S-CH 3 , according to the conventional methods known to those skilled in the art. It is preferably carried out in a chlorinated solvent (for example dichloromethane, chloroform etc.) or in other organic solvents compatible with the reaction such as for example water, alcohols, 14
  • dimethylformamide etc. in the presence of a base (for example triethylamine, soda, potash, N-ethyldiisopropylamine etc.). and at room temperature (around 20 ° C).
  • a base for example triethylamine, soda, potash, N-ethyldiisopropylamine etc.
  • the CA-S-CH 3 brick is either commercially available (this is the case for example of 2-methylthio-2-imidazoline hydroiodide), or it can be obtained by the action of a carbon disulfide on a diamine appropriate (that is to say chosen as a function of the cycloamidine group which it is desired to obtain), followed by methylation.
  • a carbon disulfide on a diamine appropriate that is to say chosen as a function of the cycloamidine group which it is desired to obtain
  • the reaction process is carried out in an alcohol (for example ethanol).
  • the methylation step is carried out by the action of a halogenomethyl, the halogen atom possibly being, for example, an iodine atom [J. Am. Cem. Soc, 1956, pp. 1618-1620 and Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, pp. 351-354].
  • CA-COOH brick can be obtained in different ways:
  • CA-S-CH 3 brick is obtained in the same way as above, and the amino or polyamine acid is chosen according to the compound according to the desired invention, or else
  • the operation is carried out in an ethanolic medium in the presence of a base (for example sodium hydroxide) and at the reflux temperature of the mixture.
  • a base for example sodium hydroxide
  • the amino substituents present in the different groups can interfere with the reactions used, it is preferable to protect them beforehand with compatible radicals which can be put in place and eliminated without touching the rest of the molecule .
  • the protective radicals can be chosen from the radicals described by T.W. GREENE, Protective Groups in Organic Synthesis, J. Wiley-Interscience Publication (1991) or by McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press (1973).
  • Another subject of the invention relates to a composition comprising at least one compound of formula (I) as defined above.
  • another object according to the present invention comprises a compound of formula (I) as defined above and a nucleic acid.
  • a compound according to the invention and a nucleic acid are brought into contact, they form a complex by interaction between the positive charges present at physiological pH on the compound according to the invention and the negative charges of the nucleic acid.
  • This complex is called “nucleolipid complex” throughout.
  • the compound according to the invention and the nucleic acid are present in amounts such that the ratio of the positive charges of the compound to the negative charges of the nucleic acid is between 0.1 and 50, preferably between 0.1 and 20. This ratio can be easily adjusted by a person skilled in the art depending on the compound used, the nucleic acid, and the applications sought.
  • nucleic acid is understood to mean both a deoxyribonucleic acid and a ribonucleic acid. They can be natural or artificial sequences, and in particular genomic DNA (gDNA), complementary DNA (cDNA), messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), ribosomal RNA (RRNA), hybrid sequences or synthetic or semi-synthetic sequences, of modified or unmodified oligonucleotides. These nucleic acids can be of human, animal, plant, bacterial, viral, etc. origin. They can be obtained by any technique known to those skilled in the art, and in particular by screening of banks, by chemical synthesis, or also by mixed methods including modification 17
  • deoxyribonucleic acids can be single or double stranded as well as short oligonuleotides or longer sequences.
  • the nucleic acids advantageously consist of plasmids, vectors, episomes, expression cassettes, etc.
  • deoxyribonucleic acids can carry an origin of functional or non-functional replication in the target cell, one or more marker genes, transcription or replication regulatory sequences, genes of therapeutic interest, modified or unmodified antisense sequences, regions to other cellular components, etc.
  • the nucleic acid comprises an expression cassette consisting of one or more genes of therapeutic interest under the control of one or more promoters and a transcriptional terminator active in the target cells.
  • the expression “gene expression cassette” means a DNA fragment which can be inserted into a vector at specific restriction sites.
  • the DNA fragment comprises a nucleic acid sequence coding for an RNA or a polypeptide of interest and further comprises the sequences necessary for expression (enhancer (s), promoter (s), polyadenylation sequences etc.) of said sequence.
  • the cassette and restriction sites are designed to ensure insertion of the expression cassette into a reading frame suitable for transcription and translation.
  • plasmid or an episome carrying one or more genes of therapeutic interest.
  • the term “gene of therapeutic interest” in particular means any gene coding for a protein product having a therapeutic effect.
  • protein thus encoded can be in particular a protein or a peptide.
  • This protein product can be exogenous homologous or endogenous with respect to the target cell, that is to say a product which is normally expressed in the target cell when the latter presents no pathology.
  • the expression of a protein makes it possible for example to compensate for an insufficient expression in the cell or the expression of an inactive or weakly active protein due to a modification, or else to overexpress said protein.
  • the gene of therapeutic interest can also code for a mutant of a cellular protein, having increased stability, modified activity, etc.
  • the protein product can also be heterologous towards the target cell.
  • an expressed protein can, for example, supplement or bring about a deficient activity in the cell, allowing it to fight against a pathology, or stimulate an immune response.
  • therapeutic products within the meaning of the present invention, there may be mentioned more particularly enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines: interieukins, interferons, TNF, etc. (FR 92/03120), growth factors, neurotransmitters or their precursors or synthetic enzymes, trophic factors (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP / pleiotrophin, etc.
  • BDNF trophic factors
  • CNTF NGF
  • IGF IGF
  • GMF aFGF
  • bFGF thelial growth factor
  • NT3, NT5 HARP / pleiotrophin
  • apolipoproteins (ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc., FR 93/05125), dystrophin or a minidystrophin (FR 91/1 1947), the CFTR protein associated with cystic fibrosis, tumor suppressor genes (p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc., FR 93/04745), genes coding for factors involved in coagulation (Factors VII, VIII, IX), genes involved in DNA repair, suicide genes (thymidine kinase, cytosine deaminase), genes of hemoglobin or other protein transporters, enzymes of metabolism, catabolism etc.
  • the nucleic acid of therapeutic interest can also be an antisense gene or sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of cellular mRNAs.
  • Such sequences can, for example, be transcribed in the target cell into RNAs complementary to cellular mRNAs and thus block their translation into protein, according to the technique. 19
  • the therapeutic genes also include the sequences coding for ribozymes, which are capable of selectively destroying target RNAs (EP 321 201).
  • the nucleic acid can also contain one or more genes coding for an antigenic peptide, capable of generating in humans or animals an immune response.
  • the invention allows the production of either vaccines or immunotherapeutic treatments applied to humans or animals, in particular against microorganisms, viruses or cancers. These may in particular be antigenic peptides specific for the Epstein Barr virus, the HIV virus, the hepatitis B virus (EP 185 573), the pseudo-rabies virus, the "syncitia forming virus", d other viruses or tumor-specific antigenic peptides (EP 259,212).
  • the nucleic acid also comprises sequences allowing the expression of the gene of therapeutic interest and / or of the gene coding for the antigenic peptide in the desired cell or organ.
  • sequences which are naturally responsible for the expression of the gene considered when these sequences are capable of functioning in the infected cell. It can also be sequences of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic).
  • they may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of a virus.
  • promoters of the El A, MLP, CMV, RSV, etc. genes can be modified by adding activation, regulation sequences, etc. It can also be a promoter, inducible or repressible.
  • the nucleic acid can also comprise, in particular upstream of the gene of therapeutic interest, a signal sequence directing the therapeutic product synthesized in the secretory pathways of the target cell.
  • This signal sequence may be the natural signal sequence of the therapeutic product, but it may 20
  • the nucleic acid may also include a signal sequence directing the synthesized therapeutic product to a particular compartment of the cell.
  • compositions according to the invention may also comprise one or more adjuvants capable of associating with the complexes formed between the compound according to the invention and the nucleic acid, and of improving their transfecting power.
  • the present invention therefore relates to compositions comprising a nucleic acid, a compound of formula (I) as defined above and one or more adjuvants capable of associating with the nucleolipid complexes compound (I ) / nucleic acid and improve its transfecting power.
  • This type of adjuvants lipids, peptides or proteins for example
  • compositions of the invention can comprise, as an adjuvant, one or more neutral lipids.
  • Such compositions are particularly advantageous, especially when the charge ratio R is low.
  • the Applicant has indeed shown that the addition of a neutral lipid makes it possible to improve the formation of nucleolipid particles and to promote the penetration of the particle into the cell by destabilizing its membrane.
  • the neutral lipids used in the context of the present invention are lipids with two fatty chains.
  • natural or synthetic lipids are used, zwitterionic or devoid of ionic charge under physiological conditions. They can be chosen more particularly from dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), oleoylpalmitoylphosphatidylethanolamine (POPE), di-stearoyl, -palmitoyl, - mirystoyl phosphatidylethanolamines as well as their N-methyl derivatives 1 to 3 times, phospol glycols, glycol glycols glycosyldiacylglycerols, cerebrosides (such as in particular galactocerebrosides), sphingolipids (such as in particular sphingomyelins) or alternatively asialogangliosides (such as in particular asialoGMl and GM2). 21
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • lipids can be obtained either by synthesis or by extraction from organs (example: the brain) or eggs, by conventional techniques well known to those skilled in the art.
  • extraction of natural lipids can be carried out using organic solvents (see also Lehninger, Biochemistry).
  • a product which may or may not intervene directly in the condensation of the nucleic acid (WO 96/25508).
  • product involved in the condensation of nucleic acid is meant to define a compacting product, directly or indirectly, nucleic acid. More precisely, this product can either act directly at the level of the nucleic acid to be transfected or intervene at the level of an additional product which is directly involved in the condensation of this nucleic acid.
  • the precompacting product can be any polycation, for example polylysine.
  • this product involved in the condensation of the nucleic acid is derived in whole or in part from a protamine, a histone, or a nucleoline and / or one of their derivatives.
  • Such a product can also consist, in whole or in part, of peptide units (KTPKKAKKP) and / or (ATPAKKAA), the number of units can vary between 2 and 10.
  • these units can be repeated continuously or not. Thus they can be separated by links of a biochemical nature, for example by one or more amino acids, or of a chemical nature.
  • compositions of the invention comprise from 0.01 to 20 equivalents of adjuvant (s) for an equivalent of nucleic acids in mol / mol and, more preferably, from 0.5 to 5. 22
  • compositions of the present invention further comprise a targeting element making it possible to direct the transfer of the nucleic acid.
  • This targeting element can be an extracellular targeting element making it possible to direct the transfer of DNA to certain, cell types or certain desired tissues (tumor cells, hepatic cells, hematopoietic cells, etc.). It can also be an intracellular targeting element making it possible to direct the transfer of the nucleic acid towards certain privileged cellular compartments (mitochondria, nucleus etc.).
  • the targeting element can be linked to the compound according to the invention or also to the nucleic acid as has been specified previously.
  • sugars peptides, proteins, oligonucleotides, lipids, neuromediators, hormones, vitamins or their derivatives.
  • these are sugars of peptides or proteins such as antibodies or fragments of antibodies, ligands of cellular receptors or fragments thereof, receptors or fragments of receptors, etc.
  • they may be ligands for growth factor receptors, cytokine receptors, cell lectin receptors, or ligands with RGD sequence with an affinity for adhesion protein receptors such as integrins. Mention may also be made of the transferrin, HDL and LDL receptors, or the folate transporter.
  • the targeting element can also be a sugar making it possible to target lectins such as receptors for asialoglycoproteins or for syalydes such as sialyde Lewis X, or alternatively an Fab fragment of antibodies, or a single chain antibody (ScFv).
  • lectins such as receptors for asialoglycoproteins or for syalydes such as sialyde Lewis X, or alternatively an Fab fragment of antibodies, or a single chain antibody (ScFv).
  • the association of the targeting elements with the nucleolipid complexes of the invention can be carried out by any technique known to those skilled in the art, for example by coupling to a hydrophobic part or to a part which interacts with the nucleic acid of the compound of general formula (I) according to the invention, or to a group which interacts with the compound of general formula (I) according to the invention or with the nucleic acid.
  • the interactions in question can be, according to a preferred mode, of ionic or covalent nature.
  • compositions of the invention can also incorporate at least one nonionic surfactant in an amount sufficient to stabilize the size of the particles of nucleolipid complexes composed of general formula (I) / nucleic acid.
  • non-ionic surfactants prevents the formation of aggregates, which makes the composition more particularly suitable for administration in vivo.
  • the compositions according to the invention incorporating such surfactants have an advantage in terms of safety. They also have an additional advantage in that they reduce the risk of interference with other proteins given the reduction in the overall charge of the compositions of nucleolipid complexes.
  • the surfactants advantageously consist of at least one hydrophobic segment, and at least one hydrophilic segment.
  • the hydrophobic segment is chosen from aliphatic chains, polyoxyalkylene, alkylidene polyester, polyethylene glycol with a benzyl polyether head and cholesterol
  • the hydrophilic segment is advantageously chosen from polyoxyalkylene, polyvinyl alccols, polyvinylpyrrolidones or saccharides.
  • nonionic surfactants have been described in application WO 98/34648.
  • a subject of the invention is also the use of the compounds of general formula (I) as defined above for manufacturing a medicament intended to treat diseases by transfer of nucleic acids (and more generally of polyanions) in primary cells or in the established lines. It can be in particular fibroblastic, muscular, nervous cells (neurons, astrcytes, glyal cells), hepatic, hematopoietic lineage (lymphocytes, CD34, dendritics etc.), epithelial, etc., in differentiated or pluripotent forms ( precursors).
  • compositions according to the invention can be formulated for topical, cutaneous, oral administration. , rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, intratracheal, intraperitoneal, etc.
  • the compositions of the invention contain a pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for a direct injection into the desired organ, or for topical administration (on the skin and / or mucosa).
  • nucleic acid used for the injection may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • the doses of nucleic acid used for the injection as well as the number of administrations can be adapted according to different parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or even the duration of the treatment sought.
  • the mode of administration it may be either a direct injection into the tissues, for example at the level of tumors, or the circulatory tract, or a treatment of cells in culture followed by their reimplantation in vivo, by injection or graft.
  • the tissues concerned in the context of the present invention are for example the muscles, the skin, the brain, the lungs, the liver, the spleen, the bone marrow, the thymus, the heart, the lymph, the blood, the bones, cartilage, pancreas, kidneys, bladder, stomach, intestines, testes, ovaries, rectum, nervous system, eyes, glands, connective tissue, etc.
  • the transfected tissues are the muscles and the lungs.
  • the invention further relates to a method for transferring nucleic acids into cells, comprising the following steps:
  • nucleic acid bringing the nucleic acid into contact with a compound of general formula (I) as defined above, to form a nucleolipid complex, and 25
  • the contacting of the cells with the nucleolipid complex can be carried out by incubation of the cells with the said complex (for uses in vitro or ex vivo), or by injection of the complex into an organism (for uses in vivo).
  • the incubation is preferably carried out in the presence of, for example, from 0.01 to 1000 ⁇ g of nucleic acid per 10 6 cells.
  • doses of nucleic acid of between 0.01 and 10 mg can for example be used.
  • compositions of the invention additionally contain one or more adjuvants as defined above
  • the adjuvant (s) are previously mixed with the compound of general formula (I) according to the invention or else with the nucleic acid.
  • the present invention thus provides a particularly advantageous method for the treatment of diseases by administration of a nucleic acid coding for a protein or which can be transcribed into a nucleic acid capable of correcting said disease, said nucleic acid being associated with a compound of general formula (I) as defined above, under the conditions defined above. More particularly, this method is applicable to diseases resulting from a deficiency in a protein or nucleic product, the administered nucleic acid coding for said protein product or being transcribed into a nucleic product or even constituting said nucleic product.
  • the invention extends to any use of a compound of formula (I) according to the invention for the in vivo, ex vivo, or in vitro transfection of cells.
  • the present invention also includes other characteristics and advantages which will emerge from the examples and figures which follow, and which should be considered as illustrating the invention without limiting its scope.
  • the Applicant proposes, without limitation, various operating protocols as well as reaction intermediates capable of being used 26
  • Figure 1 Structure of synthetic vectors called lipid A, lipid B, lipid c and lipid D in the present invention and described in patent application WO 97/18185 incorporated herein by reference.
  • Figure 2 Schematic representation of the plasmid pXL2774.
  • FIGS. 3 Phase diagram of the nucleolipid complex compounds (1YADN.
  • the binding of compound (1) to DNA was determined by following the decrease in fluorescence (in%, 100% being the fluorescence of naked DNA) of the ethidium bromide (EtBr) (symbol •, solid line), as described along the y-axis on the right.
  • the size of the complex particles (in nm) is indicated on the y-axis on the left.
  • x represents the transfer agent / DNA charge ratio.
  • the size of the nucleolipid complexes without co-lipid is represented by the symbol * in solid line.
  • the size of the nucleolipid complexes containing 25% of cholesterol is represented by the symbol D in broken line.
  • the size of the nucleolipid complexes containing 40% of DOPE is represented by the broken line symbol. The method does not allow the size of the particles to be determined beyond 3 ⁇ m.
  • Figure 4 In vitro gene transfer activity in HeLa cells of the nucleolipid complexes containing the compound (1) according to the present invention without co-lipid (middle bar in dark gray), with 25% cholesterol (left bar in medium gray), and with 40% molar of DOPE (light gray line bar), compared to naked DNA. Only the nucleolipid complexes in which the DNA is completely saturated with the compound according to the invention and whose size is between 100 nm and 300 nm were used. 27
  • Figure 5 In vitro gene transfer activity of nucleolipid complexes formed from compound (3), in HeLa cells. On the ordinate is the expression of luciferase, expressed in pg per well transfected. The abscissa shows the charge ratio between the compound (3) and the DNA in nmol / ⁇ g. The expression was measured each time for formulations without co-lipid (micelles), with DOPE and with cholesterol.
  • Figure 6 In vitro gene transfer activity of nucleolipid complexes formed from compound (5), in HeLa cells. On the ordinate is the expression of luciferase, expressed in pg per well transfected. The abscissa shows the charge ratio between the compound (5) and the DNA in nmol / ⁇ g. The expression was measured each time for formulations without co-lipid (micelles), with DOPE and with cholesterol.
  • Figure 7 In vitro gene transfer activity of nucleolipid complexes formed from compound (6), in HeLa cells. On the ordinate is the expression of luciferase, expressed in pg per well transfected. The abscissa shows the charge ratio between the compound (6) and the DNA in nmol / ⁇ g. The expression was measured each time for formulations without co-lipid (micelles), with DOPE and with cholesterol.
  • Figure 8 In vivo gene transfer activity after direct injection into the muscle of the complexes containing the compound (1) according to the present invention or the compound of formula H 2 N (CH 2 ) 3 NH (CH 2 ) 4 NH (CH 2 ) 3 NHCH 2 COArgN [(CH 2 ) 17 CH 3 ] 2 (called “lipid A” below) without co-lipid (bar in dark gray), with 25% cholesterol (bar in medium gray), and with 40 mol% of DOPE (light gray bar), compared to naked DNA. Only the complexes in which the DNA is completely saturated in lipid and whose size is between 100 nm and 300 nm were used.
  • Figure 9 The importance of the invention is illustrated by comparing the gene transfer activity of two different lipids, the compound (1) according to the invention and lipid A, and naked DNA via two routes d administration: intravenously (iv) and 28
  • intramuscular Only the complexes in which the DNA is completely saturated in lipid and whose size is between 100 nm and 300 nm were used.
  • Figure 10 In vivo gene transfer activity 48 hours after i.m. injection nucleolipid complexes containing the compounds (5) or (6) according to the present invention without co-lipid and at charge ratio 0.25 / 1, compared to naked DNA. The expression is expressed in pg of luciferase per ml.
  • the bars represent: (a) negative control; (b) naked DNA; (c) Compound (5) and (d) compound (6).
  • the starting amino acids, polyamines (or their derivatives) are commercially available. This is the case for example with N- (3-aminopropyl) glycine, N- (2-cyanoethyl) glycine, or even 2,4-diaminobutyric acid, or can be synthesized by conventional methods known in the art. skilled in the art.
  • Cyclic isothioureas are also commercial products, such as for example 2-methylthio-2-imidazoline hydroiodide, or can be synthesized by conventional methods known to those skilled in the art.
  • Products such as triethylamine, trifluoroacetic acid, benzotriazol-1-yloxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (dimethylamino) phosphonium (BOP), dimethylaminopyridine (DMAP), benzyl chloroformate, di-tert-butyl dicarbonate are commercial products.
  • the sodium chloride and sodium carnbonate solutions are saturated.
  • the potassium sulphate solution is concentrated to 0.5 M. 29
  • TLC thin layer chromatographies
  • the apparatus is an assembly for liquid phase chromatography in gradient mode allowing UV detection.
  • This preparative chain is composed of the following elements: Pump A: GILSON model 305 equipped with a 50 SC head. Pump B: GILSON model 303 fitted with a 50 SC head. Injection loop. : 5 ml. Pressure module: GILSON model 806. 30
  • GILSON model 811 C equipped with a 23 ml head.
  • UV detector GILSON model 119 equipped with a preparatory cell.
  • Fraction collector GILSON model 202 fitted with racks n ° 21 and 10 ml glass tube.
  • Integrator SHIMADZU model C-R6A.
  • the solution of product to be purified is loaded onto the column via the injection loop, the eluate is collected in fractions of a tube in 30 seconds.
  • the detector is set to the wavelengths of 220 nm and 254 nm. the mobile phases are defined as follows:
  • the columns for the analytical separations are Browlee stainless steel columns, 3 cm long and 0.46 cm in diameter, sold by APPLIED BIOSYSTEM. 31
  • the stationary phase consists of 7 micron Butyl Aquapore.
  • the mobile phases are water (with trifluoroacetic acid) and acetonitrile (with trifluoroacetic acid).
  • the injections are 20 ⁇ l of a solution of approximately 1 mg / cm 3 in a loop valve of 0.1 cm 3 .
  • the flow rate for the analyzes is adjusted between 1 cmVmin and 4 cm 3 / min.
  • the pressure is around 180 bars.
  • the separation conditions are summarized below:
  • Solvent A Solvent B Demineralized water 2500 cm 3 Acetonitrile for HPLC 2500 cm 3
  • the Gly group the amines of which are protected by Boc groups (10 mmol) and the ditetradecylamine (10 mmol) are introduced into a 250 ml flask, and 100 cm J of dichloromethane are added. The mixture is stirred until complete dissolution. 30 mmol of N-ethyldiisopropylamine (DIE A) and 11 mmol of phosphonium benzotriazol-1-yloxytrisdimethylamine (BOP) are then added. The pH is maintained at 10 thanks to the DIEA, and the mixture is stirred for 2 hours. When the reaction is complete, (followed by TLC and / or HPLC), the dichloromethane is evaporated and 35
  • the solid obtained above is dissolved in IN sodium hydroxide (200 cm 3 / amine) and dioxane (200 cm 3 ).
  • the solution is stirred in an ice bath, then a solution of (t-butoxycarbonyl) 2 O or p-chlorobenzyloxycarbonyl (0.14 mol / amine) in 200 cm 3 of dioxane is added dropwise.
  • the pH is maintained at a value greater than 9.
  • the mixture is stirred at room temperature (20 ° C) overnight.
  • the dioxane is evaporated in vacuo, then the mixture is acidified to pH 3 using a potassium sulphate solution.
  • the product (f) whose amines are protected is introduced into a flask equipped with a magnetic bar and dissolved in 10 cm J of methanol per gram of product.
  • Palladium on carbon (10%, lg / g of product) and ammonium formate (1 g / g of product) are added at room temperature.
  • the hydrogenolysis is followed by HPLC. After two hours, the reaction is complete, the mixture is filtered, and the filter washed with 3 times 10 cm " of methanol per gram of product.
  • NCH 2 of propyls and NCH 2 of fatty chains 3.68 (s, 8H: 2 NCH 2 CH 2 N); 3.72 (broad s, 2H: NCH 2 CON); 4.06 (s, 2H: CONCH 2 CON of glycyl).
  • the solvent is evaporated under vacuum, then the mixture is acidified to pH 3 with a solution of potassium sulfate. What is insoluble is extracted with ethyl acetate (3 times 200 cm 3 ), then washed with a solution of sodium chloride (2 times 100 cm 3 ). The organic phase is dried over magnesium sulfate, then filtered and evaporated in vacuo. The product obtained is optionally purified on a silica column.
  • the product (e) (50 mmol) is introduced into a 1 liter stainless steel autoclave.
  • a solution of 10 cm 3 of ethanol (95%) and 3.3 g of sodium hydroxide is prepared at the same time. 80 mol)
  • this solution is introduced into the autoclave
  • a stream of nitrogen is passed through the autoclave and 2 cm "of Raney nickel on carbon are introduced
  • the autoclave is closed
  • the initial pressure of hydrogenation is about 52 bar, and it drops to about 48.5 bar overnight at room temperature (20 ° C)
  • the suspension is filtered on paper, the filter is washed with ethanol (4 times 25 cm 3 ) , and the filtrates are concentrated to dryness under vacuum.
  • the product obtained (0.1 mol amine) is dissolved in IN sodium hydroxide (200 cm 3 / amine) and dioxane (200 cm 3 ) The solution is stirred in an ice bath, then a solution is added dropwise p-chlorobenzyloxycarbonyl (0.14 mol amine) in 200 cm 3 of dioxane The pH is maintained at a value greater than 9 Then the mixture is stirred at room temperature (20 ° C) overnight The dioxane is evaporated in vacuo, then the mixture is acidified to pH 3 using a potassium sulphate solution. What is insoluble is extracted with 42
  • the product (g) is introduced into a flask equipped with a magnetic bar and dissolved in 10 cm 'of methanol / g of product.
  • Palladium on carbon (10%, lg / g of product) and ammonium formate (1 g / g of product) are added at room temperature (20 ° C).
  • the hydrogenolysis is followed by HPLC. After two hours, the reaction is complete, the mixture is filtered, and the filter washed with 3 times 10 cm 3 of methanol / g of product.
  • Bi-distilled water is added, and the solution is frozen and lyophilized, or the filtrate is concentrated to dryness and the solid is taken up in ethyl acetate (300 cm 3 ).
  • Example 5 The procedure is the same as previously in Example 5. A white solid is obtained which is used without further purification after a TLC analysis.
  • the product obtained is used in the same way as above in order to protect the terminal amine with a benzyloxycarbonyl group.
  • This example illustrates the preparation of nucleolipid complexes according to the invention.
  • the compound used in this example is compound (1) in solution in chloroform. Amounts of 10 nmol of compound (1) (i.e. 11.8 ⁇ g) per ⁇ g of DNA were used. In some cases, a neutral co-lipid, Cholesterol or DOPE, is previously mixed with the compound. A thin lipid film forms when the chloroform is evaporated using a light stream of argon, then it is rehydrated in a mixture of 5% dextrose and 20 mM sodium chloride, overnight, 4 ° C. The samples are then treated with ultrasound for 5 minutes, heated at 65 ° C for 30 minutes, and finally treated again with ultrasound for 5 minutes. Lipid suspensions are thus obtained which are stored at 4 ° C. until they are used.
  • the DNA used is the plasmid pXL2774 (FIG. 2) in solution in a mixture of 5% dextrose and 20 mM sodium chloride at a concentration of 0.5 mg / ml or 1.0 mg / ml.
  • the plasmid pXL2774 has the following characteristics: - level of endotoxins less than 50 EU / mg,
  • RNA content that is to say of mRNA, tRNA and ribosomal RNA, (determined by HPLC) less than 5%
  • nucleolipid complexes according to the invention are prepared by rapidly mixing equal volumes of DNA solution and lipid suspension such as 48
  • the amount of compound complexed with DNA varies from 0.5 nmol / ⁇ g of DNA to 12 nmol / ⁇ g of DNA.
  • Example 8 behavior of complexes formed with different charee ratio
  • the size of the complexes was first analyzed by measuring the hydrodynamic diameter by dynamic light scattering (Dynamic Laser Light Scattering) using a Coulter N4plus device the samples are diluted 20 times in a solution containing 5% dextrose and 20 mM sodium chloride to avoid multiple diffusions
  • the effect of the cycloamidine group, of the lipid composition, and of the charge ratio on the size of the nucleolipid complexes according to the invention has thus been studied
  • FIG. 3 illustrates these 3 phases for the compound ( 1) The same behavior can be observed for other compounds according to the invention
  • phase B the DNA is completely saturated with the compound (1), and the complexes are generally neutral or slightly positive.
  • This phase is unstable because the ion repulsions are minimal and a phenomenon of “crosslinking” can occur.
  • the particle size is well above the detection limit by dynamic light scattering (much greater than 3 ⁇ m). This unstable phase is called "phase B".
  • Such a size of complex is not suitable for uses in injection. However, this does not mean that the complexes are inactive in phase B, but they are only in a formulation which is not suitable for their injection for pharmaceutical purposes.
  • phase C the nucleolipid complexes are in a form such that DNA is very well protected against enzymes, and their generally positive charge facilitates the passage of the cell membrane of an anionic nature.
  • the complexes of phase C are therefore particularly suitable for use for the transfer of nucleic acids into cells.
  • the use of a neutral co-lipid has a strong impact on the stability of the complexes, as illustrated in FIG. 3.
  • the addition of the neutral co-lipid increases the instability of the complexes, which leads to an increase in the amount of compound required to reach phase C. This is very clearly illustrated in FIG. 3 when comparing the charge ratio at which phase C is reached in the presence and in the absence of co-lipid.
  • This example illustrates the capacity of the compound (1) according to the invention to transfect DNA in cells in vitro, compared to unformulated DNA.
  • 24-well microplates are seeded with 60,000 HeLa cells (ATCC) per well, and transfected 24 hours later.
  • Complexes containing 1 ⁇ g of DNA are diluted in 0.5 ml of DMEM culture medium (Gibco / BRL) in the absence of serum, then added to each well.
  • the cells are incubated at 37 ° C for 4 hours.
  • the medium containing the complexes is then removed and replaced with a mixture of DMEM and 10% fetal calf serum. Then, the cells are again cultured for 24 hours. Finally, the cells are lysed and tested using a luciferase test kit (Promega) and a Dynex MLX luminometer.
  • This example illustrates the capacity of the compounds (3), (5) and (6) according to the invention to transfect DNA in cells in vitro, compared to unformulated DNA.
  • This example illustrates the capacity of the compound (1) according to the invention to transfect DNA in cells in vivo, compared to unformulated DNA and to lipid A of condensed formula NH 2 (CH 2 ) 3 NH (CH 2 ) 4 NH (CH 2 ) 3 NHCH 2 COArgN [(CH 2 ), 7 CH 3 ] 2 described in application WO 97/18185 and the structure of which is shown represented in FIG. 1.
  • each mouse received 30 ⁇ l of formulation containing 15 ⁇ g of DNA in the anterior tibia muscle.
  • the tissues are recovered 7 days after the injection, they are frozen and stored at -80 ° C while waiting to carry out the luciferase activity tests.
  • the luciferase activity measurements are made as in Example 8.
  • each mouse received 200 ⁇ l of formulation containing 50 ⁇ g of DNA.
  • the tissues are recovered in this case 24 hours after the injection, then frozen and stored in the same way as above. 52
  • the results of gene transfer in vivo are presented in FIG. 8 and in FIG. 9.
  • the ratio between the compound (1) and the DNA is 10 nmol / ⁇ g of DNA.
  • the ratio between lipid A and DNA is 4 nmol / ⁇ g of DNA.
  • FIG. 8 illustrates the in vivo activity in the muscle of the compound (1) according to the invention compared with naked DNA and lipid A. It can be seen that the levels of luciferase activity are equivalent between naked DNA and compound (1), the latter also having a very improved activity compared to lipid A.
  • the transfer mechanisms involved seem different between naked DNA and the use of compound (1) according to the present invention. In fact, the complexes according to the invention used do not contain free DNA (phase C) and, moreover, their in vitro results are much higher than those of naked DNA.
  • FIG. 9 compares the activities of compound (1) according to the invention, naked DNA and lipid A, intravenously and intramuscularly.
  • the transfection efficiency is roughly equivalent intravenously for lipid A and for compound (1).
  • the transfection efficiency of the compound (1) according to the invention is very much higher than that of the liquid A.
  • the compound (1) Compared to naked DNA, the compound (1) has an intravenous transfection, in addition to the at least equivalent intramuscular transfection. It therefore appears that the transfer efficiency of the nucleic acid in vivo with the compound (1) according to the invention is generally greater than that with lipid A which is a known cationic lipid and that of unformulated DNA. .
  • the complexes according to the invention have the advantage, compared to the transfection of naked DNA, of protecting DNA from degradation by nucleases, thus contributing to a significant improvement in the stability of the formulations.
  • the compounds of the present invention can also be used to protect DNA from deterioration during lyophilization, again improving the stability of the formulations. 53
  • This example illustrates the capacity of compounds (5) and (6) to efficiently transfect m vivo nucleic acid.
  • FIG. 10 shows that the compound (5) and the compound (6), formulated in a charge ratio 0.25 1 with the DNA without co-lipid, have a level of transfection in vivo greater than or equal to naked DNA 48 hours after injection in im

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux composées utiles comme agents de transfert d'acides nucléiques dans les cellules. Ces nouveaux composés sont plus particulièrement apparentés à la famile des lipopolyamines, et comportent au moins une fonction amidine cyclique. Ils sont utiles pour la transfection des acides nucléiques d'intérêt dans différents types cellulaires, aussi bien in vitro que in vivo ou ex vivo.

Description

1
NOUVEAUX AGENTS DE TRANSFERT D'ACIDES NUCLÉIQUES. COMPOSITIONS LES CONTENANT ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention concerne de nouveaux composés utiles comme agents de transfert d'acides nucléiques dans les cellules. Ces nouveaux composés sont plus particulièrement apparentés à la famille des lipopolyamines, et comportent au moins une fonction amidine cyclique. Ils sont utiles pour la transfection des acides nucléiques dans différents types cellulaires, aussi bien in vitro que ex vivo ou in vivo.
Avec le développement des biotechnologies, la possibilité de transférer efficacement des acides nucléiques dans les cellules est devenue une nécessité. Il peut s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules in vitro, par exemple pour la production de protéines recombinantes, ou au laboratoire, pour l'étude de la régulation de l'expression de gènes, le clonage de gènes, ou toute autre manipulation impliquant l'ADN. Il peut également s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules in vivo, par exemple pour la création d'animaux transgéniques, la réalisation de vaccins, des études de marquage ou également des approches thérapeutiques. Il peut encore s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules ex vivo, dans des approches de greffes de moelle osseuse, d'immunothérapie ou d'autres méthodes impliquant le transfert de gènes dans des cellules prélevées d'un organisme, en vue de leur réadministration ultérieure.
Différents types de vecteurs synthétiques ont été développés pour améliorer le transfert des acides nucléiques dans les cellules. Parmi ces vecteurs, les lipides cationiques possèdent des propriétés intéressantes. Ces vecteurs sont constitués d'une partie polaire, cationique, interagissant avec les acides nucléiques, et d'une partie lipidique, hydrophobe, favorisant la pénétration cellulaire. Des exemples particuliers de lipides cationiques sont notamment les lipides monocationiques (DOTMA : Lipofectin®), certains détergents cationiques (DDAB), les lipopolyamines et en particulier la dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS) ou la 5-carboxyspermylamide de la palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES), dont la préparation a été décrite par exemple dans la demande de brevet EP 394 1 1 1. Une autre famille de lipopolyamines est représentée par les composés tels que décrits dans la demande de brevet WO 97/18185 incorporée à la présente par référence, et sont illustrés à la figure 1.
Mais jusqu'à présent, les injections dans les tissus, et notamment les muscles, étaient souvent faites avec de l'ADN non-formulé afin de faciliter son entrée dans les cellules, l'association à des vecteurs synthétiques conduisant à des complexes de taille trop importante pour être incorporés dans les cellules.
C'est un des principaux problèmes que la présente invention se propose de résoudre. En effet, les composés selon l'invention possèdent l'avantage inattendu de présenter un niveau de transfection in vivo dans le muscle au moins équivalent à celui obtenu avec l'ADN non-formulé et en tout état de cause un très bon niveau de transfection dans les autres tissus. L'association avec un composé selon l'invention protège l'ADN des dégradations par les nucléases et/ou des détériorations au cours de la lyophilisation, ce qui contribue à améliorer significativement la stabilité des formulations nucléolipidiques. De plus, une telle association permet une libération contrôlée lente des acides nucléiques.
Par ailleurs, les composés selon la présente invention appartiennent à la famille des lipides cationiques et portent une région cationique originale qui confère aux dits composés des propriétés améliorées, notamment une cytotoxicité réduite par rapport aux vecteurs cationiques de l'art antérieur. Cette partie cationique est en effet plus précisément réprésentée par une ou plusieurs polyamine particulière(s), portant une ou plusieurs fonctions amidine cycliques qui ont très probablement pour effet de « délocaliser » les charges positives, rendant le composé globalement moins cationique, avec les effets bénéfiques qui en découlent su le plan de la toxicité.
Ainsi, un premier objet de l'invention concerne de nouveaux composés sous forme D, L, ou DL, de formule générale (I) :
CA — Rep R (I)
pour laquelle : CD CA représente un groupement cycloamidine et ses formes mésomères de formule générale (II) :
?
^W
-R, (II)
^ '(CH,)_
pour laquelle :
• m, et n sont des entiers indépendants l'un de l'autre compris entre 0 et 3 inclus et tels que m+n est supérieur ou égal à 1 ,
• Ri représente un groupement de formule générale (III) :
"(CfLV -Y- -(*) (in)
pour laquelle p et q sont des entiers indépendants l'un de l'autre compris entre 0 et 10 inclus, Y représente un groupement carbonyle, amino, méthylamino, ou bien méthylène, Y pouvant avoir des significations différentes au sein des différents groupements [(CH2)P-Y], et (*) représente soit un atome d'hydrogène, soit est le lieu de liaison au groupement Rep, étant entendu que Ri peut être lié à n'importe quel atome de la formule générale (II), y compris Z, et qu'il y a un unique groupe Ri dans la formule (II),
• X représente un groupement NR2 ou bien CHR2, R2 étant soit un atome d'hydrogène soit la liaison au groupe Ri tel que défini précédemment,
• Le groupement — i^L - représente :
V W
4 4
* 1er cas : un groupement de formule générale (IV) NH R"N-^^W' (IV)
4 i pour laquelle W représente CHR'" ou bien NR'", et R" et R"' représentent indépendemment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un méthyle, ou la liaison au groupe Ri tel que défini précédemment, ou bien
* 2e"16 cas : un groupement de formule générale (V) :
NHR'
N ^W (V)
4 4 pour laquelle W représente CHR'" ou bien NR'", et R' et R'" représentent indépendemment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un méthyle, ou la liaison au groupe Ri tel que défini précédemment,
® Rep est absent ou est un répartiteur de formule générale (VI) :
O
N- "(ÇH) ,; (VI)
R, R
dont l'atome d'azote est rattaché aux atomes X, V, W, ou Z ou au substituant Y du groupe Ri selon les cas, et
• t est un entier compris entre 0 et 8 inclus,
• r est un entier compris entre 0 et 10 inclus, r pouvant avoir des significations différentes au sein des différents groupements -NR4-(CH)r-,
• R3, qui peut avoir des significations différentes au sein des différents groupements NR4-(CH)rR3, représente un atome d'hydrogène, un groupement méthyle, ou un groupement de formule générale (VII) : -^iCH^r- N^H (VU)
R5 pour laquelle u est un entier compris entre 1 et 10 inclus, s est un entier compris entre 2 et 8 inclus pouvant avoir des significations différentes au sein des différents groupements -(CH2)S-NR5, et R5 est un atome d'hydrogène, un groupement CA tel que définis précédemment étant entendu que les groupements CA sont indépendants les uns des autres et peuvent être différents, ou bien un groupement de formule générale (VII) étant entendu que les groupements de formule générale (VII) sont indépendants les uns des autres et peuvent avoir des significations différentes,
* R4 est défini de la même façon que R3 ou bien représente un groupement CA tel que défini précédemment étant entendu que les groupements CA sont indépendants les uns des autres et peuvent être différents, et
G) R est lié a la fonction carbonyle du groupement Rep de formule générale (VI), ou bien si Rep est absent R est lié directement au groupement CA, et représente :
* soit un groupement de formule NRόR7 pour laquelle Rό et R représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical aliphatique saturé ou non, linéaire ou ramifiée, éventuellement fluoré, contenant 1 à 22 atomes de carbone, avec l'un au moins des deux substituants Rό ou R7 différent de l'hydrogène et l'autre contenant entre 10 et 22 atomes de carbone,
* soit un dérivé de stéroïde,
* soit un groupement de formule générale (VIII) :
— [NH (CH^-^-Q (VIII)
pour laquelle x est un entier compris entre 1 et 8 inclus, y est un entier compris entre 1 et 10 inclus, et soit Q représente un groupement C(O)NRβR pour lequel Rβ et R sont définis comme précédemment, soit Q représente un groupement C(O)Rg pour lequel Rs représente un groupement de formule (IX) : ,
I 6
N N O. (IX)
«
O pour laquelle z est un entier compris entre 2 et 8 inclus, et R9 est un radical aliphatique saturé ou non , éventuellement fluoré, contenant 8 à 22 atomes de carbone, ou un dérivé de stéroïde, et les deux substituants Rβ sont, indépendamment l'un de l'autre, définis comme précédemment, ou bien Rs représente un groupement -O-R9 pour lequel R9 est défini comme ci-dessus.
Selon une variante de l'invention, le groupement Ri est lié soit à Z soit à V d'une part et au groupement Rep d'autre part par l'intermédiaire de Y.
Avantageusement, le groupement cycloamidine CA de formule (II) comporte 5, 6, 7 ou 8 chaînons.
Par ailleurs, dans une autre variante de l'invention, Rep est un répartiteur à 1, 2, ou 3 « bras ». On peut par exemple citer les répartiteurs suivants :
R<
HN N\ "Or
** .
N
R. °
•NH I R< .
* -^
H O R,-
O ^ "R,
Selon une seconde variante de l'invention, R3 représente un atome d'hydrogène ou un méthyle et R4 est tel que défini précédemment, ou bien R3 et R4 présent dans la formule (VI) représentent des atomes d'hydrogène, ou bien R4 est un atome d'hydrogène et R3 est un groupement de formule (VII) dans laquelle R5 représente un groupement CA
Préférentiellement, dans la formule (V), p et q sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi 2, 3 ou 4.
De manière générale, le groupement R contient au moins un segment hydrophobe. On entend au sens de l'invention par « segment hydrophobe » tout groupement de type lipidique, favorisant la pénétration cellulaire. En particulier, le groupement R contient au moins une chaîne aliphatique ou au moins un dérivé de stéroïde.
Selon une variante préférée, le groupement R représente un groupement de formule NRôR-7, RÔ et R7 étant définis comme précédemment, ou bien représente un groupement de formule générale (VIII) dans laquelle Q représente un groupement C(O)NReR7, RÔ et R7 étant définis comme précédemment.
Préférentiellement, Ré et/ou R7 représentent indépendamennt l'un de l'autre une chaîne aliphatique linéaire saturée ou insaturée contenant 10 à 22 atomes de carbone, de préférence en 12, 14, 16, 17, 18, ou 19 atomes de carbone. Il s'agit par exemple des groupements (CH2)πCH3, (CH2),3CH3, (CH2)ι5CH3, (CH2)ι7CH3, oléyl etc..
Dans un mode particulier de mise en oeuvre, les groupes Rό et R sont identiques ou différents et représentent chacun une chaîne aliphatique saturée ou non, 8
linéaire ou ramifiée, éventuellement fluorée, contenant 10 à 22 atomes de carbone, telle que définie au paragraphe précédent.
Lorsque R représente un dérivé de stéroïde, celui-ci est avantageusement choisi parmi le cholestérol, le cholestanol, le 3-α-5-cyclo-5-α-cholestan-6-β-ol, l'acide cholique, le cholestérylformiate, le chotestanylformiate, le 3α,5-cyclo-5α-cholestan- 6β-yl formiate, la cholestérylamine, la 6-(l,5-diméthylhexyl)-3a,5a-diméthyl- hexadécahydrocyclopenta[a]cyclopropa[2,3]cyclopenta[ 1 ,2-f]naphta-lèn- 10-ylamine, ou la cholestanylamine.
Ces nouveaux composés de formule générale (I) peuvent se présenter sous forme de sels non toxiques et pharmaceutiquement acceptables. Ces sels non toxiques comprennent les sels avec les acides minéraux (acides chlorhydrique, sulfurique, bromhydrique, phosphorique, nitrique) ou avec les acides organiques (acides acétique, propionique, succinique, maléique, hydroxymaléique, benzoïque, fumarique, méthanesulfonique ou oxalique) ou avec les bases minérales (soude, potasse, lithine, chaux) ou encore avec les bases organiques (aminés tertiaires comme la triéthylamine, la pipéridine, la benzylamine).
A titre d'exemple illustrant des composés préférés selon l'invention, on peut citer les composés de formules suivantes :
n
Composé (1)
N-dioctadécylcarbamoylméthyl-2-{3-[4-(2-imino-tétrahydro-pyrimidin- 1 -yl)-butylamino]propylamino } -acétamide T NH H H » composé (2)
N-ditétradécylcarbamoylméthyl-2-{3-[4-(2-imino-tétrahydro-pyrimidin- l-yl)-butylamino]propylamino}-acétamide
I — N
I -»'V-, N H Λ/8vA !
Composé (3)
2-(3 - { 4-[3 -(4, 5-dihydro- 1 H-imidazol-2-ylamino)-propylamino]-butylamino } - N-ditétradécylcarbamoylméthyl-acétamide
N^NH HN
\— NH
Composé (4)
2-(3-{bis-[3-(4,5-dihydro-lH-imidazol-2-ylamino)-propyl]-amino} -propylamino)-N-ditétradécylcarbamoylméthyl-acétamide.
c NγN
NH " Y
Composé (5)
N-ditétradécylcarbamoylméthyl-2- { 3 -[3 -( 1 ,4, 5,6-tétrahydropyrimidin -2-ylamino)-propylamino]propylamino } -acétamide 10
NH
Composé (6)
N-dioctadécylcarbamoylméthyl-2-{3-[3-(l,4,5,6-tétrahydropyrimidin -2-ylamino)-propylamino]propylamino } -acétamide
Les composés de l'invention peuvent être préparés de différentes façons. Selon une première méthode, les composés de l'invention peuvent être obtenu par synthèse des lipopolyamines analogues (c'est-à-dire la même structure mais sans groupement cycloamidine), la cyclisation en groupements cycloamidine étant effectuée dans un second temps. Les lipopolyamines analogues peuvent être obtenues par toute méthode connue de l'homme du métier, et notamment selon les méthodes décrites dans la demande WO 97/18185 ou par des méthodes analogues. La cyclisation des têtes amidine peut par exemple être effectuée par réaction entre une et/ou plusieurs aminés primaires de la lipopolyamine et des réactifs tels que l'hydrogénosulfate d'O- méthylisourée sulfate [J. Med. Chem., 1995, 38(16), pp. 3053-3061] ou le semisulfate de S-méthylisothiourée [Int. J. Pept. Prot. Res., 1992, 40, pp. 119-126]. De préférence, on opère en milieu aqueux en présence d'une base à chaud [J. Med. Chem., 1985 , pp. 694-698 et J. Med. Chem., 1996, pp. 669-672]. A titre de solvant préféré, on peut citer les mélanges eau/alcool ou le diméthylformamide. A titre de base, on peut utiliser la triéthylamine, la N-éthyldiisopropylamine, la soude, la potasse etc.. La température est comprise de préférence entre 40°C et 60°C, et encore plus préférentiellement, la réaction est mise en oeuvre à 50°C.
Une autre méthode consiste à effectuer une synthèse de briques portant la fonction cycloamidine qui sont ensuite greffée(s) sur des lipides équipés de répartiteurs. Cette méthode présente l'avantage d'accéder à un nombre important de produits. Au sens de l'invention, on entend par « briques » tout segment fonctionnel de la molécule. Par exemple, le groupement cycloamidine CA tel que défini dans la formule générale (II), Rep ou encore R constituent des briques distinctes les une des autres au sens de l'invention. 1 1
A titre d'exemple, on peut par exemple procéder de la façon suivante :
1) Synthèse de la brique R : a) Lorsque R représente -NP sR-?, soit il est disponible commercialement, soit il peut être synthétisé selon l'une des méthodes suivantes : • par réduction alkylative entre une aminé portant le groupe R<s et un aldéhyde portant le groupe R . On opère de préférence dans un solvant chloré (par exemple le dichloromethane, le chloroforme, le dichloro-l,2-éthane etc.. [J. Org. Chem., 1996, pp. 3849-3862]) ou dans tout autre solvant organique compatible avec la réaction (par exemple du tétrahydrofuranne), en présence de triacétoxyborohydrure de sodium, cyanoborohydrure de sodium ou ses dérivés (par exemple le cyanoborohydrure de lithium) [J.Am. Chem. Soc, 1971, pp. 2897-2904] et d'acide acétique.
• ou bien par substitution d'un groupe partant porté par RÔ, par une aminé portant le groupe R7. A titre d'exemple de groupe partant, on peut citer les atomes d'halogène (Br, Cl, I) ou les substituants tosyl, mésyl, etc.. On opère de préférence en présence d'un réactif basique, par exemple du carbonate de sodium, de la potasse, de la soude de la triéthylamine etc., dans un alcool (par exemple Péthanol) au reflux [J. Am. Chem. Soc, 1996, pp. 8524-8530]
• ou bien par couplage entre un acide gras (ou ses dérivés comme les chlorures d'acide gras par exemple ) et une aminé grasse. L'amide obtenu est alors réduit par un hydrure, par exemple l'hydrure de lithium aluminium ou tout autre hydrure connu de l'homme du métier, dans un éther (par exemple le tétrahydrofuranne (THF), le t- butylméthyléther (TBME), le diméthoxyéthane (DME), etc.). b) Lorsque R représente un groupement de formule générale (VIII), on effectue le couplage peptidique entre le groupement Q et H-[NH-(CH2)x]yCOOH. Le couplage peptidique est effectué selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier
(Bodanski M., Principles and Praclices of peptide Synthesis, Ed. Springe-Verlag) ou par toute méthode analogue connue. Notamment, la réaction peut s'effectuer en présence d'une base non-nucléophile dans des solvants aprotiques convenables (comme le chloroforme, la diméthylformamide, la méthylpyrrolidone, l'acétonitrile, 12
le dichlorométhane etc.), à température comprise entre 0 et 100 °C, le pH étant ajusté entre 9 et 11. Q est soit disponible commercialement, soit lorsque Q représente un groupement C(O)R8 avec R8 de formule (IX), il peut être synthétisé par réaction entre un chloroformiate commercial (par exemple le cholestérylchloroformiate) ou obtenu selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier à partir d'un chloroformiate commercial, et une diamine commerciale (par exemple la N-éthylènediamine) ou obtenue selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier. De préférence, on opère dans un solvant chloré (par exemple le dichlorométhane, le chloroforme, le dichloro-l,2-éthane etc.) ou dans tout autre solvant organique compatible avec la réaction comme par exemple le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, l'acétonitrile etc.
Le groupement H-[NH-(CH2)x]y-COOH est un acide aminé commercial lorsque y est égal à 1, ou bien est obtenu par une ou plusieurs réactions de cyanoéthylation selon les méthodes décrites ci-après dans la synthèse de Rep lorsque y est supérieur à 1.
2) Synthèse de la brique Rep :
Le groupement Rep est obtenu par cyanoéthylation ou par dicyanoéthylation (selon que l'on souhaite obtenir une structure de Rep linéaire ou branchée) d'un acide aminé de formule HOOC-(CH2)r-NH2 puis par réduction des fonctions nitriles en aminés, a) mono- ou di-cyanoéthylation :
CN
M -CN
HOOC-(CH2)r— NH2 + 1 ou 2 R'— N
H
T
R'
13
De préférence, on opère en milieu aqueux basique. Par exemple, la réaction est effectuée dans des solvants comme l'eau, les alcools (par exemple le méthanol , l'éthanol etc.) en présence d'une base telle que la soude, la potasse , la triéthylamine etc. Dans le cas de la monocyanoéthylation, on travaille de préférence à froid [J. Am. Chem. Soc, 1950, pp. 2599-2603]. Dans le cas de la dicyanoethylation, on travaille de préférence à chaud et avec un excès d'acrylonitrile [J. Am. Chem. Soc, 1951, pp. 1641-1644] b) La réduction des fonctions nitriles en aminés est effectuée par hydrogénation catalytique en milieu basique ou par toute autre méthode connue de l'homme du métier. A titre d'exemple, on peut utiliser de l'oxyde de platine ou encore du nickel de Raney [J. Org. Chem., 1988, pp. 3108-31 11] comme catalyseur. De préférence, le solvant choisi est un alcool (par exemple le méthanol, l'éthanol etc.) en présence d'une base, par exemple de la soude, de la potasse etc.
3) Synthèse de la brique Rep-R : La brique Rep-R est obtenu par couplage peptidique entre l'acide Rep et l'amine R obtenus aux étapes précédentes.
Le couplage peptidique est effectué selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier (Bodanski M., Principles and Practices of peptide Synthesis, Ed. Springe- Verlag) ou par toute méthode analogue connue. Notamment, la réaction peut s'effectuer en présence d'une base non-nucléophile dans des solvants aprotiques convenables (comme le chloroforme, la diméthylformamide, la méthylpyrrolidone, l'acétonitrile, le dichlorométhane etc.), à température comprise entre 0 et 100 °C, le pH étant ajusté entre 9 et 11.
4) Synthèse des composés selon l'invention CA-Rep-R : Les composés selon l'invention sont obtenus selon plusieurs méthodes possibles : a) par couplage en milieu basique entre l'amine terminale présente sur Rep-R obtenu à l'étape précédente, et CA-S-CH3, selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier. On opère de préférence dans un solvant chloré (par exemple le dichlorométhane, le chloroforme etc.) ou dans d'autres solvants organiques compatibles avec la réaction comme par exemple l'eau, les alcools, le 14
diméthylformamide etc., en présence d'une base (par exemple la triéthylamine, la soude, la potasse, la N-éthyldiisopropylamine etc.). et à température ambiante (20°C environ).
La brique CA-S-CH3 est soit disponible commercialement (c'est le cas par exemple de l'hydroiodure de 2-méthylthio-2-imidazoline), soit elle peut être obtenue par action d'un disulfure de carbone sur une diamine appropriée (c'est-à-dire choisie en fonction du groupement cycloamidine qu'on souhaite obtenir), suivie d'une méthylation. Par exemple, le schéma réactionnel peut être illustré de la façon suivante :
n^NH, CS„
l r iT^NH MeX
N' H
De préférence, le processus réactionnel est mis en oeuvre dans un alcool (par exemple l'éthanol). L'étape de méthylation est effectuée par action d'un halogénométhyle, l'atome d'halogène pouvant être par exemple un atome d'iode [J. Am. Cem. Soc, 1956, pp. 1618-1620 et Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, pp. 351-354].
b) par cyclisation interne du groupement cycloamidine à partir des fonctions amino présentes sur Rep-R, par action d'hydrogénosulfate d'O- méthylisourée ou de semisulfate de S-méthylisothiourée. De préférence, on opère en milieu aqueux en présence d'un base à chaud [J. Med. Chem., 1985 , pp. 694-698 et J. Med. Chem., 1996, pp. 669-672]. A titre de solvant préféré, on peut citer les mélanges eau/alcool ou le diméthylformamide. A titre de base, on peut utiliser la triéthylamine, la N- éthyldiisopropylamine, la soude, la potasse etc. La température est comprise de préférence entre 40°C et 60°C, et encore plus préférentiellement, la réaction est mise en oeuvre à 50°C. 15
c) par couplage peptidique entre CA-COOH et Rep-R selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier, comme décrit précédemment. La brique CA-COOH peut être obtenue de différentes manières :
• par action d'une brique CA-S-CH3 sur un acide aminé ou un acide polyaminé selon les méthodes connues de l'homme du métier ou par tout autre méthode analogue
[J. Am. Chem. Soc, 1956, pp. 1618-1620]. La brique CA-S-CH3 est obtenue de la même façon que précédemment, et l'acide aminé ou polyaminé est choisi en fonction du composé selon l'invention souhaité, ou bien
• par action d'un S,S-diméthyl-tosyl-iminothiocarbonimidate ou de l'un de ses dérivés sur un acide polyaminé selon les méthodes connues de l'homme du métier ou par tout autre méthode analogue [J. Org. Chem., 1971, pp. 46-48]. De préférence on opère en milieu éthanolique en présence d'une base (par exemple la soude) et à la température de reflux du mélange.
A titre d'exemple de briques CA-COOH pouvant être obtenues par l'une des méthodes décrites ci-dessus, on peut citer les briques suivantes :
NH H H
H n* CC O
~Î_TT OHC 00.
H NH
NH — N HN
HN X N NHH J s Ή.H H Λ N Cr OH°
OH OH
NH
H N^
\ / \ H u
N J λ — N o
H ' <υ 16
Dans toutes les réactions exposées précédemment, lorsque les substituants amino présents dans les différents groupements peuvent interférer avec les réactions mises en oeuvre, il est préférable de les protéger préalablement par des radicaux compatibles pouvant être mis en place et éliminés sans toucher au reste de la molécule. A titre d'exemple, les radicaux protecteurs peuvent être choisis parmi les radicaux décrits par T.W. GREENE, Protective Groups in Organic Synthesis, J. Wiley- Interscience Publication (1991) ou par McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plénum Press (1973).
Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant au moins un composé de formule (I) tel que défini précédemment. En particulier un autre objet selon la présente invention comprend un composé de formule (I) tel que défini ci-avant et un acide nucléique. Lorsque un composé selon l'invention et un acide nucléique sont mis en présence, ils forment un complexes par interaction entre les charges positives présentes à pH physiologique sur le composé selon l'invention et les charges négatives de l'acide nucléique. Ce complexe est appelé « complexe nucléolipidique » dans toute la suite. Préférentiellement, le composé selon l'invention et l'acide nucléique sont présents en quantités telles que le rapport des charges positives du composé sur les charges négatives de l'acide nucléique soit compris entre 0,1 et 50, de préférence entre 0,1 et 20. Ce rapport peut être ajusté aisément par l'homme du métier en fonction du composé utilisé, de l'acide nucléique, et des applications recherchées
(notamment du type de cellules à transfecter).
On entend au sens de l'invention par « acide nucléique » aussi bien un acide désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences naturelles ou artificielles, et notamment d'ADN génomique (ADNg), d'ADN complémentaire (ADNc), d'ARN messager (ARNm), d'ARN de transfert (ARNt), d'ARN ribosomique (ARNr), de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques, d'oligonucléotides modifiés ou non. Ces acides nucléiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc.. Ils peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification 17
chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Ils peuvent être modifiés chimiquement.
Concernant plus particulièrement les acides désoxyribonucléiques, ils peuvent être simple ou double brin de même que des oligonuléotides courts ou des séquences plus longues. En particulier, les acides nucléiques sont avantageusement constitués par des plasmides, des vecteurs, des épisomes, des cassettes d'expression, etc. Ces acides désoxyribonucléiques peuvent porter une origine de réplication fonctionnelle ou non dans la cellule cible, un ou plusieurs gènes marqueurs, des séquences régulatrices de la transcription ou de la réplication, des gènes d'intérêt thérapeutique, des séquences antisens modifiées ou non, des régions de liaison à d'autres composants cellulaires, etc.
De préférence, l'acide nucléique comprend une cassette d'expression constituée d'un ou plusieurs gènes d'intérêt thérapeutique sous contrôle d'un ou plusieurs promoteurs et d'un terminateur transcriptionnel actifs dans les cellules cibles.
On entend au sens de l'invention par « cassette d'expression d'un gène d'intérêt » un fragment d'ADN qui peut être inséré dans un vecteur à des sîtes de restriction spécifiques. Le fragment d'ADN comprend une séquence d'acide nucléique codant pour un ARN ou un polypeptide d'intérêt et comprend en outre les séquences nécesaires à l'expression (enhanceur(s), promoteur(s), séquences de polyadénylation etc.) de ladite séquence. La cassette et les sîtes de restriction sont conçus pour assurer une insertion de la cassette d'expression dans un cadre de lecture approprié pour la transcription et la traduction.
Il s'agit généralement d'un plasmide ou d'un épisome portant un ou plusieurs gènes d'intérêt thérapeutique. A titre d'exemple on peut citer les plasmides décrits dans les demandes de brevet WO 96/26270 et WO 97/10343 incorporées à la présente par référence.
Au sens de l'invention, on entend par gène d'intérêt thérapeutique notamment tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit 18
protéique ainsi codé peut être notamment une protéine ou un peptide. Ce produit protéique peut être exogène homologue ou endogène vis-à-vis de la cellule cible, c'est- à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie. Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène d'intérêt thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interieukines, interférons, TNF, etc. (FR 92/03120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pléiotrophine, etc.) les apolipoprotéines (ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc., FR 93/05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 91/1 1947), la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs (p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc., FR 93/04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation (Facteurs VII, VIII, IX), les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), les gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les enzymes du métabolisme, catabolisme etc.
L'acide nucléique d'intérêt thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique 19
décrite dans le brevet EP 140 308. Les gènes thérapeutiques comprenent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP 321 201).
Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet la réalisation soit de vaccins soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des microorganismes, des virus ou des cancers. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, du "syncitia forming virus", d'autres virus ou encore de peptides antigéniques spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Préférentiellement, l'acide nucléique comprend également des séquences permettant l'expression du gène d'intérêt thérapeutique et/ou du gène codant pour le peptide antigénique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes El A, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. Il peut aussi s'agir de promoteur, inductible ou répressible.
Par ailleurs, l'acide nucléique peut également comporter, en particulier en amont du gène d'intérêt thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut 20
également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. L'acide nucléique peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé vers un compartiment particulier de la cellule.
Les compositions selon l'invention peuvent en outre comporter un ou plusieurs adjuvants capables de s'associer aux complexes formés entre le composé selon l'invention et l'acide nucléique, et d'en améliorer le pouvoir transfectant. Dans un autre mode de mise en oeuvre, la présente invention concerne donc des compositions comprenant un acide nucléique, un composé de formule (I) tel que défini ci-avant et un ou plusieurs adjuvants capables de s'associer aux complexes nucléolipidiques composé (I)/acide nucléique et d'en améliorer le pouvoir transfectant. La présence de ce type d'adjuvants (lipides, peptides ou protéines par exemple) peut permettre avantageusement d'augmenter le pouvoir transfectant des composés.
Dans cette optique, les compositions de l'invention peuvent comprendre comme adjuvant, un ou plusieurs lipides neutres. De telles compositions sont particulièrement avantageuses, notamment lorsque le rapport de charges R est faible. La Demanderesse a en effet montré que l'addition d'un lipide neutre permet d'améliorer la formation des particules nucléolipidiques et de favoriser la pénétration de la particule dans la cellule en déstabilisant sa membrane.
Plus préférentiellement, les lipides neutres utilisés dans le cadre de la présente invention sont des lipides à deux chaînes grasses. De manière particulièrement avantageuse, on utilise des lipides naturels ou synthétiques, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologiques. Il peuvent être choisis plus particulièrement parmi la dioleoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), l'oléoylpalmitoylphosphatidyléthanolamine (POPE), les di-stéaroyl, -palmitoyl, - mirystoyl phosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivé N-méthylés 1 à 3 fois, les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines) ou encore les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGMl et GM2). 21
Ces différents lipides peuvent être obtenus soit par synthèse, soit par extraction à partir d'organes (exemple : le cerveau) ou d'oeufs, par des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. En particulier, l'extraction des lipides naturels peut être réalisée au moyen de solvants organiques (voir également Lehninger, Biochemistry).
Plus récemment, la demanderesse a démontré qu'il était également particulièrement avantageux d'employer à titre d'adjuvant, un produit intervenant ou non directement au niveau de la condensation de l'acide nucléique (WO 96/25508). La présence d'un tel produit, au sein d'une composition selon l'invention, permet de diminuer la quantité de composé de formule (I), avec les conséquences bénéfiques qui en découlent sur le plan toxicologique, sans porter un préjudice quelconque à l'activité transfectante. Par produit intervenant au niveau de la condensation de l'acide nucléique, on entend définir un produit compactant, directement ou non, l'acide nucléique. Plus précisément, ce produit peut soit agir directement au niveau de l'acide nucléique à transfecter soit intervenir au niveau d'un produit annexe qui lui est directement impliqué dans la condensation de cet acide nucléique. De préférence, il agit directement au niveau de l'acide nucléique. Par exemple, le produit précompactant peut être n'importe quel polycation, par exemple la polylysine. Selon un mode de réalisation préféré, ce produit intervenant au niveau de la condensation de l'acide nucléique dérive en tout ou partie d'une protamine, d'une histone, ou d'une nucléoline et/ou de l'un de leurs dérivés. Un tel produit peut également être constitué, en tout ou partie, de motifs peptidiques (KTPKKAKKP) et/ou (ATPAKKAA), le nombre des motifs pouvant varier entre 2 et 10. Dans la structure du composé selon l'invention, ces motifs peuvent être répétés de manière continue ou non. C'est ainsi qu'ils peuvent être séparés par des liens de nature biochimique, par exemple par un ou plusieurs acides aminés, ou de nature chimique.
Préférentiellement, les compositions de l'invention comprennent de 0,01 à 20 équivalents d'adjuvant(s) pour un équivalent d'acides nucléiques en mol/mol et, plus préférentiellement, de 0,5 à 5. 22
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, les compositions de la présente invention comprennent en outre un élément de ciblage permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique. Cet élément de ciblage peut être un élément de ciblage extracellulaire permettant d'orienter le transfert de l'ADN vers certains, types cellulaires ou certains tissus souhaités (cellules tumorales, cellules hépatiques, cellules hématopoiétiques...). Il peut également s'agir d'un élément de ciblage intracellulaire permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers certains compartiments cellulaires privilégiés (mitochondries, noyau etc.). L'élément de ciblage peut être lié au composé selon l'invention ou également à l'acide nucléique comme cela a été précisé précédemment.
Parmi les éléments de ciblage utilisables dans le cadre de l'invention, on peut citer les sucres, les peptides, les protéines, les oligonucléotides, les lipides, les neuromédiateurs, les hormones, les vitamines ou leurs dérivés. Préférentiellement, il s'agit de sucres de peptides ou de protéines tels que des anticorps ou des fragments d'anticorps, des ligands de récepteurs cellulaires ou des fragments de ceux-ci, des récepteurs ou des fragments de récepteurs, etc. En particulier, il peut s'agir de ligands de récepteurs de facteurs de croissance, de récepteurs de cytokines, de récepteurs de type lectines cellulaires, ou de ligands à séquence RGD avec une affinité pour les récepteurs de protéines d'adhésion comme les intégrines. On peut également citer les récepteurs de la transferrine, des HDL et des LDL, ou le transporteur du folate. L'élément de ciblage peut également être un sucre permettant de cibler des lectines tels que les récepteurs aux asialoglycoprotéines ou aux syalydés tel que le sialyde Lewis X, ou encore un fragment Fab d'anticorps, ou un anticorps simple chaîne (ScFv).
L'association des éléments de ciblage aux complexes nucléolipidiques de l'invention peut être effectuée par toute technique connue de l'homme du métier, par exemple par couplage à une partie hydrophobe ou à une partie qui interagit avec l'acide nucléique du composé de formule générale (I) selon l'invention, ou encore à un groupement qui interagit avec le composé de formule générale (I) selon l'invention ou avec l'acide nucléique. Les interactions en question peuvent être, selon un mode préféré, de nature ionique ou covalente. 23
Selon une autre variante, les compositions de l'invention peuvent aussi incorporer au moins un agent de surface non-ionique en quantité suffisante pour stabiliser la taille des particules de complexes nucléolipidiques composé de formule générale (I)/acide nucléique. L'introduction d'agents de surface non-ionique prévient la formation d'agrégats, ce qui rend la composition plus particulièrement adaptée à une administration in vivo. Les compositions selon l'invention incorporant de tels agents de surface présentent un avantage sur le plan de l'innocuité. Elles présentent également un avantage supplémentaire en ce sens qu'elles diminuent le risque d'interférences avec d'autres protéines compte tenu de la réduction de la charge globale des compositions de complexes nucléolipidiques.
Les agents de surface sont constitués avantageusement d'au moins un segment hydrophobe, et d'au moins un segment hydrophile. Préférentiellement, Le segment hydrophobe est choisi parmi les chaînes aliphatiques, les polyoxyalkylène, les polyester d'alkylidène, les polyéthylène glycol à tête polyéther benzylique et le cholestérol, et le segment hydrophile est avantageusement choisi parmi les polyoxyalkylène, les alccols polyvinyliques, les polyvinylpyrrolidones ou les saccharides. De tels agents de surface non-ioniques ont été décrits dans la demande WO 98/34648.
L'invention a également pour objet l'utilisation des composés de formule générale (I) tels que définis ci-avant pour fabriquer un médicament destiné à soigner les maladies par transfert d'acides nucléiques (et plus généralement de polyanions) dans les cellules primaires ou dans les lignées établies. Il peut s'agir en particulier de cellules fibroblastiques, musculaires, nerveuses (neurones, astrcytes, cellules glyales), hépatiques, de la lignée hématopoiétique (lymphocytes, CD34, dendritiques etc.), épithéliales, etc., sous forme différenciées ou pluripotentes (précurseurs).
Une telle utilisation est particulièrement avantageuse car les composé de formule générale (I) selon l'invention présentent une cytotoxicité réduite par rapport aux lipides cationiques de l'art antérieur. La Demanderesse a notamment mis en évidence qu'à des rapports de charges très élevés entraînant habituellement la mort des animaux consécutivement à la transfection, aucune cytotoxicité apparente n'était 24
décelée. Les composés selon l'invention peuvent être utilisés notamment pour la transfection in vitro, ex vivo ou in vivo d'acides nucléiques. Pour des utilisations in vivo, par exemple en thérapie ou pour l'étude de la régulation de gènes ou la création de modèles animaux de pathologies, les compositions selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, intratrachéale, intrapéritonéale, etc. De préférence, les compositions de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses d'acide nucléique utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. En ce qui concerne plus particulièrement le mode d'administration, il peut s'agir soit d'une injection directe dans les tissus, par exemple au niveau des tumeurs, ou les voies circulatoires, soit d'un traitement de cellules en culture suivi de leur réimplantation in vivo, par injection ou greffe. Les tissus concernés dans le cadre de la présente invention sont par exemple les muscles, la peau, le cerveau, les poumons, le foie, la rate, la moelle osseuse, le thymus, le coeur, la lymphe, le sang, les os, les cartilages, le pancréas, les reins, la vessie, l'estomac, les intestins, les testicules, les ovaires, le rectum, le système nerveux, les yeux, les glandes, les tissus conjonctifs, etc. Avantageusement, les tissus transfectés sont les muscles et les poumons.
L'invention concerne en outre une méthode de transfert d'acides nucléiques dans les cellules comprenant les étapes suivantes :
(1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un composé de formule générale (I) tel que défini ci-avant, pour former un complexe nucléolipidique, et 25
(2) la mise en contact des cellules avec le complexe nucléolipidique formé en (1).
La mise en contact des cellules avec le complexe nucléolipidique peut être réalisée par incubation des cellules avec ledit complexe (pour des utilisations in vitro ou ex vivo), ou par injection du complexe dans un organisme (pour des utilisations in vivo). L'incubation est réalisée de préférence en présence de par exemple de 0,01 à 1000 μg d'acide nucléique pour 106 cellules. Pour une administration in vivo, des doses d'acide nucléique comprises entre 0,01 et 10 mg peuvent par exemple être utilisées.
Dans le cas où les compositions de l'invention contiennent en outre un ou plusieurs adjuvants tels que définis précédemment, le ou les adjuvants sont préalablement mélangés au composé de formule générale (I) selon l'invention ou bien à l'acide nucléique.
La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement avantageuse pour le traitement des maladies par administration d'un acide nucléique codant pour une protéine ou pouvant être transcrit en un acide nucléique apte à corriger ladite maladie, ledit acide nucléique étant associé à un composé de formule générale (I) tel que défini précédemment, dans les conditions définies ci-avant. Plus particulièrement, cette méthode est applicable aux maladies résultant d'une déficience en un produit protéique ou nucléique, l'acide nucléique administré codant pour ledit produit protéique ou étant transcrit en un produit nucléique ou encore constituant ledit produit nucléique.
L'invention s'étend à toute utilisation d'un composé de formule (I) selon l'invention pour la transfection in vivo, ex vivo, ou in vitro de cellules.
Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples et figures qui suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant l'invention sans en limiter la portée. Notamment, la Demanderesse propose à titre non-limitatif divers protocoles opératoires ainsi que des intermédiaires réactionnels susceptibles d'être mis en oeuvre 26
pour préparer les composés de formule générale (I). Bien entendu, il est à la portée de l'homme du métier de s'inspirer de ces protocoles et/ou produits intermédiaires pour mettre au point des porcédures analogues en vue de conduire à d'autres composés de formule générale (I) selon l'invention.
FIGURES
Figure 1 : Structure des vecteurs synthétiques dénommé lipide A, lipide B, lipide c et lipide D dans la présente invention et décrits dans la demande de brevet WO 97/18185 incorporée à la présente par référence.
Figure 2 : Représentation schématique du plasmide pXL2774.
Figures 3 : Diagramme de phase des complexes nucléolipidiques composé (1YADN. La liaison du composé (1) à l'ADN a été déterminée en suivant la diminution de la fluorescence (en %, 100% étant la fluorescence de l'ADN nu) du bromure d'éthidium (EtBr) (symbole •, ligne pleine), comme décrit selon l'axe y situé à droite. La taille des particules de complexes (en nm) est indiquée sur l'axe y situé à gauche. L'axe x représente le rapport de charge agents de transfert/ ADN. La taille des complexes nucléolipidiques sans co-lipide est représenté par le symbole * en ligne pleine. La taille des complexes nucléolipidiques contenant 25% de cholestérol est représenté par le symbole D en ligne discontinue. La taille des complexes nucléolipidiques contenant 40% de DOPE est représenté par le symbole en ligne discontinue. La méthode ne permet pas de déterminer la taille des particules au delà de 3 μm.
Figure 4 : Activité de transfert de gène in vitro dans des cellules HeLa des complexes nucléolipidiques contenant le composé (1) selon la présente invention sans co-lipide ( barre du milieu en gris foncé), avec 25% de cholestérol (barre de gauche en gris moyen), et avec 40% molaire de DOPE (barre de doite en gris clair), comparativement à l'ADN nu. Seuls les complexes nucléolipidiques dans lesquels l'ADN est complètement saturé en composé selon l'invention et dont la taille est comprise entre 100 nm et 300 nm ont été utilisés. 27
Figure 5 : Activité de transfert de gène m vitro des complexes nucléolipidiques formés à partir du composé (3), dans des cellules HeLa. En ordonnée figure l'expression de la luciférase, exprimée en pg par puit transfecté. En absisse, figure le rapport de charges entre le composé (3) et l'ADN en nmol/μg. L'expression a été mesurée à chaque fois pour des formulations sans co-lipide (micelles), avec DOPE et avec du cholestérol.
Figure 6 : Activité de transfert de gène in vitro des complexes nucléolipidiques formés à partir du composé (5), dans des cellules HeLa. En ordonnée figure l'expression de la luciférase, exprimée en pg par puit transfecté. En absisse, figure le rapport de charges entre le composé (5) et l'ADN en nmol/μg. L'expression a été mesurée à chaque fois pour des formulations sans co-lipide (micelles), avec DOPE et avec du cholestérol.
Figure 7 : Activité de transfert de gène in vitro des complexes nucléolipidiques formés à partir du composé (6), dans des cellules HeLa. En ordonnée figure l'expression de la luciférase, exprimée en pg par puit transfecté. En absisse, figure le rapport de charges entre le composé (6) et l'ADN en nmol/μg. L'expression a été mesurée à chaque fois pour des formulations sans co-lipide (micelles), avec DOPE et avec du cholestérol.
Figure 8 : Activité de transfert de gène in vivo après injection directe dans le muscle des complexes contenant le composé (1) selon la présente invention ou le composé de formule H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)17CH3]2 (appelé « lipide A » dans toute la suite) sans co-lipide (barre en gris foncé), avec 25% de cholestérol (barre en gris moyen), et avec 40% molaire de DOPE (barre en gris clair), comparativement à l'ADN nu. Seuls les complexes dans lesquels l'ADN est complètement saturé en lipide et dont la taille est comprise entre 100 nm et 300 nm ont été utilisés .
Figure 9 : L'importance de l'invention est illustrée en comparant l'activité de transfert de gène de deux lipides différents, le composé (1) selon l'invention et le lipide A, et de l'ADN nu via deux routes d'administration : par voie intraveineuse (iv) et par voie 28
intramusculaire (im). Seuls les complexes dans lesquels l'ADN est complètement saturé en lipide et dont la taille est comprise entre 100 nm et 300 nm ont été utilisés.
Figure 10 : Activité de transfert de gène in vivo 48 heures après injection i.m. des complexes nucléolipidiques contenant les composés (5) ou (6) selon la présente invention sans co-lipide et à rapport de charge 0,25/1, comparativement à l'ADN nu. L'expression est exprimée en pg de luciférase par ml.
En partant de la gauche, les barres représentent : (a) contrôle négatif ; (b) ADN nu ; (c) Composé (5)et (d) composé (6).
MATERIEL ET METHODES
A\ MATERIEL
- Les acides aminés, polyaminés (ou leur dérivés) de départ sont disponibles commercialement. C'est le cas par exemple de la N-(3-aminopropyl)glycine, N-(2- cyanoethyl)glycine, ou encore de l'acide 2,4-diaminobutyric, ou peuvent être synthétisées par des méthodes classiques connue de l'homme du métier.
- Les isothiourées cycliques sont également des produits commerciaux, comme par exemple l'hydroiodure de 2-méthylthio-2-imidazoline, ou peuvent être synthétisées par des méthodes classiques connues de l'homme du métier.
- Les aminés substituées par un/des lipide(s) sont commerciales ou bien synthétisées à partir des aminés et aldéhydes correspondants par réduction alkylative.
Les produits tels que la triéthylamine, l'acide trifluoroacétique, l'hexafluorophosphate de benzotriazol-l-yloxytris(diméthylamino)phosphonium (BOP), la diméthylaminopyridine (DMAP), le chloroformate de benzyle, le dicarbonate de di-tert-butyle sont des produits commerciaux. Les solutions de chlorure de sodium et de carnbonate de sodium sont saturées. La solution de sulfate de potassium est concentrée à 0,5 M. 29
B\ METHODES
1) Mesures Physiques.
Les spectres de RMN Proton ont été enregistrés sur des spectromètres Bruker 400 et 600 MHZ. Les spectres de masse ont été réalisés sur un API-MS/III.
2) Méthodes de purification et d'analyse
a Conditions de chromatographie en phase directe
- Les chromatographies sur couche mince (CCM) ont été effectuées sur des plaques de gel de silice Merck de 0,2 mm d' épaisseur. Elles sont révélées soit aux U.V. (254 nm), à la ninhydrine, en vaporisant (spray léger) une solution éthanolique de ninhydrine (40 mg/100 cm3 d'éthanol) pour révéler les aminés ou les amides en chauffant à 150°C, à la fluorescamine, en vaporisant une solution (40 mg/100 cm3 d'acétone) pour révéler les aminés primaires, au vert de bromocrésol, en vaporisant une solution (0, 1 % dans le propanol-2) pour révéler les acides, à la vanilline en vaporisant (spray léger) une solution éthanolique de vanilline (3 %) avec 3 % d'acide sulfurique suivi d'un chauffage à 120°C, ou à l'iode en recouvrant la plaque de poudre d'iode.
- Les chromatographies sur colonne ont été effectuées sur gel de silice 60 Merck de granulométrie 0,063-0,200 mm.
b) Conditions de purification CLHP (Chromatographie Liquide Haute Performance) préparative
L'appareillage est un ensemble pour la chromatographie en phase liquide en mode gradient permettant une détection U.V. Cette chaîne préparative est composée des éléments suivants : Pompe A : GILSON modèle 305 équipée d'une tête 50 SC. Pompe B : GILSON modèle 303 équipée d'une tête 50 SC. Boucle d'injection. : 5 ml. Module de pression : GILSON modèle 806. 30
Mélangeur : GILSON modèle 811 C équipé d'une tête de 23 ml.
Détecteur UV : GILSON modèle 119 équipé d'une cellule préparative.
Collecteur de fraction : GILSON modèle 202 équipé de portoirs n° 21 et de tube en verre de 10 ml.
Intégrateur : SHIMADZU modèle C-R6A.
Colonne : Colonne C4 (10 mm) en acier inoxydable de 25 cm de longueur et de 2.2 cm de diamètre commercialisée par VYDAC modèle 214 TP 1022.
La solution de produit à purifier est chargée sur la colonne par l'intermédiaire de la boucle d'injection, l'éluat est recueilli par fractions de un tube en 30 secondes. Le détecteur est réglé aux longueurs d'onde de 220 nm et 254 nm. les phases mobiles sont ainsi définie :
Solvant A Solvant B
Eau déminéralisée 2500 cm3 Acétonitrile pour HPLC 2500 cm3 Acide trifluoroacétique 2 cmJ Acide trifluoroacétique 2,5 cm3
Gradient :
Temps en minutes % de solvant A % de solvant B Débit en cm min
0 90 10 18
10 90 10 18
110 0 100 18
120 0 100 18 c) Techniques de chromatographie Analytique
- Les analyses CLHP (Chromatographie Liquide Haute Performance) ont été réalisées sur un appareil Merck-Hitachi équipé d'un intégrateur calculateur D 2500 HITACHI, d'un autosampler AS-2000A, d'une pompe inteligent L-6200A, et d'un détecteur UV- vis L-4000 avec longueur d'onde réglable mise à 220 nm.
Les colonnes pour les séparations analytiques sont des colonnes Browlee en acier inoxydable de 3 cm de longueur et de 0,46 cm de diamètre commercialisées par APPLIED BIOSYSTEM. 31
La phase stationnaire est constituée par de l'Aquapore Butyl 7 micron. Les phases mobiles sont l'eau (avec de l'acide trifluoroacétique) et l'acétonitrile (avec de l'acide trifluoroacétique). Les injection sont de 20 μl d'une solution d'environ 1 mg/cm3 dans une vanne à boucle de 0, 1 cm3. Le débit pour les analyses est réglé entre 1 cmVmin et 4 cm3/min. La pression est de 180 bars environ. Les conditions de séparation sont résumées ci-dessous :
Solvant A Solvant B Eau déminéralisée 2500 cm3 Acétonitrile pour HPLC 2500 cm3
Acide trifluoroacétique 2 cm Acide trifluoroacétique 2.5 cm3
Gradient :
Temps en minutes % de solvant A % de solvant B Débit en cm3/minute
0 60 40 1
3 60 40 1
20 0 100 1
35 0 100 1
35.1 60 40 4
36.1 60 40 4
36.2 60 40 2
44 60 40 2
EXEMPLES
A\ SYNTHESES DES COMPOSES SELON L'INVENTION
Exemple 1 : synthèse du composé (1) (N-dioctadécylcarbamoylméthyl-2-{3-[4-(2- imino-tétrahydro-pyrimidin-l-yl)-butylamino]-propylamino}-acétamide) à partir du lipide cationique de formule condensée NH (CH )3NH(CH2)4
NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)πCH3]2 appelé « lipide B » dans la suite (dont la préparation a été décrite dans la demande de brevet WO 97/18185 et dont la structure est représentée à la figure 1). 32
Dans un ballon équipé d'un barreau magnétique, on dissout 0,784 mmol de lipide B dans 25 cm3 de méthanol, et on ajoute 10,21 mmol de triéthylamine. Puis on coule lentement (5 minutes) sur le mélange une solution de O-Methylisourée et d'acide sulfurique (1,173 mmol) dans de l'eau (9 cm3). Le mélange est maintenu à 50°C dans un bain d'huile pendant vingt heures.
Ensuite, le mélange est concentré à sec au rotoévaporateur. On solubilise l'extrait sec avec une solution d'eau (4 cm3), d'éthanol (4 cm3), et d'acide trifluoroacétique (1 cm3). Cette solution est injectée en deux fois en CLHP préparative. Les fractions intéressantes (déterminées par CLHP analytique) sont regroupées, congelées et lyophilisées. On obtient ainsi 194 mg ( 0,163 mmol ) de produit salifié.
Rendement : 20,8 %
CLHP anaiytique : Rt = 15,99 minutes.
Spectre de RMN H (400 MHz, (CD3)2SO d6, δ en ppm) : 0,88 (t, J = 6,5 Hz, 6H : CH3 des chaînes grasses) ; 1,24 (mt, 60H : CH2 centraux des chaînes grasses) ; de 1,35 à 1,70 (mt, 4H : 1 CH2 de chaque chaîne grasse) ; 1,57 (mt, 4H : (CH2)2 centraux du butyle) ; 1,88 et 1,96 (2 mts, 2H chacun: CH2 central du propyle et CH2 central du cycle) ; de 2,85 à 3,35 (2 mts, 16H en totalité : les 8 NCH2) ; 3,81 (s large, 2H : NCH2CON) ; 4,03 (d, J = 5 Hz, 2H : CONCH2CON du glycyle) ; 7,25 et 7,84 (respectivement s et s large, IH chacun : les 2 NH du cycle) ; 8,61 (t, J = 5,5 Hz, IH : NHCO) ; 8,70 et 9,02 (2 mfs, IH chacun : les 2 NH). MHT= 846
Exemple 2 : synthèse du composé (2) (N-ditétradécylcarbamoylméthyl-2-{3-[4-(2- imino-tétrahydro-pyrimidin-l-yl)-butylamino]-propylamino}-acétamide) à partir du composé de formule condensée NH2(CH2)3NH(CH2)4
NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)ι3CH3]2 appelé « lipide C » dans la suite (dont la préparation a été décrite dans la demande de brevet WO 97/18185 et dont la structure est représentée à la figure 1).
Dans un ballon équipé d'un barreau magnétique on dissout 1,036 mmol de lipide C dans 30 cm3 de méthanol, et on ajoute 13,13 mmol de triéthylamine. Puis on coule 33
lentement (5 minutes) sur le mélange une solution de O-Methylisourée et d'acide sulfurique (1,554 mmol) dans de l'eau (9 cm3) Le mélange est maintenu à 50°C dans un bain d'huile pendant une vingtaine d'heures Puis, le mélange est concentré à sec au rotoévaporateur On solubilise l'extrait sec avec une solution d'eau (3 cm"'), d'éthanol (2 cm3), et d'acide trifluoroacétique (0,5 cm3) Cette solution est injectée en CLHP préparative
Les fractions intéressantes (déterminées par CLHP analytique) sont regroupées, congelées et lyophilisées On obtient finalement 218 mg (0,2022 mmol) de produit salifié Rendement R = 19,5 %
CLHP analyti ue Rt = 10 76 minutes
Spectre de RMN *H (400 MHz, (CD3)2SO d6, δ en ppm) 0,88 (t, J = 7 Hz, 6H CH3 des chaînes grasses) , de 1,15 à 1,40 (mt, 44H (CH2)n centraux des chaînes grasses) , 1,45 et de 1,50 à 1 65 (2 mts, 2H chacun 1 CH2 de chaque chaîne grasse) , 1,59 (mt, 4H les 2 CH2 centraux du butyle) , 1,91 et 1,97 (2 mts, 2H chacun • CH2 central des propyles) , de 2,85 à 3,10 (mt, 10H les 2 NCH2 du butyle - les 2 NCH2 d'un des 2 propyles - et 1 des 2 NCH de l'autre propyle) , 3,23 et de 3,30 à 3,50 (2 mts, respectivement 5H et IH • l'autre NCH2 de l'autre propyle et NCH2 des chaînes grasses) , 3,79 (mf, 2H NCH2CON) , 4,03 (d, J = 5 Hz, 2H CONCH2CON du glycyle) ; 7.27 et de 8,40 à 9,30 (respectivement s large et mf, 2H et 4H NH2 + CF3COO', NFf CF3COO" et =NH) ; 7,88 et 8,61 (respectivement s et s large, IH chacun : respectivement NHC=N et CONH) MH+= 734
Exemple 3 : synthèse du composé (3) (2-(3 - { 4-[3 -(4, 5-dihydro- 1 H-imidazol-2- ylamino)-propylamino]-butylamino } -propylamino)-N-ditétradécylcarbamoylméthyl- acétamide) à partir du lipide C (voir exemple 2 et figure 1 pour sa structure)
Dans un ballon équipé d'un compte-bulle et d'un barreau magnétique, on dissout
0,36 mmol de iodure de 2-méthylmercapto-2-imidazolinium dans 0,36 cm3 de soude
IN A cette solution on ajoute 0,36 mmol de lipide C préalablement dissout dans 1,44 cm3 de soude IN, 5 cm3 d'eau, et 4 cm3 d'éthanol Le mélange est maintenu sous 34
agitation jusqu'à l'arrêt de dégagement de méthyl mercaptan (24 heures). Le mélange est ensuite concentré à sec au rotoévaporateur. On solubilise l'extrait sec avec une solution d'eau (4 cm3), d'éthanol (4 cm3), et de d'acide trifluoroacétique (0,5 cm3). Cette solution est injectée en deux fois en CLHP préparative. Les fractions intéressantes (déterminées par CLHP analytique) sont regroupées, congelées et lyophilisées. On obtient finalement 213 mg ( 0, 1727 mmol ) de produit salifié.
Rendement : R = 48 % HPLCanaiytique : Rt = 8,90 minutes. Spectre de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6 avec ajout de quelques gouttes de
CD3COOD d4, δ en ppm) : 0,87 (t, J = 7 Hz, 6H : CH3 des chaînes grasses) ; de 1;15 à 1,40 (mt, 44H : (CH2)n centraux des chaînes grasses) ; 1,45 et 1,55 (2 mts, 2H chacun : 1 CH de chaque chaîne grasse) ; 1,65 (mt, 4H : les 2 CH2 centraux du butyle) ; de 1,80 à 1,95 (mt, 4H : CH2 central des propyles) ; de 2,80 à 3,05 (mt, 10H : les 2 NCH2 du butyle - les 2 NCH2 d' un des 2 propyles - et 1 des 2 NCH2 de l'autre propyle) ; 3,24 (mt, 6H : l'autre NCH2 de l'autre propyle et NCH2 des chaînes grasses) ; 3,56 (s, 2H : NCH2CON) ; 3,62 (s, 4H : NCH2CH2N) ;4,02 (d, J = 5 Hz, 2H : CONCH2CON du glycyle). MH 777 Exemple 4 : Synthèse du composé (4) (2-(3-{bis-[3-(4,5-dihydro-lH-imidazol-2- ylamino)-propyl]-amino}-propylamino)-N-ditétradécylcarbamoylméthyl-acetamide) par la méthode de synthèse de « briques ».
I) SYNTHÈSE DU BOC-GLY-DITÉTRADÉCYLAMINE (a)
Le groupement Gly dont les aminés sont protégées par des groupements Boc (10 mmol) et la ditétradécylamine (10 mmol) sont introduit dans un ballon de 250 ml, et on ajoute 100 cmJ de dichlorométhane. Le mélange est agité jusqu'à dissolution complète. 30 mmol de N-éthyldiisopropylamine (DIE A) et 11 mmol de phosphonium de benzotriazol-1-yloxytrisdiméthylamine (BOP) sont ensuite ajoutés. Le pH est maintenu à 10 grâce au DIEA, et le mélange est agité pendant 2 heures. Lorsque la réaction est achevée, (suivie par CCM et/ou CLHP), le dichlorométhane est évaporé et 35
le solide obtenu est repris dans l'acétate d'éthyle (300 cm3). La phase organique est lavée avec une solution de sulfate de potassium (4 fois 100 cm3), de carbonate de sodium (4 fois 100 cm3), et de chlorure de sodium (4 fois 100 cm3). La phase organique est ensuite séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée sous vide. Le produit (a) est obtenu avec un rendement de 93 %. CCM : Rf ≈ 0,9 (CHCl3/MeOH, 9: 1) MH+ : 567
II) SYNTHÈSE DE [Z-NH(CH2)3]2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH (b)
1) Synthèse de NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH (c) L'amine de la N-(cyanoéthyl)-glycine (0, 1 mol/amine, commerciale) est solubilisée dans de la soude IN (200 cm7amine) et du dioxane (200 cm ). La solution est agitée dans un bain de glace, puis on ajoute goutte à goutte une solution de O-(/-butoxucarbonyl) ou de p-chlorobenzyloxycarbonyle (C1Z, 0,14 mol/amine) dans 200 cm3 de dioxane. Le pH est maintenu à une valeur supérieure à 9. Puis le mélange est agité à environ 20°C pendant une nuit. Le dioxane est évaporé sous vide, puis on acidifie le mélange à pH 3 à l'aide d'une solution de sulfate de potassium. Ce qui est insoluble est extrait avec de l'acétate d'éthyle (3 fois 100 cm3) puis lavé avec une solution de chlorure de sodium (2 fois 100 cm3). La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée sous vide. Le produit (c) de formule NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH est obtenu avec un rendement de 98%. CCM : Rf = 0,66 (CHCl3/MeOH, 8:2) MH+ : 229
2) Synthèse de NH2-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH (d) Dans un autoclave en inox de 1 litre, on introduit 50 mmol de produit (c) de formule NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH. On prépare en même temps dans un bêcher une solution de 10 cm3 d'éthanol (95 %) et de 3,3 g de soude (80 mol). Lorsque la soude est dissoute, on introduit 2 cm3 de Nickel de raney sur charbon. L'autoclave est fermé. La pression initiale d'hydrogénation est de 52 bar environ , et elle descend à environ 48,5 bar en une nuit à température ambiante (20°C). La suspension est filtrée sur papier, le filtre est lavé à l'éthanol 36
(4 fois 25 cm3), et les filtrats sont concentrés à sec sous vide. On obtient le produit (d) qui est utilisé sans autre purification dans la suite. CCM : Rf = 0,12 (CHCl3/MeOH, 6:4) MH+ : 233 3) Synthèse de [NC(CH2)2]2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH (e)
Dans un ballon, le produit (d) de formule NH2-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH (0,05 mol) et de la soude (0,1 mol) sont solubilisés dans 150 cm3 d'eau. La solution est refroidie dans un bain de glace. Sous vive agitation, on coule lentement de l'acrylonitrile (0,12 mol) en gardant la température de la masse inférieure à 20°C. Le mélange de réaction est maintenu une nuit à température ambiante (20°C). Puis le mélange est maintenu à 50°C pendant 2 heures. Le solvant est évaporé sous vide, puis le mélange est acidifié à pH 3 avec une solution de sulfate de potassium. Ce qui est insoluble est extrait avec de l'acétate d'éthyle (3 fois 200 cm3), puis lavé avec une solution de chlorure de sodium (2 fois 100 cm3). La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, puis filtrée et évaporée sous vide. Le « brut » est éventuellement purifié sur une colonne de silice. On obtient le produit (e) avec un rendement de 50%. CCM : Rf ≈ 0,75 (CHCl3/MeOH, 6:4) MH+ : 339 4) Synthèse de [Z-NH-(CH2)3]2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH (b)
Dans un autoclave en inox de 1 litre, on introduit le produit (e) de formule [NC(CH2)2]2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH (50 mmol). On prépare en même temps dans un bêcher une solution de 10 cm3 d'éthanol (95 %) et de 3,3 g de soude (80 mol). Lorsque la soude est dissoute, on introduit cette solution dans l'autoclave. Un courant d'azote est passé dans l'autoclave et on introduit 2 cm de Nickel de Raney sur charbon. L'autoclave est fermé. La pression initiale d'hydrogénation est de 52 bar environ, et elle descend à 48,5 bar environ en une nuit à température ambiante (20°C). La suspension est filtrée sur papier, le filtre est lavé avec de l'éthanol (4 fois 25 cmJ), et les filtrats sont concentrés à sec sous vide. On obtient un solide blanc qui est utilisé sans autres purifications après une analyse CCM. 37
CCM : Rf = 0,14 (CHCl3/MeOH, 6:4)
Le solide obtenu précédemment est solubilisé dans de la soude IN (200 cm3/amine) et du dioxane (200 cm3). La solution est agitée dans un bain de glace, puis on ajoute goutte à goutte une solution de (t-butoxycarbonyl)2O ou de p-chlorobenzyloxycarbonyl (0,14 mol/amine) dans 200 cm3 de dioxane. Le pH est maintenu à une valeur supérieure à 9. Puis, le mélange est agité à température ambiante (20°C) pendant une nuit. Le dioxane est évaporé sous vide, puis on acidifie le mélange à pH 3 à l'aide d'une solution de sulfate de potassium. Ce qui est insoluble est extrait avec de l'acétate d'éthyle (3 fois 100 cm3) puis lavé avec une solution de chlorure de sodium (2 fois 100 cm3). La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium^ filtrée et évaporée sous vide. Les produits sont analysés par CCM et/ou CLHP.
Le Produit brut est purifié sur une colonne de silice (dichlorométhane/méthanol, 8:2). On obtient le produit (b) avec un rendement de 66% par rapport au produit (d).
CCM : Rf = 0,42 (CHCl3/MeOH, 6:4) MH+ : 615
III) SYNTHÈSE DE [Z-NH(CH2)3]2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COGlyN[(CH2)ι3-CH3]2 ω Le produit (a) dont les aminés sont protégées par des groupements Boc (1 mmol) est introduit dans un ballon équipé d'un barreau magnétique. 30 cm" d'acide trifluoroacétique à 4°C sont ajoutés, puis la solution est agitée pendant une heure. Lorsque la réaction est achevée (suivi par CCM et/ou CLHP), l'acide trifluoroacétique est évaporé sous vide puis le produit est séché par coévaporation avec 3 fois 30 cm d'éther éthylique.
CLHP : Rt = 12,86 min, (H2O/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min
[0/100]).
Le produit obtenu (Gly-ditétradécylamine, 10 mmol) et le produit (b) (10 mmol) sont introduit dans un ballon de 250 cm3, du diclorométhane (100 cm3) est ajouté et le mélange est agité jusqu'à dissolution complète. 30 mmol de N-éthyldiisopropylamine 38
(DIEA) et 11 mmol d'hexafluorophosphate de BOP sont ensuite ajoutés. Le pH est maintenu à 10 grâce au DIEA et le mélange est agité pendant deux heures. Lorsque la réaction est achevée (suivi par CCM et/ou CLHP), le dichlorométhane est évaporé et le solide obtenu est repris dans de l'acétate d'éthyle (300 cm3). La phase organique est lavée avec une solution de sulfate de potassium (4 fois 100 cm3), de carbonate de sodium (4 fois 100 cm3), et de chlorure de sodium (4 fois 100 cm3). La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée sous vide. Les produits sont utilisés sans autres purifications. Le produit (f) est obtenu avec un rendement de 75 % après purification sur une colonne de silice (dichlorométhane/méthanol, 8:2).
CCM : Rf- 0,86 (CHCl3/MeOH, 8:2)
CLHP : Rt ≈ 17,44 min, (H2O/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min
[0/100]).
IV) SYNTHÈSE DE [NH2(CH2)3]2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COGlyN[(CH2)I3-CH3]2 (g)
Le produit (f) dont les aminés sont protégées, est introduit dans un ballon équipé d'un barreau magnétique et dissous dans 10 cmJ de méthanol par gramme de produit. Du palladium sur charbon (10 %, lg/g de produit) et du formiate d'ammonium (1 g/g de produit) sont ajoutés à température ambiante. L'hydrogénolyse est suive par CLHP. Après deux heures, la réaction est achevée, le mélange est filtré, et le filtre lavé avec 3 fois 10 cm" de méthanol par gramme de produit. De l'eau bi-distillée est ajoutée et la solution est congelée et lyophilisée, ou bien le filtrat est concentré à sec et le solide est repris dans de l'acétate d'éthyle (300 cm3). La phase organique est lavée par une solution de carbonate de sodium (2 fois 100 cm3), et une solution de chlorure de sodium (2 fois 100 cm3), puis elle est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée sous vide. Les produits sont analysés par CLHP et sont utilisés sans autres purifications. Le produit (g) est obtenu avec un rendement de 40 % par rapport au produit (f). CLHP : Rt = 9,62 min, (H2O/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]). 39
MH+ : 795.
V) SYNTHÈSE DU COMPOSÉ (4) le produit (g) qui contient l'amine primaire à modifier (1 mmol/amine) est solubilisé dans du dichlorométhane (10 cm3), puis on ajoute de l'hydroiodure de 2-méthylthio imidazoline (1,2 mmol/amine) et de la triéthylamine (1,3 mmol/amine). Le mélange est agité à température ambiante (20 °C) jusqu'à l'arrêt du dégagement de sulfure de méthyle. A la fin de la réaction (suivie par CLHP), le dichlorométhane est évaporé sous vide.
Le produit obtenu, dont les aminés sont protégées par des groupements Boc, (1 mmol) est introduit dans un ballon équipé d'un barreau magnétique. 30 cm d'acide trifluoroacétique à 4°C sont ajoutés, puis la solution est agitée pendant une heure.
Lorsque la réaction est achevée (suivi par CCM et/ou CLHP), l'acide trifluoroacétique est évaporé sous vide puis le produit est séché par coévaporation avec 3 fois 30 cm d'éther éthylique. Le produit obtenu est purifié par CLHP préparative et les fractions analysées par
CLHP. On obtient ainsi le composé (4) selon la présente invention avec un rendement de 34 %.
CLHP : Rt = 10,07 min, (H2O/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min
[0/100]). Spectre de R M N ]H (400 MHz, (CD3)2SO d6 à une température de 383K, d en ppm) : 0,92 (t, J = 7 Hz, 6H : CH3 des chaînes grasses) ; de 1,25 à 1,45 (mt, 44H :
(CH2)U centraux des chaînes grasses) ; 1,57 (mt, 4H : 1 CH2 de chaque chaîne grasse)
; de 1,70 à 1,90 (mt, 6H : CH2 central des propyles) ; de 2,50 à 3,40 (mt, 16H : les 2
NCH2 des propyles et les NCH2 des chaînes grasses) ; 3,68 (s, 8H : les 2 NCH2CH2N) ; 3,72 (s large, 2H : NCH2CON) ; 4,06 (s, 2H : CONCH2CON du glycyle).
MH+ : 831
Exemple 5 : Synthèse du composé (5) : (N-ditétradécylcarbamoylméthyl-2-{3-[3- ( 1 ,4, 5, 6-tétrahydropyrimidin-2-ylamino)-propylamino] propylamino } -acetamide) par la méthode de synthèse de « briques ». 40
I) SYNTHÈSE DU BOC-GLY-DITÉTRADÉCYLAMINE (a) On opère de la même façon que dans l'exemple précédent. Le produit (a) est obtenu avec un rendement de 93 %.
CCM : Rf = 0,9 (CHCl3/MeOH, 9: 1) MH+ : 567
II) SYNTHÈSE DE Z-NH(CH2)3-N-Boc-(CH2)3-N-Boc-CH2-COOH (b)
1) Synthèse de NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH (c)
On opère de la même façon que précédemment dans l'exemple 4. Le produit (c) est obtenu avec un rendement de 98 %. CCM : Rf = 0,66 (CHCl3/MeOH, 8:2)
MH+ : 229
2) Synthèse de NH2-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH (d) Le produit (d) est obtenu de la même façon que précédemment dans l'exemple 4. CCM : Rf = 0,12 (CHCl3/MeOH, 6:4) MH+ : 233
3) Synthèse de NC(CH2)2-N-Boc-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH (e) Dans un ballon, le produit (d) (0,05 mol) et de la soude (0, 1 mol) sont solubilisés dans 150 cmJ d'eau. La solution est refroidie dans un bain de glace. Sous vive agitation, on coule lentement de l'acrylonitrile (0,05 mol) en gardant la température de la masse inférieure à 20°C. Le mélange de réaction est maintenu une nuit à température ambiante (20°C).
Le solvant est évaporé sous vide, puis le mélange est acidifié à pH 3 avec une solution de sulfate de potassium. Ce qui est insoluble est extrait avec de l'acétate d'éthyle (3 fois 200 cm3), puis lavé avec une solution de chlorure de sodium (2 fois 100 cm3). La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, puis filtrée et évaporée sous vide. Le produit obtenu est éventuellement purifié sur une colonne de silice.
Le produit obtenu (0, 1 mol/amine) est solubilisé dans de la soude IN (200 cm3/amine) et du dioxane (200 cm"'). La solution est agitée dans un bain de glace, puis on ajoute goutte à goutte une solution de (Boc)2O ou de p- 41
chlorobenzyloxycarbonyl (0,14 mol/amine) dans 200 cm3 de dioxane Le pH est maintenu à une valeur supérieure à 9 Puis, le mélange est agité à température ambiante (20°C) pendant une nuit Le dioxane est évaporé sous vide, puis on acidifie le mélange à pH 3 à l'aide d'une solution de sulfate de potassium Ce qui est insoluble est extrait avec de l'acétate d'éthyle (3 fois 100 cm") puis lavé avec une solution dechlorure de sodium (2 fois 100 cm3) La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium^ filtrée et évaporée sous vide Les produits sont analysés par CCM et/ou CLHP
Le produit (e) est ainsi obtnu avec un rendement est de 93 % CCM Rf= 0,75 (CHCh/MeOH, 8 2)
MH+ 386 4) Synthèse de Z-NH-(CH2)3-N-Boc-(CH2)3-N-Boc-CH2-COOH (b)
Dans un autoclave en inox de 1 litre, on introduit le produit (e) (50 mmol) On prépare en même temps dans un bêcher une solution de 10 cm3 d'éthanol (95 %) et de 3,3 g de soude (80 mol) Lorsque la soude est dissoute, on introduit cette solution dans l'autoclave Un courant d'azote est passé dans l'autoclave et on introduit 2 cm" de Nickel de Raney sur charbon L'autoclave est fermé La pression initiale d'hydrogénation est de 52 bar environ, et elle descend à 48,5 bar environ en une nuit à température ambiante (20°C) La suspension est filtrée sur papier, le filtre est lavé avec de l'éthanol (4 fois 25 cm3), et les filtrats sont concentrés à sec sous vide On obtient un solide blanc qui est utilisé sans autres purifications après une analyse CCM CCM Rf = 0,14 (CHCl3/MeOH, 6 4)
Le produit obtenu (0, 1 mol amine) est solubilisé dans de la soude IN (200 cm3/amine) et du dioxane (200 cm3) La solution est agitée dans un bain de glace, puis on ajoute goutte à goutte une solution p-chlorobenzyloxycarbonyle (0,14 mol amine) dans 200 cm3 de dioxane Le pH est maintenu à une valeur supérieure à 9 Puis, le mélange est agité à température ambiante (20°C) pendant une nuit Le dioxane est évaporé sous vide, puis on acidifie le mélange à pH 3 à l'aide d'une solution de sulfate de potassium Ce qui est insoluble est extrait avec 42
de l'acétate d'éthyle (3 fois 100 cm") puis lavé avec une solution de chlorure de sodium (2 fois 100 cmJ). La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium> filtrée et évaporée sous vide. Le produit obtenu est purifié sur une colonne de silice (dichlorométhane/méthanol, 9: 1). Les produits sont analysés par CCM et/ou CLHP. Le produit (b) est obtenu avec un rendement de 32 % par rapport au produit (d). CCM : Rf = 0,63 (CHCl3/MeOH, 9: 1) MH+ : 523 III) SYNTHÈSE DU 2-méthylsulfanyl-l,4,5,6-tetrahydropyrimidine (f) Dans un ballon sous agitation et courant d'azote, le 3,4,5,6-tétrahydro-2- pyrimidinethiol (0,0103 mol) est chargé, et 5 cm3 de méthanol et 0,65 cm"' d'iodure de méthyle (0,0105 mol) sont ajoutés. Le mélange est porté au reflux durant 1 heure puis est laissé à refroidir à température ambiante (20°C). Le produit est précipité par ajout de 5 cm3 d'éther éthylique. Le précipité est filtré puis lavé à l'éther éthylique. Le produit est ensuite séché une nuit sous une pression de 34 mbar.
On obtient 1,5 g (0,0041 mol) de produit (VI), soit une rendement de 40 %. CCM : Rf = 0,25 (CHCl3/MeOH, 9: 1) MH+ : 131
d) SYNTHÈSE DE Z-NH(CH2)3-N-Boc(CH2)3-N-Boc-CH2-COGlyN[(CH2)13-CH3]2 (g)
Le produit (a) dont les aminés sont protégées par des groupements Boc (1 mmol) est introduit dans un ballon équipé d'un barreau magnétique. 30 cm3 d'acide trifluoroacétique à 4°C sont ajoutés, puis la solution est agitée pendant une heure. Lorsque la réaction est achevée (suivi par CCM et/ou CLHP), l'acide trifluoroacétique est évaporé sous vide puis le produit obtenu est séché par coévaporation avec 3 fois 30 cm3 d'éther éthylique.
CLHP : Rt = 12,86 min, (H2O/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]).
Le produit obtenu (10 mmol) et le produit (b) (10 mmol) sont introduit dans un ballon de 250 cm3. Du dichlorométhane (100 cm3) est ajouté et le mélange est agité jusqu'à 43
dissolution complète. 30 mmol de DIEA et 11 mmol de BOP sont ensuite ajoutés. Le pH est maintenu à 10 grâce au DIEA et le mélange est agité pendant deux heures. Lorsque la réaction est achevée (suivi par CCM et/ou CLHP), le dichlorométhane est évaporé et le solide obtenu est repris dans de l'acétate d'éthyle (300 cm3). La phase organique est lavée avec une solution de sulfate de potassium (4 fois 100 cm3), de carbonate de sodium (4 fois 100 cm3), et de chlorure de sodium (4 fois 100 cm3). La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée sous vide. Les produits sont utilisés sans autres purifications.
Après purification sur colonne de silice (dichlorométhane/méthanol, 8:2), on obtient le produit (g) avec un rendement de 85%. CCM : Rf = 0,9 (CHCl3/MeOH, 9: 1)
CLHP : Rt = 19,79in, (H2O/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]).
V) SYNTHÈSE DE NH2(CH2)3]2-N-Boc-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COGlyN[(CH2)13- CH3]2 (h)
Le produit (g) est introduit dans un ballon équipé d'un barreau magnétique et dissous dans 10 cm' de méthanol/g de produit. Du palladium sur charbon (10 %, lg/g de produit) et du formiate d'ammonium (1 g/g de produit) sont ajoutés à température ambiante (20°C). L'hydrogénolyse est suive par CLHP. Après deux heures, la réaction est achevée, le mélange est filtré, et le filtre lavé avec 3 fois 10 cm3 de méthanol/g de produit. De l'eau bi-distillée est ajoutée, et la solution est congelée et lyophilisée, ou bien le filtrat est concentré à sec et le solide est repris dans de l'acétate d'éthyle (300 cm3). La phase organique est lavée par une solution de carbonate de sodium (2 fois 100 cm3), et une solution de chlorure de sodium (2 fois 100 cm3), puis elle est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée sous vide. Les produits sont analysés par CLHP et sont utilisés sans autres purifications. Le produit (h) est obtenu avec un rendements de 93 % par rapport au produit (g). CCM : Rf = 0,42 (CHCl3/MeOH, 6:4) CLHP : Rt = 14,66 min, (H2O/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]). 44
MH+ : 838
VI) SYNTHESE DU COMPOSÉ (5)
Le produit (h) contenant l'amine primaire à modifier (1 mmol/amine) est solubilisé dans du dichlorométhane (10 cmJ), puis on ajoute le produit (f) (1,2 mmol/amine) et la triéthylamine (1,3 mmol/amine). Le mélange est agité à température ambiante (20°C) jusqu'à l'arrêt du dégagement de sulfure de méthyle. A la fin de la réaction (suivie par CLHP), le dichlorométhane est évaporé sous vide.
Le produit obtenu est purifié par CLHP préparative et les fractions analysées par CLHP. Le composé (5) est ainsi obtenu avec un rendement de 38 %. CLHP : Rt = 8,42 min, (H2O/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]).
Spectre de R M N lU (400 MHz, (CD3)2SO d6, δ en ppm) : 0,86 (t, J = 7 Hz, 6H : CH3 des chaînes grasses) ; de 1, 10 à 1,35 (mt, 44H : (CH2)π centraux des chaînes grasses) ; 1,44 et 1,53 (2 mts, 2H chacun : 1 CH2 de chaque chaîne grasse) ; de 1,80 à 2,00 (mt, 6H : CH2 central des propyles et CH2 de la 1,4,5,6-tetrahydro-pyrimidine) ; de 2,80 à 3,10 (mt, 10H : NCH2 des propyles et NCH2 de la 1,4,5,6-tetrahydro- pyrimidine) ; de 3,15 à 3,45 (mt : les 6H correspondant au =NCH2 de la 1,4,5,6- tetrahydro-pyrimidine et aux NCH2 des chaînes grasses) ; 3,81 (mf, 2H : NCH2CON) ; 4,04 (d, J = 5 Hz, 2H : CONCH2CON du glycyle) ; 7,89 - 8,62 - 8,75 et 9,01 (4 mfs, 8H en totalité : les échangeables et OH des CF3COOH). MH+ : 720
Exemple 6 : Synthèse du composé (6) : (N-dioctadécylcarbamoylméthyl-2-{3-[3- (1,4, 5 ,6-tétrahydropyrimidin-2-ylamino)-propylamino] propylamino } -acetamide) par la méthode de synthèse de « briques ». I) SYNTHÈSE DU BOC-GLY-DITÉTRADÉCYLAMINE (a)
On opère de la même façon que dans l'exemple précédent. Le produit (a) est obtenu avec un rendement de 93 %. CCM : Rf = 0,9 (CHCl3/MeOH, 9: 1) MH+ : 567 II) SYNTHÈSE DE Z-NH(CH2)3-N-Boc-(CH2)3-N-Boc-CH2-COOH (b) 45
1) Synthèse de NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH (c)
On opère de la même façon que précédemment dans l'exemple 5. Le produit (c) est obtenu avec un rendement de 98 %. CCM : Rf = 0,66 (CHCl3/MeOH, 8:2) MH+ : 229
2) Synthèse de NH2-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH (d) Le produit (d) est obtenu de la même façon que précédemment dans l'exemple 5. CCM : Rf = 0,12 (CHCl3/MeOH, 6:4)
MH+ : 233 3) Synthèse de NC(CH2)2-N-Boc-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH (e)
On opère de la même façon que précédemment dans l'exemple 5. Le produit (e) est ainsi obtenu avec un rendement est de 93 %.
CCM : Rf ≈ 0,75 (CHCK/MeOH, 8:2)
MH+ : 386 4) Synthèse de Z-NH-(CH2)3-N-Boc-(CH2)3-N-Boc-CH2-COOH (b)
On opère de la même façon que précédemment dans l'exemple 5. On obtient un solide blanc qui est utilisé sans autres purifications après une analyse CCM.
CCM : Rf = 0,14 (CHCl3/MeOH, 6:4)
Le produit obtenu est utilisé de la même façon que précédemment afin de protéger l'amine terminale par un groupement benzyloxycarbonyle. Le produit
(b) est ainsi obtenu avec un rendement de 32 % par rapport au produit (d). CCM : Rf = 0,63 (CHCl3/MeOH, 9: 1) MH+ : 523
III) SYNTHÈSE DU 2-méthylsulfanyl-l,4,5,6-tetrahydropyrimidine (f) On opère de la même façon que précédemment dans l'exemple 5. On obtient ainsi
1,5 g (0,0041 mol) de produit (f), soit un rendement de 40 %. CCM : Rf = 0,25 (CHCl3/MeOH, 9: 1) MH+ : 131
IV) SYNTHÈSE DE Z-NH(CH2)3-N-Boc(CH2)3-N-Boc-CH2-COGlyN[(CH2)I7-CH3]2 (g) 46
On opère de la même façon que précédemment dans l'exemple 5. On obtient ainsi le produit (a) dont les groupements Boc ont été clivés.
CLHP : Rt = 19,44 min, (H2O/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min
[0/100]). Ce produit obtenu est utilisé de la même façon avec le produit (b) que précédemment dans l'exemple 5. Après purification sur colonne de silice (dichlorométhane/méthanol, 8:2), on obtient le produit (g) avec un rendement de 84 %. CCM : Rf= 0,9 (CHCl3/MeOH, 9: 1)
CLHP : Rt = 23,95 min., (H2O/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]).
V) SYNTHÈSE DE NH2(CH2)3]2-N-Boc-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COGlyN[(CH2)ι7- CH3]2 (h) On opère de la même façon que précédemment avec l'exemple 5. Le produit (h) est obtenu avec un rendements de 73 % par rapport au produit (g). CCM : Rf = 0,28 (CHCl3/MeOH, 6:4)
CLHP : Rt = 20,59 min, (H2O/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min
[0/100]).
MH+ : 838
VI) SYNTHÈSE DU COMPOSÉ (6) On opère de la même façon que précédemment à l'exemple 5. Le composé (6) est ainsi obtenu avec un rendement de 68 %.
CLHP : Rt = 15,83 min, (H2O/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min
[0/100]).
Spectre de R M N 1H (500 MHz, (CD3)2SO d6, δ en ppm) : 0,88 (t, J = 7 Hz, 6H : CH3 des chaînes grasses) ; de 1,15 à 1,35 (mt, 60H : (CH2)i5 centraux des chaînes grasses) ; 1,46 et 1,54 (2 mts, 2H chacun : 1 CH2 de chaque chaîne grasse) ; de 1,80 à
2,00 (mt, 6H : CH2 central des propyles et CH2 de la 1,4,5,6-tetrahydro-pyrimidine) ; de 2,85 à 3,05 (mt, 10H : NCH2 des propyles et NCH2 de la 1,4,5,6-tetrahydro- pyrimidine) ; de 3,15 à 3,45 (mt : les 6H correspondant au =NCH2 de la 1,4,5,6- tetrahydro-pyrimidine et aux NCH2 des chaînes grasses) ; 3,81 (mf, 2H : 47
NCH2CON) ; 4,04 (d, J = 5 Hz, 2H : CONCH2CON du glycyle) ; 7,88 - 8,61 - 8,74 et 8,99 (4 mfs, 8H en totalité : les échangeables et OH des CF3COOH).
MH+ : 832
B\ UTILISATION DES AGENTS DE TRANSFECTION SELON L'INVENTION
Exemple 7 : préparation de complexes nucléolipidiques
Cet exemple illustre la préparation de complexes nucléolipidiques selon l'invention.
Le composé utilisé dans cet exemple est le composé (1) en solution dans du chloroforme. Des quantités de 10 nmoles de composé (1) (soit 11,8 μg) par μg d'ADN ont été utilisées. Dans certains cas, un co-lipide neutre, Cholestérol ou DOPE, est préalablement mélangé au composé. Un film lipidique fin se forme lorsqu'on évapore le chloroforme à l'aide d'un flux léger d'argon, puis il est réhydraté dans un mélange de dextrose 5% et de chlorure de sodium 20 mM, pendant toute une nuit, à 4°C. Les échantillons sont ensuite traités aux ultrasons pendant 5 minutes, chauffés à 65°C pendant 30 minutes, et enfin traités à nouveau aux ultrasons pendant 5 minutes. On obtient ainsi des suspensions lipidiques qui sont stockées à 4°C jusqu'à leur utilisation.
L'ADN utilisé est le plasmide pXL2774 (figure 2) en solution dans un mélange de dextrose 5% et de chlorure de sodium 20 mM à une concentration de 0,5 mg/ml ou 1,0 mg/ml. Le plasmide pXL2774 possède les caractéristiques suivantes : - niveau d'endotoxines inférieur à 50 EU/mg,
- Taux d'ADN superenroulé supérieur à 60%,
- contenu d'ARN, c'est-à-dire d'ARNm, d'ARNt et d'ARN ribosomique, (déterminé par HPLC) inférieur à 5%,
- taux d'ADN chromosomal inférieur à 1%, - contenu protéique inférieur à 1%,
- osmolarité inférieure à 15 mosmoles/kg.
On prépare les complexes nucléolipidiques selon l'invention en mélangeant rapidement des volumes égaux de solution d'ADN et de suspension lipidique telles que 48
décrites ci-dessus La quantité de composé complexé à l'ADN varie de 0,5 nmoles/μg d'ADN à 12 nmoles/μg d'ADN.
Exemple 8 : comportement des complexes formés à différent rapport de charee
Cet exemple illustre le comportement des complexes nucléolipidiques selon l'invention à différents rapport de charge . L'impact de l'ajout d'un co-lipide neutre est également illustré
La taille des complexes a tout d'abord été analysée en mesurant le diamètre hydrodynamique par diffusion dynamique de la lumière (Dynamic Laser Light Scattering) à l'aide d'un appareil Coulter N4plus les échantillons sont dilués 20 fois dans une solution contenant 5% de dextrose et 20 mM de chlorure de sodium pour éviter les diffusions multiples L'effet du groupement cycloamidine, de la composition lipidique, et du rapport de charge sur la taille des complexes nucléolipidiques selon l'invention a ainsi été étudié
On distingue trois phases possibles lorsqu'on augmente le rapport de charge entre le composé (1) selon l'invention et l'ADN Ces trois phases déterminent le potentiel thérapeutique du composé (1) La figure 3 illustre ces 3 phases pour le composé (1) On peut observer le même comportement pour d'autres composés selon l'invention
A faible rapport de charge, l'ADN n'est pas saturé par le composé (1) Il reste encore de l'ADN nu, et les complexes sont globalement chargés négativement Les particules sont de petite taille (entre 100 et 300 nm). Cette phase est appelée « Phase
A »
Le fait que l'ADN ne soit pas complètement saturé par le composé (1) signifie que l'ADN n'est pas complètement protégé par lui L'ADN peut donc être soumis aux dégradations par les enzymes (DNAases) Par ailleurs, les complexes étant globalement négatifs, le passage de la membrane cellulaires est difficile Pour ces raisons, les complexes nucléolipidiques de la phase A sont d'une efficacité beaucoup moins grande en transfection 49
A rapport de charge intermédiaire, l'ADN est complètement saturé par le composé (1), et les complexes sont globalement neutres ou légèrement positifs. Cette phase est instable car les répulsions ioniques sont minimales et un phénomène de « crosslinking » peut se produire. La taille des particules est bien au dessus de la limite de détection par diffusion dynamique de la lumière (très supérieure à 3 μm). Cette phase instable est appelée « phase B ».
Une telle taille de complexes n'est pas adaptée pour des utilisations en injection. Cependant, cela ne signifie pas pour autant que les complexes soient inactifs dans la phase B, mais ils sont seulement sous une formulation qui n'est pas appropriée pour leur injection dans un but pharmaceutique.
A rapport de charge relativement élevé, l'ADN est sur-saturé par le composé (1), et les complexes sont globalement positifs. Du fait des fortes répulsions entre les charges positives, cette phase est stable. Elle est désignée sous le nom de « phase C ». Contrairement à la phase A, les complexes nucléolipidiques sont sous une forme telle que l'ADN est très bien protégé vis-à-vis des enzymes, et leur charge globalement positive facilite le passage de la membrane cellulaire de nature anionique. Les complexes de la phase C sont donc particulièrement adaptés à une utilisation pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules.
En plus du groupement cycloamidine du composé selon l'invention, l'utilisation d'un co-lipide neutre a un fort impact sur la stabilité des complexes, comme cela est illustré figure 3. Les co-lipides ajoutés sont soit du DOPE (lipide cationique/DOPE = 3/2), soit du cholestérol (lipide cationique /cholestérol = 3/1). En général, l'ajout du co-lipide neutre augmente l'instabilité des complexes, ce qui entraîne l'augmentation de la quantité de composé requise pour atteindre la phase C. Ceci est très clairement illustré à la figure 3 lorsqu'on compare le rapport de charge auquel la phase C est atteinte en présence et en l'absence de co-lipide.
Il faut noter que les valeurs du rapport de charge qui délimitent les trois phases A, B et C dépendent du composé utilisé. Ainsi, ces valeurs peuvent varier très fortement d'un composé à l'autre. 50
Enfin, l'affinité du composé vis-à-vis de l'ADN en fonction du rapport de charge a été étudiée. Pour cela, la réduction de fluorescence après ajout de 3 μg de bromure d'éthidium (EtBr) a été mesurée. En effet, la substitution du bromure d'éthidium de l'ADN par le composé est une indication de liaison à l'ADN. La formulation utilisée est diluées 20 fois jusqu'à une concentration finale de 25 μg d'ADN/ml. La fluorescence relative mesurée pour l'ADN nu est définie comme étant 100%). Le taux de liaison avec le composé (1) est représenté par la réduction de la fluorescence relative de l'échantillon. La figure 3 montre que la fluorescence diminue quand le rapport de charge augmente, ce qui signifie qu'une plus grande quantité de composé (1) est disponible pour se lier à l'ADN (plus la fluorescence décroît, plus une grande quantité de composé se lie à l'ADN jusqu'à atteindre la saturation).
De cette façon, il a été ainsi montré que l'affinité du composé (1) selon l'invention pour l'ADN est déterminée par le groupement cycloamidine, mais pas par l'addition d'un co-lipide.
Exemple 9 ; transfection in vitro avec le composé (1)
Cet exemple illustre la capacité du composé (1) selon l'invention à transfecter l'ADN dans les cellules in vitro, comparativement à l'ADN non-formulé.
Des microplaques de 24 puits sont ensemencées avec 60000 cellules HeLa (ATCC) par puit, et transfectées 24 heures plus tard. Des complexes contenant 1 μg d'ADN sont dilués dans 0,5 ml de milieu de culture DMEM (Gibco/BRL) en l'absence de sérum, puis ajoutés dans chaque puit. Les cellules sont incubées à 37°C pendant 4 heures. Le milieu contenant les complexes est ensuite enlevé et remplacé par un mélange de DMEM et de 10% de sérum de veau foetal. Puis, les cellules sont à nouveau mises en culture pendant 24 heures. Enfin, les cellules sont lysées et testées en utilisant un kit de test de luciférase (Promega) et un luminomètre Dynex MLX.
Les résultats indiqués à la figure 4 soulignent la différence entre les performances de l'ADN nu par rapport aux complexes composé (1)/ADN de l'invention totalement saturés : aucune activité luciférase n'a pu être détectée (sensibilité de l'appareil inférieure à 1 pg par puit) après transfection in vitro d'ADN 51
nu, alors que l'activité de transfert de gène des complexes selon l'invention varie de 200 pg/puit à 8000 pg/puit.
Cet exemple montre donc clairement l'utilisation avantageuse du composé (1) selon l'invention pour la transfection des cellules in vitro.
Exemple 10 : transfection in vitro avec les composés (3), (5) et (6)
Cet exemple illustre la capacité des composés (3), (5) et (6) selon l'invention à transfecter l'ADN dans les cellules in vitro, comparativement à l'ADN non-formulé.
La transfection est effectuée selon le protocole de l'exemple 9 précédent, dans des cellules HeLa. Les résultats sont illustrés aux figures 5, 6 et 7. On observe ainsi que ces 3 composés présentent un bon niveau de transfection in vitro.
Exemple 11 : transfection in vivo du composé (1)
Cet exemple illustre la capacité du composé (1) selon l'invention à transfecter l'ADN dans les cellules in vivo, comparativement à l'ADN non-formulé et au lipide A de formule condensée NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2),7CH3]2 décrit dans la demande WO 97/18185 et dont la structure est représentée représenté à la figure 1.
Le transfert de gène in vivo a été effectué sur des souris Balb/C par administration intramusculaire et intraveineuse. Les formulations qui ont été comparées sont des formulations d'ADN nu, des formulations contenant le lipide A, ou des formulations contenant le composé (1) selon l'invention.
Dans le cas des injections intramusculaires, chaque souris a reçu 30 μl de formulation contenant 15 μg d'ADN dans le muscle antérieur du tibia. Les tissus sont récupérés 7 jours après l'injection, ils sont congelés et stockés à -80°C en attendant d'effectuer les tests d'activité luciférase. Les mesures d'activité luciférase se font comme dans l'exemple 8.
Dans le cas des injections par voie intraveineuse, chaque souris a reçu 200 μl de formulation contenant 50 μg d'ADN. Les tissus sont récupérés dans ce cas 24 heures après l'injection, puis congelés et stockés de la même façon que précédemment. 52
Les résultats de transfert de gène in vivo sont présentés figure 8 et figure 9. Le rapport entre le composé (1) et l'ADN est de 10 nmoles/μg d'ADN. Le rapport entre le lipide A et l'ADN est de 4 nmoles/μg d'ADN.
La figure 8 illustre l'activité in vivo dans le muscle du composé (1) selon l'invention comparativement à l'ADN nu et au lipide A. On constate que les niveaux d'activité luciférase sont équivalents entre l'ADN nu et le composé (1), ce dernier présentant en outre une activité très améliorée par rapport au lipide A. Les mécanismes de transfert impliqués semblent différents entre l'ADN nu et l'utilisation du composé (1) selon la présente invention. En effet, les complexes selon l'invention utilisés ne contiennent pas d'ADN libre (phase C) et de plus, leurs résultats in vitro sont très supérieurs à ceux de l'ADN nu.
La figure 9 compare les activité du composé (1) selon l'invention, de l'ADN nu et du lipide A, par voie intraveineuse et par voie intramusculaire.
On constate que l'efficacité de transfection est à peu près équivalente par voie intraveineuse pour le lipide A et pour le composé (1). Par contre, par voie intramusculaire, l'efficacité de transfection du composé (1) selon l'invention est très nettement supérieure à celle du limide A.
Par rapport à l'ADN nu, le composé (1) présente une transfection par voie intraveineuse, en plus de la transfection au moins équivalente par voie intramusculaire. II apparaît donc que l'efficacité de transfert de l'acide nucléique in vivo avec le composé (1) selon l'invention est globalement supérieure à celle avec le lipide A qui est un lipide cationique connu et celle de l'ADN non-formulé.
Enfin, il apparait que les complexes selon l'invention possèdent l'avantage, par rapport à la transfection d'ADN nu, de protéger l'ADN des dégradations par les nucléases, contribuant ainsi à une amélioration significative de la stabilité des formulations. Les composés de la présente invention peuvent être également utilisés pour protéger l'ADN des détériorations au cours de la lyophilisation, améliorant là encore la stabilité des formulations. 53
Exemple 12 : transfection in vivo des composés (5) et (6)
Cet exemple illustre la capacité des composés (5) et (6) à transfecter de l'acide nucléique m vivo de façon efficace
Le même protocole qu'à l'exemple précédent est mis en oeuvre La figure 10 montre que le composé (5) et le composé (6), formulés dans un rapport de charges 0,25 1 avec l'ADN sans co-lipide, présentent un niveau de transfection in vivo supérieur ou égal à l'ADN nu 48 heures après injection en i m
Le tableau suivant donne les résultats obtenus avec les composes (5) et (6) dans différentes formulations
Rapport de
RLU/ voie
Compose charges Co-lipide poumon pg/poumon d'administration composé/ ADN
Composé (5) 6/1 DOPE (1.1) 254,9 1611,3 i v.
Composé (5) 8/1 DOPE (l 1) 535,2 3558,1 i v
Composé (5) 0,5/1 Chol (3 1) 209,6 1330,5 i.m
Composé (5) 0,5/1 DOPE (l 1) 155,8 974,6 i m
Composé (6) 6/1 - 175, 1 1098,7 i v
Composé (6) 5/1 DOPE (l 1) 407,7 2700,8 i v
Composé (6) 0,5/1 DOPE (l 1) 1768 ,7 13005,4 i m

Claims

54REVENDICATIONS
1. Composés, sous forme D, L ou DL, ainsi que ses sels, de formule générale (I) :
CA — Rep R (I) pour laquelle : Φ CA représente un groupement cycloamidine et ses formes mésomères de formule générale (II) :
Z
w
I — \ R, (II)
pour laquelle :
• m, et n sont des entiers indépendants l'un de l'autre compris entre 0 et 3 inclus et tels que m+n est supérieur ou égal à 1,
• Ri représente un groupement de formule générale (III) :
"(CH2)-
Jq -(*) (m)
pour laquelle p et q sont des entiers indépendants l'un de l'autre compris entre 0 et 10 inclus, Y représente un groupement carbonyle, amino, méthylamino, ou bien méthylène, Y pouvant avoir des significations différentes au sein des différents groupements [(CH2)P-Y], et (*) représente soit un atome d'hydrogène, soit est le lieu de liaison au groupement Rep, étant entendu que Ri peut être lié à n'importe quel atome de la formule générale (II), y compris Z, et qu'il y a un unique groupe Ri dans la formule (II),
• X représente un groupement NR2 ou bien CHR2, R2 étant soit un atome d'hydrogène soit la liaison au groupe Ri tel que défini précédemment, 55
Le groupement -JJ représente
"W k i
* 1er cas : un groupement de formule générale (IV) :
NH R-N-^W' (IV)
4 4 pour laquelle W' représente CHR'" ou bien NR'", et R" et R'" représentent indépendemment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un méthyle, ou la liaison au groupe Ri tel que défini précédemment, ou bien
* 2eme cas : un groupement de formule générale (V) :
NHR'
N^ v (V)
4 4 pour laquelle W' représente CHR'" ou bien NR'", et R' et R'" représentent indépendemment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un méthyle, ou la liaison au groupe Ri tel que défini précédemment,
® Rep est absent ou est un répartiteur de formule générale (VI) :
O
+v ÇH) Λr- (VI)
R4 R3
dont l'atome d'azote est rattaché aux atomes X, V, W, ou Z ou au substituant Y du groupe Ri selon les cas, et
• t est un entier compris entre 0 et 8 inclus,
• r est un entier compris entre 0 et 10 inclus, r pouvant avoir des significations différentes au sein des différents groupements -NR4-(CH)r-, 56
• R3, qui peut avoir des significations différentes au sein des différents groupements NR4-(CH)rR3, représente un atome d'hydrogène, un groupement méthyle, ou un groupement de formule générale (VII) :
-}-(CH2)^N 4_ :H (VII)
R5 pour laquelle u est un entier compris entre 1 et 10 inclus, s est un entier compris entre 2 et 8 inclus pouvant avoir des significations différentes au sein des différents groupements -(CH2)S-NR5, et R5 est un atome d'hydrogène, un groupement CA tel que définis précédemment étant entendu que les groupements CA sont indépendants les uns des autres et peuvent être différents, ou bien un groupement de formule générale (VII) étant entendu que les groupements de formule générale (VII) sont indépendants les uns des autres et peuvent avoir des significations différentes,
* R4 est défini de la même façon que R3 ou bien représente un groupement CA tel que défini précédemment étant entendu que les groupements CA sont indépendants les uns des autres et peuvent être différents, et
G) R est lié a la fonction carbonyle du groupement Rep de formule générale
(VI), ou bien si Rep est absent R est lié directement au groupement CA, et représente :
* soit un groupement de formule NRÔR pour laquelle RÔ et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical aliphatique saturé ou non, linéaire ou ramifiée, éventuellement fluoré, contenant 1 à 22 atomes de carbone, avec l'un au moins des deux substituants Rό ou R7 différent de l'hydrogène et l'autre contenant entre 10 et 22 atomes de carbone,
* soit un dérivé de stéroïde,
* soit un groupement de formule générale (VIII) :
— {NH (CH2)x-]—Q (VIII) 57
pour laquelle x est un entier compris entre 1 et 8 inclus, y est un entier compris entre 1 et 10 inclus, et soit Q représente un groupement C(O)NR_5R7 pour lequel Rβ et R7 sont définis comme précédemment, soit Q représente un groupement C(O)Rg pour lequel Rg représente un groupement de formule (IX) :
r 6
/N-W?Nγ% IX) ° pour laquelle z est un entier compris entre 2 et 8 inclus, et R9 est un radical aliphatique saturé ou non , éventuellement fluoré, contenant 8 à 22 atomes de carbone, ou un dérivé de stéroïde, et les deux substituants RÔ sont, indépendamment l'un de l'autre, définis comme précédemment, ou bien Rg représente un groupement -O-R9 pour lequel R9 est défini comme ci-dessus.
2. Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce que le groupement Ri est lié soit à Z soit à V d'une part et au groupement Rep d'autre part par l'intermédiaire de Y.
3. Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce que la tête cycloamidine CA de formule (II) comporte 5, 6, 7, ou 8 chaînons.
4. Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce que R3 représente un atome d'hydrogène ou un méthyle et R4 est tel que défini dans la revendication 1, ou bien R3 et R présent dans la formule (VI) représentent des atomes d'hydrogène, ou bien 4 est un atome d'hydrogène et R3 est un groupement de formule (VII) dans laquelle R5 représente un groupement CA
5. Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce que, dans la formule (V), p et q sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi 2, 3 ou 4.
6. Composés selon la revendication 1 caractérisé en ce que les groupements RÔ et R7 sont identiques ou différents et représentent chacun des chaînes aliphatiques saturées ou non, linéaires ou ramifiées, éventuellement fluorées, contenant 10 à 22 atomes de carbone. 9/51581
58
7. Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce que les groupements R et R sont identiques ou différents et représentent chacun des chaînes aliphatiques saturées ou non, linéaires ou ramifiées, éventuellement fluorées, et contenant 12, 14, 16, 17, 18, ou 19 atomes de carbone.
8. Composés selon la revendications 1 caractérisés en ce que lorsque R est un dérivé de stéroïde, ledit dérivé de stéroïde est choisi parmi le cholestérol, le cholestanol, le 3- α-5-cyclo-5-α-cholestan-6-β-ol, l'acide cholique, le cholestérylformiate, le chotestanylformiate, le 3α,5-cyclo-5α-cholestan-6β-yl formiate, la cholestérylamine, la 6-(l,5-diméthylhexyl)-3a,5a-diméthyl-hexadécahydrocyclopenta[a]cyclopropa- [2,3]cyclopenta-[l,2-f]naphta-lèn-10-ylamine, ou la cholestanylamine.
9. Composés selon la revendication 1 de formules
r^
Composé (1)
H H « composé (2)
I — N O
Composé (3) 59
NyNH
H
\— NH
Composé (4)
H H M rVa-
Composé (5)
H N^N. H U
NH K"Y
Composé (6)
10. Procédé de préparation des composés selon les revendications 1 à 9 caractérisé en ce que l'on effectue la synthèse des briques portant la/les fonctions cycloamidine puis l'on greffe ces briques sur des lipides équipés de répartiteurs.
11. Procédé de préparation des composés selon les revendications 1 à 8 caractérisé en ce que l'on effectue la synthèse des lipopolyamines analogues puis l'on effectue la cyclisation en groupements cycloamidine.
12. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé de formule générale (I).
13. Composition selon la revendication 12 caractérisée en ce qu'elle comprend un composé de formule générale (I) et un acide nucléique.
14. Composition selon les revendications 12 ou 13 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un ou plusieurs adjuvants. 60
15 Composition selon la revendications 14 caractérisée en ce que le ou les adjuvants sont un ou plusieurs lipides neutres à deux chaînes grasses
16 Composition selon la revendication 15 caractérisée en ce que les lipides neutres sont des lipides naturels ou synthétiques, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologique, choisis par exemple parmi la dioleoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), l' oléoylpalmitoylphosphatidyléthanol- amine (POPE), les di-stéaroyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivé N-méthylés 1 à 3 fois, les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérebrosides (tels que notamment les galacto- cérebrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines) ou encore les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGMl et GM2)
17 Composition selon la revendication 14 caractérisée en ce que l'adjuvant est un composé intervenant directement ou non au niveau de la condensation de l'acide nucléique
18 Composition selon la revendication 17 caractérisée en ce que ledit adjuvant dérive en tout ou partie d'une protamine, d'une histone, ou d'une nucléoline et/ou de l'un de leurs dérivés, ou bien est constitué, en tout ou partie, de motifs peptidiques (KTPKKAKKP) et/ou (ATPAKKAA), le nombre des motifs pouvant varier entre 2 et 10, et pouvant être répétés de manière continue ou non
19 Composition selon les revendications 12 à 18 caractérisée en ce qu'elle contient en outre un ou plusieurs agents de surface non-ionique(s) en quantité suffisante pour stabiliser la taille des particules de complexes nucléolipidiques
20 Composition selon les revendications 12 à 19 caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable
21 Composition selon les revendications 12 à 19 caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une application sur la peau et/ou les muqueuses 61
22. Composition selon la revendication 13 caractérisée en ce que ledit acide nucléique est un acide désoxyribonucléique ou un acide ribonucléique.
23. Composition selon la revendication 22 caractérisée en ce que ledit acide nucléique comprend une cassette d'expression constituée d'un ou plusieurs gènes d'intérêt thérapeutique sous contrôle d'un ou plusieurs promoteurs et d'un terminateur transcriptionnel actifs dans les cellules cibles.
24. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 9 pour fabriquer un médicament destiné à soigner les maladies.
25. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 9 pour fabriquer un médicament destiné à soigner les maladies par transfert d'acides nucléiques dans les cellules par voie intramusculaire.
26. Méthode de transfert d'acides nucléiques dans les cellules comprenant les étapes suivantes :
(1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un composé de formule générale (I) tel que défini ci-avant, pour former un complexe nucléolipidique, et
(2) la mise en contact des cellules avec le complexe nucléolipidique formé en (1).
27. Méthode de transfert d'acides nucléiques dans les cellules selon la revendication 26 caractérisée en ce que ledit acide nucléique et/ou ledit composé sont préalablement mélangés à un ou plusieurs adjuvants.
28. Méthode de traitement de maladies par administration d'un acide nucléique codant pour une protéine ou pouvant être transcrit en un acide nucléique apte à corriger lesdites maladies, ledit acide nucléique étant associé à un composé de formule générale (I).
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