EA016168B1 - Способ получения т-клеточной популяции и ее применение - Google Patents
Способ получения т-клеточной популяции и ее применение Download PDFInfo
- Publication number
- EA016168B1 EA016168B1 EA200800996A EA200800996A EA016168B1 EA 016168 B1 EA016168 B1 EA 016168B1 EA 200800996 A EA200800996 A EA 200800996A EA 200800996 A EA200800996 A EA 200800996A EA 016168 B1 EA016168 B1 EA 016168B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cells
- cell population
- cell
- group
- antigen
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 82
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 524
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 479
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 141
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 140
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims abstract description 107
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims abstract description 107
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 119
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 119
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 119
- 102400000887 Cholecystokinin-7 Human genes 0.000 claims description 88
- 101800001542 Cholecystokinin-7 Proteins 0.000 claims description 88
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 82
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 82
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 76
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 57
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 55
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 55
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 52
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 52
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 44
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 43
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 39
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 38
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 38
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 33
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 24
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims description 23
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 23
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 16
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 16
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 6
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 5
- 101100525628 Picea mariana SB62 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 4
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 4
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 abstract 1
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 abstract 1
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 abstract 1
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 abstract 1
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 abstract 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 abstract 1
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 abstract 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 abstract 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 78
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 62
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 51
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 44
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 38
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 34
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 31
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 29
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 28
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 27
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 22
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 20
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 20
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 20
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 16
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 16
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 15
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 15
- 230000006870 function Effects 0.000 description 15
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 15
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 14
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 14
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 13
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 13
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 13
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 12
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 11
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 11
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 9
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 9
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 8
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 8
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 8
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 8
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 8
- 101150114515 CTBS gene Proteins 0.000 description 7
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- -1 CH-271 Chemical compound 0.000 description 6
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 6
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 6
- 239000002957 persistent organic pollutant Substances 0.000 description 6
- 241000425571 Trepanes Species 0.000 description 5
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 5
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 5
- 102100028203 Cytochrome c oxidase subunit 3 Human genes 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000010556 Heparin Binding Activity Effects 0.000 description 4
- 101000861034 Homo sapiens Cytochrome c oxidase subunit 3 Proteins 0.000 description 4
- 101100290666 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ROX3 gene Proteins 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000004956 cell adhesive effect Effects 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 3
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 3
- 102100033772 Complement C4-A Human genes 0.000 description 3
- 102100026170 Fez family zinc finger protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 101001027130 Mus musculus Fibronectin Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 101710169169 Polyprenol monophosphomannose synthase Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102100036846 C-C motif chemokine 21 Human genes 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 101000713085 Homo sapiens C-C motif chemokine 21 Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 101100515519 Mus musculus Myo15a gene Proteins 0.000 description 2
- 241000006416 Notata Species 0.000 description 2
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000035584 blastogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- XRNFIRAZDRTPBT-KGCFEYSGSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-carbamimidamido-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2,6-diaminohexanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]acetyl]amino]pentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]cn1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O XRNFIRAZDRTPBT-KGCFEYSGSA-N 0.000 description 1
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100032366 C-C motif chemokine 7 Human genes 0.000 description 1
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101100167365 Caenorhabditis elegans cha-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 102100026891 Cystatin-B Human genes 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000797758 Homo sapiens C-C motif chemokine 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000912191 Homo sapiens Cystatin-B Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100032817 Integrin alpha-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010041014 Integrin alpha5 Proteins 0.000 description 1
- 108010042918 Integrin alpha5beta1 Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700041567 MDR Genes Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000033255 Progressive myoclonic epilepsy type 1 Diseases 0.000 description 1
- 102220469221 S-adenosyl-L-methionine-dependent tRNA 4-demethylwyosine synthase TYW1B_E18A_mutation Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101150057615 Syn gene Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 238000009172 cell transfer therapy Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010028438 cholecystokinin 21 Proteins 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 238000001050 pharmacotherapy Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108010056030 retronectin Proteins 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 206010052366 systemic mycosis Diseases 0.000 description 1
- 230000029305 taxis Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/46434—Antigens related to induction of tolerance to non-self
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/46449—Melanoma antigens
- A61K39/464491—Melan-A/MART
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464499—Undefined tumor antigens, e.g. tumor lysate or antigens targeted by cells isolated from tumor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/58—Adhesion molecules, e.g. ICAM, VCAM, CD18 (ligand), CD11 (ligand), CD49 (ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
В изобретении предлагается способ получения T-клеточной популяции, в котором T-клеточная популяция экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28, отличающийся тем, что способ включает в себя стадию культивирования клеточной популяции, содержащей T-клетку, в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси.
Description
Настоящее изобретение относится к способу получения Т-клеточной популяции, которая используется в области медицины.
Уровень техники
Живой организм защищается от чужеродных субстанций главным образом с помощью иммунной системы, и иммунная система организована из различных клеток и продуцируемых ими растворимыми факторами. Ключевую роль среди них играют лейкоциты, особенно лимфоциты. Лимфоциты делят на два больших типа: В-лимфоциты (которые обозначают в настоящем документе как В-клетки) и Тлимфоциты (которые обозначают в настоящем документе как Т-клетки); оба типа специфически распознают антиген и воздействуют на антиген, защищая живой организм.
На периферии Т-клетки в основном представлены СО4-Т-клетками, имеющими СО (кластер дифференцировки) 4-маркер и СО8-Т-клетками, имеющими СО8-маркер. Большинство СО4-Т-клеток называют хелперными Т-клетками (в настоящем документе обозначенными как Тн), оказывают помощь в продукции антител, они вызывают различные иммунные ответы и они дифференцируются в Т111 или Т112. которые отличаются по виду от цитокинов, продуцируемых антигенной стимуляцией. Большинство СО8-Т-клеток дифференцируется в цитотоксическую Т-клетку (ТС: цитотоксический Т-лимфоцит, также обозначаемый как киллерная Т-клетка, которая далее может быть обозначена как СТЬ), демонстрирующую цитотоксическую активность при антигенной стимуляции.
Например, при таком патологическом состоянии, как рак, в последние годы иммунотерапия привлекает к себе интерес в качестве четвертого вида терапии после хирургии, химиотерапии и радиотерапии. Поскольку иммунотерапия использует иммунокомпетентность, естественно принадлежащую человеку, то считают, что физическая нагрузка на пациента, вызванная иммунотерапией, является легкой по сравнению с нагрузкой, оказываемой другими терапиями. В качестве иммунотерапии известны терапия, включающая в себя стадию переноса лимфокин-активированных клеток, полученных размножением СТЬ или лимфоцитов периферической крови, индуцированным ех νίνο, или нечто подобное согласно различным способам, М<Т клетки, у5Т клетки и т.п.; терапия с переносом дендритных клеток или терапия пептидной вакциной, при которой предполагается индукция антиген-специфических СТЬ ίη νίνο; Т111 клеточная терапия; иммунная генетическая терапия, далее включающая в себя стадию трансдукции гена, для которого можно ожидать различные эффекты в вышеупомянутых клетках ех νίνο и перенос преобразованной клетки в организм; и т.п.
Фибронектин представляет собой гигантский гликопротеин, имеющий молекулярный вес 250 тысяч, который присутствует в крови животных организмов, на поверхности культивируемой клетки или во внеклеточном матриксе, и известно, что он выполняет различные функции. Его доменную структуру подразделяют на семь частей (фиг. 1 и далее), где в его аминокислотной последовательности содержатся три вида сходных последовательностей, и повторения каждой из данных последовательностей формируют полную последовательность. Три вида сходных последовательностей обозначают как тип I, тип II и тип III. Из них тип III включает в себя от 71 до 96 аминокислотных остатков, где идентичность аминокислотных остатков составляет от 17 до 40%. В фибронектине присутствует четырнадцать последовательностей III типа, из которых 8, 9 или 10 последовательности (каждая обозначается далее как Ш-8, Ш-9 или Ш-10) содержатся в домене, связывающем клетки, и 12, 13 или 14 последовательности (каждая обозначается далее как Ш-12, Ш-13 или Ш-14) содержатся в гепаринсвязывающем домене. Кроме того, УЪА-5 (тегу 1а1е ηοΐίναΐίοη апБдеп, антиген очень поздней активации) - связывающий регион находится в Ш-10, и его внутренняя последовательность представляет собой ВСЭ8. Кроме того, регион, обозначенный как ШС8, присутствует на С-концевой стороне гепаринсвязывающего домена. Участок, обозначенный как С8-1, состоящий из 25 аминокислот и обладающий связывающей активностью для УЪА-4, присутствует в ШС8 (например, непатентные публикации 1-3).
Среди видов иммунотерапии, при терапии, включающей в себя стадию переноса лимфокинактивированных клеток, полученных размножением СТЬ или лимфоцитов периферической крови, индуцированных ех νίνο, или нечто подобное в соответствии с эффектами ГЕ-2 или анти-СО3-антитела, авторы изобретения уже изучили эффекты использования фибронектина или его фрагментов в отношении таких недостатков, как, например, сохранение цитотоксической активности в тех случаях, когда размножают СТЬ, индуцированные ех νίνο, как можно эффективно размножать лимфоциты и т.п. (например, патентные публикации с 1-3).
По сообщениям последних лет о применении в иммунотерапии Т-лимфоцитов в случае, когда вводят интактные Т-клетки или более недифференцированные Т-клетки центральной памяти, то при их введении в живой организм можно ожидать значительно более высокий терапевтический эффект, чем в случае, когда вводят уже окончательно дифференцированные эффекторные Т-клетки (например, непатентные публикации 4 и 5). Далее, также для терапии с переносом дендритных клеток, терапии пептидной вакциной или подобной терапии, в которой предполагается индукция антиген-специфических СТЬ ίη νίνο, считается, что интактные Т-клетки, источники из которых могут быть индуцированы СТЬ, например, в организме пациента с прогрессирующим раком, являются малочисленными, поэтому зачастую нельзя ожидать достаточного эффекта.
- 1 016168
Непатентная публикация 1: НЬгоиеейи, Лсабет1с Рге§8 1пс., 1-8, аи!йогеб Ьу Эсапс Р. Мотег, опубликовано в 1988 г.
Непатентная публикация 2: Кпшхика Р. е! а1., 1. Вюсйет., 1991, 110(2), 284-291.
Непатентная публикация 3: НапепЬегд Н. е! а1., Нитап депе ТНегару. 1997, 8(18), 2193-2206. Непатентная публикация 4: байшош Ь. е! а1., 1. С1ш. 1пуе§!., 2005, 115(6) 1616-1626.
Непатентная публикация 5: Вешдш Р. е! а1., 1. 1ттипо1., 2005, 175(2), 739-748.
Патентная публикация 1: \УО 03/016511.
Патентная публикация 2: \УО 03/080817.
Патентная публикация 3: \УО 2005/019450.
Раскрытие изобретения
Проблемы, решаемые изобретением.
Целью настоящего изобретения является предоставление способа приготовления Т-клеточной популяции, которая является эффективной при введении в живой организм.
Средства для решения проблем.
Первое воплощение (щуепйоп) настоящего изобретения относится к способу получения Тклеточной популяции, где Т-клеточная популяция экспрессирует СО45КА и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СЭ62Ь, ССК7, СО27 и СО28, отличающемуся тем, что данный способ включает в себя стадию культивирования клеточной популяции, содержащей Тклетки, в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси. В первом изобретении настоящего изобретения общее число дней культивирования, включая стадию культивирования, в качестве примера считают равным приблизительно от 4 до 14 дней. Также в качестве примера считают, что культивирование в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси осуществляется, по меньшей мере, при стимуляции культуры и далее предпочтительно культивирование производится по меньшей мере в течение одного дня или более. Кроме того, в первом воплощении настоящего изобретения в качестве примера считают, что стадия культивирования в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси осуществляется в присутствии лиганда СЭ3. Также СЭ3 считают в качестве примера анти-СО3-антителом. В первом воплощении настоящего изобретения фрагмент фибронектина представлен в качестве примера полипептидом (т), содержащим по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, показанных в 8ЕС Ш N0: 1-8 списка последовательностей, или полипептидом (п), содержащим по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, содержащую замену, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в любую из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, где полипептид (п) имеет функцию, эквивалентную функции вышеуказанного полипептида (т). Фрагмент фибронектина также представлен в качестве примера полипептидом, включающим в себя аминокислотные последовательности, показанные в 8ЕС Ш N0: 1-3 и с 5-8 списка последовательностей. Кроме того, в первом изобретении настоящего изобретения также представлен в качестве примера способ получения, включающий в себя далее стадию выделения клеток, которые экспрессируют по меньшей мере один маркер из группы, включающей в себя СП45КА, СО62Ь, ССВ7, СЭ27 и СЭ28. В способе получения при трансдукции может быть использован ретровирусный вектор, аденовирусный вектор, аденоассоциированный вирусный вектор, лентивирусный вектор, обезьяний вирусный вектор.
Второе воплощение настоящего изобретения относится к Т-клеточной популяции, полученной по способу первого воплощения настоящего изобретения, где Т-клеточная популяция экспрессирует СО45КА и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СО62Ь, ССВ7, СО27 и СО28.
Третье воплощение настоящего изобретения относится к медикаменту, содержащему в качестве эффективного ингредиента Т-клеточную популяцию, полученную по способу настоящего изобретения, где Т-клеточная популяция экспрессирует СО45КА и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СП62Ь, ССК7, СЭ27 и СЭ28.
Четвертое воплощение настоящего изобретения относится к способу лечения или предотвращения заболевания, включающему в себя стадию введения субъекту эффективного количества Т-клеточной популяции, полученной по способу первого воплощения настоящего изобретения, где Т-клеточная популяция экспрессирует СО45КА и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СП62Ь, ССК7, СЭ27 и СО28.
Пятое воплощение настоящего изобретения относится к использованию Т-клеточной популяции, полученной по способу первого воплощения настоящего изобретения, где Т-клеточная популяция экспрессирует СО45КА и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СП62Ь, ССВ7, СЭ27 и СЭ28, в производстве медикамента.
Шестое воплощение настоящего изобретения относится к способу получения Т-клеточной популяции, отличающемуся тем, что способ включает в себя стадию стимуляции Т-клеточной популяции, полученной по способу первого воплощения настоящего изобретения, где Т-клеточная популяция экспрессирует СО45КА и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СО62Ь, ССК7, СО27 и СО28, по меньшей мере одним стимулирующим фактором, выбранным из группы, состоящей из клетки, способной презентировать антиген, клетки, имеющей презентированный анти
- 2 016168 ген, антигена, СЭ3 лиганда, СЭ28 лиганда, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин.
Седьмое воплощение настоящего изобретения относится к Т-клеточной популяции, полученной по способу шестого изобретения настоящего изобретения.
Восьмое изобретение настоящего изобретения относится к медикаменту, содержащему в качестве эффективного ингредиента Т-клеточную популяцию, полученную по способу шестого изобретения настоящего изобретения.
Девятое воплощение настоящего изобретения относится к способу лечения или предотвращения заболевания, включающему в себя стадию введения субъекту эффективного количества Т-клеточной популяции, полученной по способу шестого воплощения настоящего изобретения.
Десятое воплощение настоящего изобретения относится к использованию Т-клеточной популяции, полученной по способу шестого воплощения настоящего изобретения, в производстве медикамента.
Одиннадцатое воплощение настоящего изобретения относится к медикаменту, содержащему:
(a) препарат, содержащий в качестве эффективного ингредиента Т-клеточную популяцию, полученную по способу первого воплощения настоящего изобретения, где Т-клеточная популяция экспрессирует СО45КА и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из (3)621., ССК.7, СЭ27 и СЭ28; и (b) препарат, содержащий в качестве эффективного ингредиента по меньшей мере один стимулирующий фактор, выбранный из группы, состоящей из клетки, способной презентировать антиген, клетки, имеющей презентированный антиген, антигена, СЭ3 лиганда, СЭ28 лиганда, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин, где препараты содержатся в медикаменте в виде двух отдельных препаратов, введенных совместно или отдельно.
Двенадцатое воплощение настоящего изобретения относится к способу лечения заболевания, отличающемуся тем, что способ включает в себя следующие стадии (а) и (Ь):
(a) введение пациенту Т-клеточной популяции, полученной по способу первого воплощения настоящего изобретения, где Т-клеточная популяция экспрессирует СЭ45К.Л и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СО62Ь, ССВ7. СЭ27 и СЭ28; и (b) введение пациенту по меньшей мере одного стимулирующего фактора, выбранного из группы, состоящей из клетки, способной презентировать антиген, клетки, имеющей презентированный антиген, антигена, СЭ3 лиганда, СО28 лиганда, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин.
Эффекты изобретения.
По способу получения настоящего изобретения предоставляется Т-клеточная популяция, которая экспрессирует СЭ45ЯЛ и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СП62Ь, ССЯ7, СЭ27 и СЭ28. Клеточная популяция, полученная по способу получения изобретения, имеет высокий процент Т-клеток, которые экспрессируют СЭ45ЯЛ и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из ί.Ό62Κ ССК7, СЭ27 и СЭ28, и является высокоэффективной в лечении заболевания с помощью клеточной терапии.
Наилучший способ воплощения изобретения.
Настоящее изобретение дополнено выводами о том, что при включении стадии культивирования в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси (которые могут быть обозначены в настоящем документе как эффективный ингредиент) получают клеточную популяцию, которая содержит высокий процент Т-клеток, которые экспрессируют СЭ45К.Л и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из ί.Ό62Κ ССК7, СЭ27 и СЭ28.
В данном случае используемый в настоящем документе термин Т-клеточная популяция, которая экспрессирует СЭ45КА и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СП62Ь, ССЯ7, СЭ27 и СЭ28 означает Т-клеточную популяцию, которая содержит высокий процент Т-клеток, которые экспрессируют СЭ45ЯЛ и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из ί.Ό62Κ ССК7, СЭ27 и СЭ28.
Кроме того, высокий процент означает в настоящем документе, что если культивирование проводят в одинаковых условиях, за исключением присутствия или отсутствия эффективного ингредиента в настоящем воплощении (туеиПои), то процент Т-клеток, которые экспрессируют СЭ45ЯЛ и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из ί.Ό62Κ ССЯ7, СЭ27 и СЭ28, в Т-клеточной популяции, полученной культивированием в присутствии эффективного ингредиента в настоящем воплощении, является выше, чем в случае отсутствия эффективного ингредиента в настоящем воплощении. Предпочтительно Т-клеточная популяция содержит вышеупомянутые Т-клетки в более высоком проценте, предпочтительно на 5% или более и более предпочтительно на 10% или более, по сравнению с их количеством в случае отсутствия эффективного ингредиента в настоящем воплощении. Процент Т-клеток, которые экспрессируют СЭ45ЯЛ и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из ί.Ό62Κ ССЯ7, СЭ27 и СО28, в полученной Т-клеточной популяции меняется в зависимости от различных внешних факторов, например индивидуальных различий и физического состояния субъекта, который дает клетки для получения Т-клеток, таких как мононуклеарные клетки периферической крови (РВМСк). Следовательно, безусловное определение вышеупомянутого
- 3 016168 высокого процента в числовом значении не представляется возможным. Кроме того, Т-клеточная популяция, полученная по способу настоящего изобретения, означает популяцию, содержащую Т-клетки и клетки, не являющиеся Т-клетками, например другие лимфоциты, такие как ΝΚ-клетки, и также может присутствовать клеточный компонент крови, не относящийся к лимфоцитам.
Настоящее изобретение будет объяснено конкретно далее в настоящем документе.
(1) Фибронектин и его фрагменты, использованные в настоящем изобретении.
Фибронектин и его фрагменты, описанные в настоящем документе, могут быть натурального происхождения и искусственно синтезированные. Фибронектин и его фрагмент могут быть получены в существенно чистом виде из субстанции природного происхождения на основе описания изобретения, например, Кио51айй Е., а! а1., 1. ΒίοΙ. С11сш.. 256(14), 7277-7281 (1981). Термин существенно чистый фибронектин или фрагмент фибронектина, описанный в настоящем документе, означает, что данный фибронектин и фрагмент фибронектина не содержат, по существу, других белков, встречающихся вместе с фибронектином в природе. Каждый из вышеупомянутых фибронектина и его фрагментов может быть использован в настоящем изобретении отдельно или в смеси многочисленных разновидностей.
К тому же известно, что существует большое количество сплайсинговых вариантов фибронектина. В качестве фибронектина, используемого в настоящем изобретении, может быть использован любой вариант при условии, что проявляются эффекты настоящего изобретения. Например, в случае фибронектина, полученного из плазмы крови, известно, что удаляются регион, обозначаемый как ΕΌ-Β, присутствующий перед доменом, связывающим клетки, и регион, обозначаемый как ΕΌ-Ά, присутствующий между доменом, связывающим клетки, и гепаринсвязывающим доменом. Данный фибронектин, полученный из плазмы крови, также может быть использован в настоящем изобретении.
Полезная информация о фрагментах фибронектина, которые могут быть использованы в настоящем изобретении и о получении данных фрагментов, может быть получена из Кншбика Р. е! а1., 1. Вюсйет., 110, 284-291 (1991), КотЬпЬй Ά.Κ. е! а1., ЕМВО, 4(7), 1755-1759 (1985), 8ек1§исЫ Κ. е! а1., В1осйеш151гу, 25(17), 4936-4941 (1986) и т.п. Кроме того, последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая фибронектин, или последовательность аминокислот фибронектина раскрыта в генбанке, номера доступа ΝΜ_002026 и ΝΡ_002017.
В настоящем изобретении фрагмент фибронектина представлен в качестве примера полипептидом (т), включающим в себя по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, содержащую любой из регионов ΙΙΙ-8 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 списка последовательностей), ΙΙΙ-9 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 списка последовательностей), ΙΙΙ-10 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕЦ ΙΌ N0: 3 списка последовательностей), ΙΙΙ-11 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4 списка последовательностей), ΙΙΙ-12 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕЦ ΙΌ N0: 5 списка последовательностей), ΙΙΙ-13 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕЦ ΙΌ N0: 6 списка последовательностей), ΙΙΙ-14 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕЦ ΙΌ N0: 7 списка последовательностей) и С8-1 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕЦ ΙΌ N0: 8 списка последовательностей) (см. фиг. 1), и полипептидом (п), включающим в себя по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, содержащую замещение, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в любую из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, где полипептид (п) имеет функцию, эквивалентную функции вышеуказанного полипептида (т). Длина фрагмента составляет, например, в пересчете на количество аминокислот предпочтительно от 20 до 1000 и более предпочтительно от 100 до 800. В данном документе несколько представляет собой понятие, которое охватывает некоторое число и составляет предпочтительно от 2 до 12, более предпочтительно от 2 до 10 и еще более предпочтительно от 2 до 8 и которое в дальнейшем обозначает то же самое. Кроме того, в качестве фрагмента предпочтительно используют фрагмент, обладающий клеточно-адгезивной активностью и/или гепаринсвязывающей активностью. Клеточно-адгезивную активность можно определить известным способом, проведя количественный анализ связывания фрагмента (его домена, связывающего клетки), использованного в настоящем изобретении, с клеткой. Например, вышеупомянутый способ включает в себя способ ^1Шат5 Ό.Ά. е! а1., №!иге, 352, 438-441 (1991). Данный способ представляет собой определение связывания клетки с фрагментом, иммобилизованным на культуральном планшете. Дополнительно можно оценить известным способом гепаринсвязывающую активность, проведя количественный анализ связывания фрагмента (его гепаринсвязывающего домена), использованного в настоящем изобретении, с гепарином. Например, связывание фрагмента с гепарином можно оценить аналогичным способом, используя гепарин, например меченый гепарин вместо клетки в вышеупомянутом способе ^1Шат5 Ό.Ά. е! а1.
Далее фрагмент фибронектина представляют в качестве примера полипептидом, выбранным из группы, состоящей из С-274 (последовательность аминокислот, показанная в 8ЕЦ ΙΌ N0: 9 списка последовательностей), Н-271 (последовательность аминокислот, показанная в 8ЕЦ ΙΌ N0: 10 списка последовательностей), Н-296 (последовательность аминокислот, показанная в 8ЕЦ ΙΌ N0: 11 списка последовательностей), СН-271 (последовательность аминокислот, показанная в 8ЕЦ ΙΌ N0: 12 списка последовательностей), СН-296 (последовательность аминокислот, показанная в 8ЕЦ ΙΌ N0: 13 списка по
- 4 016168 следовательностей), С-С81 (последовательность аминокислот, показанная в 8ЕЦ ГО N0: 14 списка последовательностей) и СН-296№1 (последовательность аминокислот, показанная в 8ЕЦ ГО N0: 15 списка последовательностей).
Каждый из вышеупомянутых фрагментов СН-271, СН-296, СН-296№. С-274 и С-С81 представляет собой полипептид, имеющий домен, связывающий клетки, с УЬА-5 связывающей активностью. Кроме того, С-С81, Н-296, СН-296 и С.’Н-296№1 являются полипептидами, имеющими С8-1 с УЬА-4 связывающей активностью. Далее Н-271, Н-296, СН-271, СН-296 и СН-296№1 являются полипептидами, имеющими гепаринсвязывающий домен. В данном документе СН-296№1 представляет собой полипептид, содержащий регион из домена, связывающего клетки, к С8-1 фибронектина плазмы крови.
В настоящем изобретении также может быть использован фрагмент, в котором модифицирован каждый из вышеупомянутых доменов. Гепаринсвязывающий домен фибронектина образован тремя последовательностями типа III (ΙΙΙ-12, ΙΙΙ-13 и ΙΙΙ-14). Фрагмент, содержащий гепаринсвязывающий домен, имеющий делецию в одной или двух последовательностях вышеупомянутого типа III, также может быть использован в настоящем изобретении. Примерами фрагментов могут быть СНУ-89 (последовательность аминокислот, показанная в 8ЕЦ ГО N0: 16 списка последовательностей), СНУ-90 (последовательность аминокислот, показанная в 8ЕЦ ГО N0: 17 списка последовательностей) и СНУ-92 (последовательность аминокислот, показанная в 8ЕЦ ГО N0: 18 списка последовательностей), которые представляют собой фрагменты, в которых связаны участок связывания клеток фибронектина (УЬА-5 связывающий домен: с Рго1239 по 8ег1515) и одна из последовательностей типа III. СНУ-89, СНУ-90 и СНУ-92 содержат ΙΙΙ-13, ΙΙΙ-14 и ΙΙΙ-12 соответственно, СНУ-179 содержит ΙΙΙ-13 и ΙΙΙ-14 и СНУ-181 содержит ΙΙΙ-12 и ΙΙΙ-13 соответственно.
Кроме того, в настоящем изобретении может быть использован фрагмент, имеющий присоединение дополнительной аминокислоты к любому из вышеупомянутых фрагментов. Например, фрагмент может быть получен добавлением желаемой аминокислоты к любому из вышеупомянутых фрагментов. Например, Н-275-Сук (последовательность аминокислот, показанная в 8ЕЦ ГО N0: 21 списка последовательностей) представляет собой фрагмент, имеющий гепаринсвязывающий домен фибронектина и остаток цистеина на С-конце.
Фрагмент, использованный в настоящем изобретении, может быть фрагментом, содержащим полипептид с аминокислотной последовательностью, имеющей замещение, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность полипептида, формирующего фрагмент, содержащий по меньшей мере часть аминокислотной последовательности встречающегося в природе фибронектина, представленного ранее в качестве примера, где полипептид имеет функцию, эквивалентную функции фрагмента, при условии получения желаемых эффектов настоящего изобретения.
Предпочтительно замещение аминокислот и т. п. проводят в той мере, которая может изменить физико-химические характеристики и т.п. полипептида в диапазоне, где может быть сохранена наследственная функция полипептида. Например, замещение и т.п. аминокислот является консервативным в диапазоне, где собственные характеристики полипептида (например, гидрофобность, гидрофильность, электрический заряд, рК и т.п.) существенно не меняются. Например, предпочтительно замещение аминокислот представляет собой замещения внутри каждой из групп: 1) глицин, аланин; 2) валин, изолейцин, лейцин; 3) аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аспарагин, глутамин; 4) серин, треонин; 5) лизин, агринин; 6) фенилаланин, тирозин; и делеция, добавление или вставка представляют собой делецию, добавление или вставку аминокислот, имеющих сходные характеристики с аминокислотами вокруг области воздействия в полипептиде в диапазоне, где характеристики аминокислот, окружающих область воздействия, существенно не меняются.
В тех случаях, когда фрагмент, использованный в настоящем изобретении, был получен методом генной инженерии, то полипептид получают, например, используя ЕксйепсЫа сой и т.п. в качестве хозяина, метионин на №конце иногда удаляют действием метионинпептидазы из ЕксйепсЫа сой, и вышеупомянутый пептид может быть использован в настоящем изобретении.
Другими словами, полипептид, имеющий делецию метионина на №конце полипептидов, показанных в 8ЕЦ ГО N0: 15 и 21 списка последовательностей, также предпочтительно может быть использован в настоящем изобретении.
Замещение и т.п. аминокислот может быть таким, которое встречается в природе и вызвано различием видов или особей, или может быть вызвано искусственно. Искусственная индукция может быть выполнена известным способом и является практически неограниченной. Искусственная индукция может быть проведена путем получения, например, заданной нуклеиновой кислоты, имеющей замену, делецию, добавление или вставку одного или нескольких нуклеотидов в нуклеиновую кислоту, кодирующую вышеупомянутый регион, и данный фрагмент получен из натурального фибронектина по известному способу, и использование нуклеиновой кислоты, в соответствии с чем может быть получен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую замену и т. п. в аминокислотной последовательности полипептида, формирующего фрагменты и т.п., имеющие функцию, эквивалентную функции вышеупомянутого региона, и данный фрагмент получен из натурального фибронектина.
- 5 016168
Кроме того, фраза имеющие функцию, эквивалентную относится к тому, что доля Т-клеток, которые экспрессируют СО45КА и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СЭ62Ь, ССК7, СЭ27 и СЭ28 в Т-клеточной популяции, полученной с применением полипептида, является выше, чем в Т-клеточной популяции, полученной без применения полипептида, которая представляет собой контроль для сравнения. Вышеупомянутое действие может быть подтверждено в соответствии с методом, описанным в примерах 1, 2 и 6, изложенных далее. Кроме того, в качестве фрагмента, включающего в себя полипептид, имеющий замену аминокислот и т.п., предпочтителен фрагмент, обладающий клеточно-адгезивной активностью и/или гепаринсвязывающей активностью, и также предпочтителен фрагмент, имеющий С8-1 домен. Клеточно-адгезивная активность и/или гепаринсвязывающая активность могут быть оценены вышеупомянутыми способами.
В качестве фрагмента, включающего в себя полипептид, имеющий замену аминокислот и т.п. в настоящем изобретении, также может быть использован, например, фрагмент, имеющий одну или более аминокислоту, вставленную как линкер между двух различных доменов.
В данном случае, в качестве фибриногена, аналогичного вышеупомянутому фрагменту, в настоящем изобретении может быть использован полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую замену, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность полипептида фибронектина, где доля Т-клеток, которые экспрессируют ί.Ό45ΒΛ и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СЭ62Ь, ССК7, СЭ27 и СЭ28 в Т-клеточной популяции, полученной с применением полипептида, является выше, чем в Т-клеточной популяции, полученной без применения полипептида, которая представляет собой контроль для сравнения.
Кроме того, в качестве фибронектина или его фрагмента, использованного в настоящем изобретении, при условии получения желаемых эффектов настоящего изобретения, может быть использован полипептид, имеющий гомологию 50% или более, предпочтительно полипептид, имеющий гомологию 70% или более, более предпочтительно полипептид, имеющий гомологию 90% и более, и наиболее предпочтительно пептид, имеющий гомологию 95% и более, с аминокислотной последовательностью полипептида, формирующего фибронектин или его фрагмент, где полипептид, сформированный фибронектином или его фрагментом, имеет функцию, эквивалентную функции природного фибронектина или фрагмента, содержащего по меньшей мере часть его аминокислотной последовательности, представленной ранее в виде примера.
В данном случае для расчета гомологии может быть использована, например, программа ΌΝΆ8Ι8 Рго версия 2.6 (производство ТАКАКА ΒΙΟ ΙΝΟ)
В данном случае фрагмент фибронектина, предпочтительно используемый в настоящем изобретении, включает в себя полипептид, содержащий в аминокислотной последовательности все ΙΙΙ-8 (последовательность аминокислот, показанная в 8Еф Ш ΝΟ: 1 списка последовательностей), ΙΙΙ-9 (последовательность аминокислот, показанная в 8Еф ΙΌ ΝΟ: 2 списка последовательностей), ΙΙΙ-10 (последовательность аминокислот, показанная в 8Еф ΙΌ ΝΟ: 3 списка последовательностей), ΙΙΙ-12 (последовательность аминокислот, показанная в 8Еф ΙΌ ΝΟ: 5 списка последовательностей), ΙΙΙ-13 (последовательность аминокислот, показанная в 8Еф ΙΌ ΝΟ: 6 списка последовательностей), ΙΙΙ-14 (последовательность аминокислот, показанная в 8Еф ΙΌ ΝΟ: 7 списка последовательностей) и С8-1 (последовательность аминокислот, показанная в 8Еф ΙΌ ΝΟ: 8 списка последовательностей), другими словами, полипептид, содержащий гепаринсвязывающий домен, домен, связывающий клетки, и С8-1, и более предпочтительно фрагмент фибронектина включают в себя вышеупомянутый СН-296, или полипептид с аминокислотной последовательностью, имеющей замещение, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность полипептида, формирующего фрагмент, имеющий функцию, эквивалентную функции СН-296. Другой полипептид фибронектина, предпочтительно используемый в настоящем изобретении, включает в себя Н-296, СН-271, Н-271 и С-С81, как показано в примере 18, или полипептиды с аминокислотной последовательностью, имеющей замещение, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность полипептида, формирующего фрагмент, имеющий функцию, эквивалентную функции данных полипептидов.
Фрагмент фибронектина, описанный в настоящем документе, также может быть получен в виде фрагмента рекомбинантного фибронектина из генетического рекомбинанта на основе, например, описания спецификации патента США № 5198423. Например, каждый из вышеупомянутых фрагментов Н-271 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 10), Н-296 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 11), СН-271 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 12) и СН-296 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 13) и способ получения указанных фрагментов подробно описаны в спецификации указанного патента. Кроме того, СН-296№1 (8Еф ΙΌ ΝΟ: 15) и способ его получения описаны в международном патенте νΟ 2005/019450. Кроме того, вышеупомянутый С-274 (8Еф ΙΌ ΝΟ: 15) фрагмент может быть получен по способу, описанному в патенте США № 5102988. Далее, С-С8-1 (8Еф ΙΌ ΝΟ: 14) фрагмент может быть получен по способу, описанному в спецификации Японской патентной газеты № 3104178. Каждый из вышеупомянутых фрагментов СНУ-89 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 16), СНУ-90 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 17) или СНУ-179 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 19) может быть получен по способу, описанному в спецификации Японской патентной газеты № 2729712. Кроме того, СНУ-181 (8Еф ΙΌ ΝΟ: 20) фрагмент может быть получен по способу, описанному в между
- 6 016168 народном патенте XVО 97/18318. СНУ-92 (8ЕЦ ГО N0: 18) фрагмент может быть получен методом генной инженерии с помощью плазмиды, сконструированной традиционным способом на основе плазмиды, описанной в литературе по ссылке на спецификацию Японской патентной газеты № 2729712 и международный патент ν0 97/18318.
Данные фрагменты или фрагменты, которые могут быть произведены из них традиционным способом, могут быть получены с помощью микроорганизмов, депонированных в Международном патентном депозитарии организмов, Национальном институте передовой индустриальной науки и технологии, ТкикиЬа Ссп1га1 6, 1-1, ШдакЫ 1-скоте, ТкикиЬа-кЫ, 1Ьагак1-кеи, 1араи (почтовый индекс 305-8566) со следующими номерами доступа, или полученные модификацией плазмидой, введенной в каждый микроорганизм по известному способу.
ЕЕКМ ВР-22 64 (ЕкскепсЫа сок, содержащая плазмиду, кодирующую Н-271, дата депозита: 30 января 1989);
ЕЕКМ ВР-2800 (ЕкскепсЫа сок, содержащая плазмиду, кодирующую СН-296, дата депозита: 12 мая 1989);
ЕЕКМ ВР-2799 (ЕкскепсЫа сок, содержащая плазмиду, кодирующую СН-271, дата депозита: 12 мая 1989);
ЕЕКМ ВР-7420 (ЕкскепсЫа сок, содержащая плазмиду, кодирующую СН-296, дата депозита: 12 мая
1989) ;
ЕЕКМ ВР-1915 (ЕкскепсЫа сок, содержащая плазмиду, кодирующую С-274, дата депозита: 17 июня 1988);
ЕЕКМ ВР-5723 (ЕкскепсЫа сок, содержащая плазмиду, кодирующую С-С81, дата депозита: 5 марта
1990) ;
ЕЕКМ ВР-10073 (плазмида, кодирующая С’Н-296№. дата депозита: 23 июля 2004);
ЕЕКМ Р-12182 (ЕкскепсЫа сок, содержащая плазмиду, кодирующую СНУ-89, дата депозита: 8 апреля 1991) и
ЕЕКМ Р-12183 (ЕкскепсЫа сок, содержащая плазмиду, кодирующую СНУ-179, дата депозита: 8 апреля 1991).
Поскольку фибронектин представляет собой гигантский гликопротеин, то заведомо непросто в промышленном отношении получить и использовать природный белок для производства медикамента. Кроме того, поскольку фибронектин представляет собой многофункциональный белок, то могут быть рассмотрены некоторые недостатки, вызванные тем, что регион отличен от региона, демонстрирующего эффект с помощью метода настоящего изобретения в зависимости от условий его применения. По указанным причинам в смысле доступности, работы и безопасности предпочтительно используют фрагмент фибронектина и более предпочтительно фрагмент рекомбинантного фибронектина, полученный, как описано ранее в настоящем изобретении. Кроме того, предпочтительно использовать вышеупомянутый фрагмент фибронектина в смысле реализации высокой степени размножения. Кроме того, молекулярный вес фрагмента фибронектина, использованного в настоящем изобретении, не ограничен и предпочтительно составляет от 1 до 200 кДа, более предпочтительно от 5 до 190 кДа и наиболее предпочтительно от 10 до 180 кДа. Молекулярный вес может быть определен, например, электрофорезом в 8Ό8полиакриламидном геле.
В аминокислотной последовательности полипептида, формирующего фрагмент фибронектина настоящего изобретения, часть аминокислотной последовательности другая, чем аминокислотная последовательность полипептида, формирующего фрагмент природного фибронектина, является произвольной и неограниченной при условии, что не ингибируется проявление желаемых эффектов настоящего изобретения.
(2) Способ получения Т-клеточной популяции.
Способ получения Т-клеточной популяции настоящего изобретения будет конкретно объяснен далее. Настоящее изобретение представляет собой способ получения клеточной популяции, которая содержит высокий процент Т-клеток, которые экспрессируют СГО45КЛ и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СЭ62Ь, ССК7, СГО27 и СО28, и предпочтительно Тклеток, которые экспрессируют СО45КЛ и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СЭ62Ь и ССК.7. Способ настоящего изобретения отличается тем, что данный способ включает в себя стадию культивирования клеточной популяции, содержащей Т-клетки, в присутствии вышеупомянутого фибронектина, его фрагмента или их смеси.
СП45КЛ, СЭ62Ь, ССК7, СГО27 и СГО28 представляют собой маркеры клеточной поверхности лимфоцитов и известно, что они экспрессируются в недифференцированных клетках, таких как интактные Тклетки. Другими словами, Т-клетки, которые экспрессируют СЭ45КЛ и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СЭ62Ь, ССК7, СГО27 и СО28, содержащиеся в высоком проценте в клеточной популяции, полученной по способу получения настоящего изобретения, могут быть отнесены к недифференцированным клеткам перед дифференциацией в Т-клетки памяти, т. е. интактные Т-клетки, в виду фенотипа антигенного маркера клеточной поверхности. Как описано в вышеупомянутых непатентных публикациях 4 и 5, интактные Т-клетки обладают высоким коэффициентом
- 7 016168 выживаемости, эффектом клеточной пролиферации, эффектом аккумуляции в опухоли, высокой степенью производства опухолеспецифичных эффекторных клеток в живом организме, при введении интактных Т-клеток, и интактные Т-клетки полезны в области клеточной терапии.
Как показано далее в примере 3, Т-клеточная популяция, полученная по способу получения настоящего изобретения, превращается в активированные Т-клетки, производящие большое количество 1Ь2, при стимулировании Т-клеточной популяции анти-СЭЗ-антителом или анти-СП28-антителом. Кроме того, как показано далее в примере 4, поскольку Т-клеточная популяция, полученная по способу получения настоящего изобретения, демонстрирует хемотаксис в ответ на ССЬ21, который является хемокином, Т-клеточная популяция также обладает способностью мигрировать в лимфоузел. Кроме того, как показано далее в примерах с 5-8, к Т-клеточной популяции применяют антигенную стимуляцию, в результате чего индуцируются СТЬ, имеющие антигенспецифические цитотоксические активности. Далее, как показано в примере 9, поскольку Т-клеточная популяция демонстрирует высокую жизнеспособность в присутствии небольшого количества 1Ь-2 или без него по сравнению с Т-клеточной популяцией, полученной в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси, то ожидают, что Т-клеточная популяция также демонстрирует высокую жизнеспособность в живом организме. По существу, в примере 11, представленном далее, показано, что когда мышам ΝΟΌ/κείά вводят Т-клеточную популяцию, полученную по способу настоящего изобретения, то Т-клетки имеют более высокую степень приживления в селезенке и более высокий процент выживаемости по сравнению с Т-клеточной популяцией, полученной без фибронектина, его фрагмента или их смеси. Далее, в примере 11 также показано, что поскольку вводимая Тклеточная популяция также вызывает СУНЭ реакцию, то индуцируются клетки, имеющие высокие цитотоксические активности. Принимая во внимание вышесказанное, Т-клеточная популяция, полученная по способу настоящего изобретения, имеет не только фенотип антигенного маркера клеточной поверхности, но также функцию, подходящую для применения в области клеточной терапии, принадлежащую интактным Т-клеткам.
Однако, как показано в п.(4) примера 7, п.(2) примера 8, п.(4) примера 15 и п.(2) примера 16, неожиданно было обнаружено, что индуцированные СТЬ из Т-клеточной популяции, полученной дальнейшим воздействием на Т-клеточную популяцию, полученную с помощью описанного выше способа на стадии выделения клеточной популяции, которая экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из ί.Ό45ΒΛ. СО62Ь, ССК7, СЭ27 и СЭ28. упоминаемого далее, обладают более высокой цитотоксической активностью и способностью распознавать специфический антиген, чем интактные Т-клетки, полученные из РВМС, и Т-клетки, имеющие сходный фенотип, но полученные в отсутствие эффективного ингредиента настоящего изобретения. Другими словами, Т-клеточная популяция, полученная вышеупомянутыми способами, имеет значительно более высокую цитотоксическую активность после дифференцировки в СТЬ по сравнению с нормальными интактными Т-клетками. При этом вышеупомянутая Т-клеточная популяция представляет собой Т-клеточную популяцию, содержащую новые интактные Т-подобные клетки, имеющие более эффективные свойства, которые отличаются от интактных Т-лимфоцитов.
Можно ожидать, что сильные терапевтические эффекты Т-клеточной популяции, полученной по способу настоящего изобретения, как упоминалось ранее, будут проявляться сходным образом в СЭ8' и СЭ4' интактных Т-подобных клетках. Далее, как описано в упомянутой выше патентной публикации 2, размножение Т-клеток проводят в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси, в результате чего получают очень высокую степень пролиферации. Поэтому Т-клеточная популяция, полученная по способу настоящего изобретения, является очень подходящей для применения в области клеточной терапии.
Примерами клеточной популяции, содержащей Т-клетки, использованные в способе получения настоящего изобретения, являются РВМС, интактные Т-клетки, Т-клетки памяти, гемопоэтические стволовые клетки, мононуклеарные клетки крови из пуповины и т.п. Кроме того, в настоящем изобретении могут быть использованы клетки при условии, что они являются клетками крови. Могут быть использованы любые из данных клеток, которые получают из живого организма или культивированием ех νίνο, например может быть использована непосредственно Т-клеточная популяция, полученная по способу настоящего изобретения, или Т-клеточная популяция, которую подвергали хранению в замороженном состоянии. Кроме того, может быть использована, например, клеточная популяция, полученная с помощью различных процедур выделения из клеток, использованных в получении вышеупомянутой Т-клеточной популяции, полученной из живого организма, например любой клеточной популяции, полученной разделением клеток, таких как РВМС на СЭ8' или СЭ4'. В данном случае в способе получения Т-клеточной популяции настоящего изобретения может быть использован материал, содержащий вышеупомянутые клетки, например кровь, такая как периферическая кровь или пуповинная кровь; материал, полученный удалением из крови таких компонентов, как эритроциты и плазма; спинно-мозговая жидкость и т.п.
Предпочтительно способ получения Т-клеточной популяции настоящего изобретения осуществляют в общее число дней культивирования, предпочтительно от 4 до 14 дней. Другими словами, если общее число дней культивирования составляет от 4 до 14 дней, то процент Т-клеток, которые экспрессируют ί.Ό45ΒΛ и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из
- 8 016168
СО62Ь. ССР7. СЭ27 и СЭ28. в финальной Т-клеточной популяции является высоким, таким образом делая ее очень подходящей для использования в области клеточной терапии. Если общее число дней культивирования составляет менее 4 дней, то не может быть получено достаточное число клеток для применения в общей иммунотерапии. В настоящем изобретении общее число дней культивирования составляет более предпочтительно от 5 до 14 дней и наиболее предпочтительно от 7 до 14 дней.
В способе получения Т-клеточной популяции настоящего изобретения предпочтительно культивирование в настоящем изобретении проводят в присутствии эффективного ингредиента, особенно предпочтительно, по меньшей мере, на ранней стадии полного периода культивирования. Предпочтительно в настоящем изобретении культивирование проводят в присутствии эффективного ингредиента, более предпочтительно, по меньшей мере, в начале культивирования. Культивирование в присутствии эффективного ингредиента в настоящем изобретении может быть проведено в начальный период периода культивирования или во время другой части периода. Другими словами настоящее изобретение охватывает те воплощения, которые включают в себя вышеуказанную стадию в части стадий получения Тклеток. Предпочтительно культивирование в присутствии эффективного ингредиента в настоящем изобретении проводят в течение одного дня или более, более предпочтительно в течение 3 дней или более и наиболее предпочтительно в течение 4 дней и более от начала культивирования.
В настоящем изобретении концентрация фибронектина, его фрагмента или их смеси во время культивирования особенно не ограничена и составляет, например, предпочтительно от 0,001 до 500 мкг/мл и особенно предпочтительно от 0,01 до 500 мкг/мл.
В настоящем изобретении предпочтительно культивирование в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси проводят в присутствии лиганда ΟΩ3 с позиции эффективного стимулирования комплекса ТСВ-СЭЗ Т-клетками для пролиферации клеток.
В настоящем изобретении лиганд СОЗ особенно не ограничен при условии, что субстанция имеет связывающую активность к СОЗ и представлена, например, анти-СПЗ-антителом, особенно предпочтительно анти-СЭЗ моноклональным антителом и, например, ОКТЗ. Концентрация лиганда СОЗ в среде особенно не ограничена. Например, в случае, когда используют моноклональное антитело, концентрация составляет, например, от 0,001 до 100 мкг/мл и особенно предпочтительно от 0,01 до 100 мкг/мл.
Кроме того, в настоящем изобретении может быть добавлен другой костимуляторный фактор, такой как лиганд 0028, чтобы обеспечить, при необходимости, костимуляцию. Примерами являются антиСП28-антитело, СЭ80, В7-1, В7-2 и т.п.
Среда, использованная для получения Т-клеточной популяции в способе настоящего изобретения, особенно не ограничена и может быть использована известная среда, полученная смешиванием компонентов, необходимых для размножения Т-клеток. Например, может быть соответственно выбрана для использования коммерчески доступная среда. Данные среды могут содержать цитокины, соответствующие белки и другие компоненты в дополнение к неотъемлемым компонентам. Примерами цитокинов могут служить 1Ь-2, 1Ь-7, 1Ь-12, ΙΕΝ-γ и т.п., и предпочтительно используют среду, содержащую 1Ь-2. Концентрация 1Ь-2 в среде особенно не ограничена и составляет, например, от 0,01 х105 ед/мл и более предпочтительно от 0,1 до 1 х 104 ед/мл. Примером подходящего белка является анти-1Е-4-антитело. Также может быть добавлен лимфоцит-стимулирующий фактор, такой как лектин. Концентрация компонента в среде особенно не ограничена при условии, что могут быть получены желаемые эффекты.
Кроме того, при культивировании в среду могут быть добавлены сыворотка крови или плазма. Количества сыворотки и плазмы, добавленные к среде, особенно не ограничены и представляют, например, от 0 до 20 об.%, количества сыворотки и плазмы могут быть изменены в зависимости от стадии культивирования. Например, сыворотка или плазма могут быть использованы с постадийным снижением их концентрации. В данном случае источник сыворотки или плазмы может быть либо аутологичным (означает, что источник тот же самый, что и для культивируемой клетки) или неаутологичным (означает, что источник отличается от источника культивируемой клетки). С точки зрения безопасности предпочтительно может быть использована аутологичная сыворотка или плазма. Получение Т-клеточной популяции настоящего изобретения обычно проводят в среде, содержащей указанные компоненты, в присутствии упомянутого выше эффективного ингредиента в настоящем изобретении. Число клеток в закладке культуры, использованной в настоящем изобретении, особенно не ограничено и составляет, например, предпочтительно от 1 клетки/мл до 1х108 клеток/мл, более предпочтительно от 1 клетки/мл до 5х107 клеток/мл, наиболее предпочтительно от 1 клетки/мл до 2х107 клеток/мл. Кроме того, условия культивирования особенно не ограничены и могут быть использованы обычно применяемые для клеточной культуры условия. Например, клетки могут быть культивированы в условиях З7°С и в присутствии 5% СО2 и т.п. Кроме того, среда может быть разведена добавлением свежей среды к раствору клеточной культуры, среда может быть заменена или может быть заменено оборудование клеточной культуры в соответствующие интервалы времени.
Оборудование клеточной культуры, использованное в способе получения Т-клеточной популяции настоящего изобретения, особенно не ограничено и могут быть использованы, например, чашки Петри, матрас для культивирования, контейнер, большой культуральный бак, биореактор и т. п. В качестве кон- 9 016168 тейнера может быть использован СО2-проницаемый контейнер для культивирования клеток. Кроме того, в случае, когда Т-клетки производят промышленно в большом количестве, то может быть использована большая культуральная камера. Кроме того, культивирование может быть проведено в открытой или закрытой системе. С точки зрения безопасности полученных Т-клеток культивирование предпочтительно проводят в закрытой системе.
В данном случае эффективный ингредиент в настоящем изобретении, лиганд СЭЗ. другой костимуляторный фактор и подходящие белки, цитокины и другие компоненты, содержащиеся в упомянутой выше среде, могут быть растворены для совместного представления или могут быть иммобилизованы и применены на подходящей твердой фазе, например на оборудовании для клеточной культуры (включая любое оборудование открытой или закрытой системы), таком как чашка Петри, матрас для культивирования или контейнер, или на носителе клеточной культуры, таком как бусы, мембрана или предметное стекло. Материалы для указанных твердых фаз особенно не ограничены при условии, что материалы могут быть использованы для культивирования клеток. При иммобилизации компонентов, например, на упомянутое выше оборудование предпочтительно иммобилизовать указанное количество каждого компонента с учетом количества помещаемой в оборудование среды, для того чтобы после помещения среды в оборудование, она содержалась в пропорции, сходной с пропорцией желаемой концентрации, когда компоненты растворяют в среде и затем применяют. Количество иммобилизованных компонентов особенно не ограничено при условии, что могут быть получены желаемые эффекты. Упомянутый выше носитель применяют путем погружения носителя в культуральную среду в оборудовании для клеточной культуры во время культивирования. При иммобилизации на носитель упомянутых выше компонентов предпочтительно иммобилизовать указанное количество каждого компонента с учетом количества помещаемой в оборудование среды, для того чтобы после помещения носителя в среду она содержалась в пропорции, сходной с пропорцией желаемой концентрации, когда компоненты растворяют в среде и затем применяют. Количество иммобилизованных компонентов особенно не ограничено при условии, что могут быть получены желаемые эффекты.
Способ для иммобилизации на твердой фазе эффективного ингредиента в настоящем изобретении, лиганда СЭ3, и другого костимуляторного фактора особенно не ограничен. Например, упомянутые выше субстанции могут быть иммобилизованы путем их контактирования с твердой фазой в подходящем буферном растворе.
Кроме того, что касается иммобилизации фрагмента фибронектина на твердой фазе, то иммобилизация также может быть проведена по способам, описанным в международных патентах \О 97/18318 и \\'О 00/09168.
После того как в настоящем изобретении упомянутые выше различные компоненты или эффективный ингредиент иммобилизуют на твердой фазе, Т-клеточная популяция, полученная с помощью метода настоящего изобретения, может быть легко отделена от эффективного ингредиента и т.п. простым отделением Т-клеточной популяции от твердой фазы, для того чтобы можно было предотвратить загрязнение Т-клеточной популяции эффективным ингредиентом и т.п.
Кроме того, способ получения настоящего изобретения может далее включать в себя стадию выделения Т-клеточной популяции, которая экспрессирует по меньшей мере один из маркеров, выбранных из группы, состоящей из СП45КА, ί.Ό62Η ССК7, СЭ27 и ί.Ό28, из Т-клеточной популяции, полученной культивированием в присутствии эффективного ингредиента в настоящем изобретении. Другими словами, Т-клеточная популяция, полученная культивированием в присутствии эффективного ингредиента в настоящем изобретении, как описано выше, содержит большой процент Т-клеток, которые экспрессируют ί.Ό45ΒΛ и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из ί.Ό62Η ССК.7, СЭ27 и СЭ28. Поэтому далее проводят процедуры выделения клеток, которые экспрессируют по меньшей мере один поверхностный антигенный маркер, выбранный из группы, состоящей из СП45КА, ί.Ό62Η ССК7, СЭ27 и СЭ28, при помощи которых могут быть более эффективно получены интактные Т-подобные клетки или Т-клеточная популяция, содержащая еще больше интактных Тподобных клеток. В данном случае Т-клетки, которые необходимо отделить, особенно не ограничены и представляют собой, например, клетки, которые экспрессируют СП45КА, и предпочтительно представляют собой клетки, которые экспрессируют ί.Ό45ΒΛ и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из ί.Ό62Κ ССК7, СЭ27 и СЭ28, и более предпочтительно клетки, которые экспрессируют ί.Ό45ΒΛ и ί.Ό62Η и клетки, которые экспрессируют ί.Ό45ΒΛ и ССВ7. Процедуры выделения особенно не ограничены и выделение проводят по известному способу с помощью клеточного сортера, магнитных бус, колонки и т. п. Например, при выделении клеток, которые экспрессируют ί.Ό45ΒΛ и ССК.7, выделение может быть проведено, как описано в разделе (3) примера 3, описанного далее.
Кроме того, Т-клетки, полученные по способу настоящего изобретения, клонируют, в результате чего Т-клетки могут быть сохранены в виде стабильных Т-клеток. Кроме того, Т-клеточную популяцию далее культивируют по способу настоящего изобретения или известным способом, используя Тклеточную популяцию, полученную с помощью способа настоящего изобретения, в результате чего Тклеточная популяция может быть получена вновь. Причем применяют антигенную стимуляцию и т. п. по
- 10 016168 известному способу, например, таким же образом, как в примерах 5-8, описанных далее, с использованием Т-клеточной популяции, полученной с помощью способа настоящего изобретения, посредством чего могут быть получены антиген-специфические СТЬ.
Т-клеточная популяция, полученная с помощью способа настоящего изобретения, содержит высокий процент Т-клеток, которые экспрессируют СБ45КА и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СБ62Ь, ССЯ7, СБ27 и СБ28, которые представляют собой недифференцированные Т-клетки, как упоминалось выше, и Т-клеточная популяция также содержит Т-клетки, имеющие цитотоксические активности, в зависимости от вида клеток, использованных в культуре. Цитотоксическая активность Т-клеточной популяции также может быть оценена известным тестом ίη νίίτο.
Поскольку Т-клеточная популяция, полученная в настоящем изобретении, содержит высокий процент недифференцированных интактных Т-подобных клеток, как упоминалось ранее, то Т-клеточная популяция, полученная с помощью способа настоящего изобретения, не обязательно показывает высокую цитотоксическую активность в упомянутой выше системе.
Заболевания, при которых вводят Т-клеточную популяцию, полученную с помощью способа настоящего изобретения, не являются особенно ограниченными и представляют собой, например, рак, лейкемию, злокачественную опухоль, гепатит и инфекционные заболевания, вызванные вирусом, таким как вирус гриппа, Ηΐν, бактерией или грибком, например туберкулез, ΜΚ8Ά, УКЕ и глубокий микоз. Кроме того, далее при трансдукции чужеродного гена, как описано ниже, также можно ожидать эффекты при различных генетических заболеваниях. Т-клеточная популяция, полученная с помощью способа настоящего изобретения, также может быть использована для донорской лимфоцитарной инфузии и т.п., с целью предотвращения инфекционного заболевания после трансплантации костного мозга или рентгеновского облучения и для ремиссии рецидивирующей лейкемии.
Далее, настоящее изобретение предоставляет Т-клеточная популяция, полученная с помощью способа для получения Т-клеточной популяции настоящего изобретения, упомянутого выше, в котором Тклеточная популяция экспрессирует СБ45ВА и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СБ62Ь, ССЯ7, СБ27 и СБ28. Кроме того, настоящее изобретение предоставляет медикамент (терапевтический агент), содержащий Т-клеточную популяцию в качестве эффективного ингредиента. Упомянутый выше терапевтический агент, содержащий Т-клеточную популяцию, адекватно используют в иммунотерапии. При иммунотерапии Т-клетки, подходящие для лечения пациента, вводят пациенту, например, внутривенно, внутриартериально, подкожно, внутрибрюшинной инъекцией или капельно. Терапевтический агент очень подходит для использования при упомянутых выше заболеваниях и для донорской лимфоцитарной инфузии. Терапевтический агент может быть приготовлен в виде капель или инфузии, например, смешиванием Т-клеточной популяции, полученной способом настоящего изобретения, в качестве эффективного ингредиента, с известным органическим или неорганическим носителем, подходящим для парентерального введения, вспомогательным средством, стабилизирующим агентом и т.п., по способу, известному в фармацевтической области. В данном случае количество Тклеточной популяции настоящего изобретения, содержащееся в терапевтическом агенте, доза терапевтического агента и состояния для терапевтического агента могут быть определены соответствующим образом в соответствии с известной иммунотерапией. Например, количество Т-клеточной популяции настоящего изобретения, содержащееся в медикаменте, особенно не ограничено и составляет предпочтительно от 1х 103 до 1х 1011 клеток/мл, более предпочтительно от 1х 104 до 1х1010 клеток/мл и наиболее предпочтительно от 1 х 105 до 1 х 109 клеток/мл. Доза медикамента настоящего изобретения также особенно не ограничена и, например, составляет предпочтительно от 1 х 106 до 1 х 1012 клеток/день, более предпочтительно от 1х 107 до 5х 1011 клеток/день и наиболее предпочтительно от 1х 108 до 2х 1011 клеток/день для взрослого в день.
Далее, иммунотерапия терапевтическим агентом может быть проведена в комбинации с известной фармакотерапией или радиотерапией при введении лекарства или при хирургическом лечении.
Способ получения Т-клеточной популяции настоящего изобретения далее может включать в себя стадию трансдукции чужеродного гена в Т-клетки. Другими словами, одно воплощение настоящего изобретения предоставляет способ получения Т-клеточной популяции, далее включающий в себя стадию трансдукции чужеродного гена в Т-клетки. Термин чужеродный ген обозначает ген, который искусственно вводят в Т-клетки, в которых ген должен быть трансдуцирован и также охватывает ген, полученный из некоторых видов, как вид, из которого происходят Т-клетки, в которые должен быть трансдуцирован ген.
Путем осуществления способа получения Т-клеток настоящего изобретения усиливают способность к пролиферации культивируемых клеток. При совмещении способа получения Т-клеток настоящего изобретения со стадией трансдукции гена ожидают увеличения эффективности трансдукции гена.
Средства для трансдукции чужеродного гена особенно не ограничены и подходящий способ для применения может быть выбран из известных способов трансдукции гена. Стадия трансдукции гена может быть проведена в любой заданной точке во время получения Т-клеточной популяции. Например, с точки зрения эффективности работы предпочтительно проводить данную стадию одновременно или в
- 11 016168 течение упомянутого выше получения Т-клеточной популяции либо после данной стадии.
В настоящем изобретении в качестве упомянутого выше способа трансдукции гена могут быть использованы любые способы с применением и без применения вирусного вектора. Детали данных способов опубликованы в многочисленных литературных источниках.
Упомянутый выше вирусный вектор не является особенно ограниченным, и применяют известный вирусный вектор, обычно используемый в способе трансдукции гена, например ретровирусный вектор, лентивирусный вектор, аденовирусный вектор, аденосвязанный вирусный вектор, обезьяний вирусный вектор, коровий вирусный вектор, Сендай вирусный вектор и т.п. Особенно предпочтительно в качестве вирусного вектора используют ретровирусный вектор, аденовирусный вектор, аденосвязанный вирусный вектор, лентивирусный вектор или обезьяний вирусный вектор. В качестве упомянутого выше вирусного вектора предпочтительными являются те вирусные векторы, которые не имеют репликационной активности так, чтобы вирусный вектор не мог самореплицироваться в инфицированной клетке. Кроме того, после генетической трансдукции также может быть применена субстанция, которая усиливает эффективность трансдукции гена, такая как Ретронектин (К.е!го№е!т) (зарегистрированная торговая марка, производимая ТАКАВА ΒΙΟ ΙΝΟ).
Ретровирусный вектор и лентивирусный вектор используют для генной терапии и т. п. потому, что они могут стабильно включать в свой состав чужеродный ген, вставляемый в то место ДНК хромосомы клетки, в которое должны трансдуцироваться векторы.
Поскольку векторы имеют высокую эффективность инфицирования клеток во время деления и пролиферации, то генетическую трансдукцию предпочтительно проводят на стадии получения в настоящем изобретении.
В качестве способа трансдукции гена без применения вирусного вектора в настоящем изобретении без ограничения может быть использован способ с применением носителя, такого как липосома или лиганд-полилизин, метод с применением фосфата кальция, метод электропорации, метод бомбардировки частицами и т.п. В данном случае трансдуцируют чужеродный ген, заключенный в плазмидную ДНК, линейную ДНК или РНК.
Чужеродный ген, который можно трансдуцировать в Т-клетки в настоящем изобретении, особенно не ограничен и может быть выбран любой ген, который хотят трансдуцировать в упомянутые выше клетки. В качестве гена, который описан выше, помимо гена, кодирующего белок (например, ферменты, цитокины, рецепторы и т.п.) может быть использован ген, кодирующий антисмысловую нуклеиновую кислоту, 81-РНК (малая интерферирующая РНК) или рибозим. Кроме того, одновременно может быть трансдуцирован подходящий маркерный ген, который делает возможной селекцию клеток, в которые трансдуцируется ген.
Упомянутый выше чужеродный ген может быть вставлен, например, в вектор, плазмиду и т. п. для его экспрессии под контролем подходящего промотора и использования. Кроме того, для достижения эффективной транскрипции гена в векторе могут присутствовать другие регуляторные элементы, которые объединены с промотором или с сайтом инициации транскрипции, например энхансерная последовательность или терминаторная последовательность. Кроме того, с целью вставки чужеродного гена в хромосому Т-клеток, в которой ген должен трансдуцироваться с помощью гомологичной рекомбинации, например, чужеродный ген может быть размещен между фланкирующими последовательностями, содержащими нуклеотидные последовательности, каждая из которых обладает гомологией к нуклеотидным последовательностям, расположенным на обеих сторонах сайта желаемой целевой вставки гена в хромосому.
Чужеродный ген, который трансдуцируют, может представлять собой ген, который имеет естественное происхождение или создан искусственно, или может быть геном, в котором молекулы ДНК, имеющие различное происхождение, соединены известными средствами, такими как сшивка. Кроме того, чужеродный ген может быть геном, имеющим последовательность, в которой мутацию вносят в природную последовательность в зависимости от ее назначения.
По способу настоящего изобретения, например, ген, кодирующий фермент, связанный с устойчивостью к лекарству, применяемому для лечения пациента от рака или т. п., может быть трансдуцирован в Тклетки, давая тем самым Т-клеткам устойчивость к лекарству. Если Т-клетки используют, как описано выше, то иммунотерапия и лекарственная терапия могут быть применены в комбинации и вследствие этого могут быть получены более сильные терапевтические эффекты. Примером гена лекарственной устойчивости является ген множественной лекарственной устойчивости.
С другой стороны, в противоположность упомянутому выше воплощению, в Т-клетки может быть трансдуцирован ген для получения чувствительности к определенному лекарству, придавая тем самым Т-клеткам чувствительность к лекарству. В данном случае Т-клетки после того, как их трансплантируют в живой организм, могут быть удалены введением лекарства. Ген для придания чувствительности к лекарству представляет собой, например, ген тимидинкиназы.
Другие гены, которые можно трансдуцировать, представлены, например, геном, кодирующим ТСВ, который распознает поверхностный антиген клеток-мишеней, и геном, кодирующим химерный рецептор, который имеет антиген-распознающий сайт антитела к поверхностному антигену клеток-мишеней и
- 12 016168 внутриклеточный регион ТСН (СЭ3 или подобный ему).
Настоящее изобретение также предоставляет способ лечения или предотвращения заболевания, включающий в себя стадию введения субъекту эффективного количества Т-клеточной популяции, полученной с помощью вышеупомянутого способа.
Термин субъект, использованный в настоящем документе, особенно не ограничен и предпочтительно относится к пациенту с описанным выше заболеванием, которому вводят Т-клеточную популяцию, полученную с помощью способа настоящего изобретения.
Кроме того, термин эффективное количество, использованный в настоящем документе, обозначает количество упомянутой выше Т-клеточной популяции, демонстрирующее терапевтический или профилактический эффект, в случае, когда Т-клеточную популяцию вводят упомянутому выше субъекту, по сравнению с субъектом, которому не вводили Т-клеточную популяцию. Конкретное эффективное количество назначают соответствующим образом в зависимости от его формы введения, способа введения, цели применения и возраста, веса, симптома и т.п. у субъекта, и оно не является постоянным. Тклеточная популяция предпочтительно может быть введена в таком же эффективном количестве, как упомянутый выше медикамент. Способ введения также является неограниченным. Например, Тклеточная популяция может быть введена капельно, с помощью инъекции или подобными способами, аналогичным образом как в случае упомянутого выше медикамента.
Кроме того, настоящее изобретение предоставляет применение упомянутой выше Т-клеточной популяции в производстве медикамента. Способ производства осуществляют таким же образом, как и для упомянутого выше медикамента. Кроме того, заболевания, при которых вводят медикамент, особенно не ограничены и являются такими же, как те заболевания, при которых вводят упомянутый выше медикамент.
Кроме того, настоящее изобретение позволяет получить активированную Т-клеточную популяцию путем стимулирования Т-клеточной популяции, полученной по способу настоящего изобретения, упомянутому выше, при котором Т-клеточная популяция экспрессирует СО45КА и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СО62Ь, ССН7, СЭ2 7 и СО28, по меньшей мере одним стимулирующим фактором, выбранным из группы, состоящей из клетки, способной презентировать антиген, клетки, имеющей презентированный антиген, антигена, лиганда СЭ3, лиганда СО28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин. Далее, настоящее изобретение предоставляет Т-клеточную популяцию, полученную с помощью упомянутого выше способа получения. Активированная Т-клеточная популяция, полученная, как описано выше, может быть использована в качестве эффективного ингредиента медикамента, как и в случае Т-клеточной популяции, полученной с помощью упомянутого выше способа получения. В настоящем документе термин стимулирование с помощью стимулирующего фактора не является особенно ограниченным при условии, что Т-клеточная популяция, полученная с помощью упомянутого выше способа настоящего изобретения, активируется стимулирующим фактором, и примером стимулирования является культивирование Т-клеточной популяции, полученной по способу настоящего изобретения, в присутствии стимулирующего фактора.
Клетка, способная презентировать антиген, как использовано в настоящем документе, не является особенно ограниченной при условии, что клетку обычно используют как антиген-презентирующую клетку, и она представлена, например, дендритной клеткой, у5Т-клеткой, моноцитом, В-клеткой, Т-клеткой, макрофагом, фибробластом, клеткой Лангерганса, клеточной популяцией, содержащей по меньшей мере одну клетку из упомянутых выше клеток, и особенно предпочтительно она представлена дендритной клеткой, у5Т-клеткой, Т-клеткой, В-клеткой, моноцитом, макрофагом, клеточной популяцией, содержащей по меньшей мере одну клетку из упомянутых выше клеток. Кроме того, происхождение клетки может быть аутологичным или неаутологичным для пациента, которому вводят клетку, и предпочтительно используют аутологичную клетку. В настоящем документе под клеткой, способной презентировать антиген, понимают клетку, которая способна презентировать антиген, но не презентирует антиген.
В качестве клетки, имеющей презентированный антиген, для целей настоящего документа может быть использована клетка, в которой подходящий антиген был искусственно добавлен к упомянутой выше клетке, способной презентировать антиген, или клетка, уже презентирующая антиген при ее заборе из живого организма. Клетка, имеющая презентированный антиген, также может быть получена таким же образом, как описано в разделе (5) примера 5, описанном далее, и использована. В настоящем документе фраза клетка, способная презентировать антиген не включена в значение фразы клетка, имеющая презентированный антиген.
Антиген, использованный в настоящем документе, не является особенно ограниченным при условии, что пептид презентуется на антиген-презентирующей клетке и распознается Т-клетками так, что Тклетки эффективно активируются. Примером антигена является пептид, гликопептид, экстракт опухолевых клеток, обработанный ультразвуком продукт опухолевой клетки и гидротермально обработанный продукт опухолевой клетки, вирус, бактерия, белок и т. п.
Кроме того, описанные выше лиганд СЭ3 и лиганд СО28 представляют собой конкретные примеры лиганда СЭ3 и лиганда СЭ28.
- 13 016168
В настоящем документе Т-клеточную популяцию, которая экспрессирует СЭ45РА и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СО62Ь, ССК.7, СЭ27 и ΟΌ28, полученная по способу настоящего изобретения, упомянутому выше, костимулируют анти-СО3-антителом и анти-СО28-антителом, как описано в примере 3 далее, в результате чего может быть получена активированная популяция лимфоцитов, способная продуцировать цитокин.
Цитокин, используемый в настоящем документе, не является особенно ограниченным при условии, что цитокин может действовать на Т-клетки и активировать Т-клетки. Например, цитокин представлен ^-2, ΣΕΝ-γ, ТСЕ-β, [И-15, ΣΕ-7, ЮТ-а, [0-12, СО40Ь, [И-27 и т.п. и особенно предпочтительно представлен ^-2, ΞΕΝ-γ и №12 с точки зрения усиления клеточного иммунитета.
Хемокин, используемый в настоящем документе, не является особенно ограниченным при условии, что хемокин действует на Т-клетки и демонстрирует миграционную активность. Например, хемокин представлен ΚΑΝΊΈ8, ССБ21, М!Р1 а, МЫ1 β, ССБ19, СХСБ12, ΈΡ-10 и МЮ.
Клетка, способная продуцировать цитокин, используемая в настоящем документе, не является особенно ограниченной при условии, что клетка способна продуцировать упомянутый выше цитокин. Например, предпочтительно используют клетку ТЫ с точки зрения усиления клеточного иммунитета.
Кроме того, Т-клеточная популяция, полученная по способу настоящего изобретения, упомянутому выше, содержит высокий процент интактных Т-подобных клеток, которые являются не дифференцированными и не стимулированными антигеном. Поэтому в качестве стимулирующего фактора, использованного в настоящем документе, особенно предпочтительно использовать клетку, способную презентировать антиген, клетку, имеющую презентированный антиген и/или антиген. Например, как показано в разделе (5) примера 5, в разделе (8) примера 6, в разделе (2) примера 7, в разделе (1) примера 8, в разделе (7) примера 14 и в разделе (2) примера 15, описанных далее, антигенную стимуляцию предоставляют Тклеточной популяции, полученной по способу настоящего изобретения, упомянутому выше, при помощи которого могут быть индуцированы полезные антигенспецифические СТЬ, имеющие очень высокую цитотоксическую активность и высокую способность распознавать антиген. Кроме того, культивирование может быть проведено в присутствии упомянутого выше фибронектина, его фрагмента или их смеси и известного компонента, который используют в культуре Т-клеток в дополнение к упомянутому выше стимулирующему фактору. Т-клеточная популяция, полученная, как описано выше, является очень полезной Т-клеточной популяцией, имеющей сильные терапевтические эффекты.
Настоящее изобретение также предоставляет способ лечения или предотвращения заболевания, включающий в себя стадию введения субъекту эффективного количества Т-клеточной популяции, полученной по упомянутому выше способу. Кроме того, настоящее изобретение также предоставляет применение упомянутой выше Т-клеточной популяции в производстве медикамента. Способ для производства медикамента осуществляют таким же образом, как и способ для производства упомянутого выше медикамента. Кроме того, заболевания, при которых вводят медикамент, особенно не ограничены и являются такими же, как заболевания, при которых вводят упомянутый выше медикамент.
Далее настоящее изобретение предоставляет медикамент, содержащий:
(a) препарат, включающий в себя в качестве эффективного ингредиента Т-клеточную популяцию, полученную по способу настоящего изобретения, упомянутому выше, в котором Т-клеточная популяция экспрессирует СЭ45РА и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из 0621., ССК7, 027 и СО28; и (b) препарат, включающий в себя в качестве эффективного ингредиента по меньшей мере один стимулирующий фактор, выбранный из группы, состоящей из клетки, способной презентовать антиген, клетки, имеющей презентированный антиген, антигена, лиганда СЭ3, лиганда СЭ28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин, в которых препараты включают в медикамент в виде двух отдельных препаратов, вводимых совместно или отдельно.
Как упоминалось ранее, Т-клеточная популяция, полученная по способу настоящего изобретения, содержит высокий процент интактных Т-подобных клеток. Поэтому упомянутые выше стимулирующие факторы вводят совместно или отдельно с Т-клеточной популяцией пациента, в результате чего эффекты вводимой Т-клеточной популяции могут максимально проявиться и могут быть показаны более высокие терапевтические эффекты при заболеваниях. В качестве стимулирующего фактора предпочтительным является фактор, который может обеспечить антигенную стимуляцию, другими словами, фактор, который может быть использован как вакцина, например по меньшей мере один фактор, выбранный из группы, состоящей из клетки, способной презентовать антиген, клетки, имеющей презентированный антиген, антигена, лиганда СЭЛ, лиганда СЭ28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин, и наиболее предпочтительно в настоящем изобретении используют клетку, способную презентовать антиген, клетку, имеющую презентированный антиген и антиген.
Может быть приготовлен и организован в препарат (а) препарат, содержащий в качестве эффективного ингредиента Т-клеточную популяцию, полученную по упомянутому выше способу настоящего изобретения, при котором Т-клеточная популяция экспрессирует СЭ45РА и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СО62Ь, ССК.7, СЭ27 и СЭ28, в медикаменте, таким же
- 14 016168 образом, как в случае медикамента, содержащего Т-клеточную популяцию в качестве эффективного ингредиента, как упоминалось выше. Кроме того, содержимое в медикаменте, доза и форма введения Тклеточной популяции, которая экспрессирует СО45КА и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СО62Ь, ССК.7, СЭ27 и СЭ28, не является особенно ограниченным и может быть, например, таким же, как для медикамента, содержащего Т-клеточную популяцию, полученную по упомянутому выше способу настоящего изобретения.
Кроме того, в виде (Ь) может быть использован препарат, содержащий в качестве эффективного ингредиента по меньшей мере один стимулирующий фактор, выбранный из группы, состоящей из клетки, способной презентировать антиген, клетки, имеющей презентированный антиген, антигена, лиганда СЭ3, лиганда СЭ28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин, в медикаменте, например препарат, сформированный совмещением стимулирующего фактора с подходящим носителем. Кроме того, в качестве конкретных примеров по меньшей мере одного стимулирующего фактора, выбранного из группы, состоящей из клетки, способной презентировать антиген, клетки, имеющей презентированный антиген, антигена, лиганда СЭ3, лиганда СЭ28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин, могут быть использованы стимулирующие факторы, приведенные в примерах выше.
Например, если клетку, способную презентировать антиген, клетку, имеющую презентированный антиген, антиген, лиганд СЭ3, лиганд СЭ28, цитокин, хемокин или клетку, способную продуцировать цитокин, используют в качестве стимулирующего фактора, то препарат может быть сформирован объединением стимулирующего фактора с подходящим фармацевтическим носителем для капельного введения или инъекции без особого ограничения. Кроме того, если используют антигенный пептид, то антигенный пептид может быть объединен с подходящим адъювантом без особого ограничения. Если используют цитокин или хемокин, то препарат может быть сформирован включением цитокина или хемокина в липосому известным способом. Кроме того, состав стимулирующего фактора в препарате может быть выбран соответствующим образом в зависимости от вида используемого стимулирующего фактора, и он не является особенно ограниченным. Например, если в качестве стимулирующего фактора используют клетку, способную презентировать антиген, клетку, имеющую презентированный антиген, антиген, лиганд СЭ3, лиганд СЭ28, цитокин, хемокин или клетку, способную продуцировать цитокин, то состав представлен, например, предпочтительно от 1х103 до 1х109 клеток/мл, более предпочтительно от 1х103 до 1 х 108 клеток/мл, наиболее предпочтительно от 1х104 до 1 х 107 клеток/мл. Кроме того, форма введения стимулирующего фактора может быть выбрана подходящим образом в зависимости от вида используемого стимулирующего фактора и она не является особенно ограниченной. Например, стимулирующий фактор вводят внутривенно, внутриартериально, подкожно, внутрибрюшинно, перорально и т. п. Доза не является особенно ограниченной при условии, что доза является эффективной для лечения или улучшения состояния при заболевании. Например, если вводят клетку, способную презентировать антиген, то доза составляет, например, от 1х 103 до 1х 1011 клеток/мл, более предпочтительно от 1х 103 до 1х 1010 клеток/мл, наиболее предпочтительно от 1х 104 до 1х 109 клеток/мл. Если вводят антигенный пептид, то доза составляет, например, предпочтительно от 0,001 до 100 мг/день, более предпочтительно от 0,003 до 30 мг/день и особенно предпочтительно от 0,01 до 10 мг/день.
В данном случае, в качестве предпочтительного примера введения препарата (Ь) предпочтительно совместить клетку, способную презентировать антиген, с антигеном для создания препарата (Ь) и введения. Например, предпочтительно дендритную клетку совмещают с антигенным пептидом и вводят. В данном случае состав и доза клетки, способной презентировать антиген, и антигена в препарате могут быть осуществлены, как упоминалось ранее.
Кроме того, введение препарата (а) и препарата (Ь) в медикаменте представляет собой совместное или раздельное введение их пациенту. В настоящем документе термин совместно означает, что препараты вводят пациенту в виде отдельных препаратов совместно с точки зрения времени или препарат (а) и препарат (Ь) смешивают перед введением пациенту и затем вводят. Например, в случае, если препарат (а) и препарат (Ь) вводят капельно, то настоящее изобретение охватывает воплощение, в котором указанные выше препараты смешивают перед введением пациенту. Кроме того, термин раздельно означает, что препарат (а) и препарат (Ь) вводят раздельно с точки зрения времени. Интервалы между введением препарата (а) и препарата (Ь) особенно не ограничены при условии, что симулирование стимулирующего фактора, содержащегося в препарате (Ь), предоставляется Т-клеточной популяции, содержащейся в препарате (а), в организме пациента. Предпочтительно препарат (Ь) вводят после введения препарата (а). Кроме того, количество введений особенно не ограничено, и каждый препарат может быть введен однократно или несколько раз отдельными частями.
Кроме того, настоящее изобретение также предоставляет способ лечения заболевания, включающий в себя стадии (а) введения пациенту Т-клеточной популяции, полученной по упомянутому выше способу настоящего изобретения, при котором Т-клеточная популяция экспрессирует СО45КА и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СО62Е ССК7, СЭ27 и СЭ28, и (Ь) введения пациенту по меньшей мере одного стимулирующего фактора, выбранного из группы, состоя
- 15 016168 щей из клетки, способной презентовать антиген, клетки, имеющей презентированный антиген, антигена, лиганда СЭ3. лиганда СЭ28. цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин.
Как упоминалось ранее, способ лечения может показать очень сильные терапевтические эффекты. В настоящем документе в качестве стимулирующего фактора предпочтительным является фактор, который может обеспечить антигенную стимуляцию, другими словами, фактор, который может быть использован как вакцина, например по меньшей мере один фактор, выбранный из группы, состоящей из клетки, способной презентовать антиген, клетки, имеющей презентированный антиген, антигена, лиганда СО3, лиганда СО28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин, и наиболее предпочтительно в настоящем изобретении используют клетку, способную презентовать антиген, клетку, имеющую презентированный антиген или антиген.
В способе лечения стадия (а) введения пациенту Т-клеточной популяции, полученной по способу настоящего изобретения, не является особенно ограниченной и, например, осуществляется с использованием дозы и формы введения, которые подобны дозе и форме введения в способе введения упомянутого выше медикамента. Кроме того, стадия (Ь) введения пациенту по меньшей мере одного стимулирующего фактора, выбранного из группы, состоящей из клетки, способной презентовать антиген, клетки, имеющей презентированный антиген, антигена, лиганда СО3, лиганда СО28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин, также не является особенно ограниченной и, например, может быть осуществлена с использованием дозы и формы введения, которые подобны дозе и форме введения для упомянутого выше медикамента.
Кроме того, интервалы между введениями упомянутых выше стадий (а) и (Ь) могут быть осуществлены таким же образом, как в случае упомянутого выше медикамента, содержащего препарат (а) и препарат (Ь), другими словами, интервалы особенно не ограничены при условии, что симулирование стимулирующего фактора, введенного на стадии (Ь), добавляют к Т-клеточной популяции, введенной на стадии (а) в организм пациента, и стадии могут быть выполнены совместно или раздельно. Предпочтительно введение стадии (Ь) выполняют после введения стадии (а). Количество введений особенно не ограничено, и каждый препарат может быть введен однократно или несколько раз отдельными частями.
Примеры
Далее настоящее изобретение будет более подробно описано с помощью примеров, но без намерения ограничить рамки настоящего изобретения.
Пример 1. Анализ СО45ЯЛ'СЭ62Ь' Т-клеток.
(1) Выделение и хранение РВМС.
Кровь была получена от здорового донора при его информированном согласии. Собранный образец крови разводили в 2 раза фосфатно-буферным солевым раствором (обозначаемым далее как РВ8), наслаивали на фиколл-пак (производства Ашегайаш Вюкшепсе) и центрифугировали при 600хд в течение 20 мин. Мононуклеарные клетки периферической крови (обозначаемые далее как РВМС) в среднем слое собирали пипеткой и отмывали. Собранные РВМС суспендировали в растворе для хранения из 90% ЕВ8 (производство СатЬгех Согрогайоп)/10% ΌΜ8Θ (производство 8ЮМА) или в растворе для хранения из равных объемов СР-1 (производство КУОКИТО РНАКМАСЕиТ1САЬ 1ХЭС8ТН1АР СО., ЬТЭ.), содержащего 8% человеческого сывороточного альбумина (производство Вах1ег Ытйеб, обозначаемый далее как Н8А), и среды РРМ1 1640 (производство 8ЮМА) и хранили в жидком азоте. Во время размножения Т-клеток указанные хранящиеся РВМС быстро размораживали на водяной бане при 37°С и отмывали средой РРМ1 1640, содержащей 10 мкл/мл ДНКазы (производство Са1Ьюсйет). Затем подсчитывали число живых клеток с помощью метода окраски с трипановым синим. Затем клетки использовали в эксперименте.
(2) Иммобилизация античеловеческого СЭЗ-антитела и фрагмента СН-296.
Античеловеческое СОЗ-антитело и фрагмент СН-296 иммобилизовали на культуральном оборудовании, использованном в следующем эксперименте. Подробно, 1,9 мл РВ8, содержащего античеловеческое СОЗ-антитело (производство ΙΛΝ88ΕΝ РНАКМАСЕиТ1САЬ К.К.) (конечная концентрация 5 мкг/мл), добавляли в 12-луночный культуральный планшет (производство Вес1оп Оюкиъоп). Затем добавляли СН-296 до конечной концентрации 25 мкг/мл.
Затем данные культуральные устройства инкубировали при комнатной температуре в течение 5 ч и затем хранили при 4°С до использования. Непосредственно перед использованием РВ8, содержащего антитело, и СН-296 удаляли аспирацией из указанных культуральных устройств и каждую лунку дважды отмывали РВ8 и затем однократно средой РРМ1 1640 и использовали культуральные устройства в эксперименте.
(3) Размножение Т-клеточной популяции.
РВМС, которые получали в разделе (1) примера 1, суспендировали в А1М-У (производство 1пуйгодеп), содержащем 1% человеческой АВ сыворотки (производство СатЬгех) (обозначаемый далее как 1% А1М-У), с тем, чтобы получить клеточную суспензию с концентрацией 1 х 106 клеток/мл. Затем 1% А1МV добавляли в планшет с иммобилизованным античеловеческим СО3-антителом или в планшет с иммобилизованным античеловеческим СО3-антителом и СН-296, приготовленными в разделе (2) примера 1, в
- 16 016168 объеме 2 мл/лунку, и добавляли упомянутую выше клеточную суспензию в объеме 1 мл/лунку. Добавляли 1Ь-2 (ΡΚΌΕΕυΚΙΝ, производство СЫгоп) до конечной концентрации 1000 ед/мл и культивировали планшеты при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). На четвертый день культивирования или позже проводили пассирование культуры с помощью 1% А1М-У на чистый, пустой 12,5-см2 матрас для культивирования клеток (производство Вес1оп Оюкепкоп), и добавляли 1Ь-2 до конечной концентрации 500 ед/мл (объем культуральной среды равен 6 мл). Подробно пассирование культуры проводили при плотности 0,05х106 клеток/мл на четвертый день от начала культивирования при плотности 0,1х106 клеток/мл на седьмой день и при плотности 0,15х106 клеток/мл на десятый день. На седьмой, десятый и четырнадцатый дни от начала культивирования подсчитывали число живых клеток с помощью метода окраски трипановым синим и вычисляли кратность размножения путем сравнения с количеством клеток в начале культивирования. Результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1
| Кратность размножения (разы) | |||
| 7-й день культивирования | 10-Й день культивирования | 14-й день культивирования | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | х 14 | х 257 | х2491 |
| СН-296 | х 38 | х 315 | х 4387 |
Как показано в табл. 1, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизацией СН-296 на ранней стадии Т-клеточного размножения, кратность размножения Т-клеточной популяции была выше на любой стадии культивирования по сравнению с контрольной группой.
(4) Анализ СО45ВА+СО62Ь+ Т-клеток в каждый день культивирования.
Клетки, полученные в каждый день культивирования в разделе (3) примера 1, отмывали РВ8 и затем РВ8, содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина (производство 8ЮМА, далее обозначаемого как В8А) (далее обозначаемого как 1% В8А/РВ8). Клетки суспендировали в 1% В8А/РВ8 и в качестве отрицательного контроля добавляли Р1ТС-меченный мышиный Ι§Ο1/ΚΌ1 -меченный мышиный 1дС1/РС5-меченный мышиный 1дС1 (производство Весктапп Сои11ег). Аналогичным образом добавляют Р1ТС-меченное мышиное античеловеческое СО62Ь антитело (производство 8ЮМА)/КО1 -меченное мышиное античеловеческое СО45КА антитело (производство Весктапп Сои11ег). После добавления каждого антитела клетки инкубировали на льду в течение 30 мин. После инкубации клетки отмывали 1% В8А/РВ8 и затем ресуспендировали в РВ8. Проводили проточную цитометрию клеток (Су1отк8 РС500, производство Весктапп Соикег) и рассчитывали процент ί.Ό45ΡΛ'0’0626 Т-клеток. Результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2
| Процент СП45КА* СЭ62Ь* Т-клеток (%) | |||
| 7-й день культивирования | 10-й день культивирования | 14-й день культивирования | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | 29,1 | 39,8 | 37,5 |
| СН-296 | 48,9 | 73,8 | 51,3 |
Как показано в табл. 2, в группе, где применяли культуральное оборудование с иммобилизацией СН-296 фрагмента, при культивировании получили большую СО45КА+СО62Ь+ Т-клеточную популяцию в Т-клетках по сравнению с контрольной группой на седьмой, десятый и четырнадцатый дни культивирования. Из данных результатов понятно, что количество Т-клеток может быть увеличено с одновременным увеличением процентного количества СО45КА+СО62Ь+ Т-клеток в Т-клеточной популяции с 7 по 14 дни размножения в присутствии СН-296 фрагмента на ранней стадии размножения.
Пример 2. Анализ СО45КА+ССК7+ Т-клеток.
(1) Размножение Т-клеточной популяции.
РВМС, которые получали в разделе (1) примера 1, суспендировали в А1М-У, содержащем 3% человеческого сывороточного АВ (обозначаемого далее как 3% А1М-У), чтобы получить клеточную суспензию с плотностью 1х106 клеток/мл. Затем 3% А1М-У добавляли в планшет с иммобилизованным античеловеческим СО3-антителом или в планшет с иммобилизованным античеловеческим СО3-антителом и СН-296, приготовленном в разделе (2) примера 1, в объеме 2 мл/лунку, и затем добавляли упомянутую выше клеточную суспензию в объеме 1 мл/лунку. Добавляли 1Ь-2 до конечной концентрации 1000 ед/мл и культивировали планшеты при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). На четвертый день культивирования каждую группу разводили в А1М-У, содержащем 1% человеческого сывороточного АВ, до плотности 0,075х106 клеток/мл (объем 6 мл), разведение переносили на чистый, пустой 12,5-см2 матрас для культивирования клеток и добавляли 1Ь-2 до конечной концентрации 500 ед/мл. Концентрацию сыворотки устанавливали из расчета, что РВМС, полученные из 30 мл образца крови, культивировали в
- 17 016168 л культуральной среды. Продолжали культивирование и на седьмой день каждую группу переносили на чистый, пустой 25-см2 матрас для культивирования клеток (производство Вес1оп Иккепкоп), используя культуральную среду (объем 12,6 мл), полученную разведением с ΑΙΜ-ν, содержащим 0,05% человеческого сывороточного АВ, для получения плотности 0,25х106 клеток/мл. К каждой группе добавляли 1Ь-2 до получения конечной концентрации 500 ед/мл. На одиннадцатый день каждую группу переносили на чистый, пустой 25-см2 матрас для культивирования клеток, используя культуральную среду, полученную разведением с ΑΙΜ-ν, содержащим человеческий сывороточный АВ, в такой же концентрации, как и на седьмой день, для получения плотности 1,04х106 клеток/мл (объем 12,6 мл). К каждой группе добавляли 1Ь-2 до получения конечной концентрации 500 ед/мл. На четырнадцатый день от начала культивирования подсчитывали число живых клеток с помощью метода окраски трипановым синим и вычисляли кратность размножения путем сравнения количества подсчитанных клеток с количеством клеток в начале культивирования. Результаты представлены в табл. З.
Таблица З
| Концентрация сыворотки(%) | Дни культивирования | Кратность размножения (разы) | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | 3^1— 0,05 | 14 дней | х 276 |
| СН-296 | 3 -> 1 -> 0,05 | 14 дней | хб88 |
Как показано в табл. З, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизацией СН-296 на ранней стадии Т-клеточного размножения, кратность размножения Т-клеточной популяции была выше на любой стадии культивирования по сравнению с контрольной группой. Ясно показано, что использование СН-296 фрагмента при размножении Т-клеток соответствует требованиям и в данном примере ясно показано, что СН-296 фрагмент также целесообразно использовать во время 14-дневного размножения Т-клеток.
(2) Анализ СО45КА'ССК7' Т-клеток в субпопуляциях СЭ48' Т-клеток и СЭ48- Т-клеток.
Клетки, полученные в разделе (1) примера 2, отмывали РВ8 и затем 1% В8А/РВ8. Клетки суспендировали в РВ8, содержащем 1% В8А, и затем добавляли в качестве отрицательного контроля Е1ТСмеченный мышиный 1дС1/КО 1-меченный мышиный 1дС1/РС5-меченный мышиный 1дС 1 + ЕСИмеченный мышиный 1дС1 (производство Весктапп Сои1!ег). Подобным образом КО1-меченное мышиное античеловеческое антитело СО45КА/Е1ТС-меченное мышиное античеловеческое антитело ССК7 (производство Κ&Ώ 8у51ет5)/ЕСО-меченное мышиное античеловеческое СО8 антитело (производство Весктапп Сои11ег). После того как добавляли каждое антитело, клетки инкубировали на льду в течение З0 мин. Во время инкубации инкубационную смесь осторожно перемешивали каждые 10 мин. После инкубации клетки отмывали 1% В8А/РВ8 и ресуспендировали в РВ8. Проводили проточную цитометрию и группировали клетки по СО8+ Т-клеточному региону и СО8- Т-клеточному региону с помощью их способности окрашиваться (йатаЬПку) СО8. Для каждой клеточной популяции рассчитывали процентное содержание СО45КА'ССК7' Т-клеток. Результаты представлены в табл. 4 и 5.
Таблица 4
Таблица 5
| СО8 Т-клетки (С64* Т-клетки) | СО45Ю\'ССК7‘ Т-клетки (%) |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | 9,7 |
| СН-296 | 35,0 |
Как показано в табл. 4, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизацией СН-296, получили более высокие результаты СО45КА'ССК7' Т-клеточной популяции в Т-клетках при культивировании по сравнению с контрольной группой. Данный феномен наблюдали также в случае, когда анализировали СО8- Т-клетки, т.е. клеточную популяцию, в которой преобладали СЭ4' Т-клетки (табл. 5). Из результатов ясно видно, что Т-клеточная популяция может быть увеличена с одновременным увеличением процентного содержания СО45КА'ССК7' Т-клеточной популяции Т-клеток при культивировании в присутствии СН-296 фрагмента на ранней стадии 14-дневного размножения.
Пример З. Анализ цитокинпродуцирующей способности СО45КА'ССК7' Т-клеток и СИ45КА ССК7- Т-клеток в Т-клеточной популяции, увеличенной с помощью СН-296.
(1) Размножение Т-клеточной популяции.
РВМС, которые получали в разделе (1) примера 1, суспендировали в 6Т-Т50З (производство ТАКАКА В1О, ШС.), содержащем 0,5% человеческого сывороточного АВ и 0,2% Н8А (обозначаемый далее как 0,5% СТ-Т50З), для получения клеточной суспензии с плотностью 0,25х106 клеток/мл. Затем 0,5% СТ-Т50З добавляли к планшету с иммобилизованным античеловеческим СИЗ-антителом или планшету с
- 18 016168 иммобилизованным античеловеческим СБ3-антителом и СН-296, приготовленным в разделе (2) примера 1, в объеме 0,5 мл/лунку и затем добавляли указанную выше суспензию в объеме 1 мл/лунку. Затем добавляли 1Ь-2 до получения конечной концентрации 1000 ед/мл и культивировали планшеты при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). На четвертый день от начала культивирования культуральную среду каждой группы разводили примерно в 8 раз 0,5% СТ-Т503 и 6 мл разведения переносили на чистый пустой 12,5-см2 матрас для культивирования клеток и затем добавляли 1Ь-2 до получения конечной концентрации 500 ед/мл. Продолжали культивирование и на седьмой день среду клеточной культуры из каждой группы разводили примерно в 4,2 раза 0,5% СТ-Т503 и 12,6 мл разведения переносили на чистый пустой 25-см2 матрас для культивирования клеток. К каждой группе добавляли 1Ь-2 до получения конечной концентрации 500 ед/мл. На десятый день среду клеточной культуры из каждой группы разводили примерно в 2 раза 0,5% 6Т-Т503, содержащим 0,2% Н8А, и 12,6 мл разведения переносили на чистый пустой 25-см2 матрас для культивирования клеток. К каждой группе добавляли 1Ь-2 до получения конечной концентрации 500 ед/мл. На четырнадцатый день от начала культивирования подсчитывали число живых клеток с помощью метода окраски трипановым синим и вычисляли кратность размножения путем сравнения количества подсчитанных клеток с количеством клеток в начале культивирования. Результаты представлены в табл. 6.
Таблица 6
| Кратность увеличения (разы) | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | х 172 |
| СН-296 | х 581 |
Как показано в табл. 6, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизацией СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции (обозначаемой далее как СН-296 группа), кратность увеличения Т-клеточной популяции была выше по сравнению с контрольной группой.
(2) Анализ СБ45КА+ССК7+ Т-клеток.
Клетки, полученные в разделе (1) примера 3, окрашивали с каждым антителом и анализировали аналогичным образом, как в разделе (4) примера 1, при условии, что комбинации антител были такими, как указано далее.
Подробно, окрашивание проводили с Р1ТС-меченным мышиным 1дС1/КБ 1-меченным мышиным 1дС1/РС5-меченным мышиным 1дС1 и с КО1-меченным мышиным античеловеческим СБ45КА антителом/Р1ТС-меченным мышиным античеловеческим ССК7 антителом. Данные окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре и подсчитывали процентное количество СБ45КА+ССК7+ Т-клеток. Результаты представлены в табл. 7.
Таблица 7
| СО45КА+ССК7+ Т-клетки (%) | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | 21,2 |
| СН-296 | 63,7 |
Как показано в табл. 7, в группе СН-296 получили более высокие результаты СБ45КА+ССК7+ Тклеточной популяции в Т-клетках при культивировании по сравнению с контрольной группой.
(3) Выделение СБ45КА+ССК7+ Т-клеток и СБ45КА-ССК7- Т-клеток после размножения Тклеточной популяции.
Клетки, полученные в разделе (1) примера 3, окрашивали аналогичным образом, как в разделе (2) примера 2, и затем клетки отмывали 1% В8А/РВ8 и суспендировали в среде СТ-Т503. Проводили сортинг СБ8+ Т-клеток с помощью ΜοΡΙο (производство БАКО ΟΕΝΜΑΚΚ А/8) на СБ45КА+ССК7+ Тклетки и СБ45КА-ССК7- Т-клетки и аналогично проводили сортинг СБ8--Т-клеток, большинство которых являлось СБ4+ Т-клетками, на СБ45КА+ССК7+ Т-клетки и СБ45КА-ССК7- Т-клетки. Кроме того, окрашенные клетки перед сортингом подвергали проточной цитометрии и группировали их по СБ8+ Тклеточному региону и СБ8--Т-клеточному региону согласно их способности окрашиваться СБ8. Подсчитывали процентное количество СБ45КА+ССК7+ Т-клеток для клеточной популяции. Результаты представлены в табл. 8 и 9.
- 19 016168
Таблица 8 €ϋο1 Т-клетки
| СО45КА+ССК7+ Т-клетки (%) | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | 15,9 |
| СН-296 | 52,6 |
Таблица 9
Οϋ8 Т-клетки (СО4~ Т-клетки)
| СО45КА+ССК7+ Т-клетки (%) | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | 5,4 |
| СН-296 | 34,0 |
Как показано в табл. 8 относительно СИ8' Т-клеток, в группе СН-296 получили в результате более высокое процентное содержание СИ45КА+ССК7+ Т-клеточной популяции в Т-клетках после культивирования по сравнению с контрольной группой. Данный феномен наблюдали также в случае, когда анализировали СИ8--Т-клетки, т.е. клеточную популяцию, в которой преобладали СЭ4'-Т-клетки (табл. 9).
(4) Иммобилизация античеловеческого СИ3-антитела и античеловеческого СИ28-антитела.
Античеловеческое СИ3-антитело и античеловеческое СИ28-антитело иммобилизовали на культуральном оборудовании, использованном в следующем эксперименте.
Подробно, в 96-луночный планшет для культивирования клеток (производство Вески Иккшкоп) добавляли по 80 мкл ацетатного буфера (рН 5,3), содержащего античеловеческое СИ3-антитело (2 мкг/мл). Далее добавляли по 80 мкл ацетатного буфера, содержащего античеловеческое СИ28-антитело (производство ИАК0 ^ΕNΜАΚΚ А/8) (20 мкг/мл). Античеловеческое СИ3-антитело добавляли до получения конечной концентрации 1 мкг/мл и античеловеческое СИ28-антитело добавляли до получения конечной концентрации 10 мкг/мл. После этого культуральное оборудование культивировали при комнатной температуре в течение 5 ч и затем хранили при 4°С до использования. Непосредственно перед использованием ацетатный буфер, содержащий антитело, удаляли аспирацией из указанного культурального оборудования и каждую лунку дважды промывали ΡΒ8 и однократно средой СТ-Т503 и использовали культуральное оборудование в эксперименте.
(5) Стимуляция клеток.
Известно, что интактные Т-клетки и центральные Т-клетки памяти продуцируют ΙΕ-2 в большом количестве после стимуляции антигеном в организме. Кроме того, эффекторные Т-клетки памяти продуцируют ЮТ-у или ΙΕ-4 в большом количестве после стимуляции антигеном. Чтобы подтвердить, что каждая из клеточных фракций, полученных в разделе (3) примера 3, сохраняет свои функции, определяли их цитокинпродуцирующую способность после стимуляции анти-СИ3-антителом и анти-СИ28антителом. Собирали каждую клеточную популяцию, полученную в разделе (3) примера 3, затем клетки суспендировали в 0,5% СТ-Т503 и подсчитывали число клеток. Клетки добавляли в каждую лунку планшета с иммобилизованным античеловеческим СИ3-антителом и античеловеческим СИ28-антителом, приготовленными в разделе (4) примера 3, так чтобы их плотность составляла 2х105 клеток/0,2 мл, и культивировали клетки при 37°С в 5% С02. Через 24 ч собирали супернатант культуры и использовали в эксперименте для определения цитокина методом ЕЫ8А.
(6) Определение цитокиновой продукции методом ЕЫ8А.
Как показано в разделе (3) примера 3 в группе СН-296 были получены результаты с более высоким процентным содержанием СИ45КА+ССК7+ Т-клеток по сравнению с контрольной группой. Чтобы подтвердить, что данная СИ45КА+ССК7+ Т-клеточная популяция сохраняет свои свойства в виде интактных Т-подобных клеток, оценивали цитокинпродуцирующую способность СИ45КА+ССК7+ Т-клеток и СИ45КА-ССК7- Т-клеток, изолированных после размножения Т-клеточной популяции. Продукцию ΙΕ-2 или ЮТ-у определяли с помощью набора ЕЫ8А Эеуе1ортеп1 Κίΐ (производство К&И 8уЧет5) и продукцию Ш-4 определяли с помощью набора РЕА0У-8ЕТ-С0! Нитап !п1ег1еик1п-4 (производство ВюксЕ епсе). Результаты продукции каждого цитокина в контрольной группе и в группе СН-206 показаны в табл. 10 и 11 соответственно.
Таблица 10
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | ΙΕ-2 пг/мл | ΙΚΝ-γ пг/мл | 1Ь-4 пг/мл | |
| СВЯ'-Т-клегки | СП45Р.АССК7* Т-клетки | 286,7 | 568,0 | 30,5 |
| СО45КА'ССВ.7' Т-клетки | 104,9 | 1229,0 | 430,8 | |
| СШ'-Т-клетки | СО45ЕА*€СК7+ Т-клетки | 1539,4 | 107,9 | 113,9 |
| СО45КАССК7' Т-клетки | 877,0 | 1200,0 | 1004,0 |
- 20 016168
Таблица 11
| Иммобилизация СН-296 | ТЬ-2 пг/мл | ΙΡΝ-γ пг/мл | 1Ь-4 пг/мл | |
| СВ 8-Г-к летки | СЦ15РАССК7’ Т-клетки | 174,4 | 251,3 | <0 |
| СО45Е<А’ССКТ Т-клетки | 44,9 | 526,3 | 58,1 | |
| СО8Г-клетки | СП45КА+ССЕ7+ Т-клетки | 1958.,2 | 1443 | 20,3 |
| СП45КАССК7' Т-клетки | 611,0 | 587,5 | 7273 |
Как показано в табл. 10 и 11, продукция ΙΤ-2 была подтверждена в контрольной группе и в группе СН-296. В обеих группах СЭ8--Т-клетки имели большую продукцию цитокинов, чем СЭ8'Т-клетки и СО45КА'ССК7' Т-клетки имели большую продукцию, чем СО45КА-ССК7- Т-клетки. Показано, что СО45КА'ССК7' Т-клеточная популяция, полученная размножением Т-клеточной популяции, обладает свойствами интактных Т-подобных клеток. С другой стороны, ΙΡΝ-γ и ΙΤ-4 в основном продуцировались СО45КА-ССК7- Т-клетками в контрольной группе и в группе СН-296, что предполагает, что СЭ45КА ССК7- Т-клеточная популяция представляет собой популяцию, в которой поддерживается эффекторная функция памяти.
Пример 4. Анализ хемотаксиса Т-клеточной популяции, выращенной с использованием СН-296.
(1) Иммобилизация античеловеческого СИ3-антитела и фрагмента СН-296.
Иммобилизацию проводили аналогичным образом, как в разделе (2) примера 1, за исключением того, что РВ8, содержащий античеловеческое СИ3-антитело (конечная концентрация 5 мкг/мл) добавляли в объеме 0,45 мл.
(2) Размножение Т-клеточной популяции.
Проводили аналогичные процедуры, как в разделе (1) примера 3, за исключением того, что на четвертый день культивирования культуральную среду разводили примерно в 14 раз и 10 мл разведения добавляли в чистый 25-см2 матрас для культивирования клеток (производство Согшпд), так что на восьмой день от начала культивирования культуральную среду разводили примерно в 2 раза и 10 мл разведения добавляли в чистый 25-см2 матрас для культивирования клеток (производство Согшпд), так что на одиннадцатый день от начала культивирования 10 мл среды СТ-Т503, содержащей 0,2% НА8, добавляли к каждому из матрасов. Результаты кратности увеличения показаны в табл. 12.
Таблица 12
| Кратность увеличения (разы) | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | х414 |
| СН-296 | х 646 |
Как показано в табл. 12, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизацией СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции (обозначаемой далее как СН-296 группа), кратность увеличения Т-клеточной популяции была выше по сравнению с контрольной группой.
(2) Анализ СИ45КА+ССК7+ Т-клеток.
Процентное содержание СО45КА'ССК7' Т-клеток для клеток, полученных в разделе (2) примера 4, рассчитывали таким же образом, как в раздела (2) примера 3. Результаты представлены в табл. 13.
Таблица 13
| С045КА+ ССВ.7' Т-клетки (%) | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | 31,5 |
| СН-296 | 56,8 |
Как показано в табл. 13, в группе СН-296 были получены результаты более высокого содержания СО45КА'ССК7' Т-клеточной популяции в Т-клетках при культивировании по сравнению с контрольной группой.
(4) Анализ хемотаксиса.
В группе СН-296 были получены результаты более высокого процентного содержания СО45КА'ССК7' Т-клеточной популяции по сравнению с контрольной группой. ССК7-положительные клетки, такие как интактные Т-клетки и Т-клетки центральной памяти, демонстрируют хемотаксис в ответ на хемокин ССЬ21. Миграция из кровеносных сосудов в лимфатические узлы является важным событием для данных клеток, что подтверждали, если клетки, полученные после размножения, обладали хемотаксисом в ответ на ССЬ21. Клетки, полученные в разделе (2) примера 4, центрифугировали, супернатант удаляли и суспендировали в среде ΚΡΜΙ 1640, содержащей 0,5% В8А (называемая далее реакционной средой), чтобы получить плотность 5х106 клеток/мл. В нижнюю камеру системы Тгаи8тее11 (Тгап8тее11 Ро1усатЬопа1е, 24-луночный планшет, размер пор 5 мкм, производство Согшпд) добавляли 600 мкл реакционной среды, содержащей ССЬ21 (производство Κ&Ό ЗуЧешф с конечной концентрацией 1 мкг/мл, и в верхнюю камеру добавляли 100 мкл приготовленной клеточной суспензии. Определяли количество клеток, мигрировавших в нижнюю камеру после культивирования при 37°С в течение 2 ч, и число клеток, оставшихся в верхней камере. Процентное содержание клеток, которые участвуют в хемо
- 21 016168 таксисе, рассчитывают по следующей формуле (1):
процентное содержание (%) клеток, которые участвуют в хемотаксисе=(число клеток, мигрировавших в нижнюю камеру/(число клеток, оставшихся в верхней камере+число клеток, мигрировавших в нижнюю камеру ))х 100.
Результаты представлены в табл. 14.
Таблица 14
| Процентное содержание клеток, которые участвуют в хемотаксисе (%) | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | 43,2 |
| СН-296 | 58,8 |
Как показано в табл. 14, присутствие клеток, которые демонстрировали хемотаксис в ответ на ССЬ21, было подтверждено как в контрольной группе, так и в группе СН-296, и их процентное содержание было выше в группе СН-296. Другими словами, выяснили, что клетки, обладающие способностью мигрировать в лимфатические узлы, были получены в большом количестве с помощью использования СН-296 после размножения Т-клеточной популяции.
Пример 5. Индукция анти-МАКТ-1 СТЬ из Т-клеточной популяции, увеличенной с помощью СН296.
(1) Иммобилизация античеловеческого СИЗ-антитела и фрагмента СН-296.
Осуществляли аналогичные процедуры, как в разделе (1) примера 4.
(2) Размножение Т-клеточной популяции.
Осуществляли аналогичные процедуры как в разделе (2) примера 4.
Результаты кратности увеличения показаны в табл. 15.
Таблица 15
Как показано в табл. 15, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизацией СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции (обозначаемой далее как СН-296 группа), кратность увеличения Т-клеточной популяции была выше по сравнению с контрольной группой.
(3) Анализ СИ45КА+ССК7+ и СО45КА+СО62Ь+ Т-клеток.
Клетки, полученные в разделе (2) примера 5, окрашивали с каждым антителом и анализировали аналогичным образом, как в разделе (4) примера 1, при условии, что комбинации антител были такими, как указано далее.
Подробно, окрашивание проводили с Е1ТС-меченным мышиным 1дС1/КО 1-меченным мышиным 1дС1 (оба производства ΌΑΚΘ ΌΕΝΜΑΚΚ А/8), КО1-меченным мышиным античеловеческим СИ45КА антителом/Е1ТС-меченным мышиным античеловеческим ССК7-антителом и КО1-меченным мышиным античеловеческим СО45КА-антителом/Е1ТС-меченным мышиным античеловеческим СО62Ь-антителом (здесь и далее античеловеческое СО62Ь-антитело является продуктом производства еВю8С1еисе). Данные окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре и подсчитывали процентное количество СИ45КА+ССК7+ Т-клеток и СО45КА+СО62Ь+ Т-клеток. Результаты представлены в табл. 16.
Таблица 16
| Контроль(без иммобилизации СН-296) | СН-296 | |
| СО45КА+СО62С Т-клетки (%) | 60,2 | 76,9 |
| СО45КА’ ССК7' Т-клетки (%) | 47,1 | 75,0 |
Как видно из табл. 16, в группе СН-296 обнаружены более высокие уровни обоих маркеров клеточной поверхности по сравнению с контрольной группой.
(4) Хранение культивированных клеток.
Клетки, полученные на четырнадцатый день культивирования в разделе (2) примера 5, суспендировали в растворе для хранения, состоящем из равных объемов 90% ЕВ8/10% ΌΜ8Θ или СР-1, содержащего 8% Н8А и среды КРМ1 1640, и хранили суспензию в жидком азоте. При индукции СТЬ хранящиеся клетки быстро размораживали на водяной бане при 37°С и отмывали средой КРМ1 1640, содержащей 10 мкл/мл ДНКазы. Затем подсчитывали число живых клеток с помощью метода окраски трипановым синим. Затем клетки использовали в эксперименте.
(5) Индукция СТЬ, специфических для опухолеассоциированного антигена (МАКТ-1).
Индукцию СТЬ, специфических для опухолеассоциированного антигена (меланомный антиген, распознаваемый Т-клетками: МАКТ-1), проводили с использованием клеток, полученных в разделе (4) примера 5. Индукцию СТЬ, специфических для опухолеассоциированного антигена (МАКТ-1), проводили по частично модифицированному методу Р1еЬаи8к1 М. е! а1., Еиг. 1. 1ттиио1., 25(6), 1783-1787 (1995). Подробно, используя РВМС, полученные в разделе (1) примера 1, в качестве антиген-представляющих
- 22 016168 клеток РВМС инкубировали в среде КРМ1 1640, содержащей 5% человеческого сывороточного АВ (далее обозначаемого как 5НКРМ1) и содержащей в качестве антигенного пептида 40 мкг/мл пептида эпитопа, происходящего из антиген меланомы МАКТ-1 (пептид, связывающий НЬА-А2.1 описан в 8ЕО Ш N0: 2 списка последовательностей) и 3 мкл/мл β2 микроглобулина (производство 8спрк), 0,1 мМ смеси №АА, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ Ь-глутамата (производство СатЬгех) и 100 мкг/мл сульфата стрептомицина (производство МЕ1Л 8Е1КА КА18НА, Ь-ТЭ.) в инкубаторе в 5% СО2 при 37°С в течение 2 ч. После окончания инкубации смесь облучали рентгеновским облучением (1,42 Кл/кг) и доводили плотность 5НКРМ1 до значений от 3 до 4х106 клеток/мл.
С другой стороны, культивированные клетки, полученные в разделе (4) примера 5, суспендировали в 5НКРМ1, чтобы получить плотность 2х106 клеток/мл, и добавляли суспензию в 24-луночный культуральный планшет (производство Вес!оп Оюкепкоп) в объеме 0,5 мл/лунку. В каждую лунку добавляли антигенпрезентирующие клетки, полученные по вышеупомянутому способу, в объеме 0,5 мл/лунку и добавляли 1Ь-7 (производство Κ&Ό 8ук1етк) и КЬН (производство Са1Ьюсйет) до получения конечной концентрации 25 нг/мл и 5 мкг/мл соответственно. Планшет культивировали в инкубаторе в 5% СО2 при 37°С. В первый день инкубирования культуры 1 мл 5НКРМ1, содержащий 60 ед/мл 1Ь-2, добавляли в каждую лунку. На четвертый день культивирования удаляли половину объема культурального супернатанта и добавляли в каждую лунку 1 мл 5НКРМ1, содержащий 60 ед/мл 1Ь-2. На седьмой день антигенпрезентирующие клетки получали тем же способом, как указано выше, затем облучали смесь рентгеновским облучением (1,42 Кл/кг) и клетки получали так, чтобы плотность составляла 4х106 клеток/мл, и добавляли клетки в чистый 24-луночный планшет для культивирования клеток в объеме 0,5 мл/лунку.
Иммунореактивные клетки, которые культивировали в течение одной недели (часть клеток продолжали культивировать для исследования цитотоксической активности), суспендировали в 5НКРМ1, чтобы получить плотность от 1,8 до 2,0х106 клеток/мл, и добавляли суспензию в аналогичный планшет в объеме 0,5 мл/лунка. Далее 1Ь-7 добавляли до конечной концентрации 25 нг/мл для рестимуляции клеток. На восьмой день в каждую лунку добавляли 1 мл 5НКРМ1, содержащий 60 ед/мл 1Ь-2. На одиннадцатый день клетки в каждой лунке суспендировали, распределяли в две лунки по половине объема в каждую и добавляли 1 мл 5НКРМ1, содержащий 60 ед/мл 1Ь-2, в каждую лунку и продолжали культивировать клетки до пятнадцатого дня.
(6) Определение кратности размножения.
В отношении клеток, полученных в разделе (5) примера 5, на седьмой и четырнадцатый дни от начала культивирования подсчитывали число живых клеток с помощью окраски трепановым синим и рассчитывали кратность размножения путем сравнения количества клеток с их количеством в начале культивирования. Результаты представлены в табл. 17.
Таблица 17
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | СН-296 | |
| Седьмой день | х 1,5 | х 1,9 |
| Четырнадцатый день | х 6,0 | х 8,4 |
Как видно из табл. 17, для популяции СТЬ, индуцированной в группе СН-296, обнаруженные кратности размножения были выше, чем в контрольной группе. Другими словами, ясно показано, что популяция СТЬ может быть получена в большом количестве при проведении индукции СТЬ в культивируемых клетках, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции.
(7) Анализ цитотоксической активности.
Цитотоксическую активность СТЬ оценивали на пятнадцатый день культуры, полученной в разделе (5) примера 5, с помощью метода анализа цитотоксической активности с использованием кальцеина-АМ [Ысй!еп£е1к К. е! а1., 1. 1ттипо1. МеШобк., 172(2), 227-239 (1994)]. Подробно, клетки НЬА-А2.1ограниченной клеточной линии Т2 (АТСС СКЕ-1992), которые культивировали в течение ночи вместе с пептидом эпитопа или без него, суспендировали в среде КРМ1 1640, содержащей 5% РВ8, для получения плотности 1х106 клеток/мл, затем добавляли кальцеин-АМ (производство ЭОЛНЭО ЬАВОКАТОК1Е8) до конечной концентрации 25 мкг и культивировали клетки при 37°С в течение 1 ч. Клетки отмывали средой без кальцеина-АМ и затем получали кальцеин меченные клетки-мишени. Кальцеин меченные клетки-мишени смешивали с 30-кратным количеством клеток К562 (Нитап 8с1епсе Кекеагсй Кекоигсек Вапк 1СКВ0019), чтобы предоставить клетки для анализа цитотоксической активности. Клетки К562 использовали для исключения неспецифической цитотоксической активности из-за примеси ΝΙ< клеток в отвечающих клетках.
СТЬ, полученные в разделе (5) примера 5, серийно разводили 5НКРМ1 в качестве эффекторных клеток, так чтобы получить плотность от 3х105 до 3х106 клеток/мл. Затем разведение распределяли по 100 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета для культивирования клеток и к данным планшетам добав
- 23 016168 ляли клетки для анализа цитотоксической активности в объеме 100 мкл/лунку, приготовленные так, что кальцеин меченные клетки-мишени имели плотность 1х105/мл. После определения отношение эффекторных клеток (Е) к кальцеин меченным клеткам-мишеням (Т) выражали как отношение Е/Т и проводили определение отношения Е/Т 30, 10 и 3. Планшет, содержащий упомянутую выше суспензию, центрифугировали при 400хд в течение 1 мин и затем клетки инкубировали в инкубаторе 5% СО2 при 37°С в течение 4 ч. Затем собирали 100 мкл супернатанта культуры из каждой лунки и определяли количество кальцеина, высвобожденного в культуральный супернатант с помощью флуоресцентного планшетного ридера (спектрофлуориметра) (производство ВЕРТНОБЭ ТЕСНЫОБО61Е8) (возбуждение при 485 нм/измерение при 538 или 535 нм). Рассчитывали специфическую цитотоксическую активность (%) по следующей формуле (2):
специфическая цитотоксическая активность (%)={ (измеренное значение в каждой лункеминимальное высвобожденное количество)/максимальное высвобожденное количество-минимальное высвобожденное количество)} х 100.
В указанной выше формуле минимальное высвобожденное количество представляет собой количество кальцеина, высвобожденное в лунке, содержащей только клетки для анализа цитотоксической активности, показывающее количество кальцеина, естественно высвобождающееся из кальцеин меченных клеток-мишеней. Максимальное высвобожденное количество обозначает количество кальцеина, высвобождаемое, когда клетки полностью разрушены при добавлении 0,1% сурфактанта Тритон Х-100 (производство ΝαΕαΙαί Теэдие 1пс.) к клеткам для анализа цитотоксической активности. Результаты исследования цитотоксической активности показаны в табл. 18.
Таблица 18
| Клетюь-мишени | Е/Т | Цитотоксическая активность (%) | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | СН-296 | ||
| Т2 | 30 | <0 | <0 |
| 10 | <0 | <0 | |
| 3 | <0 | <0 | |
| Т2 + ΜΑΚΤ-Ι Пептид | 30 | 62,0 | 87,2 |
| 10 | 29,1 | 60,1 | |
| 3 | 9,2 | 26,3 |
Как видно из табл. 18, для популяции СТБ, индуцированной в группе СН-296, специфическая цитотоксическая активность популяции СТБ была выше, чем в контрольной группе. Другими словами, ясно показано, что культивируемые клетки, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции, могут быть индуцированы в популяцию СТБ, имеющую более высокую специфическую цитотоксическую активность.
Пример 6. Аллогенная МБР и индукция анти-МЛКТ-1 СТБ клеточной популяции, увеличенной с использованием газопроницаемого культурального мешка после стимуляции СН-296 на ранней стадии.
(1) Иммобилизация анти-СП3-антитела и фрагмента СН-296.
Античеловеческое СЭЛ-антитело и фрагмент СН-296 иммобилизовали на культуральное оборудование, использованное в следующем эксперименте. Подробно, 9 мл РВ8, содержащего античеловеческое СИ3-антитело (конечная концентрация: 5 мкг/мл) добавляли на 75-см2 матрас для культивирования клеток (производство Вес1оп ΌΚΕίπδοη). Затем к группе добавляли СН-296, так чтобы получить конечную концентрацию 25 мкг/мл.
Затем данное культуральное оборудование инкубировали при комнатной температуре в течение 5 ч и хранили культуральное оборудование при 4°С до использования. Непосредственно перед использованием РВ8, содержащего антитело и СН-296, удаляли аспирацией из данного культурального оборудования, затем каждый матрас дважды отмывали РВ8 и затем один раз средой ЕРМ1 и использовали культуральное оборудование в эксперименте.
(2) Размножение Т-клеточной популяции.
РВМС, которые получали в разделе (1) примера 1, суспендировали в 0,5% СТ-Т503 для получения клеточной суспензии с плотностью 0,5х106 клеток/мл. Затем на матрас с иммобилизованным античеловеческим СЭ3 -антителом или на матрас с иммобилизованным античеловеческим СЭ3 -антителом и СН296, приготовленными в разделе (1) примера 6, предварительно добавляли 0,5% СТ-Т503 в объеме 21 мл/матрас и добавляли упомянутую выше клеточную суспензию в объеме 9 мл/матрас. Затем добавляли 1Б-2 до конечной концентрации 1000 ед/мл и культивировали матрасы при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). На четвертый день от начала культивирования 14 мл культуральной среды из каждой группы и 186 мл 0,5% СТ-Т503 переносили в пустой газопроницаемый культуральный мешок (200 см2, производство ТЛКЛКА В1О, ΙΝΟ, серийный код КВ210) и затем добавляли 1Б-2 до конечной концентрации 500 ед/мл. Продолжали культивирование и на восьмой день 100 мл клеточной культуральной
- 24 016168 среды каждой группы удаляли из культурального мешка, оставшиеся в мешке 100 мл клеточной культуральной среды разводили в 2 раза 0,5% СТ-Т503, чтобы довести объем до 200 мл клеточного разведения в мешке. Далее к каждой группе добавляли 1Ь-2 до конечной концентрации 500 ед/мл. На одиннадцатый день культивирования добавляли 200 мл среды СТ-Т503, содержащей 0,2% Н8Л, чтобы развести в 2 раза клеточную культуральную среду каждой группы. Далее к каждой группе добавляли 1Ь-2 до получения конечной концентрации 500 ед/мл. На четырнадцатый день культивирования подсчитывали число живых клеток с помощью метода окраски трипановым синим и рассчитывали кратность размножения путем сравнения количества клеток с их количеством в начале культивирования. Результаты кратности увеличения показаны в табл. 19.
Таблица 19
| Кратность увеличения (разы) | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | х 225 |
| СН-296 | хЗЗЗ |
Как показано в табл. 19, даже в том случае, когда клетки культивировали в газопроницаемом культуральном мешке, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизацией СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции (обозначаемой далее как СН-296 группа), кратность увеличения Т-клеточной популяции была выше по сравнению с контрольной группой.
(3) Анализ СЭ45КЛ'ССК7' Т-клеток, СО45КА'СО6212 Т-клеток, СО45КА+СО27+ Т-клеток, СО45КА+СО28+ Т-клеток, СО27+СО28+ Т-клеток и СО45КА+ССК7+ СО6212 Т-клеток в Т-клеточной популяции, культивируемой в газопроницаемом культуральном мешке.
Клетки, полученные в разделе (2) примера 6, окрашивали с каждым антителом и анализировали аналогичным образом, как в разделе (4) примера 1, при условии, что комбинации антител были такими, как указано далее.
Подробно, окрашивание проводили с Е1ТС-меченным мышиным 1дС1/КО 1-меченным мышиным 1дС1/РС5-меченным мышиным 1дС 1, КО1-меченным мышиным античеловеческим СО45КАантителом/Е1ТС-меченным мышиным античеловеческим ССК7-антителом, КО1-меченным мышиным античеловеческим СО45КА антителом/РС5-меченным мышиным античеловеческим СО62Ь-антителом (производство Весктаии-Соикег), КО 1-меченным мышиным античеловеческим СО45КА антителом/Е1ТС-меченным мышиным античеловеческим СО28-антителом (производство еВюкшеисе), КО1-меченным мышиным античеловеческим СО45КА-антителом/РС5-меченным мышиным античеловеческим СО27-антителом (производство Весктаии-Соикег) и КО 1-меченным мышиным античеловеческим СО45КА-антителом/Е1ТС-меченным мышиным античеловеческим ССК7-антителом/РС5-меченным мышиным античеловеческим СО62Ь-антителом. Данные окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре и подсчитывали процентное количество СО45КА+ССК7+ Т-клеток, СО45КА+СО62Ь+ Тклеток, СО45КА+СО27+ Т-клеток, СО45КА+СО28+ Т-клеток, СО27+СО28+ Т-клеток и СО45КА+ССК7+СО62Ь+ Т-клеток. Результаты представлены в табл. 20.
Таблица 20
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | СН-296 | |
| СП45К А’ ССК7+ Т-клетки | 24,4% | 49,0% |
| СП45КА‘ СО62Ь+ Т-кпетки | 40,2% | 60,2% |
| ΟΏ45ΚΑ СП28+ Т-клетки | 36,9% | 63,0% |
| СО45КЛ' С1.)27+ Т-клетки | 46,3% | 63,1% |
| СО28 СО271 Т-клетки | 58,9% | 72,0% |
| СП45КА’ ССК7' СО621. Т-клетки | 23,0% | 47,3% |
Как видно из табл. 20, в группе СН-296 обнаружены более высокие уровни любого из маркеров клеточной поверхности по сравнению с контрольной группой. Известно, что СО27 и СО28 имеют высокий процент экспрессии в недифференцированных клетках, таких как интактные Т-клетки. Следовательно, в анализе с указанными маркерами ясно показано, что процентное содержание интактных Тподобных клеток увеличивается в Т-клеточной популяции при действии СН-296 на ранней стадии культуры.
(4) Аллогенная МЬК.
Аллогенную МЬК проводили с использованием клеток, полученных в разделе (2) примера 6. Подробно, РВМС, полученные аналогичным образом, как в разделе (1) примера 1, выделенные от аллогенного донора (чужой донор: донор является другим, чем донор, который был в разделе (2) примера 6), облучали рентгеновским облучением (0,88 Кл/кг) и суспендировали клетки с 5НКРМ1, чтобы получить плотность 2х106 клеток/мл (стимулирующие клетки). С другой стороны, культивированные клетки, полученные в разделе (2) примера 6, суспендировали в 5НКРМ1, чтобы получить плотность 2х106 кле
- 25 016168 ток/мл (отвечающие клетки). Полученные стимулирующие клетки и отвечающие клетки добавляли в 24луночный культуральный планшет в объеме 0,5 мл/лунка. В каждую лунку добавляли ГБ-2 до конечной концентрации 500 ед/мл и затем клетки на планшете культивировали в инкубаторе 5% СО2 при 37°С. На третий день культивирования в каждую лунку добавляли 1 мл 5ΗΒΡΜΙ, содержащей 1000 ед/мл 1Б-2. На пятый день культивирования удаляли половину объема супернатанта и в каждую лунку добавляли 1 мл 5ΗΒΡΜΙ, содержащей 1000 ед/мл ББ-2. Дополнительно, на седьмой день клетки в каждой лунке суспендировали, суспензию распределяли поровну в две лунки, по половине объема в каждую, в каждую лунку добавляли 1 мл 5ΗΒΡΜΙ, содержащей 1000 ед/мл 1Б-2, и продолжали культивирование до десятого дня.
(5) Определение кратности размножения.
В отношении клеток, полученных в разделе (4) примера 6, на седьмой и на десятый день от начала культивирования подсчитывали число живых клеток с помощью окраски трепановым синим и рассчитывали кратность размножения путем сравнения количества подсчитанных клеток с их количеством в начале культивирования. Результаты представлены в табл. 21.
Таблица 21
| Дни культивирования | Стимулирующая клетка-донор | Отвечающие клетки | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | СН-296 | ||
| Седьмой день | А | X 1,7 | х 2,7 |
| В | х 1,6 | х2,7 | |
| Десятый день | А | X 1,8 | х 3,0 |
| В | х2,1 | х 2,7 |
Как видно из табл. 21, в случае, когда аллогенную МБВ проводили с использованием группы СН296, кратность размножения была выше по сравнению с контрольной группой. Другими словами, ясно показано, что когда аллогенную МБВ проводили с использованием культивируемых клеток, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции, клетки, распознающие аллоантиген, пролиферировали в большем количестве.
(6) Анализ цитотоксической активности.
Цитотоксическую активность клеток, полученных в разделе (4) примера 6, оценивали на десятый день культуры, аналогичным образом, как в разделе (7) примера 5. В качестве кальцеин меченных клеток-мишеней использовали при определении собственные РВМС или не собственные РВМС, которые подвергали бластогенезу с фитогемагглютинином (далее обозначаемым как РНА) в течение 10 дней. При исследовании цитотоксической активности смешивали 30-кратное количество клеток К562 с кальцеин меченными клетками-мишенями. Результаты анализа цитотоксической активности показаны в табл. 22.
Таблица 22
| Донор-клетки стимулятора | Клетки-мишени | Е/Т | Цитотоксическая активность (%) | |
| Контроль (без иммобилизации СН296) | СН-296 | |||
| А | Несобственные ФГА бластные клетки | 30 | 50,6 | 63,8 |
| 10 | 29,3 | 44,1 | ||
| 3 | 7 | 16,9 | ||
| Собственные ФГА бластные клетки | 30 | <0 | <0 | |
| 10 | <0 | <0 | ||
| 3 | <0 | <0 | ||
| В | Несобственные ФГА бластные клетки | 30 | 26,6 | 60,1 |
| 10 | 9,1 | 38,0 | ||
| 3 | <0 | 13,0 | ||
| Собственные ФГА бластные клетки | 30 | <0 | <0 | |
| 10 | <0 | <0 | ||
| 3 | <0 | <0 |
Как видно из табл. 22, в случае, когда аллогенную МБВ проводили с использованием группы СН296, аллоантиген-специфическая цитотоксическая активность, исходя из реакции, была выше по сравнению с контрольной группой. Другими словами, для культивированных клеток, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным СН-296 на ранней стадии размножения Тклеточной популяции, ясно показано, что может быть получена клеточная популяция, имеющая более сильную аллоантиген-специфическую цитотоксическую активность в аллогенной МБВ.
(7) Хранение культивированных клеток.
Клетки, полученные на четырнадцатый день культивирования в разделе (2) примера 6, хранили в
- 26 016168 замороженном состоянии и размораживали аналогичным образом, как в разделе (4) примера 5. Клетки использовали в эксперименте.
(8) Индукция СТЬ, специфических к опухолеассоциированному антигену (МАНТ-1).
Используя клетки, полученные в разделе (1) примера (1) и в разделе (7) примера (6), индукцию СТЬ, специфических к опухолеассоциированному антигену (МАНТ-1), проводили аналогичным образом, как в разделе (5) примера 5, и продолжали культивирование в течение тринадцати дней, при этом проводили модификации, как изложено далее. Особенности заключались в том, что культивированные клетки, полученные в разделе (7) примера 6, суспендировали в 5ННРМ1 так, чтобы получить плотность 1х106 клеток/мл; на второй день культивирования в каждую лунку добавляли 1 мл 5ННРМ1, содержащей 60 ед/мл 1Ь-2, на шестой день культивирования отвечающие клетки суспендировали в 5ННРМ1 так, чтобы получить плотность от 0,3 до 1,3х 106 клеток/мл, и антигенпрезентирующие клетки суспендировали в нем так, чтобы получить плотность 1,6х106 клеток/мл; на седьмой день культивирования в каждую лунку добавляли 1 мл 5ННРМ1, содержащий 60 ед/мл 1Ь-2, на десятый день культивирования суспендировали клетки в каждой лунке и разделяли на две лунки, по половине объема в каждую, и добавляли в каждую лунку 1 мл 5ННРМ1, содержащий 60 ед/мл 1Ь-2.
(9) Анализ цитотоксической активности.
На четырнадцатый день от начала индукции анализировали цитотоксическую активность СТЬ, полученных в разделе (8) примера 6, аналогичным образом, как в разделе (7) примера 5, за исключением того, что отношение Е/Т для 90 дней устанавливали вновь. Результаты анализа цитотоксической активности показаны в табл. 23.
Таблица 23
| Клетки—мишени | Е/Т | Цитотоксическая активность (%) | ||
| РВМС | Контроль (без иммобилнзащш СН-296) | СН-296 | ||
| Т2 | 90 | 30,96 | Н.Т. | Н.Т. |
| 30 | 9,13 | 23,04 | 15,78 | |
| 10 | 2,42 | 9,63 | 10,56 | |
| 3 | 1,94 | 3,06 | 3,62 | |
| Т2 + ΜΑΚΤ-Ι пептид | 90 | 59,49 | Н.Т. | Н.Т. |
| 30 | 41,37 | 25,46 | 87,53 | |
| 10 | 25,29 | 8,85 | 77,21 | |
| 3 | 7,75 | 11,26 | 56,18 |
Н.Т.: не тестировали
Как видно из табл. 23, в популяции СТЬ, индуцированной из группы СН-296, специфическая цитотоксическая активность была выше по сравнению с контрольной группой и группой РВМС. Другими словами, ясно показано, что клетки, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции, могут быть индуцированы в популяцию СТЬ, имеющую более сильную специфическую цитотоксическую активность.
Пример 7. Индукция анти-МАНТ-1 СТЬ из СИ45НА+ССН7+СП8+ Т-клеток и СИ45НА-ССН7-СП8+ Т-клеток, полученных из развившихся клеток.
(1) Выделение СИ45НА+ССН7+СП8+ Т-клеток и СИ45НА-ССН7-СП8+ Т-клеток.
Клетки, полученные в разделе (1) примера (1) и в разделе (7) примера (6), окрашивали аналогичным образом, как в разделе (2) примера 2. Затем клетки отмывали 1% В8А/РВ8 и суспендировали в среде 1МЭМ (производство Ιηνίΐгоден). Клетки анализировали на высокоэффективном клеточном сортере МоЕ1о и изолировали фракцию СИ45НА+ССН7+СП8+ и фракцию СИ45НА-ССН7-СП8+ соответственно, получая при этом чистоту фракции от 92 до 99%.
(2) Индукция СТЬ, специфических к опухолеассоциированному антигену (МАНТ-1).
Используя клетки, полученные в разделе (1) примера 7, проводили индукцию СТЬ, специфических к опухолеассоциированному антигену (МАНТ-1), аналогичным образом, как в разделе (8) примера 6, и продолжали культивирование в течение тринадцати дней, при этом проводили модификации, как изложено далее. Особенности заключались в том, что в начале культивирования клетки, инициирующие культуру и антигенпрезентирующие клетки, добавляли в объеме 0,25 мл, каждый, в 48-луночный культуральный планшет (производство ВесЮн О|скеп5оп) и на второй день культивирования 0,5 мл в каждую лунку добавляли 1 мл 5ННРМ1, содержащей 60 ед/мл 1Ь-2, на четвертый день культивирования удаляли половину объема супернатанта и в каждую лунку добавляли 0,5 мл 5ННРМ1, содержащего 60 ед/мл 1Ь-2.
(3) Определение кратности размножения.
В отношении клеток, полученных в разделе (2) примера 7, на тринадцатый день от начала культивирования подсчитывали число живых клеток с помощью окраски трепановым синим и рассчитывали кратность размножения путем сравнения количества подсчитанных клеток с их количеством в начале культивирования. Результаты представлены в табл. 24.
- 27 016168
Таблица 24
| Клетки, инициирующие культуру | Кратность размножения | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | СН-296 | |
| СНИЗИЛ' ССК7+ СО8+ Тклетки | X 1,2 | х7,8 |
| СО45КАССК7’СО8+Т- клетки | х 0,8 | х 1,2 |
Как показано в табл. 24, в популяции СТЬ, индуцированной с использованием
СО45КА'ССК7'СО8' Т-клеток, изолированных из культивированных клеток, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизацией СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции (обозначаемой далее как СН-296 группа), кратность увеличения СТЬ популяции была выше по сравнению с контрольной группой. Другими словами, ясно показано, что СТЬ популяцию получили в большем количестве путем индукции СТЬ из СО45КА'ССК7' Т-клеток, содержащихся с высоким процентом в культивированных клетках, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции.
(4) Анализ цитотоксической активности.
На тринадцатый день от начала индукции анализировали цитотоксическую активность СТЬ, полученных в разделе (2) примера 7, аналогичным образом, как в разделе (7) примера 5. Результаты анализа цитотоксической активности показаны в табл. 25.
Таблица 25
| Клетки инициирующие культуру | Клетки-мишени | Е/Т | Цитотоксическая активность (%) | ||
| РВМС | Контроль (без иммобилизации СН-296) | СН-296 | |||
| СР45КА+ ССК7+ Т клетки | Т2 | 10 | 8,35 | Н.Т. | 18,62 |
| 3 | <0 | 1,77 | 9,8 | ||
| Т2 + МАКТ-1 Пептид | 10 | 83,59 | Н.Т. | 89,49 | |
| 3 | 66,61 | 20,92 | 67,07 | ||
| СЦ45КА ССК7” СО8+ Т клетки | Т2 | 30 | 17,16 | Н.Т. | Н.Т. |
| 10 | 3,19 | Н.Т. | Н.Т. | ||
| 3 | 0,78 | 10,15 | 8,96 | ||
| Т2 + МАКТ-1 Пептид | 30 | 8,66 | Н.Т. | Н.Т. | |
| 10 | <0 | Н.Т. | Н.Т. | ||
| 3 | <0 | 9,06 | 3,21 |
Н.Т.: не тестировали
Как показано в табл. 25, в популяции СТЬ, индуцированной с использованием
СО45КА'ССК7'СО8' Т-клеток, изолированных из группы СН-296, специфическая цитотоксическая активность популяции СТЬ была выше по сравнению с контрольной группой и группой РВМС. Далее, специфическая цитотоксическая активность была выше, чем активность в популяции СТЬ, индуцированной с использованием СО45КА-ССК7-СО8' Т-клеток. Другими словами, ясно показано, что СО45КА'ССК7'СО8' Т-клетки, которые содержатся с высоким процентом в культивированных клетках, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции, могут быть индуцированы в популяцию СТЬ, специфическая цитотоксическая активность которой была выше.
Пример 8. Измерение антигенраспознающей способности СТЬ.
(1) Индукция СТЬ, специфических к опухолеассоциированному антигену (МАКТ-1).
Используя клетки, полученные в разделе (1) примера 1 и в разделе (7) примера 6, индукцию СТЬ, специфических к опухолеассоциированному антигену (МАКТ-1), проводили аналогичным образом, как в разделе (8) примера 6, и продолжали культивирование в течение четырнадцати дней.
(2) Измерение антигенраспознающей способности.
Антигенраспознающую способность СТЬ, полученных в разделе (1) примера 8, определяли на четырнадцатый день после инициации индукции с помощью частичной модификации способа Уа1топ Ό. е! а1., 1. Iттиηо1., 160 1750-1758 (1998). Другими словами, клетки Т2 суспендировали в среде ΚΡΜΙ 1640, содержащей 5% ЕВ8, для получения плотности 1х 106 клеток/мл, затем добавляли кальцеин-АМ до конечной концентрации 25 мкг и культивировали клетки при 37°С в течение 1 ч. Инкубированные клетки отмывали средой без кальцеина-АМ и доводили плотность до 2х 105 клеток/мл. Кальцеин меченные клетки-мишени распределяли по 50 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета для культивирования клеток. В каждую лунку, в которой находились данные клетки, помещали 5НКΡΜI, содержащий от 0 до 20 мкМ антигенного пептида (эпитоп пептида, полученного из меланомного антигена МАКТ-1) в объеме 50
- 28 016168 мкл/лунка. Планшет инкубировали в инкубаторе с 5% СО2 при 37°С в течение 1 ч. После инкубации в каждую лунку добавляли по 50 мкл суспензии, содержащей 30-кратное количество клеток К562 (доведенную до плотности 6х106 клеток/мл).
СТЬ, полученные в разделе (1) примера 8, разводили 5НΚΡМI, так чтобы получить плотность 6х106 клеток/мл в качестве эффекторных клеток, и затем в каждую лунку планшета добавляли клетки в объеме 50 мкл/лунка. Планшет, в который помещали вышеупомянутую клеточную суспензию, центрифугировали при 400хд в течение 1 мин, затем клетки инкубировали в инкубаторе с 5% СО2 при 37°С в течение 4 ч. Затем собирали 100 мкл супернатанта культуры из каждой лунки и определяли количество кальцеина, высвобожденного в культуральный супернатант с помощью флуоресцентного планшетного ридера (спектрофлуориметра) (485 нм/535 нм). Рассчитывали специфическую цитотоксическую активность (%) по формуле (2). Результаты измерения антигенраспознающей способности представлены в табл. 26. Антигенраспознающую способность выражали как относительную величину цитотоксической активности для каждой концентрации добавленного пептида, где цитотоксическую активность принимали равной 100 при концентрации пептида, добавленного к клеткам-мишеням, равной 10 мкМ.
Таблица 26
| Конечная концентрация пептида, добавленного к клеткам-мишеням (мкМ) | Относительная величина цитотоксической активности пои добавлении 10 мкМ пептида | ||
| РВМС | Контроль (без иммобилизации СН-296) | СН-296 | |
| 10,0 | 100 | 100 | 100 |
| 1,0 | 124,36 | 74,39 | 91,44 |
| 0,1 | 72,54 | 67,59 | 87,02 |
| 0,01 | 72,77 | 57,34 | 78,88 |
| 0,001 | 29,63 | 36,83 | 74,3 |
| 0,0001 | 18,39 | 9,8 | 41,72 |
| 0 | 16,24 | 5,69 | 5,16 |
Как показано в табл. 26, в СТЬ популяции, индуцированной из группы СН-296, уничтожались даже клетки-мишени с антигеном, добавленным в более низкой концентрации, по сравнению с контрольной группой и группой РВМС, так что специфическая антигенраспознающая способность популяции СТЬ была высокой. Другими словами, ясно показано, что культивированные клетки, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным Сн-296 на ранней стадии размножения Тклеточной популяции, могут быть индуцированы в популяцию СТЬ, имеющую более высокую специфическую цитотоксическую активность.
Пример 9. Анализ жизнеспособности клеточной популяции, полученной при размножении Тклеточной популяции с использованием Сн-296.
(1) Размножение Т-клеточной популяции.
Процедуры проводили аналогичным образом, как в разделе (1) примера 3, за исключением того, что для иммобилизации античеловеческого СБ3-антитела и фрагмента СН-296 использовали ацетатный буфер, и на четвертый день культивирования культуральную среду разводили примерно в 14 раз и 6,3 мл разведения помещали на чистый 25-см2 культуральный матрас, и на восьмой день культивирования культуральную среду разводили примерно в 2 раза и 6,3 мл разведения помещали на чистый 25-см2 культуральный матрас. Результаты представлены в табл. 27.
Таблица 27
| Кратность увеличения (разы) | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | х 277 |
| СН-296 | х 344 |
Как показано в табл. 27, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизованным фрагментом СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции (обозначаемой далее как Сн-296 группа), получали более высокую кратность увеличения Т-клеточной популяции по сравнению с контрольной группой.
(2) Анализ СБ45ИА'ССИ7' Т-клеток и СБ45КА+СП62Ь+ Т-клеток.
Клетки, полученные в разделе (1) примера 9, окрашивали с каждым антителом и анализировали аналогичным образом, как в разделе (4) примера 1, при условии, что комбинации антител были такими,
- 29 016168 как указано далее.
Подробно, окрашивание проводили с Р1ТС-меченным мышиным 1дС1/КБ 1-меченным мышиным 1дС1/РС5-меченным мышиным 1дС 1 и Р1ТС-меченным мышиным античеловеческим ССК7 антителом/КБ1-меченным мышиным античеловеческим СБ45КА антителом/РС5-меченным мышиным античеловеческим СБ62Б антителом. Данные окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре и подсчитывали процентное количество СБ45КА+ССК7+ Т-клеток и СБ45КА+СБ62Ь+ Т-клеток. Результаты представлены в табл. 28 и 29.
Таблица 28
| СП45КА+ССК7+ Т-клетки (%) | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | 27,2 |
| СН-296 | 60,5 |
Таблица 29
В табл. 28 и 29 представлены результаты, которые показывают, что в группе СН-296 получили более высокую СБ45КА+ССК7+ Т-клеточную популяцию и более высокую СБ45КА+СБ62Ь+ Т-клеточную популяцию по сравнению с контрольной группой.
(3) Культивирование с применением клеток-фидеров для клеток раздела (1).
Клетки, полученные после размножения в разделе (1) примера 9, доводили 5НКРМ1 до плотности 2х106 клеток/мл и помещали в 24-луночный культуральный планшет в объеме 0,5 мл/каждая лунка. Кроме того, собственные РВМС, полученные в разделе (1) примера 1, суспендировали в 5НКРМ1, затем суспензию облучали рентгеновским облучением (0,90 Кл/кг) и ресуспендировали в 5НКРМ1, чтобы получить плотность 2х 106 клеток/мл (для получения клеток-фидеров). Указанные клетки-фидеры добавляли в упомянутый выше 24-луночный культуральный планшет по 0,5 мл/каждая лунка и культивировали планшет в инкубаторе с 5% СО2 при 37°С в течение 7 дней. В указанный период культивирование проводили без добавления цитокинов, таких как 1Ь-2.
(4) Анализ аннексин к7ААБ+ клеток.
Клетки, полученные в разделе (3) примера 9, собирали и окрашивали в соответствии с протоколом набора Аппехш ν/ТААБ (производство Весктап СоиНег) для выявления клеток, которые подверглись апоптозу. Клетки анализировали проточной цитометрией и подсчитывали для каждой клеточной популяции процентное содержание аннексин к7ААБ+ клеток, т.е. клеток, которые подверглись апоптозу. Результаты представлены в табл. 30.
Таблица 30
| Аннексин ν '7Α А (У клетки (%) | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | 57,6 |
| СН-296 | 44,9 |
По результатам табл. 30 видно, что в группе, для которой использовали культуральное оборудование с иммобилизованным СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции аннексин V'7ΑΑ^' , клеточная популяция была меньше, так что процентное содержание апоптотических клеток было ниже по сравнению с контрольной группой. Другими словами, ясно показано, что клетки, имеющие высокую жизнеспособность, в большинстве могут размножаться даже в условиях, например, низкой концентрации 1Ь-2 при использовании фрагмента СН-296 при размножении Т-клеточной популяции.
Пример 10. Исследование эффектов Т-клеточной трансплантации с использованием модели сингенной опухоли у мышей.
Чтобы подтвердить воздействия Т-клеток, которые размножали с применением СН-296, на опухоли проводили тест с использованием модели сингенной опухоли у мышей.
(1) Получение СН-296 мыши.
СН-296 мыши, показанный в 8ЕО 1Б ΝΟ: 23 списка последовательностей, получали конструированием фрагмента фибронектина мыши, основанного на последовательности СН-296 человека, и построением плазмиды по общепринятому способу, получая тем самым СН-296 мыши методом генной инженерии с использованием плазмиды. Другими словами, культивировали ЕксйепсЫа со11 НВ101, принимающую плазмиду, и проводили ее индукцию для экспрессии. Затем клетки разрушали, чтобы получить неочищенные белки и подвергали белки очистке с помощью катионобменной колонки, анионобменной колонки или гель-фильтрационной колонки для получения заданного белка. Полученный белок подвергали бактериальной фильтрации и хранили при -80°С до использования.
- 30 016168 (2) Получение лимфоцитов селезенки от мышей, имеющих опухоль.
Карциному БМС (далее обозначаемую как БМС) имплантировали в брюшную полость самкам мышей породы СИЕ1 (производство Νίρροη 8БС Ιηο.) для образования асцита и асцитические клетки имплантировали другим мышам каждые 7 дней и субкультивировали. На седьмой день асцитические клетки собирали из субкультуры, отмывали ΡΒ8, затем суспендировали в ΡΒ8, чтобы получить плотность 5х107 клеток/мл. Данную клеточную суспензию имплантировали подкожно на правую сторону брюшного отдела мышей СЭЕ1 в объеме 0,1 мл для формирования солидной опухоли. Через 21 день селезенку извлекали и гомогенизировали в среде ΚΡΜΙ 1640 с помощью предметных стекол. Часть материала от семи мышей собирали в пробирку, доводили объем до 45 мл, используя среду ΚΡΜΙ 1640, и оставляли смесь на льду в течение 5 мин. Затем смесь переносили в чистую пробирку через 40-мкм клеточный фильтр (производство Всс1оп О|сксп5оп). После центрифугирования удаляли супернатант и подвергали осадок гемолизу, включающему в себя стадии суспендирования осадка в 2 мл буфера АСК (0,15 М N^01, 0,01 М КНСО3, 0,01 мМ №2ЕИТА, рН 7,4), последующего добавления 2 мл буфера АСК для суспендирования смеси и затем добавления среды ΚΡΜΙ 1640, чтобы довести объем клеточной суспензии до 50 мл. После центрифугирования удаляли супернатант, осадок суспендировали в 10 мл среды ΚΡΜΙ 1640 и переносили суспензию в чистую пробирку через клеточный фильтр. Добавляли среду ΚΡΜΙ 1640, чтобы довести объем клеточной суспензии до 40 мл. Затем клеточную суспензию центрифугировали, удаляли супернатант и суспендировали осадок в смеси из равных объемов среды ΚΡΜΙ 1640 и СΡ-1, содержащем 8% Н8А, и хранили суспензию в жидком азоте до использования.
(3) Иммобилизация антимышиного СИЗ-антитела и фрагмента СН-296 мыши.
Антимышиное СИЗ-антитело и фрагмент СН-296 мыши иммобилизовали на культуральное оборудование, применяемое в последующем эксперименте. Подробно, 400 мкл ацетатного буфера (рН 5,3), содержащего антимышиное С03-антитело (производство Κ&Ό 8у51сш5) (конечная концентрация 14 мкг/мл) добавляли в 24-луночный планшет для культивирования клеток и инкубировали культуральное оборудование в течение ночи при 4°С. Затем СН-296 мыши, приготовленный в разделе (1) примера 10, добавляли до получения конечной концентрации 25 мкг/мл и инкубировали культуральное оборудование при комнатной температуре в течение 5 ч. Непосредственно перед применением ацетатный буфер, содержащий антитело и СН-296 мыши, удаляли аспирацией из данного культурального оборудования, затем каждую лунку дважды отмывали ΡΒ8 и однократно средой ΚΡΜΙ 1640 и использовали культуральное оборудование в эксперименте.
(4) Очистка лимфоцитов селезенки с помощью нейлоновых волокон.
Лимфоциты селезенки, полученные в разделе (2) примера 10, очищали с помощью нейлоновых волокон для увеличения степени гомогенности лимфоцитов. Шприц объемом 10 мл (производство ТЕΚυΜΟ СΟΚΡΟΚАТIΟN) наполняли 0,6 г нейлоновых волокон (производство \Уако Ριιιό Скетюа1 Ιηάι.151Г1С5. ЫД.), уравновешенных ΡΒ8, и затем стерилизовали при 121°С в течение 20 мин. Данную колонку уравновешивали средой ΚΡΜΙ 1640, содержащей 10% ΕΒ8 (производство ΩΛΙΝΙΡΡΟΝ ΡΗΛΚΜАСЕυТIСАЬ СО., БТО.), и инкубировали в инкубаторе с 5% СО2 при 37°С в течение 1 ч. Лимфоциты селезенки, полученные в разделе (2) примера 10, суспендировали в объеме от 2 до 3 мл среды ΚΡΜΙ 1640, содержащей 10% ΕΒ8, с плотностью, не превышающей 2х108 клеток, суспензию наносили на колонку и затем колонку инкубировали в инкубаторе с 5% СО2 при 37°С в течение 1 ч. Пятнадцать миллилитров среды ΚΡΜΙ 1640, содержащей 10% ΕΒ8, предварительно нагретых до 37°С, наносили на колонку и собирали элюированные клетки.
(5) Размножение мышиной Т-клеточной популяции.
Лимфоциты, полученные в разделе (4) примера 10, суспендировали в среде ΚΡΜΙ 1640, содержащей 10% ΕΒ8, 0,1 мМ смеси №АА, 1 мМ пирувата натрия и 50 мкМ 2 меркаптоэтанола (производство Ναка1а1 Теэдие, кс.) (обозначаемой далее как среда πιΕΡΜΙ), чтобы получить плотность 1,5х106 клеток/мл. Затем добавляли среду ιηΕΡΜΙ на планшет с иммобилизованным антимышиным СИ3-антителом и СН296 мыши, приготовленными в разделе (3) примера 10, в объеме 0,7 мл/лунка, упомянутую выше клеточную суспензию добавляли в объеме 0,5 мл/лунка и культивировали данные планшеты в 5% СО2 при 37°С (нулевой день инкубации). На второй день культивирования клеточную суспензию разводили средой тΚΡΜI до получения плотности 1 х 105 клеток/мл и все количество переносили на чистый, пустой 75-см2 матрас для культивирования клеток. На данном этапе добавляли мышиный Ш-2 (производство Κ&Ό 8у§!ет§) до получения конечной концентрации 100 ед/мл или добавляли мышиный Ш-2 (производство Κ&Ό 8у51ет5) до получения конечной концентрации 10 нг/мл. На пятый день культивирования проводили пассаж культуры аналогичным образом, как на второй день культивирования, за исключением того, что клеточную суспензию разводили так, чтобы получить плотность 1,5х106 клеток/мл. На седьмой день культивирования клетки собирали и тестировали с помощью следующей модели сингенной опухоли.
(6) Оценка эффекта отторжения опухоли при трансплантации Т-клеточной популяции в модели сингенной опухоли ΕΌΡΉΜί.’.
ΙΜί.' имплантировали подкожно, на правую сторону брюшного отдела самкам мышей породы СИЕ1 в возрасте 6 недель, под анестезией, аналогичным образом, как в разделе (2) примера 10. Клетки, полу
- 31 016168 ченные в разделе (5) примера 10, суспендировали в РВЗ так, чтобы получить плотность 3х108 клеток/мл, и вводили суспензию в хвостовую вену мышей в количестве 0,1 мл (нулевой день введения). Мышиный 1Ь-2 (3х104 ед/0,2 мл) вводили в брюшную полость в течение четырех последующих дней, считая с нулевого дня введения. В качестве контроля использовали группу, в которой не вводили выращенные клетки. Размер опухоли выражали в виде площади опухоли (см2) путем регулярного измерения длины и ширины опухоли вплоть до 21 дня после имплантации 1МС. Результаты представлены на фиг. 2. Фиг. 2 представляет собой график, на котором показано число дней после имплантации 1МС, и размер опухоли, где треугольными символами обозначена контрольная группа и круглыми символами обозначена группа, которой вводили Т-клетки. Как показано на фиг. 2, в группе, которой вводили клетки, культивированные в присутствии СН-296 (группа, которой вводили Т-клетки), обнаружили значительное подавление образования опухоли.
Пример 11. Оценка человеческой Т-клеточной популяции, увеличенной с использованием СН-296 с помощью индукции СУНЭ у мышей ИОО/Заб.
(1) Размножение Т-клеточной популяции.
Для получения большого количества клеток применяли другое оборудование. Подробно, 21 мл РВЗ, содержащего античеловеческое СЭ3-антитело (конечная концентрация: 5 мкг/мл), добавляли на 175 см2 культуральный матрас (производство Вес!оп Оюкепкоп). На данном этапе вносили СН-296 с конечной концентрацией 25 мкг/мл и инкубировали культуральное оборудование при комнатной температуре в течение 5 ч. Непосредственно перед использованием РВЗ, содержащего антитело и СН-296, удаляли аспирацией из данного культурального оборудования, и затем каждый матрас дважды отмывали РВЗ и затем один раз средой КРМ1. Свежие РВМС получали из 54 мл крови, собранной от здоровых доноров. РВМС суспендировали в среде СТ-Т503, содержащей 0,5% плазмы человека (ке1£ р1акта) и 0,2% НЗА (далее обозначаемой как 0,5% ке1£ р1акта СТ-Т503), для получения клеточной суспензии с плотностью 0,5х106 клеток/мл, и 21 мл суспензии наносили на матрас с иммобилизованным анти-СЭ3-антителом или на матрас с иммобилизованным анти-СЭ3 и СН-296, которые приготовили ранее, затем добавляли 1Ь-2 в конечной концентрации 1000 ед/мл. Затем начинали культивирование данных матрасов при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). На следующий день на культуральный матрас наносили 49 мл 0,5% ке1£ р1акта СТ-Т503 и добавляли 1Ь-2 в конечной концентрации 1000 ед/мл с учетом культуральной среды. На четвертый день от начала культивирования 42 мл культуральной среды из каждой группы и 158 мл 0,5% СТ-Т503 переносили в пустой газопроницаемый культуральный мешок (600 см2, производство ТАКАКА В1О, 1ИС., серийный код КВ610). Затем добавляли 1Ь-2 до конечной концентрации 500 ед/мл и продолжали культивирование. На шестой день культивирования добавляли 400 мл 0,5% ке1£ р1акта СТ-Т503 и 1Ь-2 с конечной концентрацией 500 ед/мл (600 мл культуральной среды). Через два дня (восьмой день культивирования) удаляли половину объема от 600 мл культуральной среды и добавляли такой же объем 0,5% ке1£ р1акта СТ-Т503 и 1Ь-2 (конечная концентрация 500 ед/мл). На одиннадцатый день культивирования добавляли 600 мл 0,5% СТ-Т503, содержащей 0,2% НЗА, и 1Ь-2 с конечной концентрацией 500 ед/мл и продолжали культивирование до четырнадцатого дня. После культивирования клетки суспендировали в жидкости для хранения, состоящей из равных объемов СР-1, содержащей 8% НЗА и среды КРМ11640, и хранили в жидком азоте до использования.
(2) Формирование групп.
В день перед введением клеток измеряли массу тела у десяти самок мышей породы ИОЭ/каб (полученных из СЬЕА 1арап 1пс.) в возрасте 8 недель и формировали 4 группы. В данном эксперименте были следующие группы.
Группа А: растворитель + фидер + человеческий 1Ь-2 + антиасиало СМ1-антитело.
Группа В: РВЬ + фидер + человеческий 1Ь-2 + антиасиало СМ1-антитело.
Группа С: клетки после размножения (без иммобилизации СН-296) + фидер + человеческий 1Ь-2 + антиасиало СМ1-антитело.
Группа Ό: клетки после размножения (с иммобилизацией СН-296) + фидер + человеческий 1Ь-2 + антиасиало СМ1-антитело.
Группа А и группа В соответствовали п=2, группа С и группа Ό соответствовали п=3.
(3) Введение антиасиало СМ1-антитела.
Известно, что обработку антиасиало СМ1-антителом используют для удаления ИК-клеток у мышей НОЭ/каб, тем самым усиливая приживление человеческих клеток. В день перед введением выращенных клеток 20 мкл антиасиало СМ1-антитела (производство \Уако Риге Скетка1к 1пбик!пек, Ь!б.) разводили физиологическим раствором, содержащим 0,4% НЗА (далее обозначаемым как 0,4% НЗА дополненный физиологический раствор), и вводили в брюшную полость 0,4 мл.
(4) Получение вводимых клеток и их введение.
Выращенные клетки, которые хранили в замороженном состоянии в разделе (1) примера 11, и замороженные РВМС от того же донора, полученные аналогичным образом, как в разделе (1) примера (1), быстро размораживали на водяной бане при 37°С. Концентрацию лимфоцитов периферической крови (далее обозначаемых как РВЬ) рассчитывали исходя из того, что процентное содержание СЭ3 положи
- 32 016168 тельных клеток РВМС составляло 70%. В качестве растворителя использовали физиологический раствор с добавлением 4% Н8А, суспендировали в растворителе часть РВЬ в качестве клеток-фидеров, в количестве 0,5 х107 клеток/мышь и РВЬ и клетки после размножения суспендировали в растворителе в количестве 1х 108 клеток/мышь так, чтобы получить необходимое количество клеток для клеток, предназначенных для введения. Всех мышей подвергали рентгеновскому облучению (0,090 Кл/кг) перед введением клеток и вводили 0,3 мл образованных клеток в брюшную полость последовательно, начиная с группы А.
(5) Введение человеческого 1Ь-2.
Человеческий 1Ь-2, используемый при размножении Т-клеток, готовили в физиологическом растворе с добавлением 4% Н8А, в концентрации 2х104 ед/мышь и 0,2 мл раствора вводили в брюшную полость мышей, начиная с тех мышей, которым закончили введение клеток в разделе 4 примера 11. Человеческий 1Ь-2 вводили один раз в день в течение 4 последующих дней со дня введения клеток.
(6) Изменение массы тела мышей после введения клеток.
Массу тела определяли с подходящим интервалом от дня введения и до двадцать первого дня. В результате, в группе В, которой вводили РВЬ, наблюдали уменьшение веса с восьмого дня, и одна мышь погибла на тринадцатый день. В других группах ни одна мышь не погибла до двадцать первого дня и во всех случаях подопытные животные выжили. При наблюдении за процентным снижением массы тела, несмотря на то что во время курса введения были обнаружены некоторые колебания в группе А и в группе С, исходная масса тела сохранялась на двадцать первый день, и в группе Ό наблюдалась небольшая тенденция к потере массы тела. Для реакции ксено-РТПХ (Хепо-СУНО), при оценке которой потерю массы тела используют в виде индекса, было показано, что в основном ее выявляли в РВЬ, что указывает на более высокую эффективность клеток, которые выращивали в условиях иммобилизации СН-296 по сравнению с клетками, которые выращивали без иммобилизации СН-296.
(7) Приживление Т-клеток человека в селезенке.
На двадцать первый день от начала введения клеток выделяли селезенку у мышей всех групп, за исключением группы В, и анализировали процентное содержание человеческих СЭ3-положительных клеток в селезенке с помощью проточной цитометрии. Поскольку в группе В одна мышь погибла на тринадцатый день, то селезенку данной мыши выделяли непосредственно после гибели и вскрытие оставшейся мыши также проводили на тринадцатый день. Выделенную селезенку гомогенизировали с помощью предметных стекол и гомогенизированную селезенку фильтровали через нейлоновое сито и центрифугировали. Супернатант удаляли, осадок гемолизировали буфером АСК и затем отмывали средой КРМ1 1640, чтобы получить клетки. Проводили окрашивание с использованием Р1ТС-меченного мышиного античеловеческого ί.Ό3-антитела (производство ЭАКО ^ΕNМΛΚΚ А/8). В результате показали, что процентное содержание СЭ3-положительных клеток среди клеток селезенки в группе В, исследованной на тринадцатый день, составляло около 70%, и в группе Ό, исследованной на двадцать первый день, составляло 59%, процентное содержание СЭ3-положительных клеток составляло менее 1% в группе А и несколько процентов в группе С. Из результатов видно, что клетки, выращенные в условиях иммобилизации СН-296, имели более высокий процент трансплантации в селезенке, чем клетки, выращенные без иммобилизации СН-296, и что данный процент увеличивался в течение 21 дня.
Пример 12. Размножение лимфоцитов с добавлением 1Ь-2, 1Ь-12, ΙΡΝ-γ или анти-1Ь-4-антитела.
(1) Иммобилизация античеловеческого СЭ3-антитела и фрагмента СН-296.
Проводили аналогичные процедуры, как в разделе (2) примера 1, за исключением того, что использовали раствор АСЭ-А (рН 5,0) для иммобилизации античеловеческого СЭ3-антитела и фрагмента СН296, и количество раствора АСЭ-А, которое добавляли в 12-луночный планшет для культивирования клеток, было изменено на 0,45 мл.
(2) Размножение Т-клеточной популяции с использованием среды СТ-Т503.
РВМС, полученные в разделе (1) примера 1, суспендировали в 0,5% СТ-Т503 с получением клеточной суспензии плотностью 0,25х106 клеток/мл и затем 0,5% СТ-Т503 предварительно добавляли на планшет с иммобилизованным античеловеческим СЭ3-антителом или на планшет с иммобилизованным античеловеческим СЭ3-антителом и СН-296, приготовленными в разделе (1) примера 12, в объеме 0,5 мл/лунку. Клеточную суспензию добавляли в объеме 1 мл/лунка и культивировали данные планшеты при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). На четвертый день от начала культивирования культуральную среду из каждой группы разводили примерно в 14 раз 0,5% СТ-Т503 и 6,3 мл разведения переносили на чистый пустой 25-см2 матрас для культивирования клеток. Продолжали культивирование, на седьмой день культуральную среду из каждой группы разводили примерно в 2 раза 0,5% СТ-Т503 и 6,3 мл разведения переносили на чистый пустой 25-см2 матрас для культивирования клеток. На одиннадцатый день культивирования культуральную среду из каждой группы разводили примерно в 2 раза средой СТ-Т503, содержащей 0,2% Н8А, и 12,6 мл разведения переносили соответственно на чистый пустой 25-см2 матрас для культивирования клеток. В данном эксперименте 1Ь-2 добавляли с нулевого дня культивирования в конечной концентрации 100 ед/мл. Кроме того, в качестве агентов, других, чем 1Ь-2, на четвертый день культивирования добавляли 1Ь-12 (производство Κ&Ό 8уЧет5) в конечной концентрации 50 ед/мл, ΙΝΡ-γ (производство Κ&Ό 8уЧет5) добавляли в конечной концентрации 20 нг/мл или ан
- 33 016168 тичеловеческое ГБ-4 антитело (производство Вес1оп Э|скеп5оп) добавляли в конечной концентрации 20 мкг/мл; на седьмой и на одиннадцатый день культивирования добавляли каждый цитокин и антитело в свежую добавленную среду с получением упомянутой выше конечной концентрации. На четырнадцатый день культивирования подсчитывали число живых клеток с помощью метода окраски трипановым синим и рассчитывали кратность размножения путем сравнения количества клеток с их количеством в начале культивирования. Результаты кратности увеличения показаны в табл. 31.
Таблица 31
| Кратность увеличения (разы) | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | х388 |
| СН-296 | х416 |
Как показано в табл. 31, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизованным СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеток, получали более высокую кратность увеличения Тклеточной популяции по сравнению с контрольной группой.
(3) Анализ СО45КЛ+ССК7+ Т-клеток и СО45КЛ+СО62Б+ Т-клеток.
Клетки, полученные в разделе (2) примера 12, окрашивали с каждым антителом и анализировали аналогичным образом, как в разделе (4) примера 1, при условии, что комбинации антител были такими, как указано далее.
Подробно, окрашивание проводили с МТС-меченным мышиным 1дС1/КО 1-меченным мышиным 1дС1/РС5-меченным мышиным 1дС1 + ЕСО-меченным мышиным 1дС1 в качестве отрицательного контроля, КО1-меченным мышиным античеловеческим СО45КЛ антителом/НТС-меченным мышиным античеловеческим ССК7 антителом/ЕСО-меченным мышиным античеловеческим СО4 антителом/РС5меченным мышиным античеловеческим СО8-антителом или КО 1-меченным мышиным античеловеческим СО45КЛ-антителом/НТС-меченным мышиным античеловеческим СО62Ь-антителом/ЕСОмеченным мышиным античеловеческим СО4-антителом/РС5-меченным мышиным античеловеческим СО8-антителом. Данные окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре и подсчитывали процентное количество СО45КЛ+ССК7+ Т-клеток и СО45КЛ+СО62Ь+ Т-клеток среди всех Т-клеток, среди СО8+ Т-клеток или среди СО4+ Т-клеток. Результаты представлены в табл. 32.
Таблица 32
| СО45КА+ ССК7‘ Т-клетки (%) | СО45КА+ СО621/ Т-клетки (%) | ||
| Все Т-клетки | Контроль (без иммобилизации СН-296) | 13,8 | 25,8 |
| СН-296 | 40,2 | 58,4 | |
| СО8+ Т-клетки | Контроль (без иммобилизации СН-296) | 17,1 | 33,4 |
| СН-296 | 47,4 | 69,7 | |
| СЕ>4+ Т-клетки | Контроль (без иммобилизации СН-296) | 7,7 | 11,6 |
| СН-296 | 21,8 | 25,0 |
Как показано в табл. 32, при культивировании в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизованным фрагментом СН-296, получали более высокую СО45КЛ+ССК7+ Т-клеточную популяцию и СО45КЛ+ССК7+ Т-клеточную популяцию среди Т-клеток по сравнению с контрольной группой. Из указанного выше следует, что в культуре, где ГБ-2, ГБ-12, ΙΡΝ-γ или анти-1Б-4-антитела добавляют к среде СТ-Т503, Т-клеточная популяция может быть увеличена с одновременным увеличением процентного количества СО45КЛ+ССК7+ или СО45КЛ+СО62Б+ Т-клеток в Т-клеточной популяции в присутствии СН-296 фрагмента на ранней стадии размножения.
Пример 13. Аллогенная МБК клеточной популяции, выращенной из свежевыделенных РВМС после стимуляции СН-296 на ранней стадии с использованием газопроницаемого культурального мешка.
(1) Выделение РВМС из свежей крови.
Получали пятьдесят миллилитров от здорового донора при его информационном согласии и затем выделяли РВМС из собранной крови аналогичным образом, как в разделе (1) примера 1.
Собранные РВМС окрашивали трипановым синим и по методу Тюрка (Тигк'к Чашшд шебюб) (раствор для окраски по Тюрку производства Ν;·ι1<;·ι1;·ιί Теэдие Ιπκ), при этом подсчитывали количество клеток и использовали в эксперименте без хранения в замороженном состоянии.
(2) Иммобилизация античеловеческого СО3-антитела и СН-296.
Иммобилизацию проводили аналогичным образом, как в разделе (1) примера 6.
(3) Размножение Т-клеточной популяции.
РВМС, полученные в разделе (1) примера 13, суспендировали в 0,5% 5е1Г р1а§та 6Т-Т503 для получения клеточной суспензии с плотностью 0,5х106 клеток/мл. Затем 0,5% СТ-Т503 предварительно добавляли на матрас с иммобилизованным античеловеческим СО3-антителом или в планшет с иммобилизо
- 34 016168 ванным античеловеческим СО3-антителом и СН-296, приготовленными в разделе (2) примера 13, в объеме 21 мл/матрас и добавляли упомянутую выше клеточную суспензию в объеме 9 мл/матрас. Добавляли 1Ь-2 до конечной концентрации 1000 ед/мл и культивировали матрасы при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). На четвертый день культивирования 21 мл культуральной среды из каждой группы и 279 мл 0,5% 5е1Г р1а§та СТ-Т503 переносили в пустой газопроницаемый культуральный мешок (300 см2, производство ТАКАКА В1О, ШС., серийный код КВ610) и затем добавляли 1Ь-2 до конечной концентрации 500 ед/мл. Продолжали культивирование и на восьмой день 150 мл клеточной культуральной среды каждой группы удаляли из культурального мешка, оставшиеся в мешке 150 мл клеточной культуральной среды разводили в 2 раза 0,5% 8е1Г р1а§та СТ-Т503, чтобы довести объем клеточной культуральной среды до 300 мл в каждой группе. Далее к каждой группе добавляли 1Ь-2 до конечной концентрации 500 ед/мл. На одиннадцатый день культивирования добавляли 300 мл среды СТ-Т503, содержащей 0,2% Н8А, чтобы развести в 2 раза клеточную культуральную среду в каждой группе. Далее к каждой группе добавляли 1Ь-2 до конечной концентрации 500 ед/мл. На четырнадцатый день культивирования подсчитывали число живых клеток с помощью метода окраски трипановым синим и рассчитывали кратность размножения путем сравнения количества подсчитанных клеток с их количеством в начале культивирования. Результаты показаны в табл. 33.
Таблица 33
| Кратность увеличения (разы) | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | х 885 |
| СН-296 | х 1271 |
Как показано в табл. 33, даже в том случае, когда клетки культивировали в газопроницаемом культуральном мешке, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизацией СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции (обозначаемой далее как СН-296 группа), кратность увеличения Т-клеточной популяции была выше по сравнению с контрольной группой.
(4) Анализ СО45КА+ССК7+ Т-клеток, СО45КА'СО62Е' Т-клеток, СО45КА+СО27+ Т-клеток, СО45КА+СО28+ Т-клеток, СО27+СО28+ Т-клеток и СО45КА+ССК7+СО62Ь+ Т-клеток в Т-клеточной популяции, культивируемой в газопроницаемом культуральном мешке.
Клетки, полученные в разделе (3) примера 13, окрашивали с каждым антителом и анализировали аналогичным образом, как в разделе (3) примера 6. Результаты представлены в табл. 34.
Таблица 34
| Контроль (без иммобилизации СН296) | СН-296 | |
| СО45КА ’ СЦГСЬ1 Т-клетки | 77,15% | 85,21% |
| СО45КА' ССК.7 Т-клетки | 50,46% | 60,17% |
| СО45КА' €Ώ28 Т-клетки | 65,94% | 72,88% |
| СЭ45КА+ СО27+ Т-клетки | 70,93% | 85,89% |
| СЭ28* СП27 Т-клетки | 65,54% | 76,42% |
| СО45Ю\+ССК7 СО62Е* Т-клетки | 50,05% | 59,32% |
Как видно из табл. 34, в группе СН-296 обнаружены более высокие уровни любого из маркеров клеточной поверхности по сравнению с контрольной группой.
(5) Хранение культивированных клеток.
На пятнадцатый день культивирования клетки, полученные в разделе (3) примера 13, замораживали для хранения и затем размораживали аналогичным образом, как в разделе (4) примера 5.
Затем клетки использовали в эксперименте.
(6) Аллогенная МЬК.
Аллогенную МЬК осуществляли аналогичным образом, как в разделе (4) примера 6, используя клетки, полученные в разделе (5) примера 13, за исключением указанных далее модификаций. Особенности заключались в том, что суспензию стимулирующих клеток и отвечающих клеток готовили с плотностью 1 или 2х106 клеток/мл; на пятый день клетки в каждой лунке суспендировали, затем суспензию распределяли в две лунки, по половине объема в каждую, добавляли в каждую лунку 1 мл 5НКРМ1, содержащей 1000 ед/мл 1Ь-2, и продолжали культивирование до седьмого дня.
(7) Определение кратности размножения.
В отношении клеток, полученных в разделе (6) примера 13, на седьмой от начала культивирования подсчитывали число живых клеток с помощью метода окраски трепановым синим и рассчитывали кратность размножения путем сравнения количества подсчитанных клеток с их количеством в начале культивирования. Результаты представлены в табл. 35.
- 35 016168
Таблица З5
| Дни культивирования | Количество посеянных клеток при инициации культуры (кпетки/лунка) | Отвечающие клетки | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | СН-296 | ||
| Седьмой день | 0,5х106 | х | х2,24 |
| 1x10 | х 2,29 | х 3,72 |
Как видно из табл. З5, в случае, когда аллогенную МЬК проводили с использованием группы СН296, кратность размножения была выше по сравнению с контрольной группой. Другими словами, ясно показано, что когда аллогенную МЬК проводили с использованием культивируемых клеток, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции, то клетки, распознающие аллоантиген, пролиферировали в большем количестве.
(6) Анализ цитотоксической активности.
Цитотоксическую активность клеток, полученных в разделе (6) примера 1З, оценивали на седьмой день культивирования, аналогичным образом, как в разделе (6) примера 6, за исключением того, что в качестве кальцеин меченных клеток-мишеней использовали при определении собственные РВМС или не собственные РВМС, которые подвергали бластогенезу с фитогемагглютинином (далее обозначаемым как РНА) в течение 7 дней. При исследовании цитотоксической активности смешивали З0-кратное количество клеток К562 с кальцеин меченными клетками-мишенями. Соотношение Е/Т составляло от 90 до 10. Результаты анализа цитотоксической активности показаны в табл. З6.
Таблица З6
| Количество посеянных клеток при инициации кулыуры клетки/лунка | Клетки-мишени | Е/Т | Цитотоксическая активность (%) | |
| Контроль (без иммобилизации СН296) | СН-296 | |||
| 0,5*10® | Несобственные ФГА бластные клетки | 90 | 33,18 | 49,5 |
| 30 | 17,17 | 28,31 | ||
| 10 | 6,13 | 10,81 | ||
| 3 | 3,66 | 6,12 | ||
| Собственные ФГА бластные клетки | 90 | 2,01 | 2,78 | |
| 30 | <0 | 1,67 | ||
| 10 | <0 | <0 | ||
| 3 | 4,07 | 1,1 | ||
| 1,0*10® | Несобственные ФГА бластные клетки | 90 | 69,5 | 73,42 |
| 30 | 53,68 | 66,57 | ||
| 10 | 30,29 | 43,79 | ||
| 3 | 11,78 | 18,82 | ||
| Собственные ФГА бластные клетки | 90 | 3,72 | 4,21 | |
| 30 | 2,08 | 3,59 | ||
| 10 | <0 | 1,14 | ||
| 3 | <0 | <0 |
Как видно из табл. З6, в случае, когда аллогенную МЬК проводили с использованием группы СН-2 96, аллоантиген-специфическая цитотоксическая активность, исходя из реакции, была выше по сравнению с контрольной группой. Другими словами, для культивированных клеток, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным СН-296 на ранней стадии размножения Тклеточной популяции, ясно показано, что может быть получена клеточная популяция, имеющая более сильную аллоантиген-специфическую цитотоксическую активность в аллогенной МЬК.
Пример 14. Аллогенная МЬК и индукция МАКТ-1 СТЬ клеточной популяции, выращенной с использованием газопроницаемого культурального мешка после стимуляции СН-296 на ранней стадии.
(1) Иммобилизация анти-СЭЗ-антитела и фрагмента СН-296.
Античеловеческое СЭЗ-антитело и фрагмент СН-296 иммобилизовали на культуральное оборудование, использованное в следующем эксперименте. Подробно, 9 мл РВ8, содержащего античеловеческое СЭЗ-антитело (конечная концентрация: 5 мкг/мл), добавляли в газопроницаемый культуральный мешок (культуральная площадь 75 см2, производство ТАКАКА В1О, ШС., серийный код КВ620). Затем при добавлении СН-296 в соответствующую группу добавляли одинаковые объемы РВ8, содержащего античеловеческое СОЗ-антитело (конечная концентрация 5 мкг/мл) и СН-296 (конечная концентрация 25 мкг/мл).
Затем данное культуральное оборудование инкубировали при комнатной температуре в течение 5 ч и хранили культуральное оборудование при комнатной температуре до использования. Непосредственно
- З6 016168 перед использованием РВ8, содержащий антитело и СН-296, удаляли с помощью шприца из данного культурального оборудования, затем каждый мешок дважды отмывали РВ8 и затем один раз средой КРМ1 и использовали мешки в эксперименте.
(2) Размножение Т-клеточной популяции.
Осуществляли аналогичные процедуры, как в разделе (3) примера 13, за исключением того, что при стимуляции с помощью СН-296 использовали мешок, приготовленный в разделе (1) примера 14, вместо культурального матраса. Результаты, полученные на четырнадцатый день после начала культивирования, представлены в табл. 37.
Таблица 37
| Кратность увеличения (разы) | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | х500 |
| СН-296 | х967 |
Как показано в табл. 37, даже в том случае, когда клетки культивировали в газопроницаемом культуральном мешке при стимуляции СН-296 на ранней стадии или при последующем культивировании, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизованным СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции (обозначаемой далее как СН-296 группа), кратность увеличения Т-клеточной популяции была выше по сравнению с контрольной группой.
(3) Анализ СО45КА+ССК7+ Т-клеток, СО45КА'С1)621.' Т-клеток, СО45КА+СО27+ Т-клеток, СО45КА+СО28+ Т-клеток, СЭ27'СЭ28' Т-клеток и СП45КА+ССК7+СП62Ь+ Т-клеток в Т-клеточной популяции, выращенной в газопроницаемом культуральном мешке при СН-296 на ранней стадии или при последующем культивировании.
Клетки, полученные в разделе (2) примера 14, окрашивали с каждым антителом и анализировали аналогичным образом, как в разделе (3) примера 6. Результаты представлены в табл. 38.
Таблица 38
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | СН-296 | |
| СО45КА+С062Ь+ Т-клетки | 71,73% | 85,03% |
| СО45КА* ССВ.7* Т-клетки | 47,49% | 67,46% |
| СО45КА' СП28* Т-кпетки | 59,81% | 79,83% |
| СП45КА'1 С1327 Т-клетки | 64,69% | 85,37% |
| СО28+ СО27+ Т-клетки | 59,99% | 82,15% |
| СЭ45КА+ ССК7+ СО621? Т-клеткн | 46,14% | 65,94% |
Как видно из табл. 38, в группе СН-296 обнаружены более высокие уровни любого из маркеров клеточной поверхности по сравнению с контрольной группой.
(4) Аллогенная МЬК.
Аллогенную МЬК осуществляли аналогичным образом, как в разделе (4) примера 6, используя клетки, полученные в разделе (2) примера 14.
(5) Анализ цитотоксической активности.
На десятый день от начала индукции анализировали цитотоксическую активность клеток, полученных в разделе (4) примера 14, аналогичным образом, как в разделе (6) примера 6, за исключением того, что отношение Е/Т для 90 устанавливали вновь. Результаты анализа цитотоксической активности показаны в табл. 39.
- 37 016168
Таблица 39
| Клетки — мишени | Е/Т | Цитотоксическая активность (%) | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | СН-296 | ||
| Несобственные ФГА бластные клетки | 90 | 65,05 | 72,73 |
| 30 | 44,92 | 61,43 | |
| 10 | 21,81 | 37,2 | |
| 3 | 7,23 | 17,99 | |
| Собственные ФГА бластные клетки | 90 | 0,69 | 0,17 |
| 30 | <0 | <0 | |
| 10 | <0 | <0 | |
| 3 | <0 | <0 |
Как видно из табл. 39, в случае, когда аллогенную МЬК проводили с использованием группы СН296, аллоантиген-специфическая цитотоксическая активность, исходя из реакции, была выше по сравнению с контрольной группой. Другими словами, для культивированных клеток, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным СН-296 на ранней стадии размножения Тклеточной популяции, ясно показано, что может быть получена клеточная популяция, имеющая более сильную аллоантиген-специфическую цитотоксическую активность в аллогенной МЬК.
(6) Хранение культивированных клеток.
На четырнадцатый день культивирования клетки, полученные в разделе (3) примера 13, замораживали для хранения и затем размораживали аналогичным образом, как в разделе (4) примера 5. Затем клетки использовали в эксперименте.
(7) Индукция СТЬ, специфических к опухолеассоциированному антигену (МАКТ-1).
Индукцию СТЬ, специфических к опухолеассоциированному антигену (МАКТ-1), осуществляли с использованием клеток, полученных в разделе (1) примера 1 и в разделе (6) примера 14, аналогичным образом, как в разделе (5) примера 15, и продолжали культивирование в течение четырнадцати дней, при этом выполняли указанные далее модификации. Особенности заключались в том, что отвечающие клетки суспендировали в 5НКΡМI, чтобы получить плотность от 1х106 клеток/мл, и добавляли суспензию в 24-луночный культуральный планшет в объеме 0,5 мл/каждую лунку; на третий день культивирования удаляли половину объема культурального супернатанта и в каждую лунку добавляли 1 мл 5НКΡМI, содержащей 60 ед/мл №2; через неделю культивированные клетки доводили до плотности от 1,5 до 3,0х106 клеток/мл, антигенпрезентирующие клетки доводили до плотности 1,0х106 клеток/мл и добавляли каждую суспензию в объеме 0,5 мл/лунка; на десятый день от начала культивирования удаляли половину объема культурального супернатанта и в каждую лунку добавляли 1 мл 5НКΡМI, содержащей 60 ед/мл №2.
(8) Анализ цитотоксической активности.
Цитотоксическую активность СТЬ, полученных в разделе (7) примера 14, оценивали на четырнадцатый день культуры, аналогичным образом, как в разделе (9) примера 6. Результаты анализа цитотоксической активности представлены в табл. 40.
Таблица 40
| Клетки-мишени | Е/Т | Цитотоксическая активность (%) | ||
| Т2 | РВМС | Контроль (без иммобилизапии СН-296) | СН-296 | |
| 90 | 3,92 | <0 | <0 | |
| 30 | <0 | <0 | <0 | |
| 10 | <0 | <0 | <0 | |
| 3 | <0 | <0 | <0 | |
| Т2 + МАКТ-1 Пептид | 90 | 59,86 | 61,55 | 65,59 |
| 30 | 61,78 | 56,21 | 64,66 | |
| 10 | 44,21 | 43,64 | 51,79 | |
| 3 | 7,26 | 20,36 | 27,06 |
Как видно из табл. 40, в популяции СТЬ, индуцированной из группы СН-296, специфическая цитотоксическая активность была выше по сравнению с контрольной группой и группой РВМС. Другими словами, ясно показано, что клетки, для которых использовали культуральное оборудование с иммоби- 38 016168 лизованным СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции, могут быть индуцированы в популяцию СТЬ, имеющую более сильную специфическую цитотоксическую активность.
Пример 15. Индукция анти-МАКТ-1 СТЬ из СО45КА'ССК7'СО8' Т-клеток и СО45КА-ССК7-СО8' Т-клеток, полученных из клеток, выращенных с помощью газопроницаемого культурального мешка при стимуляции СН-296 на ранней стадии или при последующем культивировании.
(1) Выделение СП45КА+ССК7+СП8+ Т-клеток и СП45КА-ССК7-СП8+ Т-клеток.
Клетки, полученные в разделе (1) примера (1) и в разделе (6) примера 14, изолировали в виде ί.Ό45ΒΑ'ί’ί’Β7'ί.Ό8' и СО45КА-ССК7-СО8' фракции соответственно аналогичным образом, как в разделе (1) примера 7, с чистотой 93-99%.
(2) Индукция СТЬ, специфических к опухолеассоциированному антигену (МАКТ-1).
Используя клетки, полученные в разделе (1) примера 15, осуществляли индукцию СТЬ, специфических к опухолеассоциированному антигену (МАКТ-1) аналогичным образом, как в разделе (7) примера 14, и продолжали культивирование в течение четырнадцати дней, при этом проводили модификации, как изложено далее. Особенности заключались в том, что клетки суспендировали в 5НКРМ! с получением плотности 1х 106 и добавляли 0,25 мл суспензии в каждую лунку 48-луночного культурального планшета; в первый день культивирования 0,5 мл 5ΠΚΡΜΙ, содержащей 60 ед/мл ΙΕ-2, добавляли в каждую лунку; на третий день культивирования удаляли половину объема супернатанта и в каждую лунку добавляли 0,5 мл 5ΠΚΡΜΙ, содержащей 60 ед/мл ΙΕ-2; через неделю доводили плотность культивированных клеток до 0,2-1,7х106 клеток/мл и плотность антигенпрезентирующих клеток до 1,0х106 клеток/мл и каждую клеточную суспензию добавляли в 24-луночный культуральный планшет в объеме 0,5 мл/лунка; на десятый день культивирования удаляли половину объема супернатанта и затем в каждую лунку добавляли 1 мл 5НКΡΜI, содержащей 60 ед/мл Ш-2.
(3) Определение кратности размножения.
В отношении клеток, полученных в разделе (2) примера 15, на четырнадцатый день от начала культивирования подсчитывали число живых клеток по методу окраски трепановым синим и рассчитывали кратность размножения путем сравнения количества подсчитанных клеток с их количеством в начале культивирования. Результаты представлены в табл. 41.
Таблица 41
| Клетки, инициирующие культуру | Кратность размножения | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | СН-296 | |
| СО45КА+ССК7+ СО8+ Тклетки | х 2,36 | х 5,38 |
| СО45КА’ ССК7‘ СШ+ Тклетки | х 3,14 | х4,9б |
Как показано в табл. 41, в популяции СТЬ, индуцированной с использованием
СО45КА'ССК7'СО8' Т-клеток, изолированных из культивированных клеток, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции (обозначаемой далее как СН-296 группа), кратность увеличения СТЬ популяции была выше по сравнению с контрольной группой. Другими словами, ясно показано, что СТЬ популяцию получили в большем количестве путем индукции СТЬ из СО45КА+ССК7+ Т-клеток, содержащихся с высоким процентом в культивированных клетках, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции.
(4) Анализ цитотоксической активности.
Цитотоксическую активность клеток, полученных в разделе (2) примера 15, оценивали на четырнадцатый день культуры аналогичным образом, как в разделе (9) примера 6, за исключением того, что отношение Е/Т составляло от 30 до 3. Результаты анализа цитотоксической активности представлены в табл. 42.
Таблица 42
| Клетки инициирующие культуру | Клетки-мишени | Е/Т | Цитотоксическая активность (%) | ||
| РВМС | Контроль (без иммобилизации СН-296) | СН-296 | |||
| С'М5КА+ ССК.7+ СО8+ Т-клетки | Т2 | 30 | <0 | Н.Т. | <0 |
| 10 | <0 | <0 | <0 | ||
| 3 | <0 | <0 | <0 | ||
| Т2 + МАКТ-1 Пептид | 30 | 56,77 | Н.Т. | 73,96 | |
| 10 | 45,7 | 64,91 | 73,62 |
- 39 016168
| 3 | 35,36 | 58,58 | 58,49 | ||
| СО45КА ССК7 СО8+ Т-клески | Т2 | 30 | <0 | н.т. | <0 |
| 10 | <0 | <0 | <0 | ||
| 3 | <0 | <0 | <0 | ||
| Т2 + МАКТ-1 Пептид | 30 | 9,75 | н.т. | <0 | |
| 10 | <0 | 1,5 | <0 | ||
| 3 | <0 | 1,5 | 3,87 |
Н.Т.: не тестировали
Как показано в табл. 42, в популяции СТЬ, индуцированной с использованием
ί.Ό45ΡΛ'ί.'ί.Ή7'ί.Ό8' Т-клеток, изолированных из группы СН-296, специфическая цитотоксическая активность популяции СТЬ была выше по сравнению с контрольной группой и группой РВМС. Далее, специфическая цитотоксическая активность была выше, чем активность в популяции СТЬ, индуцированной с использованием СО45КА-ССН7-СО8+ Т-клеток. Другими словами, ясно показано, что СО45НА+ССН7+СО8+ Т-клетки, которые содержатся с высоким процентом в культивированных клетках, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным СН-296 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции, могут быть индуцированы в популяцию СТЬ, специфическая цитотоксическая активность которой была выше.
Пример 16. Измерение антигенраспознающей способности СТЬ.
(1) Индукция СТЬ, специфических к опухолеассоциированному антигену (МАНТ-1).
Используя клетки, полученные в разделе (1) примера 1 и в разделе (6) примера 14, индукцию СТЬ, специфических к опухолеассоциированному антигену (МАНТ-1), проводили аналогичным образом, как в разделе (7) примера 14, и продолжали культивирование в течение пятнадцати дней.
(2) Измерение антигенраспознающей способности.
Антигенраспознающую способность СТЬ, полученных в разделе (1) примера 16, определяли на пятнадцатый день от инициации индукции аналогичным образом, как в разделе (2) примера 8. Результаты измерения антигенраспознающей способности представлены в табл. 43. Антигенраспознающую способность выражали как относительную величину цитотоксической активности для каждой концентрации добавленного пептида, где цитотоксическую активность принимали равной 100 при концентрации пептида, добавленного к клеткам-мишеням, равной 10 мкМ.
Таблица 43
| Конечная концентрация пептида, добавленного к клеточным мишеням (мкМ) | Относительная величина цитотоксической активности при 10 мкМ добавленного пептида | ||
| РВМС | Контроль (без иммобилизации СН-296) | СН-296 | |
| 10,0 | 100 | 100 | 100 |
| 1,0 | 101,58 | 86,33 | 99,59 |
| 0,1 | 88,24 | 80,78 | 89,13 |
| 0,01 | 72,03 | 64,48 | 67,28 |
| 0,001 | 25,18 | 26,72 | 48,35 |
| 0,0001 | 11,47 | 2,45 | 21,59 |
| 0,00001 | 6,32 | 3,07 | 15,6 |
| 0 | 8,4 | <0 | 8,17 |
Как показано в табл. 26, в СТЬ популяции, индуцированной из группы СН-296, уничтожались даже клетки-мишени с антигеном, добавленным в более низкой концентрации, по сравнению с контрольной группой и группой РВМС, так что специфическая антигенраспознающая способность популяции СТЬ была высокой. Другими словами, ясно показано, что культивированные клетки, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным СН-296 на ранней стадии размножения Тклеточной популяции, могут быть индуцированы в популяцию СТЬ, имеющую более высокую специфическую цитотоксическую активность.
Пример 17. Оценка цитокинпродуцирующей способности СО45НА+ССН7+ Т-клеток, полученных из клеток, выращенных с помощью газопроницаемого культурального мешка при стимуляции СН-296 на ранней стадии и при последующем культивировании.
(1) Выделение СО45КА+ССН7+ Т-клеток и СО45КА-ССН7- Т-клеток.
Клетки, полученные в разделе (6) примера 14, окрашивали и подвергали сортингу аналогичным образом, как в разделе (3) примера 3.
(2) Иммобилизация античеловеческого СЭ3-антитела и античеловеческого СО28-антитела и стимуляция клеток.
Чтобы стимулировать изолированные клетки античеловеческое СЭ3-антитело и античеловеческое СО28-антитело иммобилизовали на культуральный планшет аналогичным образом, как в разделе (4)
- 40 016168 примера 3. Каждую клеточную популяцию, полученную в разделе (1) примера 17, суспендировали в 0,5% СТ-Т503. клетки добавляли в каждую лунку приготовленного планшета так, чтобы их плотность составляла 2х105 клеток/0,2 мл, и культивировали клетки при 37°С в 5% СО2. Через 24 ч собирали супернатант культуры и использовали в эксперименте для определения цитокина методом ЕЫ8А.
(3) Определение продукции 1Ь-2 методом ЕЬ18А.
При размножении лимфоцитов для клинических целей применяли газопроницаемый культуральный мешок, который обеспечивает культивирование клеток в закрытой системе. В примере 14 при размножении клеток с использованием культурального мешка в группе СН-296 были получены результаты с более высоким процентным содержанием СБ45КА+ССК7+ Т-клеток по сравнению с контрольной группой. Чтобы подтвердить, что данная СБ45КА+ССК7+ Т-клеточная популяция сохраняет свои свойства в качестве интактных Т-подобных клеток, оценивали 1Ь-2 продуцирующую способность СБ45КА+ССК7+ Тклеток и СБ45КА- ССК7- Т-клеток аналогичным образом, как в разделе (6) примера 3. Результаты представлены в табл. 44.
Таблица 44
| Иммобилизация СН-296 | II--2 (пг/мл) | |
| СЭ8+ Т-клетки | С1М5КА+ ССК7+ Т-клетки | 347,2 |
| СО45КА’ ССК7‘ Т-клетки | <0 | |
| СОЗ' Т-клетки | СЭ45К А+ ССК7+ Т-клетки | 1686,7 |
| СО45КА~ ССК.7’ Т клетки | 215,6 |
Как показано в табл. 44, продукция 1Ь-2 в СБ45КА+ССК7+ Т-клетках преобладала в как СБ8+ Тклетках, так и в СБ8- Т-клетках. Как уже было показано в разделе (6) примера 3, также показано и в настоящем примере, что СБ45КА+ССК7+ Т-клеточная популяция замороженных клеток, которые культивировали в мешке с использованием СН-296, имеет свойства интактных Т-подобных клеток.
Пример 18. Анализ СБ45КА+ССК7+ Т-клеток в Т-клеточной популяции, выращенной с использованием Н-296, СН-271, Н-271 или С-С81.
(1) Иммобилизация античеловеческого СБ3-антитела и фрагментов Н-296, СН-271, Н-271 или СС81.
Проводили аналогичные процедуры, как в разделе (1) примера 4, за исключением того, что фрагмент СН-296 не использовали и вместо него добавляли в соответствующую группу каждый из фрагментов Н-296, СН-271, Н-271 или С-С81 в конечной концентрации 25 мкг/мл.
(2) Размножение Т-клеточной популяции.
Проводили аналогичные процедуры, как в разделе (1) примера 3, за исключением того, что на четвертый день культивирования культуральную среду разводили примерно в 14 раз и 10 мл разведения добавляли на чистый 25-см2 матрас для культивирования клеток (производство Согшпд), на седьмой не проводили пассаж культуры. Культивирование продолжали в течение девяти дней. Результаты кратности увеличения на восьмой день от начала культивирования представлены в табл. 45.
Таблица 45
Как видно из табл. 45, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизованным Н-296, СН-271, Н-271 или С-С81 на ранней стадии размножения Т-клеточной популяции (далее обозначаемой как группа фрагмента), кратность увеличения Т-клеточной популяции была выше по сравнению с контрольной группой.
(3) Анализ СБ45КА+ССК7+ Т-клеток.
Процентное содержание СБ45КА+ССК7+ Т-клеток для клеток, полученных в разделе (2) примера 18, рассчитывали на девятый день от начала культивирования таким же образом, как в разделе (2) примера 3. Результаты представлены в табл. 46.
- 41 016168
Таблица 46
| СО45КА’ ССК.7' Т-клетки (%) | |
| Контроль (без иммобилизации СН-296) | 38,7 |
| Н-296 | 58,15 |
| СН-271 | 56,3 |
| Н-271 | 49,75 |
| С-С81 | 44,79 |
Как показано в табл. 46, в группе фрагмента были получены результаты более высокого содержания СО45КА'ССК7' Т-клеточной популяции в Т-клетках при культивировании по сравнению с контрольной группой.
Применяемость в производственных условиях.
По настоящему изобретению предоставляют способ производства Т-клеточной популяции. Данный способ предназначен для использования, например, в иммунотерапии в качестве Т-клеточной популяции, содержащей высокий процент Т-клеток, способных экспрессировать СО45КА, и по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СО62Ь, ССК.7, СЭ27 и СЭ28. Соответственно ожидают, что способ настоящего изобретения внесет значительный вклад в области медицины.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - схематическое изображение, показывающее доменную структуру фибронектина;
фиг. 2 - график, на котором показано супрессивное действие введения Т-клеток на образование опухоли.
Последовательности, определенные авторами патента
8ЕО ΙΌ N0: 1: частичный регион фибронектина, называемый ΙΙΙ-8.
8Е0 ΙΌ N0: 2: частичный регион фибронектина, называемый ΙΙΙ-9.
8Е0 ΙΌ N0: 3: частичный регион фибронектина, называемый ΙΙΙ-10.
8Е0 ΙΌ N0: 4: частичный регион фибронектина, называемый ΙΙΙ-11.
8Е0 ΙΌ N0: 5: частичный регион фибронектина, называемый ΙΙΙ-12.
8Е0 ΙΌ N0: 6: частичный регион фибронектина, называемый ΙΙΙ-13.
8Е0 ΙΌ N0: 7: частичный регион фибронектина, называемый ΙΙΙ-14.
8Е0 ΙΌ N0: 8: частичный регион фибронектина, называемый СО-1.
8Е0 ΙΌ N0: 9: фрагмент фибронектина, называемый С-274.
8Е0 ΙΌ N0: 10: фрагмент фибронектина, называемый Н-271.
8Е0 ΙΌ N0: 11: фрагмент фибронектина, называемый Н-296.
8Е0 ΙΌ N0: 12: фрагмент фибронектина, называемый СН-271.
8Е0 ΙΌ N0: 13: фрагмент фибронектина, называемый СН-296.
8Е0 ΙΌ N0: 14: фрагмент фибронектина, называемый С-С81.
8Е0 ΙΌ N0: 15: фрагмент фибронектина, называемый СН-296№1.
8Е0 ΙΌ N0: 16: фрагмент фибронектина, называемый СНУ-89.
8Е0 ΙΌ N0: 17: фрагмент фибронектина, называемый СНУ-90.
8Е0 ΙΌ N0: 18: фрагмент фибронектина, называемый СНУ-92.
8Е0 ΙΌ N0: 19: фрагмент фибронектина, называемый СНУ-179.
8Е0 ΙΌ N0: 20: фрагмент фибронектина, называемый СНУ-181.
8Е0 ΙΌ N0: 21: фрагмент фибронектина, называемый Н-275-Сук.
8Е0 ΙΌ N0: 22: эпитоп пептида, полученного из антигена МАКТ-1 меланомы.
8Е0 ΙΌ N0: 23: фрагмент фибронектина мыши, называемый СН-296.
- 42 016168
Список последовательностей <110> ТАКАКА ΒΙΟ 1ЫС.
<120> СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Т-КЛЕТОЧНОЙ ПОПУЛЯЦИИ <130> 06-040-РСТЛР/ТН <150> ЛР 2005-288983 <151> 2005-09-30 <150> ЛР 2006-102103 <151> 2006-04-03 <150> ЛР 2006-196950 <151> 2006-07-19 <150> ЛР 2006-241773 <151> 2006-09-06 <160> 23 <170> РаСепЫп уегзЬоп 3.3 <210> 1 <211> 87 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> частичный регион фибронектина, называемый 111“$ <400> 1
| Рго 1 | ТЬг Азр Ьеи | Агд 5 | РНе | ТЬг | Азп | Не | С1у 10 | РГО | Азр | ТЬг | Ме£ | Агд 15 | Уа1 | ||
| ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | Не | Азр | Ьеи | ТЬг | Азп | РЬе | Ьеи | Уа1 | Агд |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | С1и | С1и | Азр | Уа1 | А1а | С1и | Ьеи | Зег | 11ё | Зег |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи | Рхо | С1у | ТЬг | (Ли |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | С1и | 51п | Н1з | С1и | Зег | ТЬг | Рго |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Ьеи | Агд | О1у | Агд | Е1п | Ьуз | ТНг |
<210> 2 <211? 90 <212? БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223? частичный регион фибронектина, называемый ΙΙΙ-9 <300? 2
С1у Ьеи А$р Зег Рго ТЬг С1у Не Азр РЬе Зег Азр Не Т1эг А1а Азп
- 43 016168
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||
| Зег РЬе | ТЬг | Уа1 Н1з Тгр | Не | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | О1у | Туг |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||
| Агд Не | Агд | ΗΪ5 Нхя Рго | 61и | РЬе | Зег | С1у | Агд | Рго | Агд | С1и | Азр | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||
| Агд Уа1 | Рго | Н1з Зег Агд | Азп | Зег | Не | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг | Рго |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||
| С1у ТЬг | С1и | Туг Уа1 Уа1 | Зег | 11е | Уа1 | А1а | Леи | Азп | С1у | Агд | С1и | С1и |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||
| Зег Рго | Геи | Геи Т1е 01у | 01п | С1п | Зег | ТЬг | ||||||
| 85 | 90 | |||||||||||
| <210> | 3 | |||||||||||
| <211> | 94 | |||||||||||
| <212> : | БЕЛОК | |||||||||||
| <213> 1 | Искусственная | |||||||||||
| <220> | ||||||||||||
| <223> частичный регион | фибронектина, называемый ΙΙΙ-10 | |||||||||||
| <400> : | 3 | |||||||||||
| Уа1 Зег | Азр | Уа1 Рго Агд | Азр | Геи | 01 и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго | ТЬг |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||
| Зег ъеи | Ьеи | Не Зег Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Агд | Туг | Туг |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||
| Агд Не | ТЬг | Туг 01у С1и | ТЬг | 61у | С1у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | С1п | О1и | РЬе |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||
| ТЬг Уа1 | Рго | С1у Зег Ъуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | 11е | Зег | С1у | Ъеи | Ьуз | Рго |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||
| С1у Уа1 | Азр | Туг ТЬг Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | С1у | Агд | С1у | Азр |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||
| Зег Рго | А1а | Зег Зег Ьуз | Рго | Не | Зег | Не | Азп | Туг | Агд | ТЬг | ||
| 85 | 90 |
<2Ю> 4 <211> 84 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> частичный регион фибронектина, называемый ΙΙΙ-11 <400>4
01п МеЪ С1п Уа1 ТЬг Азр Уа1 31п Азр Азл Зег Не Зег Уа1 Ъуз Тгр 15 1015
Ьеи Рго Зег Зег Зег Рго Уа1 ТЬг С1у Туг Агд Уа1 ТЬг ТЬг ТЬг Рго
2530
- 44 016168
| Ьуз Азп 31у | Рго 01у | Рго ТНг | Ъуз 40 | ТЬг Ьуз ТЬг А1а | С1у 45 | Рго | Азр | С1п | |||||||
| 35 | |||||||||||||||
| ТЬг | <31и | МеЬ | ТЬг | Не | С1и | С1у | Ееи | С1п | Рго | ТЬг | Уа1 | С1и | Туг | Уа1 | Уа1 |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Зег | 7а1 | Туг | А1а | б1п | Азп | Рго | Зег | о1у | С1и | Зег | С1п | Рго | Ьеи | Уа1 | С1п |
| 65 | 70 | 75 | 80 |
ТЬг А1а Уа1 ТЬг <210> 5 <211> 92 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220 <223> частичный регион фибронектина, называемый ΙΙΙ-12 <400 5
| А1а 1 | Не | Рго | А1а | Рго 5 | ТЬг | Азр | Ьеи |
| Бег | Ьеи | Зег | А1а 20 | С1п | Тгр | ТЬг | Рго |
| Агд | Уа1 | Агд 35 | Уа1 | ТЬг | Рго | Ъуз | 01и 40 |
| Азп | Беи 50 | А1а | Рго | Азр | Зег | Зег 55 | Зег |
| А1а 65 | ТЬг | Ъуз | Туг | С1и | Уа1 70 | Зег | Уа1 |
| Зег | Агд | Рго | А1а | 31п 85 | 01у | Уа1 | Уа1 |
| Ьуз | РЬе 10 | ТЬг | Уа1 | ТЬг | Рго 15 | ТЬг | |
| Рго 25 | Азь | Уа1 | 01п | Ъеи | ТЬг 30 | С1у | Туг |
| Ьуз | ТЬг | С1у | Рго | Ме5 45 | Ъу8 | Й1и | Не |
| Уа1 | 7а1 | Уа1 | Зег 60 | С1у | Ъеи | МеЬ | Уа1 |
| Туг | А1а | Ъеи 75 | Ьуз | Азр | ТЬг | Ъеи | ТЬг 80 |
| ТЬг | ТЬг 90 | Ьеи | е1и |
<210> 6 <2Ц> 89 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> частичный регион фибронектина, называемый ΙΙΙ-13 <400> 6
| Азп Уа1 1 | Зег | Рго | Рго Агд 5 | Агд | А1а Агд | Уа1 10 | ТЬг | Азр | А1а | ТЬг | С1и 15 | ТЬг | |||
| ТЬг | 11е | ТЬг | 11е | Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | ТЬг | 11е | ТЬг | С1у | РЬе | |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Б1П | Уа1 | Азр | А1а | Уа1 | Рго | А1а | Азп | С1 у | 01п | ТЬг | РГО | 11е | С1п | Агд | ТЬг |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Не | Ъуз | Рго | Азр | Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТЬг | 11е | ТЬг | 61у | Ьеи | С1п | Рго | 31у |
55 60
- 45 016168
ТЬг Азр Туг Вуз Не Туг Беи Туг ТНг Беи Азп Азр Азп А1а Агд £ег
70 7580
Зег Рго Уа1 Уа1 Не Азр А1а Зег ТЬг <210>7 <211>90 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> частичный регион фибронектина, называемый ΙΙΙ-14 <400> 7
| АБа 1 | Не Азр А1а | Рго 5 | 5ег Азп Ьеи | Агд | РЬе 10 | Беи А1а | ТНг | ТЬг | Рго 15 | Азп | |||||
| Зег | Беи | Ъеи | Уа1 | 5ег | Тгр | 01п | Рго | Рго | Агд | АБа | Агд | 11е | ТЬг | С1у | Туг |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Не | Не | Ьуз | Туг | С1и | Буз | Рго | 01у | 2ег | Рго | Рго | Агд | 61и | Уа1 | Уа1 | Рго |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Агд | Рго | Агд | Рго | б1у | Уа1 | ТЬг | О1и | А1а | ТНг | Не | ТЬг | СБу | Ъеи | С1и | Рго |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| О1у | ТНг | С1и | Туг | ТЬг | 11е | Туг | Уа1 | 11е | АБа | Беи | Буз | Азп | Абп | Й1п | Буз |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Зег | С1и | Рго | Беи | Не | С1у | Агд | Буз | Буз | ТЬг |
90 <210> 8 <211> 25 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> частичный регион фибронектина, называемый СЗ-1 <400>8
Азр С1и Беи Рго 61п Беи Уа1 ТНг Беи Рго НБз Рго Азп Беи НБз С1у 15 1015
Рго 61и 11е Беи Азр Ча1 Рго Зег ТНг
2025 <210>9 <211>274 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый С-274 <400> 9
Рго ТНг Азр Беи Агд РНе ТНг Азп 11е С1у Рго Азр ТЬг МеН Агд νβΐ
- 46 016168
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | Не | Азр | 1еи | ТЬг | Азп | РЬе | Беи | Уа1 | Агд |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Туг | Зег | Рго | Уа1 | Буз | Азп | 61и | 61и | Азр | Уа1 | А1а | 61и | Беи | Зег | 11е | Зег |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Рго | Зег | Авр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Беи | Тпг | Азп | Беи | Беи | Рго | 61у | ТЬг | 61и |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа! | Туг | 61и | 61п | Н13 | 61и | Зег | ТЬг | Рго |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Беи | Агд | 61у | Агд | 61п | Буз | ТЬг | С1у | Беи | Азр | Зег | Рго | ТЬг | 61у | 11е | Азр |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| РНе | Зег | Азр | 11е | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе | ТЬг | Уа1 | Ηίβ | Тгр | 11е | А1а | Рго |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Агд | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | <31у | Тус | Агд | 11е | Агд | Нхз | Η1ξ | Рго | 61и | ΗΪ3 | РЬе |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Зег | 61у | Агд | Рго | Агд | 61 и | Азр | Агд | Уа1 | Рго | Н1з | Зег | Агд | Азп | Зех | 11е |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| ТЬг | Беи | ТЬг | Азп | Беи | ТЬг | Рго | 61у | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | 11е | Уа1 |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| А1а | Беи | Азп | С1у | Агд | 61и | 61и | Зег | Рго | Беи | Беи | 11е | 61у | 61п | 61п | Зег |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | Зег | Азр | Уа1 | Рго | Агд | Азр | Беи | 61и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| ТЬг | Зег | Неи | Беи | 11е | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Агд | Туг |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Туг | Агд | 11е | ТЬг | Туг | 61 у | 61и | ТЬг | 61 у | 61у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | 61п | 61и |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| РНе | ТЬг | Уа1 | Рго | 61у | Зег | Буз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | 11е | Зег | 61у | Беи | Буз |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | 61у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | 6,1 у | Агд | 61 у |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Буз | Рго | Не | Зег | Не | Азп | Туг | Агд | ТЬг | 61и |
| 260 | 265 | 270 |
Не Азр
| <210> | 10 |
| <211> | 271 |
| <212> | БЕЛОК |
| <213> | Искусственная |
| <220> | |
| <223> | фрагмент фибронектина, называемый Н-271 |
| <400> | 10 |
- 47 016168
| А1а 1 | Не | Рго | А1а | Рго 5 | ТЬг | Λερ | Беи | Буз | РЬе 10 | ТЬг | С1п | Уа1 | ТЬг | Рго 15 | ТЬг |
| Зег | Беи | Зег | А1а | 31п | Тгр | ТНг | Рго | Рго | Азп | Уа1 | εΐη | Беи | ТНг | С1у | Туг |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Агд | Уа1 | Агд | Уа1 | ТЫ | Рго | Буз | 31и | Буз | ТЬг | 31у | Рго | МеТ | Буз | Б1и | Не |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Азп | Беи | А1а | Рго | Азр | Зег | Зег | Зег | Уа1 | 17а 1 | 17а1 | Зег | С1у | Беи | Меб | 17а1 |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| А1а | ТЫ | Буз | Туг | С1и | Уа1 | Зег | Уа1 | Туг | А1а | Беи | Буз | Азр | ТЬг | Беи | ТЬг |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Зег | Агд | Рго | А1а | Б1п | 61у | Уа1 | Уа1 | ТЬг | ТЬг | Беи | С1и | Азп | Уа1 | Зег | Рго |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Рго | Агд | Агд | А1а | Агд | Уа1 | ТЬг | Азр | А1а | ТНг | 61и | ТЬг | ТНг | 11е | ТНг | Не |
| 100 | 105 | НО | |||||||||||||
| Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Буз | ТЬг | С1и | ТЬг | Не | ТЬг | С1у | РНе | С1п | Уа1 | Азр | А1а |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Уа1 | Рго | А1а | Азп | Б1у | <31п | ТЬг | Рго | Не | б1п | Агд | ТЫ | Не | Буз | Рго | Азр |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | С1у | Беи | С1п | Рго | С1у | ТЬг | Азр | Туг | Буз |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Не | Туг | Беи | Туг | ТЬг | Беи | Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Зег | Зег | Рго | 17а1 | Уа1 |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Не | Аар | А1а | Зег | ТЬг | А1а | Не | Азр | А1а | Рго | Зег | Азп | Беи | Агд | РНе | Беи |
| 130 | 185 | 190 | |||||||||||||
| А1а | ТЬг | ТЬг | Рго | Азп | Зег | Беи | Беи | 17а 1 | Зег | Тгр | С1п | Рго | Рго | Агд | А1а |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Агд | Не | ТЬг | Б1у | Туг | Не | 11е | Буз | Туг | 51и | Буз | Рго | 01у | Зег | Рго | Рго |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Агд | 61и | Уа1 | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | Б1у | Уа1 | ТЬг | 51и | А1а | ТЬг | 11е |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| ТЬг | Б1у | Беи | С1и | Рго | С1у | ТЬг | Й1и | Туг | ТЫ | 11е | Тус | Уа1 | 11е | А1а | Беи |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Буз | Азп | Азп | 61п | Буз | Зег | 61и | Рго | Беи | Не | С1у | Агд | Буз | Буз | ТЬг |
260 265 270 <210> 11 <211> 296 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый Н-296 <400> 11
А1а Не Рго А1а Рго ТЬг А5р Беи Буз РНе ТНг С1п Уа1 ТЬг Рго ТЬг
10 15
- 48 016168
| Зег | Ьеи | Зег | А1а 20 | С1п | Тгр | ТНг | Рго | Рго 25 | Азп | Уа1 | С1п | Ьеи | ТЬг 30 | 61 у | Туг |
| Агд | Уа1 | Агд | Уа1 | ТНг | Рго | Ьуз | С1и | Ьуз | ТНг | С1у | Рго | МеЬ | Ьуз | 61и | Не |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Азп | Ьеи | А1а | Его | Азр | Зег | Зег | Зег | Уа1 | Уа1 | Уа1 | Зег | С1у | Ьеи | Мер | Уа1 |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| А1а | ТЬг | Ьуз | Туг | С1и | Уа1 | Зег | Уа1 | Туг | А1а | Ьеи | Ьуз | Азр | ТНг | Ьеи | ТНг |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Зег | Агд | Рго | А1а | С1п | 61у | Уа1 | Уа1 | ТНг | ТНг | Ьеи | 61 и | Азп | Уа1 | Зег | Рго |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Рго | Агд | Агд | А1а | Агд | Уа1 | ТЬг | Азр | А1а | ТЬг | С1и | ТНг | ТНг | Не | ТНг | Не |
| 100 | 105 | НО | |||||||||||||
| Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Ауз | ТНг | 61 и | ТНг | Не | ТНг | С1у | РНе | 61 п | νβΐ | Азр | А1а |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Уа1 | Рго | А1а | Азп | 61у | 61п | ТЬг | Рго | Не | 61п | Агд | ТНг | Не | Ьуз | Рго | Азр |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТЬг | 11е | ТЬг | 61у | Ьеи | 61п | Рго | 61 у | ТНг | Азр | Туг | Ьуз |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Не | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи | Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Зег | Зег | Рго | Уа1 | Уа1 |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| 11е | Азр | А1а | Зег | ТНг | А1а | Не | Азр | А1а | Рго | Зег | Азл | Ьеи | Агд | РНе | Ьеи |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| А1а | ТНг | ТНг | Рго | Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | Уа1 | Зег | Тгр | С1п | Рго | Рго | Агд | А1а |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Агд | Не | ТЬг | С1у | Туг | Не | Не | Ьуз | Туг | С1и | Ьуз | Рго | 61у | Зег | Рго | Рго |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Агд | С1и | Уа1 | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | Е1у | Уа1 | ТЬг | С1и | А1а | Τ1ΊΓ | Не |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| ТЬг | С1у | Ьеи | С1и | Рго | <31у | ТЬг | 61и | Туг | ТНг | 11е | Туг | Уа1 | Не | А1а | Ьеи |
| 24 5 | 250 | 255 | |||||||||||||
| ьуз | Азп | А$п | 01п | Ъуз | Зег | С1и | Рго | Ьеи | Не | С1у | Агд | Ьуз | Ьуз | ТЬг | Азр |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| 61и | Ьеи | Рго | С1п | Ней | Уа1 | ТНг | Ьеи | Рго | Н1з | Рго | Азп | Ьеи | Н13 | 61у | Рго |
| 275 | 280 | 285 |
С1и Не Ьеи Αερ Уа1 Рго Зег ТЬг
290 295
| <210> | 12 |
| <211> | 549 |
| <212> | БЕЛОК |
| <213> | Искусственная |
| <220> | |
| <223> | фрагмент фибронектина, называемый СН-271 |
| <400> | 12 |
- 49 016168
| Рго 1 | ТНг Авр | Ьеи | Агд 5 | РНе | ТНг Авп | Не | 61у 10 | Рго | Азр | ТНг | МеЬ | Агд 15 | Уа1 | ||
| ТНг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | Не | Азр | Ьеи | ТНг | Азп | РЬе | Ьеи | Уа1 | Агд |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Авп | 61и | 61и | Азр | Уа1 | А1а | 61 и | Ьеи | Зег | 11е | Зег |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТНг | Азп | Ьеи | Ьеи | Рго | 61у | ТНг | С1и |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | 61и | 61п | Низ | 61и | Зег | ТНг | Рго |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Ьеи | Агд | С1у | Агд | 61п | Ьуз | ТНг | 61у | Ьеи | Азр | Зет | Рго | ТНг | 61у | Не | Азр |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| РНе | Зег | Авр | Не | ТНг | А1а | Азп | Зег | РНе | ТНг | Уа1 | Н13 | Тгр | Не | А1а | Рго |
| 100 | 105 | НО | |||||||||||||
| Агд | А1а | ТНг | Не | ТНг | 61у | Туг | Агд | Не | Агд | Н15 | Ηίε | Рго | 61 и | Н1В | РНе |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Зег | С1у | Агд | Рго | Агд | 61и | Азр | Агд | Уа1 | Рго | Н1 з | Зег | Агд | Азп | Зег | Не |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| ТЬг | Ьеи | ТНг | Азп | Ьеи | ТНг | Рго | С1у | ТНг | С1и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Уа1 |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| А1а | Ьеи | Азп | 61 у | Агд | 61и | С1и | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | Не | 61у | С1п | 61п | Зег |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| ТНг | Уа1 | Зег | Азр | Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | (Ии | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТНг | Рго |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| ТНг | Зег | Ьеи | Ьеи | Не | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТНг | Уа1 | Агд | Туг |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Туг | Агд | Не | ТНг | Туг | С1у | 61и | ТНг | е1у | 61 у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | С1п | 61и |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| РНе | ТНг | УаЬ | Рго | 61у | Зег | Ьуз | Зег | ТНг | А1а | ТНг | 11е | Зег | 61у | Ьеи | Ьуз |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | С1у | Уа1 | Азр | Туг | ТНг | Не | ТНг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТНг | С1у | Агд | 61 у |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Не | Зег | 11е | Азп | Туг | Агд | ТНг | С1и |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Не | Азр | Ьуз | Рго | Зег | МеЬ | А1а | Не | Рго | А1а | Рго | ТНг | Азр | Ьеи | Ьув | РЬе |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| ТНг | 61п | Уа1 | ТНг | Рго | ТНг | Зег | Ьеи | Зег | А1а | 61п | Тгр | ТНг | Рго | Рго | Авп |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Уа1 | (31п | Ьеи | ТНг | 61у | Туг | Агд | Уа1 | Агд | Уа1 | ТНг | Рго | Ьуз | С1и | Ьуз | ТЬг |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| 61 у | Рго | МеЬ | Ьуз | 61и | Не | Азп | Ьеи | А1а | Рго | Азр | Зег | Зег | Зег | Уа1 | Уа1 |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Уа1 | Зег | 61у | Ьеи | МеЬ | Уа1 | А1а | ТНг | Ьуз | Туг | С1и | Уа1 | Зег | Уа1 | Туг | А1а |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Ъеи | Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд | Рго | А1а | 61п | С1 у | Уа1 | Уа1 | ТЬг | ТЬг |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Ьеи | С1и | Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд | А1а | Агд | Уа1 | ТЬг | Азр | А1а | ТЬг |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| С1и | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | 11е | Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | 61и | ТЬг | Не | ТЬг |
| 305 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| С1у | РЬе | С1п | Уа1 | Азр | А1а | Уа1 | Рго | А1а | Азп | С1у | О1п | ТЬг | Рго | 11е | 61п |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Агд | ТЬг | Не | Ьуз | Рго | Азр | Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | 61у | Ьеи | С1п |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Рго | <31у | ТЬг | Азр | Туг | Ъуз | Не | Туг | Ьеи | Тух | ТЬг | Ьеи | Азп | Азр | Азп | А1а |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| Агд | Зег | Зег | Рго | Уа1 | Уа1 | Не | Азр | А1а | Зег | ТЬг | А1а | Не | Азр | А1а | Рго |
| 450 | 4 55 | 4 60 | |||||||||||||
| Зег | Азп | Ьеи | Агд | РЬе | Ьеи | А1а | ТЬг | ТЬг | Рго | Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | Уа1 | Зег |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Тгр | С1п | Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | Не | ТЬг | С1у | Туг | Не | Не | Ьуз | Туг | С1и |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| Ьу8 | Рго | 61у | Зег | Рго | Рго | Агд | С1и | Уа1 | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | 61у |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| Уа1 | ТЬг | 61и | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | С1у | Ьеи | 61и | Рго | 61 у | ТЬг | С1и | Тух | тьг |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| Не | Туг | Уа1 | Не | А1а | Ьеи | Ьуз | Азп | Азп | С1п | Туз | Зег | О1и | Рго | Ьеи | не |
| 530 | 535 | 540 |
С1у Агд Туз Ьуз ТЬг
545 <210> 13 <211> 574 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый СН-296 <400> 13
| Рго 1 | ТЬг | Азр | Ьеи Агд 5 | РЬе | ТЬг | Азп | Не | С1у 10 | Рго | Азр | ТЬг | МеЪ Агд 15 | Уа 1 | ||
| ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | Не | Азр | Ьеи | ТЬг | Аэп | РЬе | Ьеи | Уа1 | Агд |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Тух | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | 61и | С1и | Азр | Уа1 | А1а | 61и | Ьеи | Зег | Не | Зег |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи | Рго | 61у | ТЬх | С1и |
55 60
- 51 016168
| Туг 65 | Уа1 | Уа1 | 5ег | Уа1 | 5ег 70 | Зег | Уа1 | Туг | С1и | 61п 75 | Н1з | 61и | Зег | ТЬг | Рго 80 |
| Ьеи | Агд | 61у | Агд | 61п | Ьуз | ТЬг | 61у | Ьеи | Азр | Зег | Рго | ТЬг | 61у | Не | Азр |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| РЬе | Зег | Азр | Не | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе | ТЬг | νβΐ | Н1з | Тгр | 11е | А1а | Рго |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Агд | А1а | ТЬг | Не | ТЫ | 61у | Туг | Агд | Не | Агд | ΗΪ5 | Ηί3 | Рго | С1О | ΗΪΒ | РЬе |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Зег | С1у | Агд | Рго | Агд | С1и | Азр | Агд | Уа1 | Рго | Ηίβ | Зег | Агд | Азп | Зег | Не |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| ТЬг | Ъеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг | Рго | 61у | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Уа1 |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| А1а | 1еи | Азп | 61 у | Агд | 61и | 61и | Зег | Рго | Ьеи | 1еи | Не | 61у | 61п | 61п | Зег |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | Зег | Азр | Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | С1и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| ТЬг | Зег | 1еи | Ьеи | 11е | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Агд | Туг |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Туг | Агд | 11е | ТЬг | Туг | С1у | С1и | ТЬг | 61у | Е1у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | 61п | 61ц |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| РЬе | ТЬг | Уа1 | Рго | 61у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | 11е | Зег | 61у | Ьеи | Ьуз |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | С1у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | с;1у | Агд | С1у |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | 11е | Зег | 11е | Азп | Туг | Агд | ТЬг | С1и |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Не | Азр | Ъуз | Рго | Зег | МеЬ | А1а | 11е | Рго | А1а | Рго | ТЬг | Азр | Ьеи | Ьуз | РЬе |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| ТЬг | Е1п | Уа1 | ТЬг | Рго | ТЫ | Зег | Ьеи | Зег | А1а | 61п | Тгр | ТЬг | Рго | Рго | Азп |
| 2 90 | 2 95 | 300 | |||||||||||||
| Уа1 | С1п | Ьеи | ТЬг | 61У | Туг | Агд | Уа1 | Агд | Уа1 | ТЬг | Рго | ЬУ® | С1и | Туз | ТЬг |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| С1у | РГО | Мео | Ьу® | <31и | 11е | Азп | Ъеи | А1а | Рго | Азр | Зег | Зег | Зег | Уа1 | Уа1 |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| νβΐ | Зег | 61У | Ьеи | МЫ | Уа1 | А1а | ТЬг | Ъуз | Туг | 61и | Уа1 | Зег | νπ | Туг | А1а |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Ьеи | Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд | Рго | А1а | 61п | 61у | Уа1 | Уа1 | ТЬг | ТЬг |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Ьеи | С1и | Аз η | Уа1 | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд | А1а | Агд | Уа1 | ТЬг | Азр | А1а | ТЬг |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| 61и | ТЬг | ТЬг | Т1е | ТЬг | Не | Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | С1и | ТЬг | Не | ТЬг |
| 335 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| 61У | РЬе | Е1п | Уа1 | Азр | А1а | Уа1 | Рго | А1а | Азп | С1у | 61п | ТЬг | Рго | Не | 61п |
- 52 016168
405 410 415
| Агд | ТНг | Не | Буз 420 | Рго | Азр | Уа1 | Агд | Зег 425 | Туг | ТНг | 11е | ТНг | 61у 430 | Беи | 61п |
| Рго | 61у | ТНг | Азр | Туг | Буз | 11е | Туг | Беи | Туг | ТНг | Беи | Аз η | Азр | Аз η | А1а |
| 4 35 | 440 | 445 | |||||||||||||
| Агд | бег | Зег | Рго | Уа1 | 7а1 | Не | Азр | А1а | Зег | ТНг | А1а | 11е | Азр | А1а | Рго |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Бег | Азп | Беи | Агд | РЬе | Беи | А1а | ТНг | ТНг | Рго | Азп | Зег | Беи | Беи | Уа1 | Зег |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Тгр | С1п | Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | 11е | ТНг | 61у | Туг | 11е | 11е | Буз | Туг | 61и |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| Ьуз | Рго | 61у | Зег | Рго | Рго | Агд | 61и | Уа1 | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | 61у |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| νβΐ | ТНг | 61и | А1а | ТНг | 11е | Т1и | 61у | Беи | 61 и | Рго | С1у | ТНг | С1и | Туг | ТНг |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| Не | Туг | Уа1 | Не | АТа | Беи | Буз | Аз η | Азп | 61п | Буз | Зег | 61и | Рго | Беи | Не |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| С1у | Агд | Буе | Буз | ТНг | Азр | С1и | Беи | Рго | 61п | Беи | Уа1 | ТНг | Беи | Рго | Низ |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| Рго | Аз η | Беи | ΗΪ2 | 61у | Рго | 61и | 11е | Беи | Азр | Уа1 | Рго | Зег | ТНг |
565 570 <210> 14 <211> 302 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
| <22: | 3> < | фрагмент | фибронектина, называемый С-' | 331 | |||||||||||
| <400> | 14 | ||||||||||||||
| Рго | ТНг | Азр | Беи | Агд | РНе | ТНг | Азп | 11е | 61у | Рго | Азр | ТНг | Ме1: | Агд | Уа1 |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| ТНг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | Не | Азр | Беи | ТНг | Азп | РНе | Беи | νβΐ | Агд |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Туг | Зег | Рго | Уа1 | Буз | Азп | 61и | 6111 | Азр | Уа1 | А1а | С1и | Беи | Зег | 11е | Зег |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | νβΐ | Уа1 | Беи | ТНг | Азп | Беи | Беи | Рго | С1у | ТНг | 61и |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Бег | Уа1 | Туг | 61и | С1п | Нйз | 61и | Зег | ТНг | Рго |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Беи | Агд | С1у | Агд | 61п | Буз | ТНг | 61у | Беи | Азр | Зег | Рго | ТНг | 61у | 11е | Азр |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| РНе | Зег | Азр | Не | ТНг | АТа | Азп | Зег | РНе | ТНг | Уа1 | НТз | Тгр | Не | АТа | Рго |
| 100 | 105 | НО |
- 53 016168
| Агд | А1а | ТЬх 115 | Не | ТЬг | Й1у | Туг | Агд 120 | 11е | Агд | Нгз | Я1в | Рго 125 | □1и | Ηίε | РЬе |
| Зег | С1у | Агд | Рго | Агд | б!и | Азр | Агд | Уа1 | Рго | Н13 | Зег | Агд | Азп | Зег | Не |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| ТЬг | Ьеи | ТЬг | Аз η | Ьеи | ТЬг | Рго | С1у | ТЬг | С1и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Уа1 |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| А1а | Ьеи | Азп | С1у | Агд | С1и | С1и | Бег | Рго | Ьеи | Ьеи | 11е | С1у | 61п | 61п | Зег |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | Бег | Азр | Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | 61и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| ТЬг | Зег | Ьеи | Ьеи | Не | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Агд | Туг |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Туг | Агд | Не | ТЬг | Туг | 61у | 61и | ТЬг | 61у | 61у | Азп | Бег | Рго | Уа1 | С1п | С1и |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| РЬе | ТЬг | Уа1 | Рго | С1у | Бег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | 11е | Зег | 61 у | Ьеи | Ьуз |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | 61У | Уа1 | Аэр | Туг | ТЬг | Т1е | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | 61у | Агд | <31у |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Аэр | Бег | Рго | А1а | Бег | Зег | Ьуз | Рго | Не | Бег | 11е | Азп | Туг | Агд | ТЬг | <51и |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Не | Азр | Ьуз | Рго | Зег | Азр | С1и | Ьеи | Рго | С1п | Ьеи | Уа1 | ТЬг | Ьеи | Рго | Из |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Рго | Азп | Ьеи | Н13 | 61у | Рго | 61и | Не | Ьеи | Азр | Уа1 | Рго | Бег | ТЬг |
290 295 300 <210> 15 <211> 658 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый СН-296Ыа <400> 15
| Ме£ 1 | Рго | ТЬг | Азр | Ьеи 5 | Агд | РЬе | ТНг Азп | Не 10 | 61у | Рго Азр | ТЬг | МеЬ 15 | Агд | ||
| νθι | ТЫ | Тгр | А1а | РгО | Рго | Рго | Зег | 11е | Азр | Ьеи | ТЬг | Азп | РЬе | Ьеи | Уа1 |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Агд | Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | 61и | 61и | Азр | Уа1 | А1а | 61и | Ьеи | Зег | Не |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЫ | Азп | Ьеи | Ьеи | Рго | 61у | ТЬг |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | 61и | 61п | Н1з | 61 и | Зег | ТЬг |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Рго | Ьеи | Агд | 61у | Агд | С1п | Ьуз | ТЬг | 61у | Неи | Азр | Зег | Рго | ТНг | 61 у | Не |
| 85 | 90 | 95 |
- 54 016168
| Азр | РНе | Зег | Азр 100 | 11е | ТНг А1а | Азп | Зег 105 | РНе | ТНг | Уа1 | Н13 | Тгр НО | Не | А1а |
| Рго | Агд | А1а | ТНг | Пе | ТНг 61у | Туг | Агд | Не | Агд | Н1з | Н15 | Рго | С1и | Н13 |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||
| РНе | Зег | С1у | Агд | Рго | Агд С1и | Азр | Агд | Уа1 | Рго | Н1з | Зег | Агд | Азп | Зег |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||
| Не | ТНг | Ьеи | ТНг | Азп | Ьеи ТНг | Рго | С1у | ТНг | 01и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | 11е |
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||
| Уа1 | А1а | Леи | Азп | Е1у | Агд С1и | С1и | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | 11е | С1у | С1п | С1п |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||
| Зег | ТНг | Уа1 | Зег | Азр | Уа1 Рго | Агд | Аэр | Ьеи | С1и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТНг |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||
| Рго | ТНг | Зег | Неи | Ьеи | 11е Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТНг | Уа1 | Агд |
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||
| Туг | Туг | Агд | 11е | ТНг | Туг 61у | 61и | ТНг | С1у | С1у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | Й1П |
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||||
| 61и | РНе | ТНг | Уа1 | Рго | С1у Зег | Ьуз | Зег | ТНг | А1а | ТНг | 11е | Зег | С1у | Ьеи |
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||
| Ьуз | Рго | С1у | Уа1 | Азр | Туг ТНг | 11е | ТНг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТНг | С1у | Агд |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| Й1у | Азр | Зег | Рго | А1а | Зег Зег | Ьуз | Рго | Не | Зег | Не | Азп | Туг | Агд | ТНг |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| 01и | 11е | Азр | Ьуз | Рго | Зег 61п | Ме! | С1п | Уа1 | ТНг | Азр | νβΐ | С1п | Азр | Азп |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||
| Зег | Ые | Зег | Уа1 | Ьуз | Тгр Ьеи | Рго | Зег | Зег | Зег | Рго | Уа1 | ТНг | С1у | Туг |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||
| Агд | Уа1 | ТНг | ТНг | ТНг | Рго Ьуз | Азп | 61у | Рго | 61у | Рго | ТНг | Ьуз | ТНг | Ьуз |
| 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||
| ТЫ | А1а | С1у | Рго | Азр | С1п ТНг | С1и | Ме! | ТНг | 11е | С1и | С1у | Ьеи | С1п | Рго |
| 325 | 330 | 335 | ||||||||||||
| ТНг | Уа1 | С1и | Туг | Уа1 | Уа1 Зег | Уа1 | Туг | А1а | 61п | Азп | Рго | Зег | С1у | С1и |
| 340 | 345 | 350 | ||||||||||||
| Зег | <31п | Рго | Ьеи | Уа1 | С1п ТНг | А1а | Уа1 | ТНг | А1а | 11е | Рго | А1а | Рго | ТНг |
| 355 | 360 | 365 | ||||||||||||
| Азр | Неи | Ъу$ | РНе | ТНг | С1п Уа1 | ТНг | Рго | ТНг | Зег | Ьеи | Зег | А1а | С1п | Тгр |
| 370 | 375 | 380 | ||||||||||||
| ТНг | Рго | Рго | Азп | Уа1 | С1п Ьеи | ТНг | 01у | Туг | Агд | Уа1 | Агд | νβΐ | ТНг | Рго |
| 385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||
| Ьуз | С1и | Ъуз | ТНг | С1у | Рго Ме! | Ьуз | С1и | 11е | Азп | Ьеи | А1а | Ρ1Ό | Азр | Зег |
| 405 | 410 | 415 | ||||||||||||
| Зег | Зег | Уа1 | Уа1 | Уа1 | Зег 31у | Ьеи | Ме! | Уа1 | А1а | ТНг | Ьуз | Туг | Й1и | Уа1 |
| 420 | 425 | 430 | ||||||||||||
| Зег | Уа1 | Туг | А1а | Ьеи | Ьуз Азр | ТНг | Ьеи | ТНг | Зег | Агд | Рго | А1а | С1п | 61 у |
- 55 016168
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| УаЬ | Уа1 | ТЬг | ТНг | Беи | <31и | Азп | Уа1 | 5ег | Рго | Рго | Агд | Агд | АЬа | Агд | УаЬ |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| ТЬг | Азр | А1а | ТНг | 61и | ТЬг | ТЬг | 11е | ТНг | Не | Еег | Тгр | Агд | ТНг | Ьуз | ТЬг |
| 4 65 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| 61и | ТНг | 11е | ТЬг | <31у | РНе | 61п | Уа1 | Азр | А1а | УаЬ | Рго | АЬа | Азп | СЬу | СЬп |
| 485 | 4 90 | 495 | |||||||||||||
| ТНг | Рго | 11е | С1п | Агд | ТНг | Не | Ьуз | Рго | Азр | Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТЬг | 11е |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| ТНг | С1у | Теи | Й1п | Рго | 01 у | ТНг | Азр | Туг | Буз | Не | Туг | Беи | Туг | ТЬг | Ьеи |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Еег | Еег | Рго | Уа1 | УаЬ | 11е | Азр | А1а | Зег | ТЬг | АЬа |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| Не | Азр | А1а | Рго | Зег | Азп | Беи | Агд | РНе | Беи | АЬа | ТЬг | ТЬг | Рго | Азп | Зег |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| Беи | Беи | Уа1 | Еег | Тгр | 01п | Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | 11е | ТЬг | СЬу | Туг | Не |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
| 11е | Ьуз | Туг | 31и | Ьуз | Рго | С1у | Еег | Рго | Рго | Агд | 61и | Уа1 | Уа1 | Рго | Агд |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||||||
| Рго | Агд | Рго | С1у | Уа1 | ТЬг | С1и | А1а | ТЬг | 11е | ТЬг | С1у | Беи | 61и | Рго | СЬу |
| 595 | 600 | 605 | |||||||||||||
| ТНг | С1и | Туг | ТНг | Не | Туг | Уа1 | Не | А1а | Беи | Ьуз | Азп | Азп | С1п | Ьуз | Зег |
| 610 | 615 | 620 | |||||||||||||
| 61и | Рго | Беи | 11е | С1у | Агд | Ьуз | Ьуз | ТЬг | Азр | 61и | Беи | Рго | С1п | Ьеи | УаЬ |
| 625 | 630 | 635 | 64 0 | ||||||||||||
| ТНг | Беи | Рго | ΗΪ5 | Рго | Азп | Беи | Н1з | 61у | Рго | С1и | Не | Беи | Азр | УаЬ | Рго |
645 650 655
Еег ТНг <210> 16 <211> 367 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый СНУ-89 <400> 16
| Рго 1 | ТЬг | Азр | Ьеи Агд 5 | РНе | ТЬг Азп | Не | О1у Рго Азр ТЬг 10 | Меб | Агд 15 | УаЬ | |||||
| ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | Не | Азр | Беи | ТНг | Азп | РЬе | Ьеи | УаЬ | Агд |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Туг | Зег | Рго | УаЬ | Буз | Азп | 0111 | С1и | Азр | УаЬ | АЬа | 61и | Ьеи | Еег | Не | Еег |
40 45
- 56 016168
| Рго | Зег 50 | Азр | Азп А1а | Уа1 | 7а1 55 | Ьеи | ТЬг Азп | Ьеи Ьеи 60 | Рго | С1у | ТЬг | <31и | |||
| Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | С1и | С1п | Ηί3 | С1и | Зег | ТНг | Рго |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Ьеи | Агд | 61у | Агд | 61п | Ьуз | ТНг | <31 у | Ьеи | Азр | Зег | Рго | ТЬг | 61у | Не | Азр |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| РНе | Зег | Азр | Не | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе | ТНг | Уа1 | Ηί з | Тгр | Не | А1а | Рго |
| 100 | 105 | но | |||||||||||||
| Агд | А1а | ткг | Не | ТЬг | С1у | Туг | Агд | Не | Агд | Н13 | Ηίε | Рго | С1и | Н1з | РЬе |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Зег | С1у | Агд | Рго | Агд | С1и | Азр | Агд | Уа1 | Рго | Н1з | Зег | Агд | Азп | Зег | Не |
| 1зо | 135 | 140 | |||||||||||||
| ТЬг | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТНг | Рго | 61у | ТНг | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Уа1 |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| А1а | Ьеи | Азп | С1у | Агд | С1и | С1и | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | Не | С1у | 61п | 01п | Зег |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | Зег | Азр | Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | С1и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТНг | Рго |
| 180 | 185 | 1.90 | |||||||||||||
| ТНг | Зег | Ьеи | Ьеи | Не | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Ча! | ТНг | Ча! | Агд | Туг |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Туг | Агд | 11е | ТЬг | Туг | С1у | 61и | ТЬг | 61у | 01 у | Αεη | Зег | Рго | Уа1 | С1п | 61и |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| РНе | ТНг | Уа1 | Рго | 61у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТНг | Не | Зег | с;1у | Ьеи | Ьуз |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | Й1у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТНг | 01 у | Агд | С1у |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Не | Зег | Не | Азп | Туг | Агд | ТНг | 01и |
| 260 | 2 65 | 270 | |||||||||||||
| Не | Азр | Ьуз | Рго | Зег | МеЬ | Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд | А1а | Агд | Уа1 |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| ТНг | Азр | А1а | ТНг | 61и | ТЬг | ТЬг | Не | ТНг | Не | Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Ьуз | ТНг |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| С1и | ТНг | Не | ТНг | 31у | РЬе | С1п | Уа1 | Авр | А1а | Уа1 | Рго | А1а | Азп | 01 у | С1п |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| ТЬг | Рго | Не | С1п | Агд | ТНг | 11е | Ьуз | Рго | Азр | Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТНг | Не |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| ТЬг | 01у | Ьеи | С1ь | Рго | 61 у | ТНг | Азр | Туг | Ьуз | Не | Туг | Ьеи | Туг | ТНг | Ьеи |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Зег | Зег | Рго | Уа1 | Уа1 | 11е | Азр | А1а | Зег | ТНг | |
| 355 | 360 | 365 |
<210> 17 <2Η> 368 <212> БЕЛОК
- 57 016168 <213> Искусственная <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый ΟΗν-90 <400> 17
| Рго 1 | ТНг | Азр | Беи | Агд 5 | рье | ТЬг Азп | ББе | СБу Рго 10 | Азр | ТНг | Мер | Агд 15 | УаБ | ||
| ТЫ | Тгр | АБа | Рго | Рго | Рго | Зег | ББе | Азр | Беи | ТЬг | Азп | РЬе | Беи | УаБ | Агд |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Туг | Зег | Рго | УаБ | Ьуз | Азп | СБи | СБи | Азр | УаБ | АБа | СБи | Беи | Зег | Не | Зег |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Рго | Зег | Азр | Азп | АБа | УаБ | УаБ | Беи | ТЬг | Азп | Беи | Беи | Рго | СБу | ТЬг | СБи |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Туг | УаБ | УаБ | Зег | УаБ | Зег | Зег | УаБ | Туг | СБи | СБп | НБз | СБи | Зег | ТЬг | Рго |
| 65 | 70 | 75 | 00 | ||||||||||||
| Беи | Агд | СБу | Агд | <31п | Ьуз | ТЬг | СБу | Беи | Азр | Зег | Рго | ТЬг | СБу | Не | Азр |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| РНе | Зег | Азр | ББе | ТЬг | АБа | Азп | Зег | РЬе | ТЬг | УаБ | НБз | Тгр | ББе | АБа | Рго |
| 100 | 105 | ББО | |||||||||||||
| Агд | АБа | ТЬг | ББе | ТЬг | СБу | Туг | Агд | ББе | Агд | НБз | НБз | Рго | СБи | НБз | РЬе |
| Б15 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Зег | СБу | Агд | Рго | Агд | СБи | Азр | Агд | УаБ | Рго | НБз | Зег | Агд | Азп | Зег | Не |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| ТЬг | Беи | ТЬг | Азп | Беи | ТЬг | Рго | СБу | ТЬг | С1и | Туг | УаБ | УаБ | Зег | Не | УаБ |
| 145 | Б50 | 155 | 160 | ||||||||||||
| АБа | Беи | Азп | СБу | Агд | СБи | СБи | Зег | Рго | Беи | Беи | Не | СБу | СБп | СБп | Зег |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| ТЬг | УаБ | Зег | Азр | УаБ | Рго | Агд | Азр | Беи | СБи | УаБ | УаБ | АБа | АБа | ТЬг | Рго |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| ТЬг | Зег | Беи | Беи | 11е | Зег | Тгр | Азр | АБа | Рго | АБа | УаБ | ТЬг | УаБ | Агд | Туг |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Туг | Агд | Не | ТНг | Туг | СБу | СБи | ТЬг | СБу | СБу | Азп | Зег | Рго | УаБ | СБп | СБи |
| 210 | 2Б5 | 220 | |||||||||||||
| РЬе | ТЫ | УаБ | Рго | СБу | Зег | Буз | Зег | ТЬг | АБа | ТЬг | ББе | Зег | СБу | Беи | Ьуз |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | СБу | УаБ | Азр | Туг | ТЬг | ББе | ТЬг | УаБ | Туг | АБа | УаБ | ТЬг | СБу | Агд | СБу |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Азр | Зег | Рго | АБа | Зег | Зег | Ьуз | Рго | ББе | Зег | ББе | Азп | Туг | Агд | ТНг | СБи |
| 260 | 2 65 | 270 | |||||||||||||
| 11е | Азр | Буз | Рго | Зег | МеБ | АБа | Не | Азр | АБа | Рго | Зег | Азп | Беи | Агд | РЬе |
| 275 | 280 | 235 | |||||||||||||
| Беи | АБа | ТЬг | ТЬг | Рго | Азп | Зег | Беи | Беи | УаБ | Зег | Тгр | СБп | Рго | Рго | Агд |
| 290 | 295 | 300 |
| А1а 305 | Агд | Не ТНг С1у | Туг Ъ1е 310 | 11е | Ъуз | Туг С1и Ъуз 315 | Рго | 61 у | Зег | Рго 320 | |||||
| Рго | Агд | 61и | Уа1 | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | 21у | Уа1 | ТНг | 61и | А1а | ТНг |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Не | ТНг | С1у | Ъеи | С1и | Рго | С1у | ТЬг | С1и | Туг | ТНг | 11е | Туг | Уа1 | Не | А1а |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Ъеи | Ъуз | Азп | Азп | 61п | Ъуз | Зег | 61ц | Рго | Ъеи | 11е | 61у | Агд | Ъуз | Ъуз | ТНг |
355 360 365 <210> 18 <211> 370 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
| <223> | фрагмент | фибронектина, называемый СНУ-92 | |||||||||||||
| <400> | 13 | ||||||||||||||
| Рго | ТЬг | Азр | Ъеи | Агд | РНе | ТЬг | Азп | 11е | 61у | Рго | Азр | ТНг | МеН | Агд | Уа1 |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| ТНг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | Не | Азр | Ъеи | ТЬг | Азп | РНе | Ъеи | Уа1 | Агд |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ъуз | Азп | 01и | 61и | Азр | Уа1 | АЪа | 01и | Ъеи | Зег | 11е | Зег |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ъеи | ТЬг | Азп | Ъеи | Ъеи | Рго | 01у | ТЬг | 01и |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | 01и | 01п | ΗΪ5 | 61и | Зег | ТЬг | Рго |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Ъеи | Агд | С1у | Агд | 01п | Ъуз | ТЬг | С1у | Ъеи | Азр | Зег | Рго | ТЬг | 61 у | Не | Азр |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| РЬе | Зег | Азр | 11е | ТНг | А1а | Азп | Зег | РНе | ТЬг | Уа1 | Н1з | Тгр | Не | А1а | Рго |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Агд | А1а | ТНг | 11е | ТНг | С1у | Туг | Агд | 11е | Агд | Н1з | Н1з | Рго | 61и | Н1з | РНе |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Зег | С1у | Агд | Рго | Агд | 61и | Азр | Агд | Уа1 | Рго | Ηί3 | Зег | Агд | Азп | Зег | 11е |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| ТНг | Ъеи | ТЬг | ЙЗП | Ъеи | ТНг | Рго | 61у | ТНг | С1и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Уа1 |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| А1а | Ъеи | Азп | 61у | Агд | 61и | 61 и | Зег | Рго | Ъеи | Ъеи | 11е | 61у | С1п | 61п | Зег |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| ТНг | Уа1 | Зег | Азр | Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ъеи | 0111 | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| ТНг | Зег | Ъеи | Ъеи | Не | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТНг | Уа1 | Агд | Туг |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Туг | Агд | 11е | ТЬг | Туг | 61у | 61и | ТНг | 61у | 01у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | 01п | 61и |
| 210 | 215 | 220 |
- 59 016168
| РНе 225 | ТНг | Уа1 | Рго | 61у | Зег 230 | Буз | Зег | ТНг | А1а | ТНг 235 | Т1е | Зег | С1у Ъеи | Буз 240 | |
| Рго | С1у | Уа1 | Азр | Тух | ТНг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТНг | 61у | Агд | С1у |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Буз | Рго | Не | Зег | Не | Азп | Туг | Агд | ТЬг | 61и |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| 11е | Азр | Буз | Рго | Зег | МеБ | А1а | Не | Рго | А1а | Рго | ТНг | Азр | Беи | Буз | РНе |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| ТНг | 61п | Уа1 | ТЬг | Рго | ТНг | Зег | Беи | Зег | А1а | 61П | Тгр | ТЬг | Рго | Рго | Азп |
| 2 90 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Уа1 | О1п | Беи | ТЬг | 61у | Туг | Агд | Уа1 | Агд | Уа1 | ТНг | Рго | Буз | 61и | Буз | ТНг |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| 61у | Рго | Меб | Буз | 61и | Не | Азп | Беи | А1а | Рго | Азр | Зег | Зег | Зег | Уа1 | Уа1 |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Уа1 | Зег | 61 у | Беи | Ме! | Уа1 | А1а | ТНг | Буз | Туг | 61и | Уа1 | Зег | Уа1 | Туг | А1а |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Беи | Буз | Азр | ТЬг | Беи | ТЬг | Зег | Агд | Рго | А1а | 61п | С1у | Уа1 | Уа1 | ТНг | ТЬг |
355 360 365
Бец 61и
370 <210> 19 <211> 457 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
| <223> , | фрагмент | фибронектина, называемый СНУ-179 | |||||||||||||
| <400> | 19 | ||||||||||||||
| Рго | ТЬг | Азр | Беи | Агд | РЬе | ТЬг | Азп | Не | 61у | Рго | Азр | ТЬг | Меб | Агд | Уа1 |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| ТНг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | 11е | Азр | Беи | ТНг | Азп | РНе | Беи | Уа1 | Агд |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Туг | Зег | Рго | Уа1 | Буз | Азп | 61и | С1и | Азр | Уа1 | А1а | 61и | Беи | Зег | 11е | Зег |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Беи | ТЬг | Азп | Беи | Беи | Рго | 61 у | ТЬг | 61и |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | 61и | 61п | Нхз | 61и | Зег | ТНг | Рго |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Беи | Агд | 61 у | Агд | 61п | Буз | ТЬг | 61у | Беи | Азр | Зех | Рго | ТИх | 61у | Не | Азр |
| 05 | 90 | 95 | |||||||||||||
| РНе | Зег | Азр | Не | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе | ТЬг | Уа1 | ΗΪ8 | Тхр | Не | А1а | Рхо |
| 100 | 105 | НО | |||||||||||||
| Агд | А1а | ТЬг | 11е | ТЬг | 61 у | тух | Агд | Не | Агд | Нхз | Н13 | Рго | 61и | Нхз | РЬе |
| 115 | 120 | 125 |
- 60 016168
| Зег | С1у Агд 130 | Рго | Агд | С1и Азр 135 | Агд | Уа1 | Рго | Ηίδ | Зег 140 | Агд | Азп | 5ег | Не | ||
| ТЬг | Беи | ТЬг | Азп | Беи | ТЬг | Рго | С1у | ТЬг | С1и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Уа1 |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| А1а | Беи | Азп | С1У | Агд | С1и | С1и | Зег | Рго | Беи | Ъец | Не | С1у | 61п | С1п | Зег |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | Зег | Азр | 7а1 | Рго | Агд | Азр | Беи | С1и | У£1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Ргс |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| ТЬг | Зег | Беи | Ъеи | Не | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Агд | Туг |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Туг | Агд | Не | ТЬг | Туг | С1у | С1и | ТЬг | С1у | С1у | АЗП | Зег | Рго | Уа1 | С1п | С1и |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| РЬе | ТЬг | Уа1 | Рго | С1у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | Не | Зег | Е1 у | Ьеи | Ьуз |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | С1у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | С1у | Агд | С1у |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Не | Зег | Пе | Азп | Туг | Агд | ТЬг | |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Не | Азр | Буз | Рго | Зег | МеЬ | Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд | А1а | Агд | Уа1 |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| ТЬг | Азр | А1а | ТЬг | 61и | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬп | Не | Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Ъуз | ТЬг |
| 2 90 | 295 | 300 | |||||||||||||
| С1и | ТЬг | Не | ТЬг | С1у | РЬе | С1п | Уа1 | Азр | А1а | Уа1 | Рго | А1а | Азп | 61 у | 61п |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| ТЬг | Рго | 11е | С1п | Агд | ТЬг | Не | Ьуз | Рго | Азр | Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТЬг | Не |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| ТЬг | С1у | Беи | ΰΐη | Рго | С1у | ТЬг | Азр | Туг | Ьуз | Не | Туг | Беи | Туг | ТЬг | Ъеи |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Зег | Зег | Рго | Уа1 | Уа1 | Пе | Азр | А1а | Зег | ТЬг | А1а |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| 11е | Азр | А1а | Рго | Зег | Азп | Ьеи | Агд | №е | Ьеи | А1а | ТЬг | ТЬг | Рго | Азп | Бег |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Ьеи | Беи | Уа1 | Зег | Тгр | 21п | Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | 11е | ТЬг | С1у | Туг | 11е |
| 335 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Не | Буз | Туг | С1и | Ьуз | Рго | <31у | 5ег | Рго | Рго | Агд | С1и | Уа1 | Уа1 | Рго | Агд |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Рго | Агд | Рго | С1у | Уа1 | ТЬг | ΰΐυ | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | С1у | Беи | Я1и | Рго | 61у |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| ТЬг | <31и | Туг | ТЬг | Не | Туг | Уа1 | Не | А1а | Ъеи | Ъуз | Азп | Азп | С1п | Ьуз | Зег |
| 435 | 440 | 445 |
С1и Рго Беи Не С1у Агд Буз Буз ТНг
450 455 <210> 20 <211> 459 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый СНУ-181 <400> 20
| Рго ТЬг 1 | Азр Ъеи | Агд 5 | РЬе | ТЬг Азп | Не | 61у 10 | Рго | Азр | ТЬг | Меб | Агд 15 | Уа1 | |||
| ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | Не | Азр | Беи | ТЬг | Азп | РНе | Беи | Уа1 | Агд |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Туг | Зег | Рго | Уа1 | Буз | Азп | С1и | 61и | Азр | Уа1 | А1а | <31и | Беи | Зег | Не | Зег |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Беи | ТЬг | Азп | Беи | Беи | Рго | С1у | ТЬг | С1и |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | С1и | 61п | Нтз | С1и | Зег | ТЬг | Рго |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Беи | Агд | 61 у | Агд | 61п | Буз | ТЬг | 61у | Беи | Азр | Зег | Рго | ТЬг | С1у | Не | Азр |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| РЬе | Зег | Азр | Не | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе | ТЬг | Уа1 | Н1з | Тгр | Не | А1а | Рго |
| 100 | 105 | НО | |||||||||||||
| В ν-τ лх у | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | 61 у | ~·.· * л. | Агд | Не | Г, V--, ' ... 3 | Нхз | НБз | С1и | ΙΤή β | РЬе | |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Зег | 61у | Агд | Рго | Агд | 61и | Азр | Агд | Уа1 | Рго | Н1з | Зег | Агд | Азп | Зег | Не |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| ТЬг | Беи | ТЬг | Азп | Беи | ТНг | Рго | 61у | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Уа1 |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| А1а | Беи | Азп | С1у | Агд | 61 и | С1и | Зег | Рго | Беи | Беи | Не | 61у | С1п | 61п | Зег |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | Зег | Азр | Уа1 | Рго | Агд | Азр | Беи | 61и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| ТЬг | Зег | Беи | Беи | Не | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Агд | Туг |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Туг | Агд | 11е | ТНг | Туг | Б1у | 61и | ТЬг | 61у | 61у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | Б1п | 61и |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| РЬе | ТЬг | Уа1 | Рго | 61у | Зег | Буз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | Не | Зег | 61у | Беи | Буз |
| 225 | 230 | 2 35 | 240 | ||||||||||||
| Рго | Б1у | Уа1 | Аар | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | С1у | Агд | С1у |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Буз | Рго | 11е | Зег | 11е | Азп | Туг | Агд | ТЬг | 61и |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| 11е | Азр | Буз | Рго | Зег | Меб | А1а | Не | Рго | А1а | Рго | ТЬг | Азр | Беи | Буз | РЬе |
| 275 | 280 | 285 |
- 62 016168
| ТНг | С1п Уа1 290 | ТНг | Рго | ТЬг | Зег 295 | Ьеи | Зег | А1а | С1п | Тгр 300 | ТНг | Рго | Рго | Азп |
| Уа1 | 61п Ьеи | ТЬг | С1у | Туг | Агд | Уа1 | Агд | Уа1 | ТНг | Рго | Ьуз | С1и | Ьуз | ТЬг |
| 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||
| 61у | Рго Мер | Ьуз | 61и | Не | Азп | Ьеи | А1а | Рго | Азр | Зег | Зег | Зег | Уа1 | 7а1 |
| 325 | 330 | 335 | ||||||||||||
| Уа1 | Зег 61у | Ьеи | Мер | Уа1 | А1а | Т11г | Ьуз | Туг | С1и | Уа1 | Зег | Туг | А1а | |
| 340 | 345 | 350 | ||||||||||||
| Ьеи | Ьуз Азр | ТНг | Ьеи | ТНг | Зег | Агд | Рго | А1а | <31п | С1у | Уа1 | Уа1 | ТНг | ТНг |
| 355 | 360 | 365 | ||||||||||||
| Ьеи | О1и Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд | А1а | Агд | Уа1 | ТЬг | Азр | А1а | ТНг |
| 370 | 375 | 380 | ||||||||||||
| 61и | ТНг ТЬг | 11е | ТНг | Не | Зег | Тгр | Агд | ТНг | Ьуз | ТЬг | 61и | ТЬг | 11е | ТЬг |
| 385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||
| 61у | РНе 61п | Уа1 | Азр | А1а | Уа1 | Рго | А1а | Азп | 61у | 61п | ТНг | Рго | Не | 61п |
| 405 | 410 | 415 | ||||||||||||
| Агд | ТНг Не | Ьуз | Рго | Азр | Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТЬг | 11е | ТЬг | С1у | Ьеи | 61п |
| 420 | 425 | 430 | ||||||||||||
| Рго | С1у ТНг | Азр | Туг | Ьуз | 11е | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи | Азп | Азр | Азп | А1а |
| 435 | 440 | 445 | ||||||||||||
| Агд | Зег Зег | Рго | Уа1 | Уа1 | Не | Азр | А1а | Зег | ТЬг |
450 455 <210> 21 <211> 276 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> фрагмент фибронектина, называемый Η-275-Суз <400> 21
| МеЬ 1 | А1а А1а | Зег | А1а 5 | Не | Рго А1а | Рго ТЬг Азр 10 | Ьеи | Ьуз | РНе | ТЬг 15 | С1п | ||||
| Уа1 | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи | Зег | А1а | 61п | Тгр | ТЬг | Рго | Рго | Азп | Уа1 | С1п |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Ьеи | ТЬг | 61у | Туг | Агд | Уа1 | Агд | Уа1 | ТЬг | Рго | Ьуз | 61и | Ьуз | ТНг | 61у | Рго |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Неб | Ьуз | 61и | 11е | Азп | Ьеи | А1а | Рго | Азр | Зег | Зег | Зег | Уа1 | Уа1 | Уа1 | Зег |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Й1у | Ьеи | МеЬ | Уа1 | А1а | ТНг | Ьуз | Туг | 61и | Уа1 | Зег | Уа1 | Туг | А1а | Ьеи | Ьуз |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Азр | ТЬг | Ьеи | ТНг | Зег | Агд | Рго | А1а | 61п | 61у | Уа1 | Уа1 | ТНг | ТНг | Ьеи | С1и |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд | А1а | Агд | Уа1 | ТНг | Азр | А1а | ТЬг | 61и | ТЬг |
| 100 | 105 | НО |
- 63 016168
| ТНг | Не | ТНг 115 | Не | Зег | Тгр | Агд | ТНг 120 | Ьуз | ТНг | 61и | ТНг | 11е 125 | ТНг | С1у | РНе |
| С1п | УаЬ | Азр | А1а | Уа1 | Рго | А1а | Азп | 61у | <31п | ТНг | Рго | Не | <31п | Агд | ТНг |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Не | Ьуз | Рго | Азр | Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТНг | Не | ТНг | С1у | Ьеи | с1п | Рго | С1у |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| ТНг | Азр | Туг | Ьуз | Не | Туг | Ьеи | Туг | ТНг | Ьеи | Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Зег |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Бег | Рго | Уа1 | Уа1 | Не | Азр | А1а | Зег | ТНг | А1а | Не | Азр | А1а | Рго | Бег | Азп |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Ьеи | Агд | РЬе | Ьеи | А1а | ТНг | ТНг | Рго | Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | Уа1 | Зег | Тгр | (31п |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | Не | ТНг | (Ну | Туг | Не | Не | Ьуз | Туг | (Ни | Ьуз | Рго |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| (31у | Зег | Рго | Рго | Агд | (Ии | Уа1 | Уа1 | Рхо | Агд | Рго | Агд | Рго | С1у | Уа1 | ТНг |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| 51и | А1а | ТНг | Не | ТЬг | С1у | Ьеи | С1и | Рго | С1у | ТНг | (Ни | Тух | ТНг | Не | Туг |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Уа1 | Не | А1а | Ьеи | Ьуз | Агп | Азп | С1п | Ьуз | Зег | <31 и | Рго | Ьеи | 11е | СНу | Агд |
260 265 270
Ьуз Ьуз ТНг Суз
275 <210> 22 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> эпитоп пептида, полученного из антигена МАНТ-1 <400>22
Й1и Ьеи А1а 61у Не 61у Не Ьеи ТНг Уа1
1510 <210>23 <211>574 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> фрагмент фибронектина мыши, называемый СН-296 <400> 23
| Рго ТНг Азр Ьеи 1 | Агд 5 | РНе | ТН.Г Азп | Не С1у 10 | Рго Азр ТНг МеЬ | Агд Уа1 15 | ||||||||
| ТНг | Тгр А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | Не | (Ли | Ьеи | ТНг | Азп | Ьеи | Ьеи | Уа1 | Агд |
25 30
- 64 016168
| Туг | Зег | Рго 35 | УаБ | Буз | Азп | СБи | СБи 40 | Азр | УаБ | АБа | СБи | Беи 45 | Зег | Не | Зег |
| Рго | Зег | Азр | Азп | АБа | УаБ | УаБ | Беи | ТЬг | Азп | Беи | Беи | Рго | СБу | ТЬг | СБи |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Туг | Беи | УаБ | Зег | УаБ | Зег | Зег | УаБ | Туг | СБи | СБп | НБз | СБи | Зег | Не | Рго |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Беи | Агд | СБу | Агд | СБп | Буз | ТЬг | СБу | Беи | Азр | Зег | Рго | ТЬг | СБу | РЬе | Авр |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Зег | Зег | Азр | ББе | ТЬг | АБа | Азп | Зег | РЬе | ТЬг | УаБ | НБз | Тгр | УаБ | АБа | Рго |
| 100 | 105 | 1Б0 | |||||||||||||
| Агд | АБа | Рго | Не | ТЬг | СБу | Туг | Не | Не | Агд | НБз | НБз | АБа | СБи | НБз | Зег |
| Б15 | 120 | 125 | |||||||||||||
| УаБ | СБу | Агд | Рго | Агд | СБп | Азр | Агд | УаБ | Рго | Рго | Зег | Агд | Азп | Зег | Не |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| ТЬг | Беи | ТЬг | Азп | Беи | Азп | Рго | СБу | ТЬг | СБи | Туг | УаБ | УаБ | Зег | Не | Не |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| АБа | УаБ | Азп | СБу | Агд | СБи | СБи | Зег | Рго | Рго | Беи | Не | СБу | СБп | СБп | АБа |
| 165 | Б70 | 175 | |||||||||||||
| ТЬг | УаБ | Зег | Азр | Не | Рго | Агд | Азр | Беи | СБи | УаБ | Не | АБа | Зег | ТЬг | Рго |
| 180 | 185 | ] 90 | |||||||||||||
| ТЬг | Зег | Беи | Беи | Не | Зег | Тгр | СБи | Рго | Рго | АБа | УаБ | Зег | УаБ | Агд | Туг |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Туг | Агд | ББе | ТЬг | Туг | СБу | СБи | ТНг | СБу | СБу | Азп | Зег | Рго | УаБ | СБп | СБи |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| РЬе | ТЬг | УаБ | Рго | СБу | Зег | Буз | Зег | ТЬг | АБа | ТЬг | Не | Азп | Азп | Не | Буз |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | СБу | АБа | Азр | Туг | ТЬг | Т1е | ТЬг | Беи | Туг | АБа | УаБ | ТЫ | СБу | Агд | СБу |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Азр | Зег | Рго | АБа | Зег | Зег | Буз | Рго | УаБ | Зег | Не | Азп | Туг | Буз | ТЬг | СБи |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Не | Азр | Буз | Рго | Зег | Мер | АБа | Не | Рго | АБа | Рго | ТЫ | Азп | Беи | Буз | РНе |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Зег | СБп | УаБ | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | РЬе | ТЬг | АБа | С1п | Тгр | Не | АБа | Рго | Зег |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| УаБ | СБп | Беи | ТЬг | СБу | Туг | Агд | УаБ | Агд | УаБ | Азп | Рго | Буд | СБи | Буз | ТЬг |
| 305 | ЗБО | 315 | 320 | ||||||||||||
| СБу | Рго | Мер | Буз | СБи | ББе | Азп | Беи | Зег | Рго | Азр | Зег | Зег | Зег | УаБ | ББе |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| УаБ | Зег | СБу | Беи | МеБ | УаБ | АБа | ТЬг | Буз | Туг | СБи | УаБ | Зег | УаБ | Туг | АБа |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Беи | Буз | Азр | ТЬг | Беи | ТЬг | Зег | Агд | Рго | АБа | СБп | СБу | УаБ | Не | ТЬг | ТЬг |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Беи | СБи | Азп | УаБ | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд | АБа | Агд | УаБ | ТЬг | Азр | АБа | ТЬг |
- 65 016168
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| С1и | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | Не | Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | С1и | ТЬг | Не | ТЬг |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| 61у | РЬе | С1п | Уа1 | Αερ | А1а | 11е | Рго | А1а | Азп | 31у | 61п | ТЬг | Рго | Уа1 | 31п |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Агд | Зег | Не | 5ег | Рго | Азр | Уа1 | Агд | 5ег | Туг | ТЬг | 11е | ТЬг | С1у | Ьеи | С1п |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Рго | СЬу | ТЬг | Азр | Туг | Ьуз | 11е | Н13 | Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи | Азп | Азр | Азп | А1а |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| Агд | Зег | 5ег | Рго | Уа1 | 11е | Ые | Азр | А1а | Зег | ТЬг | А1а | Не | Азр | А1а | Рго |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Зег | Азп | Ьеи | Агд | РЬе | Ьеи | ТЬг | ТЬг | ТЬг | Рго | Айп | Зег | Ьеи | Оеи | 7а1 | 5ег |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Тгр | 61 п | А1а | Рго | Агд | А1а | Агд | 11е | ТЬг | <31у | Туг | Не | Не | Ьуз | Туг | С1и |
| 485 | 490 | 4 95 | |||||||||||||
| Ьуз | Рго | С1у | Зег | Рго | Рго | Агд | С1и | νβΐ | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | С1у |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| Уа1 | ТЬг | С1и | А1а | ТЬг | Пе | ТЬг | С1у | Ьеи | СЬи | Рго | С1у | ты | С1и | Туг | ТЬг |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| Не | Туг | Уа1 | Пе | А1а | Ьеи | Ьуз | Азп | Азп | 61п | Ьуз | Еег | £1ц | Рго | Ьеи | Не |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| С1у | Агд | Ьу5 | Ьуз | ТЫ | А$р | 61и | Ьеи | Рго | 61п | Ьеи | Уа1 | ТЬг | Ьеи | Рго | Н1з |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| Рго | Азп | Ьеи | ΗΪ5 | 61 у | Рго | 61и | 11е | Ьеи | Азр | Уа1 | Рго | 5ег | ТЬг | ||
| 565 | 570 |
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Claims (19)
1. Способ получения Т-клеточной популяции, в которой Т-клетки экспрессируют СБ45КА и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СБ62Ь, ССК7, СБ27 и СБ28, включающий стадию культивирования клеточной популяции, содержащей Т-клетки, в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси и в присутствии лиганда СБ3, причем экспрессия полученными Т-клетками СБ45КА и по меньшей мере одного маркера, выбранного из группы, состоящей из СБ62Ь, ССК7, СБ27 и СБ28, на 5% или более превышает таковую Т-клетками, полученными в случае их культивирования в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси.
2. Способ по п.1, где культивирование Т-клеточной популяции проводят в течение 4-14 дней.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что стадия культивирования в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси составляет по меньшей мере один день или более.
4. Способ по любому из пп.1-3, где лиганд СБ3 представляет собой антитело к СБ3.
5. Способ по любому из пп.1-4, где фрагмент фибронектина представляет собой полипептид, включающий по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей 8Е0 Ш NΟ: 1-8, 13 списка последовательностей, или полипептид, включающий по меньшей мере одну из указанных последовательностей с заменой, делецией, вставкой или добавлением одной или более аминокислот, обладающий теми же самыми свойствами, что и исходный полипептид.
6. Способ по любому из пп.1-5, дополнительно включающий выделение клеточной популяции, которая экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СБ45КА, СБ62Ь, ССК7, СБ27 и СБ28.
7. Способ по любому из пп.1-6, дополнительно включающий стадию трансдукции чужеродного гена в клетки полученной клеточной популяции.
8. Способ по п.7, где чужеродный ген трансдуцируют с помощью ретровирусного вектора, аденовирусного вектора, аденоассоциированного вирусного вектора, лентивирусного вектора или вектора на основе вируса обезьян.
9. Т-клеточная популяция, полученная способом по любому из пп.1-8, где Т-клеточная популяция экспрессирует СБ45КА и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из СБ62Ь, ССК7, СБ27 и СБ28.
10. Лекарственное средство для иммунотерапии, включающее в качестве эффективного ингредиента Т-клеточную популяцию, полученную способом по любому из пп.1-8.
11. Способ лечения или предотвращения рака, лейкемии, злокачественной опухоли, гепатита или инфекционных заболеваний, включающий стадию введения субъекту эффективного количества Т
- 66 016168 клеточной популяции, полученной способом по любому из пп.1-8.
12. Применение Т-клеточной популяции, полученной способом по любому из пп.1-8, в производстве лекарственного средства для иммунотерапии.
13. Способ приготовления стимулированной Т-клеточной популяции, отличающийся тем, что способ включает в себя стадию стимулирования Т-клеточной популяции, полученной способом по любому из пп.1-8, по меньшей мере одним стимулирующим фактором, выбранным из группы, состоящей из клетки, способной презентировать антиген, клетки, презентировавшей антиген, антигена, лиганда СЭ3, лиганда СЭ28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин.
14. Т-клеточная популяция, полученная способом по п.13.
15. Лекарственное средство для иммунотерапии, включающее в качестве активного ингредиента Тклеточную популяцию, полученную способом по п.13.
16. Способ лечения или предотвращения рака, лейкемии, злокачественной опухоли, гепатита или инфекционных заболеваний, включающий стадию введения субъекту эффективного количества Тклеточной популяции, полученной способом по п.13.
17. Применение Т-клеточной популяции, полученной способом по п.13, в производстве лекарственного средства для иммунотерапии.
18. Лекарственное средство для иммунотерапии, включающее:
(а) препарат, содержащий в качестве эффективного ингредиента Т-клеточную популяцию, полученную способом по любому из пп.1-8; и (б) препарат, содержащий в качестве эффективного ингредиента по меньшей мере один стимулирующий фактор, выбранный из группы, состоящей из клетки, способной презентовать антиген, клетки, презентировавшей антиген, антигена, лиганда СЭ3, лиганда СЭ28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин, где указанные препараты включены в лекарственное средство в виде двух отдельных препаратов, вводимых совместно или раздельно.
19. Способ лечения рака, лейкемии, злокачественной опухоли, гепатита или инфекционных заболеваний, включающий следующие стадии (а) и (б):
(а) введение пациенту Т-клеточной популяции, полученной способом по любому из пп.1-8; и (б) введение пациенту по меньшей мере одного стимулирующего фактора, выбранного из группы, состоящей из клетки, способной презентовать антиген, клетки, презентировавшей антиген, антигена, лиганда СЭ3, лиганда СЭ28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005288983 | 2005-09-30 | ||
| JP2006102103 | 2006-04-03 | ||
| JP2006196950 | 2006-07-19 | ||
| JP2006241773 | 2006-09-06 | ||
| PCT/JP2006/319105 WO2007040105A1 (ja) | 2005-09-30 | 2006-09-27 | Ｔ細胞集団の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200800996A1 EA200800996A1 (ru) | 2008-08-29 |
| EA016168B1 true EA016168B1 (ru) | 2012-02-28 |
Family
ID=37906148
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200800996A EA016168B1 (ru) | 2005-09-30 | 2006-09-27 | Способ получения т-клеточной популяции и ее применение |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20100068192A1 (ru) |
| EP (1) | EP1939278A4 (ru) |
| JP (1) | JP5156382B2 (ru) |
| KR (1) | KR101408565B1 (ru) |
| CN (1) | CN101400785B (ru) |
| AU (1) | AU2006298188B2 (ru) |
| CA (1) | CA2623735A1 (ru) |
| EA (1) | EA016168B1 (ru) |
| HK (1) | HK1130509A1 (ru) |
| TW (1) | TW200741001A (ru) |
| WO (1) | WO2007040105A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2761557C2 (ru) * | 2015-10-22 | 2021-12-09 | Джуно Терапьютикс Гмбх | Способы культивирования клеток и наборы и устройство для них |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090024782A (ko) * | 2006-06-09 | 2009-03-09 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 림프구의 제조 방법 |
| JPWO2008143014A1 (ja) * | 2007-05-11 | 2010-08-05 | タカラバイオ株式会社 | がん治療剤 |
| JPWO2008143255A1 (ja) * | 2007-05-22 | 2010-08-12 | タカラバイオ株式会社 | 細胞集団の製造方法 |
| CA2687688C (en) * | 2007-05-23 | 2017-03-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for increased transgene expression in t cells |
| EP2267118A4 (en) * | 2008-03-27 | 2013-08-28 | Takara Bio Inc | METHOD FOR PRODUCING A TRANSFICED CELL |
| CN101831434B (zh) * | 2009-07-27 | 2012-05-09 | 浙江大学 | 抗人cd45ra鼠免疫球蛋白可变区基因及用途 |
| CN101706507B (zh) * | 2009-07-27 | 2013-05-01 | 浙江大学 | 用异硫氰酸荧光素标记的抗人cd45ra单抗的应用 |
| EP2476752A4 (en) | 2009-09-11 | 2013-04-03 | Takara Bio Inc | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF NATURAL KILLER CELLS |
| BR112014020499A2 (pt) * | 2012-02-22 | 2019-09-24 | Univ Pennsylvania | sequência de ácido nucleico isolada, célula - t, vetor, e, população persistente de células - t |
| CN104411316B (zh) | 2012-05-09 | 2018-05-01 | 坎泰克斯制药股份有限公司 | 骨髓抑制的治疗 |
| AU2014248119B2 (en) * | 2013-04-03 | 2019-06-20 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Effective generation of tumor-targeted T-cells derived from pluripotent stem cells |
| WO2016133910A1 (en) | 2015-02-17 | 2016-08-25 | Cantex Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of cancers and hematopoietic stem cell disorders privileged by cxcl12-cxcr4 interaction |
| EP3258940A1 (en) * | 2015-02-17 | 2017-12-27 | Cantex Pharmaceuticals, Inc. | Adoptive cell transfer methods |
| EP3091032A1 (en) * | 2015-05-08 | 2016-11-09 | Miltenyi Biotec GmbH | Humanized antibody or fragment thereof specific for cd3 |
| US11859208B2 (en) | 2016-04-08 | 2024-01-02 | Emory University | Methods of treating cancer using cell based therapies |
| WO2017214939A1 (zh) * | 2016-06-16 | 2017-12-21 | 毛侃琅 | 提升 ccr7 基因表达水平的慢病毒表达载体及其应用 |
| MX2021001528A (es) * | 2018-08-10 | 2021-04-19 | Univ Kyoto | Metodo para la produccion de celulas positivas para cd3. |
| JP2022501031A (ja) * | 2018-09-19 | 2022-01-06 | フジフィルム セルラー ダイナミクス，インコーポレイテッド | キメラ抗原受容体改変免疫細胞の活性化及び拡大培養のためのプロテインｌ |
| WO2020102701A1 (en) * | 2018-11-16 | 2020-05-22 | Rapa Therapeutics, Llc | Methods for the manufacture of th1/tc1 phenotype t cells |
| WO2023155009A1 (en) * | 2022-02-16 | 2023-08-24 | Stemcell Technologies Canada Inc. | Compositions and methods for expanding lymphocytes |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004018667A1 (ja) * | 2002-08-26 | 2004-03-04 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | ペプチド及びこれを含む医薬 |
| WO2005019450A1 (ja) * | 2003-08-22 | 2005-03-03 | Takara Bio Inc. | 細胞傷害性リンパ球の製造方法 |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2561131B2 (ja) * | 1988-06-30 | 1996-12-04 | 寳酒造株式会社 | 細胞接着活性ポリペプチド |
| US5198423A (en) * | 1989-05-26 | 1993-03-30 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Functional polypeptide containing a cell binding domain and a heparin binding domain of fibronectin |
| US5188959A (en) * | 1989-09-28 | 1993-02-23 | Trustees Of Tufts College | Extracellular matrix protein adherent t cells |
| JP3104178B2 (ja) | 1990-03-30 | 2000-10-30 | 寶酒造株式会社 | 機能性ポリペプチド |
| JP2729712B2 (ja) | 1991-04-23 | 1998-03-18 | 寳酒造株式会社 | 機能性ポリペプチド |
| US6821778B1 (en) * | 1993-12-01 | 2004-11-23 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Methods for using dendritic cells to activate gamma/delta-T cell receptor-positive T cells |
| DE4412794A1 (de) * | 1994-04-14 | 1995-12-14 | Univ Ludwigs Albert | Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen, so erhaltene Zellen und Behälter zur Durchführung dieses Verfahrens |
| US5827642A (en) * | 1994-08-31 | 1998-10-27 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes |
| WO1996034970A1 (en) * | 1995-05-04 | 1996-11-07 | United States Of America, Represented By The Secretary Of The Navy | Improved methods for transfecting t cells |
| US6692964B1 (en) * | 1995-05-04 | 2004-02-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Methods for transfecting T cells |
| US7067318B2 (en) * | 1995-06-07 | 2006-06-27 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods for transfecting T cells |
| US6472204B1 (en) | 1995-11-13 | 2002-10-29 | Kiyozo Asada | Methods for retroviral mediated gene transfer employing molecules, or mixtures thereof, containing retroviral binding domains and target cell binding domains |
| US6734014B1 (en) * | 1996-02-08 | 2004-05-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods and compositions for transforming dendritic cells and activating T cells |
| DE69739951D1 (de) * | 1996-03-04 | 2010-09-16 | Calyx Bio Ventures Inc | Modifizierte schnellvermehrungsmethode ('modified-rem') zur in vitro vermehrung von t-lymphozyten |
| TWI239352B (en) * | 1997-07-23 | 2005-09-11 | Takara Bio Inc | Gene transfer method with the use of serum-free medium |
| WO2000009168A1 (en) | 1998-08-11 | 2000-02-24 | The United States Of America, Represented By Department Of Health And Human Services | A method of transducing mammalian cells, and products related thereto |
| EP1163912B1 (en) * | 1999-03-23 | 2007-10-31 | Takara Bio Inc. | Gene therapeutics |
| KR20020010206A (ko) * | 2000-07-27 | 2002-02-04 | 이시우 | 인터루킨 12와 보조활성인자 ｂ7.1 유전자를 함유하는ｄｎａ 벡터 및 이벡터가 도입된 항암 세포백신 |
| WO2002014481A1 (fr) * | 2000-08-16 | 2002-02-21 | Takara Bio Inc. | Procede de culture extensive de lymphocytes t cytotoxiques specifiques de l'antigene |
| EP1401495A4 (en) * | 2001-06-01 | 2005-11-23 | Xcyte Therapies Inc | T CELL-INDUCED TISSUE PARA- TURE AND REGENERATION |
| CN100510060C (zh) * | 2001-08-15 | 2009-07-08 | 宝生物工程株式会社 | 抗原特异性细胞毒性t细胞的扩大培养方法 |
| US7745140B2 (en) * | 2002-01-03 | 2010-06-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool |
| CN100591760C (zh) * | 2002-03-25 | 2010-02-24 | 宝生物工程株式会社 | 制备细胞毒性淋巴细胞的方法 |
| US20080227504A1 (en) * | 2007-03-15 | 2008-09-18 | Shih-Yang Chan | Ceramic casing device for mobile handset |
-
2006
- 2006-09-27 EA EA200800996A patent/EA016168B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-09-27 CA CA002623735A patent/CA2623735A1/en not_active Abandoned
- 2006-09-27 JP JP2007538714A patent/JP5156382B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-09-27 KR KR1020087010395A patent/KR101408565B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2006-09-27 EP EP06810596A patent/EP1939278A4/en not_active Withdrawn
- 2006-09-27 US US11/992,661 patent/US20100068192A1/en not_active Abandoned
- 2006-09-27 AU AU2006298188A patent/AU2006298188B2/en not_active Ceased
- 2006-09-27 WO PCT/JP2006/319105 patent/WO2007040105A1/ja active Application Filing
- 2006-09-27 CN CN2006800441169A patent/CN101400785B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2006-09-28 TW TW095136081A patent/TW200741001A/zh unknown
-
2009
- 2009-09-23 HK HK09108701.4A patent/HK1130509A1/xx not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004018667A1 (ja) * | 2002-08-26 | 2004-03-04 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | ペプチド及びこれを含む医薬 |
| WO2005019450A1 (ja) * | 2003-08-22 | 2005-03-03 | Takara Bio Inc. | 細胞傷害性リンパ球の製造方法 |
Non-Patent Citations (12)
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2761557C2 (ru) * | 2015-10-22 | 2021-12-09 | Джуно Терапьютикс Гмбх | Способы культивирования клеток и наборы и устройство для них |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1939278A1 (en) | 2008-07-02 |
| AU2006298188A1 (en) | 2007-04-12 |
| KR20080056266A (ko) | 2008-06-20 |
| AU2006298188B2 (en) | 2012-03-15 |
| JP5156382B2 (ja) | 2013-03-06 |
| CA2623735A1 (en) | 2007-04-12 |
| CN101400785B (zh) | 2013-09-25 |
| EP1939278A4 (en) | 2009-06-03 |
| WO2007040105A1 (ja) | 2007-04-12 |
| TW200741001A (en) | 2007-11-01 |
| HK1130509A1 (en) | 2009-12-31 |
| JPWO2007040105A1 (ja) | 2009-04-16 |
| US20100068192A1 (en) | 2010-03-18 |
| EA200800996A1 (ru) | 2008-08-29 |
| KR101408565B1 (ko) | 2014-06-17 |
| CN101400785A (zh) | 2009-04-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA016168B1 (ru) | Способ получения т-клеточной популяции и ее применение | |
| US8609410B2 (en) | Method for activation treatment of antigen-presenting cell | |
| KR101279172B1 (ko) | 림프구의 제조 방법 | |
| CN105949325B (zh) | 包含cd27胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体及其应用 | |
| CN112512593A (zh) | 增强过继输注t细胞持久性的方法 | |
| KR20170121178A (ko) | 보편적인 살해 t-세포 | |
| EP2305796B1 (en) | Process for producing cytotoxic lymphocytes | |
| ES2910227T3 (es) | Composición y métodos para la estimulación y expansión de células T | |
| CN105296431A (zh) | 肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞及其抑癌用途 | |
| CN108289909A (zh) | 用于产生工程改造的人原代血液树突细胞系的方法 | |
| WO2009139413A1 (ja) | サイトカイン誘導キラー細胞含有細胞集団の製造方法 | |
| EA012520B1 (ru) | Способ получения цитотоксических лимфоцитов | |
| JP2016155851A (ja) | 制御性ｔ細胞の阻害のための方法および組成物 | |
| CN111849905B (zh) | 间充质干细胞靶向运输趋化因子和细胞因子的免疫疗法 | |
| JP2008523067A (ja) | 癌ワクチンアジュバントとしてのαサイモシンペプチド | |
| CA3214450A1 (en) | Single vessel expansion of lymphocytes | |
| WO2011062909A2 (en) | Creating bioengineered lymph nodes | |
| CN115975050A (zh) | 嵌合的人源t细胞受体、核酸、载体、细胞和药物组合物 | |
| EP4183872A1 (en) | Immunotherapy method of targeted chemokine and cytokine delivery by mesenchymal stem cell | |
| Issabekova et al. | Comparable Analysis of Mature Antigen-Loaded Dendritic Cells Preparation Methods for Cytokine-induced Killer Cells Activation In Vitro | |
| WO2022253957A1 (en) | Person-tailored t cell composition targeting merkel cell carcinoma | |
| CN118853582A (zh) | 基因编辑的肿瘤浸润淋巴细胞及其在免疫细胞治疗中的应用 | |
| KR20210141599A (ko) | Cd28 t 세포의 배양액, 조성물 및 그 사용 방법 | |
| MX2008004225A (es) | Metodo para la produccion de una poblacion de celulas t |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |