CZ147398A3 - Nová transfekční činidla a jejich farmaceutická použití - Google Patents

Nová transfekční činidla a jejich farmaceutická použití Download PDF

Info

Publication number
CZ147398A3
CZ147398A3 CZ981473A CZ147398A CZ147398A3 CZ 147398 A3 CZ147398 A3 CZ 147398A3 CZ 981473 A CZ981473 A CZ 981473A CZ 147398 A CZ147398 A CZ 147398A CZ 147398 A3 CZ147398 A3 CZ 147398A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
nhch
pharmaceutical composition
product
lipopolyamine
nucleic acid
Prior art date
Application number
CZ981473A
Other languages
English (en)
Inventor
Gérardo Byk
Daniel Scherman
Bertrand Schwartz
Catherine Dubertret
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S.A. filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Publication of CZ147398A3 publication Critical patent/CZ147398A3/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G11—INFORMATION STORAGE
    • G11B—INFORMATION STORAGE BASED ON RELATIVE MOVEMENT BETWEEN RECORD CARRIER AND TRANSDUCER
    • G11B19/00—Driving, starting, stopping record carriers not specifically of filamentary or web form, or of supports therefor; Control thereof; Control of operating function ; Driving both disc and head
    • G11B19/02—Control of operating function, e.g. switching from recording to reproducing
    • G11B19/04—Arrangements for preventing, inhibiting, or warning against double recording on the same blank or against other recording or reproducing malfunctions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C237/06—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C237/12—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/12—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to a nitrogen atom of the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/0055—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of at least three carbon atoms which may or may not be branched, e.g. cholane or cholestane derivatives, optionally cyclised, e.g. 17-beta-phenyl or 17-beta-furyl derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • G—PHYSICS
    • G11—INFORMATION STORAGE
    • G11B—INFORMATION STORAGE BASED ON RELATIVE MOVEMENT BETWEEN RECORD CARRIER AND TRANSDUCER
    • G11B20/00—Signal processing not specific to the method of recording or reproducing; Circuits therefor
    • G11B20/10—Digital recording or reproducing
    • G11B20/18—Error detection or correction; Testing, e.g. of drop-outs
    • G11B20/1816—Testing
    • G—PHYSICS
    • G11—INFORMATION STORAGE
    • G11B—INFORMATION STORAGE BASED ON RELATIVE MOVEMENT BETWEEN RECORD CARRIER AND TRANSDUCER
    • G11B20/00—Signal processing not specific to the method of recording or reproducing; Circuits therefor
    • G11B20/10—Digital recording or reproducing
    • G11B20/18—Error detection or correction; Testing, e.g. of drop-outs
    • G11B20/1866—Error detection or correction; Testing, e.g. of drop-outs by interleaving
    • G—PHYSICS
    • G11—INFORMATION STORAGE
    • G11B—INFORMATION STORAGE BASED ON RELATIVE MOVEMENT BETWEEN RECORD CARRIER AND TRANSDUCER
    • G11B20/00—Signal processing not specific to the method of recording or reproducing; Circuits therefor
    • G11B20/24—Signal processing not specific to the method of recording or reproducing; Circuits therefor for reducing noise
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G11—INFORMATION STORAGE
    • G11B—INFORMATION STORAGE BASED ON RELATIVE MOVEMENT BETWEEN RECORD CARRIER AND TRANSDUCER
    • G11B20/00—Signal processing not specific to the method of recording or reproducing; Circuits therefor
    • G11B20/10—Digital recording or reproducing
    • G11B20/10009—Improvement or modification of read or write signals
    • G—PHYSICS
    • G11—INFORMATION STORAGE
    • G11B—INFORMATION STORAGE BASED ON RELATIVE MOVEMENT BETWEEN RECORD CARRIER AND TRANSDUCER
    • G11B20/00—Signal processing not specific to the method of recording or reproducing; Circuits therefor
    • G11B20/10—Digital recording or reproducing
    • G11B20/12—Formatting, e.g. arrangement of data block or words on the record carriers
    • G11B20/1217—Formatting, e.g. arrangement of data block or words on the record carriers on discs
    • G11B20/1258—Formatting, e.g. arrangement of data block or words on the record carriers on discs where blocks are arranged within multiple radial zones, e.g. Zone Bit Recording or Constant Density Recording discs, MCAV discs, MCLV discs
    • G—PHYSICS
    • G11—INFORMATION STORAGE
    • G11B—INFORMATION STORAGE BASED ON RELATIVE MOVEMENT BETWEEN RECORD CARRIER AND TRANSDUCER
    • G11B20/00—Signal processing not specific to the method of recording or reproducing; Circuits therefor
    • G11B20/10—Digital recording or reproducing
    • G11B20/14—Digital recording or reproducing using self-clocking codes
    • G11B20/1403—Digital recording or reproducing using self-clocking codes characterised by the use of two levels
    • G11B2020/1476—Synchronisation patterns; Coping with defects thereof
    • G—PHYSICS
    • G11—INFORMATION STORAGE
    • G11B—INFORMATION STORAGE BASED ON RELATIVE MOVEMENT BETWEEN RECORD CARRIER AND TRANSDUCER
    • G11B20/00—Signal processing not specific to the method of recording or reproducing; Circuits therefor
    • G11B20/10—Digital recording or reproducing
    • G11B20/18—Error detection or correction; Testing, e.g. of drop-outs
    • G11B20/1816—Testing
    • G11B2020/183—Testing wherein at least one additional attempt is made to read or write the data when a first attempt is unsuccessful

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká nových sloučenin, které jsou blízké skupině lipopolyaminů, farmaceutických kompozic, které tyto sloučeniny obsahují, t jejich použití pro transfekci in vivo nebo/a in vitro nukleových kyselin a způsobu jejich přípravy.
K v
Dosavadní stav techniky * ** z > Z
Četné genetické choroby souvisí s defektni nebo/a abnormální expresí, tj. s nedostatečnou nebo nadměrnou expresí jedné nebo několika nukleových kyselin. Jedním z hlavních cílů genové terapie je korigovat tento typ genetických anomálií realizací buněčné exprese in vivo nebo in vitro klonovaných genů.
V současné době je navrženo několik způsobů doručení potřebné genetické informace do nitra buňky. Jeden z těchto způsobů spočívá v použití chemických nebo biochemických vektorů. Uvedené syntetické vektory mají dvě základní funkce, které spočívají ve zhutnění DNA určené k transfekci .a podpoření vazby DNA v cílové buňce a jejího průchodu skrze plasmovou membránu a případně skrze obě jádrové membrány.
Výrazného pokroku bylo při tomto způsobu transfekce ' dosaženo vývojem technologie založené na použití kationtového »· lip_J.du. Bylo totiž prokázáno, že kladně nabitý kationtový lipid, kterým je N-/1-(2,3-dioleyloxy)propyl/-N,N,N-trimethyl« amonium chlorid (DOTMA),spontánně interferuje ve formě liposomů nebo malých váčků (vesikul) s DNA, která je nabita zápor’ ně, za vzniku komplexů lipidy-DNA, které jsou schopné fúzovat s buněčnými membránami, a umožňuje tak nitrobuněčnou dodávku DNA. Nicméně, jakkoliv je tato molekula účinná v úrovni transfekce, má nevýhodu spočívající v tom, že není biologicky odbouratelná a má vůči buňkám toxický charakter.
-7.Od okamžiku přípravy lipidu DOTMA, byly vyvinuty další kationtové lipidy na základě strukturního modelu: lipofilní skupina spojená s amino-skupinou prostřednictvím rameně, které bývá označováno jako spacer, Z těchto kationtových lipidů lze zejména uvést ty sloučeniny, které obsahují jako lipofilní skupinu dvě mastné kyseliny nebo derivát cholesterolu a které kromě toho případně obsahují jako aminovou skupinu kvartérní amoniovou skupinu. Jakožto reprezentanty této kategorie kationtových lipidů je možné zejména uvést lipidy DOTAP, DOBT nebo ChOTB. Další sloučeniny tohoto typu, jako například : DOSC a ChOSC, jsou vyznačeny přítomností cholinové skupiny namísto kvarterni amoniove skupiny. Obecne vsak je nutno kostatovat, že transfekční účinnost těchto sloučenin je nicméně dosti nízká.
Rovněž byla popsána jiná kategorie kationtových lipidů, kterou tvoří lipopolyaminy. V rámci vynálezu výraz lipopolyamin označuje amfifilní molekulu obsahující alespoň jednu polyaminovou hydrofilní oblast spojenou oblastí nazývanou spácer s lipofilní oblastí. Kationtově nabitá polyaminová oblast lipopolyaminů je schopna vázat se reverzibilním způsobem s negativně nabitou nukleovou kyselinou. Tato interakce silně zhutňuje nukleovou kyselinu. Lipofilní oblast činí tuto iontovou interakci necitlivou vůči vnějšímu prostředí tím, že pokrývá vytvořenou nukleofilní částici lipidovým povlakem. V tomto typu sloučenin může být kationtová skupina reprezentována například L-5-karboxysperminovou skupinou, která obsahuje čtyři amoniové skupiny, z toho dvě primární a dvě sekundární. Jako příklady těchto sloučenin lze zejména uvést DOGS a DPPES. Tyto lipopolyaminy jsou obzvláště účinné pro transfekci primárních endokrynních buněk.
Ideální syntetické transfekční činidlo by ve skutečností mělo zajištovat vysokou míru tranfekce a to pro široké spektrum buněk, mělo by mít při aplikačních dávkách nulovou nebo velmi nízkou toxicitu a mělo by být konečně biodegradovatelné,
- 3 aby se zamezilo všech vedlejším účinkům v úrovni ošetřených buněk.
Cílem vynálezu je navrhnout nové lipopolyaminy s originální polyaminovou frakcí, které by byly schopné účinného použití při transfekci in vitro a/nebo in vivo buněk a zejména schopné použití pro vektorizaci nukleových kyselin.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou lipopolyaminy s konfigurací D, L nebo LD a jejich soli mající obecný vzorec I
R3 0
R1 \
N /
R2
R4 (i) ve kterém
R1, R2 et R3 nezávisle jeden na druhém znamenají atom vodíku nebo skupinu —(CH-) -NRR', ve které *4 v sz z q může znamenat 1, 2,i 3, 4, 5 a 6, přičemž může mít v jednotlivých skupinách R1, R2 a R3 stejný nebo odlišný význam, a
R a R' nezávisle jeden na druhém znamená atom vodíku nebo skupinu -(CH9) ,, ve které q' může znamenat 1, 2, 3, 4, 5 a 6, přičemž může mít v jednotlivých skupinách R a R' stejný nebo odlišný význam, m, n a p nezávisle jeden na druhém znamenají celé číslo od 0 do 6, přičemž,když je n vyšší než 1, m může mít různé hodnoty a R3 může mít různé významy v rámci obecného • ·
vzorce I a
R4 znamená skupinu obecného vzorce II
R5 Ί /E6
-fx- —l· CH) — r -Y J—N\ U \R7 (II)
ve kterém
R6 a R7 nezávisle jeden na druhém znamenají atom vodíku nebo nasycenou nebo nenasycenou alifatickou skupinu obsahující 10 až 22 uhlíkových atomů, přičemž alespoň jeden z R6 nebo R7 je odlišný od atomu vodíku, u znamená celé číslo od 0 do 10, přičemž, když u znamená celé číslo vyšší než 1, potom R5, X, Y a r mohou mít odlišné významy v jednotlivých strukturních jednotkách /X-(CHR5) -Y/,
X znamená atom kyslíku, atom síry .nebo monoalkylovanou nebo nemonoalkylovanou aminovou skupinu,
Y znamená karbonylovou skupinu nebo methylenovou skupinu,
R5 znamená atom vodíku nebo boční přírodní aminokyseli, nový řetězec , který je případně substituován, a r znamená celé číslo od 1 do 10, přičemž, když je u r rovno 1, R^ znamená boční přírodní aminokyselinový řetězec, který je případně substituován, a , když je r vyšší než 1, R^ znamená atom vodíku.
* Pod pojmem boční řetězec přírodní aminokyseliny se v rámci vynálezu zejména rozumí řetězce obsahující amidiniové strukturní jednotky, jako například boční řetězec argininu. Jak již bylo uvedeno výše, může být tento řetězec substituován nasycenými nebo nenasycenými, přímými, rozvětvenými nebo cyklickými alifatickými skupinami obsahujícími 1 až 24 uhlíkových atomů, jakými jsou například cholesterylová skupina, arachidonylová • ·
- 5 skupina nebo retinoylová skupina, nebo mono- nebo polyaromatickými skupinami, jakými jsou například substituované nebo nesubstituované benzyloxykarbonylové, benzylesterové nebo rhodaminylové deriváty.
Uvedené nové sloučeniny obecného vzorce I se mohou vyskytovat ve formě farmaceuticky přijatelných netoxických solí. Tyto netoxické soli zahrnují soli s minerálními kyselinami (s kyselinou chlorovodíkovou, kyselinou sírovou, kyselinou bromovodíkovou, kyselinou fosforečnou nebo kyselinou dusičnou) nebo s organickými kyselinami (s kyselinou octovou, kyselinou propionovou, kyselinou jantarovou, kyselinou maleinovou, kyselinou hydroxymaleinovou, kyselinou benzoovou, kyselinou fumarovou, kyselinou methansulfonovou nebo kyselinou štavelovou) anebo s minerálními bázemi (s hydroxidem draselným, hydroxidem sodným, hydroxidem lithným nebo oxidem vápenatým) nebo s organickými bázemi (s terciárními aminy, například s triethylaminem, nebo s piperidinem nebo benzylaminem).
Jakožto příklady sloučenin podle vynálezu lze zejména uvést sloučeniny následujících obecných pod-vzorců:
(IV) • · · · • ·
NRSR, (νή
Ο • ·
(IX) o
• · · ·
- 8 ve kterých R4, R6 a R7 mají výše uvedené významy. Výhodně R4 znamená skupinu NR6R7, ve které R6 a R7 figurující v podvzorcích III až XII znamenají identickou skupinu zvolenou z množiny zahrnující (CH2)17CH3, ch3.
(CH2)11CH3, (CH2)13CH3 a (CH2)12V rámci obzvláště výhodného provedení obsahují nárokované sloučeniny navíc zaměřovači prvek umožňující orientovat přenos nukleové kyseliny, ke které jsou vázány uvedené sloučeniny. Tento zaměřovači prvek je zabudován ve sloučenině obecného vzorce I v úrovni bočního řetězce aminokyseliny reprezentovaného obecným substituentem R5. Výhodněji je tento zaměřovači prvek vázán kovalentně nebo nekovalentně ke sloučenině podle vynálezu.
Může se jednat o extracelulární zaměřovači prvek, který umožňuje orientovat přenos nukleové kyseliny do některých buněčných typů nebo do některých požadovaných tkání (nádorové buňky, hepatické buňky, hematopoetické buňky, atd.). Z tohoto hlediska se může jednat o buněčný receptorový ligand přítomný na povrchu cílového buněčného typu, jako například cukr, folát, transferrin, insulin, asialo-orosomukoidní protein nebo jakákoliv bioaktivní molekula rozpoznaná extracelulárními receptory. Může se rovněž jednat o intracelulární zaměřovači prvek, umožňující orientovat přenos nukleové kyseliny do určitých privilegovaných buněčných oblastí (mitochondrie, jádro, atd.), jako například o signální sekvenci jádrové lokalizace (nls), která upřednostňuje akumulaci transfekované DNA v jádru buňky.
Obecněji specifikováno, zahrnují zaměřovači prvky, které jsou schopné použití v rámci vynálezu, cukry, peptidy, oligonukleotidy, steroidy nebo lipidy. Výhodně se jedná o cukry nebo/a peptidy, jakými jsou protilátky nebo fragmenty protilátek, ligand^uněčných receptorů nebo jejich fragmenty, receptory nebo fragmenty receptorů, a podobně. Zejména se může jednat o ligandy receptorů růstových faktorů, receptory cytokinů, *9 9
- 9 receptory buněčných lektinú nebo receptory adhezních proteinů, jakými jsou integriny. Rovněž lze uvést receptor transferrinu, lipidy HDL a lipidy LDL. Zaměřovacím prvkem může rovněž být cukr umožňující zacílit lektiny, jako asialoglykoproteinové receptory, nebo také fragment Fab protilátky umožňující zacílit receptor fragmentu Fc imunoglobulinů.
Stejně tak je možné počítat se spojením sloučeniny obecného vzorce I s markérem typu biotinu, rhodaminu nebo fo* látu, který je například vázán k aminokyselinovému bočnímu řetězci R5. Tímto markérem může být také přímá nebo cyklická ; peptidová nebo pseudopeptidová sekvence zahrnující rozpozná^* vací epitop Arg-Gly-Asp primárních nebo/a sekundárních receptorů adhezních proteinů typu integrinů.
Jakožto příklady nárokovaných lipopolyaminů lze zejména uvést následující sloučeniny, které jsou detailněji popsány v dále zařazených příkladech:
H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17-CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CON[(CH2)17-CH312 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)17-CH312 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArg(Z)2N[(CH2)17-CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(rhodamin· )N[(CH2) 17-CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(biotinyl)N[(CH2)17-CH3]2 {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17-CH3]2 (H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2CON[(CH2)17-CH3]2 {H2N(CH2)2} 2N(CH2)2NHCH2COGlyN[(CH2) 17-CH312 {H2N(CH2)2}2N(CH2)2NHCH2CON[(CH2)17-CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4N[(CH2)3NH2]CH2COGlyN[(CH2)i7CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLysN[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys [C'.-Z]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys [CHO]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys [Cholesteryl]N[(CH2)i7CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys [Arachidonyl]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COG1uN[(CH2)I7CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIu [N(CH3)2]N[(CH2)17CH3]2
- 10 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlu [O-Bz]N[(CH2)I7CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COG1u [Galaktosamid ]N[(CH2)I7CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlu [Glukosami^ ]N[(CH2)17CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COG1u [Mannosamid ]N[(CH2),7CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH(CH2)3CON[(CH2)17CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CONH(CH2)5CON[(CH2)i7CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)uCH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)12CH3]2 a
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)13CH3]2.
Jakožto příklady obzvláště reprezentativních sloučenin podle vynálezu lze zejména uvést sloučeniny následujících vzorců:
(6)
(22) •4 ♦·♦» • 4
-11RPR 122760A
RPR126097
(28) fL
- 12 ·♦ «··· * ·· ·< · ♦ » · · · · · 9 « · · · ··· * · ·· ♦ · · 9 ♦ ······· * t ♦ * · ♦ ······· ·· ·«» ·» ··
RPR130596a
RPR130595A
(31)
(32) í:
- 13 • toto ♦ to to to to · to ·« to to • · toto · · •·· • to to · · toto· • to· ·· · · ·
4« ·· • to·· to to ·· to ····· • ·t »* ··
(33)
RPR131111a (34)
RPR122767a (35)
(36)
• ·* ♦♦ ♦ · • 9
#· · ♦ · 9 • ♦ · • 9
• · · · » · · • 9 • 9
« · < · · * ♦ ♦ 9-9 • ·
* · « · • • 9
·<·»·«( ·· 9 9 9 ♦ · 9 9
RPR128506a (42)
- 15 • 9·· · ···
9 9 9 9 9 9 9 9 9· • 9 9 9 99· · 9·· • 9 9 9 9 · » 99« ·· • · · · 9<9· • 99 9999 ·· 999 9·99
V rámci vynálezu byla navíc vyvinuta původní metodika v pevné fázi pro přípravu asymetrických funkcionalizovaných polyaminů, ze kterých se odvozují polyaminy podle vynálezu.
Klasicky je přístup kasymetrickým funkcionalizovaným aminům omezen nutností zavést do lineárních nebo rozvětvených symetrických polyaminů selektivním způsobem určité modifikace. Chemické rozdíly mezi primárními a sekundárními amino-skupinami polyaminů vyžadují značnou selektivitu k provedení reakcí, mezi které patří alkylace, adice Michaelova typu nebo acylace. Navíc selektivita vynucená takovými chemickými rozdíly není slučitelná se selektivní alkylací ve skupině několika primárních a sekundárních aminů, jak je to běžné u polyaminů. Klasickou odpovědí na takové restrikce je vytvořit asymetrické funkcionalizované polyaminy z blokových monomerů nesoucích na jedné straně aminovou skupinu schopnou polyaminování a na druhé straně vhodně chráněnou asymetrickou funkci. Tento přístup vyžaduje tedy náročnou několikastupňovou syntézu a zejména ortogonální ochranu funkčních skupin.
Metoda vyvinutá v rámci vynálezu má za cíl eliminovat nedostatky, které až dosud vykazovala posledně uvedená syntéza. Výhodou metody podle vynálezu je, že vede pohodlně a rychle k polyaminům, které jsou selektivně funkcionalizované na jediné primární aminokyselině alkylací nebo redukční alkylací symetrických polyaminů.
Podstata nárokovaného způsobu je založena na použití syntézní metody v pevné fázi provedené za účelem upřednostnění bimolekulární reakce mezi alkylačním činidlem a polyaminem, což eliminuje polyalkylaci tohoto polyaminů. Přesněji specifikováno, vztahuje se v tomto ohledu vynález ke způsobu, jehož podstata spočívá v tom, že se provede kopulace alespoň jedné lipidové frakce k alespoň jedné asymetrické polyaminové frakci, přičemž tato polyaminová frakce byla předtím získána bimolekulární reakcí mezi alkylačním činidlem ^kovalentně vázaným • ·♦ •í · ♦ e ♦ · · · ♦ * • ♦ · · ··* · · ·· • ♦ · · · · ♦ ···· · ♦ ♦ ·♦ · « « * ··· ···· ♦♦ ··· ·· II
- 16 k pevnému nosiči, a symetrickým polyaminem. Podle tohoto přístupu je alkylační činidlo kovalentně vázáno k polymernímu nosiči esterifikací nebo amidací. Symetrický polyamin reaguje s alkylačním činidlem v pevné fázi mechanismem bimolekulární reakce, která vede k monofunkcionalizovanému asymetrickému polyaminu vázanému k nosiči. Volné aminy uvedeného produktu jsou obvykle chráněny v pevné fázi ochrannými skupinami typu BOC nebo Z, a nakonec se uvedené produkty odštěpí od nosiče v pevné fázi. Tyto polyaminované kyseliny jsou potom, v případě, že je to vhodné, vázány k lipidovým frakcím, čímž se získají požadovaná transfekční činidla. Pro tuto kopulaci je možné použít obvyklá peptidová kopulační činidla, jakými např. jsou BOP, Pybop, BopCl a DCC. Uvedená metodika umožňuje rovněž sestavit na pevném nosiči celé transfekční činidlo za případného zavedení značkovacích peptidů, cukrů nebo fluorescenčních sond do molekuly. Samozřejmě se ukázalo možným provést tento typ roubování na volném lipopolyaminu.
Životnost výše uvedeného způsobu byla prokázána syntézou několika asymetrických a funkcionalizovaných přímých nebo rozvětvených polyaminovaných kyselin.
Předmětem vynálezu je rovněž terapeutické použití výše popsaných lipopolyaminů buá samotných, tj. přímo, nebo v rámci farmaceutických kompozic.
Jak již bylo vysvětleno výše, ukázalo se, že sloučeniny obecného vzorce I jsou obzvláště zajímavé pro transfekci in vivo a in vitro nukleových kyselin. Tyto sloučeniny účinně zhutňují DNA a mají výhodně velmi nízkou toxicitu.
Za účelem dosažení maximálního účinku kompozic podle vynálezu jsou obsahy sloučeniny obecného vzorce I a nukleové kyseliny výhodně určeny tak, že poměr (R) kladných nábojů uvažovaného lipopolyaminu a záporných nábojů nukleové kyseliny má optimální hodnotu. Tento optimální poměr se mění zejména
- 17 9 · ···♦ • · • ♦·· podle způsobu aplikace (in vivo nebo in vitro) a podle buněčného typu určeného k transfekci a je ho třeba optimalizovat případ od případu. Tato optimalizace je v kompetenci odborníka v daném oboru.
Ve farmaceutických kompozicích podle vynálezu může být polynukleotidem jak kyselina desoxyribonukleová, tak i kyselina ribonukleová. Může se jednat o sekvence přirozeného nebo umělého původu a zejména o genomovou DNA, DNAc, RNAm, RNAt a RNAr, o hybridní sekvence nebo o modifikované nebo nemodifikované syntetické neb.o semisyntetické oligonukleotidové
X . z . z „ v sekvence. Tyto nukleove kyseliny mohou být lidského, zvířecího, rostlinného, bakteriálního, virálního a jiného původu. Mohou být získány libovolnou známou technikou a zejména vytříděním bank, chemickou syntézou nebo také směsnými metodami zahrnujícími chemickou nebo enzymatickou modifikaci sekvencí získaných vytříděním bank. Tyto kyseliny mohou být zabudovány do vektorů, jakými jsou plasmidové vektory.
Pokud jde o desoxyribonukleové kyseliny, mohou být jedno- nebo dvouvláknové a může jít o krátké oligonukleotidy nebo o delší sekvence. Tyto desoxyribonukleové kyseliny mohou nést terapeutické geny, regulační sekvence transkripce nebo replikace, modifikované nebo nemodifikované antimediátorové sekvence, vazebné oblasti k ostatním buněčným složkám atd..
Terapeutickým genem se v rámci vynálezu rozumí každý gen kódující proteinový produkt mající terapeutický účinek. Tímto takto kódovaným proteinovým produktem může být protein, peptid, atd.. Tento proteinový produkt může být homologní vůči cílové buňce (jde tedy o produkt, který je normálně exprimován v cílové buňce v případě, že tato cílová buňka nevykazuje žádnou patologii). V tomto případě umožňuje exprese proteinu například léčit nedostatečnou expresi v buňce nebo expresi neaktivního nebo málo aktivního proteinu anebo také nadměrnou expresi uvedeného proteinu. Terapeutický gen může také kódovat mutant buněčného proteinu, mající zvýšenou sta- 18 bilitu, modifikovanou aktivitu, atd.. Uvedený proteinový produkt může být také heterologní vůči cílové buňce. V tomto případě může exprimovaný protein například doplňovat nebo zcela poskytovat deficitní aktivitu v buňce a tím jí činit schopnou boje proti patologii nebo v ní stimulovat imunitní odezvu.
Z terapeutických produktů ve smyslu vynálezu lze uvést zejména enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny: inter- leukiny, interferony, TNF, atd. (FR 9203120), růstové faktory, neurotransmitory nebo jejich prekurzory nebo syntézní enzymy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, sEGF, bFGF, NT3, NT5, HARP./pleiotrof in. atd., dystrofin nebo minidystrofin (FR 9111947), protein CFTR sdružený s mukoviscidosou, geny suprese nádorů: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, atd. (FR 93 04745), geny kódující faktory implikované v koagulaci: faktory VII, VIII, IX, geny intervenující v rozdělení DNA, sebevražedné geny (thymidin-kináza, cytosin-deamináza), geny hemoglobinu a ostatní proteinová transportní činidla, geny odpovídající proteinům implikovaným v metabolismu lipidů apolipoproteinového typu, zvoleným z množiny zahrnující apolipoproteiny A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J a apo(a), enzymy metabolismu, jako například lipoproteinlipáza, hepatická lipáza, lecitincholesterol-acyltransferáza, 7-alfa-cholesterol-hydroxyláza, kyselina fosfatidová-fosfatáza, nebo také proteiny přenosu lipidů, jako protein přenosu esterů cholesterolu a protein přenosu fosfolipidů, vazebný protein lipidů LDL, receptory chylomikronremnantů a skavenžerové receptory, atd..
Terapeutickou nukleovou kyselinou může být rovněž gen nebo antimediátorová sekvence, jehož nebo jejíž exprese v cílové buňce umožňuje regulovat expresi genů nebo transkripci buněčných RNAm. Takové sekvence mohou být například přepsány do cílové buňky na RNA, které jsou komplementární k buněčným RNAm, a blokovat tak jejich přepis na proteiny, za použití techniky popsané v patentovém dokumentu EP 140 308. Terapeutické
4·
- 19 ««44 • 4 ··♦ geny rovněž obsahují sekvence kódující ribozomy, které jsou schopné selektivně zničit cílové RNA.
Jak již bylo uvedeno výše, může nukleová kyselina rovněž obsahovat jeden nebo několik genů kódujících antigenový peptid, který je schopný vyvolat u člověka nebo zvířete imunitní odezvu. V rámci tohoto specifického provedení umožňuje vynález realizovat buď vakcíny nebo imunoterapeutické léčení člověka nebo zvířete, zejména zaměřené proti mikroorganismům, virům nebo rakovinám. Může se zejména jednat o specific- . ké antigenové peptidy viru Epstein-Barrové, viru HIV, viru hepatitidy B (EP 185 573), viru pseudovztekliny, viru typu syncitia forming virus a dalších virů nebo také nádorově specifických virů (EP 259 212).
Výhodně nukleová kyselina rovněž obsahuje sekvence umožňující expresi terapeutického genu nebo/a genu kódujícího antigenový peptid v požadované buňce nebo v požadovaném orgánu. Může se jednat o sekvence, které jsou přirozeně zodpovědné za expresi uvažovaného genu v případě, že jsou tyto sekvence schopné funkce v infikované buňce. Může se rovněž jednat o sekvence různého původu (zodpovědné za expresi ostatních proteinů nebo dokonce syntetické sekvence). Zejména se může jednat o promoční sekvence eukaryotických nebo virálních genů. Tak například se může jednat o promoční sekvence pocházející z genomu buňky, která má být infikována. Stejně tak se může jednat o promoční sekvence pocházející z genomu viru. V tomto ohledu lze citovat například promotory genů E1A, MLP, CMV, RSV, atd.. Navíc tyto expresní sekvence mohou být modifikovány adicí aktivačních sekvencí, regulačních sekvencí, atd.. Může se jednat o indukovatelný nebo represibilní promotor.
Jinak může nukleová kyselina rovněž obsahovat a to zejména před terapeutickým genem signální sekvenci směrující syntetizovaný terapeutický produkt do sekrečních cest cílové buňky. Tato signální sekvence může být tvořena přirozenou signální sekvencí terapeutického produktu, i když se může • 4«
·· to··· • · • ··♦ • · · · « · ··
rovněž jednat o každou jinou funkční signální sekvenci nebo o umělou signální sekvenci. Nukleová kyselina muže rovněž obsahovat signální sekvenci směrující syntetizovaný terapeutický produkt do specifické oblasti buňky.
V rámci jiné formy provedení se vynález týká kompozic obsahujících nukleovou kyselinu, nárokovaný lipopolyamin a přísadu schopnou přidružit se ke komplexu lipopolyaminua nukleové kyseliny a zlepšit tak rezultující transfekční potenci. Přihlašovatel skutečně prokázal, že transfekční potence lipopolyaminů může být neočekávatelně zvýšena v přítomnosti některých přísad (lipidy, peptidy nebo proteiny jsou příklady takových přísad), které jsou schopné spojit se s komplexem lipopolyamin/ nukleová kyselina.
V rámci tohoto zjištění mohou kompozice podle vynálezu obsahovat jako přísadu jeden nebo několik neutrálních lipidů. Takové kompozice jsou obzvláště výhodné zejména v případě, kdy je poměr R nízký. Přihlašovatel ve skutečnosti prokázal, že přídavek neutrálního lipidu umožňuje zvýšit tvorbu nukleolipidových částic a překvapivě podpořit penetraci částice do buňky na základě destabilizace její membrány.
Výhodně jsou neutrálními lipidy použitými v rámci vynálezu lipidy se dvěma mastnými řetězci.
Výhodně se používají přírodní lipidy, syntetizované lipidy, zwitterionové lipidy nebo lipidy zbavené za fyziologických podmínek iontového náboje. Tyto lipidy mohou být zvoleny zejména z množiny zahrnující dioleoylfosfatidylethanolamin (DOPE), oleoyl-palmitoylfosfatidylethanolamin (POPE), di-stearoyl, -palmitoyl, -mirystoylfosfatidylethanolaminy, jakož i jejich 1- až 3-krát N-methylované deriváty, fosfatidylglyceroly, diacylglyceroly, glykosyldiacylglyceroly, cerebrosidy (zejména galaktocerebrosidy), sfingolipidy (zejména sfingomyeliny) nebo také asialogangliosidy (zejména asialoGM1 a GM2).
• * « · • · * * ·
- 21 ·* «··· ·♦ «··· * · · • · ··♦ • · · • * » w· ··· ·· ·· • · ·· • ··· • ·»· ·· » · · t ··«
Tyto různé lipidy mohou být získány bud syntézou nebo extrakcí z orgánů (například z mozku) nebo z vajíček o sobě známými klasickými technikami. Taková extrakce lipidů přírodního původu může být zejména provedena za použití organických rozpouštědel (o tom viz například: Lehninger, Biochemistry).
V bezprostřední minulosti přihlašovatel prokázal, že je rovněž obzvláště výhodné použít jako uvedenou přísadu sloučeniny působící přímo nebo nepřímo v úrovni kondenzace uvedené nukleové kyseliny (WO96/25508).
Přítomnost takové kyseliny v transfekční kompozici na bázi lipopolyaminu umožňuje výrazně snížit množství tohoto Činidla, což má příznivé důsledky v toxikologické rovině, aniž by přitom došlo k jakémukoliv zhoršení transfekční účinnosti uvedené kompozice. Naopak tato transfekční kompozice vykazuje vyšší míru transfekční aktivity.
Sloučeninou působící v úrovni kondenzace nukleové kyseliny se zde rozumí sloučenina, která přímo nebo nepřímo zhutňuje nukleovou kyselinu. Přesněji specifikováno, může tato sloučenina působit přímo v úrovni nukleové kyseliny určené k transfekci nebo může zasahovat v úrovni přilehlé sloučeniny, která je přímo implikována v kondenzaci uvedené nukleové kyseliny. Výhodně uvedená sloučenina působí přímo v úrovni nukleové kyseliny.
V rámci výhodné formy provedení zasahuje toto činidlo v úrovni kondenzace nukleových kyselin a je tvořeno zcela nebo částečně peptidovými motivy (KTPKKAKKP) nebo/a (ATPAKKAA), přičemž počet těchto motivů se může pohybovat od 2 do 10.
Ve struktuře sloučeniny podle vynálezu se mohou tyto motivy opakovat kontinuálně či nikoliv. Takto mohou být tyto motivy odděleny vazebnými členy biochemického charakteru, například jednou nebo několika aminokyselinami, nebo chemického charakteru. Takové činidlo může být rovněž odvozeno zcela nebo částeč- 22 ·· 9 ·
A • · *··· a a· • ·4 ·· • ·· · • ·a • a »· ·· • a · a a a aa k·· a a a a > aa *» ně od histonu, nukleolinu, protaminu nebo/a některého z jejich derivátů.
Výhodně kompozice podle vynálezu obsahují 0,01 až 20 ekvivalentů přísady na jeden ekvivalent nukleových kyselin, uvažováno hmotnostně, výhodněji 0,5 až 5 ekvivalentů přísady na jeden ekvivalent nukleových kyselin.
Kompozice podle vynálezu mohou být formulovány do galenických forem vhodných pro topické, kutánní, orální, rektální, vaginální, parenterální, intranasální, intravenózní, intramuskulární, sub-kutánní, intraokulární, transdermální a jiné podání. Výhodně obsahují farmaceutické kompozice podle vynálezu farmaceuticky přijatelný nosič pro injikovatelnou formulaci, zejména pro přímou injekci v úrovní požadovaného orgánu, nebo pro podání topickou cestou (na pokožku nebo/a sliznici). Může se zejména jednat o sterilní isotonické roztoky nebo o suché kompozice, zejména lyofilizované, které po přidání vody nebo fyziologického roztoku umožní rekonstituci injikovatelných tekutin. Dávky nukleové kyseliny použité pro injekci, jakož i počet podání mohou být určeny v závislosti na různých faktorech a zejména v závislosti na použitém způsobu podání, na léčeném patologickém stavu, na exprimovaném genu nebo také na požadované délce léčení. Pokud jde o způsob podání, může se zejména jednat o přímou injekci do tkání nebo krevního oběhu nebo o ošetření buněčné kultury a její následnou reimplantaci in vivo prostřednictvím injekce nebo roubu.
Vynález takto poskytuje obzvláště výhodný způsob léčení chorob zahrnující podání in vitro nebo in vivo nukleové kyseliny schopné korigovat uvedenou chorobu a sdružené se sloučeninou obecného vzorce I za výše uvedených podmínek. Tento způsob je zejména aplikovatelný na nemoci, jejichž příčinou je nedostatek určitého proteinového nebo nukleového produktu, přičemž podaná nukleová kyselina kóduje uvedený proteinový
• ·· ·· ···· ·· ··
·· · · • · • • · • •
• · • · ··· • · ··
• · · • · • · ·· · • •
• · • · • • • •
··· ···· ·· 9·· ·· ··
produkt nebo obsahuje uvedený nukleový produkt.
Vynález se vztahuje na každé použití lipopolyaminu podle vynálezu pro transfekci buněk in vivo nebo in vitro.
V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí příkladů jeho konkrétních provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen formulací patentových nároků.
Stručný popis obrázků
Obr.1 znázorňuje míru transfekční účinnosti po ošetření buněk NIH 3T3 (embryonální myší buňky - fibroplasty)-různými kationtovými lipidy.
Obr.2 znázorňuje míru transfekční účinnosti po ošetření králičích buněk SMC (primární kultura buněk hladkých svalů králičí aorty) různými kationtovými lipidy.
Obr.3 znázorňuje míru transfekční účinnosti po ošetření buněk 3LL (pulmonární Lewisův karcinom) různými kationtovými lipidy.
Obr.4 znázorňuje míru transfekční účinnosti po ošetření buněk NIH 3T3 (embryonální myší buňky - fibroplasty) různými kationtovými lipidy.
Obr.5 znázorňuje vliv koncentrace DOPE na transfekční účinnost buněk 3LL.
Obr.6 znázorňuje transfekci buněk NIH 3T3 za použití obměňovaných množství DNA a při stabilním poměru nanomoly lipofektantu/ ^ug DNA.
• ·
Použité zkratky a symboly:
AcOEt ethylacetát
BOC terc-butoxykarbonyl
BOP benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát
DCC dicyklohexylkarbodiimid
DCU dicyklohexylmočovina
DMAP 4-dimethylaminopyridin
DMF dimethylformamid
DMSO dimethylsulfoxid
DODÁ dioktadecylamin
EP petrolether
EzOH ethanol
NEt3 Rf triethylamin retenční frontální koeficient
TFA kyselina trifluoroctová
THF tetrahydrofuran
TMS tetramethylsilan
UV ultrafialové záření
SPPS syntéza peptidu v pevné fázi
CLHP vysokotlaká kapalinová chromatografie
Z benzyloxykarbonyl
C1Z p-chlorbenzyloxykarbonyl
A) Látky a metody použité pro chemické syntézy
D Látky
a) Sloučeniny
Výchozí polyaminy jsou komerčně dostupné, například: spermidin, spermin, tris(2-aminoethylamin, fenylendiamin, diaminoethan (propan, butan, pentan, hexan, atd.), nebo mohou být synteti zovány klasickými postupy, například úplnou kyanoethylací komerčně dostupných aminů, jakými jsou diami• ·
·· ···· ·· ·· • · ♦ · · · · • · ♦ · · · ··· • · ·· · · · · · • · · · · · ·· ··· · · · · ethan (propan, butan, pentan, hexan, atd.)amin, spermidin, spermin, za vzniku rozvětvených polyaminů.
Alkylační činidla se zvolí v závislosti na použité alkylační metodě následujícím způsobem:
pro klasickou alkylaci: kyselina bromoctová, kyseliny omegahalogenkarboxylové, pro redukční alkylaci: kyselina omega-aldehydkarboxylová, jako kyselina glyoxalová, semialdehyd kyseliny jantarové, atd., nebo ketokyselina, jako kyselina acetooctová nebo kyse lina pyrohroznová.
Použitými polymery jsou pryskyřice komerčně dostupné pro syntézu peptidů v pevné fázi (Merrifieldova syntéza), například pryskyřice typu Chlortritylchlorid, pryskyřice HMP, které poskytují produkty nesoucí volné kyselinové funkce, nebo pryskyřice typu Rink. Polyaminokyseliny mohou být syntetizovány přímo na předběžně syntetizovaném peptidu na pevné fázi nesoucím bromalkylovou funkci nebo w-aldehyd-kyselinu.
Dioktadecylamin, triethylamin, kyselina trifluoroctová, BOP, DMAP, benzylchlorformiát od firmy Aldrich jsou komerčně dostupné produkty. Roztoky NaCl a NaHCO^ jsou nasycenými roztoky. Roztok KHSO^ má koncentraci 0,5 M.
b) Fyzikální měření
Protonové nukleární magnetickorezonanční spektrum bylo zaznamenáno na spektrometrech Bruker 400 a 600 MHz.
Hmotová spektra byla získána na zařízení API-MS/III.
c)
Chromatografické techniky
Vysokotlaké kapalinové chromatografie byly provedeny • · ·· · ·
9
9·
99-.
9 9 9 9 9 99
999 9999 99 999 9999
- 26 na zařízení Merck-Hitachi vybaveném automatickým vzorkovačem AS-2000A, inteligentním čerpadlem L-6200A a detektorem UV L-4000 s regulovatelnou vlnovou délkou nastavenou na 220 nm pro analytické separace a na 235 nm pro preparativní separace. Jako kolony pro analytické separace se použijí kolony BU-300 aquapore Butyl 7m, 300 A 300x4,6 od firmy Perkin-Elmer a pro preparativní separace se použijí kolony BiosilC18HL 90-10 250x10 mm od firmy Biorad. Mobilními fázemi jsou ř^O (0,1% TFA) a acetonitril (0,1% TFA). Průtok je při analytických separacích nastaven na 1 ml/min, zatímco při preparativní ch separacích je nastaven na 4 ml/min.
*»
Chromatografie na tenké vrstvě (CCM) byly provedeny na deskách silikagelu Měrek majících tlouštku 0,2 mm.
Chromatografie na koloně byly provedeny na sloupci silikagelu 60 Měrek s granulometrií 0,063-0,200 mm.
Desky jsou vyvolány buá ultrafialovým zářením (při 254 nm), nebo ninhydrinem za použití náprášení (jemný postřik) ethanolického roztoku ninhydridu (40 mg/100 ml EtOH) a zahřátí na teplotu 150 °C za účelem detekce aminů nebo amidů, anebo fluorescaminem za použití náprášení roztoku s koncentrací 40 mg/100 ml acetonu za účelem detekce primárních aminů, anebo konečně jodem, přičemž se deska pokryje práškovým jodem.
d) Technika syntézy v pevné fázi SPPS
Syntéza v pevné fázi se provede v manuálním reaktoru pro syntézu peptidů SPPS zhotoveném řemeslným způsobem, přičemž reaktor je vybaven míchadlem Flask Shaker, model A56021. Průběh kopulace polyaminů k pevné fázi, jakož i průběh ochrany polyaminů v SPPS je sledován Kaiserovým testem /Kaiser, E, Colescolt,D.L.,Bossinger,C.D. a Cook,P.I.,Anal.Biochem. 34(2), 595 (1970)/. Pryskyřicí použitou v příkladech pro syntézu SPPS je Chlortrityl chloride Resin od firmy Novabio• · • · * · · · · · ·· · · · ♦ · ···· • · · ···· · · · · • * ·· · · · · · · · · • · ·· · ··· ······· ·· ··· ·· ··
- 27 chem, Švýcarsko.
2) Obecná metodika
a) Syntéza symetrických polaminů ilustrovaná přípravou (Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraaminopropyl)-1/4-diaminobutanu
Do tříhrdlé baňky o obsahu 2 litrů se předloží 147 g
1,4-diaminobutanu a 1000 ml demineralizované vody. Roztok v baňce se míchá magnetickým míchadlem. Při zachování teploty 38 °C se do baňky zavede v průběhu jedné hodiny pomocí iso-
Λ barické nálevky 443 g akrylonitrilu. K baňce se potom připojí chladič pro destilaci se zpětným tokem a obsah baňky se zahřívá na vodní lázni na teplotu 80 °C po dobu jedné hodiny. Test na fluoresdamin je negativní a přebytek akrylonitrilu se odpaří za vakua při teplotě 40 °C.
Takto se získají dvě fáze. Spodní organická fáze se oddělí, promyje 300 ml vody a převede do baňky o obsahu 1000 ml. Přidá se 170 ml směsi vody a methanolu v objemovém poměru 1:1. Směs se ponechá krystalizovat přes noc. Následující den se krystaly odfiltrují za použití skleněné frity s pórozitou 3. Filtrační koláč se promyje methanolem (2 x 170 ml) a etherem (2 x 150 ml). Produkt se vysuší na podložce v exsikátoru za vakua (3,5 kPa) přes noc. Takto se získá 461 g produktu (výtěžek: 93 %). Produkt se analyzuje nukleární magnetickorezonanční spektroskopií a hmotovou spektroskopií, přičemž se získají kompatibilní výsledky. Produkt se potom hydrogenuje bez jakéhokoliv dalšího čištění.
Do autoklávu z nerezavějící oceli o obsahu 1 litru se předloží 30 g předcházejícího polynitrilu (0,1 molu). V kádince se připraví roztok 140 ml ethanolu (95%) a 8 g hydroxidu sodného (0,2 molu). Když je hydroxid sodný rozpuštěn, zavede se získaný roztok do autoklávu. Autokláv se propláchne dusíkem a do autoklávu se zavede 8 ml Raneyova niklu na uhlí.
• ·
Autokláv se uzavře. Výchozí tlak vodíku činí 5,2 MPa a tento tlak v průběhu 5 hodin při okolní teplotě klesne na 2,85 MPa. Rezultující hydrogenační suspenze se zfiltruje přes papírový filtr, filtrační koláč se promyje ethanolem (2 x 25 ml) a filtráty se zahustí za vakua k suchu. Získaný olej se smísí s 30 ml vody a extrahuje 100 ml methylenchloridu. Organická fáze se vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltruje a potom odpaří za vakua. Takto se získá nažloutlá olejovitá kapalina (27 g, výtěžek: 85 %).
Získaný produkt se potom analyzuje chromatografií na tenké vrstvě (zde se získá pouze jediná skvrna), nukleární'' magnetickorezonanční chromatografií a hmotovou chromatografií, přičemž se získají kompatibilní výsledky. Získaný produkt se použije v dalším reakčnim stupni bez jakéhokoliv dalšího čištění .
b) Metoda A: Ukotvení kyselinové funkce na polymerním nosiči
Do reaktoru se zavede pryskyřice Chlorotrityl chloride (5 g, 1,2 mmolu Cl./g pryskyřice), přičemž reaktor je specificky určen pro syntézu SPPS, načež se do reaktoru přidá 50 ml methylenchloridu a získaná směs se míchá po dobu 5 minut. Potom se přidá kyselina bromoctová (1,05 g, 7 mmolů) a DIEA (0,95 ml, 7,5 mmolu). Obsah reaktoru se míchá po dobu dvou hodin při okolní teplotě. Rezultující kapalina se zfiltruje a pryskyřice se promyje methylenchloridem a isopropylalkoholem (10 x 50 ml) a potom ještě methylalkoholem (2 x 50 ml). Nakonec se pryskyřice vysuší pod proudem dusíku.
c) Metoda B: Reakce polyaminů s bromacetyl-pryskyřicí
Polyamin (10-násobný molární přebytek) se rozpustí v 50 ml methylenchloridu a roztok se zavede do reaktoru obsahujícího produkt získaný metodou A. Reaktor se míchá po dobu • · · ·
- 29 dvou hodin při okolní teplotě. Rozpouštědlo se odstraní filtrací a pryskyřice se promyje methylenchloridem a isopropylalkoholem (10 x 50 ml). Kaiserův test je pozitivní.
d) Ochrana polyaminokyselin na pryskyřici
Metoda C:
Di-terc.butyldikarbonát (48 mmolů) a DIEA (50 mmolů) se rozpustí v methylenchloridu (50 ml) a získaný roztok se zavede do reaktoru obsahujícího produkt získaný metodou B.
z Z Z >
Obsah reaktoru se potom mícha pres noc. Druhý den poskytuje Kaiserův test negativní výsledek. Rozpouštědlo se odstraní filtrací a pryskyřice se promyje střídavě methylenchloridem a isopropylalkoholem (10 x 50 ml), methylalkoholem (2 x 50 ml) a etherem (2 x 50 ml). Pryskřice se vysuší pod proudem dusíku. Kaiserův test je stále negativní.
Metoda D:
Pryskyřice získaná metodou B (1,5 g) se zavede do baňky a k obsahu baňky se přidá methylenchlorid (20 ml) a potom ještě DIEA (20 mmolů). Obsah baňky se míchá magnetickým míchadlem, načež se do baňky přidá v průběhu 5 minut a po kapkách benzylchlorformiát (14 mmolů). pH se udržuje na hodnotě 11 přidáváním DIAE. Po proběhnutí noci se pryskyřice převede do reaktoru SPPS, zfiltruje a alternativně promyje methylenchloridem a isopropylalkoholem (10 x 20 ml) a etherem (2 x 20 ml). Pryskyřice se vysuší pod proudem dusíku.
e) Metoda E: Odštěpení chráněných polyaminokyselin z pryskyřice
Pryskyřice získané metodami C a D se zavedou do baňky o obsahu 250 ml, vybavené magnetickým míchadlem. Do baňky se potom přidá roztok tvořený 50 ml methylenchloridu a 25 ml • ♦· ·· ······ ·· ···· ······· • · · ····· ··· » · · · · · · ··· · · • · · · ···· ·*····· ·· · · · · · * ·
- 30 CF^CH^OH a získaná směs se míchá po dobu dvou hodin. Roztok se zfiltruje, pryskyřice se promyje methylenchloridem (2 x 10 ml) a takto získané organické fáze se sloučí a odpaří za vakua. Produkty se potom přečistí mžikovou chromatografií na silikagelu, přičemž se jako eluční soustava použije směs CHCl^ a methanolu v objemovém poměru 9:1. Frakce obsahující požadované produkty se identifikují pomocí chromatografie na tenké vrstvě (postup je detailněji popsán v dále zařazených příkladech).
f) Metoda F: Kopulace aminokyselin s dilipidylaminy
Boc-aminokyselina (10 mmolů) a dilipidylamin s 12 až 22 uhlíkovými atomy (10 mmolů) se zavedou do baňky o obsahu 250 ml. Do baňky se potom přidá chloroform (100 ml) a obsah baňky se míchá až do okamžiku, kdy je veškerý pevný podíl rozpuštěn. Potom se do baňky přidá TEA (30 mmolů) a BOP (33 mmolů). pH se udržuje na hodnotě 10 pomocí kyseliny trifluoroctové, přičemž se obsah baňky míchá po dobu dvou hodin. Po ukončení reakce (detekováno chromatografií na tenké vrstvě) se chloroform odpaří a pevný podíl se vyjme ethylacetátem (300 ml). Organická fáze se promyje hydrogensíranem draselným (4 x 100 ml), hydrogenuhličitanem sodným (4 x 100 ml) a chloridem sodným (4 x 100 ml). Organická fáze se vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltruje a odpaří za vakua. Produkty se analyzují chromatografií na tenké vrstvě, nukleární magnetickorezonanční spektroskopií a hmotovou spektroskopií a použijí v dalším reakčním stupni bez jakéhokoliv dalšího čištění. Výtěžky produktů jsou asi 90 %.
g) Kopulace chráněných polyaminokyselin s dilipidylamidy kyselin a odštěpení ochranných skupin Boc a Z metoda G
Produkt získaný metodou F (9 mmolů) se zavede do baň- 31 ·· · · 9 · « · • · · · ky vybavené magnetickým míchadle, načež se do baňky přidá chladná kyselina trifluoroctová (4 °C) v množství 30 ml. Roztok se míchá po dobu jedné hodiny. Kyselina trifluoroctová se odpaří za vakua. Produkt se rozpustí přidáním dimethylformamidu (70 ml). Přidá se kyselina trifluoroctová (30 ml) a potom chráněná polyaminokyselina získaná metodou E (9 ml). pH se nastaví na hodnotu 10, načež se přidá BOP (33 mmolů).
Roztok se míchá po dobu dvou hodin, načež se provede analýza vzorku reakční směsi chromatografií na tenké vrstvě. Když je kopulace ukončena (stanoveno chromatografií na tenké vrstvě), přidá se roztok hydrogensíranu draselného (700 ml) a produkt se extrahuje ethylacetátem (3 x 100 ml). Organická fáze se promyje hydrogensíranem draselným (3 x 50 ml), hydrogenuhličitanem sodným (3 x 50 ml) a chloridem sodným (3 x 50 ml), vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltruje a odpaří za vakua. Produkty se analyzují nukleární magnetickorezonanční spektroskopií, chromatografií na tenké vrstvě a hmotovou spektroskopií, načež se provede jejich deprotekce a takto získané produkty se použijí dále bez jakéhokoliv dalšího čištění. K produktu se přidá kyselina trifluoroctová (50 ml) a získaný roztok se míchá po dobu 1,5 hodiny, načež se kyselina trifluoroctová odpaří. Jestliže produkt obsahuje ještě skupiny Z nebo C1Z, které nejsou odštěpitelné kyselinou trifluoroctovou, potom se bezprostředně provede metoda H. Finální produkty se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií (o tom viz příklady).
Metoda H
Produkty získané metodou G obsahující skupinu Z nebo C1Z se zavedou do baňky opatřené magnetickým míchadlem, kde se rozpustí v 10 ml methanolu/g produktu. Potom se baňky přidá při okolní teplotě palladium na uhlí (10%, 1g/g produktu). Průběh hydrogenace se sleduje vysokotlakou kapalinovou chromatograf ií. Po dvou hodinách je reakce ukončena. Hydrogenační směs se zfiltruje a filtr se promyje 10 ml methanolu. Přidá *
·· ·· · · ·· ·· · · · ♦ · » «··· • · · · · · · · · ♦ · » · · · · ♦ · ··· · · • * ·· « ··· ·*· ···· ·· ··♦ ·· ··
- 32 se dvakrát destilovaná voda, načež se získaný roztok zmrazí a lyofilizuje. Finální produkty se přečistí preparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií.
h) Metoda I deprotekce ochranné skupiny Boc
K produktu obsahujícímu skupiny Boc (1 iranol) a předloženému do baňky se přidá kyselina trifluoroctová. Získaný roztok se míchá po dobu jedné hodiny a třiceti minut, načež se kyselina trifluoroctová odpaří. Rezultující amin je zcela zbaven ochranných skupin a je připraven k použití při kopulacích a to bez jakéhokoliv dalšího čištění.
B) Materiál a metoda pro biologickou studii
1) Plasmidy použité pro přenos genů in vitro
Plasmidem pCMV-LUC je konstrukce odvozená buď od plasmidu pGL2-Basic Vector (Promega) nebo od plasmidu pGL2-Control Vector (Promega) inzercí fragmentu Mlu I-Hind III obsahujícího promotor lidského cytomegaloviru (CMV) extrahovaný z vektorového plasmidu pcDNA3 (Invitrogen).
2) Protokol pro přípravu roztoků použitých pro trans- fekci
Produkty popsané v rámci vynálezu se převedou do roztoku (20 mm) v ethanolu nebo ve vodě, načež se zředí vodou tak, aby finální koncentrace ethanolu byla nižší než 10 %.
Roztoky nukleové kyseliny zředěné fyziologickým sérem (NaCL 0,15 M) se přidají k roztokům lipofektantu v poměru 1:1 (hm./hm.). Po homogenizaci rozmícháním a 15 minutové inkubaci při okolní teplotě se roztoky DNA/lipofektant distribuují (9% obj./obj. finálně) do jamek titrační plotny, kde byly buňky promyty růstovým kultivačním prostředím zbaveným proteinů (sérum), a převedou na růstové prostředí zbavené či nezba• 999
- 33 99♦· • 9 9·
999
9 9 99
99
9999
vené séra.
C) Materiál pro testy in vivo
1 ) Materiál
a) Experimentální modely:
-dospělé myší samičky C57/BL6 (starší než 8 týdnů)
-nádory typu 3LL (Lewis-Lungův karcinon) získané přenosem nádorových fragmentů ze zvířete na zvíře a implantované pod kůži v úrovni boku.
b) Použité plasmidy pXL 2622: je odvozen od pGL2 basic (Promega, do kterého byl inzerován promotor cytomegaloviru (CMV) extrahovaný z plasmidu pCDNA3 (Invitrogen) před genem kódujícím luciferázu. Tento plasmid byl získán technikou srážením PEG (Ausubel) a přechováván v Tris-pufru, 10 mM EDTA, pH 8, při teplotě 4 °C a koncentraci asi 1O^ug DNA na mikrolitr.
2) Protokoly
Injikované roztoky: DNA určená k transfekci se nejdříve solubilizuje v pufru, načež se přidá peptid (KTPKKAKKP^ SEQ ID n°1 a po 20 minutách se ke směsi přidá vysoce koncentrovaný (20 nebo 40 mM) roztok kationtových lipidů. Po přidání všech produktů směs obsahuje kromě DNA (ve finální koncentraci 0,5 mg/ml) peptid (0,75 mg/ml) , kationtový lipid, NaCl 150 mM, D-glukózu 5 % a MES 5 mM, při pH 6,2. Injekce se provede 20 až 30 minut po přípravě roztoku.
- 34 φφφ · φ φ • · • φ φφφ φφφφ
ΦΦ φφφφ •φ •»♦· φ
Φ Φ Φ Φ
Φ Φ Φ
ΦΦ ΦΦΦ
ΦΦ ΦΦ
ΦΦ Φ *
ΦΦ ΦΦ
ΦΦΦΦΦ
Φ ΦΦ
ΦΦ ΦΦ
Syntéza H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN/(CH2)}?CH3/2 (6)
a) Syntéza kyseliny /Boc-/3-(Boc-/4-/Boc-( 3-Boc-aminopropyl)amino/butyl/amino)propyl/amino/octové (3)
Pryskyřice získaná metodou A se uvede v reakci se sperminem metodami B, C a E. Chráněný produkt se přečistí chromátografií na silikagelu. Výtěžek činí 40 %.
Chromatografie na tenké vrstvě:
Rf = 0,32 (CHCl3/methanol v objemovém poměru 9:1), vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R^_ = 4,22 min (voda/MeCN: 3 min /40:60/, 3-20 min /0:100/, min /0:100/, ^-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
(400 MHz, ,/CD3)2SO d6 s přídavkem několika kapek CD3COOD d4, delta v ppm)
1,40(4s,36H:C(CH3)3) ,
1,46(mt,4H:CH2CH2 centrální butylu),
1,64 a 1,74(2mts,2H každý:CH2 centrální propylů), 2,96(t,J=7Hz,2H:CH2NCOO),
3,15(mt,8H:CH2NCH2), 3,23(t,J=7,5Hz,2H:CH2NCOO), 3,83(s,2H:OCONCH2COO), hmotové spektrum:
MH+ 661 .
b) Syntéza kyseliny /Z-/3-/Z-/4-/Z-(3-Z-aminopropyl)amino/butyl/amino) propyl/amino./octové ( 4 )
Pryskyřice získaná metodou A se uvede v reakci se sperminem metodami B, C a D. Chráněný produkt se přečistí chromatograf ií na silikagelu. Výtěžek činí asi 20 %.
Chromatografie na tenké vrstvě:
Rf = 0,85 (CHCl3/MeOH v objemovém poměru 8:2), vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =6,92 min, ./voda/MeCN: 3 min/4O: 60/, 3-20 min/0:100./, 35
- 35 ·♦ ··♦ · t·· • · ·· · ··to· • to· ·· ··· min/O:100/, ^Η-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
( 400 MHz, (CD^^SO d6, při teplotě 413K, delta v ppm) 1,49(mt,4H:CH2CH2 centrální butylu),
1,74 a 1,81(2mts,2H každý:CH2 centrální propylů), 3,07(q,J=7Hz,2H:CH2NCOObenzyl), od 3,15 do 3,30(mt,8H:CH2NCH2),
3,33(t,J=7,5Hz,2H:NCH2COO),
3,70(s,2H:OCONCH2COO),
5,07-5,10-5,12 a 5,13(4s,2H každý:ArCH2OCON),
6,65(mf,1H:NHCO), od 7,25 do 7,40(mt,20H:H aromatické), hmotové spektrum:
MH+ 797.
c) Boc-Gly-Dioktadecylamid (5)
Boc-Gly se kopuluje s dioktadecylaminem za použití metody F. Výtěžek činí 90 %.
Chromatografie na tenké vrstvě:
Rf = 0,9(CHCl^/MeOH v objemovém poměru 9:1) hmotové spektrum:
MH+=679, 1H-nukleární magnetickorezonanční spektrum: (300 MHz, CDCl^, delta v ppm)
0,89(t,J=7 Hz,6H:CH3),
1,29(mt,60H:CH2 centrální mastných řetězců),
1,49(s,9H):C(CH3)3),
1,55(mt,4H:1 CH2 každého mastného řetězce),
3,15 a 3,33(2t,J=7,5Hz,2H každý:NCH2 mastných řetězců), 3,95(d,J=5Hz,2H:OCONCH2CON),
5,57(mf,1H:CONH).
d)
H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN/(CH2)1θ/2
Produkty (3) a (5) nebo (4) a (5) se kopulují za použi- 36 -
tí metody G. Produkty se zbaví ochranných skupin postupy popsanými v rámci metody G v případě produktu chráněného ochrannou skupinou Boc nebo v rámci metody H v případě produktu chráněného skupinou Z. Produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují vysokotlakou kapalinovou chromatografií.
Vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R = 15,35 min (H2O/MeCN: 3 min/40:60/, 3-20 min/0:100/, min/0:100/, ^H-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
(BYK 2 053, 400 MHz, (CD^^SO d6 s přídavkem několika kapek CD^COOD d4, při teplotě 300K, deptá v ppm) 0,83(t,J=7Hz,6H:CH3),
1,23(mt,60H:CH2 centrální mastných řetězců),
1,43 a 1,53(2mts,2H každý: 1 CH2 každého mastného řetězce),
1,63(mt,4H:CH2CH2 centrální butylu),
1,96(mt,4H:CH2 centrální propylů),
2,93-3,00 a 3,22(3mts,16H celkem:NCH2), 3,83(s,2H:NCH2CON), 4,03(s,2H:CONCH2CON), hmotové spektrum:
MH+=821.
Příklad 2
Syntéza H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CON/(CH2)]θ/2 (7)
Produkt (3) se kopuluje s dioktadecylaminem za použití metody F, načež se zbaví ochrany za použití metody G. Produkt se potom přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují vysokotlakou kapalinovou chromatografií.
vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =15,2 min,(H2O/MeCN: 3 min/40:60/, 3-20 min/0:100/, min/0:100, ^Η-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
(400Mhz, ve směsi 2/3 CF3COOD a 1/3 CD3COOD dč, delta v ppm) • ♦ * · 4> ♦ ♦ · ·· ·· « ♦ ♦ ♦ » · ·· · • · · · ··· ♦ ··♦ « ♦ · · · ·«·····
9 9 9 9 9 99
999 9999 99 999 9999
- 37 0,78(t,J=7Hz,6H:Ch3),
1,20(mt,60H:CH2 centrální mastných řetězců),
1,52(mt,4H:1 CH2 každého mastného řetězce),
1,80(mt,4H:CH2CH2centrální butylu),
2,23 a 2,32 (2 mts,2H každý:CH2 centrální propylů),
3,10 až 3,40(3 mts,16H celkem:NCH2),
4, 15(s,2H:NCH2CON), hmotové spektrum: MH+ = 764.
Příklad 3
Syntéza H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN/(CH2)1θ/2 (9)
a) Boc-Arg(Z2)-Dioktadecylamid
Produkt se syntetizuje kopulací BocArg(Z2) a dioktadecylaminu za použití metody F. Výtěžek činí 91 %. Chromatografie na tenké vrstvě:
Rf - 0,9(CHCl3/MeOH v objemovém poměru 9:1), hmotové spektrum:
MH+=1046.
b) H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN/(CH2)18/2 (9)
Produkt (3) nebo (4) se kopuluje s produktem (8) za použití metody G a zbaví ochrany za použití metody G v případě ochranné skupiny Boc nebo./a metody H v případě ochranné skupiny Z. Finální produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a frakce se analyzují analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =13,83 min, (H2O/MeCN: 3 min/40:60./, 3-20 min /0:100/, min /0:100/, ^Η-nukleární magnetickorezonanční spektrum: (400 MHz, (CD3)2SO d6, delta v ppm)
• · · · · • · · ·· ·· • 9 ♦ • ··
0,90(t,J=7Hz,6H:CH3),
1,28(mt,60H:CH2 mastných řetězců), od 1,40 do 1,80(mt,12H:CH2),
1,9 3(mt,4H:CH2 centrální propylů), od 2,80 do 3,10(mt,16H:NCH2 a NCH2 mastných řetězců), 3,42(mt,2H:CH2N amido-skupiny),
3,77(mt,2H:NCH2CON),
4,67(mt,1H:NCHCON), od 6,80 do 7,50(mf rozlož.,2H:NH2),
7,78-7,92-8,80 a 9,03 (mt resp. 3mfs, 1H-2H-4H resp. 1H:
CONH-NH a NH2), hmotové spektrum:
MH+ = 920.
Příklad 4
Syntéza H2N(CH2 ) 3NH(CH2 ) 4NH(CH2 ) 3NHCH2COArg( Z ) 2N./(CH2 ) 1 ?CH3/2 ( 10)
Produkt (3) se kopuluje s produktem (8) za použití metody G a skupiny Boc se odštěpí za použití téže metody. Produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií: vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =17,75 min, (H2O./MeCN: 3 min /40:60/, 3-20 min /0:100/, min /0:100/, ^Η-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
(400MHz, (CD3)2SO, d v ppm)
0,87(t,J=7Hz,6H:CH3),
1,25(mt,60H:CH2 centrální mastných řetězců),
1,40 a 1,57(2mts,2H každý: 1 CH2 každého mastného řetězce),
1,65(mt,8H:CH2CH2 centrální butylů),
1,95(mt,4H:CH2 centrální propylů), od 2,85 do 3,05(mt,15H celkem:NCH2),
3,23(t,J=7,5Hz,2H:NCH2),
3,75(s,2H:NCH2CON), ··!· • 4
- 39 3,85 a 3,95(2mts, 1H každý: Ch^NC),
4,67(mt,1H:C0NCHC0N),
5,07 až 5,25 (AB limit, resp.s, J=13,5Hz,2H každý:NCOOCH^Ar), od 7,25 do 7,45(mt,10H:H aromatické),
7,95-8,85-9,00 a 9,20(4mfs:H zaměnitelné), hmotové spektrum:
MH+ = 1188.
Příklad 5
Syntéza H2N(CH2)^NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(rhodamin)N/(CH^) ]?Ch3/2 (13)
a) Boc-Lys(Z)-Dioktadecylamid (11)
Produkt a) se syntetizuje kopulací BocLys(ClZ) s dioktadecylaminem za použití metody F.
Výtěžek: 89 %:
chromatografie na tenké vrstvě:
Rf = 0,92 (chloroform/methanol v objemovém poměru 9:1), hmotové spektrum:
MH+ = 918.
b) BocHN(CH2)3NBoc(CH2)4NBoc(CH2)3NBocCH2COLys(C1Z)N/(CH2)17-CH3/2 (12)
Produkt (3) se kopuluje s produktem (11) za použití metody G (bez deprotekce Boc):
1H-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
(400 MHz, (CD3)2SO d6, při teplotě 423K, delta v ppm)
0,92(t,J=6,5Hz,6H:CH3),
1,32(mt,60H:CH2 centrální mastných řetězců),
1,44(2s,36H celkem:C(CH3)3), od 1,50 do 1,80(mt,16H:1 CH2 od každého mastného řetězceCH2CH2 centrální butylu-CH2CH2CH2 a CH2 centrální propylu), 3,00(q,J=6,5Hz,2H:OCONCH2), • · · * 9 · · ·· ··« ·
3,05(q,J=6,5Hz,2H:CH2NCOO), od 3,15 do 3,40(mt,14H:NCH2 mastných řetězců-CH2NCH2 a ch2nch2ch2n),
3,80(s,2H:OCONCH2CON),
4,75(mt,1H:CONCHCON), , 1 5 ( s, 2H: NCOOCI^Ar) ,
5,97 a 6,53(2mts,1H každý:OCONH a NHCOO),
7,08(d,J=7,5Hz,1H:CONH), od 7,30 do 7,50(mts,4H:H aromatické).
c) H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(rhodamin)N- /(CH2)17-CH3/2 (13)
Skupina C1Z na lysinu produktu (12) se odštěpí metodou H, načež se takto získaný produkt vysuší za vakua, vyjme etherem a promyje hydrogenuhličitanem sodným a chloridem sodným. Ether se vysuší nad síranem horečnatým a odpaří za vakua.
tok se míchá po dobu 17 hodin, přičemž se reakce sleduje chromatografií na tenké vrstvě. Nazítří se roztok zahustí k suchu za vakua. Přidá se kyselina trifluoroctová (4 ml) a směs se míchá po dobu jedné hodiny. Kyselina trifluoroctová se potom odpaří a surový produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Finální výtěžek činí 30 %: chromatografie na tenké vrstvě:
Rf = 0,05 (methanol), vysokotlaká kapalinová chromatografie (semipreparativní):
R = 61,55 min,(H2O/MeCN: 3 min/100:0/, 3-45 min/0:100/, 45-140 min /0:100/, hmotové spektrum:
MH+ = 1335.
Příklad 6 • v ··· ·
- 41 Syntéza H2N(CH2)^NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(biotinyl)N/(CH2)17-CH3/2 (14)
Produkt (12) se zbaví ochrany za použití metody H (271 mg, 0,21 mmolu) a rozpustí v dimethylformamidu (10 ml). Přidá se DIEA (0,11 ml) a potom biotin (56,4 mg, 0,23 mmolu) a BOP (102 mg, 0,23 mmolu), přičemž se pH udržuje na hodnotě 10 (DIEA) a konec reakce se ověří fluorescaminem. Produkt získaný způsobem popsaným v rámci metody F se zbaví ochrany bez jakéhokoliv dalšího čištění za použití kyseliny trifluoroctové (5 ml) působící po dobu jedné hodiny. Kyselina tri··> fluoroctová se potom odpaří a získaný produkt se přečistí semipreparativní chromatografií.
Výtěžek činí 50%: vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =13,12 min,(H2/MeCN: 3 min/40:60/, 3-20 min/0:100/ min/0:100/, hmotové spektrum: MH+ = 1118.
Příklad 7
Syntéza /H2N(CH2 ) 3/2N(CH2 ) 4N/ (CH2 ) 3NH2./ (CH2 ) 3NHCH2COGlyN/(CH2)1?CH3/2 (16)
a) /BocNH(CH2)3/2N(CH2)4N/(CH2)3NHBoc/(CH2)3NBocCh2COOH (15)
Produkt (1) se ukotví na polymeru za použití metody B, chrání za použití metody C a odštěpí z pryskyřice za použití metody E. Získaný produkt se přečistí na silikagelu. Výtěžek činí 35 %: chromatografie na tenké vrstvě:
Rf = 0,2(chloroform/methanol v objemovém poměru 8:2) ^H-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
(400 MHz,(CD3)2SO d6 s přídavkem několika kapek CD3COOD d4, při teplotě 433K, delta v ppm)
- 42 ♦··
4· ·· •I • ·· • · ·»9···« • · · · · * « ·· • ♦··» • ·· • ·· ·· ··· ··» ·· ·· · ♦« •· · * • ····« • ·· ··
1,42(s,36H:C(CH3)3,
1,56(mt,4H:CH2CH2 centrální butylu), od 1,65 do 1,85(mt,8H:CH2 centrální propylů), 2,76(mt,12H:CH2N(CH2)2,
3,06(t,J=6,5Hz,6H:OCONCH2),
3,29(mt,2H:NCH2),
3,86 ( s , 2H: OCONCf^COO) , hmotové spektrum:
MH+ = 775.
b) /H2N(CH2)3/2N(CH2)4N/(CH2)3NHCH2COGlyN/(Cf^ ) (16)
Produkt (15) se kopuluje s produktem (5) za použití metody G. Získaný produkt se zbaví ochrany za použití metody G, načež se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií a lyofilizují. Výtěžek činí 55 %: vysokotlaká kapalinová chromatografie: (semipreparativní): R = 38,72 min (^O/MeCN, 10 kin/100:0/, 10-45 min/0/100/, 45-140 min/0:100/, ^Η-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
(400 MHz, (CD3)~SO d6, při teplotě 386K, delta v ppm) 0,90(t,J=7Hz,6H:CH3),
1,30(mt,60H:CH2 centrální mastných řetězců),
1,55(mt,4H:1 CH2 každého mastného řetězce),
1,65(mt,4H:CH2CH2 centrální butylu),
1,97(mt,8H.-CH2 centrální propylů), od 2,80 do 3,05-3,06 a 3,28(mt resp.2t, J=7,5Hz,18H-2H a 4H: nch2),
3,80(S,2H:NCH2CON), 4,03(d,J=5,5Hz,2H:CONCH2CON), od 6,00 do 9,00(mf rozlož.:NH2 a NH), 8,27(mt,1H:CONH), hmotové spektrum:
MH+ = 935.
- 43 ·· t
• · • · • · ······· ·· ···· • ·· • ···· • ·· · • ·· ·· ··· ·· •♦ · · •· ·· ··· ·· • ·· ·· ··
Příklad 8
Syntéza /H2N(CH2)β/2Ν(CH2)4N/(CH2)3NH2/(CH2)3NHCH2CON/(ch2)17-ch3/2 (17)
Tento produkt byl syntetizován stejně jako produkt (7) za použití produktu (15) namísto produktu (3). Získaný produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií a lyofilizují: vysokotlaká kapalinová chromatografie (semipreparativní): R = 38 min(H2O/MeCN, 10 min/100:0./, 10-45 min/0:100/,
45-140 min/0:100/, 1H-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
(400 MHz,(CD3)2SO d6 s přídavkem několika kapek CD^COOD d4, delta v ppm)
0,88(t,J=7Hz,6H:CH3),
1,29(mt,60H:CH2 centrální mastných řetězců), 1,52(mt,4H:1 CH2 každého mastného řetězce), 1,68(mt,4H:CH2CH2 centrální butylu), od 1,90 do 2,10(mt,8H:CH2 centrální propylů), 2,90-od 2,95 do 3,15-3,18 a 3,15(t,mt resp. 2t šir.,J=7,5Hz, 24H celkem:NCH2), 4,02(s,2H:NCH2CON), hmotové spektrum:
MH+ = 878.
Příklad 9
Syntéza /H2N(CH2)2/2N(CH2)2NHCH2COGlyN/(CH2)]?-CH3/2 (19)
a) /bocnh(ch2)2/2n(ch2)2nbocch2cooh (18)
Tento produkt byl syntetizován jako produkt (15) za použití tris(aminoethyl)aminu namísto produktu (1).
Výtěžek činí 29 %:
Λ 9 • · · ·
9 · 9 9 99999
9 9 99999 999
9 99 9 99 9999 9
99 9999
9999999 99 999 9999
- 44 chromatografie na tenké vrstvě:
Rf = 0,55 (chloroform/methanol v objemovém poměru 8:2), ^-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
(400MHz, (CD^^SO d6, při teplotě 393K, delta v ppm) ,44(s,27H:C(CH3)3, 2,58(t,J=6,5Hz:CH2NCH2), 2,66(t,J=7Hz,2H:NCH2), 3,04(q,J=6,5Hz:OCONHCH2), 3,28(t,J=7Hz,2H:OCONCH2), 3,76(s,2H:OCONCH2COO), 6,06(mf,2H:CONH), hmotové spektrum: MH+ = 505.
b) /H2N(CH2)2/2N(CH2)2NHCH2COGlyN/(CH2)17-CH3/2 (19)
Tento produkt byl syntetizován jako produkt (17) za použití produktu (18) namísto produktu (15).
Výtěžek činí 65 %:
vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =122 min,(H2O/MeCN, 10 min/100:0/, 10-45 min/0/100/, 45-140 min/0:100/, ^H-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
(400 MHz,(CD3)2SO dž s přídavkem několika kapek CD3COOD d4, delta v ppm)
0,87(t,J=7Hz,6H:CH3), od 1,15 do 1,35(mt,60H:CH2 centrální mastných řetězců), 1,45 a 1,55(2mts,2H každý:1 CH2 každého mastného řetězce), 2,64(t,J=5,5Hz,4H:CH2NCH2),
2,75(t,J=6Hz,2H:NCH2), 2,95(t,J=5,5Hz,4H:NCH2),
3,08(t,J=6Hz,2H:NCH2),
3,25(mt,4H:NCH2 mastných řetězců), 3,88(s,2H:NCH2CON),
4,06(d,J=5Hz,2H:CONCH2CON), • · · ·· ···· ·· ·· ···· · · · ···· o · · ···· · ··· • · ·· · ·· · · · · · • · ·· · ··· ······· ·· ··· ·· ··
- 45 7,75(mf rozložený reziduální:NH),
8,68(t reziduální,J=5Hz:C0NH), hmotové spektrum:
MH+ = 765.
Příklad 10
Syntéza /H2N(CH2)2/2N(CH2)2NHCH2CON/(CH2)]?-CH3/2
Tento produkt se syntetizuje jako produkt (19) za použití dioktadecylaminu namísto produktu (5).
Výtěžek činí 73 %: vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =100,1 min,(H2O/MeCM, 10 min/100:0/, 10-45 min/0:100/,
45-140 min/0:100/, hmotové spektrum: MH+=708.
Příklad 11
Syntéza NH2 (CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLysN/(CH2)]?CH3/2 (21) (RPR 127888 A)
Produkt (12) se zbaví ochrany za použití metody H (ClZ) a následně použitím metody I. Finální produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií: vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =11,76 min,(H2O/MeCN: 3 min/60:40/, 3-20 min/0:100/, min/0,100/, hmotové spektrum:
MH+ = 892, 1H-nukleární magnetickorezonanční spektrum: (400 MHz, (CD3)2SO d6, při teplotě 393K, delta v ppm) 0,91(t,J=7Hz,6H:CH3 mastných řetězců), • ·
-461,31(mt,60H:(CH2)i $ centrální mastných řetězců), od 1,35 do 1 , 75 (mt, 1 OH: 1 CH2 každého mastného řetězce, (C^)^ centrální lysylu),
1,75(mt,4H:(CH2)2 centrální butylu), 2,00(mt,4H:CH2 propylů),
2,82-2,98-3,06 a od 3,10 do 3,50(2t, mt resp. 2mfs,J=7Hz,
18H celkem:NCH2 lysylu-NC^ butylu-NC^ propylů a NCH2 mastných řetězců),
3,62(s,2H:NCH2CON),
4,73(q,J=7Hz,1H:CONCHCON lysylu), , 18(d,J=7Hz,1H;CONH lysylu).
Λ
Příklad 12
Syntéza NH2 (CH2 ) βΝΗ (CH2 ) 4NH (CH2 ) ^HC^COLys (Cl-Z ) N/ (CH2 ) 1 ?CH3/2 (22) (RPR 122759 A)
Produkt (12) se zbaví ochrany za použití metody I.
Finální produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií: vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R = 16,79 min, (H2O/MeCN: 3 min/60:40./, 3-20/0: 100/, min/0:100/, hmotové spektrum:
MH+ = 1060,
H-nukleární magnetickorezonancm spektrum:
(400 MHz, (CD^^SO d6, při teplotě 373K, delta v ppm)
0,91(t,J=7Hz,6H:CH3 mastných řetězců),
1,31(mt,60H:(CH2)15 centrální mastných řetězců), od 1,30 do 1,75(mt,10H: 1 CH2 každého mastného řetězce, (C^)^ centrální lysylu),
1,72(mt,4H:((^2)2 centrální butylu),
1,95(mt,4H:CH2 propylů),
2,98-3,06 a od 2,90 do 3,50(2mts resp. mf, 18H celkem:NC^ly-
- 47 sylu-NCH2 butylu-NCH2 propylů a NCH2 mastných řetězců), 3,59(s,2H:NCH2CON),
4,75(q,J=7Hz,1H:CONCHCON lysylu),
5,16(s,2H:COOCH2Ar),
6,85(mf,1H:OCONH), od 7,35 do 7,55(mt,5H:H aromatické),
8,15(mf,1H:CONH lysylu).
Příklad 13
Syntéza NH2 (CH2 ) 3NH (CH2 ) 4NH (CH2 ) ^HCf^COLys (CHO) N/ (CH2 ) 1 ?~ CH3./2 (24) (RPR 122760 A)
a) NHBoc (CH2 ) 3NBoc (CH2 ) 4NBoc (CH2 ) 3NBocCH2COLysN./ (CH2 ) j CH3./2 (23)
Produkt (12) se zbaví ochrany za použití metody H Cl-Z) a použije dále bez jakéhokoliv dalšího čištění. Výtěžek činí 65 %: vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R = 20,82 min, (H2O./MeCN: 3 min/60:40/, 3-20 min/0:100/, min/0:100/.
b)
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(CHO)N/(CH2)]? ch3)2 (24)
Produkt (23) se kopuluje s kyselinou mravenčí za použití metody G. Získaný produkt se potom přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií: vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =13,60 min,(H2O/MeCN: 3 min/60:40/, 3-20 min/0:100/, min/0:100/, hmotové spektrum: MH+ = 920, • · • · · · • · • · · · · · · ···· · • · ·· · · · · ······· ·· · ·· · · · ·
- 48 .
^Η-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
( 400 MHz, (CD^^SO d6, při teplotě 383K, delta v ppm)
0,92(t,J=7Hz,6H:CH3 mastných řetězců),
1,31(mt,60H:(CH2)i 5 centrální bočních řetězců), od 1,35 do 1,70(mt,10H: 1 CH2 každého mastného řetězce, (CH2)3 centrální lysylu),
1,73(mt,4H:(CH2)2 centrální butylu),
1,98(mt,4H:CH2 propylů), od 2,85 do 3,50(mt,18H:NCH2 lysylu-NC^ butylu-NC^ propylů a NCH2 mastných řetězců),
3,62(s,2H:NCH2CON),
4,75(mt,1H:CONCHCON lysylu),
7,60(mf,1H:CONH),
8,05(s šir.,1H:CH aldehydu),
8,18(mf,1H:CONH lysylu)
Příklad 14
Syntéza NH2(CH2)^NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys/Cholesteryl/N/(CH2)17CH3/2 (25) (RPR 128142 A)
Produkt (23) se kopuluje s cholesterylchloroformiátem za použití metody G (bez použití reakční složky BOP). Získaný produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií: vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =21,66 min,(H2O/MeCN: 3 min/60:40/, 3-20 min/0:100/, min/0:100/, hmotové spektrum: MH+ = 1304, ,
H-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
(600 MHz,(CD3)2SO d6, delta v ppm)
0,68 a 0,98(2s,3H každý:CH3 v 18 a CH3 v 19 cholesterylu), 0,86(mt,12H:CH3 mastných řetězců a CH3 v 26 a 27 cholesterylu), • · · ·· ···· ·· · · • · · · · · · · · ·· • · · ♦ ··· ·· ·· • · ♦ · · · · ····· ·· · · · · ·· ······· · · · ·· · · ··
-490,91 (d,J=7Hz,3H:CH3 v 21 cholesterylu),
1,31(mt,60H:(CH2)j2 centrální mastných řetězců), od 0,80 do 2,30(mt,42H:1 CH2 každého mastného řetězce-Cf^ v 1, 2, 4, 7, 11, 12, 15, 16, 22, 23 a 24 cholesteryluCH v 8, 9, 14, 17, 20 a 25 cholesterylu-(CH2)3 centrální lysylu a CH^ propylů),
1,65(mt,4H:(CF^ )2 centrální butylu),
2,88 a 2,96(2mts,14H celkem:HCH2 lysylu-NCH2 butylu-NCF^ propylů) od 3,20 do 3,50(mt,4H:NCH2 mastných řetězců),
3,64(s,2H:NCH2CON),
4,23(mt,1H:CH v 3 cholesterylu),
4,63(mt,1H:CONCHCON lysylu),
5,30(mt,1H:CH v 6 cholesterylu),
6,98(mt,1H:NHCOO),
7,90(mt,1H:CONH lysylu),
8,60 až 9,10(mfs vyměnielné).
Příklad 15
Syntéza NH2(CH2)βΝΗ(CH2)4NH(CH2)3NHCH COLys/Arachidonyl/N,/(CH2) 17CH3./2 (26) (RPR 130605)
Produkt (23) se kopuluje s kyselinou arachidonovou pod proudem dusíku a za nepřístupu světla za použití metody G. Produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií: vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =20,67 min, (H2O/MeCN: 3 min/60:40./, 3-20 min/0:100/, min/0:100/, hmotové spektrum: MH+ = 1177, ^H-nukleární magnetickorezonanční spektrum: (400 MHz,(CD3)2SO d6 s přídavkem několika kapek CD3COOD d4, pži teplotě 393K, delta v ppm) • · ·· ··· · ·· ♦· • · · · · 0 · · · • · · ··· · · ·· • · · · ♦ · · « · · · • · · · · · · ····· ·· ··· ·♦ ·♦
0,90(t,J=7Hz,6H:CH^ mastných řetězců),
0,91 (t,J=7Hz,3H:CH3 arachidonylu),
1,31(mt,60H:(CH2)i 5 centrální mastných řetězců), od 1,35 do 1,75(mt,18H: 1 CH2 každého mastného řetězce(CH2)3 centrální a CH2 centrální arachidonylu a (CH2)3 centrální lysylu),
1,75(mt,4H:(CH2)2 centrální butylu),
2,02(mt,4H:CH2 propylů),
2,10(mt,6H:COCH2a obě =CCH2 arachidonylu), 2,80-2,97-3,06 a od 3,10 do 3,50(mt, t, mt resp. 2mfs,J= 7Hz,24H celkem:=CCH2C= arachidonylu-NCH2 lysylu-NCH2 butyluNCH2 propylů a NCH2 mastných řetězců),
3,62(s,2H:NCH2CON),
4,73(dd,J=8 a 5Hz,1H:CONHCHCON lysylu),
5,38(mt,8H:CH=CH arachidonylu).
Příklad 16
Syntéza NH2(CH2)βΝΗ(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGluN/(CH2)]?CH3/2 (28) (RPR 126097 A)
a) Boc-Glu(O-Bz)-Dioktadecylamin (27)
Tento produkt se syntetizuje kopulací Boc-GLU(OBz) a dioktadecylaminu metodou F. Výtěžek činí 90 %: chromatografie na tenké vrstvě:
Rf = 0,88 (chloroform/methanol v objemovém poměru 9:1).
b) nh2(ch2)3mh(ch2)4nh(ch2)3nhch2cog1un/(ch2)17ch3/2 (28)
Produkt (3) nebo (4) se kopuluje s produktem (27) za použití metody G a následně metody H (deprotekce Vl-Z). Finální produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují ana• ·· · • · • * · · · · · · « ·· • * · · · · · ·· »· • · · · · ·· '·· ·· • · ·· · · ·· ··· ···· ·· ··· ·· ··
- 51 lytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií: vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =14,64 min, (E^O./MeCN: 3 min/60 :40/, 3-20 min /0:100/, min./O: 100/, hmotové spektrum: MH+ = 893, ^H-nukleární magnetickorezonanční spektrum: (400 MHz,(CD3)2SO d6, při teplotě 383K, delta v ppm) 0,90(t,J=Hz,6H:CH^ mastných řetězců),
1,30(mt,60H:(CH2)^5 centrální mastných řetězců), 1,56(mf,4H: 1 CH2 každého mastného řetězce), od 1,60 do 2,00(mt,2H:CH2 centrální glutarylu), 1,73(mt,4H:(CH2)2 centrální butylu),
1,98(mt,4H;CH2 propylů), 2,32(t,J=7Hz,2H:COCH2 glutarylu), 3,00-3,06 a 3,45 (t resp.2mts,J=7Hz,16H celkem:NCH2 butyluNCH2 propylů a NCH2 mastných řetězců),
3,65(s šir.,2H:NCH2CON),
4,85(mt,1H:CONCHCON glutarylu),
8,19(s šir.,1H:CONH glutarylu).
Příklad 17
Syntéza NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COG1u(O-Bz)N/(CH2)1?CH3/2 (29) (RPR 123027 A)
Produkt (3) se kopuluje s produktem (27) a zbaví ochrany za použití metody G (Boc). Finální produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií: vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =16,02 min,(H2O/MeCN: 3 min/60:40/, 3-20 min/0:100/, min/0:100/, hmotové spektrum: MH+ = 983, • · · · · ♦· f · · • · · ··
• · ♦ · ·♦ • · ·« ♦··
H-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
(400Mhz, (CD^^SO d6, při teplotě 413K, delta v ppm) 0,89(t,J=7Hz,6H:CH3 mastných řetězců),
1,30(mt,60H:(CH2)13 centrální mastných řetězců), 1,55(mf,4H: 1 CH2 každého mastného řetězce),
1,72(mt,4H:(CH2)2 centrální butylu), od 1,75 do 2,00(mt,2H:CH2 centrální glutarylu),
1,99(mt,4H:CH2 propylů),
2,47(t,J=7Hz,2H:COCH2 glutarylu),
2,95-3,05 a 3,40(3 mts,16H celkem:NCH2 butylu-NCH2 propylů a NCH2 mastných řetězců),
3,62(s šir.,2H:NCH2CON),
4,85(mt,1H:CONCHCON glutarylu),
5,14(AB limit.,J=12Hz,2H:CH2 benzylu),
7,35(mt,5H:H aromatické benzylu),
8,23(mf,1H:CONH glutarylu).
Příklad 18
Syntéza NH2(CH2)^NH(CH2)^NH(CH2)3NHCH2COGlu(Galaktosamid)N/(CH2)17CH3/2 (31) (RPR 130096 A)
a) BocNH(CH2)3NBoc(CH2)4NBoc(CH2)3NBocCH2COGluN/(CH2)]?CH3./2 (30)
Produkt (3) se kopuluje s produktem (27) a ochranná skupina OBz bočního řetězce se odštěpí metodou H(C1-Z) a produkt se použije bez jakéhokolv čištění: vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =22,84 min,(H2O/MeCN: 3 min/60:40/, 3-20 min/0:100/, min /0:100/, hmotové spektrum: MH+ = 1293.
b)
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COG1u(Galaktosamid)N- 53 9 99 999999
9 9 99 9
999 999
9 9 9 9 99
9 9 99
999 9999 99999
999
9 99
999
9 99
99
9999 /(CH2)17CH3/2(31)
Produkt (30) se kopuluje d D(+)-galaktosamin-hydrochloridem za použití metody G. Produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatograf ií: vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =13,71 min, (H2O/MeCN: 3 min/60:40./, 3-20 min/0:100/, min /0:100/, hmotové spektrum: MH+ = 1054.
Příklad 19
Syntéza NH2 (CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COG1u(Galaktosamid)N,/(CH2) 1?CH3/2 (32) (RPR 130595 A)
Produkt (30) se kopuluje s D(+)-glukosamin-hydrochloridem za použití metody G. Produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatograf ií : vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =12,27 min, (H2O/MeCN: 3 min/60:40./, 3-20 min/0: 100/, min/0:100/, hmotové spektrum: MH+ = 1054.
Příklad 20
Syntéza NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCOG1u(Mannosamid)N/(CH2)1?CH3/2 (33) (RPR 130598 A)
Produkt (30) se kopuluje s D-(+)-mannosamin-hydrochlo- 54 *·♦· ridem za použití metody G. Produkt se potom přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií:
vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R = 12,98 min, (H2O/MeCN: 3 min./60:40/, 3-20 min/0,100/, min/0:100/, hmotové spektrum:
MH+ = 1054.
Příklad 21
Syntéza NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlu(N(CH3)2)N/(CH2)J?CH3/2 (34) (RPR 131111 A)
Produkt (30) se kopuluje s dimethylaminem za použití metody G. Produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií: vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =14,44 min, (H2O/MeCN: 3 min/60:40./, 3-20 min/0/100/, min./0 :100/, hmotové spektrum:
MH+ = 920, 1H-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
(400 MHz,(CD3)2SO d6, delta v ppm)
0,89(t,J=7Hz,6H:CH3 postranních řetězců),
1,25(mt,60H:(CH2)15 centrální mastných řetězců),
1,43 a 1,60(2mts,2H každý: 1 CH2 každého mastného řetězce),
1,65(mt,4H:(CH2)2 centrální butylu),
1,65 a od 1,85 do 2,00(2mts,1H každý:CH2 centrální glutarylu), 1,95(mt,4H:CH2 propylů),
2,32(AB limit.,2H:COCH2 glutarylu),
2,80 a 2,92(2s,3H každý:CON(CH3)2), od 2,85 do 3,05(mt,T2H: NCH2 butylu-NCH2 propylů),
- 55 3,00-3,22-3,45 a 3,58(4mts,1H každý:NCH2 mastných řetězců), 3,78(AB,J=16Hz,2H:NCH2CON),
4,75(mt,1H:CONCHCON glutarylu),
8,72(d,J=7,5Hz,1H:CONH glutarylu),
8,85 a od 8,90 až 9,15(mfs vyměnitelné).
Příklad 22
Syntéza NH2 (CH2 ) ^NH (CH2 ) 4NH ( CH2 ) 3NHCH2COGlyN./ (CH2 ) 1 j CH3/2 (35) (RPR 122767 A)
-h
Produkt je syntetizován stejným způsobem jako produkt (6), přičemž se však použije didodecylamin namísto dioktadecylaminu. Produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují vysokotlakou kapalinovou chromatografií: vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =9,54 min, (H2O/MeCN: 3 min/60:40./, 3-20 min/0/100/, min/0:100/, hmotové spektrum:
MH+ = 653, 1H-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
(400 MHz,(CD3)2SO d6, při teplotě 403K, delta v ppm)
0,93(t,J=7Hz,6H:CH3 mastných řetězců),
1,33(mt,36H:(CH2)g centrální mastných řetězců), 1,58(mt,4H: 1 CH2 každého mastného řetězce),
1,75(mt,4H:(CH2)2 centrální butylu),
1,95 a 2,00(2mts,2H každý:CH2 centrální propylů),
2,98 a 3,00(2mts,12H celkem:NCH2 butylu a NCH2 propylů),
3,30(t,J=7Hz,4H:NCH2 mastných řetězců),
3,58(s,2H:NCH2CON), 4,05(s,2H:CONCH2CON glycylu).
- 56 Příklad 23
Syntéza NH2(CH2)3NH(CH2)^NH(CH2)3NHCH2COGlyN/(CH2)]2~CH3/2 (36) (RPR 122774 A) vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R = 10,64 min,(H2/MeCN: 3 min/60:40/, 3-20 min/0:100/, min/0:100/ hmotové spektrum:
MH+ = 681, *
H-nukleární magnetickorezonancní spektrum:
(400 MHz,(CD3)2SO d6, při teplotě 393K, delta v ppm)
0,91(t,J=7Hz,6H:CH3 mastných řetězců),
1,33(mt,40H:(CH2)iθ centrální mastných řetězců),
1,58(mts,4H: 1 CH2 každého mastného řetězce),
1,75(mt,4H:(CH2)2 centrální butylu),
2,00(mt,4H:CH2 centrální propylů),
2,98 a 3,08(2t,J=7Hz, 12H celkem:NCH2 butylu a NCH2 propylů),
3,32(t,J=7Hz,4H:NCH2 mastných řetězců), 3,65(s,2H:NCH2CON),
4,06(d,J=4Hz,2H:CONCH2CON glycylu),
8,60(s šir.,1H:CONH glycylu).
Příklad 24
Syntéza NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN/(CH2)13/2 (37) (RPR 122766 A)
Produkt se syntezizuje stejně jako produkt (6), přičemž se však použije ditetradecylamin namísto dioktadecylaminu. Produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují vysokotlakou kapalinovou chromatografií:
vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R = 9,92 min,(H^/MeCN: 3 min/60:40/, 3-20 min/0:100/, min/0:100/,
- 57 *··· hmotové spektrum:
MH+ = 709, 1H-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
(400MHz,(CD^)2SO d6, při teplotě 393K, delta v ppm)
0,90(t,J=7Hz,6H:CH^ mastných řetězců),
1,31(mt,44H:CH2)1j centrální mastných řetězců),
1,58(mt,4H: 1 CH2 každého mastného řetězce),
1,76(mt,4H:(CH2)2 centrální butylu),
2,00(mt,4H:CH2 centrální propylů),
2,98 a 3,08(mt resp. t,J=7Hz,12H cekjem:NCH2 butylu a NCH2 propylů),
3,30(t,J=7Hz,4H:NCH2 mastných řetězců),
3,65(s,2H:NCH2CON), 4,06(d,J=4Hz,2H:CONCH2CON glycylu),
8,10(mf,1H:CONH glycylu)
Příklad 25
Syntéza NH2 ( CH2 ) 3NH ( CH2 ) 4N/ ( CH2 ) 3NH2./CH2COGlyN/ ( CH2 ) ] ?CH3/2 (39) (RPR 126096 A)
a) Syntéza BocNH(CH2 ) 3NBoc(CH2 ) 4N/(CH2 ) 3NHBoc./CH2CO2H (38)
V průběhu syntézy produktu (3) se po přečištění na silikagelu izoluje produkt (38). Výtěžek produktu činí 8 %: chromatografie na tenké vrstvě:
Rf = 0,32(chloroform/methanol v objemovém poměru 9:1), hmotové spektrum:
MH+ = 561, ^Η-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
(400 MHz,(CD3)2SO d6, delta v ppm), od 1,30 do 1,60(mt,4H:(CH2)2 centrální butylu),
1,40(s,27H:C(CH3)3),
1,56(mt,4H:CH2 propylů),
- 58 «* «·«·
2,68 a 3,11(t šir. resp.t,J=7Hz,4H každý:NCH2 butylu a NCH2 propylů),
2,90 a 2,96(2q,J=7Hz,2H každý:BocNHCH2 propylů),
3, 18(s,2H:NCH2COO).
b)
NH2(CH2)3NH(CH2)4N/(CH2)3NH2/CH2COGlyN/(CH2)]?CH3/2 (39)
Produkty (38) a (5) se kopulují za použití metody G. Produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují vysokotlakou kapalinovou chromatografií: vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R = 13,60 min, (H2O./MeCN: 3 min./60 : 40/, 3-20 min/0 :100/, min/0:100/, hmotové spektrum:
MH+ = 821 , 1H-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
(400 MHz,(CD3)2SO d6 s přídavkem několika kapek CD3COOD d4, delta v ppm)
0,87(t,J=7Hz,6H:CH3 mastných řetězců),
1,28(mt,60H:(CH2)15 centrální mastných řetězců),
1,46 a 1,54(2mts,2H každý: 1 CH2 každého mastného řetězce),
1,63(mt,4H:(CH2)2 centrální butylu),
1,91(mt,4H:CH2 propylů), od 2,85 až 3,15(mt,12H:NCH2 butylu a NCH2 propylů), 3,24(mt,4H:NCH2 mastných řetězců),
3,76(mf,2H:NCH2CON), 4,05(s šir.,2H:CONCH2CON glycylu).
Příklad 26
Syntéza NH2 (CH2 ) 3NH (CH2 ) 4NH ( CH2 ) 3NH (CH2 ) 3CON/ ( CH2 ) 1 -yCH^ (41 ) (RPR 122786 A)
- 59 • ·· ···· ·· ·· • 9 « · > · «···» • * · · ··· « · ·· a · · * · · · ·*· ·· • · · · · · ·· ··♦ ···« t» a·· ·»··
a) BocNH(CH2)3NBoc(CH2)4NBoc(CH2)3NBoc(CH2)3C02H (40)
Produkt (40) se získá alkylační redukcí sperminu v přítomnosti NaCNBH3a semialdehydu kyseliny jantarové v roztoku. Do baňky o obsahu 200 ml se předloží 1,8 g sperminu, 60 ml methanolu a 0,138 g NaCNBH3. Získaný roztok se potom velmi intenzivně míchá magnetickým míchadlem. Do baňky se potom přidá pomocí isobarické nálevky a v průběhu 100 minut roztok
5,5 ml semialdehydu kyseliny jantarové (15%) a 30 ml methanolu. Míchání se udržuje po dobu 100 minut. Aminy se chrání skupinou Boc následujícím způsobem. K reakčni směsi se přilije 2,8 ml ΤΕΆ a potom 8,8 g diterc.butyldikarbonátu rozpuštěného ve 30 ml methanolu. Směs se míchá přes noc. Reakčni směs se potom zahustí za vakua, produkt se vyjme ethylacetátem a extrahuje třemi 50 ml frakcemi hydrogenuhličitanu sodného, načež se vodné fáze sloučí a promyjí etherem (3 x 100 ml). pH vodné fáze se upraví na hodnotu 3 pomocí hydrogensíranu draselného, přičemž dojde ke vzniku zákalu v důsledku vysrážení produktu 41. Směs se potom extrahuje ethylacetátem (3 x 100 ml). Organická fáze se vysuší nad síranem hořečnatým a odpaří za vakua. Produkt se použije bez dalšího čištění.
b)
Produkt (40) a dioktadecylamin se kopulují za použití metody^G. Produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují vysokotlakou kapalinovou chromatografií.
vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R = 15,04 min,(H2O/MeCN: 3 min/60:40/, 3-20 min/0:100/, min/0:100/, hmotové spektrum:
MH+ = 792, ^Η-nukleární magnetickorezonanční spektrum:
(400MHz,(CD3)2 d6, při teplotě 383K, delta v ppm) 0,85(t,J=Hz,6H:CH3 mastných řetězců),
• ·· ·· ···· ·· ··
·· · · • 4 • • · • •
• · • • ··· • · ··
• · · • • • • ··· • •
• · • • • • • •
···«··· ·· ··· ·· ··
1,22(mt,60H:(CH2)i5 centrální mastných řetězců), 1,48(mf,4H: 1 CH2 každého mastného řetězce),
1,72(mt,4H:(CH2)2 centrální butylu),
1,88(mt,2H:CH2 centrální aminopentanoylu),
1,99(mt,4H:CH2 propylů),
2,42(t,J=7Hz,2H:COCH2 aminopentanoylu),
2,96-3,03 a 3,22(3mts,18H celkem:NCH2 aminopentanoylu-NCH2 butylu-NCH2 propylů a NCH2 mastných řetězců).
Příklad 27
Syntéza NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CONH(CH2)5CON/(CH2) CH3/2 (42) (RPR 128506 A)
Produkt se syntetizuje stejně jako produkt (6), přičemž se však použije kyselina Boc-6-aminokaprová namísto BocGly. Produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují vysokotlakou kapalinovou chromatografií: vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R = 13,94 min, (H2O/MeCN: 3 min/60:40./, 3-20 min./0:100/, min/0:100/, hmotové spektrum:
MH+ = 877, , , . ~ ,
H-nuklearni magnetickorezonancni spektrum:
(300 MHz,(CD3)2SO d6, delta v ppm)
0,87(t,J=7Hz,6H: CH3 mastných řetězců),
1,28(mt,60H:(CH2)35 centrální mastných řetězců), 1,48(mt,10H: 1 CH2 každého mastného řetězce a (CH2)3 centrální aminohexanoylu),
1,65(mt,4H:(CH2)2 centrální butylu),
1,95(mt,4H:CH2 propylů),
2,27(t,J=7Hz,2H:COCH2 aminohexanoylu), od 2,85 do 3,30(mts,18H:NCH2 aminohexanoylu-NCH2 butylu-NCH2 propylů a NCH2 mastných řetězců), • · ·· · ·
- 61 3,70(s šir.,2H:NCH2CON), od 7,90 do 9,10(mfs vyměnitelné).
Příklad 28
Syntéza NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlu(11-amid-undekanyl-hepta-O-acetyllaktoso)N/(CH2)^CH3/2 (43) (RPR 130765 A)
Produkt (30) se kopuluje s 11-aminoundekanyl-heptaO-acetyllaktózou za použití metody G. Produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií.
vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R =15,91 min,(H2O/MeCN: 3 min/60:40/, 3-20 min/0:100/, min/0:100/, hmotové spektrum: MH+ = 1680.
Příklad 29
Syntéza NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COAsm(beta-NAc(Ac)3~ N/(CH2)17CH3/2 (45) (RPR 131283 A)
a) Fmoc-Asm-beta-Glc-NAc(Ac)3-Dioktadecylamin
Produkt se syntetizuje kopulací Fmoc-Asm-beta-GlcNAc (Ac)3~OH a dioktadecylaminu za použití metody F. chromatografie na tenké vrstvě:
Rf = 0,67 (chloroform/methanol), vysokotlaká kapalinová chromatografie:
= 25,31 min,(H2O/MeCN: 3 min/60:40/, 3-20 min/0:100/, min/0:100/.
• · ···· · · · · · · • · · ···· · ♦·· • * ·· · · · ···· ♦ ♦'·· · ♦ · ··· ···· ·· ··· ·· ··
b) NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COAsm(beta-NAc(Ac)3)N-
N/(CH2)17CH3/2 (45)
Odštěpení skupiny Fmoc produktu (45).
K 0,7 g produktu (45) se přilije 20 ml dimethylformamidu a 2 ml diethylaminu. Po 6 hodinách míchání se reakční směs zahustí za vakua. Získaný produkt se kopuluje s produktem (3) za použití metody G. Produkt se přečistí semipreparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií a získané frakce se analyzují analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatograf ií : vysokotlaká kapalinová chromatografie:
R = 15,35 min, (H2O./MeCN: 3 min/60:40/, 3-20 min/0:100/, min/0:100/, hmotové spektrum: MH+ = 1207.
Příklad 30
Syntéza v roztoku produktu (6) ve velkém měřítku
Produkt (6) se syntetizuje redukční alkylací sperminu v přítomnosti NaCNBH3 a kyseliny glyoxylové v roztoku. Do baňky o obsahu 2 litrů se předloží 18,2 g sperminu, 500 ml methanolu a 2 g NaCNBH3> Získaný roztok se intenzivně míchá magnetickým míchadlem. Do baňky se přidá pomocí isobarické nálevky v průběhu 100 minut 8,45 g kyseliny glyoxylové ve 300 ml methanolu. Směs se míchá přes noc. Aminy se chrání skupinou Boc následujícím způsobem. Ke směsi se přilije 14 ml TEA a potom ještě 100 g diterc.butyldikarbonátu v roztoku ve 200 ml tetrahydrofuranu. Směs se míchá přes noc. Reakční směs se zahustí za vakua a produkt se vyjme ethylacetátem (250 ml), promyje hydrogensíranem draselným (6x100 ml) a potom nasyceným roztokem chloridu sodného (3x100 ml), vysuší nad síranem hořečnatým a odpaří za vakua. Produkt se přečistí na sloupci silikagelu za použití eluční soustavy • ·
tvořené směsí chloroformu a methanolu v objemovém poměru 9:1. Frakce obsahující produkt se identifikují chromatografií na tenké vrstvě, sloučí a odpaří za vakua, přičemž se získá 10 g produktu (6). Celkový výtěžek syntézy činí 17 %.
Výsledky analýz provedených analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií, hmotovou spektroskopií a nukleární magnetickorezonanční spektroskopií jsou identické s výsledky analýz pro produkt získaný metodou v pevné fázi.
Příklad 31
Vliv nábojového poměru (aminy/fosfáty) na účinnost transfekce (7) RPR120534A, (6) RPR 120535A a (9) RPR 120531A
Vzorky 1.10^ buněk /NIH 3T3, 3LL nebo králičí SMS/ ve fázi exponenciálního růstu na 2 cm se ošetří roztoky lipofektant/pCMV-LUC, vykazujícími různé nábojové poměry, po dobu dvou hodin při teplotě 37 °C v atmosféře obsahující 5 % oxidu uhličitého. Každý vzorek přijme 2,ug nukleové kyseliny.
Exprese reportérového genu se stanoví po přidání 8 %fetálního telecího séra a po 40 hodinové inkubaci v sušárně s atmosférou oxidu uhličitého.
Aktivita luciferázy se stanoví emisí světla /RLU=relativní světelná jednotka/ v přítomnosti luciferinu, koenzymu A a ATP, po dobu 10 sekund a vztáhne na 2000 ošetřených buněk. Získané výsledky jsou graficky vyjádřeny na připojených obr. 1, obr.2 a obr.3.
Z těchto obrázků je jednoznačně zřejmé, že přítomnost glycinu v rameni spacer mezi lipidovou a polyaminovou částí umožňuje dosáhnout lepší transfekční účinnost pro nižší poměry nanomoly kationtového lipidu/ ,ug DNA.
Příklad 32
Vliv nábojového poměru (aminy/fosfáty) na transfekční účinnost
- 64 (20) RPR 120527A, (19) RPR 120528A, (17) RPR 120526A a (16)
RPR 120525A
Vzorky 1 . 1 0^ o 2 na 2 cm zují různé nábojové poměry, 37 °C a pod atmosférou s 5% vzorek přijal 1^ug nukleové térového genu se provede po (finálně 8 %) a 40 hodinové oxidu uhličitého.
růstu vykabuněk NIH 3T3 v exponenciální fázi se ošetří roztoky lipofektant/pCMV-LUC, které v průběhu dvou hodin při teplotě obsahem oxidu uhličitého. Každý kyseliny. Stanovení exprese reporpřidání fetálního telecího séra inkubaci v sušárně s atmosférou
Aktivita luciferázy se stanoví v supernartantu získaném po lyži buněk světelnou emisí /RLU = relativní světelná jednotka/ po dobu 10 sekund a vztáhne na mg proteinu. Získané výsledky jsou srnuty a vyjádřeny graficky na obr.4. Výhoda přítomnosti glycinového zbytku v rameni spacer je z tohoto příkladu rovněž patrná.
Příklad 33
Vliv délky spaceru na účinnost transfekce (6) RPR 120535, (41) RPR 122786 a (42) RPR 128506
Vzorky 1.10 buněk /NIH3T3 a HeLa/ v exponenciální fázi růstu na 2 cm se ošetří směsmi kationtový lipid/pCMVLuc, které vykazují různé koncentrace kationtového lipidu, při teplotě 37 °C, ve vlhké atmosféře s 5%,obsahem oxidu uhličitého, po da_j3u 2 hodin a v nepřítomností sérového proteinu. K růstovému prostředí buněk se potom přidá fetální telecí sérum (finálně 8 %) a stanoví se exprese transgenu a to až po dodatečné 40 hodinové inkubaci v sušárně s atmosférou oxidu uhličitého.
Strukturní charakteristiky spacerů jsou uvedeny v následující tabulce:
N°RPR Spacer
122786 -
120535 Gly
128506 NH2(CH2)SCO
V následující tabulce jsou shrnuty získané výsledky, které jsou vyjádřeny jako maximální účinnosti dosažené pro každý ze studovaných produktů.
Kationtový lipid buňky HeLa Buňky NIH3T3
Pokus 1 Pokus 2 RPR120535 (6) RPR122786 (41) RPR120535 (6) RPR128506 (42) 1.2.106 ± 9,7.104 (4) 2.3.106 ± 1,6.105 (8) 2.4.106 ± 3,2.105 (6) 1.8.106 ± 1,3.105 (6) 8.7.107 ± 4,5.106 (4) 4.6.107 ± 5,0.106 (8) 7.2.107 ± 8,3.106 (6) 5,0.107 ± 1,5.106 (6)
Transfekční účinnosti jsou udány v RLU/1Ds/2.10^. v závorkách jsou uvedeny poměry nanomoly lipidu/^ug DNA.
Pro pokusy 1 a 2 byly použity různé plasmidy v dávce mikrogramu resp. 0,5 mikrogramu DNA/1.10^ buněk.
Příklad 34
Vliv struktury spaceru na transfekční účinnost (6) RPR 120535
Za stejných experimentálních podmínek, jaké byly popsány v předcházejícím příkladu, avšak při zavedení suplementární buněčné řady (buňky 3LL), byly srovnány transfekční účinnosti získané s kationtovým lipidem (6) RPR 120535 modifikovaným substitucí na spaceru za použití skupiny typu Arg, typu Lys nebo typu Glu.
- 66 V následující tabulce jsou uvedeny struktury jednotlivých spacerů:
N° RPR SPACER
120531 Arg
121650 Árg(Z2)
127888 Lys
122759
122760 7 H
128142
120535 Gly
123027 GluOBz
126097 Glu
Účinnosti transfekce jsou udány v RLU/1Os/2.1 Cp ošetřených buněk.
V pokusech 1 a 2 byly použity různé plasmidy v dávce 0,5/Ug resp. 1yug buněk. Z analýzy výsledků vyplývá, že v závislosti na uvažovaných buňkách má přítomnost aminokyselinového řetězce, který je výhodně substituován, za následek zlepšení transfekční účinnosti.
Ό Ο © Γ~ Ο
τ—<
CO © t>
•V CM* cm
+1 +1 +1
r* > r-
Ο ο O
π—, fM
ιη © f-<
ό* fL O*
Wl •Λ m m τ
o o o O o o o © o
<υ r“4 Ch r-d O r-d có r-d cK Fd CM 1d F-d fH CO r-4 r—4 <5 r-d
S ^d r-d ^-4 m* CM* CM* rd sO* CO M·
+1 +1 +1 +1 •H +1 +1 +1 +1 +1
i Ό O WJ O 5-, o m O Ό O m O \© O MO Ό O O
^d r-d r-d r-d F-4 f-4 Fd F-d
o o <5 CM F-d M·' s co sO O
CQ F-d co CM* CM* CO f-4 c< o* CO f4
m T”4 o m CO © o CM I> r>
m m in co CO mo m Μ- o CM
in tn sO in co r* o fH o ©
o o r-d © O CM CM 00 o Cl
CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
r4 r—4 f-4 r-d r-M F“, F-4 r-d
PÍ pí Pí Pí Pí Pí Pí Pí Pí Pí
cu CL, CL, Cl, CL, CL, CL, CL, CL, Cl,
& Pí Pí Pí Pí Pí Pí Pí Pí Pí
r~ CM
cn cn
3 5
44 44
0 0
CL fL
9 9
9 9
Příklad 34
Vliv přítomnosti DOPE ve směsi lipofektant/DNA (9) RPR 120 531 A
Za použití stejného postupu, jaký byl použit v příkladu se ke kationtovému lipidu (9) RPR 120531 A přidá DOPE (dioleoylfosfatidylethanolamin) k dosažení různých molárních poměrů před přidáním DNA k transfekční směsi. Účinnost luciferázy se stanoví v supernatantu po lyži buněk a vztáhne se na miligram proteinu (obr.5). Přítomnost DOPE ve směsích lipofektantu umožňuje zlepšit transfekční účinnost v případě, že je' koncentrace (9) RPR 120531A nízká.
Příklad 35
Vliv séra na transfekční účinnost (6) RPR 120535A, (9) RPR 120531A a (10) RPR 121650A
Vzorky 1.10 buněk /NIH3T3 nebo HeLa/ v exponenciální fázi růstu na 2 cm se ošetří roztoky lipofektant/pCMV-LUC (3 nanomoly lipofektantu/,ug DNA) v nepřítomnosti séra po do bu 2 hodin nebo v přítomnosti séra v kultivačním prostředí.
V rámci tohoto příkladu každý vzorek přijme 2,ug DNA. Exprese luciferázy se stanoví v supernatantu buněčných lyzátů, vyjádří v RLU/IOs a vztáhne na miligram proteinu. Z analýzy výsledků vyplývá, že přítomnost séra nemá výrazný vliv na účinnost transfekce.
Příklad 36
Vliv koncentrace nukleové kyseliny ve směsi DNA/lipofektant (20) RPR 120527A, (19) RPR 120528A, (17) RPR 120526A a (16) RPR 120525Ά
Za podmínek popsaných v příkladu 31 se transfekují vzorky buněk NH3T3 při optimalizaci poměrů nanomoly lipofek9 · ♦· «··· • · · · · · · • * · · ♦ · ·
tantu/^ug DNA (viz příklad 32) /poměr = 6 pro (20) RPR 120 527A a (19) RPR 120528A, poměr = 3 pro (17) RPR 120526A a (16)
RPR 120525A/. Množství DNA dodaná každému vzorku se mění od
Transfekce 1.10 buněk v exponenciální fázi růstu s ,ug plasmidové DNA se zdá být dobrou volbou. Zvětšení množst ví použité DNA ve skutečnosti má za následek zvýšení koncentrace kationtového lipidu ve styku s buňkami a tedy v některých případech problémy s toxicitou. Při nižší koncentraci DNA se již nedosahuje úměrnosti s tranfekční účinností.
Příklad 37
Transfekční testy in vivo s lipopolyamidy podle vynálezu
Provede se injekce roztoku obsahujícího lipopolyamin podle vynálezu, připravený výše popsaným způsobem, do nádoru dní po implantaci, přičemž myš je anestetizovaná směsí Ketaminu a Xylazinu. Dva dny po injekci se odebere nádorová tkáň, která se zváží, rozřeže a potom rozemele v 200 ,ul pufru urče ného pro lyže (promega Cell Lysis Buffer E153 A). Po odstře dění (20 000 g po dobu 10 minut) se odebere 10zul vzorek, kte rý slouží k vyhodnocení aktivity luciferázy změřením celkové světelné emise získané po smíšení s 50zul reakčního činidla (Promega Luciferase Assay Substráte) v luminometru Lumat LB 9501 (Berthold) při integraci po dobu 10 sekund. Rezultující účinnost je vyjádřena v RLU (Relative Lights Units) a vyhodnocena v celém supernatantu nádorového lyzátu nebo je vyjádřena v RLU na miligram injikované DNA.
Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.
s 0 10 00 Os
£ ,kf ů 286 333 X OJ m m oCO
m 414 os r-4 cq OJ 00 v uo
Ό ta Ή
Φ 'fu
H C
tn X '>lD > d M 258 co co ’Τ v Os Os os 0 OJ
W >Φ 679 m 0 co t> 0 Os m
a
50
Ό -5rZ
'Pí 0 q CO v
•5 ε <
řn tí .
'|>1
S Ό Os
jJ s 's*z
ftí N
« O
Z
q >
< Λ ο. 1,5
1 pe i 1---------------------------------------------------------------------------
v
•H 0
+> CLj
a
(1)
P4 'H <
6 v v
’<3 Om
ozn
Z i m m m uo
Q sz < zl 0 0 0 0
'Ú
Es So 0 0 0 0
ω ±<ΰ H r— 1—H r-
FM
'H OJ OJ 01 OJ
C OJ Ol OJ OJ
Φ 0 0 sO
>0 OJ OJ Ol OJ
►J U J U
N X X X X
0 Q. CL Cl Cl
• · ♦ to • to 99 99 ♦· * toto·· » ·9 • to9

Claims (31)

1>V
PATENTOVÉ
L.
N Á R
L.
Lipopolyamin obecného vzorce ** ♦· to tototo » · «· • rto ·to «·to ·· ·« ve kterém
R2
R1 ,
R' q' m,
R4
R1 \
/
R2
-k (I) et R3 nezávisle jeden na druhém znamenají atom vodíku nebo skupinu ~(CH_) -NRR', ve které
Ή v ~ v ~ může znamenat 1, 2,1 3, 4, 5 a 6, přičemž může mít v jednotlivých skupinách R1, R2 a R3 stejný nebo odlišný význam, a nezávisle jeden na druhém znamená atom vodíku nebo skupinu -(CH2)g,NH2, kde může znamenat 1, 2, 3, 4, 5a6, přičemž může mít v jednotlivých skupinách R a R' stejný nebo odlišný význam, p nezávisle jeden na druhém znamenají celé číslo od 0 mít různé obecného do 6, přičemž,když je n vyšší než 1, m muže hodnoty a R3 může mít různé významy v rámci vzorce I a znamená skupinu obecného vzorce II
R5 /R6 —f· X—e- CH)-- Y ]— N U Nr7 (II)
- 72 9 99 99 9999 ··♦·
9 9 9 ♦ 9·· 9 9 99
9 999 999 9 999
9 · 9 9 9 99 9999·
99 99 9999
999 9999 ·9 999 9999 ve kterém
R6 a R7 nezávisle jeden na druhém znamenají atom vodíku nebo nasycenou nebo nenasycenou alifatickou skupinu obsahující 10 až 22 uhlíkových atomů, přičemž alespoň jeden z R6 nebo R7 je odlišný od atomu vodíku, u znamená celé číslo od 0 do 10, přičemž, když u znamená celé číslo vyšší než 1, potom R5, X, Y a r mohou mít odlišné významy v jednotlivých strukturních jednotkách /X-(CHR5 ) -Y/,
X znamená atom kyslíku, atom síry ;nebo monoalkylovanou nebo nemono a 1 kýlo vanou aminovou skupinu'',
Y znamená karbonylovou skupinu nebo methylenovou skupinu,
R5 znamená atom vodíku nebo boční přírodní aminokyselinový řetězec , který je případně substituován, a r znamená celé číslo od 1 do 10, přičemž, když je r rovno 1, R$ znamená boční přírodní aminokyselinový řetězec, který je případně substituován, a když je r vyšší než 1, R^ znamená atom vodíku , ve formě D, L nebo LD a jeho soli.
2. Lipopolyamin podle nároku 1 mající jeden z následujících obecných vzorců
O
- 73 ♦ »♦ ···♦ ·· ♦ · ♦ · ♦ · ♦ · · ··♦♦ • ♦·· ··· t ··· « · · · · ·♦ ··· ♦ · • to ♦· ···· • •to ♦··· ·♦ ♦·· ·♦·· (IV) (V) (VII)
NB • *« ·♦ ···· ·· ·· ♦ ··* ♦»· !!·..* • « * · ··· » · ·· • » , » · · ·♦·· ♦ • · «« · · · · ·«····♦ «♦ ♦·· ·♦ ··
NH ♦* • ·
- 75 «·♦· • · ·9 •· ·· • · · 9· t ·9 ·♦♦·
R4 (XII) ve kterých R^, Rg a Ry mají významy uvedené v nároku 1.
3. Lipopolyamin podle nároku 2 obecných vzorců III až XII, ve kterých R^ znamená skupinu NRgRy a Rg a Ry znamenají identickou skupinu zvolenou z množiny zahrnující skupinu (Cř^^yCH^, skupinu (CH2)11CH3, skupinu (CH2)13CH3 a skupinu ÍCH2^12CH3’
4. Lipopolyamin podle některého z předcházejících nároků, vyznačený tím, že je sdružem s extra- nebo intracelulárním zaměřovacím prvkem.
5. Lipopolyamin podle nároku 4,vyznačený tím, že má zabudován zaměřovači prvek v úrovni bočního aminokyselinového řetězce reprezentovaného substituentem R5.
6. Lipopolyamin podle nároku 4 nebo 5, vyznačený tím, že se jedná o buněčný receptorový ligand přítomný na povrchu cílového buněčného typu.
7. Lipopolyamin podle některého z předcházejících nároků
4až6vyznačený tím, že zaměřovači prvek je zvolen z množiny zahrnující cukry, peptidy, jako protilátky nebo fragmenty protilátek, buněčné receptorové ligandy nebo jejich fragmenty, receptory nebo fragmenty receptorů, jako ligandy receptorů růstových faktorů , receptorů cytokinů, receptorů
- 76 buněčných lektinů nebo receptorů adhezních proteinů typu integrinůa receptoru transferrinu, lipidy HDL nebo LDL a/nebo oligonukleotidy.
8. Lipopolyamin podle některého z nároků 4 nebo 5, v y - značený tím, že uvedený zaměřovači prvek je reprezentován signální sekvencí jádrové lokalizace.
9. Lipopolyamin podle některého z předcházejících nároků, vyznačený tím, že má zabudován markér typu bioti,nu, rhodaminu, folátu nebo lineární nebo cyklickou pseudopeptidovou sekvenci,obsahující epitop Arg-Gly-Asp, v úrovni bočního aminokyselinového řetězce reprezentovaného substituentem R5*
10. Lipopolyamin podle některého z předcházejících nároků, vyznačený tím, že je zvolen z množiny zahrnující
H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17-CH3J2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CON[(CH2)17-CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)17-CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArg(Z)2N[(CH2)17-CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(rhodamin· )N[(CH2)17-CH312 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(biotmyl)N[(CH2)17-CH3]2 {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17-CH3]2 {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2CON[(CH2)17-CH3]2 {H2N(CH2)2}2N(CH2)2NHCH2COGlyN[(CH2)17-CH312 {H2N(CH2)2}2N(CH2)2NHCH2CON[(CH2)17-CH312
H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)1712 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CON[(CH2)1712 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)1712 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArg(Z)2N[(CH2)17-CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(rhodamin )N[(CH2)17-CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(biotinyl)N[(CH2)17-CH312 {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17-CH3)2
- 77 {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2CON[(CH2)17-CH3]2 {H2N(CH2)2}2N(CH2)2NHCH2COGlyN[(CH2)17-CH3]2 {H2N(CH2)2}2N(CH2)2NHCH2CON[(CH2)17-CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4N[(CH2)3NH2]CH2COGlyN[(CH2)17CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLysN[(CH2)17CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys[Cl-Z]N[(CH2)17CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys[CHO]N[(CH2)l7CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys [Cholesteryl]N[(CH2)l7CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys[Arachidonyl]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COG1uN[(CH2)17CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COG1u [NÍCH^NKCHJnCHaL
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COG1u[O-Bz]N[(CH2)17CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COG1u [Galaktosamid ]N[(CH2)l7CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlu [Glukosamid ]N[(CH2)17CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlu [Mannosamid ]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH(CH2)3CON[(CH2)17CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CONH(CH2)5CON[(CH2)17CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)i1CH3]2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)t2CH3]2 a
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)13CH3]2.
11. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje alespoň jeden lipolyamin podle některého z nároků
1 až 10a alespoň jednu nukleovou kyselinu.
12. Farmaceutická kompozice podle nároku 11, vyznačená ť í m , že nukleovou kyselinou je desoxyribonukleová kyselina.
13. Farmaceutická kompozice podle nároku 11, vyznačená t í m , že nukleovou kyselinou je ribinukleová kyselina.
14. Farmaceutická kompozice podle nároku 11, 12 nebo 13, ·>» ··« · • 9 ♦ ··· vyznačená tím, že nukleová kyselina je chemicky modifikována.
15. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 11 až 14,vyznačená tím, že nukleovou kyselinou je antimediátorová nukleová kyselina.
16. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 11 až 14, vyznačená tím, že nukleová kyselina obsahuje terapeutický gen.
17. Farmaceutická kompozice obsahující nukleovou kyselinu, lipopolyamin podle některého z nároků 1 až 6 a přísadu schopnou přidružit se ke komplexu lipopolyamin/nukleová kyselina nebo/a zlepšit jeho tranfekční účinnost.
18. Farmaceutická kompozice podle nároku 17, vyznač en á t í m , že přísadou je jeden nebo několik neutrálních lipidů.
19. Farmaceutická kompozice podle nároku 18, vyznačená t í m , že neutrální lipid nebo neutrální lipidy jsou zvoleny z množiny zahrnující syntetické nebo přírodní lipidy, zwitterionové lipidy a lipidy zbavené iontového náboje za fyziologických podmínek.
20. Farmaceutická kompozice podle nároku 19, vyznačená t í m , že jedním nebo několika neutrálními lipidy jsou lipidy se dvěma mastnými řetězci.
21 .
Farmaceutická kompozice podle nároku 19 nebo 20, vy- 79 značená tím, že neutrální lipid nebo neutrální lipidy se zvolí z množiny zahrnující dioleoylfosfatidylethanolamin (DOPE), oleoyl-palmitoylfosfatidylethanolamin (POPE), di-stearoyl, -palmitoyl, -mirystoylfosfatidylethanolamin, jakož i jejich 1- až 3-krát N-methylované deriváty, fosfatidylglyceroly, diacylglyceroly, glykosyldiacylglyceroly, cerebrosidy (jako zejména galaktocerebrosidy), sfingolipidy jako zejména sfingomyeliny) a asialogangliosidy (jako zejména asialoGM! a GM2).
22. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 11 *· až 21, vyznačená tím, že přísadou je nebo přísada obsahuje sloučeninu, která působí v úrovni kondenzace uvedené nukleové kyseliny.
23. Farmaceutická kompozice podle nároku 22, vyznačená tím, že uvedená sloučenina je zcela nebo částečně odvozena od histonu, nukleolinu nebo/a protaminu.
24. Farmaceutická kompozice podle nároku 22, vyznačená tím, že uvedená sloučenina je částečně nebo zcela tvořena peptidovými motivy (KTPKKAKKP) nebo/a (ATPAKKAA), které se kontinuálně nebo nekontinuálně opakují, přičemž počet těchto motivů se může měnit mezi 2 a 10.
25. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 11 až 24,vyznačená tím, že obsahuje 0,01 až 20 ekvivalentů přísady na jeden ekvivalent nukleové kyseliny, výhodně 0,5 až 5 ekvivalentů přísady na jeden ekvivalent nukleové kyseliny, vyjádřeno hmotnostně.
26. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 11 až
25,vyznačená tím, že obsahuje farmaceutický nosič pro injikovatelnou formulaci.
- 80 ·· ···«
4 · • ··♦
27. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 11 až 25,vyznačená tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič pro aplikaci na pokožku nebo/a sliznici.
28. Použití lipolyaminu podle některého z nároků 1 až 10 pro transfekci buněk in vivo nebo in vitro.
29. Způsob přípravy lipopolyaminu podle některého z nároků 1 až 10,vyznačený tím, že se provede kopulace alespoň jedné lipidové frakce s alespoň jednou asymetrie-·, kou polyaminovou frakcí, přičemž se uvedená polyaminová frakce předběžně získá bimolekulární reakcí mezi alkylačním činidlem, které je kovalentně zázáno s pevnému nosiči, a symetrickým polyaminem.
30. Způsob podle nároku 29,vyznačený tím, že kopulace lipidové frakce s asymetrickou polyaminovou frakcí se provádí v úrovni pevného nosiče, ke kterému je vázána asymetrická polyaminová frakce, načež se izoluje takto získaný lipopolyamin .
31. Způsob podle nároku 30,vyznačený tím, že se kromě toho provede zavedení markérů, cukrů nebo fluorescenčních sond na lipopolyamin, vázaný nebo nevázaný na pevný nosič.
Zastupuje :
·· · · ·· · · 9 9· ·
CZ981473A 1995-11-14 1996-11-08 Nová transfekční činidla a jejich farmaceutická použití CZ147398A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9513490A FR2741066B1 (fr) 1995-11-14 1995-11-14 Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ147398A3 true CZ147398A3 (cs) 1998-08-12

Family

ID=9484558

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ981473A CZ147398A3 (cs) 1995-11-14 1996-11-08 Nová transfekční činidla a jejich farmaceutická použití

Country Status (23)

Country Link
US (1) US6171612B1 (cs)
EP (1) EP0861228B1 (cs)
JP (2) JP4176831B2 (cs)
KR (1) KR19990067552A (cs)
AT (1) ATE195721T1 (cs)
AU (1) AU718568B2 (cs)
BR (1) BR9611533A (cs)
CA (1) CA2235721C (cs)
CZ (1) CZ147398A3 (cs)
DE (1) DE69609982T2 (cs)
DK (1) DK0861228T3 (cs)
ES (1) ES2151185T3 (cs)
FR (1) FR2741066B1 (cs)
GR (1) GR3034204T3 (cs)
HU (1) HUP9900605A3 (cs)
IL (1) IL124411A (cs)
MX (1) MX9803761A (cs)
NO (1) NO981944L (cs)
PT (1) PT861228E (cs)
SI (1) SI0861228T1 (cs)
SK (1) SK282173B6 (cs)
WO (1) WO1997018185A1 (cs)
ZA (1) ZA969489B (cs)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2756491B1 (fr) * 1996-11-29 1999-01-08 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition transfectante utile en therapie genique associan t a un virus recombinant incorporant un acide nucleique exog ene, un agent de transfection non viral et non plasmidique
FR2750704B1 (fr) 1996-07-04 1998-09-25 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de production d'adn therapeutique
US6884430B1 (en) 1997-02-10 2005-04-26 Aventis Pharma S.A. Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles
FR2763943B1 (fr) * 1997-05-28 1999-07-09 Rhone Poulenc Rorer Sa Composes, leur preparation et leur utilisation pour le transfert d'acides nucleiques dans les cellules
CA2305575A1 (en) * 1997-09-08 1999-03-18 Valentis, Inc. Hydrophobic glycosylamine derivatives, compositions, and methods for use
BR9907269A (pt) 1998-01-30 2001-04-03 Aventis Pharma Sa Agente de transferência de ácidos nucleicos, composição, utilização de um agente de transferência, e, processos de transferência de ácidos nucleicos nas células, de preparação de uma composição e de tratamento de doenças.
FR2774394B1 (fr) * 1998-01-30 2002-04-26 Rhone Poulenc Rorer Sa Composes transfectants sensibles aux conditions reductrices, compositions pharmaceutiques les contenant, et leurs applications
EP1068188A1 (fr) * 1998-04-02 2001-01-17 Aventis Pharma S.A. Nouveaux agents de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant et leurs applications
FR2777017B1 (fr) * 1998-04-02 2002-08-23 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant et leurs applications
WO1999052858A2 (en) * 1998-04-08 1999-10-21 Celltech Therapeutics Limited Lipids
GB9914045D0 (en) 1999-06-16 1999-08-18 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
GB9918670D0 (en) 1999-08-06 1999-10-13 Celltech Therapeutics Ltd Biological product
GB9919338D0 (en) * 1999-08-16 1999-10-20 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US20020091242A1 (en) 2000-10-11 2002-07-11 Michel Bessodes Acid-sensitive compounds, their preparation and uses
EP1383492A4 (en) * 2001-03-23 2008-12-24 Napro Biotherapeutics Inc MOLECULAR CONJUGATES FOR USE IN CANCER THERAPY
JP4276439B2 (ja) * 2001-05-14 2009-06-10 サントリオン ポリチオ尿素の脂質誘導体
FR2824557B1 (fr) * 2001-05-14 2003-08-29 Aventis Pharma Sa Derives lipidiques de polythiouree
AUPR621501A0 (en) 2001-07-06 2001-08-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of ds rna
FR2829136B1 (fr) 2001-08-29 2006-11-17 Aventis Pharma Sa Derives lipidiques d'aminoglycosides
JP4629333B2 (ja) * 2001-08-29 2011-02-09 アベンティス・ファーマ・ソシエテ・アノニム アミノグリコシドの脂質誘導体
US7472563B2 (en) 2002-01-17 2009-01-06 Alfa Laval Corporate Ab Submerged evaporator with integrated heat exchanger
EP1507561B1 (en) * 2002-05-24 2009-07-15 Mirus Bio Corporation Compositions for delivering nucleic acids to cells
US20060211004A1 (en) 2005-02-15 2006-09-21 Ilsley Diane D Methods and compositions for determining non-specific cytotoxicity of a transfection agent
EP2476756A1 (en) * 2005-06-15 2012-07-18 Massachusetts Institute of Technology Amine-containing lipids and uses thereof
US20100035974A1 (en) * 2006-10-04 2010-02-11 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs Compositions comprising a sirna and lipidic 4,5-disubstituted 2-deoxystreptamine ring aminoglycoside derivatives and uses thereof
WO2008137470A1 (en) * 2007-05-01 2008-11-13 Pgr-Solutions Multi-chain lipophilic polyamines
WO2010026537A1 (en) 2008-09-05 2010-03-11 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Novel multimodular assembly useful for intracellular delivery
EP2365962B1 (en) 2008-11-07 2017-07-05 Massachusetts Institute of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
FR2941152B1 (fr) 2009-01-20 2013-10-18 Centre Nat Rech Scient Vecteurs comprenant une macromolecule anionique et un lipide cationique pour l'administration de petits acides nucleiques.
EP3470395A1 (en) * 2010-11-15 2019-04-17 Life Technologies Corporation Amine-containing transfection reagents and methods for making and using same
CA2831392C (en) 2011-03-28 2020-04-28 Massachusetts Institute Of Technology Conjugated lipomers and uses thereof
WO2013016058A1 (en) * 2011-07-22 2013-01-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel bis-nitrogen containing cationic lipids for oligonucleotide delivery
KR101956751B1 (ko) 2011-10-07 2019-03-11 고쿠리츠다이가쿠호진 미에다이가쿠 키메라 항원 수용체
KR102451116B1 (ko) 2011-10-27 2022-10-06 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 약물 캡슐화 마이크로스피어를 형성할 수 있는, ｎ-말단 상에 관능화된 아미노산 유도체
CZ303963B6 (cs) * 2012-01-13 2013-07-17 Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved CR, v.v.i. Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálních transfekcních systému
US9840479B2 (en) 2014-07-02 2017-12-12 Massachusetts Institute Of Technology Polyamine-fatty acid derived lipidoids and uses thereof
US10201618B2 (en) 2015-06-19 2019-02-12 Massachusetts Institute Of Technology Alkenyl substituted 2,5-piperazinediones, compositions, and uses thereof
WO2017024319A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Tunable endogenous protein degradation
US11052111B2 (en) 2015-12-08 2021-07-06 Chimera Bioengineering, Inc. Smart CAR devices and DE CAR polypeptides for treating disease and methods for enhancing immune responses
EP3506916B1 (en) 2016-09-01 2021-04-07 Chimera Bioengineering Inc. Gold optimized car t-cells
CN111386263A (zh) 2017-02-08 2020-07-07 达纳-法伯癌症研究所有限公司 调节嵌合抗原受体
EP3790896A1 (en) 2018-05-07 2021-03-17 Children's Hospital Medical Center Chimeric polypeptides, nucleic acid molecules, cells, and related methods
JPWO2020213724A1 (cs) 2019-04-19 2020-10-22
JPWO2020246563A1 (cs) 2019-06-05 2020-12-10
MX2023001120A (es) 2020-07-31 2023-02-22 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica que comprende una celula que expresa un receptor quimerico.
EP4310188A1 (en) 2021-03-17 2024-01-24 Daiichi Sankyo Company, Limited Gene coding for chimeric receptor for anti-acetylcholine receptor autoantibody
WO2022214887A1 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Phosphogam, Llc Methods and compositions for enhancing the cytotoxicity of gamma/delta-t cells

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3211692A (en) * 1961-11-06 1965-10-12 Gulf Oil Corp Ethylene polymeric compositions containing substituted ureas
US3965015A (en) * 1972-08-01 1976-06-22 Colgate-Palmolive Company Bleach-resistant fabric softener
DE2355026A1 (de) * 1973-11-03 1975-05-15 Henkel & Cie Gmbh Neue omega-amino-carbonsaeureamide, deren herstellung, sowie verwendung als antimikrobielle mittel
FR2369837A1 (fr) * 1976-11-04 1978-06-02 Labaz Derives actifs de l'uree, leur procede de preparation ainsi que les compositions therapeutiques les contenant
JPS60123451A (ja) * 1983-12-07 1985-07-02 Eisai Co Ltd ポリプレニル系化合物およびその製造方法ならびにそれを含有する医薬
CA1280414C (en) * 1985-03-15 1991-02-19 Saichi Matsumoto Isoprenoidamine derivatives and antiulcer agents
US4828982A (en) * 1985-05-28 1989-05-09 Becton, Dickinson & Company Vesticles and use thereof in an enzyme assay
EP0233101A1 (fr) * 1986-01-13 1987-08-19 Ire-Celltarg S.A. Dérivés de vinblastine et composition pharmaceutique les contenant
JPS6480282A (en) * 1987-09-22 1989-03-27 Nippon Oils & Fats Co Ltd Nonaqueous highly active enzyme
DK523288A (da) * 1987-10-06 1989-04-07 Hoffmann La Roche Aminosyrederivater
JP2720167B2 (ja) * 1988-04-11 1998-02-25 日本ケミファ株式会社 アルキレンジアミン誘導体
FR2645866B1 (fr) * 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
DE59007990D1 (de) * 1989-07-28 1995-01-26 Chemie Linz Gmbh Verfahren zur Herstellung unsymmetrisch substituierter Harnstoffe, Carbamate, Thiocarbamate und substituierter Isocyanate.
JP2620727B2 (ja) * 1990-10-26 1997-06-18 富士写真フイルム株式会社 ペプチド脂質
US5334761A (en) * 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
FR2714830B1 (fr) * 1994-01-10 1996-03-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
US5837533A (en) * 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
FR2730637B1 (fr) * 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations

Also Published As

Publication number Publication date
ZA969489B (en) 1997-06-02
HUP9900605A3 (en) 1999-11-29
GR3034204T3 (en) 2000-11-30
US6171612B1 (en) 2001-01-09
JP4999784B2 (ja) 2012-08-15
SK63198A3 (en) 1998-11-04
AU718568B2 (en) 2000-04-13
DE69609982D1 (de) 2000-09-28
ATE195721T1 (de) 2000-09-15
WO1997018185A1 (fr) 1997-05-22
SK282173B6 (sk) 2001-11-06
ES2151185T3 (es) 2000-12-16
BR9611533A (pt) 1999-07-13
CA2235721A1 (fr) 1997-05-22
FR2741066B1 (fr) 1997-12-12
EP0861228B1 (fr) 2000-08-23
FR2741066A1 (fr) 1997-05-16
EP0861228A1 (fr) 1998-09-02
CA2235721C (fr) 2009-07-14
JP2000501383A (ja) 2000-02-08
MX9803761A (es) 1998-09-30
DK0861228T3 (da) 2000-10-23
DE69609982T2 (de) 2001-01-25
JP2009029790A (ja) 2009-02-12
HUP9900605A2 (hu) 1999-06-28
NO981944D0 (no) 1998-04-29
SI0861228T1 (en) 2000-12-31
PT861228E (pt) 2001-02-28
IL124411A (en) 2001-09-13
NO981944L (no) 1998-04-29
KR19990067552A (ko) 1999-08-25
IL124411A0 (en) 1998-12-06
JP4176831B2 (ja) 2008-11-05
AU7576896A (en) 1997-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ147398A3 (cs) Nová transfekční činidla a jejich farmaceutická použití
JP4467084B2 (ja) 核酸を細胞に導入するための化合物、その製法及びその使用
US6200956B1 (en) Nucleic acid-containing composition, preparation and use thereof
JP4031045B2 (ja) 四級サイトフェクチン
JP2001511113A (ja) ピペラジンベースのサイトフェクチン
JP2000502061A (ja) カチオン脂質複合体
SK282601B6 (sk) Lipopolyamín vo forme D, L alebo DL, farmaceutická kompozícia s jeho obsahom a jeho použitie
JP2002504815A (ja) 新規類のカチオニック核酸トランスフェクション剤
AU759301B2 (en) New agents for transferring nucleic acids, compositions containing them and their uses
CZ20011909A3 (cs) Nová činidla pro přenos nukleových kyselin a farmaceutické prostředky, které je obsahují
CZ418599A3 (cs) Sloučeniny, způsob jejich přípravy a jejich použití pro přenos nukleových kyselin do buněk
MXPA99010489A (en) Compounds, preparation and use for transferring nucleic acids into cells
MXPA00008970A (en) Novel nucleic acid transfer agents, compositions containing same and uses
CZ20003592A3 (cs) Nové sloučeniny vhodné jako činidla pro přenos nukleové kyseliny do buňky, způsob jejich přípravy a farmaceutické přípravky obsahující tyto sloučeniny
MXPA99010765A (en) Novel class of nucleic acid cationic transfecting agents
MXPA97006016A (en) Composition containing nucleic acids, preparation and use
MXPA01005457A (es) Nuevos agentes de transferencia de los acidos nucleicos composiciones que los contienen y sus usos
CZ430399A3 (cs) Nová třída kationtových činidel pro přenos nukleových kyselin a farmaceutické prostředky, které je obsahují

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic