DE69534166T2 - Rekombinanter adenovirus und methoden zu dessen verwendung - Google Patents

Rekombinanter adenovirus und methoden zu dessen verwendung Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung wurde durch das „National Institute of Health Grant No. P30 DK 477,57" unterstützt. Die Regierung der Vereinigten Staaten ist an der vorliegenden Erfindung rechtsbeteiligt.
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von zur somatischen Gentherapie geeigneten Vektoren sowie die Herstellung davon.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Bei der menschlichen Gentherapie handelt es sich um einen Ansatz zur Behandlung von Erkrankungen des Menschen, der auf der Modifikation der Genexpression in Zellen des Patienten beruht. Es hat sich im Verlauf des letzten Jahrzehnts herausgestellt, daß das größte Hindernis für den Erfolg der Gentherapie als Strategie zur Behandlung von Erbkrankheiten, Krebs und anderen genetischen Fehlfunktionen in der Entwicklung geeigneter Gentransfervehikel besteht. Eukaryontische Viren wurde bereits als Vehikel für die somatische Gentherapie eingesetzt. Unter den Virusvektoren, die in der Gentherapieforschung häufig zitiert wurden, befinden sich die Adenoviren.
  • Bei den Adenoviren handelt es um eukaryontische DNA-Viren, die sich zur effizienten Zuführung eines therapeutischen oder Report-Transgens an verschiedene Zellarten modifizieren lassen. Die rekombinanten Adenoviren vom Typ 2 und 5 (Ad2 bzw. Ad5) die beim Menschen eine Erkrankung der Atemwege verursachen, werden zur Zeit für die Gentherapie weiterentwickelt. Sowohl Ad2 als auch Ad5 gehören zu einer Unterklasse von Adenoviren, die nicht mit menschlichen Malignomen assoziiert sind. Rekombinante Adenoviren sind dazu in der Lage, äußerst hohe Niveaus der Zuführung von Transgenen an praktisch alle Zellarten, unabhängig vom Mitosestatus, zu liefern. Hohe Titer (1013 plaque forming units [Plaque-bildende Einheiten]/ml) an rekombinantem Virus lassen sich leicht in 293-Zellen (dem Adenovirus-Äquivalent zu Retrovirus-Verpackungszellinien) erzeugen und über ausgedehnte Zeiträume ohne ersichtliche Verluste tiefgefroren aufbewahren. Die Wirksamkeit dieses Systems bei der Zuführung eines therapeutischen Transgens, das ein genetisches Ungleichgewicht komplementiert, in vivo konnte in Tiermodellen für verschiedene Erkrankungen demonstriert werden [Y. Watanabe, Atherosclerosis, 36: 261–268 (1986); K. Tanzawa et al, FEBS Letters, 118(1): 81–84 (1980); J. L. Golasten et al, New Engl. J. Med., 309 (11983): 288–296 (1983); S. Ishibashi et al, J. Clin. Invest., 92: 883–893 (1993); und S. Ishibashi et al, J. Clin. Invest., 93: 1885–1893 (1994)]. Tatsächlich wurde ein rekombinantes, replikationsdefektes Adenovirus, das eine cDNA für CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator) codiert, zum Einsatz in wenigstens zwei klinischen Studien an menschlichem CF zugelassen [siehe z.B. J. Wilson, Nature, 365: 691–692 (21. Okt. 1993)]. Die Sicherheit rekombinanter Adenoviren für die Gentherapie wird durch die ausgiebige Erfahrung mit Adenovirus-Lebensimpfstoffen in Bevölkerungsgruppen weiter untermauert.
  • Menschliche Adenoviren bestehen aus einem linearen, ungefähr 36 kb großen doppelsträngigen DNA-Genom, das sich in 100 m.u. (map units) [= Karteneinheiten] einteilen läßt, die jeweils eine Länge von 360 bp aufweisen. Die DNA enthält an beiden Enden des Genoms kurze inverse terminale Wiederholungen (inverted terminal repeats, ITR), die für die Replikation der viralen DNA benötigt werden. Dabei sind die Genprodukte aufgrund der Expression vor oder nach der Initiation der viralen DNA-Synthese in Form von frühen (E1 bis E4) und späten (L1 bis L5) Bereichen organisiert [siehe z.B. Horwitz, Virology, 2. Auflage, Hrsg. B. N. Fields, Raven Press, Ltd., New York (1990)).
  • Die rekombinanten, replikationsdefekten Adenoviren der ersten Generation, die für die Gentherapie entwickelt wurden, enthalten Deletionen des gesamten E1a-Bereichs und eines Teils des E1b-Bereichs. Dieses replikationsdefekte Virus wird auf einer mit Adenovirus transformierten, menschlichen embryonalen Komplementationsnierenzellinie, die ein funktionelles adenovirales E1a-Gen, durch das ein transwirkendes E1a-Protein bereitgestellt wird, enthält; der 293-Zelle [ATCC CRL1573], kultiviert. Viren mit deletiertem E1 können in den 293-Zellen, die die Genprodukte des E1a- und E1b-Bereichs in trans bereitstellen, replizieren und infektiöses Virus produzieren. Das erhaltene Virus ist in der Lage, viele Zellarten zu infizieren, und kann das eingeführte Gen (unter der Voraussetzung, daß dieses seinen eigenen Promotor trägt) exprimieren, kann jedoch in einer Zelle, die keine DNA des E1-Bereichs trägt, nichts replizieren, außer wenn die Zelle mit einer sehr hohen „multiplicity of infection" infiziert wird.
  • Es konnte jedoch in In-vivo-Untersuchungen gezeigt werden, daß die Transgenexpression in diesen Vektoren mit deletiertem E1 transient war und ausnahmslos mit der Entwicklung einer starken Entzündung an der Zielstelle des Vektors assoziiert war [S. Ishibashi et al, J. Clin. Invest., 93: 1885–1893 (1994); J. M. Wilson et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4421–4424 (1988) J. M. Wilson et al, Clin. Bio., 3: 21–26 (1991); M. Grossman et al, Som. Cell. and Mol. Gen., 17: 601–607 (1991)]. Als eine Erklärung für diesen Befund wurde vorgeschlagen, daß rekombinante Adenoviren der ersten Generation trotz der Deletion von E1-Genen niedrige Niveaus anderer Virusproteine exprimieren. Dies könnte an einer Basalexpression von den nichtstimulierten Viruspromotoren oder einer Transaktivierung durch zelluläre Faktoren liegen. Die Expression viraler Proteine führt zu zellulären Immunreaktionen gegenüber den genetisch veränderten Zellen, was zu deren Zerstörung und Austausch gegen Zellen, die kein Transgen enthalten, führt.
  • Es besteht weiterhin ein Bedarf im Fachgebiet an der Entwicklung zusätzlicher Adenovirus-Vektorkonstrukte für die Gentherapie.
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • In einem Aspekt werden durch die Erfindung die Komponenten eines neuartigen rekombinanten Adenovirus-Produktionssystems bereitgestellt. Bei einer dieser Komponenten handelt es sich um ein Shuttle-Plasmid, pAdΔ, das die für die Replikation und Virioncapsidierung notwendigen adenoviralen cis-Elemente umfaßt und in dem alle Virusgene deletiert sind. Dieser Vektor trägt ein ausgewähltes Transgen unter der Kontrolle eines ausgewählten Promotors und weiterer herkömmlicher Vektor/Plasmid-Regulationskomponenten. Bei der anderen Komponente handelt es sich um ein Helfer-Adenovirus, das allein oder zusammen mit einer Verpackungszellinie eine ausreichende Menge an für eine produktive Virusinfektion notwendigen Gensequenzen liefert. In einer bevorzugten Ausführungsform wurde das Helfervirus so verändert, daß es Modifikationen der nativen Gensequenzen, die die effiziente Verpackung steuern, enthält, um so die Verpackungsfunktion des Helfervirus oder seine Fähigkeit zur Replikation weitgehend auszuschalten oder zu „lähmen".
  • In einem weiteren Aspekt wird durch die vorliegende Erfindung ein einzigartiges rekombinantes Adenovirus, ein AdΔ-Virus, das unter Verwendung der obigen Komponenten produziert wurde, bereitgestellt. Dieses rekombinante Virus umfaßt ein adenovirales Capsid, für die Replikation und Virioncapsidierung notwendige adenovirale cis-Elemente, es sind jedoch alle Virusgene (d.h. alle viralen offenen Leseraster) deletiert. Dieses Viruspartikel trägt ein ausgewähltes Transgen unter der Kontrolle eines ausgewählten Promotors und weiterer herkömmlicher Vektorregulationskomponenten. Dieses rekombinante AdΔ-Virus ist durch eine Zuführung mit hohem Titer eines Transgens an eine Wirtszelle sowie die Fähigkeit zur stabilen Integration des Transgens in das Chromosom der Wirtszelle gekennzeichnet. In einer Ausführungsform trägt das Virus als Transgen ein Reportergen. Eine weitere Ausführungsform des rekombinanten Virus enthält ein therapeutisches Transgen.
  • In einem weiteren Aspekt wird durch die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des oben beschriebenen rekombinanten AdΔ-Virus durch Kotransfektion einer Zelllinie (entweder einer Verpackungszellinie oder Nicht-Verpackungszellinie) mit einem Shuttle-Vektor oder -Plasmid und einem Helfer-Adenovirus wie oben beschrieben bereitgestellt, wobei die transfizierte Zelle das AdΔ-Virus erzeugt. Das AdΔ-Virus wird anschließend daraus isoliert und gereinigt.
  • In noch einem weiteren Aspekt wird durch die Erfindung eines Verfahren zur Zuführung eines ausgewählten Gens an eine Wirtszelle zur Expression in dieser Zelle durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines ein therapeutisches Transgen enthaltenden rekombinanten AdΔ-Virus an einen Patienten zur Behandlung oder Korrektur einer genetisch bedingten Störung oder Krankheit bereitgestellt.
  • Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden weiter in der folgenden ausführlichen Beschreibung der diesbezüglichen bevorzugten Ausführungsformen beschrieben.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Bei 1A handelt es sich um eine schematische Darstellung der Organisation der Hauptfunktionselemente, die den 5'-Terminus von Ad5 definieren, einschließlich einer inversen terminalen Wiederholung (ITR) und einer Verpackungs-/Enhancer-Domäne. Die TATA-Box des E1-Promotors (schwarzes Kästchen) und die E1A-Transkriptionsstartstelle (Pfeil) sind ebenfalls gezeigt.
  • Bei 1B handelt es sich um eine vergrößerte schematische Darstellung des Verpackungs-/Enhancer-Bereichs von 1A, wobei die fünf Verpackungs (PAC)-Domänen (A-Wiederholungen), I bis V, angedeutet sind. Die Pfeile bezeichnen die Lage der PCR-Primer, auf die in 9A und 9B unten verwiesen wird.
  • Bei 2A handelt es sich um eine schematische Darstellung des Shuttle-Vektors pAdΔ.CMVLacZ, der 5'-ITR aus AdS, gefolgt von einem CMV-Promotor/Enhancer, einem LacZ-Gen, einem 3'-ITR aus Ad5, enthält, wobei die restliche Plasmidsequenz aus dem Grundgerüst des Plasmids pSP72 stammt. Die Restriktionsendonucleaseenzyme sind mit den herkömmlichen Bezeichnungen in den Plasmidkonstrukten dargestellt.
  • Bei 2B handelt es sich um eine schematische Darstellung des mit EcoRI zur Freisetzung des modifizierten AdΔ-Genoms aus dem pSP72-Plasmidgrundgerüst verdauten Shuttle-Vektors.
  • Bei 2C handelt es sich um eine schematische Darstellung der Funktion des Vektorsystems. In Gegenwart eines Helfervirus mit E1-Deletion, helper virus Ad.CBhpAp, der ein Reporter-Minigen für alkalische Phosphatase aus menschlicher Plazenta (hpAP) codiert, wird das AdΔ.CMVLacZ-Genom in vorgeformte Virioncapside verpackt, die sich von den Helfer- Virionen durch das Vorhandensein das LacZ-Gens unterscheiden.
  • In den 3A bis 3F [SEQ ID NO: 1] ist der obere DNA-Strang des doppelsträngigen Plasmids pAdΔ.CMVLacZ dargestellt. Die komplementäre Sequenz kann vom Fachmann leicht gewonnen werden. Die Sequenz enthält die folgenden Komponenten: 3'-Ad-ITR (Nukleotide 607–28 der SEQ ID NO: 1); 5'-Ad-ITR (Nukleotide 5496–5144 der SEQ ID NO: 1); CMV-Promotor/Enhancer (Nukleotide 5117–4524 der SEQ ID NO: 1); SD/SA-Sequenz (Nukleotide 4507–4376 der SEQ ID NO: 1); LacZ-Gen (Nukleotide 4320–845 der SEQ ID NO: 1); und eine Poly-A-Sequenz (Nukleotide 837–639 der SEQ ID NO: 1).
  • Bei 4A handelt es sich um eine schematische Darstellung des Shuttle-Vektors pAdΔc.CMVLacZ, der Ad5-5'-ITR und 3'-ITR in Kopf/Schwanz-Anordnung, wobei der 5'-ITR unmittelbar ein CMV-Enhancer/Promotor-LacZ-Minigen folgt, gefolgt von einem Grundgerüst des Plasmids pSP72 (Promega), enthält. Restriktionsendonucleaseenzyme sind mit den herkömmlichen Bezeichnungen in den Plasmidkonstrukten dargestellt.
  • Bei 4B handelt es sich um eine schematische Darstellung der Funktion des Vektorsystems aus 4A. In Gegenwart des Helfervirus Ad.CBhpAP wird die zirkuläre pADΔc.CMVLacZ-Shuttle-Vektorsequenz in Virionköpfe verpackt, die sich von den Helfervirionen durch das Vorhandensein des LacZ-Gens unterscheiden.
  • In den 5A bis 5F [SEQ ID NO: 2] ist der obere DNA-Strang des doppelsträngigen Vektors padΔc.CMVLacZ dargestellt. Die komplementäre Sequenz kann vom Fachmann leicht gewonnen werden. Die Sequenz enthält die folgenden Komponenten: 5'-Ad-ITR (Nukleotide 600–958 der SEQ ID NO: 2); CMV-Promotor/Enhancer (Nukleotide 969–1563 der SEQ ID NO: 2); SD/SA-Sequenz (Nukleotide 1579–1711); LacZ-Gen (Nukleotide 1762–5236 der SEQ ID NO: 2); Poly-A-Sequenz (Nukleotide 5245–5443 der SEQ ID NO: 2); und 3'-Ad-ITR (Nukleotide 16–596 der SEQ ID NO: 2).
  • Bei 6 handelt es sich um eine schematische Darstellung des Shuttle-Vektors pAdΔ.CBCFTR, der 5'-ITR aus AdS, gefolgt von einem chimären CMV-Enhancer/β-Actin-Promotor-Enhancer, einem CFTR-Gen, einer Poly-A-Sequenz, einer 3'-ITR aus Ad5, enthält, wobei die restliche Plasmidsequenz aus dem Rückgrat des Plasmids pSL1180 (Pharmacia) stammt. Restriktionsendonucleasenenzyme sind mit herkömmlichen Bezeichnungen in den Plasmidkonstrukten dargestellt.
  • In den 7A bis 7H [SEQ ID NO: 3] ist der obige DNA-Strang des doppelsträngigen Plasmids pAdΔ.CBCFTR dargestellt. Die komplementäre Sequenz kann vom Fachmann leicht gewonnen werden. Die Sequenz enthält die folgenden Komponenten: 5'-Ad-ITR (Nukleotide 9611–9254 der SEQ ID NO: 3); chimärer CMV-Enhancer/β-Actin-Promotor (Nukleotide 9241–8684 der SEQ ID NO: 3); CFTR-Gen (Nukleotide 8622–4065 der SEQ ID NO: 3); Poly-A-Sequenz (Nukleotide 3887–3684 der SEQ ID NO: 3); und 3'-Ad-ITR (Nukleotide 3652–3073 der SEQ ID NO: 3). Das restliche Plasmidgrundgerüst wird aus pSL1180 (Pharmacia) erhalten.
  • In 8A ist die Erzeugung der adenoviralen 5'-terminalen Sequenz, die die PAC-Domänen I und II enthielt, mittels PCR veranschaulicht. Siehe Pfeile in 1B zur Bezeichnung der rechten und linken (PAC II)-PCR-Sonden.
  • In 8B ist die Erzeugung der 5'-terminalen Sequenz, die die PAC-Domänen I, II, III und IV enthielt, mittels PCR veranschaulicht. Siehe Pfeile in 1B zur Bezeichnung der rechten und linken (PAC II)-PCR-Sonden.
  • 8C zeigt die in die Multiklonierungsstelle von pAd.Link.1 (IHGT Vector Core) unter Erhalt von pAd.PACII (Domänen I und II) bzw. pAd.PACIV (Domänen I, II, III und IV) subklonierten Amplifikationsprodukte, wodurch gelähmte Helferviren, Ad.PACII bzw. Ad.PACIV, mit modifizierten Verpackungssignalen (PAC-Signalen) erhalten werden.
  • Bei 9A handelt es sich um eine schematische Darstellung der Subklonierung eines Reporter-Minigens der alkalischen Phosphatase aus menschlicher Plazenta, das den sehr frühen [immediate early] CMV-Enhancer/Promotor (CMV), die cDNA der alkalischen Phosphatase aus menschlicher Plazenta (hpAP) sowie das SV40-Polyadenylierungssignal (pA) enthält, in pAd.PACII unter Erhalt des gelähmten Helfer-Virusvektors pAdΔ.PACII.CMVhpAP. Restriktionsendonucleaseenzyme sind mit herkömmlichen Bezeichnungen in den Plasmidkonstrukten dargestellt.
  • Bei 9B handelt es sich um eine schematische Darstellung der Subklonierung des gleichen Minigens aus 9A in pAd.PACIV unter Erhalt des gelähmten Helfer-Virusvektors pAd.PACIV.CMV.hpAP.
  • Bei 10 handelt es sich um ein Fließdiagramm, in dem die Synthese eines Polycation-Helfervirus-Konjugats auf Adenovirusbasis und dessen Kombination mit einem pAdΔ-Shuttle-Vektor unter Erhalt eines neuartigen Viruspartikelkomplexes zusammengefaßt ist. CsCl-Banden gereinigtes Helfer-Adenovirus wurde mit dem heterobifunktionellen Quervernetzer Sulfo-SMCC umgesetzt, wobei die Capsid-Proteinfaser mit der nukleophilen Maleimidgruppierung markiert wird. Freie Sulfhydryle wurden unter Verwendung von 2-Iminothiolan-HCl auf Poly-L-Lysin eingeführt und mit dem markierten Adenovirus gemischt, wodurch das Helfervirus-Konjugat Ad-pLys erhalten wurde. Ein einzigartiges Partikel auf Adenovirusbasis wird erzeugt, in dem man das Ad-pLys-Konjugat zur Abtrennung von nicht eingebautem Poly-L- Lysin über einen CsCl-Gradienten reinigt, anschließend ausgiebig dialysiert, Shuttle-Plasmid-DNAs zu Ad-pLys zugibt und den durch das Shuttle-Plasmid umhüllende Shuttle-Plasmid gebildeten Komplex entwickeln läßt.
  • Bei 11 handelt es sich um ein schematisches Diagramm von pCCL-DMD, das ausführlich in Beispiel 9 unten beschrieben ist.
  • In 12A bis 12P ist die durchgehende DNA-Sequenz von pAdΔ.CMVmDys [SEQ ID NO: 10] gezeigt.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Durch die vorliegende Erfindung werden ein einzigartiges rekombinantes Adenovirus, das zur Zuführung von Transgenen an Zielzellen in der Lage ist, ebenso wie die Komponenten für die Herstellung des einzigartigen Virus sowie Verfahren zur Verwendung des Virus zur Behandlung verschiedener genetischer Störungen bereitgestellt.
  • Bei dem AdΔ-Virus der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Viruspartikel, das lediglich die für die Replikation und Virioncapsidierung notwendigen adenoviralen cis-Elemente (d.h. ITRs und Verpackungssequenzen) enthält, in dem jedoch andererseits alle Adenovirusgene (d.h. alle viralen offenen Leseraster) deletiert sind. Dieses Virus trägt ein ausgewähltes Transgen unter der Kontrolle eines ausgewählten Promotors und weiterer herkömmlicher Regulationskomponenten, wie z.B. eines Poly-A-Signals. Das AdΔ-Virus ist durch eine verbesserte Beständigkeit der Vektor-DNA in den Wirtszellen, eine reduzierte Antigenität/Immunogenität und somit durch eine verbesserte Leistung als Zuführungsvehikel gekennzeichnet. Ein zusätzlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß das AdΔ-Virus die Verpackung sehr großer Transgene, wie z.B. einer Vollängen-Dystrophin-cDNA zur Behandlung des für die Duchenne-Muskel-Dystrophie (DMD) charakteristischen fortschreitenden Abbaus von Muskelgewebe, gestattet.
  • Dieses neuartige rekombinante Virus wird unter Verwendung eines auf Adenovirus beruhenden Vektor-Produktionssystems hergestellt, das zwei Komponenten enthält: 1) einen Shuttle-Vektor, der für die Replikation und Virioncapsidierung notwendige adenovirale cis-Elemente umfaßt und in dem alle Virusgene deletiert sind und der ein Reporter- oder therapeutisches Minigen trägt, sowie 2) ein Helfer-Adenovirus, das allein oder zusammen mit einer Verpackungszellinie dazu in der Lage ist, alle für eine produktive Virusinfektion notwendigen viralen Genprodukte bereitzustellen, wenn es mit dem Shuttle-Vektor cotransfiziert wird. Vorzugsweise ist das Helfervirus so modifiziert, daß es sich selbst nicht effizient verpacken kann. In dieser Situation wird es wünschenwerterweise zusammen mit einer Verpackungszellinie verwendet, die adenovirale Gene stabil exprimiert. Zu den Verfahren zur Herstellung dieses Virusvektors aus diesen Komponenten gehören sowohl ein neuartiges Mittel zur Verpackung eines adenoviralen/transgenhaltigen Vektors in ein Virus als auch ein neuartiges Verfahren zur anschließenden Trennung des Helfervirus von dem neugebildeten rekombinanten Virus.
  • I. Der Shuttle-Vektor
  • Der Shuttle-Vektor, mit pAdΔ bezeichnet, setzt sich aus adenoviralen Sequenzen und Transgen-Sequenzen, einschließlich Vektorregulationskontrollsequenzen, zusammen.
  • A. Die adenoviralen Sequenzen
  • Die adenoviralen Nukleinsäuresequenzen des Shuttle- Vektors stellen die minimalen adenoviralen Sequenzen bereit, die die Herstellung eines Viruspartikels mit Hilfe eines Helfervirus ermöglichen. Diese Sequenzen helfen bei der Zuführung eines rekombinanten Transgen-Genoms an eine Zielzelle mittels des erhaltenen rekombinanten Virus.
  • Die DNA-Sequenzen einer Reihe von Adenovirustypen sind von GenBank erhältlich, einschließlich Typ Ad5 [GenBank Zugangs-Nr. M73260]. Die adenoviralen Sequenzen können von einem beliebigen bekannten adenoviralen Serotyp, wie z.B. 2, 3, 4, 7, 12 und 40 gewonnen werden und dabei weiterhin einen beliebigen der zur Zeit identifizierten 41 menschlichen Typen [siehe z.B. Horwitz, oben zitiert] beinhalten. In ähnlicher Weise können auch Adenoviren, von denen bekannt ist, daß sie andere Tiere infizieren, ebenso in den Vektorkonstrukten der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Dabei wird erwartet, daß die Auswahl des Adenovirustyps die folgende Erfindung nicht beschränkt. Verschiedene Adenovirusstämme können von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland bezogen werden oder sind auf Anfrage bei verschiedenen kommerziellen und institutionellen Quellen erhältlich. Im folgenden Ausführungsbeispiel wird aus Gründen der Zweckmäßigkeit ein Adenovirus Typ 5 (Ad5) verwendet.
  • Es ist jedoch wünschenswert, verschiedene pAdΔ-Shuttle-Vektoren zu beziehen, die auf unterschiedlichen menschlichen adenoviralen Serotypen beruhen. Dabei wird erwartet, daß eine Bibliothek solcher Plasmide sowie die daraus erhaltenen AdΔ-Virusvektoren für ein therapeutisches Regime zur Umgehung der zellulären, sowie möglicherweise der humoralen Immunität sowie zur Verlängerung der Dauer der Transgenexpression, ebenso wie zur Verbesserung des Erfolgs wiederholter therapeutischer Behandlungen geeignet sein könnten. Darüber hinaus wird angenommen, daß die Verwendung verschiedener Serotypen zur Bildung rekombinanter Viren mit unterschiedlichen Zielgewebespezifitäten führt. Es wird erwartet, daß das Fehlen von adenoviralen Genen im AdΔ-Virusvektor eine negative CTL-Antwort, die normalerweise zur Zerstörung von rekombinanten Adenoviren, in denen lediglich das E1-Gen deletiert ist, führt, vermindert oder beseitigt.
  • Insbesondere handelt es sich bei den im pAdΔ-Shuttle-Vektor der vorliegenden Erfindung eingesetzten adenoviralen Nukleinsäuresequenzen um genomische Adenovirussequenzen, bei denen alle Virusgene deletiert sind. Ganz besonders handelt es sich bei den verwendeten Adenovirussequenzen um die cis-wirkenden 5'- und 3'-inversen terminalen Wiederholungssequenzen (ITR-Sequenzen) eines Adenovirus (die als Replikationsursprünge dienen) sowie die native 5'-Verpackungs/Enhancer-Domäne, die zur Verpackung linearer Ad-Genome notwendige Sequenzen sowie Enhancer-Elemente für den E1-Promotor enthält. Dies sind die für die Replikation und Virioncapsidierung notwendigen Sequenzen. Siehe z.B. P. Hearing et al, J. Virol., 61(8): 2555–2558 (1987); M. Grable und P. Hearing, J. Virol., 64(5): 2047–2056 (1990); und M. Grable und P. Hearing, J. Virol., 66(2): 723–731 (1992).
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung läßt sich die gesamte, den 5'-ITR- und den Verpackungs-/Enhancerbereich enthaltende adenovirale 5'-Sequenz als 5'-Adenovirussequenz im pAdΔ-Shuttle-Vektor einsetzen. Diese linke terminale (5'-) Sequenz des erfindungsgemäß geeigneten Ad5-Genoms reicht von Bp1 bis etwa 360 des üblichen Adenovirusgenoms, auch als Karteneinheiten 0–1 des Virusgenoms bezeichnet. Diese Sequenz wird hier in Form der Nukleotide 5496–5144 der SEQ ID NO: 1, Nukleotide 600–958 der SEQ ID NO: 2; und Nukleotide 9611–9254 der SEQ ID NO: 3 bereitgestellt und weist im allgemeinen eine Länge von etwa 353 bis etwa 360 Nukleotide auf. Zu dieser Sequenz gehören der 5'-ITR (Bp 1–103 des Adenovirusgenoms) sowie die Verpackungs-/Enhancer- Domäne (Bp 194–358 des Adenovirusgenoms). Siehe 1A, 3, 5 und 7.
  • Vorzugsweise wird dieser native adenovirale 5'-Bereich im Shuttle-Vektor in nichtmodifizierter Form eingesetzt. Dennoch sind einige Modifikationen, einschließlich Deletionen, Substitutionen und Additionen, an dieser Sequenz erlaubt, die keinen negativen Effekt auf ihre biologische Funktion ausüben. Siehe z.B. WO 93/24641, veröffentlicht am 9. Dezember 1993. Die Fähigkeit zur Modifizierung dieser ITR-Sequenzen liegt im Bereich des fachmännischen Könnens. Siehe z.B. Texte wie etwa Sambrook et al, „Molecular Cloning. A Laboratory Manual.", 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989).
  • Zu den adenoviralen 3'-Sequenzen des Shuttle-Vektors gehören die rechte terminale (3'-) ITR-Sequenz des Adenovirusgenoms, die von etwa Bp 35.353 – Ende des Adenovirusgenoms, bzw. Karteneinheiten –98.4–100, reicht. Diese Sequenz wird hier in Form der Nukleotide 607–28 der SEQ ID NO: 1, Nukleotide 16–596 der SEQ ID NO: 2 und Nukleotide 3652–3073 der SEQ ID NO: 3 bereitgestellt und weist im allgemeinen eine Länge von etwa 580 Nukleotiden auf. Diese gesamte Sequenz wird wünschenwerterweise als die 3'-Sequenz eines pAdΔ-Shuttle-Vektors verwendet. Vorzugsweise wird der native adenovirale 3'-Bereich im Shuttle-Vektor in nichtmodifizierter Form eingesetzt. Dennoch sind einige Modifikationen an dieser Sequenz, die keinen negativen Effekt auf ihre biologische Funktion ausüben, erlaubt.
  • Ein beispielhafter pAdΔ-Shuttle-Vektor der vorliegenden Erfindung, der unten und in 2A beschrieben ist, enthält nur diejenigen Adenovirussequenzen, die zur Verpackung von genomischer Adenovirus-DNA in einen vorgeformten Capsidkopf benötigt werden. Der pAdΔ-Vektor enthält die 5'-terminalen- und 3'-terminalen Sequenzen (identifiziert in der Beschreibung zu 3) codierenden Ad5-Sequenzen ebenso wie die unten beschriebenen Transgensequenzen.
  • Aus den vorstehenden Angaben darf man erwarten, daß ein Fachmann andere äquivalente Adenovirussequenzen zur Verwendung in den AdΔ-Vektoren der vorliegenden Erfindung einsetzen kann. Zu diesen Sequenzen können weitere Adenovirusstämme oder die oben erwähnten cis-wirkenden Sequenzen mit kleineren Modifikationen gehören.
  • B. Das Transgen
  • Bei der Transgensequenz des Vektors und des rekombinanten Virus handelt es sich um eine Nukleinsäuresequenz oder ein zur Adenovirussequenz heterologes reverses Transkript davon, die bzw. das ein interessierendes Polypeptid oder Protein codiert. Das Transgen ist mit den Regulationskomponenten auf eine Weise operativ verknüpft, die die Transkription der Transgene gestattet.
  • Die Zusammensetzung der Transgensequenz hängt von der Verwendung, die für das entstandene Virus vorgesehen ist, ab. Beispielsweise umfaßt eine Art von Transgensequenz eine Reporter-Sequenz, die bei der Expression ein nachweisbares Signal produziert. Zu solchen Reporter-Sequenzen gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, eine cDNA der Beta-Galactosidase (LacZ) aus E. coli, ein Gen für alkalische Phosphatase aus menschlicher Plazenta sowie ein Gen für das „green fluorescent protein". Sind diese Sequenzen mit Regulationselementen, die ihre Expression steuern, assoziiert, so liefern sie Signale, die mit herkömmlichen Mitteln, z.B. Absorption im Ultraviolettbereich, erkennbare Farbänderung, usw. nachweisbar sind.
  • Zu einer weiteren Art von Transgensequenz gehört ein therapeutisches Gen, das ein gewünschtes Genprodukt in einer Wirtszelle exprimiert. Diese therapeutischen Nukleinsäuresequenzen codieren typischerweise Produkte zur Verabreichung und Expression in einem Patienten in vivo oder ex vivo, um einen vererbten oder nicht vererbten genetischen Defekt zu ersetzen oder zu korrigieren oder eine epigenetische Störung oder Krankheit zu behandeln. Zu derartigen therapeutischen Genen, die zur Durchführung der Gentherapie wünschenswert sind, gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, ein normales Gen des transmembranen Regulators der cystischen Fibrose (CFTR) (siehe 7), ein LDL- (low density lipoprotein)-Gen [T. Yamamoto et al, Cell, 39: 27–28 (November 1984)] eine DMD-cDNA-Sequenz [Teilsequenz erhältlich von GenBank, Zugangs-Nr. M36673, M36671, [A. P. Monaco et al, Nature, 323: 646–650 (1986)] und L06900, [Roberts et al, Hum. Mutat., 2: 293–299 (1993)]] (GenBank), sowie eine Reihe von Genen, die vom Fachmann leicht ausgewählt werden können. Die Auswahl des Transgens wird nicht als Beschränkung der vorliegenden Erfindung betrachtet, da eine solche Auswahl im Bereich des Fachwissens liegt.
  • C. Regulationselemente
  • Zusätzlich zu den oben identifizierten Hauptelementen für den pAdΔ-Shuttle-Vektor, d.h. den Adenovirussequenzen sowie dem Transgen, beinhaltet der Vektor auch herkömmliche, zur Steuerung der Expression des Transgens in einer mit dem pAdΔ-Vektor transfizierten Zelle notwendige Regulationselemente. So enthält der Vektor einen ausgewählten Promotor, der mit dem Transgen verknüpft und zusammen mit dem Transgen zwischen den Adenovirussequenzen des Vektors lokalisiert ist.
  • Bei der Auswahl des Promotors handelt es sich um einen Routinevorgang, der keine Beschränkung für den pAdΔ-Vektor selbst darstellt. Als mögliche Promotoren kommen konstitutive Promotoren oder regulierte (induzierbare) Promotoren, die eine Kontrolle der Menge des zu exprimierenden Transgens erlauben, in Frage. Ein wünschenswerter Promotor ist beispielsweise der des sehr frühen Promotors/Enhancers aus Cytomegalovirus [siehe z.B. Boshart et al, Cell, 41: 521–530 (1985)]. Dieser Promotor findet sich bei den Nukleotiden 5117–4524 der SEQ ID NO: 1 sowie den Nukleotiden 969–1563 der SEQ ID NO: 2. Ein weiterer Promotor ist der CMV-Enhancer/Hühner-β-Actin-Promotor (Nukleotide 9241–8684 der SEQ ID NO: 3). Ein weiterer wünschenswerter Promotor umfaßt auch, ohne darauf beschränkt zu sein, den LTR-Promotor/Enhancer aus dem Rous-sarcoma-Virus. Noch weitere Promotor-/Enhancer-Sequenzen können vom Fachmann ausgewählt werden.
  • Die Shuttle-Vektoren enthalten ebenso wünschenwerterweise zu den Adenovirussequenzen heterologe Nukleinsäuresequenzen, einschließlich Sequenzen, die für eine effiziente Polyadenylierung des Transkripts benötigte Signale liefern, sowie Introns mit funktionellen Spleiß-Donor- und -Akzeptorstellen (SD/SA). Eine übliche, in den beispielhaften Vektoren der vorliegenden Erfindung eingesetzte Poly-A-Sequenz ist diejenige, die sich vom Papovavirus SV-40 ableitet [siehe z.B. Nukleotide 837–639 der SEQ ID NO: 1; 5245–5443 der SEQ ID NO: 2; und 3887–3684 der SEQ ID NO: 3]. Die Poly-A-Sequenz wird im allgemeinen im Vektor nach den Transgensequenzen und vor den 3'-Adenovirussequenzen eingefügt. Eine übliche Intronsequenz leitet sich ebenso von SV-40 ab und wird als SV-40-T-Intronsequenz bezeichnet [siehe z.B. Nukleotide 4507–4376 der SEQ ID NO: 1 und 1579–1711 der SEQ ID NO: 2]. Ein pAdΔ-Shuttle-Vektor der vorliegenden Erfindung kann ebenso ein solches Intron enthalten, das wünschenwerterweise zwischen der Promotor-/Enhancer-Sequenz und dem Transgen lokalisiert ist. Die Auswahl dieser und weiterer üblicher Vektorelemente ist allgemein bekannt, und viele solcher Sequenzen sind erhältlich [siehe z.B. Sambrook et al sowie darin zitierte Literaturangaben]. Beispiele für solche Regulationssequenzen für die obigen Sequenzen sind in den Plasmidsequenzen der 3, 5 und 7 angeben.
  • Die Kombination aus dem Transgen, dem Promotor/Enhancer sowie den anderen regulatorischen Vektorelementen wird hier zur erleichterten Bezugnahme als „Minigen" bezeichnet. Das Minigen ist vorzugsweise von den oben beschriebenen cis-wirkenden adenoviralen 5'- und 3'-Sequenzen flankiert. Ein derartiges Minigen kann eine Größe im Bereich von mehreren 100 Basenpaaren bis zu etwa 30 kb liegen, was auf das Fehlen der frühen und späten adenoviralen Gensequenzen im Vektor zurückzuführen ist. Somit erlaubt dieses AdΔ-Vektorsystem in Bezug auf die Größe eine große Bandbreite bei der Auswahl der verschiedenen Komponenten des Minigens, insbesondere des ausgewählten Transgens. Ausgestattet mit den Lehren der vorliegenden Erfindung läßt sich die Konstruktion eines solchen Minigens durch Zurückgreifen auf herkömmliche Techniken bewerkstelligen.
  • II. Das Helfervirus
  • Aufgrund der begrenzten Menge im AdΔ-Shuttle-Vektor vorliegender Adenovirussequenz muß ein Helfer-Adenovirus der vorliegenden Erfindung allein oder im Zusammenspiel mit einer Verpackungszellinie eine hinreichende Menge an für eine produktive Virusinfektion notwendigen adenoviralen Gensequenzen bereitstellen. Erfindungsgemäß geeignete Helferviren enthalten somit ausgewählte adenovirale Gensequenzen und gegebenenfalls ein zweites Reporter-Minigen.
  • Normalerweise führt die Produktion eines rekombinanten Adenovirus, bei Verwendung eines ein volles Komplement an adenoviralen Genen enthaltenden Helfer-Adenovirus zu einem mit einer Überschußproduktion an Helfervirus verunreinigten rekombinanten Virus. Somit ist eine ausgiebige Reinigung des Virusvektors vom verunreinigenden Helfervirus erforderlich. In der vorliegenden Erfindung wird jedoch ein Weg zur Erleichterung der Reinigung und Verringerung der Verunreinigung durch Lähmung des Helfervirus bereitgestellt.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform eines Helfervirus der vorliegenden Erfindung enthält somit drei Komponenten (A) Modifikationen oder Deletionen der nativen adenoviralen Gensequenzen, die die effiziente Verpackung steuern, so daß die Verpackungsfunktion des Helfervirus oder seine Fähigkeit zur Replikation weitgehend ausgeschaltet oder „gelähmt" wird, (B) ausgewählte Adenovirusgene und (C) gegebenenfalls ein Reporter-Minigen. Diese „gelähmten" Helferviren können auch als Polykations-Konjugaten ausgebildet werden, wie unten beschrieben.
  • Die das Helfervirus bildenden adenoviralen Sequenzen können aus den oben bei der Diskussion des Shuttle-Vektors identifizierten Quellen erhalten werden. Die Verwendung unterschiedlicher Ad-Serotypen als Helferviren ermöglicht die Produktion von rekombinanten Viren, die die ΔAd-(Serotyp-5-)Shuttle-Vektorsequenzen in einem von dem anderen adenoviralen Serotyp gebildeten Capsid enthalten. Diese rekombinanten Viren sind beim Abzielen auf unterschiedliche Gewebe oder bei der Umgehung einer Immunreaktion gegenüber den ΔAd-Sequenzen mit einem Serotyp-5-Capsid wünschenswert. Die Verwendung dieser unterschiedlichen Ad-Serotyp-Helferviren kann auch Vorteile hinsichtlich Produktion, Stabilität und besserer Verpackung des rekombinanten Virus zeigen.
  • A. Die lähmenden Modifikationen
  • Ein zur Produktion des Adenovirusvektors der vorliegenden Erfindung verwendetes wünschenswertes Helfervirus wird in seiner oben identifizierten 5'-ITR-Verpackungs-/Enhancer-Domäne modifiziert (oder gelähmt). Wie oben angegeben enthält der Verpackungs/Enhancer-Bereich für die Verpackung linearer Adenovirusgenome notwendige Sequenzen („PAC"-Sequenzen). Insbesondere enthält diese Sequenz wenigstens sieben verschiedene, aber dennoch funktionell redundante Domänen, die für eine effiziente Capsidierung der replizierten Virus-DNA benötigt werden.
  • Fünf dieser sogenannten A-Wiederholungen oder PAC-Sequenzen sind innerhalb eines Nukleotidsequenzabschnitts von Bp 194–358 des Ad5-Genoms lokalisiert (siehe 1B). PAC I ist bei Bp 241–248 des Adenovirusgenoms (auf dem zu den Nukleotiden 5259–5246 der SEQ ID NO: 1 komplementären Strang) lokalisiert. PAC II ist bei Bp 262–269 des Adenovirusgenoms (auf dem zu den Nukleotiden 5238–5225 der SEQ ID NO: 1 komplementären Strang) lokalisiert. PAC III ist bei Bp 304–311 des Adenovirusgenoms (auf dem zu den Nukleotiden 5196–5183 der SEQ ID NO: 1 komplementären Strang) lokalisiert. PAC IV ist bei Bp 314–321 des Adenovirus (auf dem zu den Nukleotiden 5186–5172 der SEQ ID NO: 1 komplementären Strang) lokalisiert. PAC V ist bei Bp 339–346 des Adenovirus (auf dem zu den Nukleotiden 5171–5147 der SEQ ID NO: 1 komplementären Strang) lokalisiert.
  • Entsprechende Sequenzen lassen sich aus den SEQ ID NO: 2 und 3 erhalten. PAC I ist bei den Nukleotiden 837–851 der SEQ ID NO: 2 sowie auf dem zu den Nukleotiden 9374–9360 der SEQ ID NO: 3 komplementären Strang lokalisiert. PAC II ist bei den Nukleotiden 859–863 der SEQ ID NO: 2 sowie auf dem zu den Nukleotiden 9353–9340 der SEQ ID NO: 3 komplementären Strang lokalisiert. PAC III ist bei den Nukleotiden 901–916 der SEQ ID NO: 2 sowie auf dem zu den Nukleotiden 9311– 9298 der SEQ ID NO: 3 komplementären Strang lokalisiert. PAC IV ist bei den Nukleotiden 911–924 der SEQ ID NO: 2 sowie auf dem zu den Nukleotiden 9301–9288 der SEQ ID NO: 3 komplementären Strang lokalisiert. PAC V ist bei den Nukleotiden 936–949 der SEQ ID NO: 2 sowie auf dem zu den Nukleotiden 9276–9263 der SEQ ID NO: 3 komplementären Strang lokalisiert.
  • In der folgenden Tabelle 1 sind diese fünf nativen Ad5-Sequenzen sowie eine auf den Ähnlichkeiten zwischen einem acht Nukleinsäuren langen Abschnitt innerhalb der fünf Sequenzen beruhende PAC-Konsensus-Sequenz aufgeführt. Die Konsensus-Sequenz enthält zwei Positionen, an denen die Nukleinsäure A oder T (A/T) sein kann. Für die Nukleinsäuren werden die herkömmlichen Ein-Buchstaben-Bezeichnungen verwendet, wie im Fachbereich bekannt ist.
  • Tabelle 1
    Figure 00210001
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können an einer oder mehreren dieser PAC-Sequenzen Mutationen oder Deletionen vorgenommen werden, um wünschenswerte gelähmte Helferviren zu erzeugen. Eine Deletionsanalyse der Verpackungsdomäne zeigte eine positive Korrelation zwischen der Capsidierungseffizienz und der Anzahl an A-Verpackungswiederholungen, die am 5'-Ende des Genoms vorhanden waren. Zu möglichen Modifikationen dieser Domäne zählen 5'-Adenovirussequenzen, die weniger als alle fünf der PAC-Sequenzen der Tabelle 1 enthalten. Beispielsweise können im gelähmten Virus nur zwei PAC-Sequenzen vorhanden sein, z.B. PAC I und PAC II, PAC III und PAC IV usw. Deletionen ausgewählter PAC-Sequenzen können die Deletion zusammenhängender oder nicht zusammenhängender Sequenzen beinhalten. So können beispielsweise PAC II und PAC IV deletiert werden, wodurch PAC I, III und IV in der 5'-Sequenz zurückbleiben. Eine alternative Modifikation kann auch der Austausch einer oder mehrerer der nativen PAC-Sequenzen gegen eine oder mehrere Wiederholungen der Konsensus-Sequenz der Tabelle 1 darstellen. Als Alternative kann dieser Adenovirusbereich modifiziert werden, indem absichtlich Mutationen eingefügt werden, die eine oder mehrere der nativen PAC-Sequenzen unterbrechen. Ein Fachmann kann die PAC-Sequenzen weiter manipulieren, so daß in ähnlicher Weise der Effekt einer Verminderung der Helfervirus-Verpackungseffizienz auf ein gewünschtes Niveau erreicht wird.
  • Beispielhafte Helferviren, bei denen die Manipulation der oben beschriebenen PAC-Sequenzen vorgenommen wird, sind in Beispiel 7 unten offenbart. Kurz gesagt enthält, wie in dem Beispiel beschrieben, ein Helfervirus anstelle des nativen 5'-ITR-Bereichs (Adenovirusgenom Bp 1–360), eine Bp 1–269 des Adenovirusgenoms umspannende 5'-Adenovirussequenz, die lediglich die 5'-ITR- sowie die PAC I- und PAC II-Sequenzen enthält und den Adenovirusbereich Bp 270–360 deletiert.
  • Ein weiteres in der PAC-Sequenz modifiziertes Helfervirus enthält nur die 5'-AdS-Sequenz des ITR und PAC I bis PAC IV (Ad Bp 1–321), wobei PAC V und weitere Sequenzen im Ad-Bereich Bp 322–360 deletiert sind.
  • Diese modifizierten Helferviren sind durch eine verminderte Effizienz der Helferviruscapsidierung gekennzeichnet. Diese Helferviren mit den spezifischen Modifikationen der mit der Verpackungseffizienz verbundenen Sequenzen liefern eine Verpackungseffizienz, die hoch genug ist, um Produktionsmengen des Helfervirus zu erzeugen, aber dennoch niedrig genug ist, daß sie das Erreichen höherer Ausbeuten an AdΔ-transduzierenden Viruspartikeln gemäß der vorliegenden Erfindung gestattet.
  • B. Die ausgewählten Adenovirusgene
  • Erfindungsgemäße Helferviren, gleichgültig ob sie die oben beschriebenen „lähmenden" Modifikationen enthalten oder nicht, enthalten je nach der Zelllinie, die mit dem Helfervirus und dem Shuttle-Vektor transfiziert wird, ausgewählte adenovirale Gensequenzen. Ein bevorzugtes Helfervirus enthält verschiedene Adenovirusgene zusätzlich zu den oben beschriebenen modifizierten Sequenzen.
  • Beispielsweise kann es sich bei dem Helfervirus um ein Wildtyp-Ad-Virus handeln, falls es sich bei der zur Produktion des rekombinanten Virus verwendeten Zelllinie nicht um eine Verpackungszellinie handelt. Somit liefert das Helfervirus die notwendigen frühen Adenovirusgene E1, E2, E4 sowie alle übrigen späten, intermediären, Struktur- und Nichtstrukturgene des Adenovirusgenoms. Bei diesem Helfervirus kann es sich durch den Einbau von Modifikationen in seiner nativen 5'-Verpackungs-/Enhancer-Domäne um ein gelähmtes Helfervirus handeln.
  • Ein wünschenswertes Helfervirus ist replikationsdefekt, wobei ihm alle oder ein hinreichender Anteil der adenoviralen frühen Gene, nämlich dem sehr frühen Gen E1a (das von mu 1.3 bis 4.5 reicht) sowie des spätfrühen [delayed early] Gens E1b (das von mu 4.6 bis 11.2 reicht), fehlen, um ihre normalen biologischen Funktionen auszuschalten. Solche replikationsdefekten Viren können auch lähmende Modifikationen in der Verpackungs-/Enhancer-Domäne aufweisen. Aufgrund der Schwierigkeit im Zusammenhang mit dem vollständigen Abtrennen von Adenovirus aus AdΔ-Präparationen, die durch CsCl-Auftriebsdichtezentrifugation angereichert wurden, wird durch Verwendung eines replikationsdefekten Helfer-Adenovirus die Einführung von infektiösem Adenovirus für in vivo-Untersuchungen an Tieren vermieden. Dieses Helfervirus wird zusammen mit einer Verpackungszellinie eingesetzt, die die fehlenden E1-Proteine liefert, wie z.B. die Zelllinie 293.
  • Darüber hinaus kann das gesamte oder ein Teil des adenoviralen späten-frühen Gens E3 (das von mu 76.6 bis 86.2 reicht) aus der Adenovirussequenz, die einen Teil der erfindungsgemäß geeigneten Helferviren bildet, entfernt werden, ohne dabei die Funktion des Helfervirus negativ zu beeinflussen, da dieses Genprodukt für die Bildung eines funktionierenden Virus nicht notwendig ist.
  • In Gegenwart anderer Verpackungszellinien, die in der Lage sind, adenovirale Proteine zusätzlich zu E1 zu liefern, können dementsprechend die diese adenoviralen Proteine codierenden Gene in dem Helfervirus deletiert sein. Solche Helferviren mit zusätzlichen Deletionen können wünschenwerterweise auch lähmende Modifikationen, wie oben beschrieben, enthalten.
  • C. Ein Reporter-Minigen
  • Ebenso ist es wünschenswert, daß das Helfervirus ein Reporter-Minigen enthält, wobei sich das Reportergen wünschenwerterweise von dem im Shuttle-Vektor enthaltenen Reportertransgens unterscheidet. Eine Reihe solcher Reportergene sind bekannt, wie oben ausgeführt. Das Vorhandensein eines Reportergens auf dem Helfervirus, das sich von dem Reportergen auf dem pAdΔ unterscheidet, gestattet die unabhängige Überwachung sowohl des rekombinanten AdΔ-Virus als auch des Helfervirus. So ermöglicht beispielsweise die Expression rekombinanter alkalischer Phosphatase die Überwachung von Restmengen an verunreinigendem Adenovirus, unabhängig von dem von einem pAdΔ-Shuttle-Vektor oder einem AdΔ-Virus exprimierten rekombinanten LacZ.
  • D. Helfervirus-Polykationen-Konjugate
  • Noch ein weiteres Verfahren zur Verringerung der Verunreinigung von Helfervirus beinhaltet die Bildung von Polykatione-Helfervirus-Konjugaten, die mit einem andere, nicht im Helfervirus vorhandene adenovirale Gene enthaltenden Plasmid assoziiert sein können. Die oben beschriebenen Helferviren können weiterhin durch Zurückgreifen auf die Adenovirus-Polylysin-Konjugat-Technologie modifiziert werden (siehe z.B. Wu et al, J. Biol. Chem., 264: 16985–16987 (1989); und K. J. Fisher und J. M. Wilson, Biochem. J., 299: 49 (1. April 1994), die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • Mit dieser Technologie wird ein vorzugsweise die späten adenoviralen Gene enthaltendes Helfervirus durch Zugabe einer um das Capsid des Helfervirus verteilten Polykationen-Sequenz modifiziert. Vorzugsweise handelt sich bei dem Polykation um Polylysin, das unter Bildung einer externen positiven Ladung um den negativ geladenen Vektor herum bindet. Danach wird ein Plasmid konstruiert, um diejenigen adenoviralen Gene, die nicht im Helfervirus vorhanden sind, beispielsweise die Gene E1, E2 und/oder E4, zu exprimieren. Das Plasmid lagert sich an das Helfervirus-Konjugat über die Ladungen auf der Polylysinsequenz an. Diese Modifikation wird wünschenwerterweise auch an einem erfindungsgemäßen lähmenden Helfervirus ausgeführt. Dieses Konjugat (auch als Trans-Infektionspartikel bezeichnet) gestattet die Entfernung zusätzlicher Adenovirusgene aus dem Helfervirus und deren Vorhandensein auf einem Plasmid, das während der Produktion des rekombinanten Virusvektors nicht in das Virus eingebaut wird. Somit wird die Auswirkung einer Verunreinigung beträchtlich vermindert.
  • III. Zusammenbau von Shuttle-Vektor, Helfervirus und Produktion von rekombinantem Virus
  • Das Material, aus dem die im pAdΔ-Shuttle-Vektor und den Helferviren verwendeten Sequenzen stammen, wird ebenso wie die unterschiedlichen Vektorkomponenten und die bei der Konstruktion der Shuttle-Vektoren, Helferviren und AdΔ-Viren der vorliegenden Erfindung verwendeten Sequenzen aus kommerziellen oder akademischen Quellen auf der Grundlage von bereits veröffentlichtem und beschriebenen Materialen bezogen. Diese Materialen können auch aus einem individuellen Patienten erhalten oder unter Verwendung von dem Fachmann bekannten und vom Fachmann praktizierten Standardtechniken der Rekombination und molekularen Clonierung erzeugt und ausgewählt werden. Alle Modifikationen von die Vektoren und Viren bildenden existierenden Nukleinsäuresequenzen, einschließlich Sequenzdeletionen, -Insertionen, sowie weitere Mutationen werden ebenso unter Verwendung von Standardtechniken erzeugt.
  • Der Zusammenbau der ausgewählten DNA-Sequenzen des Adenovirus sowie der Reportergene oder therapeutischen Gene und anderen Vektorelementen in den pAdΔ-Shuttle-Vektor unter Verwendung herkömmlicher Techniken ist im Beispiel 1 unten beschrieben. Zu solchen Techniken gehören herkömmliche cDNA-Clonierungstechniken, wie z.B. die in Lehrbüchern [Sambrook et al, oben zitiert] beschriebenen, die Verwendung überlappender Oligonukleotidsequenzen der Adenovirusgenome, die Polymerasekettenreaktion sowie alle zur Bereitstellung der gewünschten Nukleotidsequenz geeigneten Verfahren. Es werden Standard-Transfektions- und Cotransfektionstechniken eingesetzt, z.B. CaPO4-Transfektionstechniken unter Verwendung der Zelllinie HEK 293. Zu weiteren in der vorliegenden Erfindung eingesetzten herkömmlichen Verfahren gehören die homologe Rekombination der Virusgenome, die Plaquebildung von Viren in übergeschichtetem Agar, Verfahren zur Messung einer Signalerzeugung u.ä. Der Zusammenbau eines beliebigen gewünschten AdΔ-Vektors oder Helfervirus der vorliegenden Erfindung liegt im Bereich des fachmännischen Könnens auf Grundlage der Lehren der vorliegenden Erfindung.
  • A. Shuttle-Vektor
  • Wie ausführlich in Beispiel 1 unten beschrieben und unter Zurückgreifen auf 2A und die DNA-Sequenz des in 3 angegebenen Plasmids, wird ein einzigartiger pAdΔ-Shuttle-Vektor der vorliegenden Erfindung, pAdΔ.CMVLacZ, erzeugt. pAdΔ.CMVLacZ enthält Ad5-Sequenzen, die das 5'-Ende codieren, gefolgt von einem CMV-Promotor/Enhancer, einer Spleißdonor-/Spleißakzeptorsequenz, einem bakteriellen Beta-Galactosidasegen (LacZ), einer SV-40-Poly-A-Sequenz (pA), einem 3'-ITR aus Ad5 sowie der restlichen Plasmidsequenz aus dem Grundgerüst des Plasmids pSP72 (Promega).
  • Zur Erzeugung des AdΔ-Genoms, das in den Vektor eingebaut wird, muß zur Freisetzung des AdΔ.CMVLacZ- Genoms das Plasmid pAdΔ.CMVLacZ mit EcoRI verdaut werden, wobei die adenoviralen ITRs freigesetzt und als Ziele für die Replikation verfügbar gemacht werden. Somit ist die Herstellung des Vektors „restriktionsabhängig", d.h. sie erfordert die Rettung der Replikationsmatrize durch Restriktionsendonukleasen. Siehe 2B.
  • Es wurde eine zweite Art von pAdΔ-Plasmid konstruiert, bei der die 3'-terminale Ad-Sequenz in einer Kopf/Schwanz-Anordnung relativ zur 5'-terminalen Sequenz vorliegt. Wie in Beispiel 1 und 4A beschrieben und unter Zurückgreifen auf die DNA-Sequenz des in 5 angegebenen Plasmids, wird eine zweite einzigartige AdΔ-Vektorsequenz der vorliegenden Erfindung, AdΔc.CMVLacZ, aus dem Shuttle-Plasmid pAdΔc.CMVLacZ erzeugt, die eine Ad5-5'-ITR-Sequenz und eine Ad5-3'-ITR-Sequenz in Kopf/Schwanz-Anordnung, gefolgt von einem CMV-Enhancer/Promotor, einer SD/SA-Sequenz, dem LacZ-Gen und der pA-Sequenz, in einem Grundgerüst des Plasmids pSP72 (Promega) enthält. Wie in Beispiel 1B beschrieben, gestattet dieses „restriktionsunabhängige" Plasmid die Replikation des AdΔ-Genoms und seine Rettung aus dem Plasmidgrundgerüst, ohne daß dabei eine Endonukleasebehandlung erfolgt (siehe 4B).
  • B. Helfer-Virus
  • Wie ausführlich in Beispiel 2 beschrieben, handelt es sich bei einem herkömmlichen adenoviralen Helfervirus mit E1-Deletion beispielsweise um das Virus Ad.CBhpAP, das eine 5'-Adenovirussequenz von mu 0–1, eine alkalische Phosphatase aus menschlicher Plazenta (hpAP) enthaltendes Reporter-Minigen unter der Transkriptionskontrolle des β-Actin-Promotors aus Huhn, gefolgt von einer Poly-A-Sequenz aus SV40, gefolgt von Adenovirussequenzen von 9.2 bis 78.4 und 86 bis 100, enthält. Dieser Helfer enthielt Deletionen von mu 1.0 bis 9.2 und 78.4 bis 86, durch die der E1-Bereich sowie der E3-Bereich des Virus weitgehend entfernt werden. Dieses Virus kann wünschenwerterweise durch Modifikationen an seiner Verpackungs-Enhancer-Domäne erfindungsgemäß gelähmt sein.
  • Beispielhafte gelähmte Helferviren der vorliegenden Erfindung werden unter Verwendung der in Beispiel 7 beschriebenen Techniken beschrieben und enthalten die modifizierten 5'-PAC-Sequenzen, d.h. Adenovirusgenom Bp 1–269; m.u. 0–0.75 oder Adenovirusgenom Bp 1–321; m.u. 0–9.89. Kurz gesagt werden die 5'-Sequenzen durch PCR modifiziert und mittels herkömmlicher Techniken in ein herkömmliches Plasmid auf Adenovirusbasis kloniert. Ein hpAP-Minigen wird in das Plasmid eingebaut und danach durch homologe Rekombination mit einem Adenovirus mit E3-Deletion, d17001, unter Erhalt der modifizierten Vektoren so verändert, daß das Reporter-Minigen an seinem 3'-Ende mit den Adenovirussequenzen mu 9.6 bis 78.3 und 87 bis 100 gefolgt wird.
  • Die Erzeugung eines poly-L-Lysin-Konjugat-Helfervirus wurde im wesentlichen wie ausführlich in Beispiel 5 unten und 10 beschrieben demonstriert, indem poly-L-Lysin an das Ad.CBhpAP-Virioncapsid gekuppelt wurde. Als Alternative kann die gleiche Vorgehensweise bei den mit der PAC-Sequenz modifizierten Helferviren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • C. Rekombinantes Add-Virus
  • Wie oben angegeben, gestattet ein pAdΔ-Shuttle-Vektor in Gegenwart eines Helfervirus und/oder einer Verpackungszellinie die Replikation der adenoviralen Transgen-Sequenzen in den Shuttle-Vektor und deren Verpackung in Virioncapside, wodurch das rekombinante AdΔ-Virus gebildet wird. Das derzeitige Verfahren zur Produktion eines solchen AdΔ-Virus beruht auf Transfektion und ist ausführlich in Beispiel 3 beschrieben. Kurz gesagt wird dabei das Helfervirus zur Infektion von Zellen, wie z.B. der menschlichen Verpackungszellinie HEK 293, verwendet, wobei die Zellen dann anschließend mit einem pAdΔ-Shuttle-Vektor, der ein ausgewähltes Transgen enthält, mittels herkömmlicher Verfahren transfiziert werden. Mindestens 30 Stunden nach der Posttransfektion werden die Zellen geerntet und ein Extrakt präpariert. Das AdΔ-Virusgenom wird in Virionen verpackt, die in Cäsiumgradienten bei einer niedrigeren Dichte als das Helfervirus sedimentieren. Somit wird das ein ausgewähltes Transgen enthaltende rekombinante AdΔ-Virus vom Großteil des Helfervirus durch Reinigung über Auftriebsdichte-Ultrazentrifugation in einem CsCl-Gradienten getrennt.
  • Die Ausbeute des AdΔ-transduzierenden Virus hängt weitgehend von der Anzahl der Zellen ab, die mit dem pAdΔ-Shuttle-Plasmid transfiziert werden, was die Verwendung eines Transfektionsprotokolls mit hoher Effizienz wünschenswert macht. Eines dieser Verfahren beinhaltet die Verwendung eines wie oben beschriebenen poly-L-lysinierten Helfer-Adenovirus. Ein wie oben beschriebenes, das gewünschte Transgen unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors enthaltendes pAdΔ-Shuttle-Plasmid wird dann direkt mit dem positiv geladenen Helferviruscapsid komplexiert, was zur Bildung eines einzigen Transfektionspartikels führt, das den pAdΔ-Shuttle-Vektor sowie die Helferfunktionen des Helfervirus enthält.
  • Dabei besteht das zugrundeliegende Prinzip darin, daß das mit pAdΔ-Plasmid-DNA beschichtete Helfer-Adenovirus die darin gebundene Nukleinsäure durch die Zellmembran hindurch und in das Zytoplasma gemäß seinem normalen Zelleintrittsmechanismus cotransportiert. Daher übernimmt das mit poly-L-Lysin modifizierte Helfer-Adenovirus mehrere Rollen im Zusammenhang mit einem auf AdΔ beruhenden Komplex. Erstens bildet es die strukturelle Grundlage, auf der Plasmid-DNA binden kann, wodurch die wirksame Konzentration erhöht wird. Zweitens liefert die rezeptorvermittelte Endozytose des Virus das Vehikel für die zelluläre Aufnahme der Plasmid-DNA. Drittens erleichtert die mit einer Adenovirusinfektion assoziierte endosomalytische Aktivität die Freisetzung von internalisiertem Plasmid in das Zytoplasma. Und das Adenovirus steuert trans-Helferfunktionen bei, von denen das rekombinante AdΔ-Virus hinsichtlich der Replikation und Verpackung transduzierender Viruspartikel abhängt. Das auf Ad beruhende Transfektionsverfahren unter Verwendung eines pAdΔ-Shuttle-Vektors und eines Polykationen-Helfer-Konjugats ist in Beispiel 6 ausführlich dargestellt. Darüber hinaus kann, wie bereits beschrieben, das Helfervirus-Plasmid-Konjugat eine weitere Form der Zuführung der weggelassenen, nicht im pAdΔ-Vektor vorhandenen Adenovirusgene durch das Helfervirus darstellen. Eine solche Struktur ermöglicht die Aufteilung der restlichen benötigten Adenovirusgene zwischen dem Plasmid und dem Helfervirus, womit die Selbstreplikationseffizienz des Helfervirus reduziert wird.
  • Ein gegenwärtig bevorzugtes Verfahren zur Produktion des rekombinanten AdΔ-Virus der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Ausführung der oben beschriebenen Transfektion mit dem gelähmten Helfervirus oder gelähmten Helfervirus-Konjugat, wie oben beschrieben. Ein „gelähmtes" Helfervirus der vorliegenden Erfindung ist nicht dazu in der Lage, sich selbst effizient zu verpacken und gestattet daher die leichte Trennung des Helfervirus von dem neuverpackten AdΔ-Vektor der vorliegenden Erfindung mittels Auftriebsdichte-Ultrazetrifugation in einem CsCl-Gradienten, wie in den Beispielen unten beschrieben ist.
  • IV. Funktion des rekombinanten AdΔ-Virus
  • Sobald das AdΔ-Virus der vorliegenden Erfindung durch Zusammenwirken des Shuttle-Vektors und des Helfervirus produziert wird, kann das AdΔ-Virus auf eine ausgewählte Zielzelle gelenkt und von dieser aufgenommen werden. Die Auswahl der Zielzelle hängt auch von der Verwendung des rekombinanten Virus ab, d.h. ob das Transgen in vitro oder ex vivo zur Produktion in einer gewünschten Zellart zur Rückführung in einen Patienten oder in in vivo zur Zuführung an eine bestimmte Zellart oder ein bestimmtes Zellgewebe repliziert werden soll oder nicht. Bei den Zielzellen kann es sich um beliebige Säugerzellen (vorzugsweise menschliche Zellen) handeln. Beispielsweise kann bei der in-vivo-Verwendung das rekombinante Virus auf eine beliebige, normalerweise je nach Verabreichungsweg mit Adenovirus infizierte Zellart gelenkt werden, d.h. es kann, ohne darauf beschränkt zu sein, auf Neuronen, Hepatozyten, Epithelzellen, u.ä. abzielen. Die Helfer-Adenovirussequenzen liefern die notwendigen Sequenzen, um die Aufnahme des Virus durch das AdΔ zu gestatten.
  • Sobald das rekombinante Virus von einer Zelle aufgenommen wurde, wird das adenoviral flankierte Transgen aus dem adenoviralen Ausgangsgrundgerüst mittels der Maschinerie der infizierten Zelle, wie bei anderen rekombinanten Adenoviren, gerettet. Sobald das rekombinante Minigen aus dem Genom des AdΔ-Virus ausgekoppelt (gerettet) ist, sucht es eine Integrationsstelle im Wirtschromatin und wird darin integriert, und zwar entweder transient oder stabil, was zur Expression des begleitenden Transgens in der Wirtszelle führt.
  • V. Verwendung der AdΔ-Viren in der Gentherapie
  • Durch die neuartigen rekombinanten Viren und Viruskonjugate der vorliegenden Erfindung werden wirksame Gentransfervehikel für die somatische Gentherapie bereitgestellt. Diese Viren werden so hergestellt, daß sie ein therapeutisches Gen anstelle des in den beispielhaften Viren und Vektoren dargestellten LacZ-Reporter-Transgens enthalten. Durch Verwendung der therapeutische Transgene enthaltenden AdΔ-Viren können diese Transgene einem Patienten in vivo oder ex vivo zugeführt werden, um so für die Integration des gewünschten Gens in eine Zielzelle zu sorgen. Somit lassen sich diese Viren zur Korrektur genetischer Mängel oder Defekte einsetzen. Als Beispiel ist die Erzeugung eines AdΔ-Gentransfervehikels zur Behandlung der cystischen Fibrose in Beispiel 4 unten beschrieben. Einem Fachmann ist es möglich, eine beliebige Anzahl anderer Gentransfervehikel unter Einschluß eines ausgewählten Transgens zur Behandlung anderer Erkrankungen zu erzeugen.
  • Die rekombinanten Viren der vorliegenden Erfindung können einem Patienten vorzugsweise als Suspension in einer biologisch verträglichen Lösung oder einem pharmazeutisch unbedenklichen Zuführungsvehikel verabreicht werden. Als Vehikel ist unter anderem sterile Kochsalzlösung geeignet. Für diesen Zweck können auch andere wäßrige und nicht wäßrige isotonische sterile Injektionslösungen sowie wäßrige und nicht wäßrige sterile Suspensionen eingesetzt werden, die als pharmazeutisch unbedenkliche Träger bekannt und dem Fachmann allgemein bekannt sind.
  • Die rekombinanten Viren der vorliegenden Erfindung können in zur Transfektion der gewünschten Zellen und zur Bereitstellung ausreichend hoher Niveaus der Integration und Expression des ausgewählten Transgens hinreichenden Mengen verabreicht werden, so daß ein therapeutischer Vorteil ohne unnötige negative Effekte oder mit medizinisch unbedenklichen physiologischen Effekten, die sich vom Fachmann auf dem Gebiet der Medizin bestimmen lassen, bereitgestellt wird. Zu den herkömmlichen und pharmazeutisch unbedenklichen parenteralen Verabreichungswegen gehören die direkte Zuführung an das Zielorgan, das Zielgewebe oder die Zielstelle, die intranasale, intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intradermale und orale Verabreichung, falls gewünscht, können die Verabreichungswege miteinander kombiniert werden.
  • Die Dosierungen des rekombinanten Virus hängen in erster Linie von Faktoren, wie z.B. dem behandelten Leiden, dem ausgewählten Gen, dem Alter, Gewicht und der Gesundheit des Patienten, ab und können daher zwischen Patienten variieren. Man nimmt an, daß eine therapeutisch wirksame Dosierung der Viren der vorliegenden Erfindung für den Menschen im Bereich von etwa 20 bis 50 ml Kochsalzlösung mit Konzentrationen von 1 × 107 bis 1 × 1010 pfu/ml Virus der vorliegenden Erfindung liegt. Eine bevorzugte Dosierung für den Menschen beträgt etwa 20 ml Kochsalzlösung bei den obigen Konzentrationen. Die Dosierung wird so eingestellt, daß dadurch der therapeutische Vorteil gegen mögliche Nebenwirkungen aufgewogen wird. Die Expressionsniveaus des ausgewählten Gens lassen sich zur Auswahl, Einstellung oder Häufigkeit der Verabreichung der Dosierung überwachen.
  • In den folgenden Beispielen werden die Konstruktion der pAdΔ-Shuttle-Vektoren, Helferviren und rekombinanten AdΔ-Viren der vorliegenden Erfindung sowie deren Verwendung in der Gentherapie veranschaulicht. Diese Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und stellen keine Beschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung dar.
  • Beispiel 1 – Produktion der Shuttle-Vektoren pAdΔ.CMVLacZ und pAdΔc.CMVLacZ
  • A. pAdΔ.CMVLacZ
  • Eine Sequenz des menschlichen Adenovirus Ad5 wurde so modifiziert, daß sie eine Deletion im E1a-Bereich [Karteneinheiten 1 bis 9.2], die unmittelbar auf den Ad-5'-Bereich (Bp 1–360) folgt, enthält (dargestellt in 1A). Somit enthält das Plasmid die 5'-ITR-Sequenz (BP 1–103), die nativen Verpackungs/Enhancer-Sequenzen sowie die TATA-Box für den E1a-Bereich (Bp 104–360). Ein Minigen, das den sehr frühen CMV-Enhancer/Promotor, eine SD/SA-Sequenz, ein zytoplasmatisches lacZ-Gen sowie SV40-Poly-A (pA) enthält, wurde an der Stelle der E1a-Deletion eingeführt. Dieses Konstrukt wurde weiter modifiziert, so daß auf das Minigen die 3'-ITR-Sequenzen (Bp 35.353-Ende) folgen. Die DNA-Sequenzen für diese Komponenten sind in 3 und SEQ ID NO: 1 aufgeführt (siehe auch die kurze Beschreibung dieser Figur).
  • Dieses Konstrukt wurde dann mit herkömmlichen Techniken in ein Grundgerüst des pSP72-Vektors (Promega) unter Erhalt des zirkulären Shuttle-Vektors pAdΔ.CMVLacZ kloniert. Siehe die schematische Darstellung in 2A. Dieses Konstrukt wurde mit die 5'- und 3'-Ad5-ITR-Sequenzen flankierenden EcoRI-Stellen konstruiert. pAdΔ.CMVLacZ wurde danach einer enzymatischen Verdauung mit EcoRI unterzogen, wobei ein lineares Fragment des Vektors freigesetzt wurde, das vom terminalen Ende der Ad-5'-ITR-Sequenz bis zum Terminalende der 3'-ITR-Sequenz aus dem Plasmidgrundgerüst reicht. Siehe 2B.
  • B. pAdΔc.CMVLacZ
  • Der Shuttle-Vektor pAdΔc.CMVLacZ (4A und 5) wurde unter Verwendung eines Grundgerüsts von pSP72 (Promega) konstruiert, so daß die Ad5 5'-ITR und 3'-ITR in einer Kopf/Schwanz-Anordnung zueinander vorlagen. Die Organisation der Ad5-ITRs beruht auf Berichten, die vermuten lassen, daß zirkuläre Ad-Genome, bei denen die terminalen Enden in einer Kopf/Schwanz-Anordung zusammenfusioniert sind, Infektionsniveaus aufweisen, die mit denen linearer Ad-Genome vergleichbar sind. Ein für den CMV-Enhancer, eine SD/SA-Sequenz, das LacZ-Gen und die Poly-A-Sequenz kodierendes Minigen wurde unmittelbar hinter den 5'-ITR eingefügt. Die DNA-Sequenz des erhaltenen Plasmids sowie die Sequenzen der einzelnen Komponenten sind in 5 und SEQ ID NO: 2 angegeben (siehe auch die kurze Beschreibung zu 5). Dieses Plasmid benötigt keine enzymatische Verdauung vor seiner Verwendung zur Bildung der Viruspartikel (siehe Beispiel 3). Dieser Vektor wurde konstruiert, um eine restriktionsunabhängige Produktion von LacZ-AdΔ-Vektoren zu ermöglichen.
  • Beispiel 2 – Konstruktion eines Helfervirus
  • Bei dem Helfervirus Ad.CBhpAP [K. Kozarsky et al, Som. Cell Mol. Genet., 19(5): 449–458 (1993)] handelt es sich um ein replikationsdefizientes Adenovirus, das ein Minigen für alkalische Phosphatase enthält. An seiner Konstruktion waren herkömmliche Clonierungs- und homologe Rekombinationstechniken beteiligt. Das adenovirale DNA-Substrat wurde aus CsCl-gereinigten d17001-Virionen, einer Ad5-Variante (Serotyp-Untergruppe C), die eine 3 kb große Deletion zwischen mu 78.4 bis 86 im nichtessentiellen E3-Bereich trägt (von Dr. William Wold, Washington University, St. Louis, Missouri zur Verfügung gestellt), extrahiert. Virale DNA wurde zur Kotransfektion durch Verdauung mit ClaI hergestellt (Bp-Position 917 des Adenovirusgenoms), wodurch der linke Arm des Genoms, umfassend die Adenovirus-Karteneinheiten 0–2.5, entfernt wurde. Siehe unteres Diagramm der 1B.
  • Es wurde ein Ausgangsklonierungsvektor, pAd.BglII, konstruiert. Er enthält zwei Segmente des Wildtyp-Ad5-Genoms (d.h. Karteneinheiten 0–1 und 9–16.1), die durch eine einmal vorkommende BglII-Clonierungsstelle zur Insertion heterologer Sequenzen getrennt sind. Die fehlenden Ad5-Sequenzen zwischen den beiden Domänen (Adenovirusgenom Bp 361–3327) führen zur Deletion von E1a und dem Großteil von E1b nach Rekombination mit viraler DNA.
  • Ein rekombinantes hpAP-Minigen wurde konstruiert und die BglII-Stelle von pAd.BglII eingefügt, so daß das komplementierende Plasmid pAdCBhpAP erzeugt wurde. Die lineare Anordnung dieses Minigens umfaßt:
    • (a) den zytoplasmatischen β-Actin-Promotor aus Huhn [Nukleotide +1 bis +275, wie in T.A. Kost et al, Nucl. Acids Res., 11(23): 8287 (1983) beschrieben; Nukleotide 9241–8684 in 7];
    • (b) ein SV40-Intron (z.B. Nukleotide 1579–1711 der SEQ ID NO: 2),
    • (c) die Sequenz für alkalische Phosphatase aus menschlicher Plazenta (erhältlich von GenBank) und
    • (d) ein SV40-Polyadenylierungssignal (ein 237 großes Bam HI-BclI-Restriktionsfragment, das die Spaltungs-/Poly-A-Signale sowohl der frühen als auch der späten Transkriptionseinheiten enthält; z.B. Nukleotide 837–639 der SEQ ID NO: 1).
  • Das erhaltene komplementierende Plasmid, pAdCBhpAP, enthielt eine einzige Kopie des rekombinanten hpAP-Minigens, die von den Adenoviruskoordinaten 0–1 auf der einen Seite und 9.2–16.1 auf der anderen Seite flankiert wurde.
  • Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung einer einmal vorkommenden NheI-Stelle unmittelbar 5' von der Adenovirus-Karteneinheit Null (0) linearisiert, und das oben identifizierte Adenovirussubstrat sowie die komplementierenden Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung eines Standard-Calciumphosphat-Transfektionsverfahrens in 293-Zellen [ATCC CRL1573] transfiziert [siehe z.B. Sambrook et al, oben zitiert]. Das Endergebnis der homologen Rekombination mit Beteiligung von Sequenzen, die sich auf die Adenovirus-Karteneinheiten 9–16.1 kartieren lassen, ist ein Hybrid-Ad.CBhpAP-Helfervirus, das die Adenoviruskarteneinheiten 0–1 enthält, wobei anstelle der E1a- und E1b-codierenden Bereiche aus dem d17001-Adenovirussubstrat das hpAP-Minigen aus dem Plasmid, gefolgt von den Ad-Sequenzen 9 bis 100, mit einer Deletion in den E3-Bereichen (78.4–86 mu), vorliegt.
  • Beispiel 3 – Produktion des rekombinanten AdΔ-Virus
  • Das rekombinante AdΔ-Virus der vorliegenden Erfindung wird durch Kotransfektion eines Shuttle-Vektors mit dem Helfervirus in einer ausgewählten Verpackungs- oder Nicht-Verpackungszellinie erzeugt.
  • Wie ausführlich unten beschrieben, wird das in Beispiel 1A bereit gestellte lineare Fragment oder das LacZ tragende zirkuläre AdΔ-Gen aus Beispiel 1B in das Ad.CBhpAP-Helfervirus (Beispiel 2), durch das ein leerer Capsidkopf bereitgestellt wird, unter Verwendung herkömmlicher Techniken verpackt, wie in 2C dargestellt. Diejenigen Viruspartikel, von denen das pAdΔ-Shuttle-Genom erfolgreich in den Capsidkopf aufgenommen wurde, lassen sich von denjenigen, die das hpAP-Gen tragen, aufgrund der unterschiedlichen Expression von LacZ und hpAP unterscheiden.
  • Ausführlicher gesagt wurden 293-Zellen (4 × 107 pfu 293-Zellen/150-mm-Schale) wurden ausgesät und mit dem (wie in Beispiel 2 beschrieben produziertem) Helfervirus Ad.CBhpAP mit einer MOI von 5 in 20 ml (DMEM/2% fötalem Rinderserum (fetal bovine serum, FBS) infiziert. Dieser helferspezifische Marker ist zur Überwachung des Niveaus der Helferviurs-Verunreinigung in AdΔ-Präparationen vor und nach der Reinigung kritisch. Durch das Helfervirus werden in trans die für die Synthese und Verpackung des AdΔCMVLacZ-Genoms notwendigen Helferfunktionen bereitgestellt.
  • Zwei Stunden nach der Infektion mit entweder dem restriktionsabhängigen Shuttle-Vektor oder dem restriktionsunabhängigen Shuttle-Vektor wurde zu den Zellen das (EcoRI verdaute) Plasmid pAdΔ.CMVLacZ oder pAdΔc.CMVLacZ-DNA, jeweils ein LacZ-Minigen tragend, mittels einem Kalziumphosphatprecipitat (2,5 ml Kalziumphosphat-Transfektionscocktail mit 50 μg Plasmid-DNA) gegeben.
  • Dreißig bis vierzig Stunden nach Transfektion wurden die Zellen geerntet, in 10 mM Tris-Cl (pH 8,0) (0,5 ml/150-mm-Platte) suspendiert und bei –80°C eingefroren. Die gefrorenen Zellsuspensionen wurden dreimal einem Zyklus aus Einfrieren (Ethanol-Trockeneis) und Auftauen (37°C) unterzogen, um die Virioncapside freizusetzen. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (10 Minuten bei 5.000×g) abgetrennt und danach der geklärte Überstand auf einen CsCl-Gradienten aufgetragen, um rekombinantes Virus vom Fehlervirus wie folgt zu trennen.
  • Die auf den diskontinuierlichen CsCl-Gradienten (zusammengesetzt aus gleichen Volumen an CsCl mit 1,2 g/ml, 1,36 g/ml und 1,45 g/ml 10 mM Tris-Cl (pH 8,0)) aufgetragenen Überstände (10 ml) wurden 8 Stunden bei 72.128×g zentrifugiert, wodurch infektiöses Helfervirus von unvollständigen Virionen getrennt wurden. Die Fraktionen wurden aus der Zwischenphase zwischen den Helfer- und oberen Komponenten gesammelt und durch Southern-Blot-Hybridisierung oder auf das Vorhandensein von LacZ-transduzierenden Partikeln hin analysiert. Für eine Funktionsanalyse wurden Portionen (2,0 ml von jeder Probe) der gleichen Fraktionen auf Einfachschichten von 293-Zellen (in 35-mm-Vertiefungen) gegeben und die Expression der rekombinanten β-Galactosidase 24 Stunden später bestimmt. Insbesondere wurden Einfachschichten geerntet, in 0,3 ml 10 mM Tris-Cl-(pH 8,0)-Puffer suspendiert und ein Extrakt durch drei Zyklen aus Einfrieren und Auftrauen präpariert. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation abgetrennt und der Überstand gemäß den in J. Price et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84: 156–160 (1987) beschriebenen Verfahren auf β-Galactosidaseaktivität (LacZ-Aktivität) getestet. Die spezifische Aktivität (Milliunits [Millieinheiten] β-Galactosidase/mg Protein oder Reporter-Enzyme wurde von Indikatiorzellen aus gemessen. Für das rekombinante Virus betrug die spezifische Aktivität 116.
  • Fraktionen mit β-Galactosidaseaktivität aus dem diskontinuierlichen Gradienten wurden über einen Cäsium-Gleichgewichtsgradienten sedimentiert, um die Präparation für das AdΔ-Virus weiter anzureichern. Dabei wurde ein linearer Gradient mit Dichten von 1,29 bis 1,34 gm/ml in der Zone des rekombinanten Virus erzeugt. Ein scharfer Peak des rekombinanten Virus, der als das Auftreten der β-Gal-Aktivität in infizierten 293-Zellen nachgewiesen wurde, eluierte zwischen 1,31 und 1,33 gm/dl. Dieser Peak an rekombinanten Virus lag zwischen zwei Hauptpeaks der Absorption A260 nm und in einer Zone des Gradienten, wo das Helfervirus sehr stark abfiel. Durch den Gleichgewichtssedimentationsgradienten wurde eine weitere 102- bis 103fache Aufreinigung des rekombinanten Virus vom Helfervirus erzielt. Die Ausbeute an aus einer 50-Platten-Präparation nach 2 Sedimentationen gewonnenen rekombinantem AdΔ.CMVLacZ-Virus reichte von 107 bis 108 transduzierenden Partikeln.
  • Die Analyse von Lysaten von mit dem rekombinanten Vektor transfizierten und mit dem Helfer infizierten Zellen zeigte, daß Virionen zur Transduktion des im Vektor enthaltenen rekombinanten Minigens fähig waren. Bei Durchführung einer Southern-Analyse von Portionen der Fraktionen unter Verwendung von für das rekombinante Virus oder das Helfervirus spezifischen Sonden wurde die Verpackung mehrerer molekularer Formen von vektorabgeleiteter Sequenz aufgezeigt. Die vorwiegende Form des deletierten Virusgenoms bestand in der Größe (~5,5 kb) des entsprechenden doppelsträngigen DNA-Monomers (AdΔ.CMVLacZ), wobei auch weniger häufige, jedoch eigenständige Spezies mit höherem Molekulargewicht (~10 kb bzw. ~15 kb) vorhanden waren. Die Gesamtlänge des Helfervirus beträgt 35 kb. Wichtig dabei ist, daß der Peak der Vektortransduktionsaktivität mit der größtmolekularen Form des deletierten Virus übereinstimmt. Diese Ergebnisse bestätigen die Hypothese, daß ITRs und eine durchgehende Verpackungssequenz die einzigen für den Einbau in Virionen notwendigen Elemente darstellen. Eine scheinbar geordnete oder bevorzugte Anordnung des rekombinanten Ad-Monomergenoms führt zu einem biologisch aktiveren Molekül. Die Tatsache, daß höhermolekulare Spezies des deletierten Genoms 2× bzw. 3× größer sind als das monomere deletierte Virusgenom läßt darauf schließen, daß die Umordnungen eine sequentielle Verdopplung des ursprünglichen Genoms beinhalten können.
  • Diese gleichen Verfahren können zur Produktion eines rekombinanten AdΔ-Virus unter Verwendung eines gelähmten Helferviurs oder Helferviurs-Konjugats, wie bereits beschrieben, adaptiert werden.
  • Beispiel 4 – Rekombinantes AdΔ-Virus mit einem therapeutischen Minigen
  • Um die Vielseitigkeit des rekombinanten AdΔ-Virussystems zu testen, wurde das aus pAdΔCMVLacZ erhaltene Reporter-LacZ-Minigen als Kassette durch ein CFTR-codierendes therapeutisches Minigen ersetzt.
  • Das Minigen enthielt menschliche CFTR-cDNA [Riordan et al, Science, 245: 1066–1073 (1989) Nukleotide 8622–4065 der SEQ ID NO: 3] unter der Transkriptionskontrolle eines chimären CMV-Enhancer/Hühner-β-Actin-Promotorelements (Nukleotide +1 bis +275, wie in T.A. Kost et al, Nucl. Acids Res., 11(23) 8287 (1983) beschrieben; Nukleotide 9241–8684 der SEQ ID NO: 3, 7); und gefolgt von einer SV-40-Poly-A-Sequenz (Nukleotide 3887–3684 der SEQ ID NO: 3, 7).
  • Das CFTR-Minigen wurde in die E1-Deletionsstelle eines Ad5-Virus (pAd.E1Δ genannt), das eine Deletion in E1a von mu 1–9.2 und eine Deletion in E3 von mu 78,4–86 enthält, inseriert.
  • Der erhaltene, pAdΔ.CBCFTR genannte Shuttle-Vektor (siehe 6 und die DNA-Sequenz in 7 [SEQ ID NO: 3]) verwendete die gleichen Ad-ITRs von pAdΔCMVLacZ, jedoch endeten die Ad5-Sequenzen mit NhEI-Stellen anstelle von EcoRI. Daher wurde die Freisetzung des Minigens aus dem Plasmid durch Verdauung mit NheI bewerkstelligt.
  • Das in Beispiel 3 beschriebene Vektorproduktionssystem wurde unter Verwendung des Helfervirus Ad.CBhpAP (Beispiel 2) eingesetzt. Einfachschichten aus 293-Zellen, die bis 80–90% Konfluenz in 150-mm-Kulturschalen bewachsen waren, wurden mit dem Helfervirus bei einer MOI von 5 infiziert. Die Infektionen wurden in mit 2% FBS supplementiertem DMEM bei 20 ml medium/150-mm-Platte durchgeführt. Zwei Stunden nach der Infektion wurden 50 μg Plasmid-DNA in 2,5 ml Transfektionscocktail zu jeder Platte gegeben und gleichmäßig verteilt.
  • Die Zuführung des pAdΔ.CBCFTR-Plasmids an 293-Zellen wurde durch Bildung eines Kalziumphosphatprecipitats vermittelt, und das AdΔ.CBCFTR-Virus wurde vom Ad.CBphAP-Helfervirus mittels CsCl-Auftriebsdichte-Ultrazentrifugation wie folgt getrennt:
    Zellen wurden 10–14 h in diesem Zustand gelassen, wonach das Infektions-/Transfektionsmedium durch 20 ml frisches DMEDM/2% FBS ersetzt wurde. Ungefähr 30 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet, in 10 mM Tris-Cl (pH 8,0)-Puffer (0,5 ml/150-mm-Platte) suspendiert und bei –80°C gelagert.
  • Gefrorene Zellsuspensionen wurden durch drei aufeinanderfolgende Runden von Einfrieren (Ethanol-Trockeneis) und Auftauen (37°C) lysiert. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (10 min bei 5.000 × g) entfernt, und 10 ml geklärter Extrakt wurde auf einen CsCl-Stufengradienten, der sich aus drei Lagen von jeweils 9,0 ml mit Dichten von 1,45 g/ml, 1,36 g/ml und 1,20 g/ml CsCl in 10 mM Tris-Cl-(pH 8,0)-Puffer zusammensetzte, geschichtet. Die Zentrifugation wurde 8 h bei 4°C in einem Beckmann SW-28-Rotor bei 20.000 UpM durchgeführt. Fraktionen (1,0 ml) wurden vom Boden des Zentrifugenröhrchens gesammelt und auf rΔAd transduzierende Vektoren analysiert. Peakfraktionen wurden vereinigt und unter Bandenbildung bis zum Gleichgewicht zentrifugiert. Transduzierende Virionen enthaltende Fraktionen wurden gegen 20 mM HEPES (pH 7,8)/150 mM NaCl (HBS) dialysiert und eingefroren bei –80°C in Gegenwart von 10% Glyzerin oder als flüssige Stammlösung bei –20°C (HBS + 40% Glyzerin) gelagert.
  • Nach der Ultrazentrifugation gesammelte Fraktionen wurden auf Transgenexpression und Vektor-DNA analysiert. Für die lacZ-Δ-rAd-Vektoren wurden Portionen von jeweils 2 μl zu in 35-mm-Kulturschalenvertiefungen ausgesäten Einzelschichten von 293-Zellen gegeben. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Zellen geerntet, in 0,3 ml 10 mM Tris-Cl-(pH 8,0)-Puffer suspendiert und durch drei Runden aus Einfrieren/Auftauen lysiert. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (10 min bei 15.000 × g) entfernt und auf Gesamtprotein [Bradford, (1976)] sowie β-Galactosidaseaktivität [Sambrook et al, (1989)] mit ONPG (o-Nitrophenyl β-D-galactopyranosid) als Substrat getestet.
  • Die Expression des CFTR-Proteins vom AdΔ.CBCFTR-Vektor wurde durch Immunfluoreszenzlokalisierung bestimmt. Portionen von RdΔ.CBCFTR, angereichert durch zwei Runden Ultrazentrifugation und gegen HBS-Lagerungspuffer ausgetauscht, wurden zu Primärkulturen von Luftwegepithelzellen, die aus den Lungen von CF-Transplantatempfängern gewonnen wurden, gegeben. Vierundzwanzig Stunden nach Zugabe des Vektors wurden die Zellen geerntet und unter Zentrifugalkraft (Cytospin 3, Shandon Scientific Limited) auf Glasobjektträger fixiert. Die Zellen wurden mit frisch präpariertem 3% Paraformaldehyd in PBS (1,4 mM KH2PO4, 4,3 mM Na2HPO4, 2,7 mM KCl und 137 mM NaCl) 15 min bei Raumtemperatur (RT) fixiert, zweimal in PBS gewaschen und mit 0,05 NP-40 10 min bei RT permeabilisiert. Das Immunfluoreszenzverfahren begann mit einem Blockierungsschritt in 10% Ziegenserum (PBS/GS) für 1 h bei RT mit anschließender Bindung des primären monoklonalen Maus-Anti-Mensch-CFTR-Antikörpers (R-Domäne-spezifisch) (Genyme), 1:500 verdünnt in PBS/GS, für 2 h bei RT. Die Zellen wurden ausgiebig in PBS/GS gewaschen und 1 h bei RT mit einem Esel-Anti-Maus-IgG-(H + L)-FITC-konjugierten Antikörper (Jackson ImmunoReasearch Laboratories), 1:100 verdünnt in PBS/GS, inkubiert.
  • Zur Southern-Analyse der Vektor-DNA wurden Portionen von jeweils 5 μl direkt von CsCl-Fraktionen abgenommen und mit 20 μl Capsid-Verdauungspuffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,0; 1,0 mM EDTA, pH 8,0; 0,5% SDS und 1,0 mg/ml 1 h bei 50°C inkubiert. Man ließ die Reaktionen auf RT abkühlen, wonach Ladefarbstoff zugegeben wurde und eine Elektrophorese durch ein 1,2% Agarosegel durchgeführt wurde. Die aufgetrennten DNAs wurden durch Elektroblotting auf eine Nylonmembran (Hybond-N) übertragen und mit einem 32-P markierten Restriktionsfragment hybridisiert. Die Blots wurden durch Autoradiographie oder Scanning auf einem Phoshorimager 445 SI (Molecular Dynamics) analysiert.
  • Die aus der Southern-Blot-Analyse der Gradientenfraktionen erhaltenen Ergebnisse zeigten eine auffällige Virusbande, die schneller als die Ad.CBhpAP-Helfer-DNA wanderte. Die höchsten Virustiter ergaben sich für die Fraktionen 3 und 4. Eine Quantifizierung der Banden in Fraktion 4 deutete an, daß der Titer von Ad.CBhpAP ungefähr 1,5× größer war als der von AdΔCBCFTR. Berücksichtigt man jedoch den Größenunterschied zwischen den beiden Viren (Ad.CBhpAP = 35 kb; AdΔCBCFTR = 6,2 kb), so ist der Virustiter (bei dem 1 Partikel = 1 DNA-Molekül ist) von AdΔCB.CFTR wenigstens 4mal größer als der Virustiter von Ad.CBhpAP.
  • Während die Southern-Blot-Analyse der Gradientenfraktionen zur Darstellung der Produktion der AdΔ-Viruspartikel nützlich war, wurde dadurch auch der Nutzen der Ultrazentrifugation zur Reinigung von AdΔ-Viren demonstriert. Im Hinblick auf den letzteren dieser Punkte bildeten sowohl LacZ als auch CFTR transduzierende Viren in CsCl Banden bei einer mittleren Dichte, die zwischen dem infektiösem Adenovirus-Helfervirionen (1,34 g/ml) und unvollständigen Capsiden (1,31 g/ml) lag. Die geringere Dichte im Vergleich zum Helfervirus wird wahrscheinlich durch das von den AdΔ-Viren getragene kleinere Genom verursacht. Dies läßt weiterhin vermuten, daß Änderungen der Virusgröße die Dichte und Reinigung AdΔ-Virus beeinflussen. Nichtsdestotrotz ist die Fähigkeit zur Trennung des AdΔ-Virus vom Helfervirus eine wichtige Beobachtung und läßt vermuten, daß eine weitere Reinigung durch aufeinanderfolgende Runden der Bandenbildung mittels Zentrifugation durch CsCl erreicht werden.
  • Dieses rekombinante Virus eignet sich für die Gentherapie entweder allein oder vorzugsweise in Form eines wie hier beschrieben hergestellten Konjugats.
  • Beispiel 5 – Korrektur eines genetischen Defekts in CF-Luftwegepithelzellen mit AdΔCB.CFTR
  • Die Behandlung der cystischen Fibrose unter Nutzung des oben bereitgestellten rekombinanten Virus ist besonders geeignet für die lungengerichtete Gentherapie in vivo. Luftwegepithelzellen sind die wünschenswertesten Ziele für den Gentransfer, da die Komplikationen der CF im Zusammenhang mit der Lunge normalerweise die größten pathologischen und lebenseinschränkenden Folgen darstellt.
  • Das rekombinante AdΔCB.CFTR-Virus wurde auf nacheinander durchgeführten CsCl-Gradienten aufgetrennt, und CFTR-haltige Fraktionen, die zwischen den oben beschriebenen Adenovirusfraktionen und Fraktionen der oberen Komponenten wandern, wurden zur Infektion von Primärkulturen menschlicher Luftwegsepithelzellen, die aus den Lungen eines CF-Patienten stammten, verwendet. Die Kulturen wurden anschließend auf Expression des CFTR-Proteins mittels Immuncytochemie analysiert. Der Immunfluoreszenznachweis mit Maus-Anti-Mensch-CFTR-Antikörper (R-Domäne-spezifisch) wurde 24 Stunden nach Zugabe des rekombinanten Virus durchgeführt. Die Analyse von scheininfizierten CF-Zellen zeigte keine signifikante Bindung an den R-Domäne-spezifischen CFTR-Antikörper. Dem rekombinanten Virus ausgesetzte Luftwegepithel-Primärkulturen zeigten hohe Niveaus an CFTR-Protein in 10–20% der Zellen.
  • Somit kann das das CFTR-Gen enthaltende erfindungsgemäße rekombinante Virus direkt in die Luftwege eingeführt werden, indem beispielsweise das obige Virus in eine Präparation, die inhaliert werden kann, formuliert wird. Beispielsweise wird das das CFTR-Gen enthaltende erfindungsgemäße rekombinante Virus oder Konjugat in 0,25 molarem Natriumchlorid suspendiert. Das Virus oder Konjugat wird von den Atemwegzellen aufgenommen und das Gen exprimiert.
  • Als Alternative können das Virus oder die Konjugate der vorliegenden Erfindung mit anderen geeigneten Mitteln zugeführt werden, einschließlich stellengerichteter Injektion des das CFTR-Gen tragenden Virus. Im Fall einer CFTR-Gen-Zuführung sind als Lösungen für die Bronchialinstillation sterile Kochsalzlösungen, die das Virus der vorliegenden Erfindung im Bereich von etwa 1 × 107 bis 1 × 1010 pfu/ml, insbesondere im Bereich von etwa 1 × 108 bis 1 × 109 pfu/ml enthalten, bevorzugt.
  • Weitere geeignete Verfahren zur Behandlung der cystischen Fibrose durch Verwendung von gentherapeutischen rekombinanten Viren der vorliegenden Erfindung lassen sich den Fachdiskussionen über weitere Arten von Gentherapievektoren für CF entnehmen. Siehe z.B. US-Patent Nr. 5,240,846, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Beispiel 6 – Synthese des Polykationen-Helfervirus-Konjugats
  • Eine weitere Version des Helfervirus der vorliegenden Erfindung besteht in einem Polylysinkonjugat, das die direkte Komplexierung des pAdΔ-Shuttle-Plasmids mit dem Helferviruscapsid ermöglicht. Dieses Konjugat gestattet eine effiziente Zuführung des Shuttle-Plasmid-pAdΔ-Shuttle-Vektors gemeinsam mit dem Helfervirus, wodurch die Notwendigkeit für einen getrennten Transfektionsschritt entfällt. Siehe 10 für eine schematische Skizze in dieser Konstruktion. Andererseits wird durch ein solches Konjugat mit einem eine Ad-Gene liefernden Plasmid und dem die restlichen, zur Produktion des AdΔ-Virusvektors notwendigen Gene liefernden Helfer ein neuartiger Weg zur Verringerung des Helfervirus, wie oben diskutiert, bereitgestellt.
  • Gereinigte Stammlösungen einer Ad.CBhpAP-Expansion im Großmaßstab wurden im wesentlichen wie von K. J. Fisher und J. M. Wilson, Biochem. J., 299: 49–58 (1994), beschrieben durch Kupplung von Poly-L-Lysin an das Virioncapsid modifiziert, was zu einem Ad.CBhpAP-(Lys)n-Konjugat führt. Das Verfahren beinhaltet drei Schritte.
  • Erstens wurde das CsCl-Banden-gereinigte Helfervirus Ad.CBhpAP mit dem heterobifunktionellen Quervernetzer Sulfo-SMCC [Sulfo-(N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat] (Pierce) umgesetzt. Die Konjugationsreaktion, die 0,5 mg (375 nmol) Sulfo-SMCC sowie 6 × 1012 A260-Helferviruspartikel in 3, 0 ml HBS enthielt, wurde 45 Minuten unter konstantem leichtem Schütteln bei 30°C inkubiert. Bei diesem Schritt wird eine Peptidbindung zwischen dem aktiven N-Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester) des Sulfo-SMCC und einem freien Amin (z.B. Lysin), das von einer adenoviralen Proteinsequenz (Capsidprotein) im Vektor beigesteuert wird, ausgebildet, wodurch ein maleimidaktiviertes Viruspartikel erhalten wird. Das aktivierte Adenovirus ist in 10 gezeigt, wobei die Capsidproteinfaser mit der nukleophilen Maleimidgruppierung markiert ist. In der Praxis dienen auch andere Capsid-Polypeptide, einschließlich Hexon- und Pentonbase, als Ziele.
  • Nicht eingebauter, nicht umgesetzter Quervernetzer wurde durch Gelfiltration auf einer 1 cm × 15 cm großen und mit 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,0 und 150 mM NaCl equilibrierten Bio-Gel-Säule P-6DG (Bio-Rad Laboratories) abgetrennt. A260-Peak-Fraktionen, die das maleimidaktivierte Helfervirus enthielten, wurden vereinigt und auf Eis gestellt.
  • Zweitens wurde Poly-L-Lysin mit einer Molmasse von 58 kDa bei 10 mg/ml in 50 mM Triethanolaminpuffer (pH 8,0), 150 mM NaCl und 1 mM EDTA mit 2-Imminothiolan/HCl (Traut-Reagenz; Pierce) auf ein Molverhältnis von 2 Mol SH/Mol Polylysin unter N2 thioliert; das cyclische Thioimidat reagiert mit den primären Aminen des Poly-(L-Lysins) was zu einem thiolierten Polykation führt. Nach einer 45minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Reaktion auf eine 1 cm × 15 cm große, mit 50 mM Tris/HCl-Puffer (pH 7,0), 150 mM NaCl und 2 mM EDTA equilibrierte Bio-Gel-P6DG-Säule aufgetragen, um nicht eingebautes Traut-Reagenz abzutrennen.
  • Die Quantifizierung der freien Thiolgruppen erfolgte mit Ellmann-Reagenz [5,5'-Dithio-bis-(2-nitrobenzoesäure)], was ungefähr 3–4 Mol -SH/Mol Poly-L-Lysin ergab. Die Kupplungsreaktion wurde durch Zugabe von 1 × 1012 A260-Partikeln von maleimidaktiviertem Helfervirus/mg thioliertes Poly-L-Lysin und Inkubation des Gemischs auf Eis für 15 Stunden bei 4°C unter Argon gestartet. Bei Beendigung der Reaktion wurde das Gemisch mit 2-Mercaptoethylamin versetzt und bei Raumtemperatur 20 Minuten inkubiert, um nicht umgesetzte Maleimidstellen zu blockieren.
  • Viruspolylysin-Konjugate, Ad.CPAP-p(Lys)n, wurden entfernt vom, nicht-konjugierten Poly-L-Lysin mittels Ultrazentrifugation durch ein CsCl-Stufengradienten mit einer Anfangszusammensetzung aus gleichen Volumen an 1,45 g/ml (untere Stufe) und 1,2 g/ml (obere Stufe) CsCl in 10 mM Tris/HCl-Puffer (pH 8,0) gereinigt. Die Zentrifugation wurde 2 Stunden bei 90.000 g und 5°C durchgeführt. Das Endprodukt wurde gegen 20 mM Hepes-Puffer (pH 7,8) mit 150 mM NaCl (HBS) dialysiert.
  • Beispiel 7 – Bildung des AdΔ/Helfer-pLys-Viruspartikels
  • Die Bildung des Ad.CBhpAP-pLys/padΔ.CMVLacZ-Partikels wird durch Zugabe von 20 μg pAdΔ.CMVLacZ-Plasmid-DNAs zu 1.2 × 1012 A260-Partikel Ad.CBhpAP-pLys in einem Endvolumen von 0,2 ml DMEM gestartet, wobei man den Komplex zwischen 10–15 Minuten bei Raumtemperatur entwickeln läßt. Dieses Verhältnis gibt typischerweise die Plasmid-DNA-Bindungskapazität einer Standardcharge des Adenovirus-pLys-Konjugats wieder und ergibt die höchsten Niveaus an Plasmid-Transgenexpression.
  • Das erhaltende Trans-Infektionspartikel wird auf 293-Zellen (4 × 107 Zellen, ausgesät auf einer 150-mm-Schale) transfiziert. Dreißig Stunden nach der Transfektion werden die Partikel isoliert und zur Gewinnung eines Extrakts einer Einfrieren/Auftauen-Technik ausgesetzt. Der Extrakt wird auf einem CsCl-Stufengradienten mit Gradienten bei 1,20 g/ml, 1,36 g/ml und 1,45 g/ml gereinigt. Nach 8 Stunden Zentrifugation bei 90.000 × g wurden die AdΔ-Vektoren aus einer Fraktion unterhalb der oberen Komponenten, wie sie durch das Vorhandensein von LacZ identifiziert wurde, erhalten, wobei das Helfervirus aus einer kleineren, dichteren Fraktion, wie sie durch das Vorhandensein von hpAP identifiziert wurde, erhalten wurde.
  • Beispiel 8 – Konstruktion modifizierter Helferviren mit gelähmten Verpackungssequenzen (PAC-Sequenzen)
  • Dieses Beispiel bezieht sich auf 9A bis 9C, 10A und 10B bei der Konstruktion der modifizierten Helferviren der vorliegenden Erfindung.
  • Ad5'-terminale Sequenzen, die die PAC-Domänen I und II (8A) oder die PAC-Domänen I, II, III und IV (8B) wurden mittels PCR aus dem in 1B dargestellten Wildtyp Ad5-5'-Genom unter Verwendung von durch die Pfeile in 1B angezeigten PCR-Clonen erzeugt. Die Sequenzen der erhaltenen Amplifikationsprodukte (8A und 8B) unterschieden sich vom Wildtyp Ad5'-Genom in der Anzahl an A-Wiederholungen, die vom linken (5'-)Ende getragen wurden.
  • Wie in 8C dargestellt, wurden diese Amplifikationsprodukte in die Mehrfachklonierungstelle von pAd.Link.1 (IHGT Vector Core) subkloniert. Bei pAd.Link.1 handelt es sich um ein Plasmid auf Adenovirusbasis, das Adenovirus m.u. 9.6 bis 16.1 enthält. Die Insertion der modifizierten PAC-Bereiche in pAd.Link.l erzeugte zwei Vektoren, pAd.PACII (enthaltend die PAC-Domänen I und II) und pAd.PACIV (enthaltend die PAC-Domänen I, II, III und IV). Danach wurde, wie in 10A und 10B dargestellt, für jedes dieser Plasmide jeweils ein Reporter-Minigen der alkalischen Phosphatase aus menschlicher Plazenta, das den sehr frühen CMV-Enhancer/Promotor (CMV), cDNA der alkalischen Phosphatase aus menschlicher Plazenta (hpAP) sowie das SV40-Polyadenylierungssignal (pA) enthielt, in jedem PAC-Vektor subkloniert, wodurch pAd.PACII.CMVhpAP bzw. pAd.PACIV.CMVhpAP erzeugt wurden.
  • Diese Plasmide wurden dann als Substrate für die homologe Rekombination mit dem oben beschriebenen Virus d17001 durch Kotransfektion in 293-Zellen verwendet. Die homologe Rekombination fand zwischen den Adenovirus-Karteneinheiten 9–16 des Plasmids und des gelähmten Ad5-Virus statt. Die Ergebnisse der homologen Rekombination bestanden in Helferviren, die Ad5-5'-terminalen Sequenzen mit den PAC-Domänen I und II bzw. den PAC Domänen I, II, III und IV, gefolgt vom Minigen und Ad5-3'-Sequenzen 9.6–78.3 und 87–100, enthielten. Somit sind in diesen gelähmten Viren das E1-Gen sowie das E3-Gen deletiert.
  • Die Plaquebildungscharakteristika der PAC-Helferviren stellten ein unmittelbares Anzeichen dafür dar, daß die PAC-Modifikationen die Geschwindigkeit und das Ausmaß des Wachstums verminderten. Insbesondere entwickelten sich keine PAC-Helfervirenplaques bis zum Tag 14–21 nach der Transfektion, wobei die Plaques nach der Reifung klein blieben. Aus vorhergehender Erfahrung sollte ein Standard-Ad.CBhpAP-Helfervirus der ersten Generation mit einer vollständigen linken terminalen Sequenz bis Tag 7 sich zu entwickeln beginnen und bis Tag 10 gereift sein.
  • Virusplaques wurden gepickt und in 0,5 ml DMEM-Medium suspendiert. Eine kleine Portion der Virusstammlösung wurde zur Infektion einer frischen Einfachschicht aus 293-Zellen verwendet und auf rekombinante alkalische Phosphataseaktivität 24 Stunden nach der Infektion histochemisch angefärbt. Sechs der acht (die A-Wiederholungen I–IV codierenden) Ad.PACIV.CMVhpAP-Klone, die auf Transgenexpression überprüft wurden, waren positiv, während alle drei Ad.PACII.CMVhpAP-Clone, die ausgewählt wurden, ein positives Ergebnis zeigten. Die Klone untergingen zwei Runden Plaquereinigung und werden zur Zeit expandiert, um eine Arbeitsstammlösung zu erzeugen.
  • Diese gelähmten Helferviren sind bei der Produktion der AdΔ-Viruspartikel gemäß den in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren geeignet. Sie sind dadurch gekennzeichnet, daß sie eine ausreichende Menge von Adenovirusgenen enthalten, um die Verpackung des Shuttle-Vektorgenoms zu gestatten, doch wird ihre Effizienz zur Selbstcapsidierung aufgrund ihrer gelähmten PAC-Sequenzen vermindert. Somit werden weniger Helferviren zu Gunsten einer größeren Menge an rekombinanten AdΔ-Viren produziert. Die Reinigung der AdΔ-Viruspartikel von den Helferviren wird im CsCl-Gradienten erleichtert, der auf dem Gewicht der jeweiligen Viruspartikel beruht. Diese Erleichterung der Reinigung ist ein entscheidender Vorteil der AdΔ-Vektoren der vorliegenden Erfindung im Gegensatz zu den Adenovirusvektoren, die nur eine E1-Deletion oder kleinere Deletionen aufweisen. Die AdΔ-Vektoren weisen selbst mit Minigenen von bis zu 15 kb einen signifikanten Gewichtsunterschied gegenüber Wildtyp- oder anderen Helfer-Adenoviren, die viele adenovirale Gene enthalten, auf.
  • Beispiel 9 – AdΔ-Vektor mit einem Vollängen-Dystrophin transgen
  • Bei der Duchenne'schen Muskeldystrophie (DMD) handelt es sich um eine häufige X-Chromosomen-verknüpfte Erbkrankheit, die durch das Fehlen von Dystrophin, einem von einem 14 Kilobasen großen Transkript codierten 427K großen Protein, verursacht wird. Das Fehlen dieses wichtigen Sarcolemmalproteins führt zu fortschreitendem Muskelabbau, Schwäche und Tod. Ein gegenwärtiger Ansatz zur Behandlung dieser tödlichen Erkrankung besteht in der Übertragung einer funktionsfähigen Kopie des Dystrophingens in die betroffenen Muskeln. Für den Skelettmuskel stellt ein replikationsdefektes Adenovirus ein effizientes Zuführungssystem dar.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein rekombinantes Plasmid pAdΔ.CMVdys, geschaffen, das nur die Ad5-cis-Elemente (d.h. ITRs und zusammenhängende Verpackungssequenzen) enthält und das vom CMV-Promotor gesteuerte Vollängen-Dystrophingen der Maus trägt. Dieses Plasmid wurde wie folgt erzeugt.
  • pSL1180 [Pharmacia Biotech] wurde mit Not I geschnitten, durch Klenow aufgefüllt und religiert, womit die Not-I-Stelle im Plasmid entfernt wurde. Das erhaltene Plasmid wird mit pSL1180NN bezeichnet und trägt einen bakteriellen Ori und das Amp-Restistenzgen.
  • pAdΔ.CMVLacZ aus Beispiel 1 wurde mit EcoRI geschnitten, mit Klenow behandelt und mit dem ApaI-geschnittenen pSL1180NN unter Bildung von pAdΔ.CMVLacZ (ApaI) ligiert.
  • Die 14 kb große Maus-Dystophin-cDNA [Sequenzen angegeben in C. C. Lee et al, Nature, 349: 334–336 (1991)] wurde in zwei großen Fragmenten unter Verwendung eines Lambda-ZAP-Clonierungsvektors (Stratagene) kloniert und anschließend in den Bluescript-Vektor pSK kloniert, wodurch das Plasmid pCCL-DMD entstand. Ein schematisches Diagramm dieses Vektors ist in 11 angegeben, bei dem die Restriktionsenzymstellen dargestellt sind.
  • pAdΔ.CMVLacZ (ApaI) wurde mit NotI geschnitten und das große Fragment wurde von der lacZ-cDNA über ein Gel isoliert. pCCL-DMD wurde ebenfalls mit NotI geschnitten, über ein Gel isoliert und anschließend mit dem großen Not-I-Fragment des mit NotI verdauten pAdΔ.CMVLacZ (ApaI) migiert. Die Sequenzen des erhaltenen Vektors, pAdΔ.CMVmdys, sind in 12A-12P [SEQ ID NO: 10] angegeben.
  • Dieses Plasmid enthält Sequenzen aus dem linken Ende des AdS, umfassend Bp 1–360 (5'-ITR), ein Maus-Dystrophin-Minigen unter der Kontrolle des CMV-Promotors sowie eine Sequenz vom rechten Ende des Ad5, das vom Bp 35353 bis zum Ende des Genoms reicht (3'-ITR). Auf das Minigen folgt eine SV-40-Poly-A-Sequenz, ähnlich zu der für die oben beschriebenen Plasmide beschriebenen Sequenz.
  • Es wird das hier beschriebene Vektorproduktionssystem eingesetzt. Zehn 150-mm-293-Platten werden bei etwa 90% Konfluenz mit einem rekombinanten Reporter-Virus mit E1-Deletion, Ad.CBhpAP, mit einer MOI von 5 60 Minuten bei 37°C infiziert. Diese Zellen werden mit pAdΔ.CMVmDys durch Kalziumphosphat-Koprecipitation unter Verwendung von 50 μg linerisierter DNA/Schale etwa 12–16 Stunden bei 37°C transfiziert. Medium wird durch DMEM + 10% fötales Rinderserum ersetzt.
  • Man beobachtet den vollen cytopathischen Effekt, und es wird ein Zelllysat hergestellt, indem man das Zellpellet dreimal einem Einfrieren/Auftauen-Verfahren aussetzt. Die Zellen werden 2 Stunden einem dreilagigen CsCl-Gradienten im SW41 ausgesetzt, wobei eine zwischen dem Helfer-Adenovirus und unvollständigen Virus wandernde Bande nachgewiesen wird.
  • Fraktionen werden auf einer 6-Loch-Platte, die mit 5 μl der Fraktion 16–20 Stunden in DMEM + 2% FBS infizierte 293-Zellen enthält, getestet. Die Zellen werden gesammelt, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in 2 ml PBS (phosphatgepufferter Kochsalzlösung) resuspendiert. 200 μl der 2 ml-Zellfraktionen werden durch Cytozentrifugation auf einen Objektträger aufgetragen.
  • Die Zellen werden einer Immunfluoreszenz für Dystrophin wie folgt ausgesetzt. Die Zellen wurden in 10N McOH bei –20°C fixiert. Die Zellen wurden einem monoklonalen Antikörper, der für den Carboxyterminus des menschlichen Dystrophins spezifisch ist [NCL-DYS2; Novocastra Laboratories Ltd., UK], ausgesetzt. Die Zellen wurden danach dreimal gewaschen und einem sekundären Antikörper, d.h. 1:200 Ziege-Anti-Maus-IgG in FITC, ausgesetzt.
  • Der Titer/Fraktion für sieben Fraktionen, die sich aus den Immunfluoreszenzfärbungen ergaben, wurde mit der folgenden Formel berechnet und in Tabelle 2 unten aufgeführt.
  • DFU/Feld = (DFU/200 μl Zellen) × 10 = DFU/106 Zellen = (DFU/5 μl Virusfraktion) × 20 = DFU/100 μl Fraktion.
  • Tabelle 2
    Figure 00550001
  • Ein zur Transduktion des Dystrophin-Minigens fähiges Virus wird als „positive" (d.h. grünfluoreszierende) Zelle nachgewiesen. Die Ergebnisse der IF veranschaulichen, daß wärmebehandelte Fraktionen keine positive Immunfluoreszenz zeigen. Southern-Blot-Daten lassen auf eine Spezies mit derselben Größe wie die Ausgangs-DNA, mit Helfervirus-Verunreinigung, schließen.
  • Das rekombinante Virus läßt sich anschließend vom Großteil des Helfervirus mittels Sedimentation durch Cäsiumgradienten trennen. Erste Untersuchungen zeigen, daß die funktionellen AdCMVΔmDys-Vironen zwar produziert werden, jedoch mit Helfervirus verunreinigt sind. Eine erfolgreiche Reinigung würde AdΔ-Vironen ergeben, die keine Virusproteine codieren können, aber zur Transduktion von Maus-Skelettmuskel fähig sind.
  • Beispiel 10 – Pseudotypisierung
  • Durch das folgende Experiment wird ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen rekombinanten AdΔ bereitgestellt, wobei Helferviren von Serotypen verwendet werden, die sich von denen des pAdΔ im Transfektions-/Infektionsprotokoll unterscheiden. Dabei wird nicht erwartet, daß die ITRs sowie die Verpackungssequenz von Ad5 in ein Virion eines anderen Serotyps eingebaut werden könnte.
  • A. Protokoll
  • Der grundlegende Ansatz besteht darin, das rekombinante AdΔ.CMVlacZ-Virus (Ad5) in 293-Zellen zu transfizieren und anschließend die Zelle mit dem von verschiedenen Ad-Serotypen (2, 3, 4, 5, 7, 8, 12 und 40) abgeleiteten Helfervirus zu infizieren. Bei Erreichen der CPE wird das Lysat geerntet und unter Bandenbildung durch zwei Cäsiumgradienten zentrifugiert.
  • Insbesondere wurde das auf Ad5 beruhende Plasmid pAdΔ.CMVlacZ aus Beispiel 1 mit EcoRI linearisiert. Die linearisierten Plasmide wurden dann in zehn 150-mm-Schalen mit 293-Zellen unter Verwendung der Kalziumphosphat-Koprecipitation transfiziert. 10–15 Stunden nach der Transfektion wurden Wildtyp-Adenoviren (eines der folgenden Serotypen: 2, 3, 4, 5, 7, 12, 40) zur Infektion der Zellen mit einer MOI von 5 verwendet. Die Zellen wurden dann bei voller CPE geerntet und mittels drei Runden von Einfrieren und Auftauen lysiert. Das Pellet wird in 4 mL Tris-HCl resuspendiert. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation abgetrennt, und eine Teilreinigung des Ad5Δ.CMVlacZ von Helfervirus wurde mit 2 Runden CsCl-Gradientenzentrifugation (SW41-Säule, 35.000 UpM, 2 Stunden) erzielt. Fraktionen wurden vom Röhrchenboden gesammelt (Fraktion Nr. 1) und auf lacZ-transduzierende Viren auf 293-Zielzellen durch histochemische Anfärbung (bei 20 h PI) analysiert. Verunreinigende Helferviren wurden mittels Plaque-Assay quantifiziert.
  • Mit Ausnahme des Adenovirus Typ 3 konnten durch Infektion mit den Ad-Serotypen 2, 4, 5, 7, 12 und 40 lacZ-transduzierende Viren produziert werden. Der Peak der β-Galactosidaseaktivität wurde zwischen den beiden A260-Hauptabsorptionspeaks, wo die meisten Helferviren Banden bildeten (Daten nicht gezeigt), nachgewiesen. Die Menge an von 10 Platten gewonnenem lacZ-Virus lag je nach dem Serotyp des Helfers in einem Bereich von 109 bis 108 transduzierenden Partikeln. Wie erwartet produzierten Ad2 und Ad5 den höchsten Titer an lacZ-transduzierenden Viren (Tabelle 3). Die Verunreinigung mit Wildtyp lag im allgemeinen um 102–103 log höher als der entsprechende lacZ-Titer, außer im Fall von Ad40.
  • B. Ergebnisse
  • In Tabelle 3 sind die Wachstumseigenschaften der Wildtyp-Adenoviren, wie sie anhand der Vermehrung in 293-Zellen beurteilt wurden, zusammengefaßt. Dadurch wurde die Möglichkeit zur Nutzung dieser Helferviren zur Infektion der Zelllinie, die mit dem Ad5-Deletionsvirus transfiziert wurde, demonstriert.
  • Tabelle 3
    Figure 00580001
  • In Tabelle 4 sind die Ergebnisse der endgültigen gereinigten Fraktionen zusammengefaßt. Die mittlere Spalte mit der Bezeichnung LFU/μl zeigt die Quantifizierung der Produktion von lacZ-bildenden Einheiten, die ein direktes Maß für die Verpackung und Vermehrung von pseudotypisiertem rekombinanten AdΔ-Virus ist. Bei dem pfu/μl-Titer handelt es sich um eine Abschätzung des verunreinigenden Wildtyp-Virus. Es wurde mit allen adenoviralen Stämmen pseudotypisiertes AdΔ-Virus erzeugt, außer Ad3. Die Titer liegen im Bereich von 107–109.
  • Tabelle 4
    Figure 00580002
  • Figure 00590001
  • Tabelle 5A–5D zeigt eine ausführlichere Analyse der Fraktionen von der zweiten Reinigung für jedes der in Tabelle 4 zusammengefaßten Experimente. Dabei handelt es sich wiederum bei LFU/μl um die Menge an gewonnenen AdΔ-Viren, wohingegen pfu/μl die Menge an gewonnenem Helfervirus darstellt.
  • Tabelle 5A
    Figure 00590002
  • Tabelle 5B
    Figure 00600001
  • Tabelle 5C
    Figure 00610001
  • Tabelle 5D
    Figure 00620001
  • C. Charakterisierung der Struktur der verpackten Viren
  • Portionen aufeinanderfolgender Fraktion wurden mittels Southern-Blots mit lacZ als Sonde analysiert. Im Fall von Ad2 und 5 wurde nicht nur das linearisierte Monomer verpackt, sondern es wurden auch mehrere Formen von rekombinantem Virus mit unterschiedlichen Größen gefunden. Diese Formen korrelierten gut mit den Größen von Dimeren, Trimeren und anderen höher molekularen Concatameren. Die Peaks der linearisierten Monomere lagen näher am oberen Ende des Röhrchens (Bande des defekten Adenovirus) als die anderen Formen. Wurden diese Formen mit lacZ-Aktivität korreliert, so wurde eine bessere Korrelation zwischen den höher molekularen Formen als zwischen den Monomeren gefunden. Bei der Pseudotypisierung von Ad4 und Ad7 wurden keine linearisierten Monomeren verpackt und lediglich höher molekulare Formen gefunden.
  • Diese Daten demonstrieren definitiv die Produktion und Charakterisierung des Δ-Virus und der unterschiedlichen Pseudotypen. Dieses Beispiel veranschaulicht einen sehr einfachen Weg zur Erzeugung von Pseudotyp-Viren.
  • Beispiel 11 – AdΔ-Vektor mit einem FH-Gen
  • Bei der familiären Hypercholesterinämie (FH) handelt es sich um eine autosomale dominante Erkrankung die durch Anomalien (Mängel) der Funktion oder Expression von LDL-Rezeptoren verursacht wird [M. S. Brown und J. L. Goldstein, Science, 232(4746): 34–37 (1986); J. L. Goldstein und M. S. Brown, „Familial hypercholesterolemia" in Metabolic Basis of Inherited Disease, Hrsg. C. R. Scriver et al, McGraw Hill, New York, S. 1215–1250 (1989).] Patienten mit einem vererbtem abnormalen Allel weisen mäßig erhöhte Plasma-LDL-Werte auf und leiden an vorzeitiger lebensbedrohender koronarer Herzkrankheit (coronary artery disease, CAD). Homozygote Patienten leiden an schwerer Hypercholesterinämie und lebensbedrohender CAD im Kindesalter. Es wird ein FH enthaltender erfindungsgemäßer Vektor konstruiert, indem das lacZ-Minigen im pAdΔc.CMVlacZ-Vektor durch ein das LDL-Rezeptorgen enthaltendes Minigen [T. Yamamoto et al, Cell, 39: 27–38 (1984)] unter Verwendung bekannter Techniken und wie zuvor in analoger Weise für das Dystrophingen und CFTR in den vorhergehenden Beispielen beschrieben ersetzt wird. Das LDL-Rezeptorgen tragende Vektoren lassen sich leicht gemäß der vorliegenden Erfindung konstruieren. Das erhaltene Plasmid wird mit pAdΔc.CMV-LDL bezeichnet.
  • Dieses Plasmid eignet sich für die Gentherapie von FH allein oder vorzugsweise in Form eines wie hier beschrieben hergestellten Konjugats zur Substitution des für das Gen verantwortlichen abnormalen Allels mit einem normalen LDL-Gen.
  • A. Ex-vivo-Gentherapie
  • Eine Gentherapie läßt sich ex vivo durchführen, indem eine Primärkultur von Hepatocyten aus einem Patienten gewonnen und etabliert wird. Damit können zur Isolierung und Transduktion der Hepatocyten mit dem (den) obigen, das (die) LDL-Rezeptorgen(e) tragenden Vektor(en) verwendet werden. So lassen sich beispielsweise für Kaninchenleber entwickelte Kollagenase-Perfusionstechniken an menschliches Gewebe anpassen und bei der Transduktion verwenden. Nach der Transduktion werden die Hepatocyten den Gewebekulturplatten entnommen und mit bekannten Techniken, z.B. über einen in die untere Mesenterialvene eingesetzten Katheter, wieder in den Patienten eingeführt.
  • B. In-vivo-Gentherapie
  • Wünschenswerterweise erfolgt der in-vivo-Ansatz zur Gentherapie, z.B. auf die Leber gerichtet, unter Verwendung der oben beschriebenen Vektoren und Vektorkonjugate. Bei einer bevorzugten Behandlung wird ein Vektor-LDL-Konjugat der vorliegenden Erfindung in den peripheren Kreislauf des Patienten eingeführt. Der Patient wird dann auf eine Änderung in den Serumlipiden und Lebergeweben hin analysiert.
  • Das Virus oder Konjugat läßt sich zur Infektion von Hepatocyten in vivo durch direkte Injektion in eine periphere Vene oder Pfortader (107–108 pfu/kg) oder retrograd in den Gallengang (gleiche Dosis) verwenden. Dadurch wird der Gentransfer in die Mehrzahl der Hepatocyten bewirkt.
  • Die Behandlungen werden nach Bedarf, beispielsweise wöchentlich, wiederholt. Dabei wird angenommen, daß die Verabreichung einer Virusdosis, die einer MOI von ungefähr 20 (d.h. 20 pfu/Hepatocyt) entspricht, zu einer Genexpression auf hohem Niveau in der Mehrzahl der Hepatocyten führt.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (15)

  1. Verfahren zur Herstellung eines pseudotypisierten Adenovirus, wobei man: (a) in eine ausgewählte Wirtszelle: (i) einen rekombinanten Shuttle-Vektor, der Adenovirus-Nukleinsäuresequenzen sowie ein Minigen umfaßt, wobei die Adenovirussequenzen zu einem ersten Serotyp gehören und aus den für die Replikation und Virioncapsidierung notwendigen adenoviralen 5'- und 3'-cis-Elementen bestehen; und wobei das Minigen ein ausgewähltes Gen umfaßt, das mit Regulationssequenzen, die die Expression des ausgewählten Gens in einer Zielzelle steuern, operativ verknüpft ist, wobei die adenoviralen cis-Elemente das Minigen flankieren, und (ii) ein Helfervirus, das die für eine Adenovirusinfektion notwendigen adenoviralen Gensequenzen umfaßt und ein adenovirales Capsid eines zweiten Serotyps, der sich von dem Serotyp des Adenovirus aus (i) unterscheidet, codiert, einführt; (b) die den Shuttle-Vektor und das Helfervirus enthaltende Wirtszelle kultiviert, um so die Bildung eines pseudotypisierten Adenovirus, das die Adenovirus-Nukleinsäuresequenzen und das Minigen des Shuttle-Vektors (i) in einem adenoviralen Capsid eines zweiten Serotyps, der sich von dem ersten Serotyp unterscheidet, umfaßt, zu gestatten.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei dem Helfervirus alle oder ein hinreichender Anteil der adenoviralen E1- und/oder E3-Gene fehlen, um so deren biologische Funktion zu beseitigen.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der erste und der zweite Serotyp unabhängig ausgewählt sind aus einem Adenovirus-Serotyp der Gruppe bestehend aus 2, 4, 5, 7, 12 und 40.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei man in weiteren Schritten das pseudotypisierte Adenovirus aus der Wirtszelle oder der diese enthaltenden Zellkultur isoliert.
  5. Verfahren zur Herstellung eines pseudotypisierten Adenovirus, wobei man: (a) in eine ausgewählte Wirtszelle: (i) einen rekombinanten Shuttle-Vektor, der Adenovirus-Nukleinsäuresequenzen sowie ein Minigen umfaßt, wobei die Adenovirussequenzen zu einem ersten Serotyp gehören und aus den für die Replikation und Virioncapsidierung notwendigen adenoviralen 5'- und 3'-cis-Elementen bestehen; und wobei das Minigen ein ausgewähltes Gen umfaßt, das mit Regulationssequenzen, die die Expression des ausgewählten Gens in einer Zielzelle steuern, operativ verknüpft ist, wobei die adenoviralen cis-Elemente das Minigen flankieren, und (ii) ein Helfervirus, das adenovirale Gensequenzen eines zweiten Serotyps, der sich von dem Serotyp der Adenovirussequenzen aus (i) unterscheidet, umfaßt, einführt; und (b) die den Shuttle-Vektor und das Helfervirus enthaltende Wirtszelle kultiviert, wobei das Helfervirus und die Wirtszelle die Adenovirusgene enthalten, die für die Adenovirusinfektion notwendig sind und die die Bildung eines pseudotypisierten Adenovirus, das die Adenovirus-Nukleinsäuresequenzen und das Minigen des Shuttle-Vektors (i) in einem adenoviralen Capsid eines zweiten Serotyps, der sich von dem ersten Serotyp unterscheidet, umfaßt, gestatten.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der erste und der zweite Serotyp unabhängig ausgewählt sind aus einem Adenovirus-Serotyp der Gruppe bestehend aus 2, 4, 5, 7, 12 und 40.
  7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei man in weiteren Schritten das pseudotypisierte Adenovirus aus der Wirtszelle oder der diese enthaltenden Zellkultur isoliert.
  8. Pseudotypisiertes Adenovirus, umfassend: (a) Adenovirus-Nukleinsäuresequenzen und ein Minigen, wobei die Adenovirus-Nukleinsäuresequenzen die für die Replikation und Virioncapsidierung notwendigen adenoviralen 5'- und 3'-cis-Elemente umfassen; wobei das Minigen ein ausgewähltes Gen umfaßt, das mit Regulationssequenzen, die die Expression des ausgewählten Gens in einer Zielzelle steuern, operativ verknüpft ist, und wobei die adenoviralen cis-Elemente zu einem ersten Serotyp gehören und das Minigen flankieren; und (b) ein Capsid eines zweiten Adenovirus-Serotyps, der sich von dem ersten Serotyp unterscheidet und die Adenovirus-Nuleinsäuresequenzen sowie das Minigen aus (a) capsidiert.
  9. Pseudotypisiertes Adenovirus nach Anspruch 8, wobei der erste und der zweite Serotyp unabhängig ausgewählt sind aus einem Adenovirus-Serotyp der Gruppe bestehend aus 2, 4, 5, 7, 12 und 40.
  10. Pseudotypisiertes Adenovirus nach Anspruch 8 oder 9, wobei die adenoviralen 5'-cis-Elemente native adenovirale 5'-inverse terminale Wiederholungen (inverted terminal repeats, ITRs) und Verpackungssequenzen umfassen.
  11. Pseudotypisiertes Adenovirus nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die 3'-cis-Elemente die nativen adenoviralen 3'-inversen terminalen Wiederholungen (ITRs) umfassen.
  12. Pseudotypisiertes Adenovirus nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei es sich bei dem ausgewählten Gen um ein Reportergen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Genen, die β-Galactosidase, alkalische Phosphatase und Green Fluorescent Protein codieren, handelt.
  13. Pseudotypisiertes Adenovirus nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei es sich bei dem ausgewählten Gen um ein therapeutisches Gen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem normalen CFTR-Gen, einem DMD-Becker-Allel und einem normalen LDL-Rezeptor-Gen, handelt.
  14. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein pseudotypisiertes Adenovirus nach einem der Ansprüche 8 bis 13 und ein pharmazeutisch unbedenkliches Vehikel.
  15. Verwendung eines pseudotypisierten Adenovirus nach einem der Ansprüche 8 bis 13 bei der Herstellung eines Arzneimittels.
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