DE2917891A1 - Verfahren zur herstellung von acyl-coa- synthetase lcf-18 - Google Patents
Verfahren zur herstellung von acyl-coa- synthetase lcf-18Info
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung
von Acy1-CoA-synthetase mit hoher Aktivität gegenüber
langkettigen C. g-C. «-Fettsäuren durch Züchten von Stämmen,
die zu verschiedenen Gattungen gehören, sowie auf deren Verwendung. Bekanntlich wird Acy1-CoA-synthetase mit starker
Aktivität gegenüber langkettigen C^-C-g-Fettsäuren im allgemeinen
aus Rattenleber erhalten/ es wurde nun jedoch gefunden, daß Acyl-CoA-synthetase aus Mikroorganismen erhalten
werden kann, und dieses Enzym wird als Acyl-CoA-synthetase
LCF-18 bezeichnet. Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen
Acyl-CoA-synthetase LCF-18, die eine hohe Aktivität gegenüber langkettigen C16-C1«-Fettsäuren aufweist, können nichtveresterte
Fettsäuren des Menschen genau bestimmt werden, und dies ist sehr nützlich für die Diagnose von Diabetes usw.
Die Erfindung betrifft also ein Verfahren zur Produktion von Acyl-CoA-synthetase aus Mikroorganismen und insbesondere
eine fermentative Erzeugung von Acyl-CoA-synthetase durch Mikroorganismen, wobei das Enzym eine hohe Aktivität gegenüber
Cg-C1 η-Fettsäuren, insbesondere langkettigen C1g~Ci«-Fettsäuren
aufweist.
Im allgemeinen ist Acyl-CoA-synthetase ein Enzym, das nichtveresterte
Fettsäure in Gegenwart von CoA, ATP und Mg-Ionen
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zu Acyl-CoA thioverestert und auch als Thiokinase bezeichnet
wird. Diese enzymatische Reaktion verläuft wie folgt:
Mg*
R-COOH + ATP ^ R-CO-AMP + PPi
R-COOH + ATP ^ R-CO-AMP + PPi
R-CO-AMP + CoASH > R-CO-SCoA + AMP
R-COOH + ATP + CoASH » R-CO-SCoA + PPi + AMP
In den letzten Jahren ist mit der Aufklärung der physiologischen Bedeutung nicht-veresterter Fettsäure in vivo eine
Zunahme und Abnahme der Menge nicht-veresterter Serumfettsäure zunehmend medizinisch als bedeutend angesehen worden.
Beispielsweise wurde gefunden/ daß eine extreme Zunahme nicht-veresterter Serum-Fettsäure im Falle von Diabetes zu
erkennen ist.
Als Folge hiervon ist eine Zunahme nicht-veresterter Serum-Fettsäure, durch ihre Bestimmung erfaßt, für die Diagnose
des Zustands einer solchen Krankheit wie Diabetes herangezogen worden, aber die nicht-veresterte Serum-Fettsäure
ist im allgemeinen durch chemisch-colorimetrische Methoden bestimmt worden. Die chemisch-colorimetrische Methode jedoch
erfordert eine große Menge Blut, komplizierte analytische Arbeitsweisen und eine längere Zeit für die Durchführung, was
diese Methode unerwünscht macht. Dann ist mit der jüngsten Entwicklung der Methode für klinische Laborverwendung die quantitative
Bestimmung nicht-veresterter Fettsäure nach der sogenann-
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ten enzymatischen Methode in jüngster Zeit der Anwendung
zugeführt worden.
Zur quantitativen Bestimmung nicht-veresterter Fettsäure
nach der enzymatischen Methode wird nicht-veresterte Fettsäure und Acy1-CoA-synthetase zu Acyl-CoA umgesetzt
und das durch diese Reaktion gebildete Produkt enzymatisch bestimmt, wodurch die Konzentration an nicht-veresterter
Fettsäure erhalten wird. Aber hinsichtlich nicht-veresterter Serum-Fettsäure ist, da langkettige C16-C1„-Fettsäuren
in großen Mengen in Serum enthalten sind, eine solche Acyl-CoA-synthetase,
die in der Lage ist, langkettige C1 g-C·]g~
Fettsäuren zu Acyl-CoA wirksam thiozuverestern, natürlich erforderlich, jedoch als für diesen Zweck geeignete Acyl-CoA-
synthetase war nur eine solche aus Lebermikrosomen von Ratten bekannt.
Da sich diese Acyl-CoA-synthetase aus Tieren ableitet,
ist sie jedoch sehr teuer, daher ist es aus wirtschaftlichen
Gründen wünschenswert, die aus Mikroorganismen stammende Acyl-CoA-synthetase zu erhalten, die eine billige Quelle
darstellen.
Bislang sind als zur Produktion von Acyl-CoA-synthetase
befähigte Mikroorganismen die folgenden bekannt: Escherichia coli (European Journal of Biochemistry, Bd. 12, 576-582 (1970));
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Bacillus megaterium, Stamm M (Biochemistry, Bd. 4, 85-95 (1965)); Torulopsis Yg (Journal of Bacteriology, Bd. 104,
1397-1398 (1970)); Pseudomonas 22 (Journal of Bacteriology, Bd. 105, 1216-1218 (1971)) und Nocardia asteroides (Journal
of Bacteriology, Bd. 114, 249-256 (1973)).
Da aber alle dieser bekannten Stämme als Substratspezifität eine solche Acyl-CoA-synthetase produzieren, die
optimale Aktivität gegenüber Fettsäuren mit 14 und weniger Kohlenstoffatomen in der Kohlenstoffkette aufweist, kann ein
aus diesen Stämmen stammendes Enzym nicht im klinischen Laboratorium für langkettige C. g-C. «-Fettsäuren verwendet
werden.
Im Hinblick auf die Acyl-CoA-synthetase, die auf langkettige C. g-Cj „-Fettsäuren ebenso stark einwirkt wie eine solche
aus Rattenlebermikrosomen, würde, wenn ein solcher Stamm, der die Acyl-CoA-synthetase in großen Mengen produziert,
unter enzymproduzierenden Mikroorganismen gefunden werden könnte, eine große gewerbliche Bedeutung aufweisen, und unter
diesem Gesichtspunkt wurden die vorliegenden Untersuchungen durchgeführt, und dabei wurde gefunden, daß ein solcher Stamm,
der diese enzymatische Aktivität besitzt, unter einer Vielzahl von Mikroorganismen existiert.
Die Figuren veranschaulichen die Erfindung weiter; von diesen zeigt:
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Fig. 1 ein Schema zur teilweisen Reinigung des erfindungsgemäßen Enzyms durch Behandeln mit Sephadex G-200,
Fig. 2 ein Schema zur Substratspezifität des erfindungsgemäßen
Enzyms gegenüber Fettsäuren mit verschiedenen Kohlenstoff-Kettenlängen,
Fig. 3 und Fig. 4 Diagramme zum optimalen pH-Wert und zur
optimalen Temperatur des erfindungsgemäßen Enzyms.
Bei Fig. 3 wurde im Falle der pH-Werte von 6,0 bis 8,0 und von 7,5 bis 9,0 Kaliumphosphat-Puffer bzw. Tris-HCl-Puffer
verwendet.
Im Rahmen der Erfindung wurden zahlreiche Stämme untersucht, die in der Lage sind, Natriumpalmitat als Kohlenstoffquelle
zu assimilieren, und dann wurde jeder Stamm gezüchtet, den man im Natriumpalmitat-Medium wachsen lassen kann, einem
Medium (pH 7,0) mit 1 % Natriumpalmitat, 0,2 % Pepton, 0,1 % K2HPO4, 0,1 % KH2PO4, 0,05 % MgSO4^H3O, 0,03 % Hefeextrakt
und 0 bis 1,0 % Triton X-100, und solche gezüchteten Zellen
wurden in 0,02 m Kaliumphosphat-Puffer (pH 8) mit 10 mMol
2-Mercaptoäthanol suspendiert, die Zellen durch einen Ultraschalloszillator
aufgebrochen, um Acyl-CoA-synthetase zu extrahieren, so daß sich eine enzymatische Aktivität von
Palmitoyl-CoA-synthetase ergab. Tabelle I zeigt eine Reihe
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der diese enzymatische Aktivität stark aufweisenden Stämme.
Im übrigen war die Aktivität von Stearyl-CoA-synthetase
und die vonPalmitoyl-CoA-synthetase dieser Stämme nahezu
gleich.
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| Stamm | IFO | 13545 | IFO | IFO | 3919 | Aktivität der Palmitoyl-CoA- synthetase (μΜοΙ/mg/h) |
| Escherichia intermedia | IFO | 3318 | IFO | IFO | 3903 | 0,044 |
| Aerobacter aerogenes | IFO | 3849 | IFO | IFO | 12048 | 0,029 |
| Proteus mirabilis | IFO | 13245 | " schuylkilliensis | IFO | IFO 1205 | 0,026 |
| Salmonella typhimurium | IFO | 3060 | " marginalis | IFO | 3925 | 0r030 |
| Staphylococcus nureus | Corynebacterium paurometabolum IFO 12 | " cruciviae | IFO | 12047 | 0,034 | |
| Pseudomonas aeruginosa | " synxantha | IFO | 390 6 | 160 0,020 | ||
| " fluorescens | " teatrolens | IFO | 12691" | 0,149 | ||
| " dacunhae | Aeromonas hydrophila | IFO | 3820 | 0,048 | ||
| 11 liquefaciens | IFO | 12978 | 0,040 | |||
| Streptomyces rimosus | 3441 | 5 0,055 | ||||
| Aspergillus sojae | 4279 | 0,022 | ||||
| " terreus | 7078 | 0,037 | ||||
| Penicillium javanicum | 4639 | 0,077 | ||||
| 0,022 | ||||||
| 0,057 | ||||||
| 0,042 | ||||||
| 0,036 | ||||||
| ,0,033 | ||||||
| 0,025 | ||||||
| 0,047 |
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Tabelle I (Fortsetzung)
| Stamm | IFO | 5942 | Aktivität der Palmitoyl-CoA- fuMnT/mg/h) |
| Fusarium oxysporum | IFO | 6604 | 0F058 |
| Gibberella fujikuroi | IFO | 0566 | 0,080 |
| Candida guilliermondix | IFO | 0717 | 0,025 |
| " lipolytica | IFO | 1070 | 0,123 |
| " tropicalis | 0,029 | ||
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Ferner wurde im Rahmen der Erfindung unter den Stämmen von Basidiomyceten eine Auswahl zu Stämmen getroffen, die
Glucose und/oder NatriumpaImitat als Kohlenstoffquelle zu
assimilieren vermögen, und dann wurde jeder Stamm gezüchtet, in dem obigen Medium bzw. in den folgenden Medien wachsen
gelassen:
Das eine war ein Medium (pH 4,5) (Glucosemedium: nachfolgend als G-Medium bezeichnet) mit 0,5 % Hefeextrakt,
2,0 % Glucose und Leitungswasser;
das andere war ein Medium (pH 4,5) (Glucose-Natriumpalmitat-Medium,
nachfolgend als G+P-Medium bezeichnet) bestehend aus einem solchen, hergestellt durch Zusatz von
0,5 % Natriumpalmitat zum G-Medium, und die so gezüchteten Zellen wurden jeweils in 0,02 m
Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol
kultiviert, mit einem Ultraschall-Oszillator aufgebrochen, um Acyl-CoA-synthetase zu extrahieren, und so, daß,
wie bei der so erhaltenen Acyl-CoA-synthetase, jeweils die
Aktivität der Palmitoyl-CoA-synthetase geprüft wurde.
Tabelle II zeigt mehrere dieser Stämme, die diese enzymatische Aktivität stark aufweisen.
Die Aktivität der Stearyl-CoA-synthetase dieser Acyl-CoA-synthetase
und der der Palmitoyl-CoA-synthetase war nahezu gleich.
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| Stamm | Aktivität von | Palmitoyl- |
| CoA-synthetase | (μΜοΙ/mg/g) | |
| (G) | (G+P) | |
| Gloeophyllum sepiarium IFO 4944 | 0,290 | - |
| Trametes gibbosa IFO 4946 | <T0,200 | CO,200 |
| Gloeophyllum sepiarium IFO 6267 | 0,318 | 0,358 |
| Gloeophyllum trabeum IFO 6429 | 0,182 | 0,362 |
| Gloeophyllum trabeum IFO 6430 | 0,397 I | -0,200 |
| Gloeophyllum ungulatum IFO 6431 | 0,262 | 0,482 |
| Daedalea dickinsii IFO 6488 | ^0,200 4 | .0,200 |
| Laetiporus sulphureus IFO 6497 | -CO, 200 ^ | 0,200 |
| Gloeophyllum striatum IFO 6506 | £0,200 ^ | 0,200 |
| Gloeophyllum ungulatum IFO 6507 | 0,200 | |
| Gloeophyllum trabeum IFO 6509 | 0,236 | - |
| Flammulina velutipes IFO 8329 | <0,200 Z. | 0,200 |
| Lentinus edodes IFO 8340 | 4.0,200 < | 0,200 |
| Lenzites belutina IFO 8715 | /__ 0,200 <C | 0,200 |
| Pycnoporus coccineus IFO 9768 | C 0,200 | 0,224 |
| Tyromyces palustris IFO 30339 | ^-0,200 <i | 0,200 |
| Coriolus versicolor IFO 30338 | ^•0,200 ^- | 0,200 |
| Trametes sanguinea IFO 6489 | 0,333 | 0,421 |
| Trametes sanguinea IFO 6490 | 0,250 | 0,421 |
| Trametes sanguinea IFO 6491 | 0,246 <ί | 0,200 |
| Schizophyllum commune IFO 4928 | £ 0,200 -£ | 0,200 |
| Schizophyllum commune IFO 4929 | £ 0,200 <£ | 0,200 |
| Schizophyllum commune IFO 6502 | L 0,200 | 0,220 |
| Schizophyllum commune IFO 6503 | L 0,200 <- | 0,200 |
| Schizophyllum commune IFO 6504 | <- 0,200 -^ | 0,200 |
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J nachqereichtJ
Wie die in den Tabellen I und II wiedergegebenen Ergebnisse
erkennen lassen/ sind die Mikroorganismen/ die zur Produktion von Palmitoyl-CoA-synthetase in der Lage sind, die
Stämme, die zu den folgenden Gattungen gehören: Escherichia, Aerobacter, Proteus, Salmonella,
Staphylococcus, Corynebacterium, Pseudomonas, Aeromonas, Streptomyces, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Gibberella,
Candida, Gloeophyllum, Trametes, Daedalea, Laetiporus, Flammulina, Lentinus, Lenzites, Pycnoporus, Tyronyces,
Coriolus und Schizophyllum.
Weiter können solche Mikroorganismen konkret beispielsweise
durch die folgenden Arten angegeben werden: Pseudomonas aeruginosa IFO 3919, Pseudomonas synxantha IFO
3906, Pseudomonas schuylkilliensis IFO 12055, Candida lipolytica IFO 0717, Gibberella fujikuroi IFO 6604, Fusarium
oxysporum IFO 5942, Aeromonas
hydrophila IFO 3820, Gloeophyllum sepiarium IFO 6267,
Gloeophyllum trabeum IFO 6430, Gloeophyllum ungulatum IFO 6431, Pycnoporus coccineus IFO 9768, Trametes sanguinea
IFO 6489 und Glceophyllum trabeum IFO 6509.
Alle diese Stämme sind beim IFO (Institute for Fermentation,
Osaka) hinterlegt, der Öffentlichkeit zugänglich und frei erhältlich.
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Als verwendbares Medium kommen sowohl natürliche als auch synthetische Medien mit Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff
und anorganische Salze in Frage, und Quellen für andere Nährstoffe können außerdem breite Anwendung finden.
Als Quellen für Kohlenstoff können folgende verwendet werden: C4-C.g-Fettsäuren, z.B. Oleinsäure, Palmitinsäure, Linolsäure
usw. und deren Salze, z.B. das Natrium-, Kaliumsalz usw., sowie Glucose, Fructose, Galactose, Glycerin, Citrat, Sorbit
oder jede andere gewöhnlich verwendete Verbindung.
Als Quellen für Stickstoff können folgende verwendet werden: anorganische Stickstoffverbindungen, wie Natriumnitrat,
Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid usw. oder organische Stickstoffverbindungen,
wie Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Hefeextrakt usw. Als anorganische Salze können
KH2PO4, MgSO4 usw. verwendet werden, außerdem wird Triton X-100
als grenzflächenaktives Mittel verwendet.
Eine bevorzugte Zusammensetzung des Mediums zur Durchführung der Erfindung ist beispielsweise wie folgt:
1,0 % Natriumpalmitat, 0,3 % Pepton, 0,1 % K2HPO4, 0,03 %
Hefeextrakt und 0,05 % MgSO4.7H2O. Vorteilhafte Kulturbedingungen
für das Züchten des Stammes sind 22 - 37°C für 2 bis 7 Tage unter aeroben Bedingungen.
Die so erhaltene Fermentationsbrühe wird bei vermindertem Druck zentrifugiert oder filtriert, um Zellen zu erhalten,
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diese werden durch einen Ultraschalloszillator (6 min bei 15°C und darunter) aufgebrochen und der Zentrifugalabschexdung
unterworfen, um überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Dann wird aus der überstehenden Flüssigkeit Acy1-CoA-synthetase
nach folgender Arbeitsweise gereinigt. Zuerst wird die überstehende Flüssigkeit, nämlich die rohe Enzymlösung, mit
Ammoniumsulfat (30 bis 45 % Sättigung) fraktioniert, dann wird auf eine Sephadex G-200-Säule aufgebracht und die aktiven
Fraktionen werden bei 30 bis 50 % Sättigung mit Ammoniumsulfat fraktioniert, mit DEAE-Cellulose und Sephadex G-200
behandelt, so daß Acyl-CoA-synthetase erhalten wird. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der so erhaltenen
Acyl-CoA-synthetase sind wie folgt:
1. Substratspezifität:
Dieses Enzym wirkt auf Fettsäuren mit Cg-C. g-Kohlenstoffkette,
insbesondere auf Fettsäuren mit langer C1g-C18-Kette
unter jeweiliger Bildung der Acyl-CoA-synthetase je nach der verwendeten Fettsäure.
2. Optimaler pH-Wert:
Der optimale pH-Wert des erfindungsgemäßen Enzyms liegt nahe
7 bis 8.
3. Optimale Temperatur:
Die optimale Temperatur des erfindungsgemäßen Enzyms liegt bei 35 bis 450C.
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'
j nachgereicht]
4. Stabilität:
Das erfxndungsgemäße Enzym ist in der Lösung (pH 7,4) eines 0,02 m Tris-HCl-Puffers mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol
bei 50C und darunter 7 Tage stabil, weiterhin
1 Monat darüber in Gegenwart von Glycerin bei einer Endkonzentration von 50 % stabil.
5. Einfluß eines Inhibitors usw.
Hohe Konzentration wasserlöslicher, langkettiger Fettsäure, wie Laurinsäure, Oleinsäure, Palmitoleinsäure usw.,
hemmt die Reaktion extrem stark. Diese Hemmwirkung wird aber im Falle der gleichzeitigen Anwesenheit von Serumalbumin
stark reduziert.
Die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms wurde nach der
Methode von Kornberg-Pricer (Journal of Biological Chemistry, Bd. 204, 329-343 (1953)) unter Verwendung langkettiger Fettsäuren,
wie Palmitat (C16) oder Stearat (C18) als Substrat
bestimmt.
Eine Aktivität (spezifische Aktivität) wird durch die Menge an Hydroxamat (μΜοΙ) repräsentiert, die durch 1 mg Enzymprotein
pro h gebildet wird.
Acyl-CoA-synthetase, erfindungsgemäß erhalten, besitzt
die Eigenschaft,auf langkettige C^-C1 g-Fettsäuren genauso
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wie die aus Rattenleberinikrosomen stammende Acyl-CöA-synthetase
einzuwirken. Dies ist das erste Mal, daß eine solche Acyl-CoA-synthetase aus Mikroorganismen jemals aufgefunden
worden ist, daher wird die erfindungsgemäße Acyl-CoA-synthetase als Acyl-CoA-synthetase LCF-18 bezeichnet.
Acyl-CoA-synthetase LCF-18 wird aus Mikroorganismen erhalten,
daher kann sie in großem, industriellem Maßstab produziert werden, und da sie eine starke Aktivität gegenüber
langkettigen C. g-C. «-Fettsäuren besitzt, ist sie äußerst
brauchbar zur Bestimmung von nicht-veresterter Fettsäure im Humanserum.
Die quantitative Bestimmungsmethode für nicht-veresterte Serum-Fettsäure unter Verwendung von Acyl-CoA-synthetase
LCF-18 ist wie folgt:
Umsetzen von Acyl-CoA-synthetase LCF-18 mit nicht-veresterter Serum-Fettsäure in Gegenwart von ATP und CoA, Umsetzen
von Myokinase mit so gebildetem AMP in Gegenwart von ATP, Umsetzen von Pyruvatkinase mit so gebildetem ADP in Gegenwart
von Pho sphoeno lpyr uva t und dann Umsetzen von La"ctatdehydrogenase
mit so gebildetem Pyruvat in Gegenwart von NADH und damit Umwandlung von NADH in NAD, dann wird die Konzentration
der erhaltenen reduzierten NADH bei 340 nm gemessen. Diese Reaktion kann durch die folgenden Gleichungen (1) bis (4)
veranschaulicht werden:
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NEFA + CoA + ATP
Acyl-CoA-synthetase LCF-18
Acyl-CoA-synthetase LCF-18
-> Acyl-CoA+AMP+PPi ... (1)
Myokinase
k2ADP (2)
2 ADP + 2 Phosphoenolpyruvat
Pyruvatkinase
Pyruvatkinase
2 ATP + 2 Pyruvat .... (3)
2 Pyruvat + 2 NADH
se
2 Lactat + 2 NAD ... (4)
Lactat-dehydrogenase
Nach der erfindungsgemäßen Methode kann nicht-veresterte
Serum-Fettsäure quantitativ genau bestimmt werden, und die Diagnose von Diabetes usw. ist leicht durchzuführen.
Die Erfindung wird nun im folgenden Beispiel beschrieben:
500 ml-Sakaguchi-Kolben mit jeweils 200 ml eines Hauptmediums
werden vorbereitet. Das Hauptmedium (10 1, pH 6,4) setzt sich aus 0,5 % Succinat, 0,3 % Pepton, 0,1 % K2HPO4,
0,03 % Hefeextrakt und 0,05 % MgSO4.7H2O zusammen und wird
vor der Verwendung 20 min bei 1200C sterilisiert. Jeder Kolben
wird mit 2 ml einer Impfkulturflüssigkeit von Pseudomonas
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aeruginosa IFO 3919 inokuliert, die zuvor durch Einimpfen des
Stammes in ein Impfmedium (pH 6,4) aus 1 % Glucose, 1,5 %
Pepton, 0,3 % K2HPO4 und 0,02 % MgSO4^H3O und anschließendes
Inkubieren erhalten worden ist. Der Kolben wird 24 h bei 280C aerob inkubiert, danach wird die so erhaltene Kulturbrühe
zentrifugiert, um 45 g nasser Zellen zu erhalten. Diese
nassen Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol versetzt, durch Ultraschall
aufgebrochen und dann zentrifugiert (mit 25000 g), und so werden 96 ml einer überstehenden Flüssigkeit erhalten.
Diese überstehende Flüssigkeit zeigt eine spezifische Aktivität der Acyl-CoA-synthetase von 0,230 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
500 ml-Sakaguchi-Kolben mit jeweils 200 ml eines Hauptmediums
werden vorbereitet. Das Hauptmedium (10 1, pH 6,4) setzt sich aus 1,0 % Natriumpalmitat, 0,3 % Pepton, 0,1 %
K2HPO4, 0,03 % Hefeextrakt und 0,05 % MgSO4.7H2O zusammen und
wird vor Gebrauch 20 min bei 1200C sterilisiert. Jeder Kolben
wird mit 2 ml einer Impfkulturflüssigkeit von Candida lipolytica IFO 0717 beimpft, die zuvor durch Einimpfen des Stammes in
ein Impfmedium (pH 6,4) aus 1 % Glucose, 1,5 % Pepton, 0,3 % K2HPO4 und 0,02 % MgSO4.7H2O und anschließendes Inkubieren
erhalten worden ist. Der Kolben wird 24 h bei 28°C aerob inkubiert, darauf wird die so erhaltene Kulturbrühe zentrifugiert
und liefert 48 g nasser Zellen. Diese nassen Zellen werden mit
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100 ml eines 0,02 m Kaliumphosphat-Puffers (pH 8,0) mit
10 mMol 2-Mercaptoäthanol, 1 % Triton X 100, 1 mMol MgCl2
und 1 mMol ÄDTA versetzt, durch Ultraschall aufgebrochen (6 min bei 15°C und darunter), dann der Zentrifugalabscheidung
(bei 12000 g) unterworfen, um 98 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern. Die so erhaltene überstehende Flüssigkeit
hat die spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,12 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
500 ml Sakaguchi-Kolben mit jeweils 200 ml eines Hauptmediums werden vorbereitet. Das Hauptmedium (10 1, pH 7,0)
setzt sich aus 0,5 % Glucose, 0,5 % Natriumpalmitat, 0,3 % Pepton, 0,1 % K2HPO4, 0,03 % Hefeextrakt und 0,05 % MgSO4.
7H2O zusammen und wird vor Gebrauch 20 min bei 1200C sterilisiert.
Jeder Kolben wird mit 2 ml einer Impfkulturflüssigkeit
von Gibberella fujikuroi IFO 6604 beimpft, die zuvor durch Einimpfen des Stammes in ein Impfmedium (pH 7,0) aus
1 % Glucose, 1,5 % Pepton, 0,3 % K3HPO4 und 0,02 % MgSO4.
7H2O und anschließendes Inkubieren erhalten worden ist. Der
Kolben wird 24 h bei 30° C aerob inkubiert, darauf wird die so erhaltene Kulturbrühe zentrifugiert und liefert 45 g nasser
Zellen. Die so erhaltenen nassen Zellen werden mit 100 ml eines 0,02 m Kaliumphosphat-Puffers (pH 8,0) mit 10 mMol
2-Mercaptoäthanol versetzt, durch Ultraschall aufgebrochen (6 min bei 15°C und darunter) und dann (bei 25000 g) zentri-
909848/0581
fugiert, um 95 ml überstehende Flüssigkeit zu ergeben. Die so
erhaltene überstehende Flüssigkeit zeigt eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,142 μΜοΙ/mg/h
als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
Ähnlich wie in Beispiel 1 wird Pseudomonas synxantha
IFO 3906 kultiviert, um 40 g nasser Zellen zu erhalten. Die so erhaltenen nassen Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer
(pH 8,0) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol
versetzt, durch Ultraschall aufgebrochen (6 min bei 150C
und darunter), gefolgt von der Zentrifugalabscheidung (bei 25000 g), um 90 ml überstehende Flüssigkeit zu ergeben. Die
so erhaltene überstehende Flüssigkeit zeigt eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,180 μΜοΙ/mg/h als
Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
Ähnlich wie in Beispiel 2 wird Fusarium oxysporum IFO 5942 gezüchtet, um 40 g nasser Zellen zu erhalten. Die so
erhaltenen nassen Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer
(pH 8,0) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol, 1 % Triton X 100, 1 mMol MgCl2 und 1 mMol ÄDTA versetzt, durch
Ultraschall (6 min bei 15°C und darunter) aufgebrochen und dann (bei 12000 g) zentrifugiert, um 95 ml überstehende
Flüssigkeit zu liefern. Die so erhaltene überstehende Flüssig-
909848/0581
[ NAOHGE RBCKT
- 22 -
keit hat eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,15 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
Ähnlich wie in Beispiel 1 wird Aeromonas hydrophila IFO 3820 kultiviert, um 42 g nasser Zellen zu erhalten. So
erhaltene nasse Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol versetzt, durch
Ultraschall (6 min bei 150C und darunter) aufgebrochen, dann
(bei 25000 g) der Zentrifugalabscheidung unterworfen, um 98 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern. Die so erhaltene
überstehende Flüssigkeit hat eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,057 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
909848/0581
Ähnlich wie in Beispiel 1 wird Pseudomonas schuylkilliensis
IFO 12055 gezüchtet, um 40 g nasser Zellen zu erhalten. So erhaltene nasse Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer
(pH 8,0) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol versetzt, durch
Ultraschall (6 min bei 15°C und darunter) aufgebrochen, dann (bei 25000 g) der Zentrifugalabscheidung unterworfen, um
95 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern. So erhaltene überstehende
Flüssigkeit hat die spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,055 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
500 ml-Sakaguchi-Kolben mit jeweils 200 ml eines Hauptmediums
werden vorbereitet. Das Hauptmedium (10 1, pH 4,5) setzt sich aus 2,0 % Glucose, 0,5 % Natriumpalmitat, 0,3 %
Pepton, 0,1 % K3HPO4, 0,5 % Hefeextrakt und 0,05 % MgSO4.
7H-O zusammen und wird vor Gebrauch 20 min bei 1200C sterilisiert.
Jeder Kolben wird mit 2 ml einer Impfkulturflüssigkeit von Gloeophyllum sepiarium IFO 6267 beimpft, die zuvor
durch Einimpfen des Stammes in ein Impfmedium (pH 4,5) mit
1 % Glucose, 1,5 % Pepton, 0,3 % K2HPO4 und 0,02 % MgSO4.7H2O
und anschließendes Inkubieren erhalten worden ist. Der Kolben wird 5 Tage bei 28°C aerob inkubiert, dann wird die so erhaltene
Kulturbrühe bei vermindertem Druck fitriert, um 45 g nasser Zellen zu liefern. So erhaltene nasse Zellen werden mit
100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol
9 0 98 48/0581
Ζ5Π7891
CHT [
2-Mercaptoäthanol versetzt, durch Ultraschall (6 min bei
15°C und darunter) aufgebrochen und dann (bei 25000 g) zentrifugiert, um 96 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern.
So erhaltene überstehende Flüssigkeit hat eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,358 μΜοΙ/mg/h
als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
500 ml-Sakaguchi-Kolben mit jeweils 200 ml eines Hauptmediums
werden vorbereitet. Das Hauptmedium (10 1, pH 4,5) setzt sich aus 2,0 % Glucose, 0,3 % Pepton, 0,1 % K2HPO4,
0,5 % Hefeextrakt und 0,05 % MgSO..7H2O zusammen und wird
vor Gebrauch 20 min bei 1200C sterilisiert. Jeder Kolben
wird mit 2 ml einer Impfkulturflüssigkeit von Gloeophyllum trabeum IFO 64 30 beimpft, die zuvor durch Einimpfen des
Stammes in ein Impfmedium (pH 4,5) aus 1 % Glucose, 1,5 % Pepton, 0,3 % K3HPO4 und 0,02 % MgSO4.7H2O mit anschließender
Inkubation erhalten worden war. Der Kolben wird 5 Tage bei 280C aerob inkubiert, darauf wird die so erhaltene Kulturbrühe
bei vermindertem Druck filtriert> um 48 g nasser Zellen zu liefern. So erhaltene nasse Zellen werden mit 100 ml
0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol,
1 % Triton X-100, 1 mMol MgCl2 und 1 mMol ÄDTA
versetzt, durch Ultraschall (6 min bei 15° C oder darunter) aufgebrochen und dann (bei 12000 g) zentrifugiert, um 98 ml
überstehende Flüssigkeit zu ergeben. Die so erhaltene über-
909848/0581 0RI6INAL INSPECTED
IS
stehende Flüssigkeit zeigt spezifische Acyl-CoA-synthetase-Aktivität
von 0,397 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
Ähnlich wie in Beispiel 8 wird Gloeophyllum ungulatum IFO 6431 kultiviert, um 40 g nasser Zellen zu erhalten. So
erhaltene nasse Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol versetzt,
durch Ultraschall (6 min bei 15°C und darunter) aufgebrochen
und dann (bei 25000 g) der Zentrifugalabscheidung unterworfen, um 90 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern.
Die so erhaltene Flüssigkeit zeigt spezifische Acyl-CoA-synthetase-Aktivität
von 0,482 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
Ähnlich wie in Beispiel 9 wird Gloeophyllum trabeum IFO 6509 kultiviert, um 40 g nasser Zellen zu erhalten. So
erhaltene nasse Zellen werden mit 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol, 1 % Triton
X-100, 1 mMol MgCl2 und 1 mMol ÄDTA versetzt, durch Ultraschall
(6 min bei 15°C und darunter) aufgebrochen und dann (bei 12000 g) zentrifugiert, um 95 ml überstehender Flüssigkeit
zu liefern. So erhaltene überstehende Flüssigkeit hat eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von
0,236 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
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[NAOHQEREtOHTl
Ähnlich wie in Beispiel 8 wird Pycnoporus coccineus IFO 9768 kultiviert, um 42 g nasser Zellen zu erhalten. So
erhaltene nasse Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer
(pH 6,5) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol
versetzt, durch Ultraschall (6 min bei 150C oder darunter)
aufgebrochen, darauf der Zentrifugalabscheidung (bei 25000 g) unterworfen, um 98 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern.
So erhaltene überstehende Flüssigkeit zeigt eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,224 μΜοΙ/mg/h
als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
Ähnlich wie in Beispiel 3 wird Trametes sanguinea IFO
6489 kultiviert, um 40 g nasser Zellen zu erhalten. So erhaltene nasse Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer
(pH 6,5) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol versetzt, durch Ultraschall (6 min bei 15°C und darunter) aufgebrochen,
darauf der Zentrifugalabscheidung (bei 25000 g) unterworfen, um 95 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern.
So erhaltene überstehende Flüssigkeit zeigt eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,421 μΜοΙ/mg/h
als Palmitoyl-CoA-synthetase.
500 ml Acyl-CoA-synthetase-enthaltender Flüssigkeit
(Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität 0,230 μΜοΙ/mg/h),
9 Ü 9 8 A 8 / 0 5 8 1
nach Beispiel 1 erhalten, wurden mit Ammoniumsulfat (25 bis 45 % Sättigung) fraktioniert, darauf gegen 0,02 m Kaliumphosphatpuffer
dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde auf eine DEAE-Cellulose-Säule (11 χ 25 cm) aufgebracht, die
mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war. Nach dem Waschen der Säule mit 0,02 m Kaliumphosphatpuffer,
pH 8,0, mit 0,075 m KCl (6 1) wurde das Enzym mit 0,02 m Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, mit 0,3 m KCl eluiert.
Aktive Fraktionen wurde mit Ammoniumsulfat (30 bis 50 % Sättigung) fraktioniert, durch eine Sephadex G-200-Säule
(3,5 χ 105 cm) geführt, mit 0,02 m Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, ins Gleichgewicht gebracht. Das Enzym wurde durch
Ultrafiltration konzentriert, gegen 0,005 m Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, dialysiert und auf eine Hydroxylapatit-Säule
(3,5 χ 10 cm), mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht
gebracht, gebracht. Elution erfolgte unter linearem Gradienten des Kaliumphosphatpuffers (0,02 bis 0,4 m, 500 ml).
Aktive Fraktionen wurden wie oben konzentriert, gegen 0,02 m Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, dialysiert und mit 4/10 Volumen
Glycerin gemischt. Das endgültige Präparat hatte 60-fache spezifische Aktivität gegenüber zellfreiem Extrakt
mit 26 % Ausbeute. Das Enzym war wenigstens 4 Monate bei Lagerung bei -200C stabil.
909848/0 5 81
Zu 0,63 ml des 50 μΜοΙ Tris-HCl-Puffer, pH 8,0,
6 μΜοΙ MgCl2, 3,2 μΜοΙ ATP, 7,4 μΜοΙ Phosphoenolpyruvat,
0,28 μΜοΙ NADH, 0,4 μΜοΙ ÄDTA, 0,8 mg Triton X-100,
21,6 Einheiten Myokinase, 12 Einheiten Pyruvatkinase und 12 Einheiten Lactatdehydrogenase enthaltenden Inkubationsgemischs
wurden 1 bis 20 nMol Palmitinsäure und 3 mE Acyl-CoA-synthetase
LCF-18 gegeben.
Nach einer kurzen Vorinkubation wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,26 μΜοΙ CoA in einem Gesamtvolumen von 0,68 ml
gestartet. Die Abnahme der Absorption bei 340 nm aufgrund der Oxydation von NADH wurde mit Hilfe eines Spektrophotometers
mit 1 cm Lichtweg bei 25°C (Hitachi 200-10) verfolgt.
909848/0581
-ze-
Leerseite
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von Acyl-CoA-synthetase
LCF-18, dadurch gekennzeichnet/ daß ein Acyl-CoA-synthetase LCF-18 produzierender Stamm aus der Gruppe der Gattungen
Escherichia, Aerobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Staphylococcus, Corynebacterium, Pseudomonas, Aeromonas,
Streptomyces, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Gibberella, Candida, Gloeophyllum, Trametes, Daedälea,
Laetiporus, Flammulina, Lentinus», Lenzites, Pycnoporus,
Tyromyces, Coriolus und Schyzophyllum gezüchtet und dann
das Enzym Acyl-CoA-synthetase LCF-18 aus den so gezüchteten Zellen isoliert wird.
909848/0 58 1
[NAOHQERBCH-qg 1 7ft Cf f
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch, gekennzeichnet,
daß als Acy1-CoA-synthetase LCF-18 produzierender Mikroorganismus
ein solcher aus der Gruppe Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas schuylkilliensis/
Candida lipolytica, Gibberella fujikuroi, Fusarium oxysporum,
Serratia marcescens, Aeromonas hydrophila, Gloeophyllum
sepiarium, Gloeophyllum trabeum, Gloeophyllum ungulatum,
Pycnoporus coccineus, Trametes sanguinea gezüchtet wird.
909848/0581
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| DE2962521D1 (en) * | 1978-09-29 | 1982-05-27 | Mitsubishi Chem Ind | Process for the purification of long-chain acyl-coenzyme-a synthetase and the enzyme, acyl-coa synthetase, purified thereby |
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- 1979-05-11 FR FR7912048A patent/FR2434200B1/fr not_active Expired
-
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- 1980-03-20 US US06/132,177 patent/US4269942A/en not_active Expired - Lifetime
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| Journal of Bacteriology, 1973, S. 249 * |
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| FR2434200A1 (fr) | 1980-03-21 |
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| US4269942A (en) | 1981-05-26 |
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