DE3883397T2 - HUMAN INSULINAL LOCATION AND PREPARATIONS THEREOF. - Google Patents
HUMAN INSULINAL LOCATION AND PREPARATIONS THEREOF.Info
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Human-Insulinanaloge, die eine hohe spezifische biologische Aktivität zeigen, sowie Insulin-Zubereitungen, welche die Human-Insulinanaloge der Erfindung enthalten.The present invention relates to novel human insulin analogues which exhibit a high specific biological activity, as well as insulin preparations which contain the human insulin analogues of the invention.
Seit der Entdeckung von Insulin im Jahre 1922 sind viele verschiedene Arten von Insulin-Zubereitungen für die Behandlung von Diabetis mellitus verwendet worden. Am Anfang wurden ausschließlich Insulin-Lösungen verwendet, die eine schnell einsetzende und relativ schnell endende Insulinaktivität zeigten, aber später sind Insulin-Zubereitungen hergestellt worden, die ein breiteres Aktivitätsprofil zeigen, das dadurch bewirkt wurde, daß die Löslichkeit von Insulin mit Hilfe von Zusätzen, wie z.B. Zinksalz und/oder Protaminen, abgesenkt wurde. Aus Gründen der Verfügbarkeit ist das hierfür verwendete Insulin normalerweise aus Pancreas von Nutztieren gewonnen worden, am häufigsten von Ochsen, Schweinen und Schafen, vor kurzem sind jedoch auch Zubereitungen auf dem Markt aufgetaucht, die Human-Insulin biotechnologischer Herkunft enthalten.Since the discovery of insulin in 1922, many different types of insulin preparations have been used for the treatment of diabetes mellitus. Initially, only insulin solutions showing a rapid onset and relatively rapid termination of insulin activity were used, but later insulin preparations have been produced showing a broader activity profile, achieved by lowering the solubility of insulin with the help of additives such as zinc salt and/or protamines. For reasons of availability, the insulin used for this purpose has usually been obtained from pancreases of farm animals, most commonly oxen, pigs and sheep, but recently preparations containing human insulin of biotechnological origin have also appeared on the market.
Über die Jahre ist eine große Anzahl von künstlich hergestellten Analogen von Human-Insulin beschrieben worden, üblicherweise zum Zweck der Aufklärung des Einflusses der Struktur auf die Aktivität, siehe z.B. Märke et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 360, S. 1619-32 (1979). Untersuchungen der Wirksamkeit von Substitutionen der (B22-B26)-Sequenz des Insulins auf die Rezeptorbindung sind von besonderem Interesse gewesen, da besagte Sequenz als das Hauptbindungsfeld für den Insulinrezeptor angesehen wird und da natürlich auftretende Mutationen mit Substitutionen in besagtem Feld gefunden worden sind. Siehe z.B. S. Shoelson et al. PNAS 80, S. 7390-94 (1983) und M. Kobayashi et al.: Biomed. Res. 5 (3) s. 267-72 (1984). So werden hier sehr niedrige Aktivitäten für Analoge gefunden, in denen Phe(B24) oder Phe(B25) ersetzt sind, und daher wird gefolgert, daß das Vorhandensein dieser zwei Aminosäuren von entscheidender Bedeutung für die Rezeptorbindung ist.Over the years, a large number of synthetic analogues of human insulin have been described, usually for the purpose of elucidating the influence of structure on the activity, see eg Märke et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 360, pp. 1619-32 (1979). Investigations into the effectiveness of substitutions of the (B22-B26) sequence of insulin on receptor binding have been of particular interest since said sequence is considered to be the major binding field for the insulin receptor and since naturally occurring mutations with substitutions in said field have been found. See eg S. Shoelson et al. PNAS 80, pp. 7390-94 (1983) and M. Kobayashi et al.: Biomed. Res. 5 (3) pp. 267-72 (1984). Thus, very low activities are found for analogues in which Phe(B24) or Phe(B25) is replaced, and therefore it is concluded that the presence of these two amino acids is crucial for receptor binding.
Ersetzungen im Insulinmolekül können auch zum Zweck der Verbesserung des Aktivitätsprofils des Insulins bei der Behandlung von Diabetes eingeführt werden. So offenbart z.B. die dänische Patentanmeldung Nr. 5457/86, daß eine oder mehrere Ersetzungen von Glu im Insulinmolekül durch einen neutralen Aminosäurerest eine Verschiebung der Ausfällungszone des Insulins in der Art bewirken, daß eine langsame Freisetzung nach Injektion erhalten wird.Substitutions in the insulin molecule can also be introduced for the purpose of improving the activity profile of insulin in the treatment of diabetes. For example, Danish patent application No. 5457/86 discloses that one or more substitutions of Glu in the insulin molecule by a neutral amino acid residue cause a shift in the precipitation zone of insulin such that a slow release after injection is obtained.
Darüber hinaus offenbart die dänische Patentanmeldung Nr. 4116/86 Insulinanaloge, die nach Injektion besonders schnell absorbiert werden. Dieser Effekt ist eine Folge der Tatsache, daß mit Hilfe von hydrophilen Ersetzungen insbesondere in den B9- und in den B28-Positionen im Insulinmolekül eine Unterdrückung der Aggregationsfähigkeit des Insulins erhalten wird, so daß es im wesentlichen als Monomer vorliegt. Eine Ahzahl dieser Insulinanaloge zeigen jedoch eine verringerte biologische Aktivität.In addition, Danish patent application no. 4116/86 discloses insulin analogues that are absorbed particularly quickly after injection. This effect is a consequence of the fact that with the help of hydrophilic replacements, particularly in the B9 and B28 positions in the insulin molecule, a suppression of the aggregation ability of insulin is obtained, so that it exists essentially as a monomer. A number of these insulin analogues, however, show reduced biological activity.
Peptides 1980, Proceedings of the Sixteenth European Peptide Symposium Helsingor, Dänemark, 31. August - 6. September 1980, S. 372-377 beschreibt die Darstellung von [TyrB25, AlaB30]-Humaninsulin durch enzymatische Kopplung des entsprechenden geschützten Octapeptids an Des-octapeptid (B23-B30)-Insulin, gefolgt von der Abspaltung der Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure. Keine Daten für biologische Aktivität sind angegeben.Peptides 1980, Proceedings of the Sixteenth European Peptide Symposium Helsingor, Denmark, 31 August - 6 September 1980, pp. 372-377 describes the preparation of [TyrB25, AlaB30]-human insulin by enzymatic coupling of the corresponding protected octapeptide to des-octapeptide (B23-B30)-insulin, followed by deprotection with trifluoroacetic acid. No data for biological activity are provided.
Biol. Chem. Hoppe-Seyler 1987, 368(6), S. 709-716 beschreibt die Darstellung von Analogen von Des-(B26-B30)-Insulin-B25- Amid, in dem PheB25 durch TyrB25 oder HisB25 ersetzt ist, wodurch eine erhöhte Aktivität von 230 bzw. 370 % erhalten wird. Die Analoge sind gestutzt und an der B25-Position.Biol. Chem. Hoppe-Seyler 1987, 368(6), pp. 709-716 describes the preparation of analogues of des-(B26-B30)-insulin-B25-amide in which PheB25 is replaced by TyrB25 or HisB25, resulting in an increased activity of 230 or 370%, respectively. The analogues are truncated and at the B25 position.
Es ist nunmehr überraschenderweise festgestellt worden, daß bestimmte Human-Insulinanaloge, in denen Phe in Position B25 durch His oder Tyr ersetzt ist und fakultativ außerdem ein oder mehrere der Aminosäurereste in den Positionen A4, A8, A17, A21, B9, B10, B12, B13, B21, B26, B27, B28 und B30 durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt sind und in denen der Aminosäurerest in Position B30 außerdem vollständig fehlen oder am C-Terminus in der Form von Ester oder Amid blockiert sein kann, eine höhere biologische Aktivität zeigen als in dem Fall, wo Phe in Position B25 unverändert ist.It has now surprisingly been found that certain human insulin analogues in which Phe in position B25 is replaced by His or Tyr and optionally in addition one or more of the amino acid residues in positions A4, A8, A17, A21, B9, B10, B12, B13, B21, B26, B27, B28 and B30 are replaced by another amino acid residue and in which the amino acid residue in position B30 may also be completely absent or blocked at the C-terminus in the form of ester or amide, show a higher biological activity than in the case where Phe in position B25 is unchanged.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung Human-Insulinanaloge, in denen der Aminosäurerest in Position B25 His oder Tyr ist, der Aminosäurerest in einer oder mehreren der Positionen A4, A8, A17, A21, B9, B10, B12, B13, B21, B26, B27, B28 und B30 fakultativ durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist und der Aminosäurerest der B30-Position fakultativ fehlt oder am C-Terminus in der Form von Ester oder Amid blockiert ist, vorausgesetzt daß, wenn B25 Tyr ist, B30 dann von Ala verschieden ist.Accordingly, the present invention relates to human insulin analogues in which the amino acid residue at position B25 is His or Tyr, the amino acid residue at one or more of positions A4, A8, A17, A21, B9, B10, B12, B13, B21, B26, B27, B28 and B30 is optionally replaced by another amino acid residue, and the amino acid residue of the B30 position is optionally absent or blocked at the C-terminus in the form of ester or amide, provided that when B25 is Tyr, then B30 is different from Ala.
Beispiele von besonders bevorzugten Substitutionen in den oben angegebenen Positionen sind: A4:Gln, A8:His, A17:Gln, A21:Asp, B9:Asp, B10:Asp, B12:Ile, B13:Gln oder Arg, B21:Gln oder Ile, B26:Glu, B27:Arg, B28:Asp und B30:Ala oder Ser, vorausgesetzt daß, wenn B25 Tyr ist, B30 dann von Ala verschieden ist. Wenn gleichzeitig mehrere Substitutionen in den oben angegebenen Positionen gewünscht sind, ist es aus Verwendungsgründen bevorzugt, daß sie innerhalb der Gruppe: A4, A8, A17, B13, B21, B27 und B30 oder innerhalb der Gruppe: A8, A21, B9, B10, B12, B26, B28 und B30 vorliegen, vorausgesetzt daß, wenn B25 Tyr ist, B30 dann von Ala verschieden ist.Examples of particularly preferred substitutions in the positions indicated above are: A4:Gln, A8:His, A17:Gln, A21:Asp, B9:Asp, B10:Asp, B12:Ile, B13:Gln or Arg, B21:Gln or Ile, B26:Glu, B27:Arg, B28:Asp and B30:Ala or Ser, provided that when B25 is Tyr, then B30 is different from Ala. If several substitutions are desired simultaneously in the positions indicated above, it is preferred for reasons of use that they are within the group: A4, A8, A17, B13, B21, B27 and B30 or within the group: A8, A21, B9, B10, B12, B26, B28 and B30, provided that when B25 is Tyr, then B30 is different from Ala.
So sind die Human-Insulinanaloge der Erfindung vorteilhaft bei der Behandlung von Diabetes, da die erhöhte biologische Aktivität, die aus den Ersetzungen in der B25-Position resultieren, eine schnellere Absorption aus dem Blut bedeuten und überdies die Abnahme an biologischer Aktivität neutralisieren kann, die ansonsten das Ergebnis anderer Substitutionen im Hunan-Insulinmolekül sein kann.Thus, the human insulin analogues of the invention are advantageous in the treatment of diabetes because the increased biological activity resulting from the substitutions at the B25 position may result in more rapid absorption from the blood and may also neutralise the decrease in biological activity that may otherwise be the result of other substitutions in the Hunan insulin molecule.
Ein besondere Ausführungsform der Erfindung wird repräsentiert durch Human-Insulinanaloge, die [HisB25] oder [TyrB25] enthalten und wenigstens einen Ersatz-Aminosäurerest, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus [GlnA4], [HisA8], [GlnA17], [AspA21], [AspB9], [AspB10], [IleB12], [GlnB13], [ArgB13], [GlnB21], [ProB21], [GluB26], [ArgB27], [AspB28], [AlaB30] und [SerB30] besteht, vorausgesetzt daß, wenn B25 Tyr ist, B30 dann von Ala verschieden ist.A particular embodiment of the invention is represented by human insulin analogues containing [HisB25] or [TyrB25] and at least one replacement amino acid residue selected from the group consisting of [GlnA4], [HisA8], [GlnA17], [AspA21], [AspB9], [AspB10], [IleB12], [GlnB13], [ArgB13], [GlnB21], [ProB21], [GluB26], [ArgB27], [AspB28], [AlaB30] and [SerB30], provided that when B25 is Tyr, then B30 is different from Ala.
Eine andere besondere Ausführungsform der Erfindung wird repräsentiert durch Human-Insulinanaloge, die [HisB25] oder [TyrB25] enthalten und wenigstens zwei Ersatz-Aminosäurereste, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus [GlnA4], [HisA8], [GlnA17], [GlnB13], [ArgB13], [GlnB21], [IleB21], [ArgB27], [AlaB30] und [SerB30] besteht, vorausgesetzt daß, wenn B25 Tyr ist, B30 dann von Ala verschieden ist.Another particular embodiment of the invention is represented by human insulin analogs containing [HisB25] or [TyrB25] and at least two replacement amino acid residues selected from the group consisting of [GlnA4], [HisA8], [GlnA17], [GlnB13], [ArgB13], [GlnB21], [IleB21], [ArgB27], [AlaB30] and [SerB30], provided that when B25 is Tyr, then B30 is different from Ala.
Noch eine andere besondere Ausführungsform der Erfindung wird repräsentiert durch Human-Insulinanaolge, die [HisB25] oder [TyrB25] enthalten und wenigstens zwei Ersatz-Aminosäurereste, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus [HisA8], [AspA21], [AspB9], [AspB10], [IleB12], [GluB26], [AspB28], [AlaB30] und [SerB30] besteht, vorausgesetzt daß, wenn B25 Tyr ist, B30 dann von Ala verschieden ist.Yet another particular embodiment of the invention is represented by human insulin analogs containing [HisB25] or [TyrB25] and at least two replacement amino acid residues selected from the group consisting of [HisA8], [AspA21], [AspB9], [AspB10], [IleB12], [GluB26], [AspB28], [AlaB30] and [SerB30], provided that when B25 is Tyr, then B30 is different from Ala.
Bevorzugte Human-Insulinanaloge der Erfindung sindPreferred human insulin analogues of the invention are
[TyrB25]-Human-Insulin[TyrB25]-human insulin
[TyrB25, AspB28]-Human-Insulin[TyrB25, AspB28]-human insulin
[HisB25]-Human-Insulin[HisB25]-human insulin
[HisB25, AspB28]-des-[ThrB30]-Human-Insulin[HisB25, AspB28]-des-[ThrB30]-human insulin
[TyrB25]-Human-Insulin-B30-Amid[TyrB25]-Human-Insulin-B30-Amide
[HisB25]-Human-Insulin-B30-Amid[HisB25]-Human-Insulin-B30-Amide
Die beschriebenen Insulinderivate können biosynthetisch in Hefe produziert werden, die eine DNA-Sequenz exprimiert, die einen gegebenen Insulinvorläufer kodiert. Nach der Biosynthese kann dieser Vorläufer durch enzymatisch katalysierte Reaktion in das Insulinderivat überführt werden. Um Sekretion in das Nährmedium zu erreichen, kann die DNA-Sequenz, die den Insulinvorläufer kodiert, mit einer anderen DNA-Sequenz verschmolzen werden, die ein in Hefe funktionales Signalpeptid kodiert. Sekretion kann erreicht werden durch Insertion der Mfα1-Leader-Sequenz aus Saccharomyces cerevisiae in das Expressionsplasmid (Kurjan & Herskowitz, Cell 30, 933-943 (1982)). Eine bevorzugte Konstruktion verwendet die DNA-Sequenz, die die gesamte Mfα1-Leader-Sequenz kodiert, einschließlich der zweibasigen Stelle LysArg, aber ausschließlich der Peptidsequenz GluAlaGluAla, die das Substrat für die Hefeprotease DPAP (Dipeptidylaminopeptidase) ist. Auf diese Weise wird eine effiziente Sekretion von Insulinvorläufern mit dem korrekten N- Terminus erreicht.The insulin derivatives described can be produced biosynthetically in yeast expressing a DNA sequence encoding a given insulin precursor. After biosynthesis, this precursor can be converted into the insulin derivative by an enzymatically catalyzed reaction. To achieve secretion into the culture medium, the DNA sequence encoding the insulin precursor can be fused to another DNA sequence encoding a signal peptide functional in yeast. Secretion can be achieved by inserting the Mfα1 leader sequence from Saccharomyces cerevisiae into the expression plasmid (Kurjan & Herskowitz, Cell 30, 933-943 (1982)). A preferred construction uses the DNA sequence encoding the entire Mfα1 leader sequence, including the dibasic site LysArg, but excluding the peptide sequence GluAlaGluAla, which is the substrate for the yeast protease DPAP (dipeptidylaminopeptidase). In this way, efficient secretion of insulin precursors with the correct N-terminus is achieved.
DNA-Sequenzen, die modifizierte insulinvorläufer kodieren, wurden mit Basis in der Expressionskassette konstruiert, die im BamHI-Restriktionsfragment aus dem Expressionsplasmid pYGABA enthalten ist, wie in Figur 1 gezeigt, eine Länge von 1103 Basenpaaren hat und im wesentlichen das folgende enthält (aufgelistet in Aufeinanderfolge, beginnend vom 5'-Ende): Den GAPDH-Promotor (Travis et al., J. Biol. Chem., 260, 4384-4389 (1985)), gefolgt von der Kodierungsregion, bestehend aus: Den 83 N-terminalen Aminosäuren der Mfα1-Leader-Sequenz, kodiert von der Wildtyp-Hefe-DNA-Sequenz, wie beschrieben von Kurjan & Herskowitz (Literaturstelle oben angegeben), gefolgt von den zwei Codons AAA und AGA, die Lys und Arg kodieren, und wieder gefolgt von der Kodierungsregion für den Insulinvorläufer einzelkettiges Des-[TyrB30]-Human-Insulin (SCI), der ein synthetisch konstruiertes Gen ist, das bevorzugte Hefecodons verwendet. Nach zwei Stop-Codons, ist eine MFα1-Restriktionsstelle angeordnet und der Rest der Sequenz stellt die MFα1-Sequenz dar, die die Terminatorregion enthält. Die Sequenz wird unter Verwendung von vollständig standardmäßigen Techniken konstruiert.DNA sequences encoding modified insulin precursors were constructed based on the expression cassette contained in the BamHI restriction fragment from the expression plasmid pYGABA, as shown in Figure 1, having a length of 1103 base pairs and containing essentially the following (listed in sequence starting from the 5' end): The GAPDH promoter (Travis et al., J. Biol. Chem., 260, 4384-4389 (1985)), followed by the coding region consisting of: the 83 N-terminal amino acids of the Mfα1 leader sequence encoded by the wild-type yeast DNA sequence as described by Kurjan & Herskowitz (reference given above), followed by the two codons AAA and AGA encoding Lys and Arg, and again followed by the coding region for the insulin precursor single-chain des-[TyrB30]-human insulin (SCI), which is a synthetically constructed gene using preferred yeast codons. After two stop codons, an MFα1 restriction site is located and the remainder of the sequence represents the MFα1 sequence containing the terminator region. The sequence is constructed using completely standard techniques.
Das verwendete Verfahren war "positionsgerichtete Oligonukleotid-Mutagenese", die von Zoller & Smith, DNA, Bd. 3, Nr. 6, 479-488 (1984) beschrieben ist. Das Verfahren wird im folgenden kurz beschrieben und wird ausführlich in Beispiel 1 beschrieben. Isoliert aus dem Expressionsplasmid wird die Insulinvorläufersequenz in einen einzelsträngigen, zirkulären M13- Bakteriophagenvektor inseriert. An das einzelsträngige Genom wird ein chemisch synthetisierter, konplenentärer DNA-Strang aneliert. Der DNA-Strang enthält die gewünschte Sequenz, umgeben von vollständig zu Insulinsequenzen homologen Sequenzen auf der zirkulären DNA. In vitro wird der Primer dann in der gesamten Länge des zirkulären Genoms biochemisch unter Verwendung von Klenow-Polymerase extendiert. Dieser Strang führt zu einzelsträngigen Phagen, die, wenn sie in E. coli gezüchtet werden, die Möglichkeit geben, doppelsträngige DNA mit der gewünschten Sequenz zu isolieren. Aus dieser doppelsträngigen DNA kann ein Restriktionsfragment isoliert und in den Expressionsvektor re-inseriert werden.The method used was "site-directed oligonucleotide mutagenesis" described by Zoller & Smith, DNA, Vol. 3, No. 6, 479-488 (1984). The method is briefly described below and is described in detail in Example 1. Isolated from the expression plasmid, the insulin precursor sequence is inserted into a single-stranded, circular M13 bacteriophage vector. A chemically synthesized complementary DNA strand is annealed to the single-stranded genome. The DNA strand contains the desired sequence surrounded by sequences completely homologous to insulin sequences on the circular DNA. In vitro, the primer is then biochemically extended throughout the length of the circular genome using Klenow polymerase. This strand gives rise to single-stranded phages which, when grown in E. coli, provide the opportunity to isolate double-stranded DNA with the desired sequence. From this double-stranded DNA, a restriction fragment can be isolated and re-inserted into the expression vector.
Human-Insulinanaloge der Erfindung, in denen mögliche Substitutionen nur in den letzten Aminosäureresten vorliegen, die dem C-Terminus der B-Kette am nächsten sind, können außerdem in einer der se bekannten Art und Weise semisynthetisch aus z.B. Schweine-Insulin hergestellt werden, wie in K. Inouye et al.: JACS 101 (3), S. 751-52 (1979) beschrieben, wobei das Schweine-Insulin zunächst mit Trypsin zu Des-(B23-30)-Human- Insulin gespalten wird, woraufhin das letztere, ebenfalls enzymatisch, mit einem synthetischen Peptid mit der gewünschten Aminosäuresequenz gekoppelt wird.Human insulin analogues of the invention in which possible substitutions are present only in the last amino acid residues closest to the C-terminus of the B-chain may also in a manner known to the se, semi-synthetically from, for example, porcine insulin, as described in K. Inouye et al.: JACS 101 (3), pp. 751-52 (1979), whereby the porcine insulin is first cleaved with trypsin to des-(B23-30)-human insulin, whereupon the latter is coupled, also enzymatically, with a synthetic peptide with the desired amino acid sequence.
Die Erfindung betrifft auch Insulin-Zubereitungen, die neben den üblichen Adjuvantien, Füllstoffen und/oder Trägerstoffen wenigstens ein Human-Insulinanalog enthalten, in dem der Aminosäurerest in Position B25 His oder Tyr ist, der Aminosäurerest in einer oder mehreren der Positionen A4, A8, A17, A21, B9, B10, B12, B13, B21, B36, B27, B28 und B30 fakultativ substituiert ist und der Aminosäurerest in der B30-Position fakultativ fehlt oder am C-Terminus in der Form von Ester oder Amid blockiert ist. Die Insulin-Zubereitungen der Erfindung können gemäß herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Insulin-Zubereitungen hergestellt werden.The invention also relates to insulin preparations which, in addition to the usual adjuvants, fillers and/or carriers, contain at least one human insulin analogue in which the amino acid residue in position B25 is His or Tyr, the amino acid residue in one or more of positions A4, A8, A17, A21, B9, B10, B12, B13, B21, B36, B27, B28 and B30 is optionally substituted and the amino acid residue in the B30 position is optionally absent or blocked at the C-terminus in the form of ester or amide. The insulin preparations of the invention can be prepared according to conventional methods for preparing insulin preparations.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.The invention is further illustrated by the following examples.
Die Expressionskassette, die im Expressionsplasmid pYGABA (dargestellt in Figur 1) auf einem BamHI-Restriktionsfragment enthalten ist, wurde isoliert: Das Expressionsplasmid wurde mit der Restriktionsendonuklease BamHI inkubiert. Die Bedingungen waren: 20 ug Plasmid, 50 Einheiten BamHI, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; und 1 mM DTT in einem Volumen von 100 ul. Die Temperatur war 37ºC und die Reaktionszeit 2 Stunden. Zwei DNA-Fragmente wurden auf einem 1 % Agarosegel getrennt und das gewünschte Fragment wurde isoliert.The expression cassette contained in the expression plasmid pYGABA (shown in Figure 1) on a BamHI restriction fragment was isolated: The expression plasmid was incubated with the restriction endonuclease BamHI. The conditions were: 20 µg plasmid, 50 units BamHI, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2 and 1 mM DTT in a volume of 100 µl. The temperature was 37°C and the reaction time 2 hours. Two DNA fragments were separated on a 1% agarose gel and the desired fragment was isolated.
Das isolierte Restriktionsfragment wurde an den Bakteriophagenvektor M13mp18 der ebenfalls mit der Restriktionsendonuklease BamHI geschnitten worden war, in der folgenden Reaktionsmischung ligiert: Fragment 0,2 ug, Vektor 0,02 ug, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mM ATP in einem Volumen von 20 ul. 5 ul dieser Mischung wurden in den E. coli- Stamm JM101 transformiert. Das Vorhandensein des Fragments im Vektor und die Orientierung des Fragments wurde bestimmt durch Restriktionsenzymkartierung auf doppelsträngiger M13-DNA, die aus den Transformanten isoliert wurde.The isolated restriction fragment was ligated to the bacteriophage vector M13mp18, which had also been cut with the restriction endonuclease BamHI, in the following reaction mixture: fragment 0.2 µg, vector 0.02 µg, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT and 1 mM ATP in a volume of 20 µl. 5 µl of this mixture was transformed into E. coli strain JM101. The presence of the fragment in the vector and the orientation of the fragment was determined by restriction enzyme mapping on double-stranded M13 DNA isolated from the transformants.
Die obige Reaktionsmischung wurde in verschiedenen Verdünnungen in CaCl&sub2;-behandelte E. coli-JM101-Zellen unter Verwendung von Standardtechniken transformiert und in 2 x YT-Topagar auf 2 x YT-Agarplatten plattiert. (2 x YT = Trypton 16 g/Liter, Hefeextrakt 10 g/Liter, NaCl 5 g/Liter. 2 x YT-Topagar = 2 x YT mit 0,4 % zugegebener Agarose und autoklaviert. 2 x YT- Agarplatten = 2 x YT mit 2 % zugegebenem Agar und autoklaviert). Die Platten wurden bei 37ºC über Nacht inkubiert.The above reaction mixture was transformed at various dilutions into CaCl2-treated E. coli JM101 cells using standard techniques and plated in 2 x YT top agar on 2 x YT agar plates. (2 x YT = tryptone 16 g/liter, yeast extract 10 g/liter, NaCl 5 g/liter. 2 x YT top agar = 2 x YT with 0.4% agarose added and autoclaved. 2 x YT agar plates = 2 x YT with 2% agar added and autoclaved). Plates were incubated at 37ºC overnight.
Das verwendete Verfahren war Plaque-Lift-Hybridisierung, die im folgenden beschrieben ist: Ein Nitrozellulose-Filter wurde auf eine Platte mit einer geeigneten Plaque-Dichte gelegt, so daß der Filter benetzt wurde. Der Filter wurde dann in den folgenden Lösungen gebadet: 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH für 30 s, 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0 für 1 min, 2 x SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumzitrat) bis zur späteren Verwendung. Der Filter wurde auf 3 MM-Filterpapier getrocknet und für 2 Stunden bei 80ºC in einem Vakuumofen gebacken.The method used was plaque lift hybridization, which is described below: A nitrocellulose filter was placed on a plate with an appropriate plaque density so that the filter was wetted. The filter was then bathed in the following solutions: 1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH for 30 s, 1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl, pH 8.0 for 1 min, 2 x SSC (0.3 M NaCl, 0.03 M sodium citrate) until later use. The filter was dried on 3 MM filter paper and incubated for 2 hours. baked at 80ºC in a vacuum oven.
Der Mutagenisierungs-Primer mit der Sequenz 5'-TGGAGTGTAGTAGAAACCTCT-3' wurde in einem 30 ul-Volumen, das 70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 10 pmol Oligonukleotid, 20 pmol γ-³²-PATP und 3,5 Einheiten T4-Polynukleotid-Kinase enthielt, im 5'-Ende radioaktiv markiert. Die Mischung wurde bei 37ºC für 30 min und dann für 5 min bei 100ºC inkubiert.The mutagenization primer with the sequence 5'-TGGAGTGTAGTAGAAACCTCT-3' was radiolabeled at the 5' end in a 30 μl volume containing 70 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 10 pmol oligonucleotide, 20 pmol γ-32-PATP and 3.5 units T4 polynucleotide kinase. The mixture was incubated at 37°C for 30 min and then for 5 min at 100°C.
Der getrocknete Filter wurde für 2 Stunden bei 65ºC in 6 x SSC, 0,2 % Rinderserumalbumin, 0,2 % Ficoll, 0,2 % Polyvinylpyrrolidon, 0,2 % Natriumdodecylsulfat (SDS) und 50 ug/ml Lachssperma-DNA vorhybridisiert. Dann wurde die Reaktionsmischung, die die markierte Sonde enthielt, zu 15 ml frischen Vorhybridisierungsgemisches zugegeben und der Filter wurde hierin über Nacht bei 31ºC unter sanftem Rütteln gebadet. Nach Hybridisierung wurde der Filter dreimal für jeweils 15 min in 2 x SSC + 0,1 % SDS gewaschen und autoradiographiert. Nach Waschung in derselben Lösung, aber nunmehr bei 61ºC und einer weiteren Audiographie wurden Plaques identifiziert, die DNA- Sequenzen enthielten, die zum Mutagenisierungs-Primer komplementär waren.The dried filter was prehybridized for 2 hours at 65ºC in 6 x SSC, 0.2% bovine serum albumin, 0.2% Ficoll, 0.2% polyvinylpyrrolidone, 0.2% sodium dodecyl sulfate (SDS) and 50 µg/ml salmon sperm DNA. Then the reaction mixture containing the labeled probe was added to 15 ml of fresh prehybridization mixture and the filter was bathed therein overnight at 31ºC with gentle shaking. After hybridization, the filter was washed three times for 15 min each in 2 x SSC + 0.1% SDS and autoradiographed. After washing in the same solution but now at 61ºC and further audiography, plaques containing DNA sequences complementary to the mutagenization primer were identified.
Weil der identifizierte Klon ein Ergebnis einer Heteroduplex ist, wurde die Plaque erneut plattiert. Die Hybridisierung und Identifizierung wurden wiederholt.Because the identified clone is a result of a heteroduplex, the plaque was replated. Hybridization and identification were repeated.
Ein erneut gescreenter Klon wurde zur Infektion des E. coli- Stammes JM101 verwendet. Eine Kultur, die etwa 108 Phagen und 5 Kolonien von JM101 enthielt, wurde für 5 Stunden in einem 5 ml-2 x YT-Medium bei 37ºC gezüchtet. Dann wurde doppelsträngige, zirkuläre DNA gemäß dem Verfahren, das von Birnboim & Doly, Nucleic Acids Res., 2, 1513 (1979) beschrieben ist, aus dem Pellet gereinigt.A rescreened clone was used to infect E. coli strain JM101. A culture containing approximately 108 phages and 5 colonies of JM101 was grown for 5 hours in 5 ml 2 x YT medium at 37ºC. Then double-stranded circular DNA was extracted from the pellet is cleaned.
Aus dem oben beschriebenen Transformanten wurde ss-DNA gemäß dem Verfahren, das von Messing in Gene, 19, 269-276 (1982) beschrieben ist, isoliert.From the transformant described above, ss-DNA was isolated according to the procedure described by Messing in Gene, 19, 269-276 (1982).
Der Mutagenisierungs-Priiuer mit der Sequenz 5'-TGGAGTGTAGTAGAAACCTCT-3' wurde in einer 30 ul-Reaktionsmischung, die 70 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 1 mM ATP, 100 pmol Oligonukleotid und 3,6 Einheiten T4-Polynukleotid-Kinase enthielt, im 5'-Ende phosphoryliert. Die Reaktion wurde für 30 min bei 37ºC durchgeführt. Dann wurde das Enzym durch Inkubieren der Mischung für 10 min bei 65ºC inaktiviert.The mutagenization probe with the sequence 5'-TGGAGTGTAGTAGAAACCTCT-3' was 5'-end phosphorylated in a 30 µl reaction mixture containing 70 mM Tris-HCl, pH 7.0, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP, 100 pmol oligonucleotide and 3.6 units of T4 polynucleotide kinase. The reaction was carried out for 30 min at 37°C. Then the enzyme was inactivated by incubating the mixture for 10 min at 65°C.
Anelierung von Matrize und Primer wurde in einem 10 ul-Volumen durchgeführt, das 0,5 pmol Matrize, 4 pmol Primer, 20 mM Tris- HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl und 1 mM DTT enthielt, durch Erhitzen für 10 min bei 65ºC und anschließendes Abkühlen auf 0ºC.Annealing of template and primer was performed in a 10 μl volume containing 0.5 pmol template, 4 pmol primer, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, and 1 mM DTT by heating for 10 min at 65°C followed by cooling to 0°C.
Zur obigen Reaktionsmischung wurden 10 ul der folgenden Mischung zugegeben: 0,3 mM dATP, 0,3 mM dCTP, 0,3 mM dGTP, 0,3 mM TTP, 1 mM ATP, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 3 Einheiten T4-DNA-Ligase und 2,5 Einheiten Klenow-Polymerase. Dann wurde die Reaktion für 16 Stunden bei 16ºC durchgeführt.To the above reaction mixture was added 10 µl of the following mixture: 0.3 mM dATP, 0.3 mM dCTP, 0.3 mM dGTP, 0.3 mM TTP, 1 mM ATP, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 3 units of T4 DNA ligase and 2.5 units of Klenow polymerase. Then the reaction was carried out for 16 hours at 16°C.
Die DNA-Zubereitung (etwa 5 pg), die oben isoliert worden war, wurde mit 10 Einheiten der Restriktionsendonuklease BamHI in 60 ul 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 19 mM MgCl&sub2; und 1 mM DTT für 2 Stunden bei 37ºC verdaut. Die DNA-Produkte wurden auf einem Agarosegel getrennt und das Fragment wurde aus dem Gel gereinigt.The DNA preparation (approximately 5 pg) isolated above was digested with 10 units of the restriction endonuclease BamHI in 60 µl of 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 19 mM MgCl2 and 1 mM DTT for 2 hours at 37°C. The DNA products were separated on an agarose gel and the fragment was purified from the gel.
Das isolierte Restriktionsfragment wurde an den mit der Restriktionsendonuklease BamHI verdauten Hefevektor pAB24 in der folgenden Reaktionsmischung ligiert: Fragment 0,2 ug, Vektor 0,02 ug, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 1 mM ATP in einem Gesamtvolumen von 20 pl. 5 ul dieses Reaktionsgemisches wurden zur Transformation des E. coli-Stammes MC1061 verwendet, in dem das modifizierte Expressionsplasmid identifiziert und vermehrt wurde. Das Plasmid war identisch mit pYGABA, mit Ausnahme des ausgetauschten Codons.The isolated restriction fragment was ligated to the yeast vector pAB24 digested with the restriction endonuclease BamHI in the following reaction mixture: fragment 0.2 µg, vector 0.02 µg, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP in a total volume of 20 µl. 5 µl of this reaction mixture was used to transform the E. coli strain MC1061, in which the modified expression plasmid was identified and propagated. The plasmid was identical to pYGABA, except for the exchanged codon.
Transformation des Expressionsplasmids in den Hefestamm Saccharomyces cerevisiae JC482ΔpepΔLeu2cir&sup0; (α, his4, ura3, leu2, cir&sup0;) wurde durchgeführt, wie von Ito et al., J. Bact., Bd. 153, Nr. 1, 163-168 (1983) beschrieben. Die transformierten Zellen wurden auf SC-ura-Medium (0,7 % Hefe-Stickstoffbasis, 2,0 % Glucose, 0,5 % Casaminosäuren, 2,0 % Agar) zur Selektion von plasmidhaltigen Zellen plattiert.Transformation of the expression plasmid into the yeast strain Saccharomyces cerevisiae JC482ΔpepΔLeu2cir⁻ (α, his4, ura3, leu2, cir⁻) was carried out as described by Ito et al., J. Bact., Vol. 153, No. 1, 163-168 (1983). The transformed cells were plated on SC-ura medium (0.7% yeast nitrogen base, 2.0% glucose, 0.5% casamino acids, 2.0% agar) for selection of plasmid-containing cells.
Das verwendete Verfahren war im wesentlichen dasselbe, wie in Beispiel I beschrieben, mit der Ausnahme, daß der Mutagenisierungs-Primer die Sequenz 5'ACAATACCCTTGTCAGTGTAGTGGAAACCTCTTT3' besaß, daß die Hybridisierungstemperatur 42ºC war und daß die Waschtemperatur nach der Hybridisierung 63ºC war. Das modifizierte Plasmid hatte eine mit pYGABA identische Sequenz, mit Ausnahme der modifizierten Codons.The procedure used was essentially the same as described in Example I, except that the mutagenization primer had the sequence 5'ACAATACCCTTGTCAGTGTAGTGGAAACCTCTTT3' that the hybridization temperature was 42ºC and that the wash temperature after hybridization was 63ºC. The modified plasmid had a sequence identical to pYGABA, except for the modified codons.
Hefe, die wie in Beispiel I oder II beschrieben transformiert worden war, wurde auf Petri-Schalen, die Minimalmedium ohne Uracil enthielten, für 48 Stunden bei 30ºC vermehrt. 100 ml- Rüttelflaschen, die Minimalmedium ohne Uracil + 5 g/Liter Casaminosäure + 10 g/Liter Bernsteinsäure + 30 g/Liter Glucose bei pH 5,0 enthielten, wurden mit einer einzelnen Kolonie aus der Petri-Schale beimpft. Die Flaschen wurden dann bei 30ºC in einem Inkubator für 72 Stunden gerüttelt.Yeast transformed as described in Example I or II was grown on Petri dishes containing minimal medium without uracil for 48 hours at 30ºC. 100 ml shake flasks containing minimal medium without uracil + 5 g/liter casamino acid + 10 g/liter succinic acid + 30 g/liter glucose at pH 5.0 were inoculated with a single colony from the Petri dish. The flasks were then shaken in an incubator at 30ºC for 72 hours.
Nach Zentrifugation wurde 1 Liter gepoolter Überstand durch Filtration sterilisiert und auf pH 4-4,5 und eine Leitfähigkeit < 10 mS durch Zugabe von 5 M HCl und Wasser eingestellt. Mit einem Durchfluß von 120 ml/Stunde wurde der Überstand dann auf eine 1,6 x 6 cm-Säule aus S-Sepharose FF aufgebracht, die zuvor äquilibriert worden war mit 50 mM Essigsäure, 50 % (volumenbezogen) Ethanol, eingestellt auf pH 4,0 mit NaOH. Die Säule wurde mit 60 ml Puffer gewaschen und der Vorläufer wurde mit einem linearen Gradienten von NaCl von 0 bis 0,35 M in 360 ml Puffer mit einem Durchfluß von 10 ml/Stunde eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 4 ml aufgeteilt und auf UV-Extinktion untersucht. Fraktionen, die Vorläufer enthielten, wurden durch RP-HPLC-Analyse identifiziert und wurden gepoolt. Nach Entsalzung auf einer Säule aus Sephadex G25 in 1 M Essigsäure wurde der Vorläufer durch Lyophilisation isoliert.After centrifugation, 1 liter of pooled supernatant was sterilized by filtration and adjusted to pH 4-4.5 and conductivity < 10 mS by addition of 5 M HCl and water. At a flow rate of 120 ml/hour, the supernatant was then applied to a 1.6 x 6 cm column of S-Sepharose FF that had previously been equilibrated with 50 mM acetic acid, 50% (by volume) ethanol, adjusted to pH 4.0 with NaOH. The column was washed with 60 ml of buffer and the precursor was eluted with a linear gradient of NaCl from 0 to 0.35 M in 360 ml of buffer at a flow rate of 10 ml/hour. The eluate was divided into 4 ml fractions and analyzed for UV absorbance. Fractions containing precursors were identified by RP-HPLC analysis and were pooled. After desalting on a column of Sephadex G25 in 1 M acetic acid, the precursor was isolated by lyophilization.
450 mg [TyrB25]-SCI, hergestellt mit den in den Beispielen I und III beschriebenen Verfahren, wurden gelöst in 45 ml 50 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 20 % (volumenbezogen) Ethanol, eingestellt auf pH 7,7 mit HCl, und 45 ml (abgesetztes Volumen) Sepharose , enthaltend 36 mg immobilisiertes Trypsin im selben Puffer, wurden zugegeben. Die Suspension wurde für 3 Stunden bei 20ºC bei sanfter Bewegung gehalten und wurde dann filtriert. Das Gel wurde mit 40 ml Puffer gewaschen und die gepoolten Filtrate wurden auf eine 2,6 x 7,5 cm-Säule aus Q- Sepharose FF aufgebracht, die zuvor äquilibriert worden war mit 50 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 50 % (volumenbezogen) Ethanol, eingestellt auf pH 8,0 mit HCl. Die Säule wurde dann mit einem linearen Gradienten von NaCl von 0 bis 0,15 M im selben Puffer über 6 Stunden mit einem Durchfluß von 225 ml/Stunde eluiert. Das Eluat wurde auf UV-Extinktion untersucht und die Fraktionen, die den Hauptproteinpeak enthalten, wurden gepoolt.450 mg of [TyrB25]-SCI, prepared by the procedures described in Examples I and III, were dissolved in 45 ml of 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane, 20% (by volume) ethanol, adjusted to pH 7.7 with HCl, and 45 ml (settled volume) of Sepharose containing 36 mg of immobilized trypsin in the same buffer were added. The suspension was kept for 3 hours at 20°C with gentle agitation and was then filtered. The gel was washed with 40 ml of buffer and the pooled filtrates were applied to a 2.6 x 7.5 cm column of Q-Sepharose FF previously equilibrated with 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane, 50% (by volume) ethanol, adjusted to pH 8.0 with HCl. The column was then eluted with a linear gradient of NaCl from 0 to 0.15 M in the same buffer over 6 hours at a flow rate of 225 ml/hour. The eluate was examined for UV absorbance and the fractions containing the major protein peak were pooled.
Nach Verdünnung mit demselben Volumen Wasser wurde der Pool auf eine 2,6 x 25 cm-Säule aus Lichroprep RP-18 (25-40 um) aufgebracht, die zuvor äquilibriert worden war mit 10 mM H&sub3;PO&sub4;, 0,1 M NaCl, 30 % (volumenbezogen) Ethanol. Bei einem Durchfluß von 16 ml/Stunde wurde die Säule dann mit einem linearen Gradienten von Ethanol von 30 % bis 40 % (volumenbezogen) über 20 Stunden eluiert. Das Eluat wurde auf UV-Extinktion untersucht und Fraktionen, die den Hauptproteinpeak enthielten, wurden gepoolt. Nach Entsalzung auf einer Säule aus Sephadex G25 in 1 M Essigsäure wurden 105 mg [TyrB25]-des[ThrB30]-Human-Insulin durch Lyophilisation isoliert.After dilution with an equal volume of water, the pool was applied to a 2.6 x 25 cm column of Lichroprep RP-18 (25-40 µm) previously equilibrated with 10 mM H₃PO₄, 0.1 M NaCl, 30% (by volume) ethanol. At a flow rate of 16 ml/hour, the column was then eluted with a linear gradient of ethanol from 30% to 40% (by volume) over 20 hours. The eluate was analyzed for UV absorbance and fractions containing the major protein peak were pooled. After desalting on a column of Sephadex G25 in 1 M acetic acid, 105 mg of [TyrB25]-des[ThrB30]-human insulin was isolated by lyophilization.
Das Protein wurde in einer Mischung, die 200 mg Threoninmethylester, 1,0 ml Ethanol und 0,4 ml Wasser enthielt, erneut aufgelöst. Der pH-Wert wurde mit Essigsäure auf 6,3 eingestellt und 2 ml (abgesetztes Volumen) Sepharose , enthaltend 1,6 mg immobilisiertes Trypsin, wurden zugegeben. Nach Stehenlassen für 2 Stunden bei 20ºC bei sanfter Bewegung wurde das Gel durch Filtration entfernt und das Protein wurde durch Zugabe von 10 Volumenteilen 2-Propanol ausgefällt. Der luftgetrocknete Niederschlag wurde in 20 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan/HCl, 60 % (volumenbezogen) Ethanol pH 8,25, erneut gelöst und auf eine 1,6 x 20 cm Q-Sepharose FF-Säule aufgebracht, die zuvor mit dem besagten Puffer äquilibriert worden war, und mit einem linearen NaCl-Gradienten im selben Puffer, der von 0 bis 0,1 M anstieg, über 15 Stunden bei einem Durchfluß von 50 ml/Stunde eluiert. Das Ethanol wurde in vacuo aus den gepoolten Fraktionen entfernt, die [TyrB25]-Human-Insulin- (B30-Methylester) enthielten, und das Protein wurde durch Einstellen des pH-Wertes auf 6,1 ausgefällt. Nach Zentrifugation und Lyophilisation wurde der Methylester für 10 min in kaltem 0,1 M NaOH bei einer Proteinkonzentration von 10 mg/ml hydrolysiert. Die Reaktion wurde durch Einstellen des pH-Wertes auf 8,5 gestoppt und 2 volumenteile in 20 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan/HCl, pH 8,5, wurden zugegeben. Die Lösung wurde dann auf eine 1,6 x 20 cm Q-Sepahrose FF-Säule aufgebracht und wie oben beschrieben eluiert. Das Protein wurde bei einem pH-Wert von 5,5 nach Entfernung des Ethanols in vacuo ausgefällt. 40 mg [TyrB25]-Human-Insulin wurden nach Lyophilisation erhalten.The protein was redissolved in a mixture containing 200 mg of threonine methyl ester, 1.0 ml of ethanol and 0.4 ml of water. The pH was adjusted to 6.3 with acetic acid and 2 ml (settled volume) of Sepharose containing 1.6 mg of immobilized trypsin was added. After standing for 2 hours at 20ºC with gentle agitation, the gel was removed by filtration and the protein was precipitated by the addition of 10 volumes of 2-propanol. The air-dried precipitate was redissolved in 20 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane/HCl, 60% (by volume) ethanol pH 8.25, applied to a 1.6 x 20 cm Q-Sepharose FF column previously equilibrated with said buffer and eluted with a linear NaCl gradient in the same buffer increasing from 0 to 0.1 M over 15 hours at a flow rate of 50 ml/hour. Ethanol was removed in vacuo from the pooled fractions containing [TyrB25] human insulin (B30 methyl ester) and protein was precipitated by adjusting the pH to 6.1. After centrifugation and lyophilization, the methyl ester was hydrolyzed for 10 min in cold 0.1 M NaOH at a protein concentration of 10 mg/ml. The reaction was stopped by adjusting the pH to 8.5 and 2 volumes of 20 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane/HCl, pH 8.5, were added. The solution was then applied to a 1.6 x 20 cm Q-Sepahrose FF column and eluted as described above. Protein was precipitated in vacuo at pH 5.5 after removal of ethanol. 40 mg of [TyrB25]-human insulin was obtained after lyophilization.
Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse und durch sequentiellen Edman-Abbau der abgetrennten vinylpyridylierten A- und B-Ketten bestätigt.The identity of the product was confirmed by amino acid analysis and by sequential Edman degradation of the separated vinylpyridylated A and B chains.
100 mg [HisB25, AspB28]-SCI, hergestellt mit den in den Beispielen II und III beschriebenen Verfahren, wurden gelöst in 10 ml 50 mM Tris(hydroxymethyl)aminonethan, 20 % (volumenbezogen) Ethanol, eingestellt auf pH 7,7 mit HCl, und 10 ml (abgesetztes Volumen) Sepharose , enthaltend 8 mg immobilisiertes Trypsin, im selben Puffer wurden zugegeben. Die Suspension wurde für 3 Stunden bei 20ºC mit sanfter Bewegung gehalten und wurde dann filtriert. Das Gel wurde mit 10 ml Puffer gewaschen und die gepoolten Filtrate wurden auf eine 1,6 x 7,5 cm-Säule aus Q-Sepharose FF aufgebracht, die zuvor äquilibriert worden war mit 50 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 50 % (volumenbezogen) Ethanol, eingestellt auf pH 8,0 mit HCl. Die Säule wurde dann mit einem linearen Gradienten von NaCl von 0 bis 0,15 M im selben Puffer über 6 Stunden mit einem Durchfluß von 90 ml/Stunde eluiert. Das Eluat wurde auf UV-Extinktion untersucht und Fraktionen, die den Hauptproteinpeak enthielten, wurden gepoolt.100 mg of [HisB25, AspB28]-SCI, prepared according to the procedures described in Examples II and III, were dissolved in 10 ml of 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane, 20% (by volume) ethanol, adjusted to pH 7.7 with HCl, and 10 ml (settled Volume) Sepharose containing 8 mg of immobilized trypsin in the same buffer was added. The suspension was kept for 3 hours at 20ºC with gentle agitation and was then filtered. The gel was washed with 10 ml of buffer and the pooled filtrates were applied to a 1.6 x 7.5 cm column of Q-Sepharose FF previously equilibrated with 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane, 50% (volume) ethanol, adjusted to pH 8.0 with HCl. The column was then eluted with a linear gradient of NaCl from 0 to 0.15 M in the same buffer over 6 hours at a flow rate of 90 ml/hour. The eluate was examined for UV absorbance and fractions containing the major protein peak were pooled.
Nach Verdünnung mit demselben Volumen Wasser wurde der Pool auf eine 1,6 x 25 cm-Säule aus Lichroprep RP-18 (25-40 um) aufgebracht, die zuvor äquilibriert worden war mit 10 mM H&sub3;PO&sub4;, 0,1 M NaCl, 30 % (volumenbezogen) Ethanol. Mit einen Durchfluß von 6,5 ml/Stunde wurde die Säule dann mit einem linearen Gradienten von Ethanol von 30 % bis 40 % (volumenbezogen) über 20 Stunden eluiert. Das Eluat wurde auf UV-Extinktion untersucht und Fraktionen, die den Hauptproteinpeak enthielten, wurden gepoolt. Nach Entsalzung auf einer Säule aus Sepahdex G25 in 1 M Essigsäure wurden 39 mg [HisB25, AspB28]-des[ThrB30]-Human-Insulin durch Lyophilisation isoliert.After dilution with an equal volume of water, the pool was applied to a 1.6 x 25 cm column of Lichroprep RP-18 (25-40 µm) previously equilibrated with 10 mM H₃PO₄, 0.1 M NaCl, 30% (by volume) ethanol. At a flow rate of 6.5 mL/hour, the column was then eluted with a linear gradient of ethanol from 30% to 40% (by volume) over 20 hours. The eluate was analyzed for UV absorbance and fractions containing the major protein peak were pooled. After desalting on a column of Sepahdex G25 in 1 M acetic acid, 39 mg of [HisB25, AspB28]-des[ThrB30]-human insulin were isolated by lyophilization.
Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse und durch sequentiellen Edman-Abbau der getrennten vinylpyridylierten A- und B-Ketten bestätigt.The identity of the product was confirmed by amino acid analysis and by sequential Edman degradation of the separated vinylpyridylated A and B chains.
1 g Na-kristallisiertes Schweine-Insulin (Proteingewicht) wurde in 40 ml Wasser gelöst und eine Lösung von 50 mg Schweine- Trypsin in 10 ml frisch hergestellter 0,25 M Ammoniumhydrogencarbonatlösung, in der der pH mit Ammoniakwasser auf 9,0 eingestellt worden war, wurde zugegeben. Dann wurde die Lösung in einem Kühlschrank bei 4ºC aufbewahrt. Nach 48 Stunden zeigte eine HPLC-Analyse einen Reaktionsgrad von 65 %. Danach wurde die Lösung bei 4ºC auf einer 5 x 90 cm-Säule aus Sephadex G50 Superfine in 0,05 M Ammoniumhydrogencarbonat bei einem Durchfluß von 90 ml/Stunde gelfiltriert. Fraktionen, die den Hauptproteinpeak enthielten, wurden gepoolt und lyophilisiert.1 g Na-crystallized porcine insulin (protein weight) was dissolved in 40 ml water and a solution of 50 mg porcine trypsin in 10 ml freshly prepared 0.25 M ammonium hydrogen carbonate solution, in which the pH had been adjusted to 9.0 with ammonia water was added. The solution was then stored in a refrigerator at 4ºC. After 48 hours, HPLC analysis showed a reaction rate of 65%. The solution was then gel filtered at 4ºC on a 5 x 90 cm column of Sephadex G50 Superfine in 0.05 M ammonium hydrogen carbonate at a flow rate of 90 ml/hour. Fractions containing the major protein peak were pooled and lyophilized.
Ausbeute: 520 mg des-(B23-30)-Human-Insulin einer Reinheit von 97,5 %, gemessen durch HPLC-Analyse.Yield: 520 mg of des-(B23-30)-human insulin with a purity of 97.5%, measured by HPLC analysis.
Peptide wurden mit Hilfe einer Peptidsynthesemaschine von Applied Biosystems hergestellt, wodurch die Konstruktion auf einem PAM-Harz mit Hilfe geschützter svmmetrischer Aminosäureanhydride durchgeführt wurde. Die Kapazität war etwa 0,1 mmol Peptid. Schließlich wurde das Peptid durch Reaktion mit wasserfreiem Fluorwasserstoff bei 0ºC vom Harz abgespalten, wodurch die restlichen Schutzgruppen gleichzeitig entfernt wurden.Peptides were prepared using an Applied Biosystems peptide synthesis machine, which allowed the construction on a PAM resin using protected symmetric amino acid anhydrides. The capacity was approximately 0.1 mmol of peptide. Finally, the peptide was cleaved from the resin by reaction with anhydrous hydrogen fluoride at 0°C, which simultaneously removed the remaining protecting groups.
200 mg des-(B23-30)-Human-Insulin und 400 mg Gly-Phe-His-Tyr- Thr-Pro-Lys-Thr wurden in einer Mischung aus 2,40 ml Dimethylformamid und 1,20 ml Wasser gelöst, wobei der pH der Mischung mit Triethylamin auf 6,5 eingestellt wurde.200 mg des-(B23-30)-human insulin and 400 mg Gly-Phe-His-Tyr- Thr-Pro-Lys-Thr were dissolved in a mixture of 2.40 ml dimethylformamide and 1.20 ml water, the pH of the mixture being adjusted to 6.5 with triethylamine.
Dann wurde eine Lösung von 10 mg Schweine-Trypsin in 0,20 ml Wasser zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei 20ºC stehengelassen. Nach 4 Stunden zeigte eine HPLC-Analyse eine Reaktion von 60 % und die Reaktion wurde durch Ausfällung mit 25 ml 2-Propanol gestoppt. Der Niederschlag, der durch zentrifugation isoliert wurde, wurde in 10 ml 1 M Essigsäure erneut aufgelöst und bei 20ºC auf eine 2,6 x 20 cm-Säule auf Lichroprep RP-18 (25-40 um) aufgebracht, die in einem Puffer äquilibriert worden war, der aus 0,5 mM Chlorwasserstoff, 0,1 M Natriumchlorid in 30 % (volumenbezogen) Ethanol bestand. Dann wurde die Säule mit demselben Puffer bei einem Durchfluß von 20 ml/Stunde eluiert, wobei der Ethanolgehalt jedoch linear über 24 Stunden auf 50 % erhöht wurde. Die Fraktionen, die den Hauptproteinpeak enthielten, wurden gepoolt, woraufhin das Protein durch Verdünnung mit demselben Volumen und Einstellung des pH auf 5,5 mit Natriumhydroxidlösung ausgefällt wurde. Nach Stehenlassen bei 4ºC für 1 Stunde wurde die Suspension zentrifugiert und der Niederschlag wurde gefriergetrocknet. Hierdurch wurden 90 mg [HisB25]-Human-Insulin erhalten, identifiziert durch Gesamtaminosäureanalyse und durch sequentiellen Edman-Abbau der getrennten vinylpyridylierten A- und B-Ketten.Then a solution of 10 mg of porcine trypsin in 0.20 ml of water was added and the reaction mixture was left at 20ºC. After 4 hours, HPLC analysis showed a reaction of 60% and the reaction was stopped by precipitation with 25 ml of 2-propanol. The precipitate, isolated by centrifugation, was redissolved in 10 ml of 1 M acetic acid and applied at 20ºC to a 2.6 x 20 cm column of Lichroprep RP-18 (25-40 µm) equilibrated in a buffer consisting of 0.5 mM hydrogen chloride, 0.1 M sodium chloride in 30% (by volume) ethanol. The column was then eluted with the same buffer at a flow rate of 20 ml/hour, but increasing the ethanol content linearly to 50% over 24 hours. The fractions containing the major protein peak were pooled and the protein was precipitated by dilution with the same volume and adjustment of the pH to 5.5 with sodium hydroxide solution. After standing at 4ºC for 1 hour, the suspension was centrifuged and the precipitate was freeze-dried to yield 90 mg of [HisB25] human insulin, identified by total amino acid analysis and by sequential Edman degradation of the separated vinylpyridylated A and B chains.
150 mg des-(B23-30)-Human-Insulin und 350 mg Gly-Phe-Tyr-Tyr- Thr-Asp-Lys-Thr wurden in einer Mischung aus 2,0 ml Dimethylformamid und 1,0 ml Wasser aufgelöst, wobei der pH mit Triethylamin auf 6,5 eingestellt wurde. Nun wurde eine Lösung von 8 mg Schweine-Trypsin in 0,20 ml 1 mM Calciumacetatlösung zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei 15ºC stehengelassen. Nach 3 Stunden zeigte eine HPLC-Analyse eine Reaktion von 50 % und die Reaktion wurde durch Zugabe von 25 ml 2-Propanol gestoppt.150 mg of des-(B23-30) human insulin and 350 mg of Gly-Phe-Tyr-Tyr- Thr-Asp-Lys-Thr were dissolved in a mixture of 2.0 ml of dimethylformamide and 1.0 ml of water, with the pH adjusted to 6.5 with triethylamine. A solution of 8 mg of porcine trypsin in 0.20 ml of 1 mM calcium acetate solution was then added and the reaction mixture was left at 15ºC. After 3 hours, HPLC analysis showed a reaction of 50% and the reaction was stopped by adding 25 ml of 2-propanol.
Nach Zentrifugation wurde der Niederschlag in 10 ml 1 M Essigsäure erneut aufgelöst und bei 20ºC auf eine 2,6 x 20 cm-Säule aus Lichroprep RP-18 (25-40 Pm) aufgebracht, die in einem Puffer äquilibriert worden war, der aus 0,5 mM Chlorwasserstoff, 0,1 M Natriumchlorid in 30 % (volumenbezogen) Ethanol bestand. Dann wurde die Säule mit demselben Puffer bei einem Durchfluß von 20 ml/Stunde eluiert, wobei der Ethanolgehalt jedoch über 24 Stunden linear auf 50 % erhöht wurde. Die Fraktionen, die den Hauptproteinpeak enthielten, wurden gepoolt, woraufhin das Protein durch Verdünnung mit demselben Volumen Wasser und pH- Einstellung auf 5,0 mit Natriumhydroxidlösung ausgefällt wurde. Nach Stehenlassen über Nacht bei 4ºC wurde der Niederschlag durch zentrifugation isoliert und gefriergetrocknet.After centrifugation, the precipitate was redissolved in 10 ml of 1 M acetic acid and applied at 20ºC to a 2.6 x 20 cm column of Lichroprep RP-18 (25-40 μm) suspended in a buffer consisting of 0.5 mM hydrogen chloride, 0.1 M sodium chloride in 30% (by volume) ethanol. The column was then eluted with the same buffer at a flow rate of 20 ml/hour, but the ethanol content was increased linearly to 50% over 24 hours. The fractions containing the major protein peak were pooled and the protein was precipitated by dilution with the same volume of water and pH adjustment to 5.0 with sodium hydroxide solution. After standing overnight at 4ºC, the precipitate was isolated by centrifugation and freeze-dried.
Ausbeute: 60 mg [TyrB25, AspB28]-Human-Insulin, identifiziert durch Gesamtaminosäureanalyse und durch sequentiellen Edman- Abbau der getrennten vinylpyridylierten A- und B-Ketten.Yield: 60 mg [TyrB25, AspB28] human insulin, identified by total amino acid analysis and by sequential Edman degradation of the separated vinylpyridylated A and B chains.
Die biologische Aktivität in vitro wurde durch Messen der Bindungsaffinität an die Insulinrezeptoren isolierter Ratten-Adipozyten und Hepatozyten gemessen, im wesentlichen wie bei J. Gliemann, S. Gammeltoft: Diabetologia 10, 105-113 (1974) beschrieben.The biological activity in vitro was determined by measuring the binding affinity to the insulin receptors of isolated rat adipocytes and hepatocytes, essentially as described by J. Gliemann, S. Gammeltoft: Diabetologia 10, 105-113 (1974).
Die Insulinanaloge wurden mit semisynthetischem Human-Insulin verglichen, dessen Potenz auf 100 % festgesetzt wurde, und die Ergebnisse sind in der Tabelle unten dargestellt.The insulin analogues were compared with semi-synthetic human insulin, the potency of which was set at 100%, and the results are presented in the table below.
Adipozyten HepatozytenAdipocytes Hepatocytes
[TyrB25]-Human-Insulin 356 % 222 %[TyrB25]-human insulin 356% 222%
[TyrB25, AspB28]-Human-Insulin 201 % 138 %[TyrB25, AspB28]-human insulin 201% 138%
[HisB25]-Human-Insulin 150 % 142 %[HisB25]-human insulin 150% 142%
[HisB25, AspB28]-des[ThrB30]- Human-Insulin 130 % 135 %[HisB25, AspB28]-des[ThrB30]- Human insulin 130% 135%
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