DE69228118T2

DE69228118T2 - Bmp-9 zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69228118T2
Application number: DE69228118T
Authority: DE
Inventors: Anthony Celeste; John Wozney
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1991-06-25
Filing date: 1992-06-25
Publication date: 1999-08-19
Anticipated expiration: 2012-06-26
Also published as: CA2108770A1; ES2127757T3; US5661007A; JP2004002464A; DE69228118D1; CA2108770C; WO1993000432A1; EP0592562A1; ATE175441T1; JP3485917B2; JPH06508990A; AU652472B2; KR100255415B1; DK0592562T3; AU2269992A; EP0592562B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Familie gereinigter Proteine, die als BMP-9-Proteine bezeichnet werden, und Verfahren, um diese zu erhalten. Diese Proteine können verwendet werden, um Knochen- und/oder Knorpelbildung zu induzieren, und bei der Wundheilung und Gewebereparatur. Die murine BMP-9-DNA-Sequenz (SEQ ID NR: 1) und - Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 2) sind in Fig. 1 dargestellt. Die menschliche BMP-9-Sequenz ist in Fig. 3 dargestellt (SEQ ID NR: 8 und SEQ ID -NR: 9). Man nimmt an, daß BMP-9-Proteine fähig sind, die Bildung von Knorpel und/oder Knochen zu induzieren. BMP-9-Proteine können weiter durch die Fähigkeit charakterisiert werden, in dem nachfolgend beschriebenen Ratten-Knochenbildungsexperiment Knorpel- und/oder Knochenbildungsaktivität zu zeigen.
Murines BMP-9 ist dadurch charakterisiert, daß es die Aminosäuren #319 bis #428 von Fig. 1 umfaßt (SEQ ID NR: 2 Aminosäuren #1-110). Murines BMP-9 kann dadurch hergestellt werden, daß man eine Zelle, die mit einer DNA-Sequenz, umfassend Nucleotid #610 bis Nucleotid #1893, wie in Fig. 1 gezeigt (SEQ ID NR: 1), transformiert wurde, züchtet und aus dem Kulturmedium ein Protein gewinnt und reinigt, das gekennzeichnet ist durch die Aminosäuresequenz umfassend Aminosäure #319 bis #428, wie in Fig. 1 gezeigt (SEQ ID NR: 2), und im wesentlichen frei von anderen proteinartigen Stoffen, mit welchen es gemeinsam produziert wurde.
Es wird erwartet, daß menschliches BMP-9 zu dem murinen BMP-9 homolog ist und dadurch gekennzeichnet ist, daß es Aminosäure #1 (Ser, Ala, Gly) bis #110 von Fig. 3 (SEQ ID NR: 9) (Arg) umfaßt. Die Erfindung beinhaltet Verfahren zum Erhalt der DNA- Sequenzen, welche menschliches BMP-9 codieren. Dieses Verfahren umfaßt die Verwendung der BMP-9-Nucleotid-Sequenz oder Teilen davon zur Gestaltung von Sonden, um unter Verwendung von Standardtechniken Banken nach dem menschlichen Gen oder Fragmenten davon zu durchmustern. Menschliches BMP-9 kann dadurch hergestellt werden, daß man eine Zelle, welche mit der BMP-9-DNA-Sequenz transformiert wurde, züchtet und BMP-9 aus dem Kulturmedium gewinnt und aufreinigt. Das exprimierte Protein wird aus dem Kulturmedium isoliert, gewonnen und aufgereinigt. Das gereinigte exprimierte Protein ist im wesentlichen frei von anderen proteinartigen Stoffen, mit welchen es gemeinsam produziert wurde, sowie von anderen Verunreinigungen. Von dem gewonnenen gereinigten Protein wird angenommen, daß es Knorpel- und/oder Knochenbildungsaktivität zeigt. Die erfindungsgemäßen Proteine können weiter durch die Fähigkeit, in dem nachfolgend beschriebenen Ratten- Knochenbildungstest Knorpel- und/oder Knochenbildungsaktivität zu zeigen, gekennzeichnet werden.
Menschliches BMP-9 kann durch Züchtung einer Zelle hergestellt werden, welche mit einer DNA-Sequenz, umfassend Nucleotid #124 bis #453, wie in SEQ ID NR: 8 gezeigt transformiert wurde, und durch Gewinnung und Aufreinigung eines Proteins, welches durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 9 von Aminosäure #1 bis Aminosäure #110 gekennzeichnet ist und im wesentlichen frei von anderen proteinartigen Stoffen ist, mit welchen es gemeinsam produziert wurde.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Arzneimittel, welche eine therapeutisch wirksame Menge eines BMP-9-Proteins in einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel oder Träger enthalten. Erfindungsgemäße BMP-9-Arzneimittel können zur Bildung von Knorpel verwendet werden. Diese Arzneimittel können weiterhin für die Bildung von Knochen eingesetzt werden. BMP-9 Arzneimittel können auch für Wundheilung und Gewebereparatur verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können weiter mindestens ein anderes therapeutisch wirksames Mittel beinhalten, wie die BMP-Proteine BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und BMP-7, welche z. B. in den PCT- Veröffentlichungen WO88/00205, WO89/10409 und WO90/11366 offenbart sind, und BMP-8, offenbart in der U. S. Anmeldung Ser. Nr. 07/641,204, eingereicht am 15. Januar 1991, Ser. Nr. 07/525, 357, eingereicht am 16. Mai 1990, und Ser. Nr. 07/800,364, eingereicht am 20. November 1991.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können zusätzlich zu dem BMP-9 Protein andere therapeutisch wirksame Mittel enthalten, einschließlich Wachstumsfaktoren, wie der epidermale Wachstumsfaktor (epidermal growth factor, EGF), der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (fibroblast growth factor, FGF), der transformierende Wachstumsfaktor (transforming growth factor, TGF-α und TGF-β) und der insulinähnliche Wachstumsfaktor (insulin-like growth factor, IGF). Die Arzneimittel können auch eine geeignete Matrix beinhalten, z. B, zur Stützung der Zusammensetzung und zur Bereitstellung einer Oberfläche für das Wachstum von Knochen und/oder Knorpel. Die Matrix kann eine langsame Freisetzung des osteoinduktiven Proteins und/oder die geeignete Umgebung für dessen Präsentation bereitstellen.
Die BMP-9 Arzneimittel können in Verfahren zur Behandlung einer Anzahl von Knochen- und/oder Knorpeldefekten, Periodontalerkrankungen und verschiedenen Arten von Wunden angewendet werden. Diese Verfahren beinhalten gemäß der Erfindung die Verabreichung einer wirksamen Menge eines BMP-9 Proteins an einen Patienten, der solche Knochen- und/oder Knorpelbildung, Wundheilung oder Gewebereparatur benötigt. Diese Verfahren können auch die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Proteins in Verbindung mit mindestens einem der neuen BMP-Proteine beinhalten, die in den vorstehend beschriebenen Anmeldungen des gleichen Anmelders offenbart sind. Zusätzlich können diese Verfahren ebenso die Verabreichung eines BMP-9-Proteins mit anderen Wachstumsfaktoren, einschließlich EGF, FGF, TGF-α, TGF-β und IGF, einschließen.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung sind DNA-Sequenzen, die die Expression eines BMP-9-Proteins codieren. Solche Sequenzen beinhalten die Abfolge von Nucleotiden in einer 5'- nach 3'- Richtung, wie in Fig. 1 (SEQ ID NR: 1) und Fig. 3 (SEQ ID NR: 8) veranschaulicht, oder DNA-Sequenzen, welche unter stringenten Bedingungen mit den DNA-Sequenzen von Fig. 1 oder 3 hybridisieren und ein Protein codieren, welches die Fähigkeit hat, die Bildung von Knorpel und/oder Knochen zu induzieren. Schließlich sind allelische oder andere Variationen der Sequenzen von Fig. 1 oder 3, unabhängig davon ob solche Nucleotidaustausche in Veränderungen der Peptidsequenz resultieren oder nicht, ebenfalls in der vorliegenden Erfindung enthalten.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung beinhaltet Vektoren, umfassend eine DNA-Sequenz, wie vorstehend beschrieben, in funktioneller Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz dafür. Diese Vektoren können in einem neuen Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen BMP-9-Proteins angewendet werden, in welchem eine Zellinie, die mit einer DNA-Sequenz, welche ein BMP-9-Protein codiert, in funktioneller Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz dafür transformiert wurde, in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet wird und ein BMP-9- Protein daraus gewonnen und aufgereinigt wird. Dieses Verfahren kann eine Vielzahl bekannter Zellen, sowohl prokaryontischen und eukaryontischen Ursprungs, als Wirtszellen zur Expression des Polypeptids verwenden.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden unter Berücksichtigung der folgenden detaillierten Beschreibung und bevorzugtet Ausführungsformen davon offensichtlich.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 umfaßt die DNA-Sequenz und die davon abgeleitete Aminosäure-Sequenz des murinen BMP-9 von Clon ML14a, der nachfolgend näher beschrieben wird.
Fig. 2 umfaßt die DNA-Sequenz und davon abgeleitete Aminosäure- Sequenz von menschlichem BMP-4 aus Lambda U2OS-3 ATCC #40342.
Fig. 3 umfaßt die DNA-Sequenz und die davon abgeleitete Aminosäure-Sequenz von menschlichem BMP-9 aus Lambda FIX/H6111 ATCC #75252.

Detaillierte Bescheibung der Erfindung

Die murine BMP-9-Nucleotid-Sequenz (SEQ ID NR: 1) und codierte Aminosäure-Sequenz (SEQ ID NR: 2) sind in Fig. 1 dargestellt. Gereinigte erfindungsgemäße murine BMP-9-Proteine werden durch Züchtung einer Wirtszelle, welche mit einer DNA-Sequenz, umfassend die codierende DNA-Sequenz von Fig. 1 (SEQ ID NR: 1) von Nucleotid #610 bis Nucleotid #1893, transformiert wurde, und die Gewinnung und Aufreinigung eines Proteins, welches die Aminosäure-Sequenz oder eine im wesentlichen homologe Sequenz enthält, wie sie durch die Aminosäure #319 bis #428 von Fig. 1 (SEQ ID NR: 2) repräsentiert ist, aus dem Kulturmedium produziert. Die aus dem Kulturmedium gewonnenen BMP-9-Proteine werden aufgereinigt, indem sie von anderen proteinartigen Stoffen, mit denen sie gemeinsam produziert wurden, und von anderen vorhandenen Verunreinigungen isoliert werden.
Die menschliche BMP-9-Nucleotid- und Aminosäure-Sequenz ist in SEQ ID NR: 8 und 9 gezeigt. Man erwartet, daß reifes menschliches BMP-9 die Aminosäuren #1 (Ser, Ala, Gly) bis #110 (Arg) umfaßt. Menschliches BMP-9 kann dadurch produziert werden, daß man eine Zelle züchtet, welche mit einer DNA- Sequenz, umfassend Nucleotid #124 bis #453, wie in SEQ ID NR: 8 gezeigt, transformiert wurde, und aus dem Kulturmedium ein Protein-, welches durch die Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NR: 9, von Aminosäure #1 bis Aminosäure #110 gekennzeichnet ist, und welches frei von anderen proteinartigen Stoffen ist, mit welchen es gemeinsam produziert wurde, gewinnt und aufreinigt.
BMP-9-Proteine können durch die Fähigkeit gekennzeichnet werden, Knorpelbildung zu induzieren. BMP-9-Proteine können weiterhin durch die Fähigkeit gekennzeichnet werden, Knochenbildung zu induzieren. BMP-9-Proteine können weiterhin durch die Fähigkeit gekennzeichnet werden, in dem nachfolgend beschriebenen Ratten-Knochenbildungstest Knorpel- und/oder Knochenbildungsaktivität zu zeigen.
Die BMP-9-Proteine, die hierin bereitgestellt werden, beinhalten auch Faktoren, welche durch zu denen von Fig. 1 und 3 (SEQ ID NR: 1 und 8) ähnlichen Sequenzen codiert werden, in denen aber Modifikationen natürlicherweise bereitgestellt werden (z. B. allelische Variation in der Nucleotidsequenz, welche in Aminosäureaustauschen im Polypeptid resultieren können) oder die beabsichtigt konstruiert sind. Z. B. können synthetische Polypeptide fortlaufende Sequenzen der Aminosäurereste von Fig. 1 oder Fig. 3 (SEQ ID NR: 2 und 9) vollständig oder teilweise duplizieren. Diese Sequenzen können dadurch, daß sie Primär-, Sekundär- oder Tertiär- Struktur- und Konformations- Eigenschaften mit den Knochenwachstumsfaktor- Polypeptiden von Fig. 1 und Fig. 3 teilen, mit diesen biologische Eigenschaften von Knochenwachstumsfaktoren gemeinsam besitzen. Damit können sie als biologisch aktiver Ersatz von natürlich auftretendem BMP-9 und anderen BMP-9- Polypeptiden in therapeutischen Verfahren angewendet werden. Andere spezifische Mutationen der hierin beschriebenen BMP-9- Proteine beinhalten Modifikationen von Glykosylierungsstellen. Diese Modifikationen können O-verknüpfte- oder N-verknüpfte Glykosylierungsstellen beinhalten. Die Abwesenheit von Glykosylierung oder die nur teilweise Glykosylierung resultiert z. B. aus Aminosäuresubstitution oder -deletion an Asparaginverknüpften Glykosylierungserkennungsstellen. Die Asparaginverknüpften Glykosylierungserkennungsstellen umfassen Tripeptidsequenzen, welche durch geeignete zelluläre Glykosylierungsenzyme spezifisch erkannt werden. Diese Tripeptidsequenzen sind entweder Asparagin-X-Threonin oder Asparagin-X-Serin, worin X üblicherweise eine beliebige Aminosäure ist. Eine große Anzahl von Aminosäuresubstitutionen oder -deletionen an der ersten oder dritten oder beiden Aminosäurepositionen einer Glykosylierungserkennungsstelle oder an beiden (und/oder Aminosäuredeletion an der 2. Position) resultiert in der Nichtglykosylierung der modifizierten Tripeptid-Sequenz.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die neuen DNA-Sequenzen, frei von einer Verknüpfung mit DNA-Sequenzen, die andere proteinartige Stoffe codieren, und die bei Expression BMP-9- Proteine codieren. Diese DNA-Sequenzen beinhalten diejenigen, die in Fig. 1 oder in Fig. 3 (SEQ ID NR: 1 und 8) in einer 5- nach 3'-Richtung gezeigt sind und diejenigen Sequenzen, welche daran unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren [siehe T. Maniatis et al. Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Seite 387 bis 389] und ein Protein codieren, welches Knorpel- und/oder Knocheninduzierende Aktivität besitzt.
In ähnlicher Weise codieren DNA-Sequenzen, welche BMP-9- Proteine codieren, die durch die Sequenzen von Fig. 1 oder Fig. 3 codiert werden, aber welche in der Codonsequenz aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes oder allelischer Variationen (natürlich auftretende Basenaustausche in der Artenpopulation, welche in einem Aminosäureaustausch resultieren können oder nicht) ebenfalls die hierin beschriebenen neuen Faktoren. Variationen in den DNA-Sequenzen von Fig. 1 oder Fig. 3 (SEQ ID NR: 1 und 8), welche durch Punktmutationen oder durch induzierte Modifikationen (einschließlich Insertion, Deletion und Substitution) verursacht werden, um die Aktivität, die Halbwertszeit oder Produktion der codierten Polypeptide zu verstärken, sind ebenfalls in der Erfindung enthalten.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Produktion von BMP-9-Proteinen. Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet die Züchtung einer geeigneten Zellinie, welche mit einer DNA-Sequenz transformiert wurde, die ein erfindungsgemäßes BMP-9-Protein unter der Kontrolle von bekannten regulatorischen Sequenzen codiert. Die transformierten Wirtszellen werden gezüchtet und die BMP-9- Proteine aus dem Kulturmedium gewonnen und gereinigt. Die gereinigten Proteine sind im wesentlichen frei von anderen Proteinen, mit welchen sie gemeinsam produziert wurden, sowie von anderen Verunreinigungen.
Geeignete Zellen oder Zellinien können Säugerzellen, wie Ovarzellen des chinesischen Hamsters (Chinese Hamster Ovary Cells, CHO) sein. Die Auswahl der geeigneten Säugerwirtszellen und Verfahren zur Transformation, Züchtung, Amplifikation, Durchmusterung, Produktherstellung und Aufreinigung sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z. B. Gething and Sambrook, Nature, 293: 620-625 (1981), oder alternativ dazu, Kaufmann et al., Mol. Cell. Biol., 5(7): 1750-1759 (1985) oder Howley et al., U.S.-Patent 4.419.446. Eine andere geeignete Säugerzellinie, welche in den begleitenden Beispielen beschrieben wird, ist die Affen-COS-1-Zellinie. Die Säugerzellinie CV-1 kann ebenfalls geeignet sein. Bakterielle Zellen können ebenfalls geeignete Wirte sein. Z. B. sind die verschiedenen Stämme von E. coli (z. B. HB101, MC1061) als Wirtszellen auf biotechnologischem Gebiet gut bekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilies, Pseudomonas, anderer Bazillen und ähnlichem können ebenfalls bei diesem Verfahren verwendet werden.
Viele Stämme von Hefezellen, die dem Fachmann bekannt sind, können ebenfalls als Wirtszellen zur Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide erhältlich sein. Zusätzlich, wo gewünscht, können Insektenzellen als Wirtszellen in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Siehe z. B. Miller et al. Genetic Engineering, 8: 277-298 (Plenum Press 1986) und die darin zitierten Literaturstellen.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Vektoren zur Verwendung in dem Verfahren zur Expression dieser neuen BMP-9-Polypeptide. Vorzugsweise enthalten die Vektoren die vorstehend beschriebenen vollständigen neuen DNA-Sequenzen, welche die neuen erfindungsgemäßen Faktoren codieren. Zusätzlich enthalten die Vektoren auch geeignete Expressionskontrollsequenzen, welche die Expression der BMP-9- Proteinsequenzen erlauben. Alternativ dazu sind Vektoren, welche modifizierte Sequenzen, wie vorstehend beschrieben, enthalten, ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die Vektoren können in dem Verfahren zur Transformation von Zellinien verwendet werden und enthalten ausgewählte regulatorische Sequenzen in funktioneller Verknüpfung mit den erfindungsgemäßen DNA-codierenden Sequenzen, welche befähigt sind, deren Replikation und Expression in ausgewählten Wirtszellen zu steuern. Regulatorische Sequenzen für solche Vektoren sind dem Fachmann bekannt und können in Abhängigkeit von den Wirtszellen ausgewählt werden. Eine solche Auswahl stellt ein Routineverfahren dar und ist kein Teil der vorliegenden Erfindung.
Ein Protein der vorliegenden Erfindung, welches Knorpel- und/oder Knochenbildung induziert, unter Bedingungen, bei denen Knochen normalerweise nicht gebildet wird, findet Anwendung bei der Heilung von Knochenfrakturen und Knorpeldefekten in Menschen und Tieren. Eine solche Präparation, welche ein BMP-9- Protein bereitstellt, kann prophylaktische Verwendung bei der Einrichtung von geschlossenen wie offenen Frakturen haben und auch zur verbesserten Fixation künstlicher Gelenke verwendet werden. Eine Knochenneubildung, welche durch einen osteogenen Wirkstoff induziert wird, trägt zur Reparatur angeborener, durch Verletzung induzierter oder durch onkologische Resektion induzierter craniofacialer Defekte bei und ist ebenfalls bei kosmetischen plastischen Operationen zweckmäßig. Ein BMP-9- Protein kann zur Behandlung von Periodont-Erkrankungen und bei anderen Zahnreparaturprozessen verwendet werden. Solche Wirkstoffe können eine Umgebung bereitstellen, um knochenbildende Zellen anzuziehen, das Wachstum knochenbildender Zellen zu stimulieren oder die Differenzierung von Vorläufern knochenbildender Zellen zu induzieren. Erfindungsgemäße BMP-9-Polypeptide können auch bei der Behandlung von Osteoporose verwendet werden. Eine Vielzahl von osteogenen, knorpelinduzierenden und knocheninduzierenden Faktoren sind beschrieben worden. Siehe z. B. die europäischen Patentanmeldungen 148.155 und 169.016 zu deren Erläuterung. Die Proteine der Erfindung können auch bei der Wundheilung und bei verwandter Gewebereparatur verwendet werden. Die Wundarten beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Verbrennungen, Schnittwunden und Geschwüre (siehe z. B. PCT Veröffentlichung WO84/01106 zur Erläuterung von Wundheilung und verwandter Gewebereparatur).
Es wird weiterhin angenommen, daß erfindungsgemäße Proteine das Überleben von Neuronen erhöhen können und deshalb bei der Transplantation und der Behandlung von Zuständen, welche einen Abfall der neuronalen Überlebensrate zeigen, zweckmäßig sind. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein therapeutisches Verfahren und eine Zusammensetzung zur Reparatur von Frakturen und anderen Zuständen, welche mit Knorpel- und/oder Knochendefekten oder Erkrankungen des Periodonts verwandt sind. Die Erfindung umfaßt weiterhin therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen zur Wundheilung und zur Gewebereparatur. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einem der erfindungsgemäßen BMP-9-Proteine im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel, Träger oder einer Matrix.
Es wird erwartet, daß die erfindungsgemäßen Proteine gemeinsam mit oder vielleicht synergistisch mit anderen verwandten Proteinen und Wachstumsfaktoren wirken können. Weitere therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung umfassen deshalb eine therapeutische Menge von mindestens einem erfindungsgemäßen BMP-9-Protein mit einer therapeutischen Menge von mindestens einem der anderen BMP-9-Proteine, welche in vorstehend beschriebenen Anmeldungen des gleichen Anmelders offenbart sind. Solche Kombinationen können getrennte Moleküle der BMP-Proteine oder Heteromoleküle, zusammengesetzt aus verschiedenen BMP-Untereinheiten, umfassen. So kann z. B. ein erfindungsgemäßes Verfahren und eine Zusammensetzung ein Disulfid-gekoppeltes Dimer, umfassend eine BMP-9- Proteinuntereinheit und eine Untereinheit aus einem der vorstehend beschriebenen "BMP"-Proteine, sein. Ein weiterer Gegenstand kann ein Heterodimer von BMP-9-Untereinheiten umfassen. Desweiteren können BMP-9-Proteine mit anderen Wirkstoffen, welche für die Behandlung von Knochen- und/oder Knorpelschäden, betreffender Wunden oder Gewebe von Nutzen sind, kombiniert sein. Diese Wirkstoffe beinhalten verschiedene Wachstumsfaktoren, wie epidermaler Wachstumsfaktor (epidermal growth factor, EGF), aus Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor (platelet derived growth factor, PDGF), transformierende Wachstumsfaktoren (transforming growth factors, TGF-α und TGF-β) und Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor (insulin-like growth factor, IGF).
Die Herstellung und Formulierung solcher physiologisch verträglicher Proteinzusammensetzungen, hinsichtlich pH, Isotonizität, Stabilität und ähnlichem ist auf dem Fachgebiet bekannt. Die therapeutischen Zusammensetzungen sind aufgrund einer fehlenden Artenspezifität der BMP-Proteine gegenwärtig auch für veterinäre Anwendungen geeignet. Insbesondere Haustiere und Zuchtpferde sind zusätzlich zum Menschen gewünschte Patienten für solch eine Behandlung mit dem erfindungsgemäßen BMP-9.
Die therapeutischen Verfahren beinhalten die topische, systemische oder lokale Verabreichung der Zusammensetzung als Implantat oder Vorrichtung. Wenn verabreicht, befindet sich die therapeutische Zusammensetzung für die erfindungsgemäße Verwendung natürlich in einer pyrogen-freien, physiologisch verträglichen Form. Desweiteren kann die Zusammensetzung wünschenswerterweise eingekapselt sein oder in einer viskösen Form injiziert werden, damit sie an die entsprechende Stelle des Knochen-, Knorpel- oder Gewebeschadens gelangt. Die topische Verabreichung kann für die Wundheilung und Gewebereparatur geeignet sein. Andere therapeutisch verwendbare Wirkstoffe als die BMP-9-Proteine, die gegebenenfalls ebenfalls, wie vorstehend beschrieben, in die Zusammensetzungen eingeschlossen werden können, können alternativ oder zusätzlich, gleichzeitig oder nacheinander mit den BMP- Zusammensetzung in den erfindungsgemäßen Verfahren verabreicht werden.
Zur Knochen- und/oder Knorpelbildung würde die Zusammensetzung vorzugsweise eine Matrix beinhalten, welche befähigt ist, BMP- 9-oder andere BMP-Proteine an der Stelle des Knochen- und/oder Knorpelschadens freizusetzen, dabei eine Struktur zur Entwicklung von Knochen und Knorpel bereitstellend, welche optimal befähigt ist, in den Körper resorbiert zu werden. Die Matrix kann eine langsame Freisetzung von BMP-9 und/oder eine geeignete Umgebung zu dessen Verfügung bereitstellen. Solche Matrices können aus Materialien bestehen, wie sie gegenwärtig für andere medizinische Implantationsanwendungen eingesetzt werden.
Die Auswahl des Matrixmaterials basiert auf Bioverträglichkeit, Bioabbaubarkeit, mechanischen Eigenschaften, kosmetischem Erscheinungsbild und Grenzflächeneigenschaften. Die jeweilige Anwendung der BMP-9-Zusammensetzungen wird die geeignete Formulierung bestimmen. Potentielle Matrizes für die Zusammensetzungen können bioabbaubare und chemisch definiertes Calciumsulfat, Tricalciumphosphat, Hydroxyapatit, Polymilchsäure und Polyanhydride sein. Andere potentielle Materialien sind bioabbaubar und biologisch gut definiert, wie Knochen- oder Hautkollagen. Weitere Matrizes sind aus reinen Proteinen oder extrazellulären Matrixkomponenten zusammengesetzt. Andere potentielle Matrizes sind nicht bioabbaubar und chemisch definiert, wie gesintertes Hydroxyapatit, Bioglas, Aluminate oder andere Keramikwerkstoffe. Matrizes können aus Kombinationen beliebiger, der vorstehend erwähnten Typen von Materialien zusammengesetzt sein, wie Polymilchsäure und Hydroxyapatit oder Kollagen und Tricalciumphosphat. Die Biokeramiken können in der Zusammensetzung verändert werden, wie in Calcium-Aluminat- Phosphat und zur Veränderung der Porengröße, Partikelgröße, Partikelform und Bioabbaubarkeit prozessiert werden. Das Dosierungsschema wird von dem durchführenden Arzt unter Bedacht verschiedener Faktoren, welche die Wirkung des BMP-9- Proteins modifizieren, bestimmt, z. B. die gewünschte Menge Knochengewicht, die gebildet werden soll, die Stelle des Knochenschadens, die Verfassung des geschädigten Knochens, die Größe einer Wunde, die Art des geschädigten Gewebes, das Alter, das Geschlecht und die Ernährung des Patienten, die Schwere einer Infektion, die Verabreichungszeit und andere klinische Faktoren. Die Dosierung kann mit dem Typ der Matrix, der bei der Wiederherstellung verwendet wird, und den Typen von BMP- Proteinen in der Zusammensetzung variieren. Die Zugabe anderer bekannter Wachstumsfaktoren, wie IGF I (insulinähnlicher Wachstumsfaktor I) zu der fertigen Zusammensetzung kann ebenfalls die Dosierung beeinflussen. Ein Fortschritt kann durch periodische Überprüfung des Knochenwachstums und/oder der Reparatur beobachtet werden, z. B. mit Röntgenstrahlung, histomorphometrischen Bestimmungen und Tetracyclinmarkierung. Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Praxis der vorliegenden Erfindung bezüglich der Gewinnung und Charakterisierung von murinen BMP-9-Proteinen und wie man sie verwendet, um die menschlichen und anderen BMP-9-Proteine zu gewinnen, die menschlichen Proteine zu erhalten und die Proteine über rekombinante Verfahren zu exprimieren.

Beispiel I

Murines BMP-9

750.000 Rekombinanten einer Mausleber-cDNA-Bibliothek im Vektor LambdaZAP (Stratagene/Catalog #935302) werden ausplattiert und zweifache Nitrocellulose-Replikafilter werden hergestellt. Ein Fragment aus menschlicher BMP-4-DNA, entsprechend den Nucleotiden 133-1627 von Figure 2 (SEQ ID NR: 3) (die menschliche BMP-4-Sequenz) wird mit dem "random priming"- Verfahren von Feinberg et al. [Anal. Biochem. 132: 6-13 (1983)] markiert und 2 bis 3 Tage auf beide Filtersätze in SHB bei 60ºC hybridisiert. Beide Filtersätze werden unter Bedingungen reduzierter Stringenz gewaschen (4 · SSC, 0,1% SDS, bei 60ºC). Viele doppelt-hybridisierende Rekombinanten verschiedener Intensitäten (etwa 92) wurden gefunden. 50 der am stärksten hybridisierenden rekombinanten Bakteriophagen werden Plaquegereinigt und ihre Insertionen werden in das Plasmid Bluescript SK (+/-), gemäß dem in vivo-Ausschneideverfahren, welches vom Hersteller (Stratagene) beschrieben ist, transferiert. Die DNA- Sequenzanalyse mehrere Rekombinanten zeigt, daß sie ein Protein codieren, welches zu andern BMP-Proteinen und anderen Proteinen der TGF-β-Familie homolog sind. Die DNA-Sequenz und davon abgeleitete Aminosäure-Sequenz einer Rekombinante, als ML14a bezeichnet, ist in Fig. 1 dargestellt (SEQ ID NR: 1) Die Nucleotid-Sequenz von Clon ML14a enthält ein offenes Leseraster von 1284 bp, welches ein BMP-9-Protein aus 428 Aminosäuren codiert. Man geht davon aus, daß das codierte 428 Aminosäuren-BMP-9-Protein das primäre Translationsprodukt darstellt, da der codierenden Sequenz 609 bp 5- nichttranslatierte Sequenz mit Stop-Codons in allen drei Leserastern vorgeschaltet ist. Die 428 Aminosäure-Sequenz sagt ein BMP-9-Protein mit einem Molekulargewicht von 48.000 Dalton voraus.
Auf der Grundlage der Kenntnis anderer BMP-Proteine und anderer Proteine innerhalb der TGF-β-Familie wird vorhergesagt, daß das Vorläuferpolypetid, in Übereinstimmung mit einer vorgeschlagenen Consensus-proteolytischen Prozessierungssequenz von ARG-X-X-ARG, an der multibasischen Sequenz ARG-ARG-LYS-ARG gespalten wird. Die Spaltung des BMP-9-Vorläuferpolypeptids an dieser Stelle würde ein 110 Aminosäure langes reifes Peptid erzeugen, welches mit der Aminosäure SER an Position 319 beginnt. Man erwartet, daß die Prozessierung von BMP-9 in die reife Form die Dimerisierung und Entfernung der N-terminalen Region beinhaltet, und zwar in analoger Weise zu der Prozessierung des verwandten Proteins TGF-β [L. E. Gentry, et al., Molec. & Cell. Biol. 8: 4162 (1988); R. Derynck, et al., Nature 316: 701 (1985)].
Man geht deshalb davon aus, daß die reifen aktiven Formen des murinen BMP-9 aus einem Homodimer von 2 Polypeptiduntereinheiten bestehen, wovon jede Untereinheit die Aminosäuren 319 bis 428 mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von etwa 12.000 Dalton umfaßt. Es werden weitere aktive Formen erwartet, umfassend die Aminosäuren 326 bis 428, dabei den ersten konservierten Cysteinrest einschließend. Wie mit anderen Mitgliedern der BMP- und TGF-β- Familie von Proteinen zeigt die carboxyterminale Region des BMP-9-Proteins eine größere Sequenzkonservierung, als der mehr aminoterminale Teil. Die Prozentzahl Aminosäureidentität des murinen BMP-9-Proteins innerhalb der Cystein-reichen C- terminalen Domäne (Aminosäuren 326 bis 428) zu der entsprechenden Region anderer menschlicher BMP-Proteine und anderer Proteine innerhalb der TGF-β-Familie ist wie folgt: BMP-2, 53%; BMP-3, 43%; BMP-4, 53%; BMP-5, 55%; BMP-6, 55%; BMP-7, 53%; Vgl, 50%; GDF-1, 43%; TGF-β1, 32%; TGF-β2, 34%; TGF-ß3, 34%; Inhibin β (B), 34%; und Inhibin β (A) 42%.

Beispiel II

Menschliches BMP-9

Man geht davon aus, daß die Gene menschlicher und muriner osteoinduktiver Faktoren signifikante Homologien zeigen, und deshalb wird die murine codierende Sequenz oder ein Teil daraus als Sonde verwendet, um eine menschliche genomische Bibliothek zu durchmustern, oder als eine Sonde, um eine menschliche Zellinie oder menschliches Gewebe zu identifizieren, welches das analoge menschliche Knorpel- und/oder Knochenprotein synthetisiert. Eine menschliche genomische Bibliothek (Toll et al., supra) kann mit einer solchen Sonde durchmustert werden und vermeintlich Positive isoliert und die DNA-Sequenz erhalten werden. Beweise dafür, daß diese Rekombinanten einen Teil des menschlichen BMP-9 codieren, basieren auf den Strukturhomologien des murinen/menschlichen Proteins und Gens.
Wenn dann ein rekombinanter Bakteriophage erhalten wird, der DNA enthält, die einen Teil des menschlichen knorpel- und/oder knocheninduktiven Faktormoleküls codiert, kann die menschliche codierende Sequenz als Sonde verwendet werden, um eine menschliche Zellinie oder ein Gewebe zu identifizieren, welches BMP-9 synthetisiert. Alternativ dazu kann die murine codierende Sequenz als Sonde verwendet werden, um eine solche menschliche Zellinie oder ein menschliches Gewebe zu identifizieren. Kurz beschrieben, wird die RNA von einer ausgewählten Zell- oder Gewebequelle extrahiert und entweder auf einem Formaldehyd- Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrocellulose transferiert, oder mit Formaldehyd umgesetzt und direkt auf Nitrocellulose aufgebracht. Die Nitrocellulose wird dann mit einer Sonde hybridisiert, welche aus einer codierenden Sequenz für murines oder menschliches BMP-9 stammt. Durch Oligo (dT)- Cellulosechromatographie wird die mRNA isoliert und cDNA synthetisiert und in Lambdagt10 oder LambdaZAP cloniert, indem etablierte Methoden verwendet werden (Toole et al., supra). Weitere, dem Fachmann bekannte Verfahren können verwendet werden, um die erfindungsgemäßen BMP-9-Proteine des Menschen und anderer Arten zu isolieren.

A. Isolierung von menschlicher BMP-9-DNA

Eine Million Rekombinanten einer menschlichen genomischen Bibliothek im Vektor λFIX (Stratagene Katalog #944201) werden ausplattiert und zweifache Nitrocellulose-Replikas gemacht. Zwei Oligonucleotidsonden, die auf der Grundlage der Nucleotide 1665 bis 1704 und 1837 bis 1876 der in Fig. 1 (SEQ ID NR: 1) dargestellten Sequenz erzeugt wurden, werden mit einem automatischen DNA-Syntheseautomaten hergestellt. Die Sequenz dieser beiden Oligonucleotide ist nachfolgend gezeigt:
#1:CTATGAGTGTAAAGGGGGTTGCTTCTTCCCATTGGCTGAT
#2:GTGCCAACCCTCAAGTACCACTATGAGGGGATGAGTGTGG
Diese beiden Oligonucleotidsönden werden mit γ³²P-ATP radioaktiv markiert und jedes wird mit einem Satz der zweifachen Nitrocellulose-Replikafilter in SHB bei 65ºC hybridisiert und mit 1x SSC, 0,1% SDS, bei 65ºC gewaschen. Drei Rekombinanten, welche mit beiden Oligonucleotidsonden hybridisieren, werden gefunden. Alle drei positiv hybridisierende Rekombinanten werden Plaquegereinigt, Bakteriophagen-Stammplatten werden hergestellt und von jedem wird Bakteriophagen-DNA isoliert. Die Oligonucleotid-hybridisierenden Regionen von einem dieser Rekombinanten, als HG111 bezeichnet, wird als auf einem 1,2 kb Pst I/Xba I Fragment lokalisiert gefunden. Dieses Fragment wird in einen Plasmidvektor (pGEM-3) subcloniert und eine DNA- Sequenzanalyse wird durchgeführt. HG111 wurde bei der ATCC, 12301 Parklawrn Drive, Rockville, Maryland, USA am 16. Juni 1992, gemäß den Richtlinien des Budapester Vertrags, hinterlegt und als ATCC #75252 bezeichnet. Dieser Subclon wird als pGEM- 111 bezeichnet. Ein Teil der DNA-Sequenz von Clon pGEM-111 ist in Fig. 3 gezeigt (SEQ ID NR: 8 / menschliche BMP-9-Sequenz). Diese Sequenz codiert die gesamte reife Region von menschlichem BMP-9 und einen Teil des Propeptids. Es sollte angemerkt werden, daß diese Sequenz aus vorläufigen Daten besteht. Insbesondere die Propeptidregion ist Gegenstand weiterer Analysen und Charakterisierung. So codieren z. B. die Nucleotide #1 bis #3 (TGA) ein Translationsstopcodon, welches aufgrund der vorläufigen Natur der Sequenz unkorrekt sein kann. Es wird vorausgesagt, daß zusätzliche Sequenzen, welche sowohl in pGEM- 111 (das 1,2 kb PstI/XbaI-Fragment von HG111, welches in pGEM subcloniert ist) und HG111 weitere Aminosäuren der menschlichen BMP-9-Propeptidregion codieren. Auf der Grundlage der Kenntnis anderer BMP's und anderer Proteine innerhalb der TGF-β-Familie wird vorhergesagt, daß das Vorläuferpolypeptid in Übereinstimmung mit einer vorgeschlagenen Consensusproteolytischen Prozessierungssequenz ARG-X-X-ARG an der multibasischen Sequenz ARG-ARG-LYS-ARG (Aminosäuren #-4 bis #-1 der Sequenz ID NR: 9) gespalten wird. Die Spaltung des menschlichen BMP-9-Vorläuferpolypeptids an dieser Stelle würde ein 110 Aminosäuren-reifes Peptid erzeugen, welches mit der Aminosäure SER an Position #1 der Sequenz ID NR: 9 (codiert von den Nucleotiden #124 bis #126 von Sequenz ID NR: 8), beginnt. Man geht davon aus, daß die Prozessierung von menschlichem BMP- 9 in die reife Form die Dimerisierung und die Entfernung der N- terminalen Region in einer Art und Weise, die zur Prozessierung des verwanden Proteins TGF-β analog ist, umfaßt [L. E. Gentry et al., Molec. & Cell. Biol. 8: 4162 (1988); R. Derynck, et al., Nature 316: 701 (1985)].
Man glaubt deshalb, daß die reife aktive Form von menschlichem BMP-9 ein Homodimer aus zwei Polypeptideinheiten umfaßt, wobei jede Untereinheit die Aminosäuren #1 bis #110 von SEQUENZ ID NR: 9, mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 12.000 Dalton, umfaßt. Es werden weitere aktive Formen erwartet, umfassend die Aminosäuren #8 bis #110, dabei den ersten konservierten Cysteinrest einschließend. Wie mit anderen Mitgliedern der BMP- und TGF-β-Familie von Proteinen zeigt die carboxyterminale Region des BMP-9-Proteins eine größere Sequenzkonservierung, als der mehr aminoterminale Teil. Die Prozentzahl Aminosäureidentität des murinen BMP-9-Proteins innerhalb der Cystein-reichen C-terminalen Domäne (Aminosäuren #8 bis #110) zu der entsprechenden Region anderer menschlicher BMP-Proteine und anderer Proteine innerhalb der TGF-β-Familie ist wie folgt:
BMP-2, 52%; BMP-3, 40%; BMP-4, 52%; BMP-5, 55%; BMP-6, 55%; BMP-7, 53%; BMP-9 der Maus, 97%; Vgl, 50%; GDF-1, 44%; TGF-β1, 32%; TGF-β2, 32%; TGF-β3, 32%; Inhibin β (B), 35%; und Inhibin β (A), 41%.

Beispiel III

Sampath-Reddi-Test, modifiziert nach Rosen

Es wird eine modifizierte Version des Ratten- Knochenbildungstests, der in Sampath & Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 6591-6595 (1983) beschrieben ist, verwendet, um die Knochen- und/oder Knorpelaktivität der BMP-Proteine zu evaluieren. Dieser modifizierte Test wird hierin als Sampath- Reddi-Test, modifiziert nach Rosen genannt. Der Ethanolfällungsschritt des Sampath-Reddi-Verfahrens wird durch Dialyse (wenn die Zusammensetzung eine Lösung ist) oder Diafiltration (wenn die Zusammensetzung eine Suspension ist) gegen Wasser für die Fraktion, die getestet werden soll, ersetzt. Die Lösung oder Suspension wird dann in 0,1% TFA wieder gelöst und die resultierende Lösung wird zu 20 mg Rattenmatrix zugegeben. Eine scheinbare Ratten-Matrixprobe, welche nicht mit dem Protein behandelt wurde, dient als eine Kontrolle. Dieses Material wird eingefroren und lyophylisiert und das resultierende Pulver in #5-Gelatinekapseln eingeschlossen. Die Kapseln werden subkutan in die abdominale Thoraxregion von 21-49 Tage alten männlichen Long Evans- Ratten implantiert. Die Implantate werden nach 7-14 Tagen entfernt. Die Hälfte jedes Implantats wird für eine alkalische Phosphataseanalyse verwendet [siehe, A. H. Reddi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 1601 (1972)].
Die andere Hälfte jedes Implantates wird fixiert und für histologische Analysen prozessiert. 1 um dicke Glykol- Methacrylat-Schnitte werden mit Von Kossa und saurem Fuchsin gefärbt, um die Menge an induzierter Knochen- und Knorpelbildung, die in jedem Implantat vorliegt, zu bestimmen. Die Begriffe +1 bis +5 stellen den Bereich jedes histologischen Schnitts eines Implantates dar, der durch neue Knochen- und/oder Knorpelzellen und Matrix besetzt wird. Ein Wert von +5 gibt an, daß mehr als 50% des Implantats neuer Knochen und/oder Knorpel ist, welcher als ein direktes Ergebnis von Protein im Implantat produziert wurde. Ein Wert von +4, +3, +2 und +1 würde angeben, daß mehr als 40%, 30%, 20% bzw. 10% des Implantats neuen Knorpel und/oder Knochen enthält. In einem modifizierten Zählverfahren werden 3 nicht benachbarte Bereiche jedes Implantats evaluiert und der Durchschnittswert bestimmt. "+/-" gibt eine vorläufige Identifizierung von Knorpel oder Knochen an; "+1" gibt an, daß > 10% jedes Schnittes neuer Knorpel oder Knochen ist; "+2", > 25%, "+3", > 50%; "+4", ungefähr 75%; "+5", > 80%. Ein "-" gibt an, daß das Implantat nicht wiedergewonnen wird. Man geht davon aus, daß die Dosis- Wirkungsnatur der BMP-9-enthaltenden Proben der Matrixproben zeigen wird, daß die Menge an gebildetem Knochen und/oder Knorpel mit der Menge an BMP-9 in der Probe ansteigt. Man geht davon aus, daß die Kontrollproben keinerlei Knochen- und/oder Knorpelbildung zeigen werden.
Wie mit anderen Knorpel und/oder Knocheninduktiven Proteinen, wie die vorstehend erwähnten "BMP"-Proteine, wird erwartet, daß der gebildete Knochen und/oder Knorpel sich physikalisch auf den Raum beschränkt, welcher durch die Matrix besetzt ist. Die Proben werden auch durch SDS-Gelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung, gefolgt von Autoradiographie analysiert. Die Aktivität wird mit den Proteinbanden und dem pl-Wert korreliert. Um die Reinheit des Proteins in einer bestimmten Fraktion zu bestimmen, wird als Bestimmungsgröße für Protein ein Extinktionskoeffizient von 1 OD/mg-cm verwendet und das Protein wird in einer SDS-PAGE aufgetrennt, gefolgt von Silberfärbung oder Radioiodinierung und Autoradiographie.

Beispiel TV

Expression von BMP-9

Um murine, menschliche oder BMP-9-Proteine anderer Säuger herzustellen, wird die jeweilige codierende DNA in einen geeigneten Expressionsvektor transferiert und in Säugerzellen oder andere bevorzugte eukaryontische oder prokaryontische Wirte mit Hilfe herkömmlicher gentechnischer Methoden eingebracht. Man geht davon aus, daß das bevorzugte Expressionssystem für biologisch aktives, rekombinantes, menschliches BMP-9 stabil transformierte Säugerzellen sind. Ein Fachmann kann Säuger-Expressionsvektoren konstruieren, indem er die Sequenzen von Fig. 1 (SEQ ID NR: 1) oder Fig. 3 (SEQ ID NR: 8) oder andere DNA-Sequenzen, die BMP-9-Proteine codieren, oder andere modifizierte Sequenzen und bekannte Vektoren, wie pCD [Okayama et al., Mol Cell. Biol., 2: 161-170 (1982)], pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4: 645-653 (1985)] und pMT2 CXM, benutzt.
Der Säuger-Expressionsvektor pMT2 CXM ist ein Derivat von p91023 (b) (Wong et al., Science 228: 810-815, 1985), der sich von dem letzteren dadurch unterscheidet, daß er das Ampicillin- Resistenzgen anstelle des Tetracyclin-Resistenzgens, und ferner eine XhoI-Stelle zur Insertion der cDNA-Clone enthält. Die funktionellen Elemente von pMT2 CXM sind beschrieben worden (Kaufmann, R. J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 689-693) und umfassen die Adenovirus VA-Gene, den SV40- Replikationsursprung, enthaltend den 72 bp-Enhancer, den hauptsächlichen späten Promotor des Adenovirus (adenovirus major late promotor), einschließlich einer 5'-Spleißstelle und die Mehrheit der dreiteiligen Adenovirus-Leadersequenz, welche innerhalb der späten mRNA's des Adenovirus enthalten ist, eine 3'-Spleiß-Akzeptorstelle, eine DHFR-Insertion, die frühe Polyadenylierungsstelle des SV40 (SV40) und pBR322-Sequenzen, die für die Propagierung in E. coli benötigt werden. Das Plasmid pMT2 CXM wird durch Spaltung von pMT2-VWF, welches bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD (USA) mit der Hinterlegungsnummer ATCC 67122 hinterlegt wurde, mit EcoRI erhalten. Die EcoRI-Spaltung schneidet die cDNA- Insertion, die in pMT2-VWF enthalten ist, aus und es wird pMT2 in linearer Form erhalten, welcher ligiert und zur Transformation von E. coli HB101 oder DH-5 für Ampicillinresistenz verwendet werden kann. Die DNA des Plasmids pMT2 kann durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden. pMT2 CXM wird dann unter Verwendung eines "loopout/in" - Mutageneseverfahrens [Morinaga, et al., Biotechnology 84: 636 (1984)] hergestellt. Dieses entfernt die Basen 1075 bis 1145 relativ zu der Hind III-Stelle nahe des SV40- Replikationsursprungs und Enhancer-Sequenzen von pMT2. Zusätzlich inseriert es die folgende Sequenz:
5'PO-CATGGGCAGCTCGAG-3' (SEQ ID NR: 5)
an Nucleotidposition 1145. Diese Sequenz enthält die Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease Xho I. Ein Derivat von pMT2 CXM, genannt pMT23, enthält Erkennungsstellen für die Restriktionsendonucleasen PstI, Eco RI, SalI und XhoI. Die DNA der Plasmide pMT2 CXM und pMT23 kann nach herkömmlichen Verfahren hergestellt werden.
PEMC2bI, der aus pMT21 erhalten wird, kann ebenfalls für die Anwendungen der Erfindung geeignet sein. PMT21 wird aus pMT2 erhalten, welcher aus pMT2-VWF erhalten wurde. Wie vorstehend beschrieben, schneidet die Spaltung mit EcoRI die cDNA- Insertion, die in pMT-VWF enthalten ist, aus, wobei pMT2 in linearer Form erhalten wird, welcher ligiert werden kann und für die Transformation von E. coli HB101 oder DH-5 für Ampicillinresistenz verwendet werden kann. Die DNA des Plasmids pMT2 kann nach herkömmlichen Verfahren hergestellt werden. PMT21 wird aus pMT2 durch die folgenden zwei Modifikationen erhalten. Erstens, 76 bp der 5'-nichttranslatierten Region der DHFR-cDNA, einschließlich einer Folge von 19 G-Resten aus dem "G/C-tailing" der cDNA-Clonierung, wird deletiert. In diesem Verfahren wird eine XhoI-Stelle inseriert, um die folgende Sequenz unmittelbar stromaufwärts von DHFR zu erhalten:
5' -CTGCAGGCGAGCCTGAATTCCTCGAGCCATCATG - 3
Pst I EcoRI XhoI
(SEQ ID NR: 6).
Zweiten, eine einzelne ClaI-Stelle wird durch Spaltung mit EcoRV und XbaI, Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA- Polymerase I und Ligierung an einen ClaI-Linker (CATCGATG) eingefügt. Dies deletiert ein 250 bp-Segment aus der Adenovirus-assoziierten RNA (VAI)-Region, interferiert jedoch nicht mit der Expression oder Funktion des VAI-RNA-Gens. PMT21 wird mit EcoRI und XhoI geschnitten und verwendet, um den Vektor pEMC2B1 zu erhalten.
Ein Teil der EMCV-Leadersequenz wird aus pMT2-ECAT1 [S. K. Jung, et al., J. Virol 63: 1651-1660 (1989)] durch Spaltung mit EcoRI und PstI, resultierend in einem 2752 bp-Fragment, erhalten.
Dieses Fragment wird mit TaqI geschnitten, wobei ein Eco RI- TaqI-Fragment von 508 bp erhalten wird, welches durch Elektrophorese in einem niedrig schmelzenden Agarosegel gereinigt wird. Ein Adapter von 68 bp, welcher die folgende Sequenz hat, und sein komplementärer Strang werden mit einem 5'-TaqI-überstehenden und einem 3'-XhoI-überstehenden Ende synthetisiert:
5 -CGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGCTTTT
TaqI
CCTTTGAAAAACACGATTGC-3'
XhoI (SEQ ID NR: 7).
Diese Sequenz entspricht der Leadersequenz des EMC-Virus von Nucleotid 763 bis 827. Sie verändert auch das ATG an Position 10 innerhalb der EMC-Virus-Leadersequenz zu einem ATT und ist gefolgt von einer XhoI-Stelle. Eine Dreiwegeligierung des pMT21-Eco RI-XhoI-Fragments, des EMC-Virus-EcoRI-TaqI-Fragments und des 68 bp-Oligonucleotidadapters TaqI-XhoI resultiert in dem Vektor pEMC2β1.
Dieser Vektor enthält den SV40-Replikationsursprung und - Enhancer, den Adenovirus "major late promoter", eine cDNA- Kopie der Mehrheit der dreiteiligen Leadersequenz des Adenovirus, eine kleine hybride Verbindungssequenz, ein SV40- Polyadenylierungssignal und das Adenovirus VA I-Gen, DHFR- und β-Laktamasemarker und eine EMC-Sequenz in geeigneter Verknüpfung, um die hohen Expressionsspiegel der gewünschten cDNA in Säugerzellen zu steuern.
Die Herstellung der Vektoren kann die Modifikation der BMP-9- DNA-Sequenzen beinhalten. Zum Beispiel kann die BMP-9-cDNA durch Entfernen der nicht codierenden Nucleotide am 5'- und 3- Ende der codierenden Region modifiziert werden. Die deletierten nicht codierenden Nucleotide können oder können nicht durch andere Sequenzen, welche bekannt dafür sind, daß sie für die Expression hilfreich sind, ersetzt werden. Diese Vektoren werden zur Expression von BMP-9-Proteinen in geeignete Wirtszellen transformiert.
Ein Fachmann kann die Sequenzen aus Fig. 1 oder Fig. 3 (SEQ ID NR: 1 und 8) manipulieren, indem er die regulatorischen Säugersequenzen, welche die codierende Sequenz flankieren, eliminiert oder mit bakteriellen Sequenzen ersetzt, um bakterielle Vektoren zur intrazellulären oder extrazellulären Expression durch Bakterienzellen, herzustellen. Z. B. könnten die codierenden Sequenzen weiter manipuliert werden (z. B. an andere bekannte Linker ligiert werden oder durch Deletion nicht codierender Sequenzen modifiziert werden oder durch Veränderung von darin enthaltenen Nucleotiden durch andere bekannte Verfahren). Die modifizierte BMP-9-codierende Sequenz könnte dann in einen bekannten bakteriellen Vektor, unter Verwendung von Verfahren, wie beschrieben in T. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci.- USA, 77: 5230-5233 (1980), in einen bekannten bakteriellen Vektor inseriert werden. Dieser exemplarische bakterielle Vektor könnte dann in bakterielle Wirtszellen transformiert werden und dabei ein BMP-9-Protein exprimiert werden. Für eine Strategie zur Herstellung extrazellulärer Expression von BMP-9-Proteinen in bakteriellen Zellen siehe z. B. die europäische Patentanmeldung EP-A 177.343. Ähnliche Manipulationen können für die Herstellung eines Insektenvektors zur Expression in Insektenzellen durchgeführt werden [siehe z. B. Verfahren, die in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung 155.476 beschrieben sind]. Ein Hefevektor könnte auch konstruiert werden, indem man Heferegulatorische Sequenzen zur intrazellulären oder extrazellulären Expression der erfindungsgemäßen Faktoren durch Hefezeilen, benutzt [siehe z. B. Verfahren, die in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO86/00639 und der europäischen Patentanmeldung EP-A 123.289 beschrieben sind]. Ein Verfahren zur Herstellung hoher Spiegel von erfindungsgemäßem BMP-9-Protein in Säugerzellen kann die Konstruktion von Zellen beinhalten, die multiple Kopien des heterologen BMP-9-Gens enthalten. Das heterologe Gen ist an einen amplifizierbaren Marker geknüpft, z. B. das Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Gen, über welches Zellen, die eine erhöhte Genkopienzahl enthalten, selektioniert werden können, zur Propagierung in ansteigenden Konzentrationen von Methotrexat (MTX) gemäß den Verfahren von Kaufmann und Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982). Dieser Ansatz kann mit einer Anzahl verschiedener Zelltypen benutzt werden.
Zum Beispiel ein Plasmid, welches eine DNA-Sequenz für ein erfindungsgemäßes BMP-9, funktionell assoziiert mit anderen Plasmidsequenzen, die dessen Expression erlauben, enthält und das DHFR-Expressionsplasmid pAdA26SV(A)3 [Kaufmann und Sharp, Mol. Cell. Biol., 2: 1304 (1982)] können gemeinsam in DHFR- defiziente CHO-Zellen, DUKX-BII durch verschiedene Verfahren, einschließlich Calciumphosphat-Copräzipitation und Transfektion, Elektroporation oder Protoplastenfusion eingebracht werden. Durch Wachstum in Alphamedium mit dialysiertem fötalen Kälberserum und nachfolgender Selektion auf Amplifikation durch Wachstum in ansteigenden Konzentrationen von MTX (z. B. sequentielle Schritte in 0,02, 0,2, 1,0 und 5 uM MTX) wie in Kaufmann et al., Mol. Cell. Biol., 5: 1750 (1983) beschrieben, werden DHFR-exprimierende Transformanten selektioniert. Transformanten werden cloniert und die Expression von biologisch aktivem BMP-9 wird durch den Sampath-Reddi-Ratten-Knochenbildungstest, modifiziert nach Rosen, welcher vorstehend in Beispiel III beschrieben wurde, nachgewiesen. Die BMP-9-Expression sollte mit ansteigenden Werten MTX-Resistenz zunehmen. Die BMP-9-Polypeptide werden unter Verwendung von Standardverfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wie Puls-Markierung mit [³&sup5;S]-Methionin oder -Cystein und Polyacrylamid-Gelelektrophorese charakterisiert. Zur Herstellung anderer verwandter BMP-9- Proteine können ähnliche Verfahren benutzt werden.

A. BMP-9-Vektorkonstruktion

Um die erfindungsgemäßen menschlichen BMP-9-Proteine herzustellen, können DNA-Sequenzen, die die reife Region des menschlichen BMP-9-Proteins codieren, an DNA-Sequenzen, die die Propeptid-Region des murinen BMP-9-Proteins codieren, gekoppelt werden. Diese murine/menschliche Hybrid-DNA-Sequenz wird in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert und in Säugerzellen oder andere bevorzugte eukaryontische oder prokaryontische Wirte mit Hilfe herkömmlicher gentechnischer Verfahren eingebracht. Die Herstellung murine/menschliche BMP-9 enthaltenden Expressionsplasmids ist nachstehend beschrieben. Ein Derivat der menschlichen BMP-9-Sequenz (SEQ ID NR: 8), umfassend die Nucleotidsequenz von Nucleotid #105 bis #470, wird spezifisch amplifiziert. Die folgenden Oligonucleotide werden als Primer verwendet, um die Amplifikation der Nucleotide #105 bis #470 der menschlichen BMP-9-Sequenz (SEQ ID NR: 8) aus vorstehend beschriebenem Clon pGEM-111, zu ermöglichen.
#3 ATCGGGCCCCTTTTAGCCAGGCGGAAAAGGAG
#4 AGCGAATTCCCCGCAGGCAGATACTACCTG
Dieses Verfahren führt zur Insertion der Nucleotidsequenz ATCGGGCCCCT unmittelbar vor Nucleotid #105 und zur Insertion der Nucleotidsequenz GAATTCGCT unmittelbar nachfolgend auf Nucleotid #470. Die Addition dieser Sequenzen resultiert in der Erzeugung einer Apa I- und EcoR I- Restriktionsendonucleasestelle an den jeweiligen Enden des spezifischen, amplifizierten DNA-Fragments. Das resultierende 374 bp große Apa I/EcoR I-Fragment wird in den Plasmidvektor pGEM7Zf(+) (Promega Katalog #p2251) subcloniert, welcher mit Apa I und EcoR I geschnitten worden war. Der resultierende Clon wird mit phBMP9mex-1 bezeichnet.
Die folgenden Oligonucleotide wurden auf der Grundlage muriner BMP-9-Sequenzen entwickelt (SEQ ID NR: 1) und wurden modifiziert, um die Herstellung des vorstehend erwähnten murinen/menschlichen-Expressionsplasmids zu erleichtern:
#5 GATTCCGTCGACCACCATGTCCCCTGGGGCCTGGTCTAGATGGATACACAGCTGTGGGGCC
#6 CCACAGCTGTGTATCCATCTAGACCAGGCCCCAGGGGACATGGTGGTCGACG
Diese Oligonucleotide enthalten komplementäre Sequenzen, welche nach gegenseitiger Addition die Anelierung (Basenpaarung) der beiden individuellen Sequenzen erleichtern, wobei ein doppelsträngiger synthetischer DNA-Linker (als LINK-1 bezeichnet) gebildet wird, auf die Art wie nachfolgend gezeigt:
Dieser DNA-Linker (LINK-1) enthält Erkennungsstellen für Restriktionsendonucleasen, die benötigt werden, um nachfolgende Manipulationen zu erleichtern, die erforderlich sind, um das murine/menschliche-Expressionsplasmid herzustellen, sowie Sequenzen, die für die maximale Expression heterologer Sequenzen in Säugerzell-Expressionssystemen erforderlich sind. Genauer (in Bezug auf die Sequenz-Nummerierung von Oligonucleotid #5/LINK-1): Die Nucleotide #1 bis #11 umfassen die Erkennungsstellen für die Restriktionsendonucleasen BamH I und Sal I, Nucleotide #11 bis #15 erlauben die maximale Expression heterologer Sequenzen in Säugerzell- Expressionssystemen, Nucleotide #16 bis #31 entsprechen den Nucleotiden #610 bis #625 der murinen BMP-9-Sequenz (SEQ ID NR: 1), Nucleotide #32 bis #33 werden inseriert, um einen effizienten Verdau zweier benachbarter Restriktionsendonucleasestellen (Eco0109 I und Xba I) zu erleichtern. Nucleotide #34 bis #60 entsprechen den Nucleotiden #1515 bis #1541 der murinen BMP-9-Sequenz (SEQ ID NR: 1), mit der Ausnahme, daß Nucleotid #58 des synthetischen Oligonucleotids #5 ein G ist, gegenüber dem A, welches an Position #1539 von SEQ ID NR: 1 auftaucht (diese Nucleotidkonversion resultiert in der Bildung einer Apa I- Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle, ohne dabei die Aminosäuresequenz, die sie codieren soll zu verändern, um weitere. Manipulationen des murinen/menschlichen Hybrid- Expressionsplasmids zu erleichtern. LINK-1 (das doppelsträngige Produkt der Basenpaarung der Oligonucleotide #5 und #6) wird in den Plasmidvektor pGEM-7Zf (+) subcloniert, welcher mit den Restriktionsendonucleasen Apa I und BamH I geschnitten worden ist. Das resultiert in einem Plasmid, in welchem die Sequenzen, die normalerweise zwischen den Apa I- und BamH I-Stellen des pGEM-7Zf (+)-Plasmid-Polylinkers liegen, durch die Sequenzen des vorstehend beschriebenen LINK-1 ersetzt werden. Der resultierende Plasmidclon wird mit pBMP-9-link bezeichnet.
PBMP-9-link wird mit den Restriktionsendonucleasen BamH I und Xba I geschnitten, was in der Entfernung der Nucleotide #1 bis #34 von LINK-1 (in Bezug auf die Nummerierung von Oligo #5) resultiert. Der Clon ML14a, welcher eine Insertion enthält, die die Sequenz umfaßt, welche in SEQ ID NR: 1 gezeigt ist, wird ebenfalls mit den Restriktionsendonucleasen BamH I und Xba I geschnitten, was in der Entfernung der Sequenzen, umfassend die Nucleotide #1 bis #1515 von SEQUENZ ID NR: 1 (murines BMP-9) resultiert. Dieses BamH I/Xba I-Fragment vom murinen BMP-9 wird aus dem Rest des ML14a-Plasmidclons isoliert und in die BamH I/Xba I-Stellen, welche durch die Entfernung der vorstehend beschriebenen synthetischen Linker-Sequenzen hergestellt wurden, subcloniert. Der resultierende Clon wird mit p302 bezeichnet.
Der p302-Clon wird mit der Restriktionsendonuclease Eco0109 I geschnitten, was in dem Ausschneiden der Nucleotide, entsprechend·den Nucleotiden #621 bis #1515 der BMP-9-Sequenz der Maus (SEQ ID NR: 1) und der Nucleotide #35 bis #59 von LINK- 1 (mit Bezug auf die Nummerierung von Oligonucleotid #5) resultiert. Es sollte bemerkt werden, daß die Apa I- Spaltungsstelle in LINK-1, welche durch die vorstehend beschriebene A- nach G-Konversion hergestellt wurde, ein Teil der Erkennungssequenz von Eco0109 I ist, und deshalb die Spaltung von p302 mit Eco0109 I sowohl an der Apa I-Stelle als auch an der natürlich auftretenden murinen Eco0109 I (Lokalisierung #619 bis #625 von SEQ ID NR: 1) schneidet, was in dem Ausschneiden eines 920 bp großen Eco0109 I/Eco0109 I (Apa I)-Fragments resultiert, welches die vorstehend beschriebenen Sequenzen umfaßt. Dieses 920 bp große Eco0109 I/Eco0109 I (Apa I)-Fragment wird von dem Rest des p302-Plasmidclons isoliert und in den Clon pBMP-9-link subcloniert, welcher genauso mit Eco0109 I geschnitten wurde. Man sollte bedenken, daß die Nucleotide GG (#32-33 von Oligonucleotid #5), welche ursprünglich eingebracht wurden, um eine vollständigere Spaltung der beiden benachbarten Restriktionsstellen Eco0109 I und Xba I von LINK-1 zu erleichtern, welches jetzt ein Teil von pBMP-9link (vorstehend beschrieben) ist, in der Ausbildung einer Dcm-Methylierungs-Erkennungssequenz resultieren. Die Restriktionsendonuclease Eco0109 I ist für Dcm-Methylierung sensitiv und deshalb ist die Spaltung dieser Sequenz (Nucleotide #25-#31 von Oligonucleotid #5/LINK-1) durch die Restriktionsendonuclease Eco0109 I an dieser Stelle verhindert. Aus diesem Grund wird der Plasmidclon pBMP-9link nach Spaltung mit der Restriktionsendonuklease Eco0109 I an der Apa I-Stelle geschnitten, jedoch nicht, wie vorstehend beschrieben, an der Eco0109 I-Stelle, wobei die beabsichtigte Entfernung der Sequenzen zwischen der Eco0109 I und Xba- I- Stelle von LINK-1 (#32-#55, bestimmt durch die Nummerierung von Oligonucleotid #5) verhindert wird. Das resultiert in der Insertion des 920 bp großen Eco0109 I/Apa I-Fragment in die Eco0109 I (Apa I)-Stelle des pBMP-9link. Der resultierende Clon wird mit p318 bezeichnet. -
Clon p318 wird mit den Restriktionsendonucleasen Sal I und Apa I geschnitten, was in dem Ausschneiden der Sequenzen, umfassend die Nucleotide #6-#56 von LINK-1 (zur Lokalisierung siehe Oligo #5), Nucleotide #621 - #1515 vom murinen BMP-9 (SEQ ID No: 1), und Nucleotide #35 bis #60 von LINK-1 (zur Lokalisierung beziehe auf Oligo #5). Das vorstehend beschriebene resultierende 972 bp große Sal I/Apa I-Fragment wird von dem Rest des p318-Plasmidclons isoliert und für nachfolgende Manipulationen verwendet.
Der Clon phBMP9mex-1 (vorstehend beschrieben), der DNA- Sequenzen enthält, welche die ganze reife Region und Teile des Propeptids von menschlichem BMP-9-Protein codieren, wird mit den Restriktionsendonucleasen Apa I und EcoR I geschnitten. Das resultiert in dem Ausschneiden eines 374 bp-Fragments, umfassend Nucleotide #105-#470 der menschlichen BMP-9-Sequenz (SEQ ID NR: 8) und die zusätzlichen Nucleotide der Oligonucleotidprimer #3 und #4, welche die Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonucleasen Apa I und EcoR I enthalten. Das 374 bp große Apa I/EcoR I-Fragment wird mit dem 972 bp großen Sal I/Apa I-Fragment aus p138 (dessen Isolierung wurde vorstehend beschrieben) vereint und mit dem Säugerzell- Expressionsplasmid pED6 (ein Derivat von pEMC2β1) ligiert, welches mit Sal I und EcoR I geschnitten worden ist. Der resultierende Clon wird als p324 bezeichnet.
Der Clon ML14a (murines BMP-9) wird mit Eco0109 I und Xba I geschnitten, um ein Fragment zu erzeugen, welches die Nucleotide #621 bis #1515 SEQ ID NR: 1 umfaßt.
Die folgenden Oligonucleotide werden mit einem automatischen DNA-Syntheseautomaten hergestellt und in einer Weise vereint, daß ihre komplementären Sequenzen Basenpaarungen miteinander eingehen können ("annealing"), um einen doppelsträngigen synthetischen DNA-Linker herzustellen, welcher als LINK-2 bezeichnet wird:
# 7 TCGACCACCATGTCCCCTGG
# 8 GCCCCAGGGGACATGGTGG
Dieser doppelsträngige synthetische DNA-Linker (LINK-2), paart sich derart, daß Einzelstrangenden erzeugt werden, die mit DNA- Fragmenten, welche mit Sal I (an einem Ende) oder Eco0109 I (am anderen Ende) gespalten wurden, wie nachstehend gezeigt, kompatibel sind:
#7 TCGACCACCATGTCCCCTGG
GGTGGTACAGGGGACCCCG #8
Dieser LINK-2 synthetische DNA-Linker wird an das 895 bp große Eco0109 I/Xba I Fragment ligiert, welches die Nucleotide #621 - #1515 von BMP-9 der Maus (SEQ ID NR: 1), welches vorstehend beschrieben ist, umfaßt. Das resultiert in einem 915 bp großen Sal I/Xba I-Fragment.
Der Clon p324 wird mit Sal I/Xba I geschnitten, um die Sequenzen, umfassend Nucleotide #6 bis #56 von Link-1 (zur Lokalisierung siehe Oligo #5) und die Nucleotide #621 bis #1515 vom murinen BMP-9 (SEQ ID NR: 1) zu entfernen. Die Sequenzen, welche die Nucleotide #35 bis #60 von LINK-1 (zur Lokalisierung siehe Oligo #5) umfassen und die Sequenzen, welche das 374 bp große Apa I/EcoR I-Fragment (menschliche BMP-9 Sequenzen) umfassen, welches aus phBMP9mex-1 stammt, bleiben an das pED6- Rückgrat angeheftet. Das 915 bp große Sal I/Xba I-Fragment, welches die LINK-2-Sequenzen und Nucleotide #621-#1515 vom murinen BMP-9 (SEQ ID NR: 1) umfaßt, wird in den p324-Clon ligiert, aus welchem die vorstehend beschriebenen Sal I bis Xba I-Sequenzen entfernt wurden.
Das resultierende Plasmid wird als BMP-9-Fusion bezeichnet und umfaßt LINK-2, Nucleotide #621 bis #1551 vom murinen BMP-9 (SEQ ID NR: 1), Nucleotide #35 bis #59 von LINK-1 (siehe die Nummerierung von Oligonucleotid #5), und das 374 bp große Apa I/EcoR I-Fragment (menschliches BMP-9), welches von Clon pBMP9mex-1 erhalten wurde (vorstehend beschrieben), zwischen die Sal I- und EcoR I-Stellen des Säugerzell-Expressionsvektors pED6 inseriert.
BMP-9-Fusion wird in CHO-Zellen, unter Verwendung von Standardtechniken, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, transfiziert, um eine stabile Zellinie zu erzeugen, welche fähig ist, menschliches BMP-9-Protein zu exprimieren. Die Zellinien werden unter geeigneten Kulturbedingungen gezüchtet und das BMP-9-Protein wird aus dem Kulturmedium isoliert und gereinigt.

Beispiel V

Biologische Aktivität von exprimiertem BMP-9

Um die biologische Aktivität der exprimierten BMP-9-Proteine, welche aus vorstehendem Beispiel IV erhalten wurden, zu messen, werden die Proteine aus der Zellkultur gewonnen und durch Isolierung der BMP-9-Proteine von anderen proteinartigen Stoffen, mit welchen sie gemeinsam produziert werden, sowie von anderen Verunreinigungen, gereinigt. Die gereinigten Proteine können gemäß dem, in Beispiel III beschriebenen Ratten- Knochenbildungstest getestet werden.
Die Reinigung wird unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt, die dem Fachmann bekannt sind. Man geht davon aus, daß wie für andere BMP-Proteine, die Reinigung die Verwendung von Heparin-Sepharose beinhalten kann.
Proteinanalysen werden unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt, wie SDS-PAGE [U. K. Laemmli, Nature 227: 680 (1970)], gefärbt mit Silber [R. R. Oakley, et al., Anal. Biochem. 105: 361 (1980)] und durch Immunblot [H. Tobin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350 (1979)].
Die vorstehenden Beschreibungen zeigen zur Zeit bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Man geht davon aus, daß nach Heranziehen dieser Beschreibungen ein Fachmann zahlreiche Modifikationen und Variationen in deren Durchführung einsetzen kann.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION

(i) ANMELDER:
(A) NAME: Wozney, John M., Celeste Anthony Genetics Institute, Inc.
(B) STRASSE: Legal Affairs - 87 Cambridge Park Drive
(C) STADT: Cambridge
(D) STAAT: Massachusetts
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 02140
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: BMP-9-Zusammensetzungen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 9
(iv) COMPUTER-LESBARES FORMAT:
(A) ART DES MEDIUMS: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Auflage #1,0, Version 1,25 (EPÜ)
(v) LAUFENDE ANMELDUNGSDATEN: ANMELDUNGSNUMMER: US

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NO: 1

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 2447 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENSE: Nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LOKALISATION: 610..1896
(xi) SEQUBNZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
CATTAATAAA TATTAAGTAT TGGAATTAGT GAAATTGGAG TTCCTTGTGG AAGGAAGTGG 60
GCAAGTGAGC TTTTTAGTTT GTGTCGGAAG CCTGTAATTA CGGCTCCAGC TCATAGTGGA 120
ATGGCTATAC TTAGATTTAT GGATAGTTGG GTAGTAGGTG TAAATGTATG TGGTAAAAGG 180
CCTAGGAGAT TTGTTGATCC AATAAATATG ATTAGGGAAA CAAVIATTAG GGTTCATGTT 240
GGTCCTTTTG GTGTGTGGAT TAGCATTATT TGTTTGATAA TAAGTTTAAC TAGTCAGTGT 300
TGGAAAGAAT GGAGACGGTT GTTGATTAGG CGTTTTGAGG ATGGGAATAG GATTGAAGGA 360
AATATAATGA TGGCTACAAC GATTGGGAAT CCTATTATTG TTGGGGTAAT GAATGAGGCA 420
AATAGATTTT CGTTCATTTT AATTCTCAAG GGGTTTTTAC TTTTATGTTT GTTAGTGATA 480
TTGGTGAGTA GGCCAAGGGT TAATAGTGTA ATTGAATTAT AGTGAAATCA TATTACTAGA 540
CCTGATGTTA GAAGGAGGGC TGAAAAGGCT CCTTCCCTCC CAGGACAAAA CCGGAGCAGG 600
GCCACCCGG ATG TCC CCT GGG GCC TTC CGG GTG GCC CTG CTC CCG CTG 648
AGCCACCCAG GGTGGGGATA CAGGACATGG AAGAGGTTCT GGTACGGTCC TGCATCCTCC 1963
TGCGCATGGT ATGCCTAAGT TGATCAGAAA CCATCCTTGA GAAGAAAAGG AGTTAGTTGC 2023
CCTTCTTGTG TCTGGTGGGT CCCTCTGCTG AAGTGACAAT GACTGGGGTA TGCGGGCCTG 2083
TGGGCAGAGC AGGAGACCCT GGAAGGGTTA GTGGGTAGAA AGATGTCAAA AAGGAAGCTG 2143
TGGGTAGATG ACCTGCACTC CAGTGATTAG AAGTCCAGCC TTACCTGTGA GAGAGCTCCT 2203
GGCATCTAAG AGAACTCTGC TTCCTCATCA TCCCCACCGA CTTGTTCTTC CTTGGGAGTG 2263
TGTCCTCAGG GAGAACAGCA TTGCTGTTCC TGTGCCTCAA GCTCCCAGCT GACTCTCCTG 2323
TGGCTCATAG GACTGAATGG GGTGAGGAAG AGCCTGATGG CCTCTGGCAA TCAGAGCCCG 2383
AAGGACTTCA AAACATCTGG ACAACTCTCA TTGACTGATG CTCCAACATA ATTTTTAAAA 2443
AGAG 2447

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 428 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENSE: Nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 1954 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENSE: Nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
CTCTAGAGGG CAGAGGAGGA GGGAGGGAGG GAAGGAGCGC GGAGCCCGGC CCGGAAGCTA 60
GGTGAGTGTG GCATCCGAGC TGAGGGACGC GAGCCTGAGA CGCCGCTGCT GCTCCGGCTG 120
AGTATCTAGC TTGTCTCCCC GATGGGATTC CCGTCCAAGC TATCTCGAGC CTGCAGCGCC 180
ACAGTCCCCG GCCCTCGCCC AGGTTCACTG CAACCGTTCA GAGGTCCCCA GGAGCTGCTG 240
CTGGCGAGCC CGCTACTGCA GGGACCTATG GAGCCATTCC GTAGTGCCAT CCCGAGCAAC 300
GCACTGCTGC AGCTTCCCTG AGCCTTTCCA GCAAGTTTGT TCAAGATTGG CTGTCAAGAA 360
TCATGGACTG TTATTATATG CCTTGTTTTC TGTCAAGACA CC ATG ATT CCT GGT 414
CACACACACA CACCACATAC ACCACACACA CACGTTCCCA TCCACTCACC CACACACTAC 1726
ACAGACTGCT TCCTTATAGC TGGACTTTTA TTTAAAAAAA AAAAAAAAAA AATGGAAAAA 1786
ATCCCTAAAC ATTCACCTTG ACCTTATTTA TGACTTTACG TGCAAATGTT TTGACCATAT 1846
TGATCATATA TTTTGACAAA ATATATTTAT AACTACGTAT TAAAAGAAAA AAATAAAATG 1906
AGTCATTATT TTAAAAAAAA AAAAAAAACT CTAGAGTCGA CGGAATTC 1954

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 408 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENSE: Nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 15 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENSE: Nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
CATGGGCAGC TCGAG

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 34 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENSE: Nein
(xii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
CTGCAGGCGA GCCTGAATTC CTCGAGCCAT CATG

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 68 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENSE: Nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
CGAGGTTAAA AAACGTCTAG GCCCCCCGAA CCACGGGGAC GTGGTTTTCC
TTTGAAAAAC ACGATTGC

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 470 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENSE: Nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 151 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

Claims

1. DNA-Sequenz, die ein Protein mit der biologischen Aktivität der Induktion der Bildung von Knorpel und/oder Knochen eines BMP-9-Proteins codiert, wobei die Sequenz ist

(a) die DNA-Sequenz von Nucleotid 124 bis 453 von SEQ ID No. 8; oder

(b) die DNA-Sequenz von Nucleotid 145 bis 453 von SEQ ID No. 8; oder

(c) eine DNA-Sequenz, die sich von der DNA-Sequenz nach

(a) oder (b) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet; oder

(d) eine allelische Variante der Sequenz nach (a) oder (b) ; oder

(e) eine DNA-Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit den Sequenzen nach (a) oder (b) hybridisiert.

2. Rekorrbinantes DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 enthält.

3. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 2, wobei die DNA-Sequenz unter der Kontrolle von regulatorischen Elementen steht, die ihre Expression in einer gewünschten Wirtszelle erlauben.

4. Wirtszelle, die das rekombinante DNA-Molekül nach Anspruch 2 oder 3 enthält.

5. Wirtszelle nach Anspruch 4, die eine Bakterienzelle, eine Hefezelle oder eine Säugerzelle ist.

6. Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der biologischen Aktivität eines BMP-9-Proteins, umfassend die Züchtung einer Wirtszelle nach Anspruch 4 oder 5 unter Bedingungen, die für die Expression der DNA-Sequenz geeignet sind, und die Gewinnung des Proteins aus der Kultur.

7. Protein, das von der DNA-Secuenz nach Anspruch 1 codiert wird.

8. Protein, das durch das Verfahren nach Anspruch 6 hergestellt wird.

9. Protein mit der biologischen Aktivität eines BMP-9-Proteins, das eine der folgenden Aminosäuresequenzen umfaßt

(a) die Aminosäuresequenz von Aminosäure Nr. 8 bis 110, die in Fig. 3 (SEQ ID No. 9) dargestellt ist; oder

(b) die Aminosäuresequenz von Aminosäure Nr. 1 bis 110, die in Fig. 3 (SEQ ID No. 9) dargestellt ist.

10. Protein mit der biologischen Aktivität eines BMP-9-Proteins, wobei das Protein ein Dimer ist, in dem jede Untereinheit mindestens die Aminosäuresequenz von Aminosäure Nr. 8 bis 110 von Fig. 3 (SEQ ID No. 9) oder mindestens die Aminosäuresequenz von Aminosäure Nr. 1 bis 110 von Fig. 3 (SEQ ID No. 9) umfaßt.

11. Gereinigtes BMP-9-Protein, erhältlich durch die Schritte

(a) Züchtung einer Zelle, die mit einer cDNA transformiert ist, die die Nucleotidsequenz von Nucleotid Nr. 124 bis 453 umfaßt, die in Fig. 3 (SEQ ID No. 8) gezeigt ist; und

(b) Gewinnung und Reinigung eines Proteins, das die Aminosäuresequenz von Aminosäure Nr. 1 bis 110 umfaßt, die in Fig. 3 (SEQ ID No. 9) gezeigt ist, aus dem Kulturmedium.

12. Gereinigtes BMP-9-Protein, erhältlich durch die Schritte

(b) Gewinnung eines Proteins, das die Aminosäuresequenz von Aminosäure Nr. 8 bis 110 umfaßt, die in Fig. 3 (SEQ ID No. 9) gezeigt ist, aus dem Kulturmedium.

13. Arzneimittel, das eine wirksame Menge eines Proteins nach einem der Ansprüche 7 bis 12 gegebenenfalls in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.

14. Arzneimittel nach Anspruch 13, das weiter eine Matrix als Träger des Arzneimittels umfaßt und eine Oberfläche für Knochen- und/oder Knorpelwachstum bereitstellt.

15. Arzneimittel nach Anspruch 14, wobei die Matrix ein Material umfaßt, das Hydroxyapatit, Collagen, Polymilchsäure oder Tricalciumphosphat ist.

16. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 13 bis 15 zur Wundheilung, Gewebewiederherstellung, Induktion des Knochenwachstums oder Induktion des Knorpelwachstums.

17. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 7 bis 12 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Induktion der Knochenbildung oder der Knorpelbildung, zur Behandlung von Wunden oder zur Gewebewiederherstellung.

18. Verfahren zur Herstellung einer DNA-Sequenz, die ein Protein mit der biologischen Aktivität der Induktion der Bildung von Knorpel und/oder Knochen eines BMP-9-Proteins codiert, wobei die Sequenz ist

(a) die DNA-Sequenz von Nucleotid 124 bis 453 von SEQ ID No. 8; oder

(b) die DNA-Sequenz von Nucleotid 145 bis 453 von SEQ ID No. 8; oder

(c) eine DNA-Sequenz, die sich von der DNA-Sequenz nach (a) oder (b) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet; oder

(d) eine allelische Variante der Sequenz nach (a) oder (b) ; oder

(e) eine DNA-Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit den Sequenzen nach (a) oder (b) hybridisiert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(i) Plattierung einer menschlichen genomischen Genbank und Herstellung von Nitrocellulose- Zweifachreplikas;

(ii) Hybridisierung eines Satzes der Nitrocellulose-Zweifachreplikas mit dem markierten Oligonucleotid

#1: CTATGAGTGTAAAGGGGGTTGCTTCTTCCCATTGGCTGAT

und des anderen Satzes mit dem markierten Oligonucleotid

#2: GTGCCAACCCTCAAGTACCACTATGAGGGGATGAGTGTGG;

und

(iii) Isolierung derjenigen Clone, die mit beiden Oligonucleotiden hybridisieren, und Bestimmung der Sequenz ihrer Insertionen.

19. Verfahren zur Herstellung eines Mittels nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Protein nach einem der Ansprüche 7 bis 12 als wesentlichen Bestandteil des Mittels verwendet.