DE1231697B

DE1231697B - Verfahren zur Herstellung von 11alpha-Oxy-delta 4-3-ketosteroiden

Info

Publication number: DE1231697B
Application number: DES85381A
Authority: DE
Inventors: Carlos Casas Campillo
Original assignee: Roche Palo Alto LLC
Current assignee: Roche Palo Alto LLC
Priority date: 1962-05-31
Filing date: 1963-05-25
Publication date: 1967-01-05
Also published as: GB989918A; US3190809A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. CL:

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

C07c

Deutsche Kl/. 12 ο-25/02

1 231697
S85381IVb/12o
25. Mai 1963
5. Januar 1967

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Herstellung von ll«-Oxy-J⁴-3-ketosteroiden aus den entsprechenden A ⁵-3-Oxy-und -3-Acyloxyverbindungen, die in der 11-Stellung unsubstituiert sind, durch Bebrütung der Zt⁵-Steroide mit dem Mikro-Organismus Psilocybe caerulescens Var. Mazatecorum (ATCC 13964).

Viele Steroide mit der Δ ⁴-3-Ketogruppierung und einer sauerstoffhaltigen Funktion in der 11-Stellung sind therapeutische Mittel oder Zwischenprodukte zur Herstellung anderer Steroide mit therapeutischer Wirksamkeit. So können z. B. die lloc-Oxysteroide durch bekannte Verfahren in die entsprechenden 9a-Halogen-ll/?-oxy- und 9oc-Halogen-ll-ketoverbin- düngen umgewandelt werden. -

Es ist bekannt, daß verschiedene Mikroorganismen, insbesondere solche der Rhizopus-Art, die Einführung einer U-a-Hydroxylgruppe in das Steroidmolekül bewirken.

Auch die mikrobiologische Oxydation von 4⁵-3-Oxysteroiden zu den entsprechenden zl⁴-3-Ketoverbindungen ist beschrieben. So beschreibt z. B. die USA.-Patentschrift 2 915 439 die Oxydation von Pregnenolon zu Progesteron unter Verwendung von Kulturen verschiedener Arten von Streptomyces, wie z. B. S. aureofaciens, S. griseus, S. fradiae, S. lavendulae, S. argenteolus, S. olivaceous usw. In gleicher Weise wurde die Oxydation von /l⁵-Androsten-3ß,17j3-diol mittels Flavobacterium zur Herstellung von zl⁴-Androsten-3,17-dion oder Testosteron von A. Ercoli in BoIl. Sei. fac. Chim. ind. (Bologna), 10 (1940), und in Z. physiol. Chem., 370, S. 266 (1941), beschrieben.

In der USA.-Patentschrift 3 118 822 ist die Einführung einer ll«-Hydroxylgruppe in verschiedene Steroide durch Bebrütung der entsprechenden 11-Desoxysteroide mit Mikroorganismen der Agaricaceae-Familie, Gruppe Agaricales, Art Psilocybe, Stropharia und Conocybe, beschrieben worden.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß der Mikroorganismus Psilocybe caerulescens Var. Mazatecorum (ATCC 13964) in Steroiden der vorstehend genannten Art durch eine einzige Bebrütung die Verseifung der vorhandenen veresterten Hydroxylgruppen, die Oxydation einer Hydroxylgruppe in der 3-Stellung zur entsprechenden Ketogruppe mit gleichzeitiger Umlagerung der Doppelbindung von der 5(6)-Stellung in die 4(5)-Stellung und die Einführung einer Hydroxylgruppe in die lla-Stellung bewirkt.

Das erfindungsgemäße Oxydationsverfahren kann zur Behandlung von Steroidverbindungen der Androstan-, Pregnan-, Cholestan- und Sapogeninreihe, Verfahren zur Herstellung

von lla-Oxy~zf⁴-3-ketosteroiden

Anmelder:

Syntex Corporation, Panama (Panama)

Vertreter:

Dr. W. Schalk, Dipl.-Ing. P. Wirth,

Dipl.-Ing. G. E. M. Dannenberg

und Dr. V. Schmied-Kowarzik, Patentanwälte,

Frankfurt/M., Große Eschenheimer Str. 39

Als Erfinder benannt:

Carlos Casas Campillo, Naucalpan (Mexiko)

Beanspruchte Priorität:

Mexiko vom 31. Mai 1962 (67568)

vorzugsweise von solchen mit 18 bis 27 Kohlenstoffatomen, angewendet werden. Weiterhin können andere Substituenten in verschiedenen Stellungen des Steroidmoleküls anwesend sein, wie z. B. Ketogruppen, Hydroxylgruppen, Halogenatome, Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylreste. Freie Hydroxylgruppen im Steroidausgangsmaterial können mit Acylgruppen mit weniger als 12 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit solchen von Kohlenwasserstoffcarbonsäuren, wie z. B. dem Acetyl-, Propionyl-, Butyryl- oder Önanthylrest, verestert sein.

So liefert z. B. das erfindungsgemäß behandelte Pregnenolonacetat ll«-Oxyprogesteron, während aus dem 3,21-Diacetat von Zl⁵-Pregnen-3^,17«,21-triol-20-ondaszl ⁴-Pregnen-ll«,17«,21-triol-3,20-dion (11-epi »F«) erhalten wird.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Kultur von Psilocybe caerulescens Var. Mazatecorum, ATCC 13964, unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium, d. h. einem solchen, das Kohlehydrate, Salze und organische Stickstoffquellen enthält, bei einer Temperatur zwischen etwa 25 und 28 ⁰C bebrütet, bis ein reichliches Wachstum des Myceliums erzielt ist, was gewöhnlich in etwa 3 bis 5 Tagen erfolgt.

Das Mycelium wird dann dispergiert, und aliquote Mengen dieser Dispersion werden zu größeren Mengen desselben Kulturmediums zugegeben. Dann wird das Steroidausgangsmaterial in fester Form oder als Alkohol- oder Acetonlösung zugefügt und die Bebrütung unter aeroben Bedingungen, gewöhnlich von

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etwa 12 Stunden bis etwa 3 Tage, fortgesetzt, worauf deutschen Auslegeschrift 1 002 348 und der USA.-Pa-

das Reaktionsprodukt durch Extraktion mit einem tentschrift 2 602 769. Entsprechend dem letztgenannten

geeigneten Lösungsmittel isoliert wird. Verfahren tritt im übrigen die Hydroxylierung nicht

Das Kulturmedium kann auch unter sterilen Bedin- nur am Kohlenstoffatom 11,. sondern auch am

gungen mit der Kultur von Psilocybe caerulescens 5 Kohlenstoffatom 8 ein. Erfindungsgemäß erfolgt je-

beimpft werden, und das Steroidausgangsmaterial doch die Hydroxylierung nur am Kohlenstoffatom 11.

wird gleichzeitig oder nach begonnenem Wachstum Im allgemeinen werden Ausbeuten zwischen 30

des Mikroorganismus zugefügt. Die besten Ergebnisse und 40% erzielt.

erzielt jedoch das Verfahren, bei welchem der Mikro- Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsorganismus zuerst in einem geeigneten Kulturmedium io gemäße Verfahren,
unter aeroben Bedingungen und in Abwesenheit des Beispiel 1
Steroidausgangsmaterials entwickelt wird. Das erhaltene Mycelium wird dann abfiltriert und erneut in Eine Kultur von Psilocybe caerulescens Var. Mazateeinem frisch hergestellten Kulturmedium, in welchem corum (Heim), ATCC13964, wurde durch Seriendas Steroidausgangsmaterial ebenfalls suspendiert ist, 15 überführung alle 2 Wochen in einem Mycophil-Agarsuspendiert. Medium gehalten, das bei einer Temperatur von 25

Unter Anwendung bekannter Verfahren können bis 28 ⁰C bebrütet wurde. Das in einem geneigten

auch die oxydierend wirkenden Enzyme dieses Mikro- Agarrohr erzielte Wachstum wurde dann in 10 ecm

Organismus verwendet werden. sterilem Wasser suspendiert, und 2 ecm dieser Suspen-

Im allgemeinen wird eine Konzentration des ao sion wurden zum Beimpfen eines Erlenmeyerkolbens

Steroidausgangsmaterials von etwa 5 Gewichtsprozent, verwendet, der 200 ecm des folgenden Kulturmediums

bezogen auf das Gesamtgewicht des Substrates, ver- enthielt:

wendet, obgleich auch größere oder kleinere Konzen- »Phvtone« 2 ε

trationen angewendet werden können. Dextrose 2 g

Die verwendbaren Kulturmedien enthalten Vorzugs- 25 \y_asser auf 200 ecm

weise Dextrose als Kohlenstoffquelle und Phytone

(ein enzymatisches Abbauprodukt von Sojamehl; Die Kultur wurde 3 Tage unter rotierendem Rühren Baitimor Biol. Lab., Baltimore, Md.) als Stickstoff- (200 Umdr./Min.) zwischen 25 und 28⁰C bebrütet, quelle. An Stelle oder zusammen mit der Dextrose worauf das Mycelium unter Verwendung eines können auch andere Kohlehydrate, wie Stärke, 30 Mischers dispergiert wurde. Eine 20-ccm-Probe der Zuckerrohr, Lactose, Glycerin oder Maltose, ver- erhaltenen mikrobischen Suspension wurde zum wendet werden. In gleicher Weise können Sojabohnen- Beimpfen von je zehn 1-1-Erlenmeyer-Kolben, die mehl, Maismehl oder andere handelsübliche Produkte, jeweils 200 ecm des obigen »Phytone«-Dextrose-Kulwie Casitone, Edamine, Mycophil, Nutrient L-I turmediums enthielten, verwendet.
(Milcheiweißhydrolysate; Sheffield Farms, Norwich, 35 In jedem Kolben wurden 50 mg des 3,21-Diacetates N. Y.) oder NZ-Amine (pankreatisches Hydrolysat von ^⁵-Pregnen-3/3,17oi,21-triol-20-on gegeben, und von Kasein; Baltimore Biol. Lab., Baltimore, Md.) die erhaltene Reaktionsmischung wurde unter Bean Stelle von Phytone verwendet werden. ' lüftung 72 Stunden bei einer Temperatur zwischen

Nach beendeter Sauerstoffeinführung wird das 25 und 28⁰C gerührt. Dann wurden die Kolbeninhalte Produkt durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht 40 vereinigt und einige Male mit Methylenchlorid exmischbaren Lösungsmittel, vorzugsweise einem chlo- trahiert; der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, rierten Kohlenwasserstoff, wie z. B. Methylenchlorid, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter Äthylendichlorid, Chloroform oder Trichloräthan, vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der aus dem Kulturmedium gewonnen. Besonders gute Rückstand wurde in einer mit 12 g Kieselsäuregel Ergebnisse werden erzielt, wenn die Extraktion des 45 und 12 g Diatomeenerde (bekannt unter dem Handels-Produktes mit heißem Äthylendichlorid bei Tempe- namen Celite) gefüllten Kolonne absorbiert und raturen zwischen 40 und 8O⁰C erfolgt. Der so erhaltene lieferte 150 mg Δ ⁴-Pregnen-lla,17«,21-triol-3,20-dion. Extrakt wird dann auf ein kleines Volumen reduziert (Schmelzpunkt 217 bis 219 ⁰C), das mit einer authen- oder zur Trockne eingedampft. Der Rückstand kann tischen Probe von 11-epi »F« identisch ist.
durch verschiedene Verfahren, üblicherweise durch 50 . .
Chromatographie und Umkristallisation, gereinigt Beispiel 2
werden. Das Verfahren von Beispiel 1 wurde im einzelnen

Die erfindungsgemäß erzielbaren Ausbeuten van- wiederholt, wobei jedoch an Stelle von »Phytone« im

ieren in Abhängigkeit z. B. von dem verwendeten Kulturmedium »Casitone« verwendet wurde. Wieder-

Steroidausgangsmaterial, Kulturmedium oder der 55 um wurde 11-Epihydrocortison erhalten.

Bebrütungszeit. . .

Es war nicht zu erwarten, daß mit dem erfindungs- Beispiel j

gemäß zu verwendenden Mikroorganismus höhere Gemäß Verfahren von Beispiel 1 wurden die unter I

Ausbeuten an den gewünschten Endprodukten erhalten aufgeführten Verbindungen in die entsprechenden

werden als gemäß den bekannten Verfahren der¹ 60 Ha-Oxy-Zl⁴-3-keto-derivate (II) umgewandelt:

I II

Zl⁵-Pregnen-3/5,ol-20-on-acetat lla-Oxyprogesteron

Zl⁶-Pregnen-3|e,17a-diol-20-on ll«,17«-Dioxyprogesteron

Zl⁵-Pregnen-3/S,21,-diol-20-on-diacetat Δ ⁴-Pregnen-lla,21-diol-3,20-dion

16«-Methyl-Zl^B-pregnen-3/S-ol-20-on 16a-Methyl-lla-oxyprogesteron

16«-Methyl-J^s-pregnen-3_j5,17a,21-triol-20-on-3,21-diacetat looc-Methyl-ll-epihydrocortison

17«-Methykd⁵-androsten-3/?,17/3-diol 17a-Methyl-lla-oxytestosteron

Beispiel 4

In dem im Beispiel 1 beschriebenen Medium wurde unter Belüftung ein vegetatives Wachstum von Psilocybe caerulescens Var. Mazatecorum, ATTC 13964, hergestellt. Zur erhaltenen Kultur wurde eine 2%ige Äthanollösung von zl⁵-Pregnen-3/?-ol-20-on in einer Menge von 10 mg der Verbindung pro 50 ecm des Kulturmediums zugegeben. Die erhaltene Reaktionsmischung wurde 5 Tage unter Belüftung zwischen 25 und 28° C gerührt und dann mit heißem Äthylendichlorid extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde durch Chromatographie auf Kieselsäuregel gereinigt und lieferte das lla-Oxyprogesteron, das mit einer authentischen Probe identisch war.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von lla-Oxyzl⁴-3-ketosteroiden durch enzymatische Bebrütung mittels Mikroorganismen aus dem entsprechenden ll-Desoxy-zl⁵-3-oxy-steroid oder 11-Desoxy- -d⁵-3-acyloxy-steroid, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Psilocybe caerulescens Var. Mazatecorum (ATCC 13964) verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsmaterial das 3,21-Diacetat von zl^s-Pregnen-3/3,17a,21-triol-20-on oder das Zl⁵-Pregnen-3/?,ol-20-on-3-acetat verwendet wird.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Deutsche Auslegeschrift Nr. 1 002 348;
USA.-Patentschrift Nr. 2 602 769.