DE69219610T2 - Dimere unsymmetrische Cyaninfarbstoffe - Google Patents

Dimere unsymmetrische Cyaninfarbstoffe

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    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
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    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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Description

    GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft neue Fluoreszenzfarbstoffe. Insbesondere betrifft die Verbindung Dimere von unsymmetrischen Cyaninfarbstoffen, die zur Nucleinsäureanfärbung verwendet werden.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Fluoreszenzfarbstoffe finden in vielfältiger Weise Anwendung und eignen sich bekanntlich insbesondere für biologische Anwendungen, bei denen eine hohe Fluoreszenznachweisbarkeit erwünscht ist. Einen Fluoreszenzfarbstoff kann man dazu verwenden, durch Anbindung an einen speziellen biologischen Bestandteil einer Probe die Anwesenheit oder die Menge des speziellen Bestandteils einer Probe anzuzeigen. Eine ganze Reihe von Fluoreszenzfarbstoffen sind zur spezifischen Fluoreszenzanfärbung und zur quantitativen Bestimmung von DNA und RNA sowie andere Nucleinsäuren betreffende Anwendungen erhältlich.
  • Unsymmetrische Cyaninfarbstoffe wurden schon lange bevor man etwas genaueres uber DNA wußte von Brooker et al., J. AM. CHEM. SOC. 64, 199 (1942), beschrieben. Inzwischen hat es sich herausgestellt, daß diese Farbstoffe bei der Fluoreszenzanfärbung von DNA und RNA brauchbar sind. Der unter dem Handelsnamen Thiazole Orange vertriebene Farbstoff besitzt spezielle Vorteile bei der quantitativen Analyse von unausgereiften Blutzellen oder Reticulozyten, siehe US- PS 4,883,867 von Lee et al. (1989); Lee et al, Thiazole Orange: A New Dye for Reticulocyte Analysis, CYTOMETRY 7, 508 (1986). Gemäß der Patentschrift von Lee et al. muß der zu diesem Zweck verwendete Farbstoff die Zellmembran durchdringen können.
  • Die Erfinder haben entdeckt, daß es sich bei einer Zusammensetzung, die zwei geeignet verbundene unsymmetrische Cyaninfarbstoffeinheiten, d.h. ein Cyaninfarbstoffdimer enthält, um eine polare Verbindung handelt, die Zellmembranen nur schwer durchdringen kann. Trotzdem eignet sich die von den Erfindern entdeckte Zusammensetzung sehr gut als Färbemittel für Nucleinsäuren, da sie auch gegenüber kleinen Fragmenten von Nudeinsäurepolymeren, die nicht in lebenden Zellen enthalten sind, z.B. in Zellextrakten, sowie gegenüber Nucleinsäuren in permeabilisierten Zellen empfindlich ist. Das Dimer ist im Hinblick auf Thiazole Orange oder verwandte Verbindungen, bei denen es sich um Monomere handelt, weder vorweggenommen noch offensichtlich.
  • Andere bekanntlich an Nudeinsäuren bindende Dimerverbindungen mit einer hohen Fluoreszenzverstärkung sind u.a. Varianten von Ethidiumhomodimer, Acridinhomodimeren, Acridin- Ethidiumheterodimeren und 7-Hydropyridocarbazolen, siehe z.B. Rye et al., NUCLEIC ACIDS RESEARCH 19(2), 327 (1990); Haugland, MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS Set 28 (1989). Zwar werden in der Veröffentlichung von Rye et al. Eigenschaften erwähnt, die die Affinität und den Bindungsmodus von Dimeren an DNA beeinflussen, jedoch werden die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen dort nicht beschrieben. Die hier beschriebenen neuen Dimerenverbindungen unterscheiden sich nicht nur in ihrer Struktur von anderen Dimerenverbindungen, sondern sind anderen Dimeren und Thiazole Orange auch in Bezug auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Nucleinsäuren überlegen.
    • BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN Figur 1. Syntheseweg eines beispielhaften Dimeren aus Zwischenprodukten
  • Die Synthese eines beispielhaften Dimeren erfolgt nach der in den Beispielen 1 oder 2 beschriebenen Vorgehensweise. Wo X für S steht, handelt es sich bei der Verbindung um ein Dimer eines Benzthiazolderivats. Wo X für O steht, handelt es sich bei der Verbindung um ein Dimer eines Benzoxazolderivats.
    • Figur 2. Absorptionsspektren von beispielhaften Verbindungen A. Absorptionsspektren eines beispielhaften Benzthiazolderivat-Dimers (Verbindung 1)
  • (4×10&supmin;&sup6; M) in 10 ZnM Tris, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, pH 7,4 unter Zugabe von Kalbsthymus-DNA (Sigma Chem. Co. D- 1501, Charge 118F-9525).
  • An DNA wurden zugegeben: 1) Null, 2) 11 µg/ml,
  • 3) 25 µg/ml und 4) 32 µg/ml.
  • Die DNA-Konzentrationen basieren auf A&sub2;&sub6;&sub0;=1,0 für 50 µg/ml DNA (Ausubel et al., SHORT PROTOCOLS IN MOLEC- UAAR BIOLOGY, S. 359, John Wiley and Sons].
  • B. Absorptionsspektren eines beispielhaften Benzoxazolderivat-Dimers (Verbindung 2) (4×10&supmin;&sup6; M) in 10 ZnM Tris, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, pH 7,4 unter Zugabe von Kalbsthymus-DNA (Sigma Chem. Co. D- 1501, wie in Figur 1).
  • An DNA wurden zugegeben: 1) Null, 2) 11µg/ml, 3) 25 µg/ml und 4) 32 µg/ml, wie in Figur 1.
    • Figur 3. Fluoreszenzspektren beispielhafter Verbindungen A. Fluoreszenzspektren eines beispielhaften Benzthiazolderivat-Dimers (Verbindung 1)
  • (1,0 µm) in 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 2,0 M NaCl, pH 7,4 zur Veranschaulichung des Einflußes des Zusatzes von DNA und RNA. Die Nucleinsäurekonzentrationen betrugen: DNA (Kalbsthymus-DNA, Sigma Chemical Co. Produkt D-1501) = 15,4 µg/ml und RNA (Kalbsleber-RNA, Sigma Chemical Co. Produkt R-7250) = 18,6 µg/ml. Die Nucleinsäurekonzentrationen wurden auf der Basis von A260 nm = 1,0 = 50 µg/ml Doppelstrang-DNA bzw. 40 µg/ml Einzelstrang-RNA berechnet. Die Fluoreszenzspektren wurden mit einem Spektrofluorometer SPF 500C der Firma SLM Instruments unter Erregung bei 450 nm aufgenommen. In Gegenwart von DNA oder RNA liegt das Fluoreszenzmaximum bei 533 nm (+/- 1 nm). In einem Puffer mit niedriger Salzkonzentration (50 mM NaCl) wurde eine im wesentlichen gleiche durch Nudeinsäure induzierte Fluoreszenzverstärkung festgestellt, jedoch mit dem Unterschied, daß die schwache langwellige Emission (Maximum 645 nm) des freien Farbstoffs fehlte (Daten nicht gezeigt).
  • B. Einfluß von DNA und RNA auf Fluoreszenzspektren eines beispielhaften Benzoxazolderivat-Dimeren (Verbindung 2). Alle Versuchsbedingungen entsprechen denen des in Figur 3A gezeigten Versuchs. In Gegenwart von DNA oder RNA betrgt das Fluoreszenzmaximum 509 nm (+/&supmin; 1 nm).
    • Figur 4. DNA-Titration.
  • DNA-Titrationen eines beispielhaften Benzthiazolderivat-Dimeren (Verbindung 1) ( ) und eines beispielhaften Benzoxazolderivat-Dimeren (Verbindung 2) ( ) in 10 ZnM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH 7,4. Es wird analog Beispiel 6 verfahren. Alle Datenpunkte sind Mittelwerte von Zweifachbestimmungen, von denen der Blindwert für die gleiche Farbstoffkonzentration in Abwesenheit von DNA subtrahiert worden ist. Die Nachweisgrenze für DNA bei diesen Messungen beträgt 0,01 µg/ml, was 2 ng DNA im Analysenvolumen von 200 µl entspricht.
    • KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG UND BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Bei den für die Erfindung verwendeten Farbstoffen handelt es sich um Dimere von unsymmetrischen Cyaninfarbstoffeinheiten. Die Farbstoffeinheiten sind über eine Brücke zwischen den Cyaninfarbstoffeinheiten verknüpft. Die beiden Farbstoffeinheiten, die gleich oder verschieden sein können, können symmetrisch oder asymmetrisch verbrückt sein. Die neuen Dimere haben allgemein die Formel:
  • R¹ und R², die gleich oder verschieden sein können, bedeuten Alkylgruppen mit 1-6 Kohlenstoffatomen. R¹ und R² weisen bevorzugt 1-3 Kohlenstoffatome auf.
  • X bedeutet O, S oder N-R³, worin R³ für H oder eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen steht. Z, das gleich X oder davon verschieden sein kann, bedeutet O, S oder N-R&sup4;, worin R&sup4; für H oder eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen steht. X und Z bedeuten bevorzugt O oder S. Bei einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Dimer von Benzoxazolanalogen, wobei sowohl X als auch Z Sauerstoff bedeuten. Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Dimer von Benzthiazolanalogen, wobei sowohl X und Z Schwefel bedeuten.
  • Die Indizes n und s, die die Länge jeder Farbstoffeinheit bestimmen, sind = 0, .1 oder 2. Die das Dimer bildenden Farbstoffeinheiten können die gleiche oder verschiedene Länge haben. Eine Veränderung der Länge der Farbstoffeinheiten durch Erhöhung von n und/oder s beeinflußt die Spektraleigenschaften der Farbstoffeinheiten und des Dimeren.
  • Y bedeutet HC=CH, dessen Position durch die Indizes p, m, q und r, die = 0 oder 1 sind, angegeben wird. Ist p = 1, so ist m = 0 und umgekehrt. Ist q = 1, so ist r = 0 und umgekehrt. Sind p und q = 1 und n und s gleich 0 und bedeuten X und Z Schwefel, so handelt es sich bei der Verbindung um ein dimeres Analogon von Thiazole Orange.
  • Bei der die beiden Farbstoffeinheiten, die gleich oder verschieden sein können, verbindenden BRÜCKE handelt es sich um eine aliphatische Kette mit einer Hauptkette mit 4-19 Kohlenstoffatomen. Die Kohlenstoffhauptkette kann an einer oder mehreren Stellen durch ein Nichtkohlenstoffhauptkettenatom ("Heteroatom") unterbrocher sein. Die Heteroatome, die gleich oder verschieden sein können, sind N, O oder S. Als Heteroatom ist Stickstoff bevorzugt. Das Stickstoff-Heteroatom kann mit einem oder mehreren Alkylsubstituenten mit 1-6 Kohlenstoffatomen, die gleich oder verschieden sein können, substituiert sein.
  • BRÜCKE hat die allgemeine Formel:
  • Die Indizes α, β, γ und δ, die gleich oder verschieden sein können, geben die Größe der Alkyleinheiten, die jeweils 2-4 Kohlenstoffatome enthalten, an. Die Indizes I und II, die gleich oder verschieden sein können, sind gleich 0 oder 1 und zeigen die Anwesenheit oder Abwesenheit dieser Einheit an.
  • A¹, A² und A³ können gleich oder verschieden sein. A¹ bedeutet eine zusätzliche Alkylgruppe (CH2)µ, worin µ = 0 oder 1 ist. Alternativ dazu bedeutet A¹ ein Heteroatom O oder S oder ein gegebenenfalls substituiertes Stickstoff-Heteroatom -(NR&sup5;)-, worin R&sup5; für H oder eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen steht, oder -(N&spplus;R&sup6;R&sup7;)-, worin R&sup6; und R&sup7;, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig voneinander für Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen stehen. Genauso bedeuten A² und A³, die gleich A¹ oder davon und voneinander verschieden sein können, unabhängig voneinander (CH2)µ, worin µ = 0 oder 1 ist; O; S; -(NR&sup5;)-, worin R&sup5; für H oder einer Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen steht, oder - (N+R&sup6;R&sup7;)-, worin R&sup6; und R&sup7;, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig voneinander für Wasserstoff oder einer Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen stehen. In einer bevorzugten Ausführungsform liegen A¹ und A³ als -(N&spplus;R&sup6;R&sup7;)- vor. Besonders bevorzugt bedeuten R&sup6; und R&sup7; Methylgruppen und II = 0, so daß A² abwesend ist.
  • Die Spektraleigenschaf ten der neuen Dimerverbindungen sind denen bekannter Cyaninfarbstoffe zwar ähnlich, unterscheiden sich aber doch davon. Die neuen Dimerfarbstoffe zeigen im ungebundenen Zustand ein starkes Absorptionssignal im Bereich von etwa 400 nm bis etwa 550 nm, liefern jedoch im ungebundenen Zustand keine nachweisbare Anregung bzw. ein nachweisbares Emissionssignal. Nach dem Binden mit DNA oder RNA ändern sich jedoch die optischen Eigenschaften der Dimere drastisch. Insbesondere verschiebt sich die Absorptionskurve zu einer längeren Wellenlänge, und der Farbstoff zeigt nun starke Fluoreszenz. Die mit Nucleinsäurepolymeren kombinierten Dimere von Benzthiazolderivaten weisen ein Anregungsmaximum bei etwa 510 nm und ein Emissionsmaximum bei etwa 530 nm auf, was eine Stokes-Verschiebung von etwa 20 nm ergibt. Die mit Nudeinsäurepolymeren kombinierten Dimere von Benzoxazolderivaten weisen ein Anregungsmaxlmum bei etwa 490 nm und ein Emissionsmaximum bei etwa 510 nm auf, was ebenfalls eine Stokes-Verschiebung von etwa 20 nm ergibt (Tabelle 1). Dazu ist zu bemerken daß der Argonionenlaser, eine Hochenergiequelle zur Fluoreszenzanregung, zwei Hauptemissionslinien bei 514 nm und 488 nm aufweist, die fast genau mit den Anregungsmaxima der neuen Dimere zusammenfallen. Tabelle 1: Absorptions- und Fluoreszenzmaxima des beispielhaften Benzthiazoldimeren (Verbindung 1) und Benzoxazoldimeren (Verbindung 2).
  • ¹10 mM Tris, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 714
  • ²Zwischen 15 und 35 mg/ml Kalbsthymus-DNA im gleichen Puffer.
  • ³λA-Wellenllnge des Absorptionsmaximums
  • &sup4;λp-Wellenlange des Fluoreszenzmaximums
  • &sup5;NF - für eine genaue Bestimmung nicht ausreichend fluoreszierend
  • Für Cyaninfarbstoffe ist wohl bekannt, daß die Verlängerung der Polymethinbrücke zwischen den heterocyclischen endständigen Gruppen zu einer Verschiebung des Absorptionsspektrums zu längeren Wellenlängen führt [Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES, S. 241 Academic Press (1976)].
  • Die Fluoreszenz der an DNA oder RNA gebundenen Dimere wird je nach der in der Probe vorhandenen Nucleinsäuremenge in der Regel etwa um den Faktor 1000, manchmal sogar um den Faktor 5000, verstärkt, siehe z.B. Figur 4. Durch diesen bedeutenden Anstieg der Fluoreszenzintensität stellt die von ungebundenem Farbstoff herrührende Hintergrundfluoreszenz kein Problem dar. Die Fluoreszenzintensität des Nucleinsäure- Dimer-Komplexes ist proportional zur Nucleinsäuremenge in der Probe (Beispiel 6, Figur 4).
  • Da die Dimerverbindungen die Zellmembran einer gesunden Zelle nur schwer durchqueren, kann man den Nachweis von Fluoreszenz in einer Probe ganzer Zellen zur Anzeige der Lebensfähigkeit von Zellen in der Probe verwenden. Zelltod oder Toxizität führt in der Regel zum Verlust der Integrität der Zellmembran. Somit zeigt die Fluoreszenz einzelner Zellen an, daß die Zellmembran derartiger Zellen nicht normal funktioniert, d.h. bei fluoreszierenden Zellen handelt es sich um nicht lebensfähige Zellen (Beispiel 7).
  • Die Erfindung schließt daher Fluoreszenzzusammensetzungen, enthaltend ein an einen erfindungsgemäßen Farbstoff gebundenes Nucleinsäurepolymer, ein. Bei dem Nucleinsäurepolymer kann es sich um DNA oder RNA handeln.
  • Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zum Nachweis von Nudeinsäuren, bei dem man eine Probe, von der angenommen wird, daß sie Nucleinsäurepolymere enthält, mit einem erfindungsgemäßen Farbstoff kombiniert und, nachdem man den Farbstoff mit jeglichen Nudeinsäurepolymeren kombinieren gelassen hat, durch die Kombination des Farbstoffs mit Nucleinsäurepolymeren entstehende Fluoreszenz nachweist. Die Nucleinsäuren können in Zellen enthalten sein, wobei man die Fluoreszenz zur Anzeige des Verlusts der Integrität der Zellmembran verwenden kann. Alternativ dazu kann die Probe Nucleinsäurepolymere in Lösung enthalten, wobei man die Fluoreszenzintensität zur Bestimmung der Menge der Nudeinsäurepolymere in der Probe verwenden kann.
  • Die Erfindung schließt ferner die Verwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung als Nucleinsäurefärbemittel oder zur Bildung eines Fluoreszenzfarbstoffkomplexes ein.
    • BEISPIEL 1: HERSTELLUNG EINES BEISPIELHAFTEN DIMEREN EINES BENZTHIAZOLDERIVATS (Verbindung 1)
  • Die folgende Verbindung wird hergestellt:
  • Eine Mischung aus 0,72 g eines 1'-(3'-Iodpropyl)-3- methyl-thia-4'-cyaniniodid-Vorläufers (nach bekannten Methoden hergestellt, z.B. Brooker et al., J. AM. CHEM. SOC. 64, 199 (1942)) und 69 mg N,N,N',N'-Tetramethyl propandiamin in 5 mL DMF wird eine Stunde auf 130ºC erhitzt. Nach dem Abkühlen der Reaktionsmischung auf Raumtemperatur und der Zugabe von 40 mL MeOH wird die Mischung über Nacht bei -20ºC gelagert. Der rote Feststoff wird abfutriert und aus DMF/MeOH umkristallisiert, was das reine Produkt Verbindung 1 ergibt.
    • BEISPIEL 2: HERSTELLUNG EINES BEISPIELHAFTEN DIMEREN EINES BENZOXAZOLDERIVATS (Verbindung 2)
  • Die folgende Verbindung wird hergestellt:
  • Die entsprechenden Benzoxazolderivatdimer-Vorläufer werden gemäß Brooker et al., J. AM. CHEM. SOC. 64, 199 (1942) hergestellt und analog Beispiel 1 dimerisiert.
    • BEISPIEL 3: HERSTELLUNG EINES BEISPIELHAFTEN DIMERS MIT ERHÖHTER ABSORPTIONSWELLENLÄNGE (Verbindung 3)
  • Es wurde ein Dimer der folgenden Verbindung hergestellt:
  • Der Monomervorläufer wird aus 2-(2-Acetanilidovinyl)-3- methylbenzothiazoliumtosylat gemäß Brooker et al., J. AM. CHEM. SOC. 64, 199 (1942) hergestellt und analog Beispiel 1 dimerisiert.
    • BEISPIEL 4: HERSTELLUNG EINES BEISPIELHAFTEN DIMERS, DAS NICHT AN DER 4-POSITION, SONDERN AN DER 2-POSITION DES CHINOLINS VERBUNDEN IST (Verbindung 4)
  • Die folgende Verbindung wird hergestellt:
  • Der Vorläufer 1'-(3'-Iodpropyl)-3-methylthio-2'-cyaniniodid wird nach dem Verfahren von Brooker et al., J. AM. CHEM. SOC. 64, 199 (1942) hergestellt und wie oben dimerisiert
    • BEISPIEL 5: HERSTELLUNG EINES BEISPIELHAFTEN DIMERS MIT EINER UNSUBSTITUIERTEN ALKYLBRÜCKENGRUPPE (Verbindung 5)
  • Die folgende Verbindung wird hergestellt:
  • Die Verbindung wird aus Bi-(1'-(4-methylchinolinium)- 1,3-propandibromid und 2 Äquivalenten 2-Methylthio-3- methylbenzothiazolium-p-toluolsulfonat nach dem Verfahren von Brooker et al., J. AM. CHEM. SOC. 64, 199 (1942) hergestellt. Durch 6 Stunden langes Kochen von 4,5 g Lepidin und 3 g 1,3-Dibrompropan in 4 ml DMF am Rückfluß wird das Dibrbmid erhalten. Die Lösung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und das Produkt durch Zugabe von 150 ml Ether ausgefällt.
    • BEISPIEL 6: DNA-TITRATIONEN BEISPIELHAFTER VERBINDUNGEN
  • Gemäß den oben beschriebenen Verfahrensweisen wird ein Benzthiazolderivat-Dimer oder ein Benzoxazolderivat-Dimer hergestellt. Die Farbstoffkonzentration im Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH 7,4) beträgt 1 µM. DNA (Kalbsthymus-DNA, Sigma Chemical Co. Produkt D-1501) wird aus einer 250 µg/ml enthaltenden Vorratslösung (basierend auf A260 nm = 1,0 = 50 µg/ml) verdünnt. Die Fluoreszenzmessungen werden auf einem Mikrotiterplattenlesegerät des Typs Millipore Cytofluor 2300 unter Anregung bei 485 um (Bandbreite 20 um) und Emissionsmessung bei 530 um (Bandbreite 25 um) durchgeführt. Die Fluoreszenzintensität wird gegen die DNA- Konzentration aufgetragen (Figur 4).
    • BEISPIEL 7: QUANTITATIVE FLUORIMETRISCHE BESTIMUUNG VON TOTEN ZELLEN Zellinie:
  • P3×63Ag8.653 (IgG, nichtsekretierendes Mausmyeion) von einer BALB/c-Maus. Vermehrungsmedium: Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium mit 10% Kalbsserum&sub1; 1% HEPES-Pufferlösung, 1% L-Glutamin und 0,5% Gentamicin.
    • Verfahrensweise:
  • Die Zellen werden 3 bis 4 Tage vermehren gelassen. Dann werden die Zellen zweimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und 10 Minuten bei 700 U/min zentrifugiert. Nach dem Resuspendieren in PBS zählt man die Zellen durch Trypanblauausschluß unter Verwendung einer Blutkörperchenzählkammer. Man bestimmt die Lebensfähigkeit und stellt die Zellenkonzentration auf 1,2×10&sup6; Zellen/ml ein. Dann teilt man die Zellen in zwei Populationen auf. Man tötet eine Population ab, beispielsweise durch 15 Minuten langes Erhitzen auf 60ºC. Nun stellt man die Zellenkonzentration auf 600,000 Zellen/ml ein. Dann teilt man eine bekannte Anzahl von Zellen auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen auf. Man füllt die Vertiefungen mit PBS auf ein Volumen von 200 µl auf. Dann gibt man 100 µl von 6 µM des dimeren Farbstoffs zu jeder Probenvertiefung, so daß die Endkonzentration des Farbstoff 2 µM beträgt. Dann liest man die Fluoreszenz als Funktion der Zellenzahl unter Verwendung einer geeigneten Kombination von Anregungs- und Emissionsfiltern auf einem Mikrotiterplattenfluoreszenzlesegerät (beispielsweise Millipore Cytofluor 2300) ab. Für die Verbindungen 1 und 2 eignet sich eine Anregung bei 485 um und eine Emissionsmessung bei 530 um. Die lineare Proportionalität des Fluoreszenzsignals zur Zahl toter Zellen kann zur quantitativen Bestimmung der Lebensfähigkeit der Zellen verwendet werden.

Claims (20)

1. Verbindung der Formel:
worin R¹ und R², die gleich oder verschieden sein können, Alkylgruppen mit 1-6 Kohlenstoffen bedeuten;
X O, S oder N-R³, worin R³ für H oder eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen steht&sub1; bedeutet;
Z O, S oder N-R&sup4;, worin R&sup4; für H oder eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffen steht, bedeutet;
n und s, die gleich oder verschieden sein können, gleich 0, 1 oder 2 sind;
Y HC=CH bedeutet und
p, m, q und r = 0 oder 1 sind, so daß p + m = 1 und q + r = 1 sind, und worin -BRÜCKE- die allgemeine Formel:
worin α, β, γ und δ, die gleich oder verschieden sein können, ganze Zahlen größer 1 und kleiner 5 bedeuten;
I und II, die gleich oder verschieden sein können, = 0 oder 1 sind und
A¹, A² und A³, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig voneinander O; S; (CH2)µ, worin µ = 0 oder 1 ist; -(NR&sup5;)-, worin R&sup5; für H oder eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen steht oder (N&spplus;R&sup6;R&sup7;), worin R&sup6; und R&sup7;, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig voneinander für Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen stehen, bedeuten, besitzt.
2. Verbindung nach Anspruch 1, worin A¹, A² und A³, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig voneinander (CH2)µ, -(NR&sup5;)- oder -(N&spplus;R&sup6;R&sup7;)- bedeuten.
3. Verbindung nach Anspruch 1, worin A¹ und A², die gleich oder verschieden sein können, unabhängig voneinander -(NR&sup5;)-, worin R&sup5; für H oder eine Alkylgruppe mit 1-2 Kohlenstoffatomen steht, oder - (N&spplus;R&sup6;R&sup7;)-, worin R&sup6; und R&sup7;, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig voneinander für Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1-2 Kohlenstoffatomen steht, bedeuten und II = 0 ist.
4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin X und Z, die gleich oder verschieden sein können, O oder S bedeuten.
5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin X und Z gleich sind, R¹ und R² gleich sind, n = s und m = r ist.
6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin n ungleich s ist.
7. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin m und r jeweils 1 sind.
8. Verbindung nach Anspruch 1, worin R¹ und R², die gleich oder verschieden sein können, Alkylgruppen mit 1-3 Kohlenstoffen bedeuten;
X und Z, die gleich oder verschieden sein können, O oder S bedeuten;
m und r = 1 sind;
und in der Formel der BRÜCKE
α, β, γ und δ, die gleich oder verschieden sein können, gleich 2 oder 3 sind;
A¹, A² und A³, die gleich oder verschieden sein können, (CH2)µ, worin µ = 0 ist; -(NR&sup5;)-, worin R&sup5; für H oder eine Alkylgruppe mit 1-2 Kohlenstoffatomen steht, oder -(N&spplus;R&sup6;R&sup7;)-, worin R&sup6; und R&sup7;, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig voneinander für Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1-2 Kohlenstoffatomen stehen, bedeuten.
9. Verbindung nach Anspruch 8, worin X und Z gleich sind, R1¹ und R² gleich sind und n = s und m = r ist.
10. Verbindung nach Anspruch 8, worin n ungleich s ist.
11. Fluoreszenzzusammensetzung, enthaltend ein Nucleinsäurepolymer, das an einen Farbstoff der allgemeinen Formel:
worin R¹ und R²&sub1; die gleich oder verschieden sein können, Alkylgruppen mit 1-6 Kohlenstoffatomen bedeuten;
X O, S oder N-R³, worin R³ für H oder eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen steht, bedeutet;
Z O, S oder N-R&sup4;, worin R&sup4; für H oder eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen steht, bedeutet;
n und s, die gleich oder verschieden sein können, gleich 0, 1 oder 2 sind; Y HC=CH bedeutet und
p, m, q und r = 0 oder 1 sind, so daß p + m = 1 und q + r = 1 sind, und worin -BRÜCKE- die allgemeine Formel:
worin α, β, γ und δ, die gleich oder verschieden sein können, ganze Zahlen größer 1 und kleiner 5 bedeuten;
I und II, die gleich oder verschieden sein können, gleich 0 oder 1 sind und
A¹, A² und A³, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig voneinander O; S; (CH2)µ, worin µ = 0 oder 1 ist; -(NR&sup5;)-, worin R&sup5; für H oder eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen steht oder -(N&spplus;R&sup6;R&sup7;)-, worin R&sup6; und R&sup7;, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig voneinander für Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen stehen, bedeuten, besitzt, gebunden ist.
12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, worin der Farbstoff gemäß einem der Ansprüche 2 bis 10 definiert ist.
13. Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, worin es sich bei dem Nudeinsäurepolymer um
(i) DNA oder
(ii) RNA
handelt.
14. Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren, bei dem man:
a) eine Probe, von der angenommen wird, daß sie Nucleinsäurepolymere enthält, mit einem Farbstoff der allgemeinen Formel:
worin R¹ und R², die gleich oder verschieden sein können, Alkylgruppen mit 1-6 Kohlenstoffatomen bedeuten;
X O, S oder N-R³, worin R³ für H oder eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen steht, bedeutet;
Z O, S oder N-R&sup4;, worin R&sup4; für H oder eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffen steht, bedeutet;
n und s, die gleich oder verschieden sein können, gleich 0, 1 oder 2 sind;
Y HC=CH bedeutet und
p, m, q und r = 0 oder 1 sind, so daß p + n = 1 und q + r = 1 sind, und worin -BRÜCKE- die allgemeine Formel:
worin α, β, γ und δ, die gleich oder verschieden sein können, ganze Zahlen größer 1 und kleiner 5 bedeuten;
I und II, die gleich oder verschieden sein können, gleich 0 oder 1 sind und A¹, A² und A³, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig voneinander O; S; (CH2)µ, worin µ = 0 oder 1 ist; -(NR&sup5;)-, worin R&sup5; für H oder eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen steht oder -(N&spplus;R&sup6;R&sup7;)-, worin R&sup6; und R&sup7;, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig voneinander für Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen stehen, bedeuten, besitzt, kombiniert;
b) nachdem man den Farbstoff mit jeglichen Nucleinsäurepolymeren kombinieren gelassen hat, durch die Kombination des Farbstoffs mit Nucleinsäurepolymeren entstehende Fluoreszenz nachweist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem man einen Farbstoff gemäß einem der Ansprüche 2 bis 10 einsetzt.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, bei dem die Nucleinsäuren in der Probe in Zellen enthalten sind.
17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem man die Fluoreszenz zur Anzeige des Verlusts der Zellmembranintegrität verwendet.
18. Verfahren nach Anspruch 14 oder Anspruch 15, bei dem die Probe Nudeinsäurepolymere in Lösung enthält.
19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem man die Fluoreszenzintensität zur Bestimmung der Menge der Nucldeinsäurepolymere in der Probe verwendet.
20. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10
(ij) als Nucleinsäureanfärbemittel oder
(ii) zur Bildung eines Fluoreszenzfarbstoffkomplexes.
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