EA021399B1 - Способ идентификации факторов риска заболеваний - Google Patents

Abstract

Предоставляются способ идентификации генетического варианта, который связан с развитием представляющего интерес состояния (например, болезни Альцгеймера), и идентифицированные таким образом генетические варианты. Также предоставляются способы лечения активным агентом (например, особым активным агентом и/или на ранних сроках жизни) после обнаружения описываемого здесь генетического варианта. В некоторых вариантах осуществления генетический вариант представляет собой делеционный/инсерционный полиморфизм (DIP) гена ТОММ40. Также предоставляются наборы для определения того, подвержен ли субъект увеличенному риску развития болезни Альцгеймера с поздним началом. Кроме того, предоставляются наборы для определения, поддается ли субъект лечению в отношении представляющего интерес состояния активным агентом.

Description

Заявка на данный патент притязает на приоритет предварительной заявки на патент США № 61/088203, поданной 12 августа 2008 г., предварительной заявки на патент США № 61/186673, поданной 12 июня 2009 г., и предварительной заявки на патент США № 61/224647, поданной 10 июля 2009 г., описание каждой из которых включено сюда в целом посредством ссылки.

Область техники

Настоящее изобретение относится к области геномики, генетики, фармакогенетики и биоинформатики, в том числе анализу генома и исследованию вариации в последовательностях ДНК. Настоящее изобретение также относится к исследованиям связи между вариациями в последовательностях ДНК и антиципацией подверженности индивидуума конкретному заболеванию, нарушению или состоянию и/или ответной реакции на конкретное лекарственное средство или лечение.

Предпосылки создания изобретения

Ведется поиск генетических маркеров, связанных со сложными заболеваниями. Продолжаются исследования, основанные на сканировании всего генома с использованием множеств однонуклеотидных полиморфизмов (8ΝΡ), для выделения участка АроЕ в качестве самого важного участка для анализа при изучении болезни Альцгеймера (Сооп е! а1., 1. Сйи. РзусЫайу 68: 613-618 (2007); Ы е! а1., АгсИ. №ито1. 65: 45-53 (2007)).

Ранее была установлена устойчивая связь изоформы АроЕ 4 с увеличенным риском развития болезни Альцгеймера с поздним началом (Рейсак-Уаисе е! а1., Ат. 1. Нит. Ссис1. 48, 1034-1050 (1991); Магйи с1 а1., 2000, патент США № 6027896, выданный Ро5С5 е! а1., патент США № 5716828, выданный Ро5С5 е! а1.). Эта связь является дозозависимой (Уо51и/а\\ц е1 а1., 1994; 8сЬе11еиЬег§, 1995). Другими словами, у носителя двух аллелей АроЕ 4 болезнь Альцгеймера с поздним началом (ЬОАЭ) развивается скорее, чем у носителя только одного аллеля АроЕ 4, и в более раннем возрасте (Сотйет е! а1., Зсюисе 261, 921-3 (1993)).

Тем не менее, аллели Е4 являются причиной наследственной болезни Альцгеймера только в приблизительно 50% случаев. Одним из объяснений является то, что АроЕ 4 служит лишь в качестве суррогатного маркера для чего-либо в неравновесном сцеплении по соседству. Альтернативно, принимая во внимание недавнее обнаружение механистической роли АроЕ 4 в митохондриальной токсичности, негативные эффекты АроЕ 4 могут быть аннулированы или усилены с помощью другого продукта гена, кодируемого по соседству (СИаид е! а1., 2005).

Поскольку имеется также связь статуса АроЕ с риском развития болезни коронарных артерий и, вероятно, также носителем других заболеваний и нарушений, выводы из исследования участка АроЕ не ограничиваются болезнью Альцгеймера, а являются потенциально далеко идущими (МаИ1еу е! а1., Ргос. №11. Асай. 8с1. И8А 103: 5644-5651 (2006)). Более широко, изучение ради хода развития или путей вариантов последовательностей, окружающих гены в неравновесном сцеплении с другими генетическими участками, которые, как известно, вовлечены в ходы развития сложных заболеваний, даст ценную информацию при расшифровке механизмов этих заболеваний.

Краткое изложение сущности изобретения

Здесь предоставляется способ идентификации генетического варианта, который связан с развитием представляющего интерес состояния (например, ранним или поздним началом представляющего интерес заболевания), включающий (а) определение на основе биологических образцов, содержащих ДНК, нуклеотидных последовательностей, которые несет множество являющихся людьми отдельных субъектов в представляющем интерес генетическом локусе, причем субъекты включают как (ί) субъектов, страдающих представляющим интерес состояниям, так и (й) субъектов, не страдающих представляющим интерес состоянием; (Ь) идентификацию генетических вариантов в указанном генетическом локусе на основе нуклеотидных последовательностей, обнаруженных у указанного множества субъектов (например, используя анализ с использованием совмещения множества последовательностей); (с) картирование указанных генетических вариантов посредством построения филогенетического дерева указанных нуклеотидных последовательностей указанных субъектов, при этом указанное дерево включает ветви, которые идентифицируют вариантные изменения между указанными субъектами (например, вариантные изменения в одном и том же цистроне); (й) исследование генетических вариантов, представленных в виде ветвей на указанном дереве, и определение соотношения пораженных и непораженных субъектов для идентификации тех изменений, которые приводят к изменению отношения пораженных субъектов к непораженным субъектам (причем предпочтительно, когда исходной точкой является генетический вариант, представляющий наибольшее число субъектов); а затем (е) идентификацию генетического варианта или группы вариантов (гаплотипа), для которого отношение пораженных субъектов к непораженным субъектам отличается от такового для одного или более соседних вариантов на указанном дереве в значительной степени (например, по крайней мере на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90%) для идентификации, тем самым, генетического варианта, связанного с развитием указанного представляющего интерес состояния.

В некоторых вариантах осуществления все субъекты несут один и тот же известный полиморфизм, который связан с представляющим интерес состоянием.

- 1 021399

В некоторых вариантах осуществления представляющим интерес состоянием является нейродегенеративное заболевание, болезнь обмена веществ (например, дислипидемия), сердечно-сосудистое заболевание, психиатрическое расстройство или рак. В некоторых вариантах осуществления представляющим интерес заболеванием является заболевание, в патогенез которого вовлечен АроЕ и/или ТОММ40.

В некоторых вариантах осуществления представляющее интерес состояние связано с повышенным или пониженным функционированием митохондрий (митохондриальной дисфункцией). В некоторых вариантах осуществления представляющим интерес состоянием является шизофрения. В некоторых вариантах осуществления представляющим интерес состоянием является болезнь коронарных артерий. В некоторых вариантах осуществления представляющим интерес состоянием является сахарный диабет, тип II. В некоторых вариантах осуществления представляющим интерес состоянием является болезнь Паркинсона. В некоторых вариантах осуществления представляющим интерес состоянием является болезнь Альцгеймера.

В некоторых вариантах осуществления фактором риска с известным полиморфизмом является аллель аполипопротеина Е (например, АроЕ 2, АроЕ 3 или АроЕ 4).

В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес генетический локус находится в неравновесном сцеплении с известным полиморфизмом. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес генетический локус находится на одной и той же хромосоме и на расстоянии, составляющем менее 10, 20, 30, 40 или 50 тысяч пар оснований, от известного полиморфизма. В некоторых вариантах осуществления генетическим локусом является ТОММ40.

Также предоставляется способ определения увеличенного риска развития представляющего интерес состояния, включающий (а) определение на основе биологического образца, содержащего ДНК, генетического варианта, идентифицируемого способом любого предшествующего абзаца, который несет отдельный субъект; и затем (Ь) определение того, что субъект подвержен увеличенному риску развития представляющего интерес состояния, когда присутствует генетический вариант.

Кроме того, предоставляется способ определения увеличенного риска развития болезни Альцгеймера у субъекта (например, субъекта, несущего по крайней мере один аллель Аро Е3), включающий (а) определение на основе взятого от субъекта биологического образца, содержащего ДНК, присутствия или отсутствия генетического варианта гена ТОММ40, связанного с увеличенным или уменьшенным риском развития болезни Альцгеймера; и (Ь) определение того, что субъект подвержен увеличенному или уменьшенному риску развития болезни Альцгеймера, когда генетический вариант присутствует или отсутствует.

В некоторых вариантах осуществления определяют, является ли субъект субъектом с генотипом Аро Е2/Е2, Е2/Е3, Е2/Е4, Е3/Е3, Е3/Е4 или Е4/Е4. В некоторых вариантах осуществления определяют, является ли субъект субъектом с генотипом Аро Е3/Е3 или Е3/Е4.

В некоторых вариантах осуществления способ, кроме того, включает стадию (с) введения субъекту активного агента против болезни Альцгеймера в эффективном для лечения количестве после определения того, что субъект подвержен увеличенному риску развития болезни Альцгеймера.

В некоторых вариантах осуществления стадию введения проводят в отношении субъекта в раннем возрасте, когда субъект, как определено по присутствию или отсутствию у него генетического варианта, подвержен увеличенному риску по сравнению с субъектом, у которого генетический вариант не присутствует или отсутствует (например, в случае субъекта с АроЕ 4/4, с началом в возрасте 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 или 53 и постоянно в течение каждого года после этого, а не с началом в возрасте 55 или старше; в случае субъекта с АроЕ 4/3 в возрасте 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 или 58 и постоянно в течение каждого года после этого, а не с началом в возрасте 60 или старше; в случае субъекта с АроЕ 3/3 в возрасте 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 или 63 и постоянно в течение каждого года после этого, а не с началом в возрасте 65 или старше; и в случае субъекта с АроЕ 2/3 субъекта в возрасте 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 или 68 и постоянно в течение каждого года после этого, а не с началом в возрасте 70 или старше).

В некоторых вариантах осуществления активный агент выбирают из группы, состоящей из ингибиторов ацетилхолинэстеразы, антагонистов рецепторов ΝΜΌΑ, агонистов или модуляторов РРАК (активируемых пролифератором пероксисом рецепторов) (например, лекарственных средств классов тиазолидиндионов или глитазара), антител, гибридных белков, терапевтических молекул РНК и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления активным агентом является росиглитазон или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах осуществления генетическим вариантом ТОММ40 является вариант, приведенный в списке в табл. 1, приведенной ниже.

Также предоставляется способ лечения субъекта (например, субъекта, имеющего по крайней мере один аллель АроЕ 3) в отношении болезни Альцгеймера посредством введения субъекту активного агента против болезни Альцгеймера в эффективном для лечения количестве, при этом усовершенствование включает введение активного агента субъекту в раннем возрасте, когда субъект несет генетический вариант гена ТОММ40, связанный с увеличенным риском развития болезни Альцгеймера, по сравнению с соответствующим субъектом, который не несет генетический вариант (например, в случае субъекта с АроЕ 4/4, с началом в возрасте 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 или 53 и постоянно в течение каждого года

- 2 021399 после этого, а не с началом в возрасте 55 или старше; в случае субъекта с АроЕ 4/3 в возрасте 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 или 58 и постоянно в течение каждого года после этого, а не с началом в возрасте 60 или старше; в случае субъекта с АроЕ 3/3 в возрасте 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 или 63 и постоянно в течение каждого года после этого, а не с началом в возрасте 65 или старше; и в случае субъекта с АроЕ 2/3 в возрасте 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 или 68 и постоянно в течение каждого года после этого, а не с началом в возрасте 70 или старше).

В некоторых вариантах осуществления субъект является субъектом с генотипом Аро Е2/Е2, Е2/Е3, Е2/Е4, Е3/Е3, Е3/Е4 или Е4/Е4. В некоторых вариантах осуществления субъект является субъектом с генотипом Аро Е3/Е3 или Е3/Е4.

В некоторых вариантах осуществления активный агент выбирают из группы, состоящей из ингибиторов ацетилхолинэстеразы, антагонистов рецепторов ΝΜΌΆ, агонистов или модуляторов ΡΡΆΚ (например, лекарственных средств классов тиазолидиндионов или глитазара), антител, гибридных белков, терапевтических молекул РНК и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления активным агентом является росиглитазон или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах осуществления генетический вариант гена ТОММ40 представляет собой делеционный/инсерционный полиморфизм (ΌΙΡ). В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является инсерционным полиморфизмом. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является делеционным/инсерционным полиморфизмом поли-Т (например, между 5 и 100, или 10 и 80, или 20 и 50 п.о. поли-Т).

В некоторых вариантах осуществления генетическим вариантом ТОММ40 является вариант, приведенный в списке в табл. 1, приведенной ниже. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является Т810524523, Т810602329 или ΌΙΡ3. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является г§10524523.

Кроме того, предоставляется способ лечения представляющего интерес состояния, связанного с АроЕ и/или ТОММ40, у нуждающегося в этом пациента, включающий стадии (а) определения присутствия или отсутствия генетического варианта, идентифицируемого способом абзаца 1-12, который несет отдельный субъект, для составления генетического профиля пациента; а затем, если профиль служит признаком пациента, чувствительного к активному агенту, (Ь) введения субъекту активного агента в эффективном для лечения количестве для осуществления лечения представляющего интерес состояния.

В некоторых вариантах осуществления активный агент выбирают из группы, состоящей из ингибиторов ацетилхолинэстеразы, антагонистов рецепторов ΝΜΌΆ, агонистов или модуляторов ΡΡΆΚ (например, лекарственных средств классов тиазолидиндионов или глитазара), антител, гибридных белков, терапевтических молекул РНК и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления активным агентом является росиглитазон или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах осуществления генетический вариант гена ТОММ40 представляет собой делеционный/инсерционный полиморфизм (ΌΙΡ). В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является инсерционным полиморфизмом. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является делеционным/инсерционным полиморфизмом поли-Т (например, между 5 и 100, или 10 и 80, или 20 и 50 п.о. поли-Т).

В некоторых вариантах осуществления генетическим вариантом ТОММ40 является вариант, приведенный в списке в таблице 1, приведенной ниже. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является Т810524523, Т810602329 или ΌΙΡ3. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является г§10524523.

Также предоставляется способ лечения болезни Альцгеймера у субъекта, включающий (а) определение на основе взятого от субъекта биологического образца, содержащего ДНК, присутствия или отсутствия генетического варианта гена ТОММ40, связанного с чувствительностью к активному агенту; и, если генетический вариант присутствует, (Ь) введение субъекту активного агента в эффективном для лечения количестве для осуществления лечения болезни Альцгеймера.

В некоторых вариантах осуществления субъект несет по крайней мере один аллель АроЕ 3. В некоторых вариантах осуществления субъект является субъектом с генотипом Аро Е3/Е3 или Е3/Е4.

В некоторых вариантах осуществления активный агент выбирают из группы, состоящей из ингибиторов ацетилхолинэстеразы, антагонистов рецепторов ΝΜΌΆ, агонистов или модуляторов ΡΡΆΚ (например, лекарственных средств классов тиазолидиндионов или глитазара), антител, гибридных белков, терапевтических молекул РНК и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления активным агентом является росиглитазон или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых вариантах осуществления генетический вариант гена ТОММ40 представляет собой делеционный/инсерционный полиморфизм (ΌΙΡ). В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является инсерционным полиморфизмом. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является делеционным/инсерционным полиморфизмом поли-Т (например, между 5 и 100, или 10 и 80, или 20 и 50 п.о. поли-Т).

В некоторых вариантах осуществления генетическим вариантом ТОММ40 является вариант, приведенный в списке в табл. 1, приведенной ниже. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является Т810524523, Т810602329 или ΌΙΡ3. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является г§10524523.

Кроме того, предусматривается применение активного агента против болезни Альцгеймера для

- 3 021399 приготовления лекарственного средства для выполнения способа лечения болезни Альцгеймера в соответствии с приведенными выше абзацами. Также предусматривается применение активного агента против болезни Альцгеймера для выполнения способа лечения болезни Альцгеймера.

Предоставляется способ составления прогноза для пациента, подверженного риску развития болезни Альцгеймера, включающий составление профиля пациента, при этом составление профиля пациента включает определение присутствия или отсутствия по крайней мере одного аллеля АроЕ в биологическом образце пациента и определение присутствия или отсутствия по крайней мере одного делеционного/инсерционного полиморфизма (ΌΙΡ) ТОММ40, локализованного в интроне 6 или интроне 9 гена ТОММ40, а затем трансформирование профиля пациента в прогноз, причем присутствие аллеля АроЕ и присутствие по крайней мере одного ΌΙΡ-полиморфизма ТОММ40 отождествляет пациента с пациентом, подверженным риску развития болезни Альцгеймера.

В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является инсерционным полиморфизмом. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является делеционным/инсерционным полиморфизмом поли-Т (например, между 5 и 100, или 10 и 80, или 20 и 50 п.о. поли-Т).

В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является τδ10524523, т§10602329 или ΌΙΡ3. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является т§10524523.

В некоторых вариантах осуществления способ, кроме того, включает определение того, является ли субъект субъектом с генотипом Аро Е2/Е2, Е2/Е3, Е2/Е4, Е3/Е3, Е3/Е4, Е4/Е4. В некоторых вариантах осуществления субъект является субъектом с генотипом Аро Е3/Е3 или Е3/Е4.

Также предоставляется распределение субъекта в подгруппу клинического испытания терапии для лечения болезни Альцгеймера, включающий определение присутствия или отсутствия по крайней мере одного аллеля АроЕ в биологическом образце пациента и определение присутствия или отсутствия по крайней мере одного делеционного/инсерционного полиморфизма (ΌΙΡ) ТОММ40, локализованного в интроне 6 или интроне 9 гена ТОММ40, причем субъекта распределяют в подгруппу клинического испытания терапии, исходя из присутствия или отсутствия по крайней мере одного аллеля АроЕ и/или ΌΙΡ ТОММ40.

В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является инсерционным полиморфизмом. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является инсерционным полиморфизмом поли-Т (например, между 5 и 100, или 10 и 80, или 20 и 50 п.о. поли-Т).

В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является т§10524523, т§10602329 или ΌΙΡ3. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является т§10524523.

В некоторых вариантах осуществления способ, кроме того, включает определение того, является ли субъект субъектом с генотипом Аро Е2/Е2, Е2/Е3, Е2/Е4, Е3/Е3, Е3/Е4, Е4/Е4. В некоторых вариантах осуществления субъект является субъектом с генотипом Аро Е3/Е3 или Е3/Е4.

Кроме того, предоставляется способ идентификации пациента для клинического испытания лечения болезни Альцгеймера, включающий а) идентификацию пациента, у которого диагностирована болезнь Альцгеймера; и Ь) составление прогноза для пациента, у которого диагностирована болезнь Альцгеймера, включающее составление профиля пациента, при этом составление профиля пациента включает ί) определение присутствия или отсутствия по крайней мере одного аллеля АроЕ в биологическом образце пациента, ίί) определение присутствия или отсутствия по крайней мере одного делеционного/инсерционного полиморфизма (ΌΙΡ) ТОММ40, локализованного в интроне 6 или интроне 9 гена ТОММ40, и ίίί) трансформацию профиля пациента в прогноз, включающий предсказание того, является ли пациент кандидатом на клиническое испытание лечения болезни Альцгеймера.

В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является инсерционным полиморфизмом. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является делеционным/инсерционным полиморфизмом поли-Т (например, между 5 и 100, или 10 и 80, или 20 и 50 п.о. поли-Т).

В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является т§10524523, т§10602329 или ΌΙΡ3. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является т§10524523.

В некоторых вариантах осуществления способ, кроме того, включает определение того, является ли субъект субъектом с генотипом Аро Е2/Е2, Е2/Е3, Е2/Е4, Е3/Е3, Е3/Е4, Е4/Е4. В некоторых вариантах осуществления субъект является субъектом с генотипом Аро Е3/Е3 или Е3/Е4.

Предоставляется набор для определения того, подвержен ли субъект увеличенному риску развития болезни Альцгеймера с поздним началом, включающий (А) по крайней мере один реагент, который специфически детектирует АроЕ 3, АроЕ 4 или АроЕ 2, причем реагент выбирают из группы, состоящей из антител, которые избирательно связываются с АроЕ 3, АроЕ 4 или АроЕ 2, и олигонуклеотидных зондов, которые избирательно связываются с кодирующей их ДНК; (В) по крайней мере один реагент, который специфически детектирует присутствие или отсутствие по крайней мере одного делеционного/инсерционного полиморфизма (ΌΙΡ) ТОММ40, локализованного в интроне 6 или интроне 9 гена ТОММ40; и (С) инструкции в отношении определения того, что субъект подвержен увеличенному риску развития болезни Альцгеймера с поздним началом, посредством (ί) детектирования присутствия или отсутствия изоформы АроЕ у субъекта с помощью по крайней мере одного реагента; (ίί) детектирования присутствия или отсутствия по крайней мере одного делеционного/инсерционного полиморфизма (ΌΙΡ)

- 4 021399

ТОММ40, локализованного в интроне 6 или интроне 9 гена ТОММ40; и (ίίί) установления, подвержен ли субъект увеличенному риску развития болезни Альцгеймера с поздним началом, посредством установления, детектируется ли присутствие изоформы АроЕ и ΌΙΡ ТОММ40 с помощью по крайней мере одного реагента, причем присутствие изоформы АроЕ и ΌΙΡ ТОММ40 указывает на то, что субъект подвержен увеличенному риску развития болезни Альцгеймера с поздним началом.

В некоторых вариантах осуществления по крайней мере один реагент и инструкции упакованы в один контейнер.

В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является инсерционным полиморфизмом. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является делеционным/инсерционным полиморфизмом поли-Т (например, между 5 и 100, или 10 и 80, или 20 и 50 п.о. поли-Т).

В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является Г810524523, Г810602329 или ΌΙΡ3. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является Г810524523.

В некоторых вариантах осуществления стадия определения, кроме того, включает определение того, является ли субъект субъектом с генотипом Аро Е2/Е2, Е2/Е3, Е2/Е4, Е3/Е3, Е3/Е4 или Е4/Е4. В некоторых вариантах осуществления субъект является субъектом с генотипом Аро Е3/Е3 или Е3/Е4.

Предоставляется набор для определения того, поддается ли субъект лечению в отношении представляющего интерес состояния, связанного с АроЕ и/или ТОММ40, активным агентом, включающий:

(A) по крайней мере один реагент, который специфически детектирует АроЕ 3, АроЕ 4 или АроЕ 2, причем реагент выбирают из группы, состоящей из антител, которые избирательно связываются с АроЕ 3, АроЕ 4 или АроЕ 2, и олигонуклеотидных зондов, которые избирательно связываются с кодирующей их ДНК;

(B) по крайней мере один реагент, который специфически детектирует присутствие или отсутствие по крайней мере одного делеционного/инсерционного полиморфизма (ΌΙΡ) ТОММ40, локализованного в интроне 6 или интроне 9 гена ТОММ40; и (C) инструкции в отношении определения того, что субъект поддается лечению в отношении представляющего интерес состояния представляющим интерес активным агентом, посредством (ί) детектирования присутствия или отсутствия изоформы АроЕ у субъекта с помощью по крайней мере одного реагента; (ίί) детектирования присутствия или отсутствия по крайней мере одного делеционного/инсерционного полиморфизма (ΌΙΡ) ТОММ40, локализованного в интроне 6 или интроне 9 гена ТОММ40; и (ίίί) установления, поддается ли субъект лечению, посредством установления, детектируется ли присутствие изоформы АроЕ и ΌΙΡ ТОММ40 с помощью по крайней мере одного реагента, причем присутствие АроЕ и ΌΙΡ ТОММ40 указывает на то, что субъект поддается лечению активным агентом.

В некоторых вариантах осуществления по крайней мере один реагент и инструкции упакованы в один контейнер.

В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является инсерционным полиморфизмом. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является делеционным/инсерционным полиморфизмом поли-Т (например, между 5 и 100, или 10 и 80, или 20 и 50 п.о. поли-Т).

В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является Г810524523, Г810602329 или ΌΙΡ3. В некоторых вариантах осуществления ΌΙΡ является Г810524523.

В некоторых вариантах осуществления стадия определения, кроме того, включает определение того, является ли субъект субъектом с генотипом Аро Е2/Е2, Е2/Е3, Е2/Е4, Е3/Е3, Е3/Е4 или Е4/Е4. В некоторых вариантах осуществления субъект является субъектом с генотипом Аро Е3/Е3 или Е3/Е4.

Будет понятно, что все вышеизложенные варианты осуществления могут быть объединены любым способом и/или в любую комбинацию. Вышеизложенные и другие объекты и аспекты настоящего изобретения объяснены подробнее на чертежах, предоставленных при этом, и в изложенном ниже описании.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена общая блок-схема для идентификации генетического варианта в заранее заданном участке геномной последовательности в представляющем интерес генетическом локусе, который может быть связан с представляющим интерес состоянием, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления.

На фиг. 2 представлен график зависимости среднего возраста возникновения болезни Альцгеймера от наследования пяти распространенных генотипов для АроЕ, представляющий АроЕ 4 в качестве фактора риска развития болезни Альцгеймера (1993).

На фиг. 3 представлены участки А, В и С на хромосоме 19, которые являются приводимыми в качестве примеров генетическими локусами, представляющими интерес. Ген ТОММ40 находится вблизи гена АроЕ и кодирует белок с М.м. 40 кДа, направляемый во внешнюю митохондриальную мембрану. ТОММ40 взаимодействует с АроЕ непосредственно при регуляции импортирования белков в митохондрии, и существующая в настоящее время гипотеза состоит в том, что присутствие особого варианта(ов) ТОММ40 повышает увеличенный риск болезни Альцгеймера, связанный с дозозависимым присутствием аллеля АроЕ 3.

На фиг. 4 демонстрируется, в схематическом виде, карта эволюции участка В, отмеченного на фиг. 3, построенная в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, подробно описанными здесь.

- 5 021399

Каждый горизонтальный эллипс представляет отмеченный вариант последовательности (например, изменение нуклеотида), а размер эллипса отражает его частоту. Каждый вариант называется узлом на дереве, а соединение одного узла с другим узлом с помощью ветви представляет экспериментальное определение двух вариантов в цис-положении, которые несет отдельный субъект.

Фиг. 5 представляет собой блок-схему филогенетического дерева на основе участка В, созданную для ТОММ40, на которой представлены процентные содержания фенотипов для Аро в двух основных группировках, или монофилетических таксонах, вариантов ТОММ40 в этом участке.

Фиг. 6 представляет собой схематическое представление локуса ТОММ40-АроЕ, включающего участок неравновесного сцепления, демонстрирующее гаплотипные блоки и участки, подвергнутые определению первичных последовательностей в предварительном (К1) (23 т.п.о.) и подтверждающем (К2) (10 т.п.о.) исследованиях (компоновка 36.3 ΝΟΒΙ). Участок неравновесного сцепления представлен в отношении данных по карте гаплотипов (набор анализов СЕИ), определения прочных хребетных блоков гаплотипов, значений г² с использованием цветовой гаммы Ό'/ΕΘΌ, представленных различными особенностями линий.

На фиг. 7 представлены изображения филогенетических деревьев с использованием сортировки вариантов. 7А: варианты однонуклеотидных полиморфизмов, монофилетический таксон А в сравнение с монофилетическим таксоном В, Е6-Е10 представляют экзоны ТОММ40, а вертикальные линии показывают приблизительные локализации однонуклеотидных полиморфизмов. Отделение двух основных ветвей имеет прочное подтверждение методом ступенчатого перехода от малых значений к большим и наоборот (973/1000). 7В: полиморфизмы длин гк10524523. Для каждой группы полиморфизмов длин были даны количественные показатели распределения. Несколько длинных гаплотипов, которые образовывали индивидуальные корневые виды на дереве или очень небольшие монофилетические таксоны, находятся в группе, определенной как Остальные.

На фиг. 8 представлены столбиковые диаграммы длины полиморфизма длины гк10524523 с распределением по гаплотипам для АроЕ 3/3 (8А), 3/4 (8В) и 4/4 (8С). N=210 гаплотипов (группы А§).

На фиг. 9 демонстрируется связь между возрастом начала болезни Альцгеймера и длиной полиморфизма гк10524523 для пациентов с началом в возрасте 60-86 лет. На ящиковой диаграмме указаны 95% размах (вертикальные линии), медиана (горизонтальная линия в ящике) и межквартильный размах (ящик).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение подробнее объяснено ниже. Не предполагается, что это описание является полным каталогом всех различных способов возможного осуществления настоящего изобретения или всех признаков, которые могут быть добавлены в настоящее изобретение. Например, признаки, проиллюстрированные по отношению к одному варианту осуществления, могут быть включены в другие варианты осуществления, а признаки, проиллюстрированные по отношению к конкретному варианту осуществления, могут быть удалены из этого варианта осуществления. Кроме того, принимая во внимание настоящее описание, квалифицированным в данной области техники специалистам будут очевидны многочисленные изменения различных вариантов осуществления, предложенных здесь, и добавления к ним, которые не отступают от настоящего изобретения. Следовательно, предполагается, что следующее описание иллюстрирует некоторые конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, и не предполагается, что оно полностью устанавливает все их перестановки, комбинации и изменения.

Предполагается, что используемые в описании настоящего изобретения и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают также формы множественного числа, если контекст ясно не указывает на иное. Так же, как здесь используется, и/или относится к любым и всем возможным комбинациям одного или более перечисленных элементов и охватывает их, а также к отсутствию комбинаций при представлении в альтернативной форме (или).

Настоящее изобретение направлено на способы выявления генетической вариации в представляющих особый интерес участках для сложных заболеваний и нарушений. Оно также относится к обнаружению наиболее информативных генетических маркеров на основе совмещения с касающейся фенотипа информации. В одном варианте осуществления настоящее изобретение может использоваться для локализации генетических маркеров, связанных с подверженностью конкретному заболеванию, нарушению или состоянию. В другом варианте осуществления данные, касающиеся ответной реакции субъекта на являющееся кандидатом лечение или лекарственное средство, могут быть включены в филогенетический анализ для локализации генетических маркеров, связанных с полезной ответной реакцией на это лечение или лекарственное средство (т.е. фармакогенетику). Способы могут применяться к любому множеству данных о генетической вариации из конкретного локуса. См. фиг. 1 ради блок-схемы подхода к обнаружению генетических факторов риска в соответствии с настоящим изобретением.

В одном аспекте анализ генетической вариации основан на данных о вариантах последовательностей. Во втором аспекте структуру выявляют, используя данные о генотипе диплоидного субъекта, избегая, тем самым, необходимости либо в экспериментальном, либо в вычисляемом выведении гаплотипов в качестве составных частей (см., например, патент США № 6027896, выданный Кокек с1 а1.). В другом аспекте настоящий способ можно применять к не охарактеризованной аллельной вариации, которая вы- 6 021399 текает из исследования целевой нуклеиновой кислоты с помощью экспериментальной процедуры, которая обеспечивает регистрацию присутствующей вариации последовательности, но на самом деле не предоставляет полную последовательность. Исходная структура генетической вариации также применима для выведения гаплотипов в качестве составных частей из данных о генотипе диплоидного субъекта.

Предпочитается и предусматривается, что(бы) описанные здесь способы используются (использовались) в сочетании с другой клинической диагностической информацией, известной или описанной в данной области техники, которая используется при оценке субъектов с заболеваниями или нарушениями (например, теми, в которые, как полагают, вовлечена митохондриальная дисфункция (например, с болезнью Альцгеймера или другими нейродегенеративными заболеваниями)) или при оценке субъектов с подозрением на подверженность риску развития такого заболевания. Настоящее изобретение также применимо для обнаружения генетических факторов риска развития других сложных заболеваний, нарушений или состояний.

Описания всех приведенных здесь ссылок на патенты Соединенных Штатов Америки включены, таким образом, сюда в целом посредством ссылки.

1. Определения.

Здесь используются следующие определения.

Представляющее интерес состояние относится к конкретному состоянию, заболеванию или нарушению, определенному для филогенетического исследования и/или последующего диагностирования или прогнозирования. Как здесь используется, состояние включает, но без ограничения, состояния, связанные с АроЕ и/или ТОММ40 и/или митохондриальной дисфункцией, например, нейродегенеративные заболевания, болезни обмена веществ, психиатрические расстройства и рак.

Примеры состояний, при которых подразумевались АроЕ и/или ТОММ40, включают, но без ограничения, сердечно-сосудистое заболевание; болезнь обмена веществ; нейродегенеративное заболевание; неврологическое повреждение или нарушение; аутоиммунное заболевание (например, рассеянный склероз (ΡίηΗοΙΙ М., е! а1. Аро Ε ίη ти1Пр1е 8с1его818 аиб ορίίο ηοπΓίίίδ: !Не аро Е-ер811ои4 а11е1е 18 а88ос1а!еб уНН ртодге88юи οί ти1Нр1е 8с1его818. Ми1! 8с1ег. 11: 511-515 (2005); Ма81егтаи. Т. & НШей 1. ТНе 1е1Па1е 8саи: АРОЕ 84 ίη ти1йр1е 8с1его818. Ьаисе! №ито1. 3: 331 (2004), системную красную волчанку с нейропсихиатрической симптоматикой (Ρи11таηи 1т. К., е! а1. АроНроргойш Е ро1утогрН18т ίη райеи!8 уйН иеигор8усйайгс 8ЬЕ. С1ш КНеита1о1. 23: 97-101 (2004)), и т.д.)); вирусную инфекцию (например, заболевание печени, связанное с инфицированием вирусом гепатита С (\Уо/шак М.А., е! а1. АроПроргсйет Е-84 рго!ес!8 адаш8! 8еуете Нует б18еа8е саи8еб Ьу НераИ118 С У1ти8. Нера1о1. 36: 456-463 (2004)), вызываемое ВИЧ заболевание (Вий Т.И., е! а1. АроПроргсйет (аро) Е4 еηНаисе8 Н1У-1 се11 ейту ίη уйто, аиб 1Не АРОЕ ер811ои4/ер811ои4 деиоПуре ассе1ега1е8 Ηΐν б18еа8е ртодге88юи. Ргос Ыа!1 Асаб 8а И8А. 105: 8718-8723 (2008)), и т.д.)); перелом костей тазобедренного сустава/остеопороз (Р1иут 8.М., е! а1. ЕГГсс!8 оГ деибег аиб аде ои !Не а88оаайои оГ ароНрорто!еш Е ер8бои4 \\ЙН Ьоие тшета1 беи8Йу, Ьоие Щгпоусг аиб 1Не Й8к оГ Ггас1игс8 ίη о1бег реор1е. О8!еорого8 ΐηΐ. 13: 701-709 (2002)); митохондриальные болезни (СНаид 8., е! а1. Ь1р1б- аиб гесер!ог-Ьтбшд гедюш оГ ароНрорго!еш Е4 Ггадтеи!8 ас! ίη соисей !о саи8е тйосНоибйа1 бу8Гиисйои аиб иешйохюйу. Ргос ЫаЙ Асаб 8с И8А. 102: 18694-18699 (2005)); старение (8сНасН!ет Р., е! а1. Сеиейс а88оаайои8 \\ЙН Нитаи 1оидеуйу а! !Не АРОЕ аиб АСЕ 1оа. Ыа! Сеие!. 6: 29-32 (1994); Кеа 1.М., е! а1., Аройрорто!еш Е а11е1е8 ίη ηοηадеηа^^аη 8иН)ес!8 ίη !Не Ве1Га8! Е1бег1у Ьоидйибша1 Ртее-Нушд Адешд 8!ибу (ВЕЬРА8Т). МесН. Адшд аиб Иеуе1ор. 122: 1367-1372 (2001)); воспаление (Й1 Ь., е! а1., 1иГсс!юп шбисе8 а ро81Пус аси!е рНа8е ароНрорто!еш Е ге8рои8е Ггот а иедайуе аси!е рНа8е деие: го1е оГ Нерайс ЬВЬ гесер!ог8. ί Ь1р1б Ке8. 49: 1782-1793 (2008)); и нарушение памяти (Са8е1Н К.Т, е! а1. ^οид^!иб^па1 тобеНид оГ адеге1а!еб тетогу бесНие аиб !Не АРОЕ ер8Йои4 еГГес!. N Еид1 1 Меб. 361: 255-263 (2009)).

Сердечно-сосудистое заболевание, как здесь используется, относится к заболеванию, в которое вовлечено сердце и/или кровеносные сосуды, включающему, но без ограничения, болезнь коронарных артерий (8оид Υ., е! а1. Ме1ааиа1у818: ароНрорто!еш Е де1то1уре8 аиб Й8к Гог согоиагу Исай б18еа8е. Апп 1и!еги Меб. 141: 137-147 (2004); Вете! А.М., е! а1., А88оаа!юи оГ ароНрорто!еш Е деио!уре8 \уйН Нр1б 1еуе18 аиб согоиагу Й8к. 1АМА 298:1300-11 (2007)), атеросклероз (Ыога!а С.И., е! а1. ЕГГес!8 оГ РС8К9 уайаи!8 ои соттои сагойб айету шйта теб1а Нйск1те88 аиб ге1айои !о АроЕ а11е1е8. А!Него8с1его818 (2009) 1ии 27. [ЕриЬ аНеаб оГ рйи!], бок10.1016/).а1Ьего8с1его818 2009.06.023; Ра!егио8!ег Ь., е! а1. Л88оаайои Вс1уссп АроНрорго!еш Е Сеио!уре аиб Сатойб 1ийта-Меб1а ТЫские88 Мау 8идде8! а 8ресйтс ЕГГес! ои Ьатде Айету Л!Не^ο!Н^οтЬο!^с 8!гоке. 8йоке 39: 48-54 (2008)), ишемическую болезнь сердца (8сНтй/ Р., е! а1., КоЬи8! а88оаайои оГ !Не АРОЕ 4 а11е1е \\ЙН ргета!иге туосагб1а1 шГагсйои е8реаа11у ίη райеи!8 \\йНой НурегсНо1е8!его1ает1а: !Не АасНеи 8!ибу. Еиг. 1. Сйи. 1иуе8Йдайои 37: 106-108 (2007)), сосудистое заболевание, такое как ишемический инсульт (Реск С., е! а1. ТНе деиейс8 оГ рйшату НаетоттНадю 8!гоке, 8иЬагас1то1б НаетоггНаде аиб гир!игеб ш!гасгата1 аиеигу8т8 ίη аби1!8. РЬо8 Оие. 3:е3691 (2008); Ра!егио8!ег Ь., е! а1. А88оаа!юи Вс1уссп АроНроргойш Е Сеио!уре аиб СагоПб 1ийта-Меб1а ТНюкие88 Мау 8идде8! а 8реайс ЕГГес! ои Ьатде АНету Л!Не^οίН^οтЬοί^с 8!гоке. 8!гоке 39: 48-54 (2008)), сосудистая деменция (Ваид ОУ, е! а1. 1тройаи! Пик Ье!уееи бетеийа 8иЫуре аиб ароНрорго!еш Е: а те!а-аиа1у818. Υοη8е^ Меб ί. 44: 401413 (2003); Вайт Ь., е! а1. АроНроргойш Е ер8Йои4 а11е1е 18 а88оаа!еб уПП уа8си1ат бетеийа. Иетеи! Сейа!г Соди И18огб. 22: 301-305 (2006)), и т.д.

- 7 021399

Нейродегенеративное заболевание, как здесь используется, относится к болезни Альцгеймера (СогДег Е.Н., е! а1. Оеие Доке οί ароПроргоЮт Е 1уре 4 а11е1е аиД 1Нс пкк οί АкЬешег'к Дйеаке ίη 1а!е опке! ГаииНек. 8с1епсе 261: 921-923 (1993); СогДег Е.Н., е! а1. ТПеге ίκ а раДю1одю ге1аПопк1Пр ЬеЕусеп АроЕеркДоп 4 апД АППсппсг'к Д1кеаке. АтсН №иго1. 52: 650-651 (1995)), болезни Паркинсона (Ниапд X., е! а1. АроПроргоЮп! Е апД ДешепДа ίη РаДДпкоп Д1кеаке: а те!а-апа1ук1к. АтсН №ито1. 63: 189-193 (2006); Ниапд X е! а1. АРОЕ-[ерк11оп]2 а11е1е аккоааЮД \\ДП ЫдНет ргеуа1епсе оГ крогаДю Раткткоп Дхкеаке. №ито1оду 62: 2198-2202 (2004); МаПп^. М. е! а1. АроПроргоЮт Е4 1к ртоЬаЫу текропыЫе Гог (Не сНтотокоте 19 Дпкаде реак Гог Раткшкоп'к Д1кеаке. Ат. 1. МеД. СепеГ В №игоркус1йа1г. Сепе!. 136В, 172-174 (2005)), хореи Гентингтона и множеству менее распространенных заболеваний и нарушений, являющихся причиной снижения нейронов, например, возрастной дегенерации желтого пятна (ТНаккткОап А., е! а1. АккоааДоп Ье!уееп ароПроргоЮп! Е ро1утотрЫктк апД аде-ге1а!еД таси1аг ДедепетаДоп: А НиСЕ ге\ае\у апД те!аапа1ук1к. Ат 1 ЕрШетюк 164: 813-822 (2006); Во)апо\ук1Д С.М., е! а1. Ап ароПроргоЮп! Е уапаШ тау рго1ес1 адатк! аде-ге1а!еД таси1аг ДедепетаДоп !ПтоидН су!окше теди1аДоп. Епуиоп Мо1 Ми!адеп. 47: 594-602 (2006)).

Неврологическое повреждение или нарушение включает, но без ограничения, последствие повреждения головы (2Нои е! а1. Ме1а-апа1ук1к оГ АРОЕ4 а11е1е апД ои!соте айет йаитаДс Ьгат щиту. 1 №иго!гаита. 25: 279-290 (2008); Ьо Τ.Υ., е! а1. МоДи1аДпд еГГес! оГ ароПроргоЮт Е ро1утогрЫктк оп кесопДагу Ьгат шки1! апД ои!соте айет сНПДНооД Ьгат !гаита. СНПДк №τν 8ук!. 25: 47-54 (2009)), мигрень (Сир!а К., е( а1. Ро1утогр1Пкт ш ароПроргоЮп! Е атопд т1дгашеигк апД Юпкюп-Юре НеаДасНе киЬ|ес(к. 1 НеаДасНе Рат. 10: 115-120 (2009)), вазогенный отек (1атек М.Ь., е( а1. АроПроргоЮп! Е тоДШек пеиго1одюа1 ои(соте Ьу аПссДпд сегеЬга1 еДета Ьи( по! Нета(ота же айет 1п(гасегеЬга1 НетоггНаде т Нитапк. 1 8(гоке Эй. 18: 144-149 (2009); 1атек М.Ь., е( а1. РНагтасодепотю еГГсс!к оГ ароПроргоЮт Е оп т!гасегеЬга1 НетоггНаде. 8(гоке 40: 632-639 (2009)), и т.д.

Болезнь обмена веществ, как здесь используется, включает, но без ограничения, дислипидемию (ХУШег С.Е, е( а1. №\\!у ШепДПеД 1оа На! шйиепсе Нр1Д сопсепйаДопк апД пкк оГ согопагу айету Д1кеаке. №!( Сепе!. 40: 161-169 (2008); Веппе! А.М., е! а1., АккоааДоп оГ ароПроргоЮт Е депо(урек \уНП Нр1Д 1еуе1к апД согопагу пкк. 1АМА 298: 1300-1311 (2007)), болезнь почек в конечной стадии (ОДа Н., е! а1. АроДрорто!еш Е ро1утотрЫкт апД гепа1 Д1кеаке. КтДпеу 1п! 8ирр1. 71: 825-7 (1999); НиЬасек кА., е! а1. АроДрорто!еш Е Ро1утотрЫкт ш НетоД1а1\уеД РаДеп!к апД Неа1!Ну Соп!го1к. ВюсНет Сепе!. (2009) йт 30. [ЕриЬ аНеаД оГ рпп!] ΌΟΙ 10.1007/к10528-009-9266-у), хроническую болезнь почек (Аок1ПДа Т., е! а1. АккоааПоп оГ а ро1утотрЫкт оГ !Не ароДрорго!еш Е депе уДН сНтотс ЮДпеу Д1кеаке ш Прапеке шДМДиа1к уДН те!аЬоДс купДготе. Сепотюк 93: 221-226 (2009); Бейа Е., е! а1. Ке1а!юпкЫр Ье!уееп АроДрорго!еш Е ро1утотрЫкт апД перНгора!Ну ш !уре-2 Д1аЬеДс раДеп!к. П1аЬе!ек Кек С1ш Ргас!. 78: 196-201 (2007)), заболевание желчного пузыря (Во1апД Ь.Ь., е! а1. АроДрорго!ет Е депо!уре апД да11Ь1аДДег Д1кеаке пкк ш а 1агде рори1а!юп-ЬакеД соНой. Апп Ер1Детю1. 16: 763-769 (2006); АпДгео!й С., е! а1. Ро1утотрЫктк оГ депек ш !Не Нр1Д те!аЬоДкт ра!Нуау апД пкк оГ ЬШагу !гас! сапсегк апД к!опек: а рори1а!юп-ЬакеД саке-соп!го1 к!иДу ш 8НапдНа1, С1ипа. Сапсег Ер1Детю1 Вютагкегк Рге\\ 17: 525-534 (2008)), сахарный диабет (тип II) (Е1окиа К., е! а1. ОЬекйу МоДи1а!ек !Не АккоааДоп атопд АРОЕ Сепо!уре, 1пкиДп, апД С1исоке ш Меп. ОЬек Кек. 11: 1502-1508 (2003); Могепо ТА., е! а1. ТНе АроДрорто!ет Е Сепе Ргото!ег (-219С/Т) Ро1утогрП1кт Эе!егттек 1пкиДп 8епκ^(^ν^(у ш Кекропке !о П1е!агу Ра! ш Неа1!Ну Υοипд АДи1!к. I ΝιΠγ. 135: 2535-2540 (2005)), метаболический синдром, желчно-каменную болезнь (АЬи АЬеШ 8., е! а1. АроДрорто!ет-Е депо!уре апД !Не пкк оГ ДехШорПхд сПокПДиакй ГоДоушд ЬаДаДтс кигдегу: а с1ие !о рге\'спПоп оГ тоиДпе ргорНу1асДс сНо1есук!ес!оту. ОЬек 8игд. 12: 354-357 (2002)), и т.д.

Психиатрическое расстройство, как здесь используется, относится к шизофрении (Катртап О., е! а1. АроДрорго!еш Е ро1утотрЫкт 1к аккоаа!еД уДН аде оГ опке! т κсΠ^ζοрΠ^еп^а. 1 Нит Сепе!. 49: 355-359 (2004); Эеап В. е! а1., Р1акта ароДрорго!еш Е 1к ДесгеакеД ш кс1ШорПгета крес!гит апД Ыро1аг ДйотДег. РкусЫаДу Кек. 158: 75-78 (2008)), синдрому навязчивых состояний (ОСИ), поведению человека, подверженного пагубным привычкам (никотинозависимости, алкогольной зависимости и т.д.), биполярному расстройству (Леап В. е! а1., Р1акта ароНрорто!ет Е 1к ДесгеакеД ш κсΠ^ζοрΠ^еп^а кресДит апД Ыро1аг Д1когДег. РкусП|а!гу Кек. 158: 75-78 (2008)) и другим психиатрическим заболеваниям, расстройствам или состояниям.

Развитие состояния, как здесь используется, относится либо к первичному диагностированию заболевания, нарушения или другого состояния здоровья или обострению имеющегося заболевания, нарушения или состояния здоровья, которое уже диагностировано у субъекта.

Диагностирование или прогнозирование, как здесь используется, относится к использованию информации (например, генетической информации или данных от других молекулярных анализов на биологических образцах, признаков и симптомов, результатов осмотра, результатов когнитивного функционирования и т.д.) для предвидения наиболее вероятных последствий, временных интервалов и/или ответной реакции на конкретное лечение для конкретного заболевания, нарушения или состояния на основе сравнений с множеством индивидуумов, имеющих общие нуклеотидные последовательности, симптомы, признаки, семейные анамнезы или другие данные, имеющие отношение к анализу состояния здоровья пациента.

- 8 021399

Биологический образец, как здесь используется, относится к материалу, в котором подозревается содержание представляющей интерес нуклеиновой кислоты. Биологические образцы, содержащие ДНК, включают волосы, кожу, ротовой мазок и биологические жидкости, такие как кровь, сыворотка, плазма, мокрота, лимфатическая жидкость, семенная жидкость, вагинальная слизь, кал, моча, спинномозговая жидкость и т.п. Выделение ДНК из таких образцов хорошо известно квалифицированным в данной области техники специалистам.

Субъектом в соответствии с некоторыми вариантами осуществления является индивидуум, генотипы) или гаплотип(ы) которого должен быть определен и документирован в сочетании с состоянием индивидуума (т.е. состоянием заболевания или нарушения) и/или ответной реакцией на являющееся кандидатом лекарственное средство или лечение. Нуклеотидные последовательности от множества субъектов используют для построения филогенетического дерева, а затем можно сравнить аналогичные нуклеотидные последовательности от отдельных субъектов с последовательностями на филогенетическом дереве с диагностической или прогнозной целью.

Ген, как здесь используется, означает сегмент ДНК, который содержит всю информацию для регулируемого биосинтеза продукта РНК, включающий промоторы, экзоны, интроны и другие нетраслируемые участки, контролирующие экспрессию.

Генетический локус или локус, как здесь используется, означает место на хромосоме или в молекуле ДНК, часто соответствующее гену или физическому или фенотипическому признаку или конкретному нуклеотиду или участку из нуклеотидов. Локусы являются формой множественного числа существительного локус.

Амплификация, распространяющаяся на нуклеиновые кислоты, относится здесь к любому способу, который приводит к образованию одной или более копий нуклеиновой кислоты, причем предпочтительно амплификация является экспоненциальной. Один такой способ ферментативной амплификации специфических последовательностей ДНК известен как полимеразная цепная реакция (ПЦР), описанная 8;·ιί1<ί с1 а1., 1986, 8с1еисе 230: 1350-1354. Длина используемых в ПЦР праймеров обычно варьирует от приблизительно 10 до 50 или более нуклеотидов, и обычно подбирается так, чтобы она составляла по крайней мере приблизительно 15 нуклеотидов для обеспечения достаточной специфичности. Получаемый двухцепочечный фрагмент называется ампликоном, и его длина может варьировать от настолько малого количества, как приблизительно 30 нуклеотидов, до 20000 или больше.

Маркер или генетический маркер, как здесь используется, представляет собой известную вариацию последовательности ДНК в конкретном локусе. Вариация может присутствовать у индивидуума благодаря мутации или наследованию. Генетический маркер может быть короткой последовательностью ДНК, такой как последовательность, окружающая изменение одной пары оснований (однонуклеотидный полиморфизм, 8ΝΡ), или длинной последовательностью, подобной мини-сателлитам. Маркеры могут использоваться для исследования связи между наследственным заболеванием и его генетической причиной (например, конкретной мутацией гена, которая приводит к дефектной или в других отношениях нежелательной форме белка).

Генетический фактор риска, как здесь используется, означает генетический маркер, который связан с увеличенной подверженностью состоянию, заболеванию или нарушению. Он может также относиться к генетическому маркеру, который связан с конкретной ответной реакцией на выбранное лекарственное средство или лечение, представляющее интерес.

Связанный(ая,ое) с, как здесь используется, означает проявление вместе двух или более характеристик чаще, чем ожидалось бы по стечению случайных обстоятельств по отдельности. В пример связи вовлечена характерная черта поверхности лейкоцитов, называемая НЬА (НЬА означает антиген лейкоцитов человека). Особый тип НЬА, тип НЬА - В-27, связан с увеличенным риском развития ряда заболеваний, включающих анкилозирующий спондилоартрит. Анкилозирующий спондилоартрит в 87 раз скорее возникает у людей с НЬА В-27, чем в общей популяции.

Субъект, подверженный увеличенному риску развития состояния благодаря генетическому фактору риска, является субъектом, который предрасположен к состоянию, имеет генетическую подверженность состоянию и/или у которого состояние развивается скорее, чем у субъектов, у которых генетический фактор риска отсутствует. Например, болезнь Альцгеймера развивается у субъекта, подверженного увеличенному риску развития болезни Альцгеймера благодаря присутствию одного или двух аллелей АроЕ 4, скорее, чем у субъекта, который не несет аллель АроЕ 4.

Полиморфизм, как здесь используется, относится к существованию двух или более различных нуклеотидных последовательностей в конкретном локусе в ДНК генома. Полиморфизм может служить в качестве генетических маркеров и может также упоминаться как генетические варианты. Полиморфизм включает замены, инсерции, делеции нуклеотидов и микросателлиты и может, но необязательно, приводить к выявляемым различиям в экспрессии генов или функции белков. Полиморфный сайт представляет собой место нуклеотида внутри локуса, в котором нуклеотидная последовательность отличается от контрольной последовательности по крайней мере у одного индивидуума в популяции.

Делеционный/инсерционный полиморфизм или ΌΙΡ, как здесь используется, представляет собой инсерцию одного или более нуклеотидов в один вариант последовательности, родственный другому.

- 9 021399

Если известно, какие из аллелей представляют минорные аллели, используется термин делеция, когда минорный аллель представляет собой делецию нуклеотида, а термин инсерция используют, когда минорный аллель представляет собой добавление нуклеотида. Термин делеционный/инсерционный полиморфизм также используется, когда существует множество форм или длин, а минорный аллель не является явным. Например, в случае описываемого здесь полиморфизма поли-Т наблюдается множество длин полиморфизмов.

Используемый здесь термин данные о полиморфизме означает информацию в отношении конкретного гена, касающуюся одного или более из следующего: места полиморфных сайтов; вариации последовательности в этих сайтах; частоты полиморфизмов в одной или более популяциях; различных генотипов и/или гаплотипов, определенных для этого гена; частоты одного или более из этих генотипов и/или гаплотипов в одной или более популяциях; и любой известной связи(ей) между характерной чертой и генотипом или гаплотипом для этого гена.

Гаплотип, как здесь используется, относится к генетическому варианту или комбинации вариантов, который несет по крайней мере одна хромосома индивидуума. Г аплотип часто включает множество смежных полиморфных локусов. Все части гаплотипа, как здесь используется, находятся на одной и той же копии хромосомы или молекуле гаплоидной ДНК. В отсутствие данных в отношении противного, полагают, что гаплотип представляет комбинацию множества локусов, которые, вероятно, передаются вместе во время мейоза. Каждый человек несет пару гаплотипов для любого конкретного генетического локуса, состоящую из последовательностей, получаемых по наследству на гомологичных хромосомах от двух родителей. Эти гаплотипы могут быть идентичными или могут представлять два различных генетических варианта для конкретного локуса. Гаплотипирование является процессом определения одного или более гаплотипов у индивидуума. Гаплотипирование может включать использование семейной родословной, молекулярных методов и/или статистического вывода.

Вариант, вариация или генетический вариант, как здесь используется, относится к специфической изоформе гаплотипа в популяции, специфической форме, отличающейся от других форм того же гаплотипа последовательностью по крайней мере в одном и часто более чем одном вариантном сайте или нуклеотидами внутри последовательности гена. Последовательности в этих вариантных сайтах, которые отличаются между различными аллелями гена, называют вариантами последовательности гена, аллелями, вариациями или вариантами. Термин альтернативная форма относится к аллелю, который можно отличить от других аллелей по содержанию по крайней мере одного и часто более одного вариантного сайта внутри последовательности гена. Другие известные в данной области техники термины, эквивалентные термину вариации или варианты, включают мутации и однонуклеотидные полиморфизмы (8ΝΡ). Ссылка на присутствие вариации или вариаций означает конкретные вариации, т.е. конкретные нуклеотиды в конкретных полиморфных сайтах, а не просто присутствие любой вариации в гене.

Изоформа, как здесь используется, означает особую форму гена, мРНК, кДНК или белка, кодируемого им(ей), отличающуюся от других форм своей особой последовательностью и/или структурой. Например, изоформа аполипопротеина Е - АроЕ 4 в противоположность изоформам АроЕ2 или АроЕЗ.

Цистрон, как здесь используется, означает участок ДНК, находящийся на одной хромосоме, который содержит генетический код для одного полипептида и функционирует в качестве единицы наследования. Цистрон включает экзоны, интроны и регуляторные элементы, относящиеся к одной функциональной единице (т.е. гену). Термин происходит из классического функционального теста на аллелизм ради определения того, были ли способны генетические элементы к функциональному взаимодействию независимо от того, находились ли они на разных молекулах ДНК, (транс-комплементации), или только тогда, когда они находились на одной и той молекуле ДНК (действующие в цис-положении элементы).

Термин генотип в контексте этого изобретения относится к конкретной аллельной форме гена, которую можно установить по особому нуклеотиду(ам), присутствующему в последовательности нуклеиновой кислоты в конкретном сайте(ах). Генотип может также означать пару аллелей, находящихся в одном или более полиморфных локусах. В случае диплоидных организмов, таких как люди, два гаплотипа составляют в итоге генотип. Генотипирование представляет собой любой процесс для определения генотипа индивидуума, например, посредством амплификации нуклеиновых кислот, связывания с антителами или другого химического анализа. Результирующий генотип может быть несинхронизированным, что означает, что неизвестно, происходят ли обнаруживаемые последовательности из одной родительской хромосомы или от другой.

Неравновесное сцепление, как здесь используется, означает неслучайную связь аллелей в двух или более локусах.

Неравновесное сцепление характеризует ситуацию, в которой некоторые комбинации аллелей или генетических маркеров возникают в популяции в большей или меньшей степени чаще, чем можно было бы ожидать из случайного образования гаплотипов из аллелей на основе их частот. Неслучайные связи между полиморфизмами в различных локусах определяются степенью неравновесного сцепления.

Совмещение множества последовательностей или ΜδΑ, как здесь используется, означает со- 10 021399 вмещение трех или более нуклеотидных последовательностей геномной ДНК, происходящих от множества индивидуумов, для определения гомологии и гетерологии между последовательностями. В общем, исходят из того, что совокупность значений входных данных последовательностей запроса имеет эволюционную взаимосвязь, при которой они имеют общую родословную и происходят от общего предка. Компьютерные алгоритмы чаще всего используются для проведения анализа совмещенных последовательностей.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения описываются со ссылкой на блоксхемы, иллюстрирующие способы (например, фиг. 1), которые могут включать стадии, выполняемые с помощью компьютера и/или продуктов в виде компьютерных программ. Будет понятно, что каждый блок блок-схем и/или операционных иллюстраций, и комбинации блоков в блок-схемах и/или операционных иллюстрациях, может быть выполнен с использованием аналоговой и/или цифровой аппаратуры, и/или команд компьютерных программ. Эти команды компьютерных программ могут предоставляться процессору ЭВМ общего назначения, ЭВМ специального назначения, прикладной интегральной микросхеме и/или другому программируемому обрабатывающему данные устройству, так что команды, выполняемые через процессор компьютера и/или другое программируемое обрабатывающее данные устройство, создают средство для выполнения функций/действий, указанных в блок-схемах и/или операционных иллюстрациях. Соответственно, будет понятно, что блок-схемы и операционные иллюстрации совместимы с устройством, способами и продуктами в виде компьютерных программ.

Также может быть включено другое программное обеспечение, например, операционная система. Кроме того, будет понятно, что функциональные возможности модуля для совмещения множества последовательностей, модуля для картирования и/или других модулей, описываемых здесь, могут быть реализованы, по крайней мере, отчасти, используя дискретные компоненты аппаратного средства, одну или более прикладных интегральных микросхем (А81С) и/или один или более цифровых процессоров и/или ЭВМ специального назначения.

Картирование, как здесь используется, означает построение филогенетического дерева посредством определения узла для каждого нового установленного варианта нуклеотидной последовательности, соединения этого узла с другим узлом, представляющим известную последовательность, которую несет тот же индивидуум на той же хромосоме или в том же цистроне, и подсчета числа каждого типа субъекта, представленного в каждом узле. См. фиг. 4 ради примера филогенетического дерева, построенного таким образом.

Филогенетическое означает имеющее отношение к изучению эволюционных связей среди различных групп организмов или индивидуумов в пределах вида. До того как генетическая информация стала легко доступной, филогенез основывался преимущественно на фенотипических данных. Филогенетическое картирование, как здесь используется, означает использование данных о последовательностях ДНК для связи родственных вариантов последовательностей, которые несет множество индивидуумов, для того чтобы определить эволюционные связи и хронологию дивергенции. Филогенетическое дерево является результатом картирования связей между вариантами.

Узел, как здесь используется, означает точку в данных о полиморфизме на филогенетическом дереве, представляющую фактический вариант последовательности, который несет по крайней мере один субъект. Узел соединен посредством ветви с другим узлом, представляющим вариант последовательности, который несет тот же индивидуум на той же хромосоме и в том же цистроне, но в отличном генетическом локусе в пределах этого цистрона. Наличие узла означает, что по крайней мере один субъект нес как последовательность, показанную узлом, так и последовательность, представленную близлежащим узлом, с которым он соединен ветвью.

Ветвь, как здесь используется, означает связь между двумя узлами, представляющими два отличных варианта последовательности или гаплотипа, при этом два варианта находятся на одной и той же хромосоме и в одном и том цистроне отдельного субъекта. Точка ветвления означает любой узел, из которого тянутся более чем две ветви, но этот термин специально используется здесь для ссылки на корневой узел, из которого тянутся три и более узла. Корневой узел представляет генетическую последовательность общего эволюционного предка, на основе которой генетическая дивергенция создала множество ближайших вариантов последовательности, представленных соединенными узлами.

Повторно, как здесь используется, относится к повторным расчетам значений для каждой характерной черты в группе. Например, анализируют каждый узел на филогенетическом дереве для расчета отношения числа субъектов, пораженных представляющим интерес состоянием (таким как болезнь Альцгеймера), к числу контрольных непораженных субъектов; это отношение сравнивают с отношением для соединенных узлов для установления корреляцией с увеличенным или уменьшенным риском развития представляющей интерес болезни, нарушения или состояния. Существенное изменение в этом отношении между одним узлом и следующим узлом означает присутствие варианта, который либо увеличивает, либо уменьшает риск раннего начала заболевания. Повторное исследование генетических вариантов означает начало анализа с узлов, представляющих последовательности, которые разделяет наибольшее число отдельных субъектов, и последовательный анализ узлов, соединенных ветвями, тянущимися из этого узла, а затем узлов второго уровня и т.д. Итак, анализ идет в общем от корней дерева по направле- 11 021399 нию к наружным ветвям и узлам дерева.

Лечение, как здесь используется, включает любое лекарственное средство, процедуру, изменение образа жизни или другую корректировку, вносимую в попытке осуществления изменения в конкретном аспекте здоровья субъекта (т.е. направленную на конкретное заболевание, нарушение или состояние).

Лекарственное средство, как здесь используется, относится к химической молекуле или биологическому продукту, или комбинации химических молекул или биологических продуктов, вводимой субъекту для лечения или предупреждения или контролирования заболевания или состояния. Используемый здесь термин лекарственное средство является синонимом терминов лекарство, медикамент, терапевтическое вмешательство или фармацевтический продукт. Наиболее предпочтительно, когда лекарственное средство разрешено государственным органом для лечения по крайней мере одного конкретного заболевания или состояния.

Термины заболевание, нарушение и состояние общепризнаны в данной области техники и обозначают наличие у индивидуума или пациента признаков и/или симптомов, которые обычно определяют как анормальные и/или нежелательные. Заболевания или состояния можно диагностировать и классифицировать на основе патологических изменений.

Заболевание или состояние может быть выбрано из типов заболеваний, перечисленных в типовых текстах, например, в Наткои'к Ргтс1р1ек οί 1п1сгпа1 МеФсте, 1997, или КоЬЬтк Ра11ю1ощс Вак15 οί Όίκеаке, 1998.

Митохондриальная дисфункция, как здесь используется, означает любые вредные аномалии митохондрий внутри клетки или клеток. Некоторые заболевания, нарушения или состояния, о которых в настоящее время известно в данной области техники, что они связаны с митохондриальной дисфункцией, включают болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и другие нейродегенеративные заболевания, вызванное ишемией-реперфузией повреждение при инсульте и инфаркт миокарда, эпилепсию, сахарный диабет и старение. В данной области техники была установлена связь многих других заболеваний, нарушений и состояний с митохондриальной дисфункцией. В самом деле, митохондрия важна для надлежащего функционирования большинства типов клеток, а ухудшение в функционировании митохондрий часто приводит к гибели клеток. Зга митохондриальная дисфункция является причиной повреждения и гибели клеток посредством препятствования продукция АТФ, нарушения гомеостаза кальция и увеличения окислительного стресса. Кроме того, повреждение митохондрий может привести к гибели клеток в результате апоптоза посредством вызова выброса цитохрома с и других проапоптозных факторов в цитоплазму (для обзора см. Зайасе, 1999; §сйариа, 2006). Что касается конкретных примеров, представленных здесь, предполагается, что изоформы АроЕ 3 и АроЕ 4 являются причиной митохондриальной дисфункции благодаря взаимодействиям с ТОММ40. Некоторые варианты ТОММ40 могут действовать синергетическим образом с изоформой АроЕ 3 для ускорения ухудшения в функционировании митохондрий. Полагают, что этот митохондриальный механизм вносит вклад во многие сложные генетические заболевания, нарушения и состояния.

Как здесь используется, субъекты являются предпочтительно, но без ограничения, людьми. Субъекты могут быть мужчинами или женщинами и могут быть любой расовой или этнической принадлежности, в том числе, но без ограничения, представителем белой европеоидной расы, афроамериканцем, африканцем, азиатом, латиноамериканцем, индейцем, и т.д. Субъекты могут быть любого возраста, в том числе новорожденным, ребенком в возрасте до одного месяца, младенцем, ребенком, подростком, взрослым и лицом пожилого возраста. Субъекты могут также включать являющихся животными субъектов, в частности, являющихся млекопитающими субъектов, таких как субъекты семейства псовые, кошачьи, бычьи, козлиные, лошадиные, рода баранов, семейства свиные, грызуны (например, крысы и мыши), зайцеобразные, приматы (в том числе не являющиеся людьми приматы) и т.д., которых подвергают скринингу с ветеринарной целью или с целью разработки фармацевтических средств.

Как здесь используется, лечить или лечение относится к любому типу мер, который дает пользу пациенту, пораженному заболеванием, в том числе улучшение состояния пациента (например, одного или более симптомов), задержку начала или прогрессирования заболевания и т.д.

Как здесь используется, болезнь Альцгеймера с поздним началом или 'ΈΘΆΌ известна в данной области техники, и такая классификация используется, если болезнь Альцгеймера начинается или диагностируется после возраста 65. Она является самой распространенной формой болезни Альцгеймера.

2. Способы идентификации генетических вариантов.

Хотя перечни связей, получаемые на основе сканирований всего генома, являются полезными, они обычно являются недостаточными для объяснения сложности заболевания. Семьи, пути и взаимодействия генов могут давать особенности. С помощью высокоразрешающего картирования вариаций можно найти ответы на сложные генетические взаимодействия. Оно особенно применимо в случае, если один известный генетический фактор риска, который сам по себе не объясняет целиком и полностью связь с представляющим интерес заболеванием, нарушением или состоянием, может представлять генетический локус, являющийся превосходным кандидатом на более детальные исследования. Кроме того, фармакогенетика, которая между тем, как применима для разработки лекарственных средств, может также расширить биологическую важность. Анализ данных о последовательностях большого числа индивидуумов

- 12 021399 для обнаружения вариаций в последовательности гена между индивидуумами в популяции приведет к выявлению большей доли всех вариантов в этой популяции.

Подвергаемую анализу способом настоящего изобретения информацию о первичных последовательностях получают на основе геномной ДНК множества субъектов. Организмом может быть любой организм, для которого в наличии имеется множество последовательностей, но предпочтительно он является человеком. При идентификации новых вариаций часто полезным является скринирование различных групп в популяции на основе расовой, этнической принадлежности, анатомического пола и/или географического происхождения, поскольку частота конкретных вариаций может отличаться между такими группами. Наиболее предпочтительно в случае заболеваний или нарушений, которые, как полагают, являются мультигенными (генетически сложными заболеваниями/нарушениями), когда фенотипы, которые представляет популяция субъектов, являются фенотипами краев спектра. Биологическими образцами, содержащими ДНК, могут быть кровь, семенная жидкость, ротовой мазок и т.д. Выделение ДНК из таких образцов хорошо известно в данной области техники.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анализу данных о нуклеотидных последовательностях множества субъектов, имеющих по крайней мере один известный фактор риска развития конкретного заболевания, нарушения или состояния (генетического или иного). Нуклеотидные последовательности анализируют для генерирования данных о гаплотипах, а гаплотипы или генетические варианты затем картируют на филогенетическом дереве для наглядного показа эволюции представленных последовательностей. Посредством сравнения этого дерева с фенотипическими данными в отношении множества субъектов возможно прогнозирование или диагностирование для отдельного субъекта, несущего гаплотипы, наблюдаемые на филогенетическом дереве.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к областям фармакогенетики и фармакогеномики и использованию информации о генетических гаплотипах для предсказания подверженности индивидуумов заболеванию и/или их ответной реакции на конкретное лекарственное средство или лекарственные средства, вследствие чего можно разработать и/или вводить индивидуумам с соответствующим генетическим профилем лекарственные средства, подогнанные к генетическим различиям групп в популяции.

Информацию о нуклеотидных последовательностях получают на основе геномной ДНК. Используемые данные о геномных последовательностях можно получить от животных для клинических оценок или не являющихся людьми животных или из исследований культивируемых клеток или изолированных тканей. Организм может быть любым организмом, для которого в наличие имеется множество последовательностей, но предпочтительно он является человеком. При идентификации новых вариаций часто полезным является скринирование различных групп в популяции на основе расовой, этнической принадлежности, анатомического пола и/или географического происхождения, поскольку частота конкретных вариаций может отличаться между такими группами. Наиболее предпочтительно в случае заболеваний или нарушений, которые, как полагают, являются мультигенными (генетически сложными заболеваниями/нарушениями), когда фенотипы, которые представляет популяция субъектов, являются крайними противоположностями.

Биологическими образцами, содержащими ДНК, могут быть кровь, семенная жидкость, ротовой мазок и т.д. Выделение ДНК из таких образцов хорошо известно в данной области техники. В данной области техники также известны способы определения последовательности ДНК в конкретном генетическом локусе, представляющем интерес. Автоматизированное секвенирование в настоящее время широко доступно, и для него необходимы только образец выделенной ДНК и по крайней мере один праймер, который конкретно разработан для распознавания высококонсервативной последовательности внутри или в непосредственной близости от представляющего интерес генетического локуса.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления точно секвенируют представляющий интерес, определенный генетический участок или локус (например, определенный с помощью группы из прямого и обратного праймеров для ПЦР) из группы людей, включая пациентов, достаточно охарактеризованных в отношении конкретного нарушения.

Определяют консенсусную последовательность, и составляют список всех отмеченных вариантов последовательности для конкретного генетического локуса. Локусы, имеющие наибольшее число отмеченных вариантов, представляют эволюционную дивергенцию от общего предка. В таком качестве эти локусы соединены в цис-положении с локусами, имеющими только один или очень небольшое количество отмеченных вариантов. По крайней мере, во время начальных фаз исследования предпочтительным является разбивание популяций на группы субъектов, имеющих общий основной фенотип, представляющий схожее происхождение. Иначе для анализа этих данных благодаря построению филогенетического дерева потребуется чрезмерно большое количество субъектов.

3. Совмещения множества последовательностей.

Определение присутствия конкретной вариации или множества вариаций в гене или участке гена в популяции можно выполнить рядом способов, все из которых включают локализацию конкретного генетического локуса посредством выявления внутри представляющего интерес участка последовательностей, которые, как известно, являются высококонсервативными. На основе высококонсервативного локу- 13 021399 са легко получить смежные последовательности благодаря одному из многих методов, широко известных в данной области техники.

Первым шагом при анализе параллельных последовательностей ДНК от множества субъектов является совмещение множества последовательностей (ΜδΑ). ΜδΑ обычно используют для визуального представления совмещения последовательностей из гомологичных образцов с полиморфными различиями внутри генов или участков генов для обнаружения консервативных областей и вариантов последовательностей. ΜδΆ информации о последовательностях, полученной в представляющем интерес локусе, можно создать, используя один или более различных известных методов и общедоступное программное обеспечение, и общедоступны из многих источников, в том числе Интернета. Известные в данной области техники способы анализа совмещений множества последовательностей включают, например, способы, описанные в патенте США № 6128587, выданном &)о1аибег; патенте США № 6291182, выданном §ебогк и др.; и патенте США № 6401043, выданном §1аи!ои и др.

4. Филогенетические деревья и анализ.

Различные способы построения филогенетических деревьев известны в данной области техники (см., например, 8аибег8ои, 2008). δυη и др. использовали анализ блоков гаплотипов для исследования связей между вариантами То11-подобного рецептора (ТЬК) и раком предстательной железы (2005), а Вагбе1 и др. (2005) использовали подход с применением кладистического анализа для исследования связей между вариантами гена САКЭ 15 и болезнью Крона. Однако никто из них не использовал генетические локусы, для которых ранее была установлена связь с заболеванием, для исследования сцеплений.

Филогенетические деревья в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, в которых варианты гаплотипной последовательности, отмеченные у отдельных, являющихся людьми субъектов, подвергнутых изучению, образуют узлы (представляющие каждую отмеченную последовательность в данных) на дереве, можно построить с использованием топологии. Узлы могут быть соединены с другими узлами, а общий предок находится в месте ветвления, общем корне или корневом узле дерева. Филогенетическое дерево отражает эволюционную связь между генетическими локусами, данные в отношении которых анализируют (см. §аибег8ои, 2008; Т/епд, 2005; §ебтаи, 2003). На фиг. 4 демонстрируется детальное филогенетическое дерево, построенное для участка В генетического локуса, представленного на фиг. 3.

Исходной точкой для оценки филогенетического дерева обычно является ΜδΑ (см. выше). В наличие имеется множество прикладных программ программного обеспечения для построения филогенетических деревьев на основе данных о последовательностях. См., например, патент США № 7127466 и патент США № 6532467, выданные Вгоек1еЬаик и др. Основной предпосылкой является то, что генетический локус, демонстрирующий множество вариантов, представлен этими вариантами, соединенными в цисположении. Полиморфизм создает точки ветвления (узлы) на дереве, которые определяют группы родственных последовательностей или гаплотипов.

Филогенетическое дерево используется для получения информации посредством повторной проверки отношений субъектов, пораженных заболеванием, к непораженным контрольным субъектам; расчеты начинают с узлов, отмеченных у наибольшего числа субъектов, и идут по направлению периферии дерева к узлам, отмеченным у небольшого числа субъектов. Целью является локализация точки ветвления, ветви или узла, в которой имеется существенное изменение отношения субъектов, пораженных представляющим интерес состоянием, к непораженным контрольным субъектам. Такая точка ветвления представляет эволюционную дивергенцию субъектов, подверженных большему риску, от субъектов, подверженных меньшему риску, или наоборот.

Статистический анализ построенного филогенетического дерева можно выполнить в соответствии со способами, известными в данной области техники. Одним принятым в данной области техники способом является расчет уровней достоверности при ступенчатом переходе от малых значений к большим и наоборот (см. Е1гои е! а1., Ргос. ИаИ. Асаб. δει. υδΑ 93, 13429-13434 (1996)).

5. Оценка пациентов.

После построения филогенетического дерева для конкретного генетического локуса можно провести оценку отдельного субъекта посредством сравнения его последовательности ДНК с последовательностями, которые включает филогенетическое дерево. Наличие гаплотипов или вариантов последовательности, находящихся в соответствии с участками дерева, представляющими субъектов с более высокой частотой возникновения представляющего интерес состояния (т.е. более высокими отношениями субъектов, пораженных заболеванием или нарушением, к непораженным контрольным субъектам), вероятно, означает, что этот отдельный субъект также подвержен увеличенному риску. С другой стороны, значительно более низкие отношения соответствуют уменьшенному риску развития представляющего интерес состояния.

Филогенетические деревья можно также проанализировать, исходя из чувствительности представляющего интерес состояния к лечению представляющим интерес активным агентом или представляющему интерес способу лечения в соответствии с некоторыми вариантами осуществления.

6. АроЕ и ТОММ40.

Фенотипы и генотипы для АроЕ хорошо известны в данной области техники. Широко известная

- 14 021399 номенклатурная система, а также фенотипы и генотипы для АроЕ описываются, например, в Ζαηηίκ с1 а1., 1982, который включен сюда посредством ссылки.

Фенотипы и генотипы для ТОММ40 (субъединицы с М.м. 40 кДа канала внешней митохондриальной мембраны) также известны. ТОММ40 функционирует в качестве образующей канал субъединицы транслоказы, найденной в митохондриальной мембране, которая весьма важна для импортирования белков в митохондрии.

Данные основанных на сканировании всего генома исследований связей у пациентов с болезнью Альцгеймера однозначно идентифицировали участок неравновесного сцепления, который содержит ген аполипопротеина Е (АроЕ). Вариант АроЕ 4 широко тиражировали как подтвержденный ген подверженности заболеванию со времени первоначальных публикаций в 1993 г. (см., например, Согбег с1 а1.). Однако данные основанного на сканировании всего генома исследования связей дали в результате заметное совпадение, отмеченное в исследованиях, относящихся к клеточной биологии, включающее солокализацию АроЕ и ТОММ40 во внешней митохондриальной мембране. С этим вторым геном, ТОММ40, впервые столкнулись во время исследований по построению модели неравновесного сцепления вблизи АроЕ в 1998 г. Полиморфизм был локализован рядом с АроЕ внутри небольшого участка неравновесного сцепления.

АроЕ солокализуется во внешней митохондриальной мембране, что наводит на мысль о специфичных для изоформ взаимодействиях, которые приводят к потенциальной роли в развитии АроЕиндуцированного митохондриального апоптоза в качестве ранней стадии проявления болезни Альцгеймера. Биологические данные показали, что доля подвижных митохондрий в культурах нервных клеток, а также скорость, с которой они перемещаются, и расстояние, которое они проходят, являются факторами, влияющими на увеличение митохондриального апоптоза. Филогенетические данные говорят о независимом генетическом эффекте на развитие болезни Альцгеймера в случае ТОММ40.

АроЕ специфически связывается с митохондриями в культурах нервных клеток (СБапд, 2005), и с помощью секвенирования этого участка неравновесного сцепления у сотен пациентов с болезнью Альцгеймера и подобранных контролей в сочетании с отображением эволюции генетических вариантов ТОММ40 определяется представляющий особый интерес участок для взаимодействий АроЕ-ТОММ40, продемонстрированный на фиг. 3. Эти относящиеся к эволюции данные служат дополнительным подтверждением генетической связи между АроЕ и ТОММ40 и наводят на мысль, что митохондриальная дисфункция могла бы быть ответственной за гибель нейронов, происходящую медленно на протяжении многих лет. Распределение по возрасту возникновения болезни Альцгеймера (см., например, патент США № 6027896, выданный Кокек и др.), возможно, отражает наследование прочно сцепленных вариантов двух биохимически взаимодействующих белков, которые приводят к клиническому проявлению болезни.

Как здесь подробно описывается, взаимодействие между множественными гаплотипами вариантов ТОММ40 и аллелями АроЕ 3 вносит вклад в патогенез болезни Альцгеймера; в частности, в патогенез заболевания вносят вклад гаплотипы ТОММ40 в сцеплении с аллелем Е 3 АроЕ. Некоторые из вариантов гена ТОММ40 создались только сцепленными в цис-положении с АроЕ 3. (Так же специфические варианты ТОММ40, возможно, создались сцепленными в цис-положении с АроЕ 4 или АроЕ 2.) Таким образом, любой добавочный генетический эффект вариантов ТОММ40 сегрегируется независимо от АроЕ 4, но два варианта белковых продуктов могут функционально взаимодействовать, в транс-положении, для вызова данного наблюдаемого фенотипа и признака. Таким образом, любой добавочный генетический эффект вариантов ТОММ40 сегрегируется независимо от АроЕ 4. Это совпадение смежных взаимодействующих генов может являться причиной чрезвычайно значимых статистических данных о связях, установленных во всех основанных на сканировании всего генома исследованиях связей у пациентов с болезнью Альцгеймера. Интересно отметить, что первоначальные, имеющиеся в продаже платформы для основанного на сканировании всего генома исследования связей не содержали какие-либо полиморфизмы АроЕ, а связи были идентифицированы с использованием однонуклеотидных полиморфизмов ТОММ40 и АроС1 - но участок практически всегда называли участком АроЕ.

Эти данные, которые объединяют генетику заболевания и предполагаемые молекулярные механизмы патогенеза, можно также рассмотреть в контексте фармакогенетики. Из-за устойчивого генетического эффекта наследования аллеля АроЕ 4 АроЕ 4 упоминали как ген комплексной чувствительности в течение более десяти лет. Стойкие повторения распределений по возрасту возникновения болезни в зависимости от генотипа для АроЕ подтверждают, что роль наследования АроЕ 3 не является полностью доброкачественной, а является фактором незначительного риска, отмеченным при более медленной скорости возникновения заболевания. Существуют генетические варианты ТОММ40, которые находятся только в цепях ДНК, содержащих АроЕ 3, в участках неравновесного сцепления (Кокек е1 а1., неопубликованные данные), а, следовательно, не в соответствии с законом Харди-Вейнберга, что требовалось для однонуклеотидных полиморфизмов в панелях для основанного на сканировании всего генома исследования связей. Эволюционные изменения последовательностей ТОММ40, которые сцеплены только с АроЕ 3 в цис-положении, действует с увеличением риска развития болезни Альцгеймера, связанного с АроЕ 3, в то время как другие варианты ТОММ40, сцепленные с АроЕ 3 в цис-положении, уменьшают риск, свя- 15 021399 занный с АроЕ 3. Независимый генетический анализ мог бы определить, сегрегируются ли эти полиморфизмы ТОММ40, связанные с меньшим риском развития болезни Альцгеймера, в более позднем возрасте на графиках распределений по возрасту возникновения в случае содержащих АроЕ 3 генотипов [АроЕ 3/3 или АроЕ 4/3].

Определение присутствия или отсутствия АроЕ 2, 3 или 4 и/или гаплотипов ТОММ40 или кодирующей их ДНК (в том числе, в некоторых вариантах осуществления, числа аллелей для каждого из них) у субъекта можно провести либо напрямую, либо косвенно с помощью любого подходящего способа. Квалифицированным в данной области техники специалистам известен ряд методов. Все из них обычно включают стадию получения образца биологического материала, содержащего либо ДНК, либо белок, от субъекта, а затем определения того, имеет ли субъект представляющий интерес гаплотип. Например, стадию определения АроЕ можно выполнить посредством получения содержащего АроЕ образца от субъекта (например, из спинномозговой жидкости или любой другой жидкости или ткани, содержащей АроЕ), а затем определения присутствия или отсутствия изоформы АроЕ 2, 3 или 4 в образце АроЕ (например, с помощью изоэлектрофокусировки или иммуноанализа).

Определение присутствия или отсутствия ДНК, кодирующей изоформу АроЕ и/или ТОММ40, можно провести с помощью прямого секвенирования представляющего интерес участка геномной ДНК с использованием олигонуклеотидного зонда, меченного подходящей поддающейся обнаружению группой, и/или посредством реакции амплификации, такой как полимеразная цепная реакция или лигазная цепная реакция (продукт этой реакции амплификации можно затем выявить с помощью меченого олигонуклеотидного зонда или ряда других методов). Кроме того, стадия определения может включать стадию определения того, является ли субъект гетерозиготным или гомозиготным по гену, кодирующему гаплотип для АроЕ и/или ТОММ40. Известны многочисленные различные форматы анализов с использованием олигонуклеотидных зондов, которые могут использоваться для выполнения настоящего изобретения. См., например, патент США № 4302204, выданный \Уай1 и др.; патент США № 4358535, выданный Ра1коет и др.; патент США № 4563419, выданный Каик1 и др.; и патент США № 4994373, выданный 81аупаиорои1о8 и др. (заявителями определенно предполагается, что описания всех ссылок на патенты США, перечисленные здесь, включены сюда посредством ссылки).

В некоторых вариантах осуществления определение может включать многократную амплификацию ДНК (например, ПЦР со специфичной для аллеля флуоресцентной детекцией). В некоторых вариантах осуществления определение может включать гибридизацию с ранжированным микрорядом (чипом, гранулами и т.д.). В некоторых вариантах осуществления определение может включать секвенирование соответствующих частей гена, содержащие гаплотипы, которые стремятся определить. В некоторых вариантах осуществления для определения могут использоваться гаплотипы, в которых изменена чувствительность к расщеплению одним или более ферментами - рестрикционными эндонуклеазами. Например, можно использовать полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (КРЬР), который называют паттерном расщепления при применении к ДНК различных рестрикционных ферментов. В некоторых вариантах осуществления присутствие одного или более гаплотипов можно определить с помощью аллельспецифической амплификации. В некоторых вариантах осуществления присутствие гаплотипов можно определить с помощью удлинения праймера. В некоторых вариантах осуществления присутствие гаплотипов можно определить с помощью лигирования с олигонуклеотидом. В некоторых вариантах осуществления присутствие гаплотипов можно определить с помощью гибридизации с использованием выявляемого меченого зонда. См., например, публикацию заявки на патент США № 2008/0153088, поданную 8ии и др.; КоЬ1ег е! а1., Иеиййсайои оГ аи 11Т а11е1е ш !йе ро1уруйт1йше !гас! оГ тйои 8 о£ Ше СРТК деие, Сеиейск ш Мейюше 8(2): 125-128 (2006); СоЧа е! а1., Ми1йр1ех А11е1е-8рес1Йс Ииотексеи! РСК £от Нар1о1уршд !йе 1У88 (ТС)т(Т)и Ьосик ш !йе СРТК Сеие, Сйи. СИет., 54: 1564-1567 (2008); Гойикои е! а1., А Сотратайуе 8!ийу о£ Рйе Тссйηо1од^са11у Эйте СРТК Текйид Р1аЙогтк, I. Мо1. П1адиокйс5, 9(3) (2007); Рга!! е! а1., Пеуе1ортеи! о£ Сеиотю КеГегеисе Ма!ейа1к £ог Сукйс Р1Ьто515 Сеиейс Текйид, I. Мо1. П1адиокйсз, 11: 186-193 (2009).

Амплификацию выбранной, или целевой, последовательности нуклеиновой кислоты можно выполнить посредством любого подходящего способа на ДНК, выделенной из биологических образцов. См. в общем плане Ό. Кетой и Т. Кетой, 1990. Примеры подходящих методов амплификации включают, но без ограничения, полимеразную цепную реакцию, лигазную цепную реакцию, амплификацию замещением цепей (см. в общем плане \Уа1кег е! а1., 1992а; \Уа1кег е! а1., 1992Ь), амплификацию на основе транскрипции (см. Кетой е! а1., 1989), самоподдерживающую репликацию последовательностей (или 38К) (см. Сиа!е1й е! а1., 1990), систему репликазы Οβ (см. Ы/агШ е! а1., 1988), амплификацию на основе последовательности нуклеиновой кислоты (или ΝΛ8ΒΛ) (см. Ьеет15, 1992), репаративную цепную реакцию (или КСК) (см. Ьеет15, выше) и амплификацию ДНК с использованием единственного праймера (или ВОА) (см. Ьеет15, выше). В настоящее время предпочтительной является полимеразная цепная реакция.

Методы амплификации ДНК, такие как вышеприведенные методы, могут включать использованием зонда, пары зондов или двух пар зондов, которые специфически связываются с ДНК, кодирующей АроЕ 4, но не связываются с ДНК, кодирующей АроЕ 2 или АроЕ 3 в тех же самых условиях гибридизации, и которые служат в качестве праймера или праймеров для амплификации ДНК АроЕ 4 или ее части в реак- 16 021399 ции амплификации. Аналогично, может использоваться зонд, пара зондов или две пары зондов, которые специфически связываются с ДНК, кодирующей АроЕ 2, но не связываются с ДНК, кодирующей АроЕ 3 или АроЕ 4 в тех же самых условиях гибридизации, и которые служат в качестве праймера или праймеров для амплификации ДНК АроЕ 2 или ее части в реакции амплификации; и может использоваться зонд, пара зондов или две пары зондов, которые специфически связываются с ДНК, кодирующей АроЕ 3, но не связываются с ДНК, кодирующей АроЕ 2 или АроЕ 4 в тех же самых условиях гибридизации, и которые служат в качестве праймера или праймеров для амплификации ДНК АроЕ 3 или ее части в реакции амплификации.

Подобным образом, может использоваться зонд, пара зондов или две пары зондов, которые специфически связываются с ДНК, кодирующей представляющий интерес гаплотип для ТОММ40, но не связываются с другими гаплотипами для ТОММ40 в тех же самых условиях гибридизации, и которые служат в качестве праймера или праймеров для амплификации ДНК ТОММ40 или ее части в реакции амплификации.

Как правило, олигонуклеотидным зондом, используемым для обнаружения ДНК, кодирующей гаплотип для АроЕ и/или ТОММ40, является олигонуклеотидный зонд, который связывается с ДНК, кодирующей представляющий интерес гаплотип, но не связывается с ДНК, кодирующей другие гаплотипы в тех же самых условиях гибридизации. Олигонуклеотидный зонд метят подходящей, поддающейся обнаружению группой, такой как те, которые изложены ниже в связи с антителами.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) может выполняться в соответствии с известными методами. См., например, патенты США № 4683195, 4683202, 4800159 и 4965188. Как правило, ПЦР сначала включает обработку содержащего нуклеиновую кислоту образца (например, в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы) одним олигонуклеотидным праймером для каждой цепи выявляемой конкретной последовательности в условиях гибридизации, так что синтезируется продукт удлинения каждого праймера, который комплементарен каждой цепи нуклеиновой кислоты, с использованием праймеров, достаточно комплементарных каждой цепи конкретной последовательности, чтобы подвергаться гибридизации с ней, вследствие чего продукт удлинения, синтезированный с каждого праймера, после отсоединения от своего комплемента, может служить в качестве матрицы для синтеза продукта удлинения другого праймера, а затем обработку образца в денатурирующих условиях для отсоединения продуктов удлинения праймеров от их матриц, если выявляемая последовательность или последовательности присутствуют. Эти стадии циклически повторяют до достижения желаемой степени амплификации. Выявление амплифицированной последовательности можно осуществить посредством добавления к продукту реакции олигонуклеотидного зонда, способного гибридизоваться с продуктом реакции (например, олигонуклеотидного зонда по настоящему изобретению), зонда, несущего поддающуюся обнаружению метку, а затем обнаружения метки в соответствии с известными методами или посредством непосредственной визуализации в геле.

Когда условия ПЦР позволяют амплифицировать все аллельные типы АроЕ, типы можно различить посредством гибридизации с аллельспецифическим зондом, посредством расщепления рестрикционными эндонуклеазами, посредством электрофореза в градиентных гелях в денатурирующих условиях или других методов. Протокол ПЦР для определения генотипа для АроЕ описан в Хепйат с( а1. (1991), включенном сюда посредством ссылки. Примеры праймеров, эффективных для амплификации и идентификации изоформ АроЕ, описаны здесь. Можно использовать праймеры, специфичные для полиморфного участка АроЕ (либо АроЕ 4, Е3, либо Е2). В Хепйат, например, используются праймеры для ПЦР, которые амплифицируют участок размером 227 п.о. ДНК, который охватывает полиморфные сайты АроЕ (кодоны 112-158, которые содержат нуклеотиды 3745 - 3883). Амплифицированные фрагменты затем подвергают воздействию рестрикционной эндонуклеазы С£Ы, которая дает различные рестрикционные фрагменты из шести возможных генотипов для АроЕ, которые можно распознать в геле после электрофореза. Ради дополнительных способов см. также Ηίχοη е( а1. (1990); НоибЮп е( а1. (1989) Хепйат е( а1. (1991); и Копги1а е( а1. (1990), все из которых включены сюда посредством ссылки.

Помимо болезни Альцгеймера, существует несколько других генетически сложных заболеваний и нарушений, для которых способы настоящего изобретения дают преимущества над существующими анализами. Например, данные множества генетических исследований сахарного диабета типа 2 поддерживают точку зрения, что очень большой ряд клинических случаев/контролей будет необходим для обеспечения статистической значимости для локусов, определенных с помощью исследования связей по всему геному.

7. Активные агенты, композиции и лечение.

Как отмечено выше, филогенетические деревья, созданные с использованием подробно изложенных здесь способов, можно также проанализировать, исходя из чувствительности представляющего интерес состояния к лечению активным агентом или способом лечения, представляющим интерес, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, и решения в отношении лечения субъекта или пациента могут быть основаны на конкретных идентифицированных генетических вариантах.

Активные агенты. Активные агенты включают активные агенты, известные для лечения представляющего интерес состояния, и содержат активные агенты против болезни Альцгеймера, включающие, но

- 17 021399 без ограничения, ингибиторы ацетилхолинэстеразы, антагонисты рецепторов ΝΜΌΑ и агонисты или модуляторы активируемых пролифератором пероксисом рецепторов (РРАК), включающие, но без ограничения, лекарственные средства классов тиазолидиндионов или глитазара. Активный агент мог бы также быть биофармацевтическим продуктом, например, антителом (например, моноклональным, поликлональным, их производными или модифицированными антителами, такими как Όοιηαίη АпиЬоФек™. бапинеузумаб и т.д.), гибридными белками или терапевтическими молекулами РНК. Активный агент мог бы также быть комбинацией любых этих продуктов.

Примеры ингибиторов ацетилхолинэстеразы включают, но без ограничения, донепезил (имеющийся в продаже под названием АК1СЕРТ), галантамин (имеющийся в продаже под названием ΚΑΖΑΌΥΝΕ) и ривастигмин (имеющийся в продаже под названием ΕΧΕίΟΝ) и их фармацевтически приемлемые соли. Дополнительные примеры включают, но без ограничения, те, которые описаны в патентах США № 6303633, 5965569, 5595883, 5574046 и 5171750 (описания всех приведенных здесь ссылок на патенты США включены сюда в целом посредством ссылки).

Примеры антагонистов рецепторов ΝΜΌΑ включают, но без ограничения, мемантин (имеющийся в продаже под названием ΑΚΑΤΙΝΟΌ, ΑΧϋΚΑ, ΕΒΙΧΙΑ/ΑΒΙΧΙΑ, МЕМОХ и ΝΑΜΕΝΌΑ) и их фармацевтически приемлемые соли. Дополнительные примеры включают, но без ограничения, те, которые описаны в патентах США № 6956055, 6828462, 6642267, 6432985 и 5990126.

Примеры тиазолидиндионов включают, но без ограничения, росиглитазон (имеющийся в продаже под названием Авандиа) и его фармацевтически приемлемые соли. Дополнительные примеры включают, но без ограничения:

5-(4-[2-Щ-метил-^(2-бензотиазолил)амино)этокси]бензил)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^(2-бензотиазолил)амино)этокси]бензилиден)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^(2-бензоксазолил)амино)этокси]бензил)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^(2-бензоксазолил)амино)этокси]бензилиден)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^(2-пиримидинил)амино)этокси]бензил)-2,4-тиазолидиндион;

5- (4-[2-Щ-метил-^(2-пиримидинил)амино)этокси]бензилиден)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-(2-Щ-метил-^[2-(4,5-диметилтиазолил)]амино)этокси]бензил)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^[2-(4,5-диметилтиазолил)]амино)этокси]бензилиден)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^(2-тиазолил)амино)этокси]бензил)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^(2-тиазолил)амино)этокси]бензилиден)-2,4-тиазолидиндион;

5- [4-(2-Щ-метил-^(2-(4-фенилтиазолил))амино)этокси)бензил]-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^(2-(4-фенилтиазолил))амино)этокси]бензилиден)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^[2-(4-фенил-5-метилтиазолил)]амино)этокси]бензил)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^[2-(4-фенил-5-метилтиазолил)]амино)этокси]бензилиден)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^[2-(4-метил-5-фенилтиазолил)]амино)этокси]бензил)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^[2-(4-метил-5-фенилтиазолил)]амино)этокси]бензилиден)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^[2-(4-метилтиазолил)]амино)этокси]бензил)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^[2-(4-метилтиазолил)]амино)этокси]бензилиден)-2,4-тиазолидиндион;

5-[4-(2-Щ-метил-^[2-(5-фенилоксазолил)]амино)этокси)бензил]-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^[2-(5-фенилоксазолил)]амино)этокси]бензилиден)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^[2-(4,5-диметилоксазолил)]амино)этокси]бензил)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^[2-(4,5-диметилоксазолил)]амино)этокси]бензилиден)-2,4-тиазолидиндион;

5-[4-(2-(2-пиримидиниламино)этокси)бензил]-2,4-тиазолидиндион;

5-[4-(2-(2-пиримидиниламино)этокси)бензилиден]-2, 4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-ацетил-^(2-пиримидинил)амино)этокси]бензил)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-(2-Щ-(2-бензотиазолил)-^бензиламино)этокси)бензилиден)-2,4-тиазолидиндион;

5- (4-(2-Щ-(2-бензотиазолил)-^бензиламино)этокси)бензил)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[3-Щ-метил-^(2-бензоксазолил)амино)пропокси]бензил)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[3-Щ-метил-^(2-бензоксазолил)амино)пропокси]бензилиден)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^(2-пиридил)амино)этокси]бензил)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-метил-^(2-пиридил)амино)этокси]бензилиден)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[4-Щ-метил-^(2-бензоксазолил)амино)бутокси]бензилиден)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[4-Щ-метил-^(2-бензоксазолил)амино)бутокси]бензил)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-(2-бензоксазолил)амино)этокси]бензилиден)2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-(2-бензоксазолил)амино)этокси]бензил)-2,4-тиазолидиндион;

5-(4-[2-Щ-изопропил-^(2-бензоксазолил)амино)этокси]бензил)-2,4-тиазолидиндион и их фармацевтически приемлемые соли (см., например, патент США № 5002953).

Описанные здесь активные агенты можно, как отмечено выше, приготовить в форме их фармацевтически приемлемых солей. Фармацевтически приемлемыми солями являются соли, которые сохраняют желаемую биологическую активность исходного соединения и не дают нежелательные токсические эффекты. Примерами таких солей являются (а) кислотно-аддитивные соли, образованные неорганическими кислотами, например, соляной кислотой, бромисто-водородной кислотой, серной кислотой, фосфорной

- 18 021399 кислотой, азотной кислотой и т.п.; и соли, образованные органическими кислотами, таким как, например, уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, глюконовая кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, бензойная кислота, дубильная кислота, пальмитиновая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталинсульфокислота, метансульфокислота, пара-толуолсульфокислота, нафталиндисульфокислота, полигалактуроновая кислота и т.п.; (Ь) соли, образованные анионами элементов, таких как хлор, бром и иод, и (с) соли, получаемые из оснований, такие как аммонийные соли, соли щелочных металлов, такие как соли натрия и калия, соли щелочно-земельных металлов, такие как соли кальция и магния, и соли, образуемые органическими основаниями, такими как дициклогексиламин и Ν-метил-Э-глюкамин.

Активные агенты могут вводиться в виде пролекарств. Как здесь используются, пролекарства относятся к таким пролекарствам соединений настоящего изобретения, которые, по результатом тщательной медицинской оценки, подходят для приведения в контакт с тканями людей и низших животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.п., находятся в соответствии с приемлемым отношение риск/польза и эффективны в случае их намеченного применения, а также к цвиттерионным формам, по мере возможности, соединений настоящего изобретения. Термин пролекарство относится к соединением, которые быстро трансформируются ίη νίνο с выходом исходного соединения вышеприведенных формул, например, посредством гидролиза в крови. Детальное обсуждение приведено в Т. ШдисЫ апб V. 81с11а, Ρτο6ιυ§8 аз Νονοί бсПусгу ЗуЧспъ. νοί. 14 ο£ Фе А.С.8. 8утро5шт 8спс5 и в Еб\\агб В. ΕοΟβο, еб., ВюгсусШЫс Сатсгз ίη Эгид Оскщп, Атепсап ΡΗαι™α^υΐκα1 Αδδοααΐίοη апб Ρο датοη ΡΐΌ55, 1987, оба из которых включены сюда посредством ссылки. См. также патент США № 6680299. Примеры включают пролекарство, которое метаболизируется ίη νίνο субъектом в активное лекарственное средство, обладающее активностью активных соединений, описанных здесь, при этом пролекарство является сложным эфиром гидроксигруппы или карбоксильной группы, если такая группа присутствует в соединении; ацеталем или кеталем гидроксигруппы, если такая группа присутствует в соединении; Ν-основанием Манниха или имином аминогруппы, если такая группа присутствует в соединении; или основанием Шиффа, оксимом, ацеталем, эфиром эноловой кислоты, оксазолидином или тиазолидином карбонильной группы, если такая группа присутствует в соединении, например, описанном в патенте США № 6680324 и патенте США № 6680322.

Композиции.

Для введения можно составить смесь описанных выше активных агентов с фармацевтическим носителем в соответствии с известными методами. См., например, ΕωηίηβΙοη, ТНс §сюпсс Ап6 Ρ^асί^сс ο£ Ρ1ι;·ιηη;κ\· (9ΐΗ Еб. 1995). При производстве фармацевтического препарата в соответствии с настоящим изобретением активное соединение (в том числе его физиологически приемлемую соль) обычно смешивают, в числе прочих, с приемлемым носителем. Носитель должен быть, конечно, приемлемым в том смысле, что он является совместимым с любыми другими ингредиентами в препарате, и не должен быть вредным для пациента. Носитель может быть твердым веществом или жидкостью, или и тем и другим, и предпочтительно составляется в смесь с соединением в виде препарата со стандартной дозой, например, таблетки, которая может содержать от 0,01 или 0,5% до 95 или 99% по весу активного соединения. Одно или более активных соединений могут быть включены в препараты настоящего изобретения, которые можно приготовить с помощью любого из широко известных методов фармации, включающих смешивание компонентов, необязательно включающих один или более дополнительных ингредиентов.

Препараты настоящего изобретения включают препараты, подходящие для орального, ректального, местного, трансбуккального (например, сублингвального), вагинального, парентерального (например, подкожного, внутримышечного, внутрикожного или внутривенного), местного (т.е. как на поверхность кожи, так и слизистых оболочек, в том числе на поверхности дыхательных путей) и чрескожного введения, хотя самый подходящий путь в любом конкретном случае будет зависеть от природы и тяжести подвергаемого лечению состояния и от природы конкретного используемого активного соединения.

Препараты, подходящие для орального введения, могут быть представлены в дискретных единицах, таких как капсулы, саше, лепешки или таблетки, при этом каждая из них содержит заранее заданное количество активного соединения; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водном или неводном растворе; или в виде эмульсии типа масло-в-воде или вода-в-масле. Такие препараты можно приготовить с помощью любого подходящего способа фармации, который включает стадию соединения активного соединения и подходящего носителя (который может содержать один или более дополнительных ингредиентов, отмеченных выше). Как правило, препараты настоящего изобретения готовят посредством равномерного и тесного перемешивания активного соединения с жидкостью или высокодисперсным твердым носителем, или с тем и с другим, а затем, при необходимости, формования результирующей смеси. Например, таблетку можно приготовить посредством прессования или формовки порошка или гранул, содержащих активное соединение, необязательно с одним или более дополнительными ингредиентами. Прессованные таблетки можно приготовить посредством прессования, в подходящем устройстве, соединения в порошкообразной форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанного со связующим веществом, смазывающим веществом, инертным разбавителем и/или поверхностно-активным веществом(ами)/диспергатором(ами). Формованные таблетки можно изготовить посред- 19 021399 ством формовки, в подходящем устройстве, порошкообразного соединения, увлажненного инертным жидким связующим веществом.

Препараты, подходящие для трансбуккального (сублингвального) введения, включают лепешки, включающие активное соединение в ароматизированной основе, обычно сахарозе и аравийской или трагакантовой камеди; и пастилки, включающие соединение в инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахарозе и аравийской камеди.

Подходящие для парентерального введения препараты настоящего изобретения, являющиеся предпочтительно изотоническими с кровью намеченного реципиента, включают стерильные водные и неводные растворы для инъекций активного соединения(й). Эти препараты могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические факторы и растворенные вещества, которые придают препарату изотоничность с кровью намеченного реципиента. Водные и неводные стерильные суспензии могут включать суспендирующие агенты и загустители. Препараты могут быть представлены в упаковке одной стандартной дозы или в упаковке для многократного приема, например, герметически закупоренных ампулах или флаконах, и могут храниться в лиофилизированном состоянии, требующим лишь добавления стерильного жидкого носителя, например, солевого раствора или воды для инъекции непосредственно перед использованием. Инъецируемые растворы и суспензии по индивидуальным рецептам можно приготовить из стерильных порошков, гранул и таблеток ранее описанного вида. Например, в одном аспекте настоящего изобретения предоставляется инъецируемая, стабильная, стерильная композиция, включающая активный агент(ы), или ее соль, в стандартной лекарственной форме в герметически закрытой упаковке. Соединение или соль предоставляются в форме лиофилизата, который можно воссоздать с использованием подходящего фармацевтически приемлемого носителя с образованием жидкой композиции, подходящей для ее инъекции субъекту. Стандартная лекарственная форма обычно включает от приблизительно 10 мг до приблизительно 10 г соединения или соли. Когда соединение или соль являются по существу нерастворимыми в воде, можно использовать эмульгатор, который является физиологически приемлемым, в количестве, достаточном для приготовления эмульсии соединения или соли в водном носителе. Одним из таких применимых эмульгаторов является фосфатидилхолин.

Препараты, подходящие для местного нанесения на кожу, предпочтительно принимают форму мази, крема, лосьона, пасты, геля, разбрызгиваемого раствора, аэрозоля или масла. Носители, которые могут использоваться, включают вазелин, ланолин, полиэтиленгликоли, спирты, усилители чрескожной доставки и комбинации двух или более указанных носителей.

Препараты, подходящие для чрескожного введения, могут быть представлены в виде отдельных пластырей, приспособленных к сохранению в тесном контакте с эпидермисом реципиента в течение длительного периода времени. Препараты, подходящие для чрескожного введения, могут также доставляться посредством ионтофореза (см., например, Ρΐιαπηαοοιιΐίοαΐ КекеагсЬ 3 (6): 318 (1986)) и обычно принимают форму необязательно забуференного водного раствора активного соединения. Подходящие препараты включают цитратный или бис/трис буфер (рН 6) или этанол/воду и содержат 0,1-0,2 М активный ингредиент.

Помимо активного соединения(й), фармацевтические композиции могут содержать другие добавки, такие как добавки для регулирования рН. В частности, применимые рН-регулирующие агенты включают кислоты, такие как соляная кислота, основания или буферы, такие как лактат натрия, ацетат натрия, фосфат натрия, цитрат натрия, борат натрия или глюконат натрия. Кроме того, композиции могут содержать предохраняющие от микробов средства. Применимые предохраняющие от микробов средства включают метилпарабен, пропилпарабен и бензиловый спирт. Предохраняющее от микробов средство обычно используют при размещении препарата во флаконе, предназначенном для многократного использования. Конечно, как отмечено, фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть подвергнуты лиофилизации, используя широко известные в данной области техники методы.

Доза. Терапевтически эффективная доза любого конкретного активного агента, применение которого входит в объем настоящего изобретения, будет меняться до некоторой степени при переходе от соединения к соединению и от пациента к пациенту и будет зависеть от состояния пациента и пути доставки. Для орального введения может использоваться общая суточная доза, составляющая от 1, 2 или 3 мг вплоть до 30, 40 или 50 мг, назначаемая в виде одной суточной дозы или в виде суточной дозы, разделенной на два или три приема.

Лечение. Генетические варианты, описанные здесь или обнаруженные с использованием способов, которым здесь обучают, могут использоваться для определения курса лечения пациента, пораженного состоянием (например, состоянием, связанным с АроЕ и/или ТОММ40), с помощью, например, определения того, какой активный агент и/или курс лечения должен быть назначен, исходя из присутствия или отсутствия генетического варианта или вариантов. Присутствие или отсутствие генетических вариантов может показывать эффективность активного агента и/или курса лечения для пациента, предсказывать возраст возникновения состояния, указывать на предпочтительные схемы введения доз и т.д. Для пациента может быть составлен генетический профиль, и к профилю обращаются для определения, находится ли пациент в группе пациентов, которые, вероятно, чувствительны к конкретному активному агенту.

Вместе с активным агентом можно упаковать или иначе соединить инструкции в отношении при- 20 021399 менения, в которых указаны рекомендации в отношении лечения, времени до лечения, схем введения доз и т.д., исходя из присутствия или отсутствия генетических вариантов.

8. Способы предсказания риска заболевания или установления прогноза.

Для предсказания риска заболевания для индивидуума без симптомов или установления прогноза (перспективы поражения или хода заболевания, ожидаемой(ого) на основе обычного хода заболевания или особенностей случая) в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения можно обработать диагностические данные, включающие диагноз или историю болезни пациента, и генетические данные, такие как генотип пациента (например, генотип для АроЕ и/или ТОММ40), для установления терапевтических опций и предсказаний исхода. Обработка может включать составление профиля пациента, например, сборку историю болезни пациента, включающую возраст и анатомический пол, генотипирование представляющих интерес локусов (например, используя соответственно разработанные праймеры и используя ОТ-ПЦР или стадию амплификации с помощью ПЦР, и/или генотипирование, например, используя способ с использованием антител или ферментный анализ) и статистические или другие анализы, которое трансформируют эти исходные данные в прогноз. Прогноз может включать предсказание возраста возникновения заболевания у пациента, ответную реакцию на лекарственную терапию, время до лечения, эффективность лечения и т.д. В некоторых вариантах осуществления прогнозирование может включать использованием компьютерной программы программного обеспечения для анализа данных пациента и прогонки статистических перекрестных контролей против реляционной базы данных для трансформации данных или профиля пациента в прогноз.

Профиль пациента включает данные и/или материалы, имеющие отношение к пациенту, для которого выполняют анализ с прогнозированием и/или прогнозный анализ. Данные могут включать информацию о диагнозе, возрасте, анатомическом поле и/или генотипе пациента. Профиль пациента может также включать материалы от пациента, такие как кровь, сывороточные белковые образцы, спинномозговая жидкость или очищенная РНК или ДНК.

9. Распределение по генотипам в клинических испытаниях.

Определение генотипа, которому обучают здесь, или с использованием описанных здесь способов можно использовать при проведении клинического испытания таким же образом, как используется другая информация о генотипах для проведения клинического испытания, например, описанного в патентах США № 6573049, 6368797 и 6291175.

В некоторых вариантах осуществления такие способы предпочтительно распределяют или позволяют подразделить популяцию пациентов (например, с помощью разделения популяции на одну или более подгрупп), вследствие чего преимущества конкретных схем лечения можно определить точнее, особенно в отношении конкретных субпопуляций пациентов с конкретными генотипами. В некоторых вариантах осуществления такие способы включают назначение исследуемого активного агента или терапии множеству субъектов (контрольной терапии или плацебо-терапии, обычно назначаемой отдельному, но аналогично охарактеризованному множеству субъектов) и определение присутствия или отсутствия генотипа (например, АроЕ и/или ТОММ40), как описано выше, у множества субъектов. Генотип можно определять до, после стадии назначения исследуемой терапии или одновременно с ней. Влияние одной или более выявленных аллелей на исследуемую терапию можно затем определить по любому подходящему параметру или возможному исходу или последствию лечения, в том числе, но без ограничения, эффективности указанной терапии, отсутствию побочных эффектов терапии и т.д.

Клиническое испытание можно организовать для проверки эффективности исследуемых соединений в лечении любого ряда заболеваний, с которым, как установлено, связан конкретный генотип, на субъектах, у которых диагностировано заболевание или которые подвержены риску развития заболевания. Если субъекты подвергнуты генотипированию после завершения клинического испытания, анализы все еще направлены на определение связи между лечением заболевания и аллелем, оцениваемым в отношении эффективности. Альтернативно, если у субъекта с симптомами или без них заболевание еще не было диагностировано, но определено, что он подвержен риску развития заболевания, могут быть проведены клинические испытания, схожие с описанными выше клиническими испытаниями.

При планировании групп лечения могут также учитываться лежащие в основе биологические механизмы. Например, фрагмент (1-272) АроЕ 4 связывается с митохондриями, снижает динамику митохондрий в клетках и уменьшает синаптогенез больше, чем АроЕ 3 (1-272). Росиглитазон, лекарственное средство - кандидат на лечение болезни Альцгеймера, увеличивает митогенез и увеличивает синаптогенез - в противоположность эффектам связывания фрагмента АроЕ - в случае АроЕ 3 больше, чем в случае АроЕ

4. Поэтому лекарственное средство или лечение -кандидат (например, росиглитазон) можно выбрать, исходя из лежащего в основе механизма действия, поскольку он связан с генетическими маркерами, используемыми для распределения (например, АроЕ 2, Е 3, Е 4 и/или вариантами ТОММ40).

Оценка эффективности лекарственного средства, выбранного для испытания, может включать наблюдение за субъектом в течение периода времени и анализ задержки начала заболевания и замедление интенсивности заболевания в момент возникновения, а также определение возникновения симптомов, сопровождающих заболевание. Лекарственное средство, которое в клиническом испытании исключает или задерживает начало заболевания, или ослабляет симптомы заболевания, может быть лекарственным

- 21 021399 средством, полезным для применения к пациентам, у которых диагностировано заболевание или которые подвержены риску развития заболевания. Исследуемые соединения, которые могут использоваться в таких испытаниях, включают описанные выше агенты, в том числе агенты, ранее разрешенные для клинического применения, и новые соединения, еще не разрешенные для применения или разрешенные для лечения конкретного заболевания. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления клиническое испытание может включать оптимизацию введения лекарственного средства, в том числе дозы, выбора времени введения, токсичности или побочных эффектов, пути введения и эффективности лечения.

10. Наборы, применимые для детектирования вариантов генотипа в представляющих интерес локусах.

Здесь предусматриваются наборы для определения того, подвержен ли субъект увеличенному риску развития заболевания, развития заболевания в раннем возрасте возникновения, и/или он является кандидатом на конкретное лечение, причем указанное заболевание (например, болезнь Альцгеймера с поздним началом) связано с АроЕ и/или ТОММ40. Наборы включают по крайней мере один реагент, специфичный для детектирования присутствия или отсутствия варианта АроЕ и/или ТОММ40, как здесь описывается, и могут включать инструкции для оказания помощи в определении того, подвержен ли субъект увеличенному риску развития заболевания. Набор может необязательно включать нуклеиновую кислоту для детектирования гена АроЕ (например, АроЕ 2, АроЕ З и/или АроЕ 4) или инструкции в отношении способов изоэлектрофокусировки для детектирования генотипа для АроЕ; и/или нуклеиновую кислоту для детектирования варианта ТОММ40, как здесь описано. В некоторых вариантах осуществления набор может необязательно включать одно или более антител, которые связываются с АроЕ 2, АроЕ 3, АроЕ 4 или с изоформами ТОММ40. Набор для анализа может быть упакован любым подходящим образом, при этом обычно все элементы находятся в одном контейнере вместе с листком напечатанных инструкций для выполнения анализа.

В некоторых вариантах осуществления набор может необязательно содержать буферы, ферменты и реагенты для амплификации геномных нуклеиновых кислот посредством амплификации с затравкой праймером(ами). Набор может также включать одно или более устройств для детектирования присутствия или отсутствия конкретных гаплотипов в амплифицированной нуклеиновой кислоте. Такие устройства могут включать один или более зондов, которые гибридизуются с нуклеиновой кислотой гаплотипа, которые могут быть прикреплены к устройству в виде биочипа или ранжированного микроряда, такому как любое из устройств, описанных в патенте США № 6355429. Устройство в виде биочипа или ранжированного микроряда необязательно содержит по крайней мере один прикрепленный к поверхности зонд для захвата, который может гибридизоваться с последовательностью гаплотипа. В предпочтительных вариантах осуществления биочип или ранжированный микроряд содержит множество зондов, а наиболее предпочтительно он содержит по крайней мере один зонд для последовательности гаплотипа, которая, в случае ее присутствия, будет амплифицироваться с помощью набора фланкирующих праймеров. Например, если для амплификации используются пять пар фланкирующих праймеров, устройство могло бы содержать по крайней мере один специфичный для гаплотипа зонд для каждого продукта амплификации или по крайней мере пять зондов. Предпочтительно набор также включает инструкции в отношении использования компонентов набора.

Настоящее изобретение детальнее объяснено в следующих неограничивающих примерах.

Пример 1. Построение филогенетических деревьев.

Во всех из известных исследований, основанных на сканировании всего генома, демонстрируются весьма значимые значения р по локусу аполипопротеинаС1 [АроС1] (МаЫеу с1 а1., Ргос. ΝαΙΙ. Асаб. δοί. И8А 103: 5644-5651 (2006), Сооп е1 а1., I. С1ш. РкусЫабу 68: 613-618 (2007); Ы е1 а1., АгсБ. №иго1. 65: 4553 (2007)). В равной степени важно то, что в каждой серии был идентифицирован пользующийся преимуществом ген-кандидат спорной значимости вне участка неравновесного сцепления с АроЕ, но эти преимущественные гены-кандидаты были различными в каждом исследовании. ТОММ40 находится около АроС1 и в неравновесном сцеплении с АроЕ. Полагают, что взаимодействия между АроЕ 3 или АроЕ 4 и различными изоформами ТОММ40 связаны с увеличенным или уменьшенным риском развития болезни Альцгеймера в пределах раннего возраста. На фиг. 2 представлены графики зависимости возраста возникновения от генотипов Аро 4/4, 3/4, 3/3, 2/4 и 2/3, показывающие область риска для раннего развития заболевания в зависимости от профиля АроЕ. Однако АроЕ сам по себе, по-видимому, не объясняет все из данных в этих кривых зависимости от возраста возникновения.

Были предложены различные способы полиморфного профилирования риска развития болезни Альцгеймера, связанного с различными аллелями АроЕ (см., например, заявку на патент США, поданную Сох и др., № 20060228728; заявку на патент США, поданную Ы и Огире, № 20080051318). Здесь демонстрируется филогенетический подход к проблеме, связанной с АроЕ 4.

Биологические образцы, выделение ДНК, амплификация представляющих интерес локусов. Всего 340 субъектов включали 135 пациентов с болезнью Альцгеймера и 99 подобранных по возрасту контролей в группе А, а также 57 пациентов и 49 контролей в группе В. Все субъекты несли генотипы для АроЕ, для которых ранее была установлена связь с более высоким риском раннего возникновения заболевания (т.е. 3/3, 3/4 или 4/4). Биологические образцы, содержащие ДНК, получали от всех субъектов.

- 22 021399

Геномную ДНК затем выделяли в соответствии с общепринятыми способами для секвенирования генетических локусов на хромосоме 19.

На фиг. 3 представлены генетические участки на хромосоме 19, намеченные для исследования, используя полученные с помощью сканирования всего генома данные множества сообщений. Этот участок заключен в контрольную последовательность в СепВапк -ЛГ050154. Использовали программное обеспечение (например, С1и8!а1^2, Еигореап Вюш&гтаИск 1п8!йи!е) для создания совмещений множества последовательностей для вариантов локусов. Впоследствии совмещения множества последовательностей анализировали, используя программное обеспечение для построения филогенетических деревьев (например, МЕСА версии 2.1, СеШег Гог ЕуоЬФопагу Рипсйопа1 Сепописх. ТКЕЕУОЬУЕ, ЬераПтеШ оГ Ζοо1оду, Итуегкйу оГ ОхГогй, или программное обеспечение для построения по принципу экономности, такое как РАИР, 81паиег А88ос1а!е8). Статистические анализы можно выполнить с использованием, например, анализа генетических данных (СНА: программного обеспечения для анализа дискретных генетических данных, ТЬе Вю1пГогтайс8 КезеагсЬ СеШег оГ ЫойЬ СагоЬпа 8!а!е ишуегзЬу). Результаты анализа участка В представлены на филогенетическом дереве фиг. 4.

Каждый блок данных на фиг. 4 представляет отмеченный вариант последовательности. Эти варианты могут быть заменами, инсерциями, делециями нуклеотидов или микросателлитами и могут или могут не приводить к выявляемым различиям в экспрессии гена или функции белка. Каждый вариант представляет вариант (или ряд вариантов), который встречается на более чем одной хромосоме. Соседние узлы определяют границы последовательностей, которые находятся в цис-положении, а, следовательно, с большей вероятностью наследуются как единица, в представляющем интерес участке на хромосоме субъекта. Узлы, предшествующие наибольшему числу последующих узлов, представляют варианты эволюционного предка, на основе которых происходила генетическая дивергенция в течение времени.

Наличие у субъекта гаплотипов или вариантов последовательности, находящихся в соответствии с участками дерева, представляющими субъектов со значительно более высокой частотой возникновения болезни Альцгеймера (т.е. более высокими отношениями субъектов, пораженных заболеванием, к непораженным контрольным субъектам), вероятно, означает, что этот отдельный субъект также подвержен увеличенному риску. С другой стороны, значительно более низкие отношения соответствуют уменьшенному риску развития болезни Альцгеймера.

ТОММ40 взаимодействует с АроЕ непосредственно при регуляции импортирования белков в митохондрии, и существующая в настоящее время гипотеза состоит в том, что экспрессия особого варианта(ов) ТОММ40 увеличивает относительно умеренный риск болезни Альцгеймера, связанный с дозозависимым присутствием аллеля АроЕ 3. Такой вариант ТОММ40 обнаружен в участке В, используя способы настоящего изобретения.

Проверка новых лекарственных средств на являющихся людьми субъектах несет огромный риск (см. КеШег апй СоЬеп, Ьапсе!, 368: 1387-1391 (2006)). Использование филогенетических деревьев для предвидения ответной реакции индивидуума на представляющее интерес лекарственное средство или лечение способно к значительному уменьшению этого риска. Предварительные исследования показали, что росиглитазон (АуапФа) может обладать специфичной для генетического профиля эффективностью в лечении болезни Альцгеймера (см. К|8пег е! а1., ТЬе РЬагтасодеиотюх 1оигпа1 6, 246-254 (2006); ВгойЬеск е! а1., Ргос. Ыа!. Асай. 8ск 105, 1343-1346 (2008)). Данные клинического испытания фазы II указывают на то, что пациенты с болезнью Альцгеймера без аллеля АроЕ 4 имели лучшую ответную реакцию на росиглитазон, чем пациенты, которые несут аллели или 1, или 2 АроЕ (не представленные данные). Это подтверждает гипотезу, что варианты, идентифицированные с помощью способов, которым обучают здесь, могут использоваться для предвидения ответной реакции индивидуума на лечение, исходя из генотипа.

Пример 2. Идентификация представляющих интерес вариантов ТОММ40.

Были совмещены 174 последовательности (2 от каждого из 87 субъектов), используя программу СЬи8ТАЬ X (версии 2.0.10, Ьагкт е! а1., С1и8!а1 и С1и8!а1 X версии 2.0. ВюшГогтайсх, 23:2947-2948 (2007)). Совмещение множества последовательностей использовали для построения филогенетического дерева, используя алгоритм для ближайшего связывания (8аЬои апй №ί, ТЬе ие^дЬЬο^-^ο^п^и§ те!Ьой: а пе\у те!Ьой Гог гесоп8!гис!т§ рЬуЦдепейс !гее8. Мо1. Еуо1. Вю1., 4: 406-425 (1987)), внедренный на сайте Еигореап ВютГогтаЬс8 ЬъШШе (ЕВ1).

Результирующее филогенетическое дерево имеет структуру из двух основных групп (А, В) при первой дивергенции. Частоты генотипов для АроЕ для этих групп сведены в таблицу и представлены на фиг.

5. Очевидно, что группа В содержит гаплотипы-субъекты в основном с генотипами ε3/ε3 и ε3/ε4 АроЕ и почти не содержит ε4/ε4. Почти вся группа А состоит из гаплотипов-субъектов с генотипом ε4/ε4.

Перечень полиморфизмов, созданный с помощью платформы для обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов (Ро1утогрЫс), использовали для идентификации конкретных вариантов в гене ТОММ40, что разделило данные на две группы. Тест отношений правдоподобия использовали для идентификации значимых вариантов с величиной р, составляющей менее 0,005.

Перечень вариантов сведен в табл. 1. В таблице термин делеция используется, когда минорный

- 23 021399 аллель представляет собой делецию нуклеотида, а термин инсерция используется, когда минорный аллель представляет собой добавление нуклеотида. Термин делеционный/инсерционный полиморфизм используется, когда существуют более двух возможных форм, а минорный аллель не является явным. Например, в случае полиморфизмов поли-Т отмечаются множество полиморфизмов длин. Во втором столбце таблицы представлена информация о названиях конкретных аллелей, связанных с вариантом, которые делят последовательности на две группы. Например, Т>А означает, что аллель Т сортирует последовательности в группу А на филогенетическом дереве. Когда перечислены два аллеля, например, 0>В; А>А, каждый аллель однозначно сортирует данные о последовательностях в две группы, в то время как, когда приведен один аллель, он связан с доминирующей сортировкой данных, а остающийся аллель однозначно не сортирует данные в гомогенную группу, а вместо этого смесь обеих групп.

Таблица 1

Варианты ТОММ40, связанные с группами на филогенетическом дереве, которые распределяют по генотипу для АроЕ

Вариант	Аллель>группа на дереве	Локализация в геноме (компоновка Зб.ЗТЧСВГ)	Функция	иске Классификация
50092565	1>А	50092565	Интрон 6	замена одного нуклеотида
50092587	Т>А	50092587	Интрон 6	замена одного нуклеотида

- 24 021399

«8106922	С>В; А>А	50093506	Интрон 6	замена одного нуклеотида
«34896370, «55821237, «56290633	Т12_С_Т15, Т12_С_Т16, Т13_С_Т14, Т13_С_Т15, Т13_С_Т16>А; Т14_С_Т14; Т14СТ15ХЗ	50093609	Интрон 6	комплексный
гз34878901	Т>В; С>А	50094317	Интрон 6	замена одного нуклеотида
«35568738	ОВ	50094558	Интрон 6	замена одного нуклеотида
«10602329	Т16,17,18>А Т14,15>В	50094716	Интрон 6	инсерция/ делеция
50094733	->А	50094733	Интрон 7	инсерция
«10524523	Т12,14,15,1б,17>В Т21,22,26,27,28,29,30, 31,32,33,34 35,36>А	50094889	Интрон 6	инсерция/ делеция
«1160985	Т>В; С>А	50095252	Интрон 6	замена одного нуклеотида
50095506	Т>А	50095506	Интрон 6	замена одного нуклеотида
«760136	А>А;О>В	50095698	Интрон 6	замена одного нуклеотида
«1160984	Т>В	50095764	Интрон 6	замена одного нуклеотида
«741780	ОВ; 1>А	50096271	Интрон 8	замена одного нуклеотида
«405697	А>А	50096531	Интрон 9	замена одного нуклеотида
50096647 (ΏΙΡ3)	->А	50096647	Интрон 9	делеция
50096697	ОА	50096697	Интрон 9	замена одного нуклеотида
«1038025	ОВ; Т>А	50096812	Интрон 9	замена одного нуклеотида
«1038026	О>В; А>А	50096902	Интрон 9	замена одного нуклеотида
«1305062	С>В; О>А	50097361	Интрон 9	замена одного нуклеоткца
«34215622	ОВ; ->А	50098378	Экзон 10	инсерция
«10119	А>А	50098513	Экзон 10	замена одного нуклеотида
«7259620	ОА; А>В	50099628	Не известна	замена одного нуклеотида

Пример 3. Две отличные формы АроЕ 3: формы, сцепленные с гаплотипами для ТОММ40, которые увеличивают риск и снижают возраст возникновения, и формы, которые уменьшают риск.

Связь генотипов для аполипопротеина Е (АроЕ), особенно АроЕ ε4 (АроЕ 4), с риском и возрастом

- 25 021399 возникновения болезни Альцгеймера (АО) остается наиболее подтвержденной генетической связью для любого сложного заболевания. Оценки наследуемости АроЕ 4 в случае болезни Альцгеймера с поздним началом колеблются от 58 до 79%, и присущий популяции риск вследствие аллеля АроЕ 4 находится между 20 и 70%. Эти оценки наводят на мысль, что другие генетические варианты и/или взаимодействия между вариантами несут дополнительный риск заболевания и модифицируют распределения по возрасту возникновения.

Результаты исследования связей с помощью сканирования всего генома в случае болезни Альцгеймера раз за разом отражали необыкновенную связь участка неравновесного сцепления, содержащего АроЕ. ТОММ40, ген белка транслоказы внешней митохондриальной мембраны, находится в высоком неравновесном сцеплении с АроЕ, и кодирует мембранный канал, через который цитоплазматические пептиды и белки перемещаются для синтеза новых митохондрий. Целью авторов настоящего изобретения была идентификация дополнительных гаплотипов в участке неравновесного сцепления, которые увеличивают оценки наследуемости.

Способы. Был исследован участок неравновесного сцепления, содержащий и АроЕ, и ТОММ40, используя глубокое (10Х) первичное секвенирование у пациентов с болезнью Альцгеймера и контролей. Были проведены филогенетические анализы участка неравновесного сцепления, охватывающего ТОММ40 и АроЕ, у 66 пациентов и 66 подобранных по возрасту контролей в отношении риска и распределения по возрасту возникновения.

Заключение. Установлено, что уникальные и отличные наследуемые семейства различных вариантов ТОММ40 находятся в том же отрезке генома, что и АроЕ 3, но не в отрезке генома, содержащем АроЕ 4, и могут либо увеличивать, либо уменьшать распределение по возрасту риска болезни Альцгеймера. Следовательно, генетическая наследуемость этих вариантов ТОММ40 не зависит от наследуемости АроЕ 4, обеспечивая тем самым разграничение двух отличных форм АроЕ 3: форм, сцепленных с гаплотипами ТОММ40, которые увеличивают риск и снижают возраст возникновения, и форм, которые уменьшают риск. Эти данные увеличивают точность генетического, связанного с возрастом возникновения риска, зависящего от возраста, генотипов для АроЕ и ТОММ40 и дают возможность определить высокий риск болезни Альцгеймера в течение следующих 5-7 лет, против низкого риска болезни Альцгеймера.

Пример 4. Анализ трех идентифицированных ΏΧΡ-вариантов ТОММ40.

Три варианта ТОММ40, идентифицированные в этом изобретении, представляют собой делеционные/инсерционные полиморфизмы (ΏΙΡ), локализованные в интроне 6 или интроне 9. Эти ΏΙΡ отождествлены с Г810524523 и Г810602329 в базе данных ^δΝΡ Национального центра биотехнологической информации (ЫСВ1), а третий ΏΙΡ определен как ранее не описываемый полиморфизм, названный ΏΙΡ3. Эти полиморфизмы находятся в хромосоме 19:50094889, хромосоме 19:50094731 и хромосоме 19:50096647, соответственно, в соответствии с компоновкой 3 6 NСВI. В этом изобретении описывается идентификация этих ΏΙΡ, используя филогенетический анализ гена ТОММ40, в частности, фрагмента размером 10 т.п.о. этого гена, и то, что эти ΏΙΡ связаны с различными эволюционными группами, определенными с помощью филогенетического анализа. Кроме того, в этом изобретением описывается полезность этих ΏΙΡ для (1) определения риска развития болезни Альцгеймера у здорового человека в будущем и (2) для предсказания возраста возникновения болезни Альцгеймера в пределах срока, составляющего приблизительно 8 лет.

Три ΏΙΡ-полиморфизма, охарактеризованных здесь, соответствуют различным длинам повторов поли-Т ΏΙΡ в гене ТОММ40. Связь вариантов поли-Т ΏΙΡ с риском заболевания обладает первенством. Например, вариант поли-Т в интроне 8 гена регулятора трансмембранной проводимости при муковисцидозе (СРТК) связан с пропуском экзона 9 и развитием миковисцидоза (Оготаи е! а1., Ат 1 Нит Оеие! 74(1): 176-179 (2004)). Здесь описывается (1) применение нового способа - филогенетического исследования связей (описанного выше) - для идентификации ΏΙΡ, позволяющих предсказать риск заболеваний и/или различия в возрасте возникновения заболевания, (2) название трех специфических ΏΙΡ, связанных с различиями в возрасте возникновения болезни Альцгеймера и риске болезни Альцгеймера, (3) применение этих δΝΡ по отдельности, вместе или с другими вариантами последовательностей ТОММ40 или АроЕ для диагностирования заболевания или предсказания или определения характеристик заболевания, таких как возраст возникновения заболевания, прогноз заболевания, подтипы заболевания, тяжесть заболевания, а также для анализа или определения ответной реакции на лекарственные средства.

Филогенетический анализ обнаружил распределение ΏΙΡ г§10524523 и г§10602329 по двум различным монофилетическим таксонам. Этот анализ обнаружил, что более короткие длины поли-Т в этих локусах локализуются в филогенетически идентифицированных таксонах в группе В, группе, которая также включает более высокое процентное содержание субъектов с генотипом АроЕ ε3/ε3, действительное незначительное (0%) число субъектов с АроЕ ε4/ε4 и характеризуется более низкими отношениями пациент/контроль (т.е. риском болезни Альцгеймера) (фиг. 5). Связь между длиной ΏΙΡ и филогенетической группой является статистически значимой (р < 0,0001) при использовании теста отношений правдоподобия или критерия хи-квадрат Пирсона.

- 26 021399

Из-за геномной архитектуры, высокого неравновесного сцепления и эволюционных связей, как показал филогенетический анализ, между двумя генами и предполагаемого физического взаимодействия продуктов двух генов влияние генотипа для ТОММ40, вероятно, распространяется на другие заболевания, на которые оказывает влияние генотип для АроЕ. Эти заболевания включают, но без ограничения, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз, сердечно-сосудистое заболевание, дислипидемию, реконвалесценцию после травматического повреждения головного мозга, реконвалесценцию после случаев ишемии головного мозга, ответную реакцию на анестетики и ответную реакцию на лекарственные средства, используемые для лечения болезни Альцгеймера и перечисленных выше заболеваний.

Эти полиморфизмы могли бы также использоваться при попытках отбора соединений, применимых для лечения заболеваний, на которые оказывают влияние вариации в белке ТОММ40 или АроЕ или варианты этих генов, для обнаружения лекарственного средства.

Кроме того, варианты могут оказывать влияние на терапии, основанные на специфически нацеленных биофармацевтических препаратах, примерами которых являются моноклональные антитела и молекулы коротких интерферирующих РНК, или определять их.

ΌΙΡ-полиморфизмы в ТОММ40, которые описываются здесь, можно идентифицировать на основе образца ДНК индивидуума, используя множество различных молекулярных методик нуклеотидного анализа, в том числе, но без ограничения, ДНК-секвенирование с праймерами, отмеченными в табл. 4, включенными в список ниже.

Пример 5. Более длинные участки поли-Т в гк10524523 значимо коррелируют с ранним возрастом возникновения болезни Альцгеймера с поздним началом.

Филогенетический анализ был использован для идентификации геномных связей между генетическими вариантами с низкой частотой и для образования кластеров эволюционно родственных гаплотипов (НаНп е! а1. Рори1айоп депейс апб рйу1одепейс еу1бепсе Гог рокШуе ке1есйоп оп теди1а1огу ти1абопк а! 1Не ГасЮг VII 1осик ίη Нитапк. Сепейск 167, 867-77 (2004)). Эту методику использовали для исследования блока неравновесного сцепления АроЕ-ТОММ40 в отношении существования новых решающих факторов риска развития болезни Альцгеймера с поздним началом. В предварительном исследовании 23 т.п.о. ДНК, содержащей гены ТОММ40 и АроЕ, были подвергнуты амплификации и секвенированию, и были определены с синхронизацией гаплотипы для 72 пациентов с болезнью Альцгеймера с поздним началом и 60 подобранных по возрасту контролей (Ы е! а1. Сапб1ба1е кЙ1д1е-пис1еойбе ро1утотрЫктк Ггот а депоте\\абе аккоаайоп кЮбу оГ Акйешег бйеаке. АгсН №иго1 65, 45-53 (2008)). Стало возможным построение отличного филогенетического дерева для 10 т.п.о., кодирующих экзоны 2-10, этого участка. Были выделены два монофилетических таксона (А и В) с прочным подтверждением методом ступенчатого перехода от малых значений к большим и наоборот (98%, 1000 повторов). Существовало значимое различие в распределении генотипов для АроЕ между двумя таксонами гаплотипов для ТОММ40 на этом филогенетическом дереве, наводя на мысль, что этот участок мог бы быть функционально значимым. Оба таксона включали субъектов с генотипом ε3/ε3, но 98% всех гаплотипов в таксоне В встречались в цис-положении с аллелем АроЕ ε3 (Р=1,2х10^-18, точный критерий Фишера, двусторонний).

Впоследствии филогенетическая структура этого участка размером 10 т.п.о. ТОММ40, специфичное для АроЕ ε3 наследование конкретных гаплотипов и название специфичных для монофилетических таксонов полиморфизмов были подтверждены в двух независимых группах пациентов с болезнью Альцгеймера с поздним началом/контролей, включающих одну группу с данными о подтвержденном с помощью аутопсии о состоянии болезни Альцгеймера и возрасте возникновения заболевания. Для этих двух групп была также исследована связь между двумя монофилетическими таксонами и риском заболевания и возрастом возникновения заболевания, в случае наличия данных. Первая группа (АБ), установленная в Ап/опа А1/Не1тег'к Эйеаке КекеагсН СеШег (АЭКС), включала пациентов с болезнью Альцгеймера (п=74) и контроли (п=31). Вторая группа (ИБ) была составлена в Энке Вгуап АЭКС и включала только субъектов с АроЕ ε3/ε4 (40 пациентов с подтвержденным с помощью аутопсии диагнозом и с известным возрастом возникновения заболевания и 33 контролей) (табл. 2). Хотя ДНК-секвенирование было успешным для субпопуляции группы ОБ, у которой заболевание возникло в возрасте от 50 до 68 лет, исследования связей были ограничены исследованиями на субпопуляции пациентов, у которой болезнь Альцгеймера развилась после возраста 60.

Таблица 2

Составы групп. Для каждой группы представлено число пациентов и контролей, средний возраст и процент женщин. В качестве среднего возраста задан возраст при диагностировании болезни Альцгеймера для пациентов и возраст в момент обследования для контролей. В скобках представлено среднеквадратическое отклонение (БЭ) от среднего значения

Группа		Средний возраст	% женщин
Пациенты	Контроли	Пациенты	Контроли	Пациенты	Контроли
А8	74	31	81,7	(8,01)	77	(8,93)	56,3	46,7
РЗ	40	33	69,3	(8,3)	71,9	(7,5)	70	66,7

- 27 021399

Было построено филогенетическое дерево со структурой, схожей с таковой филогенетического дерева, построенного в предварительном исследовании, с прочным подтверждением методом ступенчатого перехода от малых значений к большим и наоборот (97%, 1000 повторов), для группы А8. Субъекты с АроЕ ε4/ε4 встречались лишь в монофилетическом таксоне А (98% разделение между группами, Р=2,0х 10^-4, точный критерий Фишера, двусторонний), в то время как остальные генотипы для АроЕ были распределены между таксонами А и В (фиг. 6). Т.е. АроЕ ε4 находился всегда в неравновесном сцеплении с вариантами таксона А, тогда как АроЕ ε3 встречался в гаплотипах и таксона А, и таксона В. Анализ распределения немногочисленных субъектов сАроЕ ε2/ε4 на филогенетическом дереве наводит на мысль о том, что гаплотипы АроЕ ε2-ΤΟΜΜ40 и гаплотипы АроЕ ε3-ΤΟΜΜ40 разделяют схожую эволюционную историю (не представленные данные). Для подтверждения филогенетической структуры с использованием отличного способа и для гарантии того, что рекомбинация в генетическом участке не вносила помехи в структуру филогенетического дерева, построенного для группы А8, были также построены сети гаплотипов, используя экономность при статистическом анализе (ТС8 версии 1.21 (С1етеп1 е1 а1. ТС8: а сотрШег ргодгат ΐο екбта1е депе депеа1од1ек. Μο1 Есо1 9, 1657-1659 (2000))). Два основных кластера субъектов-гаплотипов, полученные на основе двух способов (максимальной экономности и ТС8), совпадали.

Связь с пациентами с болезнью Альцгеймера чаще устанавливалась в случае монофилетического таксона А, чем в случае монофилетического таксона В (ΟΚ (отношение вероятностей = шансы) = 1,44, 95% С1 (доверительный интервал) = 0,76-2,70). Гетерозиготы АроЕ ε3/ε4 (п=36) были проанализированы для оценки риска заболевания, связанного с гаплотипами монофилетического таксона А, между тем наблюдая за эффектом АроЕ ε4. Наблюдалась тенденция к более высокой частоте возникновения болезни Альцгеймера с поздним началом в случае субпопуляции, которая была гомозиготной по ТОММ40 таксона А, чем в случае субпопуляции, которая была гетерозиготной по ТОММ40 и таксона А, и таксона В (ΟΚ=1,36, 95% С1=0,40-4,61), и поэтому теоретически допустили, что, по крайней мере, некоторые из вариантов ТОММ4, характеризующих таксон А, дают не зависящий от АроЕ ε4 риск развития болезни Альцгеймера с поздним началом.

В результате анализа данных о последовательностях группы А8 были идентифицированы 39 полиморфных сайтов в участке размером 10 т.п.о. ТОММ40, среди которых было 30 информативных при использовании экономности сайтов (по крайней мере два различных нуклеотида, каждый, представленный в по крайней мере двух последовательностях). Из 30 информативных при использовании экономности сайтов 18 имели частоту минорного аллеля (ΜΛΕ) >0,10, а шесть однонуклеотидных полиморфизмов находились вне границы гена ТОММ40. 10 однонуклеотидных полиморфизмов встречались исключительно в случае АроЕ ε3 (Р=6,07х10^-50, точный критерий Фишера, двусторонний, п=210) и никогда не отмечались у гомозиготных АроЕ ε4/ε4 субъектов (п=16). Большая часть ε3-специфичных вариантов ТОММ40 находилась в интронных областях.

На фиг. 7 иллюстрируются 10 однонуклеотидных полиморфизмов и 6 инсерционных/делеционных полиморфизмов, которые характеризируют монофилетические таксоны А и В ТОММ40 (при Р<0,001), в случае субъектов с АроЕ ε3/ε3 из группы А8. Эти полиморфизмы были проанализированы по отдельности и в виде гаплотипов на связь с риском болезни Альцгеймера с поздним началом (табл. 3). Шансы риска возникновения заболевания в случае каждого из аллелей таксона В, во всех случаях минорного аллеля, говорят о том, что аллели таксона В предохраняют от риска возникновения болезни Альцгеймера в группе А8, однако в каждом случае слегка ошибочная значимость связи. Для объяснения эффекта АроЕ ε4 на шансы, сообщенные в табл. 3, уравновешенное множество из 48 пациентов с болезнью Альцгеймера и 48 контролей в отношении болезни Альцгеймера было создано посредством произвольного отбора последовательностей от субъектов с АроЕ ε3/ε4 из объединенных групп А8 и Ό8. В этом уравновешенном множестве данных снова не была установлена значимая связь однонуклеотидных полиморфизмов с болезнью Альцгеймера с поздним началом. Однако минорные аллели четырех однонуклеотидных полиморфизмов (гк8106922, гк1160985, гк760136, гк741780), которые характеризуют монофилетический таксон В ТОММ40, были проанализированы ранее в трех исследования связей по всему геному у пациентов с болезнью Альцгеймера с поздним началом/контролей и, как было установлено, предохраняют от риска возникновения заболевания (ΟΚ<1 в каждом случае), что согласуется с тенденцией, отмеченной в настоящем исследовании (АЬгайат е1 а1. А депоте-Мбе аккоиабоп к1ибу £ог 1а1е-опке1 АкЬешег'к ббеаке и81пд ^NА рообпд. ВΜС Μеб Оепотюк 1, 44 (2008); СаггакциШо е1 а1. Оепебс уабабоп ш РСИН11Х ίκ аккос1а1еб \νίΐ1ι киксербЬббу Ю 1а1е-опке1 АкЬешег'к б1кеаке. Νΐ Оепе! 41, 192-198 (2009); Таке1 е1 а1. Оепебс аккоаабоп к1нбу оп т апб агоипб 1бе АроЕ т 1а1е-опке1 АкЬешег б1кеаке ш .Тарапеке. Оепотюк 93, 441-448 (2009)).

- 28 021399

Таблица 3

Количественные показатели распределения и результаты исследования связей с аллелем и генотипом для отдельных однонуклеотидных полиморфизмов (8ΝΡ) __

АП АроЕ £епо(уре$

Название 5ΝΡ	Аллель Положение Аллель таКсона В	МАР (у всех)	МАР (у пациентов)	МАР (у контролей)	ШЛО <М)	ШАО (м)	Контроль (М)	Контроль (м)	ио АО (ММ)	ШАО (Мм)	ШАО Контроль Контроль Контроль	ОВ	95* С1 нижний	95« С1 верхний
(мм)	(ММ)	(Мм)	(мм)
«1038025	50096812	Т/с	с	031	0.28	037	106	41	39	23	40	27	7	11	17	3	0.66	035	1.23
»1038028	50096902	А/8	8	031	0.28	037	106	41	39	23	40	27	7	11	17	3	0.66	035	1.23
»1160985	50095252	СЛ	1	030	038	037	107	41	39	23	40	27	7	11	17	3	0.65	034	1.19
»1305062	50097361	0/с	с	038	036	031	106	38	43	19	43	24	7	13	17	1	0.81	0.42	136
»34215622	50098378	-/8	8	038	036	034	по	38	40	21	42	26	6	12	17	2	0.66	0.35	1.25
»34878901	50094317	сл	1	0.26	035	038	105	35	44	17	45	23	6	15	15	1	0.86	0.44	1.70
«7259620	50099628	С/а	а	030	037	037	108	40	39	23	41	26	7	П	17	3	0.63	033	1.18
»741780	50096271	Т/с	с	030	038	037	107	41	39	23	40	27	7	11	17	3	0.65	034	1.19
»760136	50095698	А/8	8	030	0.28	037	107	41	39	23	40	27	7	11	17	3	0.65	034	1.19
»8106922	50093506	А/8	8	038	036	031	109	39	43	19	42	25	7	13	17	1	0.81	0.42	135
				ϊίβββΐϊ			3 , / · -' \	авив	ЛР0£еЗ/е4	У|§|}|1||		·/.· +			аивик	' V
Название			Аллель	МАР	МАР	МАР	шло	ШАО	Контроль	Контроль	ШЛО	шло	ШЛО	Контроль Контроль Контроль	ОК	95% С1	95« а
3ΝΡ	Положение	Аплепь таксона В	(у всех)	(у пациентов)	(у контролей)	<М)	(м)	(М)	(м)	(ММ)	(Мм)	(мм)	(ММ)	(Мм)	(мм)		нижний	верхний
»1038025	50096812	Т/с	с	0.28	ю	038	68	28	63	33	22	24	2	17	29	2	0.79	0.43	1.45
»1305062	50097361	с/е	С	037	0.24	0.38	69	25	64	32	25	21	2	17	30	1	0.72	039	135
«34215622	50098378	-/8	8	038	035	038	70	26	64	32	24	22	2	17	30	1	0.74	0.40	138
«34878901	50094317	СЛ	1	034	030	038	69	25	61	31	25	21	2	18	29	1	0.71	038	134
»8106922	50093506	А/8	8	038	035	038	70	25	64	32	25	21	2	17	30	1	0.71	038	133

Другим полиморфизмом, который характеризовал два монофилетических таксона, а, следовательно, две группы гаплотипов для АроЕ ε3, был вариант поли-Т (г§10524523), локализованный в интроне 6 ТОММ40. На содержащих АроЕ ε4 хромосомах вариант был относительно длинным, с узким одномодальным, распределением длин (21-30 остатков Т, среднее значение = 26,78, среднеквадратическое отклонение = 2,60, п=32), в то время как на содержащих АроЕ ε3 хромосомах наблюдалось бимодальное распределение с пиками в 15,17 (среднеквадратическое отклонение = 0,85, п=36) и 33,15 (среднеквадратическое отклонение = 2,09, п=55) остатков Т (фиг. 8). Большие длины поли-Т (Т>27) скапливались почти исключительно в таксоне А, таксоне с большим риском, в группе А8 (Ρ=7,6χ10^-46, п=210, точный критерий Фишера, двусторонний). Отношение пациенты/контроль для категории, содержащей две, самые распространенные, более короткие длины (15 или 16 остатков Т), составляло 1,46 (95% 0=1,25-1,75), а отношение пациенты/контроль для категории больших длин (28, 29, 33 и 34 остатков Т) составляло 2,02 (95% 0=1,13-2,87). Эти данные обозначили тенденцию к связи между большей длиной поли-Т гз10524523 и болезнью Альцгеймера (ОК=1,38, 95% 0=0,80-2,39).

В то время как существовали только тенденции к связи гаплотипов для ТОММ40 или отдельных полиморфизмов с болезнью Альцгеймера с поздним началом для группы Л8, существовала значимая связь между категорией длин поли-Т в г§10524523 и возрастом возникновения болезни Альцгеймера с поздним началом. Она была проверена с использованием группы Ό8 субъектов с подтвержденным с помощью аутопсии АроЕ §3/е4, для которых имелись данные о начале заболевания. Была установлена значимая связь аллелей с более длинными поли-Т (>27 остатков Т) с началом заболевания в намного более молодом возрасте (70,5 лет ± 1,2 в сравнение с 77,6 лет ± 2,1, Р = 0,02, п=34) (фиг. 5).

Следовательно, этот полиморфизм значительно влиял на возраст возникновения болезни в случае индивидуумов, которые несут аллель АроЕ ε3. Три других полиморфизма длин поли-Т, локализованных в интроне 6 (г§34896370, г§56290633 и г§10602329), также характеризуют таксоны А и В, но эти полиморфизмы не были связаны с возрастом возникновения заболевания. Так же не было связи между гаплотипами характеризующих таксоны однонуклеотидных полиморфизмов и возрастом болезни Альцгеймера с поздним началом, или в случае одного однонуклеотидного полиморфизма, г§8106922, для которого была установлена значимая связь с риском болезни Альцгеймера в трех исследованиях связей по всему геному (АЬгайат е! а1. А уепоте-шбе ১ос1а1юп §1ибу Юг 1а1е-оп§е1 Акйетег^ Фзеазе шш§ ΌΝΑ роо1т§. ВМС Меб Оепот1с§ 1, 44 (2008); СаггазциШо е! а1. Оепейс уапайоп т Ρ0ΌΗ11Χ ΐδ аδδοс^а!еб хйй δΐϊδίχψίΦΠίΚ 1о 1а1е-оше1 Акйетег'з б^δеаδе. Ν! Оепе! 41, 192-198 (2009); Таке1 е! а1. Оепейс аδδοс^а!^οη δ!ибу оп т апб агоипб !йе АроЕ т 1а!е-още! Акйе1тег б^δеаδе т ^араηеδе. Оепопчс^ 93, 441-448 (2009)) (не представленные данные).

Делается заключение, что существует значимая корреляция более длинных участков поли-Т в Γδ10524523 с более ранним возрастом возникновения болезни Альцгеймера с поздним началом. Длина этого варианта является относительно однородной, и относительно большой, на содержащей АроЕ ε4 хромосоме, тогда как существуют две категории длин поли-Т, сцепленные с АроЕ ε3. Содержащие АроЕ ε2 хромосомы также, по-видимому, несут повторы поли-Т различных длин, схожие с таковыми на ε3содержащих хромосомах, но необходимо дополнительное исследование для подтверждения этих предварительных данных и для определения того, влияет ли этот повтор поли-Т на очень поздний возраст возникновения заболевания в случае носителей АроЕ ε2.

- 29 021399

Хотя возможно существование других вариантов, которые оказывают влияние на возраст возникновения болезни Альцгеймера с поздним началом в случае индивидуумов, которые не являются гомозиготными по АроЕ ε4, длина полиморфизма поли-Т в интроне 6 ТОММ40, по-видимому, является самым мощным прогностическим генетическим фактором в этом участке сцепления и должна быть оценена в будущем. Эти данные говорят о том, что графики зависимости возраста возникновения от распределения по генотипу для АроЕ (Согбег е1 а1. Оепе боке оГ ароНроргоЮю Е 1уре 4 а11е1е апб 1Не пкк оГ Аккешег'к б1кеаке ίη 1а1е опке! ГаниПек. §иепсе 261, 921-923 (1993); Ь1 е1 а1. Сапб1ба1е 81пд1е-пис1еоббе ро1утогрк1ктк Ггот а депотеюбе аккоиакоп к!ибу оГ Айкенпег б1кеаке. Агск №иго1 65, 45-53 (2008)) являются, в действительности, совокупностью графиков, при этом каждый график отражает специфическое взаимодействие сцепленных полиморфизмов в АроЕ и ТОММ40. Следовательно, эти данные увеличивают способность к предсказанию возраста возникновения болезни Альцгеймера с поздним началом, в интервале 5-7 лет, для индивидуумов возрастом старше 60 лет. В настоящее время планируется исследование для оценки связи генотипов для АроЕ и гаплотипов для ТОММ40 или гк10524523 с возрастом возникновения заболевания. Это исследование будет будущим 5-летним исследованием на основе популяции, проводимым в нескольких этнических группах, и будет объединено с испытанием лекарственных средств для предотвращения или задержки возникновения заболевания.

Способы

Две группы, анализируемые в этом исследовании, были из Ап/опа А1/ке1тег'к Эбеаке Кекеагск Сеп1ег (АЭКС), Ρкоеη^x, Ап/опа и Энке Вгуап АЭРС, Эигкат. Ыойк Сагокпа. Все субъекты были европейского происхождения. Ап/опа- и Энке-исследования были разрешены Институтскими наблюдательными советами, и от всех участников было получено соответствующее информированное согласие. Данные о возрасте и анатомическом поле пациентов и контролей в каждой группе представлены в табл. 2. Для Энке-группы возраст начала заболевания был определен ретроспективно, а диагноз заболевания был подтвержден с помощью аутопсии.

Образцы помещали в 96-луночные планшеты для ПЦР длинных фрагментов и ДНК-секвенирования в Ρо1уто^рк^с ОЫА Тескпо1оЦек (А1атеба, СА).

ПЦР длинных фрагментов проводили, используя Тад-полимеразу Такага ЬА (Такага М1гик Вю). Реакционная смесь и условия ПЦР были одинаковыми с реакционной смесью и условиями ПЦР, рекомендуемыми производителем. ПЦР проводили в объеме 50 мкл с 2,5 Ед. ЬА Тад и 200-400 нг геномной ДНК человека. Термоциклирование выполняли при следующих условиях: 1 цикл при 94°С в течение 1 мин; 14 циклов, каждый при 94°С в течение 30 с; при 57°С в течение 30 с; при 68°С в течение 9 мин; 16 циклов, каждый при 94°С в течение 30 с; при 57°С в течение 30 с; при 68°С в течение 9 мин и 15 с; 1 цикл при 72°С в течение 10 мин. Праймеры для ПЦР длинных фрагментов представлены в табл. 4.

- 30 021399

Таблица 4

Перечислены прямые и обратные праймеры для секвенирования. Затемненный ряд показывает прямой и обратный праймеры, использованные для ПЦР длинных фрагментов К2 (фиг. 2)

Прямые праймеры	Обратные праймеры
Последовательность	Координата праймера (3' конца праймера) ! в исзс	ί Положение > праймера (3' конца праймера) 1 в клонированном продукте ПЦР	8ΕΟΙΡ ΝΟ:	Последовательность	- Координата праймера (3' конца праймера) в исзс	Положение праймера (3' конца праймера) в клонированном продукте ПЦР |	8ΕΟΙΡ ΝΟ:
ААСТСАОАССССАОАОАТТСТААОТ	50,092,429	. 25 '	- .Д	ЛАСАСССТААТСССАОСАСАТТТАС	50,101^560	9,156 ; - .	Э А .
САООАААСАССТАТСАС	50,092,292	-112	3	СССАСТССТТОТТОА	50,093,034	630	4
ОТОТСАТСОТСАТГСААС	50,093,038	634	5	ОААТАООООССТТТСА	50,093,282	878	6
СТССАСОТАТОАААО	50,093,287	883	7	СААТСТССТАСООТСС	50,093,512	1108	8
ОТСТСТССАСАТСТС	50,093,601	1197	9	СССААСТТССАСТААС	50,093,706	1302	10
ТАСТССААСТТССОС	50,093,722	1318	11	ААССТСААОСТТАСАСТ	50,094,318	1914	12
ТСТСТСТТССССАСО	50,094,289	1885	13	АСААСССТАОСТСАСАТ	50,094,790	2386	14
СССААСТААТТТТТОТАГТСС	50,094,609	2205	15	ССТСТААТСССАССТАТ	50,095,002	2598	16
АСАТТТОТССССТСТАС	50,095,129	2725	17	ТСАТСТСТСТСТОААССТАА	50,095,324	2920	18
ССАСАТСООСТТОТСТ	50,095,603	3199	19	СССААААТСАСОАТСАСТ	50,095,804	3400	20
СССАСАТССССАААТС	50,096,082	3678	21	ССАОСАССАССТАСТ	50,096,218	3814	22
ААСТСТСАСТСОАТСТС	50,096,471	4067	23	САТССТСТСААТСТССТТА	50,096,620	4216	24
СТАТАСТСССААСТАСТСА	50,096,730	4326	25	ТТТТТТССААССАТААААСАТАОТА	50,096,863	4459	26
АСТССССССТАСТТ А	50,097,080	4676	27	ОСССАТОСАСАААССТ	50,097,268	4864	28
АССАСАООТСТАТССС	50,097,451	5047	29	ТОААААОСССТСТАСАС	50,097,898	5494	30
ОААСАСАТТСАТССОСА	50,097,864	5460	31	САСССАССАТССАСТТ	50,098,141	5737	32
ТОТООАТАОСААСТССАТ	50,098,148	5744	33	САААСССАСАСТСАААСТТ	50,098,231	5827	34
ООСАТТСТОАСТАОСА	50,098,469	6065	35	САСААТССТОССТ	50,098,526	6122	36
ТССТСССТТААОТССО	50,098,937	6533	37	АСАСТТСАСААААСОС	50,098,797	6393	38
СТСОСОТСАОСТОАТ	50,099,350	6946	39	АСАААСТССТСТАТАССС	50,099,077	6673	40
ТОАААСАТСТОООАТТТАТААС	50,099,679	7275	41	ТААССТОООСТТОСТТ	50,099,429	7025	42
СТСОАААССАСААТАСС	50,099,990	7586	43	ААСТТССТТТССТСАТСАС	50,099,829	7425	44
АТСТССССТСАСТОТА	50,100,261	7857	45	ОСААСАСООАОАСТОТ	50,100,207	7803	46
ОТСААААСАССТСТАТСС	50,100,739	8335	47	ТОТСССТСОАТСААТСТА	50,100,567	8163	48
АОСАСТССАССАОТ	50,101,197	8793	49	ТСАССТСАТСССССТ	50,100,960	8556	50
				ССОТСТТССАТТТАТОАО	50,101,328	8924	51
				ОТААААССАСООССАС	50,101,681	9277	52

Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 0,8% агарозном геле, визуализировали с помощью кристаллического фиолетового красителя, сравнивали со стандартами размеров, вырезали из геля и экстрагировали с использованием материалов для очистки, включенных в набор для клонирования продуктов ПЦР ТОРО ХБ (1пуйго§еп). Продукты ПЦР длинных фрагментов клонировали в вектор для клонирования продуктов ПЦР ТОРО ХЬ. В этой системе используется ТА вектор для клонирования, и она рекомендуется для вставок вплоть до 10 т.п.о. Согласно инструкциям производителя электрокомпетентные клетки (из того же набора) трансформировали вектором, засевали в присутствии антибиотика и инкубировали. Из каждой чашки отбирали десять клонов, и их культивировали в 96-луночном формате.

Разведенные культуры переносили в денатурирующий буфер, который был частью набора ТетрБРЫ ΏΝΆ 8ериепс1п§ ТетрЫе АтрРйеаНоп (ОЕ НеаНКСаге/Атегзйат Вюзшепсез). Этот буфер вызывает высвобождение плазмидной ДНК, но не бактериальной ДНК. Культуры нагревали, охлаждали, центрифугировали и переносили в новые планшеты, содержащие фермент ТетрБРЫ и другие компоненты. Эту смесь инкубировали при 30°С в течение 18 часов для активирования амплификации плазмидных матриц. Эти продукты затем центрифугировали и нагревали до 65°С для инактивации фермента.

Плазмидные матрицы использовали в реакциях секвенирования ДНК, используя набор для секвенирования Βΐ§ Эуе, вариант 3.1 (АррБеб Вю8у81ет§). Для каждой реакции использовали подходящий для секвенирования праймер (табл. 4), который был разработан для отжига в уникальном месте матрицы. Циклическое секвенирование проводили с использованием температуры для отжига, составляющей 50°С, температуры для элонгации, составляющей 60°С, и температуры для денатурации, составляющей 96°С, в течение всего 30 циклов. Продукты реакций секвенирования прогоняли в ДНК-секвенаторе АВ1 3730ХБ с 50 см капиллярным блоком, используя стандартный рабочий режим.

Использовали запатентованную программу для анализа последовательностей, названную А§еп1 (разработанную Се1ега), для совмещения прочтений последовательностей с соответствующей контрольной последовательностью и для создания контингов, связанных с каждым клоном. Эта система дает приблизительные бальные оценки качества для всех оснований, для которых существует какая-либо вариация в случае любого из образцов. Данные о последовательности для каждого образца анализировали на присутствие однонуклеотидных полиморфизмов, для которых устанавливали связь в одном гаплотипном наборе для одной субпопуляции клонов и в отличном гаплотипном наборе для остальных клонов. Справочный файл для представляющего интерес участка был создан посредством внесения в список известных вариаций для этого участка, общедоступных из άΟδΝΡ NСΒI. Файл генотипов для представляющего интерес участка был создан посредством поиска всех данных о гаплотипах субъектов для всех вариаций между известной последовательностью и консенсусными последовательностями гаплотипов.

Было установлено значение ошибки прочтения длины для вариантов поли-Т (например, г§ 10524523) посредством анализа отмеченных длин из 10 клонов, приготовленных ради образцов, которые имели один гаплотип. Для типичного образца с короткой длиной, составляющей 16, поли-Т среднеквадратиче- 31 021399 ское отклонение для 10 клонов составляло 0,97. Для типичного образца с большей длиной, составляющей, например, 27, поли-Т среднеквадратическое отклонение составляло 1,58.

Был проведен филогенетический анализ. Совмещение множества последовательностей выполняли, используя программу С.'1и81а1\У2 (в версии 2.0.10) с использованием параметров по умолчанию. Ручную регулировку совмещений завершали, используя ОепеДос (в версии 2.7.000). Филогенетические деревья строили, используя Вауемап. максимальное правдоподобие и построения на основе меры различия. Используемым программным обеспечением для построения филогенетических деревьев было Раир* (версия 4.0Ы0), С1из1а1Х2 (способы ближайшего связывания, версия 2.0.10) и Мг. Вауез (версия 3.1.2).

Во всех способах использовали смену разделения дерева пополам и пересоединения ветвей. Модель оптимальной подгонки эволюции последовательностей была определена с использованием программы МойеНез! (версии 3.7), которая дает оценки следующих решающих факторов: матрицы величин, формы гамма-распределения и доли инвариантных сайтов. Анализ методом ступенчатого перехода от малых значений к большим и, наоборот, был выполнен с использованием 1000 повторов для установления статического подтверждения конкретной структуры дерева.

Были также построены сети гаплотипов на основе данных о последовательностях с использованием программы ТС8 (версии 1.21 (С1етеп1 е1 а1. ТС8: а сотрШег ргодгат ΐο езйта1е депе депеа1од1ез. Мо1 Есо1 9, 1657-1659 (2000))) для сравнения филогенетических деревьев с кладограммами, определенными с использованием экономности при статистическом анализе. Филогенетические деревья и сети гаплотипов строили дважды, с использованием пропусков, обрабатываемых сначала как недостающие данные, а затем как пятый символ. Разнообразие нуклеотидов в представляющем интерес участке рассчитывали, используя Ипа8Р (версию 5.00.02 (ЫЬгаДо е1 а1. Ипа8Р ν5: а 8оП\уаге йог сотргеЬепзйе апа1у818 ой ΌΝΑ ро1утогрЫзт 0а1а. Вюшйогтайсз 25, 1451-1452 (2009))).

После построения филогенетических деревьев, сетей гаплотипов и завершения анализа разнообразия нуклеотидов в представляющем интерес участке результаты различных способов сравнивали и увязывали в консенсусное дерево. Предполагали, что группы последовательностей, разделяющие новую, связанную с заболеванием мутацию, скапливаются теснее на филогенетическом дереве, однако единичные случаи вследствие фенокопии, доминирования и эпистаза могут вносить помехи в связь фенотипгаплотип (ТасНта/Шои е1 а1. Оепейс аззоиайоп тарршд \аа еуокШоп-Ьазей с1и81егшд ой Нар1о1уре8. РЬо8 Сепе! 3, е111 (2007)).

Однако единичные случаи вследствие фенокопии, доминирования и эпистаза могут вносить помехи в связь фенотип-гаплотип. Этот филогенетический анализ фокусировался на интенсивном скоплении монофилетических таксонов для минимизации этих эффектов. Монофилетические таксоны, установленные при первом разбиении на филогенетическом дереве, использовали для проверки гипотезы, состоящей в том, что субъекты-гаплотипы для ТОММ40 из таксона В были связаны с возникновением болезни Альцгеймера в более позднем возрасте, чем субъекты-гаплотипы из таксона А (каждый субъект вносил два гаплотипа в признак связи с возрастом возникновения болезни Альцгеймера). Число проверок связи, которые были выполнены с использованием этого подхода, имело порядок величины, меньший такового в обычных исследованиях связей по всему геному, поскольку филогенетический анализ идентифицировал категории эволюционно связанных субъектов-гаплотипов. Если проверки связей подтверждали, что различные таксоны сортируют данные о субъектах-гаплотипов по возрасту возникновения, проводили дополнительный статистический анализ для идентификации вариантов, которые сортировали последовательности в каждый таксон. Фактически, этот анализ определил значимость каждого варианта в качестве фактора, оказывающего влияние на возраст возникновения, используя ряд анализов с использованием одной степени свободы, руководствуясь структурой дерева. Филогенетические анализы были проведены с использованием однонуклеотидных и инсерционных/делеционных полиморфизмов. Статистические анализы связи были скорректированы с использованием поправки Бонферонни для ряда полиморфных сайтов, включенных в анализ.

Данные о гаплотипах, полученные с использованием программного обеспечения для полиморфного анализа, и данные, полученные на основе программного обеспечения Эпа8Р (версии 5.00.02 (ЫЬгаДо е! а1. Ипа8Р ν5: а 8оП\уаге йог сотргеЬепзйе апа1у818 ой ΌΝΑ ро1утогр1Й8т йа!а. Вю1пйогтайс8 25, 1451-1452 (2009))), были использованы для последующих статистических анализов. Были подвергнуты анализу отдельные варианты однонуклеотидных полиморфизмов ТОММ40, гаплотипы для ТОММ40 и длина повторов поли-Т на связь с риском болезни Альцгеймера с поздним началом в случае группы А8 и возрастом возникновения болезни Альцгеймера с поздним началом в случае группы Ό8. Различия в долях специфических аллелей ТОММ40, связанных с каждым аллелем АроЕ или каждым генотипом для АроЕ, сравнивали, используя точный критерий Фишера (двусторонний). Начиная с 30 информативных при использовании экономности сайтов и α=0,05, для поправки Бонферонни для значимости связи со специфическим аллелем, возможно, потребуется значение Р, составляющее 0,001. Отношения вероятностей (шансы, ОК) рассчитывали как (число минорных аллелей у пациентов/число минорных аллелей у контролей)/(число основных аллелей у пациентов/ число основных аллелей у контролей) и представляли с 95% доверительным интервалом. Средние значения для групп с установленным возрастом возникновения болезни Альцгеймера с поздним началом сравнивали с использованием проверок по критерию Сть- 32 021399 юдента, двусторонних. Стандартный Р-тест на групповых вариациях выполняли для определения того, был ли рассчитан критерий Стьюдента при предположении равных или неравных вариаций. Статистический анализ завершали, используя программное обеспечение 1МГ (версии 8, §А§ ШзЙШс, Сагу, ΝΟ).

Коды доступа: СсηВаηк: ТОММ40, гомолог транслоказы внешней митохондриальной мембраны 40, 10452; АроЕ, аполипопротеин Е, 348.

Вышеприведенное описание является иллюстрацией настоящего изобретения и не должно рассматриваться как его ограничение. Настоящее изобретение определяется следующей формулой изобретения, при этом в нее должны быть включены ее эквиваленты.

Claims (53)

1. Способ определения риска развития болезни Альцгеймера у субъекта, включающий:

(a) определение на основе взятого от указанного субъекта биологического образца, содержащего ДНК, присутствия или отсутствия генетического варианта гена ТОММ40, связанного с увеличенным или уменьшенным риском развития болезни Альцгеймера, причем указанный вариант представляет собой делеционный/инсерционный полиморфизм в интроне 6 или интроне 9 гена ТОММ40; и (b) определение того, что указанный субъект подвержен увеличенному или уменьшенному риску развития болезни Альцгеймера на основании присутствия или отсутствия указанного генетического варианта.

2. Способ по п.1, дополнительно включающий определение того, является ли указанный субъект субъектом с генотипом Аро Е2/Е2, Е2/Е3, Е2/Е4, Е3/Е3, Е3/Е4 или Е4/Е4.

3. Способ по п.1, дополнительно включающий определение того, является ли указанный субъект субъектом с генотипом Аро Е3/Е3 или Е3/Е4.

4. Способ по любому из пп.1-3, дополнительно включающий стадию:

(c) введения указанному субъекту активного агента против болезни Альцгеймера в эффективном для лечения количестве после определения того, что субъект подвержен увеличенному риску развития болезни Альцгеймера.

5. Способ по п.4, в котором указанную стадию введения проводят в отношении указанного субъекта в раннем возрасте, когда определено по присутствию или отсутствию у него указанного генетического варианта, что субъект подвержен увеличенному риску по сравнению с субъектом, у которого указанный генетический вариант не присутствует или отсутствует.

6. Способ по п.4 или 5, в котором указанный активный агент выбирают из группы, состоящей из ингибиторов ацетилхолинэстеразы, антагонистов рецепторов НМЭА, агонистов или модуляторов активируемых пролифератором пероксисом рецепторов, антител, гибридных белков, терапевтических молекул РНК и их комбинаций.

7. Способ по любому из пп.1-6, в котором указанным генетическим вариантом ТОММ40 является инсерционный вариант поли-Т в местоположении в геноме 50094889 компоновки 36.3 ΝΟΒΙ (Т510524523).

8. Способ лечения субъекта в отношении болезни Альцгеймера посредством введения указанному субъекту активного агента против болезни Альцгеймера в эффективном для лечения количестве, причем усовершенствование включает введение указанного активного агента указанному субъекту в раннем возрасте, когда указанный субъект несет генетический вариант гена ТОММ40, связанный с увеличенным риском развития болезни Альцгеймера, по сравнению с соответствующим субъектом, который не несет указанный генетический вариант, причем указанный генетический вариант ТОММ40 представляет собой делеционный/инсерционный полиморфизм (ΌΙΡ) в интроне 6 или интроне 9 гена ТОММ40.

9. Способ по п.8, дополнительно включающий определение того, является ли указанный субъект субъектом с генотипом Аро Е2/Е2, Е2/Е3, Е2/Е4, Е3/Е3, Е3/Е4 или Е4/Е4.

10. Способ по п.9, дополнительно включающий определение того, является ли указанный субъект субъектом с генотипом Аро Е3/Е3 или Е3/Е4.

11. Способ по любому из пп.8-10, в котором указанный активный агент выбирают из группы, состоящей из ингибиторов ацетилхолинэстеразы, антагонистов рецепторов ИМЭА, агонистов или модуляторов активируемых пролифератором пероксисом рецепторов, антител, гибридных белков, терапевтических молекул РНК и их комбинаций.

12. Способ по любому из пп.8-10, в котором активным агентом является тиазолидиндион.

13. Способ по любому из пп.8-10, в котором активным агентом является лекарственное средство, содержащее тиазолидиндион.

14. Способ по любому из пп.8-13, в котором указанным генетическим вариантом гена ТОММ40 является вариант, выбираемый из группы, состоящей из тз10524523, тз10602329 или ΌΙΡ3.

15. Способ по любому из пп.8-13, в котором указанным ΌΙΡ является инсерционный полиморфизм.

16. Способ по любому из пп.8-13, в котором указанным ΌΙΡ является делеционный/инсерционный полиморфизм поли-Т.

17. Способ по любому из пп.8-13, в котором указанным генетическим вариантом гена ТОММ40 яв- 33 021399 ляется гк10524523.

18. Способ по любому из пп.8-13, в котором указанным Э1Р является делеционный/инсерционный полиморфизм поли-Т из от 20 до 50 пар последовательных оснований.

19. Способ по любому из пп.8-13, в котором указанным Э1Р является делеционный/инсерционный полиморфизм поли-Т из от 20 до 50 пар последовательных оснований гк10524523.

20. Способ составления прогноза для пациента или определение риска развития болезни Альцгеймера у пациента, включающий составление профиля пациента, причем указанное составление профиля пациента включает определение присутствия или отсутствия по крайней мере одного аллеля АроЕ 2, АроЕ 3 или АроЕ 4 в биологическом образце указанного пациента и определение присутствия или отсутствия по крайней мере одного варианта делеционного/инсерционного полиморфизма (ИГР) ТОММ40, локализованного в интроне 6 или интроне 9 гена ТОММ40, связанного с увеличением или уменьшением риска заболевания Альцгеймера, а затем трансформирование указанного профиля пациента в указанный прогноз, причем присутствие указанного аллеля АроЕ 3, АроЕ 4 или АроЕ 2 и присутствие указанного по крайней мере одного варианта ОГР-полиморфизма ТОММ40 указывает на указанного пациента как пациента, подверженного риску развития болезни Альцгеймера.

21. Способ по п.20, в котором указанным ΌΡ является гк10524523, гк10602329 или О1Р3.

22. Способ по п.20, в котором указанным Э1Р является инсерционный полиморфизм.

23. Способ по п.20, в котором указанным Э1Р является делеционный/инсерционный полиморфизм поли-Т.

24. Способ по п.20, в котором указанным ΌΡ является гк10524523.

25. Способ по любому из пп.20-24, дополнительно включающий определение того, является ли указанный субъект субъектом с генотипом Аро Е2/Е2, Е2/Е3, Е2/Е4, Е3/Е3, Е3/Е4 или Е4/Е4.

26. Способ распределения субъекта в подгруппу клинического испытания терапии для лечения болезни Альцгеймера, включающий определение присутствия или отсутствия по крайней мере одного аллеля АроЕ 2, АроЕ 3 или АроЕ 4 в биологическом образце указанного пациента, определение присутствия или отсутствия по крайней мере одного варианта делеционного/инсерционного полиморфизма (ИГР) ТОММ40, локализованного в интроне 6 или интроне 9 гена ТОММ40, связанного с увеличением или уменьшением риска заболевания Альцгеймера, распределение указанного субъекта в указанную подгруппу указанного клинического испытания указанной терапии, исходя из присутствия или отсутствия указанного по крайней мере одного варианта АроЕ 2, АроЕ 3 или АроЕ 4 и/или Э1Р ТОММ40.

27. Способ по п.26, в котором указанным Э1Р является инсерционный полиморфизм.

28. Способ по п.26, в котором указанным Э1Р является делеционный/инсерционный полиморфизм поли-Т.

29. Способ по п.26, в котором указанным ΌΡ является тк10524523, тк10602329 или О1Р3.

30. Способ по п.26, в котором указанным ΌΡ является тк10524523.

31. Способ по любому из пп.26-30, дополнительно включающий определение того, является ли указанный субъект субъектом с генотипом Аро Е2/Е2, Е2/Е3, Е2/Е4, Е3/Е3, Е3/Е4 или Е4/Е4.

32. Набор для определения подверженности субъекта повышенному риску развития болезни Альцгеймера с поздним началом, включающий:

(A) по крайней мере один реагент, который специфически детектирует АроЕ 3, АроЕ 4 и/или АроЕ 2, причем указанный реагент выбирают из группы, состоящей из антител, которые избирательно связываются с изоформами АроЕ, и олигонуклеотидных зондов, которые избирательно связываются с кодирующей аллели АроЕ ДНК;

(B) по крайней мере один реагент, который специфически детектирует присутствие или отсутствие по крайней мере одного варианта делеционного/инсерционного полиморфизма (ИГР) ТОММ40, локализованного в интроне 6 или интроне 9 гена ТОММ40, связанного с увеличением или уменьшением риска заболевания Альцгеймера; и (C) инструкции в отношении определения того, что субъект подвержен увеличенному риску развития болезни Альцгеймера с поздним началом, посредством:

(ί) детектирования присутствия или отсутствия изоформы АроЕ 3, АроЕ 4 и/или АроЕ 2 у указанного субъекта с помощью указанного по крайней мере одного реагента;

(ίί) детектирования присутствия или отсутствия по крайней мере одного варианта делеционного/инсерционного полиморфизма (ИГР) ТОММ40, локализованного в интроне 6 или интроне 9 гена ТОММ40, связанного с увеличением или уменьшением риска заболевания Альцгеймера; и (ίίί) установления, подвержен ли субъект увеличенному риску развития болезни Альцгеймера с поздним началом посредством установления, детектируется ли присутствие АроЕ 3, АроЕ 4 и/или АроЕ 2 и указанного ΌΡ ТОММ40 с помощью указанного по крайней мере одного реагента, причем присутствие изоформы АроЕ 3, АроЕ 4 и/или АроЕ 2 и указанного варианта ΌΡ ТОММ40 указывает на то, что указанный субъект подвержен увеличенному риску развития болезни Альцгеймера с поздним началом.

33. Набор по п.32, в котором указанный по крайней мере один реагент и указанные инструкции упакованы в один контейнер.

34. Набор по п.32 или 33, где указанным Э!Р является инсерционный полиморфизм.

- 34 021399

35. Набор по п.32 или 33, где указанным ΌΙΡ является делеционный/инсерционный полиморфизм поли-Т.

36. Набор по п.32 или 33, где указанным ΌΙΡ является г§10524523, г§10602329 или ΌΙΡ3.

37. Набор по п.32 или 33, где указанным ΌΙΡ является г§10524523.

38. Набор по любому из пп.32-37, где указанная стадия определения дополнительно включает определение того, является ли указанный субъект субъектом с генотипом Аро Е2/Е2, Е2/Е3, Е2/Е4, Е3/Е3, Е3/Е4 или Е4/Е4.

39. Способ определения риска развития болезни Альцгеймера у субъекта, включающий:

(a) определение на основе взятого от указанного субъекта биологического образца, содержащего ДНК, присутствия или отсутствия генетического варианта гена ТОММ40, связанного с увеличенным или уменьшенным риском развития болезни Альцгеймера, причем указанный вариант находится в генетическом местоположении компоновки 36.3 NСΒI, выбираемом из группы, состоящей из 50092565, 50092587, 50093506, 50093609, 50094317, 50094558, 50094716, 50094733, 50094889, 50095252, 50095506, 50095764, 50096531,50096647,50096697, 50096812, 50096902, 50097361, 50098378 и 50098513; и (b) определение того, что указанный субъект подвержен увеличенному или уменьшенному риску развития болезни Альцгеймера на основании присутствия или отсутствия указанного генетического варианта.

40. Способ по п.39, дополнительно включающий определение того, является ли указанный субъект субъектом с генотипом Аро Е2/Е2, Е2/Е3, Е2/Е4, Е3/Е3, Е3/Е4 или Е4/Е4.

41. Способ по п.39, дополнительно включающий определение того, является ли указанный субъект субъектом с генотипом Аро Е3/Е3 или Е3/Е4.

42. Способ по любому из пп.39-41, дополнительно включающий стадию:

(c) введения указанному субъекту активного агента против болезни Альцгеймера в эффективном для лечения количестве после определения того, что субъект подвержен увеличенному риску развития болезни Альцгеймера.

43. Способ по п.42, в котором указанную стадию введения проводят в отношении указанного субъекта в раннем возрасте, когда определено, по присутствию или отсутствию у него указанного генетического варианта, что субъект подвержен увеличенному риску по сравнению с субъектом, у которого указанный генетический вариант не присутствует или отсутствует.

44. Способ по п.42 или 43, в котором указанный активный агент выбирают из группы, состоящей из ингибиторов ацетилхолинэстеразы, антагонистов рецепторов ΝΜΌΑ, агонистов или модуляторов активируемых пролифератором пероксисом рецепторов, антител, гибридных белков, терапевтических молекул РНК и их комбинаций.

45. Способ лечения субъекта в отношении болезни Альцгеймера посредством введения указанному субъекту активного агента против болезни Альцгеймера в эффективном для лечения количестве, причем усовершенствование включает введение указанного активного агента указанному субъекту в раннем возрасте, когда указанный субъект несет генетический вариант гена ТОММ40, связанный с увеличенным риском развития болезни Альцгеймера, по сравнению с соответствующим субъектом, который не несет указанный генетический вариант, причем указанный генетический вариант гена ТОММ40 находится в генетическом местоположении компоновки 36.3 NСΒI, выбираемом из группы, состоящей из 50092565, 50092587, 50093506, 50093609, 50094317, 50094558, 50094716, 50094733, 50094889, 50095252, 50095506, 50095764, 50096531, 50096647, 50096697, 50096812, 50096902, 50097361, 50098378, 50098513.

46. Способ по п.45, дополнительно включающий определение того, является ли указанный субъект субъектом с генотипом Аро Е2/Е2, Е2/Е3, Е2/Е4, Е3/Е3, Е3/Е4 или Е4/Е4.

47. Способ по п.45, дополнительно включающий определение того, является ли указанный субъект субъектом с генотипом Аро Е3/Е3 или Е3/Е4.

48. Способ по п.45 или 47, в котором указанный активный агент выбирают из группы, состоящей из ингибиторов ацетилхолинэстеразы, антагонистов рецепторов ΝΜΌΑ, агонистов или модуляторов активируемых пролифератором пероксисом рецепторов, антител, гибридных белков, терапевтических молекул РНК и их комбинаций.

49. Способ по любому из пп.7, 20-31, 32-38, в котором генетический вариант гена ТОММ40 представляет собой делеционный/инсерционный полиморфизм Г810524523 с поли-Т из от 20 до 50 пар последовательных оснований Г810524523.

50. Способ по любому из пп.4 или 5, в котором указанным активным агентом является тиазолидиндион.

51. Способ по любому из пп.4 или 5, в котором активным агентом является лекарственное средство, содержащее тиазолидиндион.

52. Способ по любому из пп.4-19, 26-31, 42-51, в котором указанное лечение включает задержку начала болезни Альцгеймера.

53. Способ по любому из пп.4-19, 26-31, 42-51, в котором указанное лечение включает задержку развития болезни Альцгеймера.

- 35 021399

Получить информацию о последовательностях ДНК заданного генетического локуса из соответствующей популяции субъектов

.......... ...... у

Использовать алгоритм для совмещения множества последовательностей для определения блоков гаплотило а в исследуемом генетическом участке _ __ у ..........

Построить филогенетическое дерево, представляющее связи между определенными блоками гаплотипов у

Перемещаться вдоль ветвей филогенетического дерева, подсчитывая субъектов, представляющих каждый представляющий интерес фенотип, для каждого узла _,_γ_

Идентифицировать узел, в котором отношение пораженные субъекты : непораженные субъекты для представляющего интерес фенотипа в значительной степени отличается от указанного отношения для предыдущего узла, который является представляющей интерес точкой ветвления