CN1810834B - 制备高纯度白蛋白溶液的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了制备高纯度白蛋白溶液的方法，该方法包括对白蛋白(优选由转化的酵母表达和分泌的)进行一系列层析步骤。优选此方法包括主动方式阳离子交换层析，主动方式阴离子交换层析，主动方式亲和层析，被动方式亲和层析(优选使用固相化氨基苯硼酸)，被动方式阳离子交换层析，和被动或主动方式阴离子交换层析。本发明还公开了用于降低白蛋白溶液中镍的水平的方法，以及一种重组白蛋白编码序列，其含有两个或多个位于同一读码框架内的翻译终止密码子。本发明还公开了产生重组白蛋白的方法，该方法包括培养能表达重组白蛋白编码序列的真菌细胞，其中所述细胞使重组表达的白蛋白发生甘露糖基化的能力降低。

Description

制备高纯度白蛋白溶液的方法
本申请是基于申请号为200410005015.3，申请日为2000年1月31日，发明名称为“制备高纯度白蛋白溶液的方法”，国际申请号为PCT/GB00/00257的发明申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及纯化从血清或血浆提取的人血清白蛋白(HSA)，或用编码人血清白蛋白氨基酸序列的核苷酸序列转化或转染生物而生产的重组人白蛋白(rHA)，包括使用转基因动物或植物而生产的rHA的方法。在本说明书中，术语“白蛋白”一般指HSA和/或rHA。
背景技术
白蛋白用于处理严重烧伤，休克或失血的患者。它也用作培养高等真核细胞的培养基添加剂和药理学活性化合物的赋形剂，其中许多有待稳定。目前，通过从人血液中提取白蛋白来满足对此产品的需要。提取和分离技术的实施例包括公开于：JP 03/258728中关于阳离子交换剂的使用；EP428758中关于阴离子交换的使用；和EP 452753中加热，加盐和渗滤的使用。
已经在EP 330451和EP 361991中公开了微生物中rHA的生产。针对rHA的纯化技术已经公开于：WO 92/04367，去除介质源性染料；EP 464590，去除酵母源性色料；EP 319067，rHA的碱沉淀反应和随后在亲脂相的应用；和包含几个彻底纯化方法的WO 96/37515。
本发明代表对WO 96/37515和US 5728553(在此引入作为参考)中所述方法进一步开发的结果。
发明内容
本发明的第一方面提供纯化白蛋白溶液的方法，此方法包括将pH8.0-9.5，电导率在1-75mS.cm-1范围内的起始白蛋白溶液进行就白蛋白而论为被动方式的亲和层析步骤并且层析利用含固相化二羟基硼基的亲和介质，由此获得纯化的白蛋白溶液。
优选所述起始白蛋白溶液的pH值为pH8.0-9.0，更优选pH8.3-8.6。优选将所述起始白蛋白用溶液上述pH范围内的缓冲液缓冲。
优选所述缓冲液包括浓度10-500mM的氨基酸，优选浓度为25-200mM，更优选50-150mM。优选所述氨基酸是甘氨酸。
优选所述缓冲液包括浓度为0-500mM的一价阳离子，优选浓度为25-200mM，更优选50-150mM。优选所述一价阳离子是钠，优选为NaCl的形式。相应地，在优选实施方案中缓冲液包括浓度为0-500mM的NaCl，优选浓度为25-200mM，更优选50-150mM。
优选所述缓冲液包括浓度为5-250mM，优选10-100mM的二价阳离子。优选所述二价阳离子是钙，优选为CaCl2的形式。相应地，在优选实施方案中缓冲液包括浓度为5-250mM，优选10-100mM的CaCl2。
在一个具体优选实施方案中所述起始白蛋白溶液和/或缓冲液包括约100mM甘氨酸，约100mM NaCl和约50mM CaCl2.
优选所述起始白蛋白溶液和/或缓冲液的电导率为10-50mS.cm-1，更优选18-22mS.cm-1。
在所述起始白蛋白溶液中白蛋白的浓度在20-120g.L-1范围内较有利，优选70-120g.L-1，更优选100±10g.L-1。优选将所述白蛋白上样至小于0.5倍柱体积，更优选小于0.35倍柱体积。
优选所述介质包括硼酸(boronic acid)。术语“酸”在本文包括它们的盐。使所述硼酸经三嗪或取代的三嗪结合至支持物如琼脂糖等，形成如单硼三嗪或二硼三嗪。优选所述硼酸为氨基苯硼酸。
关于苯硼酸替代物，如脂肪酸族配基和取代型芳香族配基的文献包括：Adamek，V.等(1992)J.Chrom.625，91-99，Singhal，R.P.等(1991)J.chrom543，17-38和liu，X.等(1994)687，61-69。
在亲和层析步骤后优选对纯化的白蛋白溶液进行进一步纯化，优选进一步层析纯化。优选将白蛋白进一步用阳离子交换层析和/或阴离子交换层析纯化。只要仍是进行纯化目的可以将阳离子和阴离子交换步骤的顺序互换，从操纵的角度看，优选先进行阳离子交换层析随后进行阴离子交换层析。
按照本发明第一方面的方法生产的纯化白蛋白溶液优选进行下列一种或多种处理：缓冲液交换；浓缩；稀释；透析；渗滤；pH调节(优选pH高于pH2.0或pH4.0，且优选pH低于pH10.0)；用还原剂处理(例如在EP 570916中描述的)；脱色处理(例如用炭)；加热(包括灭菌)；冷却或调节状态；制成人类非肠道给药的制剂；或放于最后的容器中。
经肠道外给药包括静脉给药，皮下给药和肌肉内给药。所述白蛋白可以作为能经肠道给药的药理活性蛋白质的赋形剂。
“最后容器”是指离开制造商并被分送到诸如医院和药店等用户处的容器。
本发明的第二方面提供纯化白蛋白溶液的方法，此方法包括阳离子交换层析和阴离子交换层析，其中所纯化的白蛋白溶液可任选进行一种或多种以下处理：缓冲液交换；浓缩；稀释；透析；渗滤；pH调节(优选至pH高于pH2.0或pH4.0，且优选至pH低于pH10.0)；加还原剂；脱色处理(例如用炭)；加热(包括灭菌)；冷却；或调节状态，但是在放入最后的容器之前不进行进一步纯化，特别是不进行进一步层析纯化。
阳离子交换层析步骤可以在阴离子交换层析步骤之后进行，或反过来。优选阳离子交换层析步骤之后进行阴离子交换层析步骤。
优选在阳离子和阴离子交换步骤之间，尽管可以对白蛋白进行如上所述的缓冲液交换等，但没有进一步纯化步骤。
通过调节状态，我们的意思是指为方法中下一步骤或最后应用而改善白蛋白环境或状态的任何非纯化处理步骤。调节状态可包括加入白蛋白稳定剂如辛酸酯和/或其它脂肪酸，如C6或C10脂肪酸，或乙酰色氨酸钠或扁桃酸盐。调节状态也可以包括添加盐等，并且可涉及对白蛋白溶液电导率的调节。
本发明的第一和第二方面中阳离子交换步骤可以以针对白蛋白被动或主动的方式进行。在优选实施方案中阳离子交换步骤就白蛋白而言是被动方式进行的。优选所选条件可以使糖基化白蛋白对阳离子交换物质的结合强于非糖基化白蛋白。
本发明的第一和第二方面中阳离子交换层析步骤可以使用商业性的阳离子交换介质例如SP-SepharoseFF，SP-Spherosil，CM-SepharoseFF，CM-纤维素，SE-纤维素或S-Spheradex。优选阳离子交换步骤利用含固相化磺基丙基取代基作为阳离子交换剂的介质。
优选进行阳离子交换层析的白蛋白溶液pH值为4.5-6.0，更优选pH5.0-5.6，还更优选pH5.2-5.4。
优选进行阳离子交换层析的白蛋白溶液所含白蛋白浓度为10-250g.L-1，优选20-70g.L-1，还更优选50±10g.L-1。
优选进行阳离子交换层析的白蛋白溶液所含辛酸根浓度为2-15mM，优选5-10mM，更优选6-9mM。
方便地，在阳离子交换步骤前，对白蛋白溶液进行一种或多种下列处理：(i)pH调节(优选至pH高于pH2.0或pH4.0，且优选pH低于pH10.0)；(ii)浓缩；(iii)渗滤；或(iv)通过加入稳定剂如辛酸盐和/或其它脂肪酸，如C6或C10脂肪酸，或乙酰色氨酸钠或扁桃酸盐来调节状态。或者，额外对白蛋白溶液进行一种或多种以下处理：缓冲液交换；稀释；透析；渗滤；用还原剂处理；脱色处理(例如用炭)；加热；冷却；或调节状态。
总体上，任何修改均涉及添加，而非去除。优选通过加入乙酸调节白蛋白溶液的pH值，优选通过超滤法将白蛋白溶液浓缩。
本发明第一和第二方面的阴离子交换层析步骤可以利用商业性的阴离子交换介质例如QSepharose-FF，QMA-Spherosil，DEAE-Spherodex，Q-HyperD，DEAE-纤维素，QAE-纤维素，或TMAE，DMAE，或DEAE Fractogel。优选阴离子交换步骤利用含固相化二烷基氨基烷基(例如二乙基氨基乙基)取代基作为阴离子交换剂的介质。
在一个优选实施方案中本发明第一和第二方面的阴离子交换层析步骤就白蛋白而论以被动方式进行。
优选进行被动方式阴离子层析的白蛋白溶液pH值为4.0-5.2，更优选pH4.2-4.9，还更优选pH4.5-4.7。
优选进行阴离子交换层析的白蛋白溶液的电导率低于4.0mS.cm-1，还更优选电导率1.0±0.5mS.cm-1，还更优选1.05±0.1mS.cm-1。
方便地，在阴离子层析步骤前，对白蛋白溶液进行pH调节和/或用水稀释。优选用乙酸调节白蛋白溶液的pH值。
在另一个优选实施方案中，本发明的第一和第二方面的阴离子层析步骤就白蛋白而论以主动方式进行。
优选进行主动方式阴离子交换层析的白蛋白溶液pH值为6.0-8.0，优选pH6.5-7.5，还更优选pH6.8-7.2。优选用正磷酸盐离子进行白蛋白溶液的pH值调节。
在一个优选实施方案中白蛋白浓度为10-100g.L-1，更优选25-80g.L-1，且最优选30±60g.L-1。优选白蛋白溶液的电导率为1.0-2.0mS.cm-1，优选1.2-1.6mS.cm-1。
将白蛋白从阴离子交换剂上洗脱时最好用包含20-90mM磷酸盐，例如磷酸钠的缓冲液，优选30-70mM还更优选35-65mM。优选用pH6.0-8.0(更优选pH6.5-7.5)的缓冲液将白蛋白从阴离子交换剂上洗脱。
尤其优选在本发明的第一和第二方面步骤之前进行一种或多种下列步骤：发酵；初级分离；集中调节状态；阳离子交换层析，优选使用磺基丙基取代基作为阳离子交换剂；阴离子交换层析，优选使用二乙基氨基烷基取代基作为阴离子交换剂；或亲和层析，优选使用含固相化白蛋白特异性染料的亲和介质，优选Cibacron蓝型染料。
本发明一个优选实施方案中提供的纯化白蛋白的方法包括下列步骤：
(a)对白蛋白溶液进行就白蛋白而言为主动方式的阳离子交换层析步骤；
(b)收集包含白蛋白的阳离子交换洗脱物；
(c)对所述阳离子交换洗脱物进行就白蛋白而言为主动方式的阴离子交换层析步骤；
(d)收集包含白蛋白的阴离子交换洗脱物；
(e)对所述阴离子交换洗脱物进行就白蛋白而言为主动方式的亲和层析步骤；
(f)收集包含白蛋白的亲和层析洗脱物；
(g)对所述亲和层析洗脱物进行就白蛋白而言为被动方式并且就糖偶联物(糖基化白蛋白和/或糖蛋白)而言为主动方式的亲和层析步骤；
(h)收集包含所述白蛋白的亲和层析流出物；
(i)对所述亲和层析流出物进行就白蛋白而言为被动方式的阳离子交换层析步骤；
(j)收集包含所述白蛋白的阳离子交换层析流出物；
(k)对所述阳离子交换流出物进行被动方式或主动方式的阴离子交换层析步骤；
(l)收集被动方式阴离子交换步骤后含白蛋白的阴离子交换流出物；或主动方式阴离子交换步骤后从阴离子交换介质上洗脱出的阴离子交换洗脱物；
并且上述纯化步骤中任一步可任选在其之前或随后进行一种或多种以下处理：缓冲液交换；浓缩；稀释；透析；渗滤；pH调节(优选至pH高于pH2.0或pH4.0，且优选pH低于pH10.0)；用还原剂处理；脱色处理(例如用炭)；加热(包括灭菌)；冷却；或调节状态。
相应地，纯化步骤可以用或不用下列一种或多种步骤间隔：缓冲液交换；浓缩；稀释；透析；渗滤；pH调节；用还原剂处理；脱色处理；加热；冷却；或调节状态。
当任何步骤以针对白蛋白为被动的方式进行时，除流出物外也要收集洗脱物。
本发明另一优选实施方案提供的纯化白蛋白的方法包括下列步骤：
(a)对白蛋白溶液进行就白蛋白而言为主动方式的阳离子交换层析步骤；
(b)收集包含白蛋白的阳离子交换洗脱物；
(c)对所述阳离子交换洗脱物进行就白蛋白而言为主动方式的阴离子交换层析步骤；
(d)收集包含白蛋白的阴离子交换洗脱物；
(e)对所述阴离子交换洗脱物进行就白蛋白而言为主动方式的亲和层析步骤；
(f)收集包含白蛋白的亲和层析洗脱物；
(g)对所述亲和层析洗脱物进行就白蛋白而言为被动方式并且就糖偶联物而言为主动方式的亲和层析步骤；
(h)收集包含所述白蛋白的亲和层析流出物；
(i)对所述亲和介质流出物进行就白蛋白而言为被动或主动方式的阴离子交换层析步骤；
(j)收集被动方式阴离子交换步骤后含所述白蛋白的阴离子交换流出物；或主动方式阴离子交换步骤中从阴离子交换介质上洗脱的阴离子交换洗脱物；
(k)对经过阴离子交换层析纯化的白蛋白溶液进行以白蛋白而论为被动方式的阳离子交换层析步骤；
(l)收集包含所述白蛋白的阳离子交换层析流出物；
并且上述纯化步骤中任一步可任选在其之前或随后进行一种或多种以下处理：缓冲液交换；浓缩；稀释；透析；渗滤；pH调节(优选至pH高于pH2.0或pH4.0，且优选pH低于pH10.0)；用还原剂处理；脱色处理(例如用炭)；加热(包括灭菌)；冷却；或调节状态。
相应地，所述纯化步骤可以用或不用下列一种或多种步骤间隔：缓冲液交换；浓缩；稀释；透析；渗滤；pH调节；用还原剂处理；脱色处理；加热；冷却；或调节状态。
优选在本发明主动方式阳离子交换步骤之前，将白蛋白溶液如上述调节状态。优选向其中加入辛酸盐至终浓度大约1-10mM且调节pH值至约4.0-5.0。
有利地，将滞留在阳离子交换步骤中的白蛋白在洗脱前用高盐溶液(例如已缓冲为pH3.5-4.5的0.5-3.0M NaCl，优选约pH4.0，10-100mM，优选20-40mM，例如25-30mM乙酸钠)洗涤。
优选将在阳离子交换步骤中的白蛋白用含特异亲和白蛋白之化合物的缓冲液洗脱，所述化合物优选酸，例如辛酸盐或其他脂肪酸，如C6或C10。
合适地，用包含高水平(例如至少50mM，优选50-200mM，例如80-150mM)硼酸盐的缓冲液，例如四硼酸钠或四硼酸钾，将白蛋白从第一次阴离子交换步骤的阴离子交换剂上洗脱。
优选主动方式亲和层析步骤使用含固相化白蛋白特异性染料的树脂，所述染料如Cibacron蓝型染料，优选其通过间隔臂固定于树脂上，所述间隔臂如1，4-二氨基丁烷或另一种C1-8间隔臂，优选C1-6，例如C1-5且最优选C4长度，优选具有α，ω-二氨基取代。优选所述介质是按WO 96/37515中所述制备的“δ蓝介质”(DBA)。
本发明的第三方面提供减少白蛋白溶液中镍离子水平的方法，此方法包括将白蛋白溶液调至pH2.5-7.5，优选2.5-6.0，并除去镍离子。优选将白蛋白溶液调至pH4.0-7.5，优选4.0-6.0，更优选pH4.0-5.5，还更优选4.0-pH5.0，最优选pH4.0-pH4.5。
优选本发明第三方面的方法包括对pH2.5-6.0或具有pH在前述提到的一种pH范围的缓冲液渗滤。或者，用pH在上述列出的一种pH范围的缓冲液通过凝胶通透层析可以完成镍离子的去除。凝胶通透层析可以用Sephacryl S200HR进行。优选缓冲液包括乙酸根和/或苹果酸根。或者，白蛋白有足够的缓冲能力可以承受pH调节并用水进行渗滤/凝胶通透层析。
或者可以从白蛋白中将镍离子螯合并去除。此方法可以用螯合剂，如低pH条件下，优选pH4.0-6.0，更优选pH4.0-4.5固定于Sepharose(螯合的Sepharose，Pharmacia)或另一种聚合物(例如Chelex，Bio Rad实验室)上的亚氨基二乙酸来完成。
优选当将本发明的第三方面方法的产物立即进行被动方式阳离子交换层析时优选本发明第三方面包括将白蛋白溶液调至pH5.0-5.6。相反地，当不将本发明的第三方面方法的产物立即进行被动方式阴离子交换层析时优选本发明第三方面包括将白蛋白溶液调至pH4.3-4.9。
在本发明的第一，第二和第三方面的优选实施方案中，通过在发酵培养基中培养用编码白蛋白的核苷酸序列转化的真菌，使该真菌表达白蛋白并将其分泌到培养基中，可从获得的真菌培养基衍生得到起始白蛋白溶液。所述真菌可以是丝状真菌例如曲霉属。优选所述真菌是酵母。更优选真菌是糖酵母属(例如酿酒酵母)，克鲁维酵母属(例如乳酸克鲁维酵母)或毕赤酵母属(例如巴斯德毕赤酵母)。
优选至少某些按照本发明第一，第二或第三方面纯化的白蛋白是用细胞按本发明第五方面或按照本发明第六方面的方法生产的。
本发明的第四方面提供可由本发明前述任一方面的方法获得的白蛋白溶液。优选白蛋白溶液包括具有下列一种或多种特性的重组白蛋白：
(1)与伴刀豆球蛋白A结合的少于0.5％(w/w)，优选少于0.2％或0.15％；
(2)糖基化水平小于0.6摩尔己糖/摩尔蛋白质，且优选小于0.10，0.075或0.05摩尔基糖/摩尔蛋白质。
按照本发明的方法制备的纯化的白蛋白溶液可以根据其预期用途进一步加工。例如，可以将它通过超滤膜超滤以获得具有白蛋白浓度至少约10g/L的超滤滞留物，优选至少40g白蛋白/L或更优选约80g白蛋白/L，并使该超滤滞留物对至少5倍于滞留物的水渗滤。
本发明的第五方面提供包括重组白蛋白编码序列的DNA序列，质粒或细胞，其中重组白蛋白编码序列3’端包括两个或多个框架内翻译终止密码子，优选三个框架内翻译终止密码子。
本发明第五方面的重组细胞可以是真核细胞或原核细胞。这些重组细胞可以是细菌(例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)，酵母(例如糖酵母属的酵母(例如酿酒酵母)，克鲁维酵母属的酵母(例如乳酸克鲁维酵母)或毕赤酵母属的酵母(例如巴斯德毕赤酵母))，丝状真菌(例如曲霉属)，植物或植物细胞，动物或动物细胞(它可以是转基因的)或昆虫细胞。
本发明的第六方面提供生产重组白蛋白的方法，此方法包括培养表达重组白蛋白编码序列的真菌细胞并获得所述白蛋白，其中所述细胞具有基因修饰，其至少使所述细胞对重组白蛋白的甘露糖基化能力降低并且其中培养基至少1,000L且pH值为6.0-6.8。
在本发明的含义中，基因修饰优选意味着真菌细胞DNA序列的一个或多个碱基或片段的任何抑制，取代，缺失或添加。这种基因修饰可以在体外(直接在分离的DNA上)或在原位完成，例如通过基因工程技术或通过将真菌细胞暴露于诱变剂。诱变剂包括例如物理因素诸如能量射线(X射线，γ射线，紫外线等等)或能与DNA不同功能基团反应的化学试剂，例如烷化剂(EMS，NQO等等)双烷化剂，嵌加剂，等等。基因修饰也可以通过基因的破坏获得，例如按照Rothstein等公开的方法[酶学方法194(1991)，281-301]。按照此方法，将基因的部分或全部用体外改良型同源重组而置换。基因修饰也可以通过在DNA序列上任何突变性的插入而获得，例如转座子，噬菌体等等。
已知某种修饰例如点突变可以通过细胞机制回复或变弱。这样的修饰不能提供本发明真菌细胞修饰的最有用形式因为它们的表型特征可能很不稳定。相应地，优选基因修饰是稳定遗传的和/或非回复的和/或非渗漏的。这样的修饰一般通过缺失或基因破坏而获得。
“渗漏突变”和其符合语法规则的其它表述方式，指包括野生型功能部分失活而非全部失活的突变体。
通过本发明真菌细胞完成的基因修饰可以定位于该细胞DNA序列的编码区和/或影响基因表达的区域。更具体而言，该修饰一般会影响编码区或者负责或参与一个或多个基因表达的区，这些基因的表达产物是参与甘露糖基化的酶。
本发明真菌细胞使蛋白甘露糖基化的能力降低可能因为无活性酶的产生，这源于结构和/或构象变化，产生改变了生物特性的酶产物，所述酶产物生产的缺乏，或所述酶产物的低水平产生。
真菌细胞甘露糖基化途径涉及第一个甘露糖残基对蛋白质或肽的丝氨酸和/或苏氨酸羟基的连接，然后通过随后添加甘露糖残基而延长至O-连接的双-和寡糖。第一个甘露糖残基从多萜醇一磷酸甘露糖(Dol-P-Man)转移到内质网中蛋白质上，其它甘露糖残基从高尔基体中的GPD-Man转移。
在本发明的一个优选实施方案中，修饰的真菌细胞具有至少一个基因中的基因修饰，此基因的表达产物参与甘露糖残基对丝氨酸或苏氨酸羟基的结合。
在本发明的另一个优选实施方案中，修饰的真菌细胞具有至少一个基因中的基因修饰，此基因的表达产物参与甘露糖残基从Dol-P-Man前体向丝氨酸或苏氨酸羟基的转移。而还更优选这些基因之一是PMT基因(例如PMT1，PMT2，PMT3，PMT4，PMT5，PMT6或PMT7)。优选PMT基因是PMT1，PMT5或PMT7。
WO 94/04687，在此引入以作参考，描述了O-甘露糖基化活性缺陷型酿酒酵母的制备。通过基因破坏，URA3基因插入PMT1开放读码框架的HindIII限制性酶切位点可制备O-甘露糖基化活性缺陷型酿酒酵母。将所得突变体在YEPD(约pH6.95)上培养或在基本培养基+Ade，+Leu(约pH4.75，随酵母生长而下降)。意外地，我们发现在WO 94/04687使用的生长培养基的pH值对于大规模培养PMT突变体以产生分泌型白蛋白不是最佳的。就大规模发酵期间宿主细胞完整性而言，我们发现pH6.0-6.8的生长培养基是较好的。
除了在参与甘露糖残基对丝氨酸或苏氨酸羟基之连接的基因中的修饰外，本发明的真菌细胞也可以在以下基因中带有修饰，即参与随后添加甘露糖残基形成二-或寡糖的基因或参与甘露糖残基供体(Dol-P-Man)合成的基因。
优选所述真菌细胞在PMT基因内或影响PMT基因表达或产物的基因内具有修饰。影响PMT基因表达的基因可以，例如，影响mRNA转录水平或PMT产物水平。
本发明第六方面的真菌细胞可以从丝状真菌和酵母中选择，例如糖酵母属(例如酿酒酵母)，克鲁维酵母属(例如乳酸克鲁维酵母)或毕赤酵母属(例如巴斯德毕赤酵母)。
优选将表达重组白蛋白编码序列的真菌细胞在至少5,000L培养基中培养，更优选至少7,500L。
优选将表达重组白蛋白编码序列的真菌细胞在维持于pH6.2-6.7范围内的培养基中培养，更优选pH6.3-6.5。优选将培养基的pH范围用设置为pH6.3-pH6.5之间的pH控制仪保持，优选设置为pH6.35-pH6.45之间，更优选约pH6.4。优选将pH控制剂控制在上述任一pH范围中任何pH值的0.20或0.10pH单位或pH6.4的0.20或0.10pH单位内变动。
在另一实施方案中，将真菌细胞在保持pH5.30-pH5.90范围的培养基中培养，优选pH5.50-pH5.90，pH5.40-pH5.90或pH5.40-pH5.60。优选低控制设置点在pH5.40-pH5.60之间，优选在pH5.45-pH5.55之间，更优选低控制设置点是约pH5.50。
本发明提供制备高纯度白蛋白的方法。此白蛋白的特征是色料水平非常低。用在此处的术语“色料”意思指使白蛋白着色的任何化合物。例如，色素是由生物如用于制备重组白蛋白的酵母所产生的色料，而染料是由纯化白蛋白的层析步骤产生的色料。
此白蛋白的特征也在于非常低水平的，或基本上不含，铝，乳酸盐，柠檬酸盐，金属，非白蛋白的人类蛋白质，例如免疫球蛋白，前-激肽释放酶激活剂，转铁蛋白，α1-酸糖蛋白，血红蛋白和凝血因子，原核蛋白，白蛋白片段，白蛋白凝聚物或聚合体，或内毒素，胆红素，血红素，酵母蛋白，动物蛋白和病毒。基本上不合是指低于可检测到的水平。
本发明的白蛋白可以至少99.5％是单体和二聚体，优选基本上100％为单体和二聚体。最多0.5％，优选0.2％的三聚体是容许的但是白蛋白的更大分子形式一般是没有的。它还有下列一个或多个特征：其镍离子水平低于100ng/克白蛋白；用Amadori产物测定法检测的糖基化水平低于0.6，优选低于0.10，0.075或0.05摩尔己糖/摩尔蛋白质；完整的即均质的C-末端；conA结合的白蛋白低于0.5％(w/w)，优选低于0.2％或0.15％；游离硫醇含量低于0.85摩尔SH/摩尔蛋白质；基本上无C18或C20脂肪酸。用本发明方法纯化的白蛋白制剂中蛋白质总重量的至少99％，优选至少99.9％是白蛋白。如此高纯度的白蛋白是极不可能引起副作用的。
由于在起始原料中不存在血清，所以一般本发明的纯化rHA完全无源自血清的污染。
按照本发明，可从不纯的白蛋白溶液获得高纯度的白蛋白。此方法包括一个或多个下列步骤：在发酵培养中培养用编码人白蛋白氨基酸序列的核苷酸序列转化的微生物；优选将所述微生物与发酵培养基分离；必要时调节培养基状态以便进一步纯化；将调节过的培养基通过三个连续的层析步骤；将产物超滤/渗滤；将超滤产物进行进一步层析步骤；在通过另两步层析步骤纯化前再次超滤/渗滤；最后超滤/渗滤。
或者，不用所述发酵培养基，可以用近50年来发展的任何提取和纯化技术从血清中获得不纯的白蛋白溶液，例如Stoltz等(1991)Pharmaceut.Tech.Int.1991年6月，60-65和More&Harvey(1991)在“血液分离和血浆分级分离”Harris编，Wiley-Liss，261-306中所述。
或者可以从转基因动物，例如山羊，绵羊或牛获得白蛋白，例如从，所述动物的牛奶或血液或，如果是转基因鸡，从蛋清获得。
又或者可以从转基因植物，例如烟草，马铃薯或谷类(玉米)获得白蛋白。
当白蛋白从非血浆来源纯化时，现有技术中的纯化方法导致相当高水平的镍离子。已知白蛋白在其分子N-末端具有对铜，镍和锌离子高亲和力的结合位点。结果，白蛋白分子从用于培养和/或纯化的培养基中强力聚集镍离子。按照本发明纯化的白蛋白具有相当低水平的镍离子。
在本发明的任意步骤之前或随后可以对白蛋白溶液进行缓冲液交换，浓缩，稀释，加热(包括灭菌)，冷却或者可以向白蛋白溶液中加盐等，这可以，例如，改善或调节该溶液的pH值。可以任选将白蛋白用还原剂处理或可进行脱色步骤。
可以将最终产物配制成具有添加稳定性并可根据其预期用途配制，例如可以将其制成制剂用于胃肠外给药，优选对人的非肠道给药。合适地，将白蛋白进行灭菌。
优选本发明的高纯度白蛋白产物包含至少100g，更优选1kg或10kg白蛋白，它们可以被分成许多瓶。
除了在烧伤，休克或失血时用于治疗外，本发明的白蛋白可以有许多作用。如可将它作为终产物赋形剂(例如在液体制剂，冻干制剂或吸入制剂中)，用于纯化过程中使其他蛋白质稳定，用于细胞培养，病毒的生产，基因治疗，体外培养基灭菌，和用于医疗设备如插管，导管和血管假体的涂层。
应理解可将本发明的每一方面与本发明的一个或多个其他方面组合。
附图说明
在附图中进一步说明本发明，其中：
图1至7分别表示质粒pAYE309，pAYE440，pAYE438，pDB2241，pDB2242，pDB2243和pDB2244的构建；和
图8表示按照本发明制备的rHA中conA结合型rHA级分的电喷射质谱图。
图9表示pH值和时间对用ChelexTM从rHA中去除镍的影响。
图10和11代表与酿酒酵母PMT1蛋白编码区具有同源性的两种DNA序列。
图12至15代表与酿酒酵母PMT7蛋白编码区具有同源性的四种DNA序列。
图16和17代表与酿酒酵母PMT5蛋白编码区具有同源性的两种DNA序列。
具体实施方式
本发明的方法可用于从多种来源的不纯的白蛋白溶液如血清获得高纯度白蛋白，尤其适用于纯化重组人白蛋白(rHA)。按照本发明生产的白蛋白可以是任何哺乳动物的白蛋白，例如大鼠，牛或羊的白蛋白，但是优选是人白蛋白。
可以将编码白蛋白的DNA在合适的宿主内表达以生产白蛋白。因此，可以按照已知技术使用DNA，根据本文所含指教作适当的修改，以构建表达载体，然后将其用于转化合适的宿主细胞从而表达和生产白蛋白。
为导入合适的宿主内可以将编码白蛋白的DNA连接到很多种其它DNA序列中。所述伙伴DNA将取决于宿主的性质，DNA导入宿主的方式，以及希望以附加体形式保持还是整合。
一般地，为了表达将DNA以正向和正确的读码框形式插入表达载体，例如质粒。如果需要，可以将DNA连接到所选宿主能识别的相应转录和翻译调控核苷酸序列上，但这类调控序列在所述表达载体上通常已存在。为了尽量减少翻译的通读并因此避免延长的，非自然融合蛋白的产生，最好引入一种以上编码翻译终止密码子的DNA序列，例如UAA，UAG或UGA。编码翻译终止密码子的DNA序列优选UAA。然后用标准技术将载体导入宿主，随后筛选已转化的宿主细胞。然后将如此转化的宿主细胞培养足够的时间并且在本领域技术人员熟知的适合条件下培养，并根据本文已公开的指教，使之表达白蛋白并随后回收。
已知有许多表达系统，包括细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)，酵母(例如酿酒酵母，巴斯德毕赤酵母和乳酸克鲁维酵母)，丝状真菌(例如曲霉属)，植物细胞，动物细胞和昆虫细胞。优选微生物是酵母中的酿酒酵母，乳酸克鲁维酵母和巴斯德毕赤酵母。尤其有利的是使用在一种或多种参与蛋白质O-糖基化的甘露糖基转移酶中有缺陷的酵母，例如通过基因编码序列的破坏造成的缺陷。
白蛋白的蛋白质序列不包含任何N-连接糖基化位点并且尚无在天然状态下被O-连接的糖基化的报道。然而，已经发现在许多酵母种属生产的rHA可以经通常有甘露糖参与的O-连接的糖基化来修饰。甘露糖基化的白蛋白能结合伴刀豆球蛋白A。由酵母生产的甘露糖基化白蛋白的量可以通过使用缺陷一种或多种PMT基因的酵母株(WO94/04687)而降低。
达到此目的最方便的方式是创建具有基因组缺陷的酵母因此产生降低了水平的其中一种Pmt蛋白质。例如，可以在其编码序列或调节区(或调节PMT基因之一表达的另一个基因中)缺失，插入或转座因而产生少量或不产生Pmt蛋白质。或者，可以将酵母转化以产生抗-Pmt因子，例如抗-Pmt抗体。
为了修饰其中一种PMT基因以致生产降低了水平的Pmt蛋白质，可以使用定点诱变或其他已知技术以创建单或多突变，例如置换，插入，缺失，和转座，如在Botstein和Shortle，“体外诱变的战略和应用”，科学，229：193-210(1985)中描述的，在此将其引入以作参考。合适的突变包括链终止突变(明显地导入到近3’端的终止密码子可能对有益的基因产物已影响不足，本领域的技术人员将容易地在该编码序列5’侧四分之三区域中制造突变)，改变读码框架的点突变，编码序列的小到大的缺失，影响基因表达的启动子或终止子内的突变和使mRNA失去稳定性的突变。通过称为基因置换(Winston，F.等(1993)酶学方法101，211-228)的基因破坏技术之延伸技术可以介导特殊的突变。
一般地，使用选择标记破坏基因序列，但是这不是必须情况，尤其如果可以在表型水平上检测破坏事件时。在许多实例中间插序列的插入指终止密码子与Pmt序列共存于个读码框架中且插入的编码序列不被翻译。或者，插入的序列可以在与Pmt不同的读码框架中。
基因可以具有一个或多个切除或转化的部分(可任选包括调节区，甚至整个基因)，或者它可以具有插入部分，从而使其中一个PMT位点的蛋白质生产水平降低和/或使其中一个PMT位点产生活性水平降低了的蛋白质。
酿酒酵母的PMT基因编码O-甘露糖基转移酶家族的七个(PMT1-PMT7)特异性各不相同的蛋白质。这些蛋白质也称作多萜醇磷酸-D-甘露糖：蛋白质转移酶，多萜醇-磷酸-D-甘露糖：蛋白质，O-D-甘露糖基转移酶或磷酸甘露糖转移酶(Gentzsch和Tanner，欧洲分子生物学组织杂志15，5752-5757，1996，和它包括的参考文献)。这种膜整合型酶家族催化甘露糖以多萜醇磷酸甘露糖形式转移到多肽链内丝氨酸或苏氨酸的羟基上，可用下列反应描述：
Mg2+
Dol-P-Man+蛋白质(Ser/Thr)→蛋白质(Ser/Thr)-Man+Dol-P
现有证据表明多萜醇磷酸甘露糖的合成和随后甘露糖向蛋白质的转移发生在内质网内。
很明显这个家族的酶具有不同的底物(蛋白质)特异性(Gentzsch和Tanner(1997)糖生物学(Glycobiology)7，481-486)。参与试验的七种蛋白质有五种是Pmt1p和Pmt2p(分别是PMT1和PMT2基因的产物)的底物，如它们在pmt1或pmt2突变的酿酒酵母株中糖基化不足所显示。另外两种蛋白质明显不受PMT1或PMT2突变的影响，但是在pmt4突变株中糖基化不足。
已经将92kD的Pmt1p蛋白质O-甘露糖基转移酶从溶解的酿酒酵母膜中纯化成同质型(Strahl-Bolsinger和Tanner(1991)欧洲生物化学杂志196，185-190)。编码Pmt1p的基因(PMT1)已克隆并测序。此基因定位在IV号染色体上并且编码具有817个氨基酸的一级序列的单一多肽(Strahl-Bolsinger等(1993)P.N.A.S.USA90，8164-8168)。PMT1(和其他PMT基因)的序列信息可用于在酿酒酵母中相关甘露糖基转移酶编码基因的鉴定。
图10和11显示的序列与酿酒酵母PMT1的蛋白编码区同源，图12至15显示的序列与酿酒酵母PMT7的蛋白编码区同源，图16至17显示的序列与酿酒酵母PMT5的蛋白编码区同源。本领域的技术人员将会理解这些序列的任何一个可以用于鉴定(或破坏)酿酒酵母甘露糖基转移酶基因。可以理解图10至17代表的序列片段可如许多同源于图10至17所示序列及其片段的序列一样作相似使用。产生同源序列的技术是本领域熟知的。
应当理解同源序列在这里指与图10至17中任何一个所示序列，或与图10至17中任何一个所示序列的片段具有至少70％，80％，90％，95％，或98％同源性的序列。
判定同源性百分比可以通过，例如，用Devereux等描述的(核酸研究12：387，1984)GAP计算机程序，6.0版本对比序列信息，此程序可以从维斯康新大学遗传计算机组(UWGCG)获得。GAP程序利用经Smith和Waterman修改(Adv.Appl.Math 2.482.1981)的Neddleman和Wunsch的比对方法(分子生物学杂志48：443，1970)。优选GAP程序的默认参数包括：(1)核苷酸一元对比矩阵(其中同一性分值为1，非同一性分值为0)，及Bribskov和Burgess，核酸研究14：6745，1986的加权对比矩阵，见Schwarts和Dayhoff编，蛋白质序列及结构图谱，国家生物医学研究基金，353-358，1979；(2)每个空位罚分3.0，每个空位中的一个符号额外罚分0.10；和(3)末端空位不罚分。
如果使用除酿酒酵母以外的酵母，如巴斯德毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母，则破坏一种或多种等价于酿酒酵母PMT基因的基因也有利。从酿酒酵母分离的PMT1(或任何其它PMT基因)的序列可用于鉴定或破坏其它真菌种属中编码相似酶活性的基因。乳酸克鲁维酵母的PMT1同系物的克隆在WO94/04687中有描述。
如果使用除酿酒酵母以外的酵母，图10至17代表的序列也可以被用来鉴定(或破坏)等价于酿酒酵母PMT基因的基因。本领域技术人员会理解，图10至17所示序列的片段可如同源于图10-17所示序列及其片段的众多序列一样作类似应用。
实施基因破坏的方法在文献中有描述，如Boehm等(Boehm，T.，Pirie-Shepherd，S.，Trinh，L.，Shiloach，J.和Folkman，J.(1999)酵母15563-572)，其描述酿酒酵母SUC2基因作为标记的应用，该基因侧翼为靶基因特异性的巴斯德毕赤酵母DNA。在巴斯德毕赤酵母破坏的实例中，可以将SUC2DNA序列插入图10至17所示任一种DNA序列内。
如分别在WO95/33833和WO95/23857指出的具有HSP150和/或YAP3基因缺失的酵母会较有利。
在优选实施方案中将酵母用基于酿酒酵母2μm质粒的表达质粒转化。转化酵母时，质粒包含细菌复制和选择序列，它们在转化后，按照EP 286424的方法通过内部重组事件切除。该质粒也包含一个表达盒，其包括：如EP431880所示的酵母启动子(例如酿酒酵母PRB1启动子)；编码分泌前导序列的序列，例如，所述前导序列包括天然HSA分泌前导序列的大部分，加上如WO 90/01063所示的酿酒酵母α-交配因子分泌前导序列的一小部分；HSA编码序列，其可用分离相应人基因cDNA的已知方法获得，并且也公开于，例如，EP 73646和EP 286424；和转录终止子，优选EP 60057所示糖酵母ADH1的终止子。优选该载体结合至少两个翻译终止密码子。
尽管上述质粒各种因素的选择可能有助于改善产物的产量，但是认为与所得白蛋白产物的纯度无直接相关。发酵和纯化方法的优选实施方案在实施例1中描述。
实施例1
构建白蛋白生产型微生物的克隆策略如EP 431880所示，不同的是白蛋白编码序列的3’末端及其与ADH1转录终止序列的连接被改变，从而消除了ADH编码序列并导致出现两个连续的读码框内翻译终止密码子，下游还跟有一个第三终止密码子，如下所示：
.....L    G    L    终止密码    终止密码    A  终止密码
.... TTA  GGC  TTA  TAA         TAA GCT     TAA......
这可用两条单链寡核苷酸JMADH1和JMADH2，对质粒pAYE309的ADH1终止子(见EP 431880)进行PCR诱变来实现，所述引物序列为：
JMADH1
HindIII
5’-GCATAAGCTTTGGACTTCTTCGCCAGAGGTTTGGTCAAG-3’
JMADH2
                                       NotI  BamHI
3’-TGGACAACATTAGCAAGAAGGTGTGCCTAGCGCCGGCGCCTAGGTACG-5’
PCR反应条件为94℃60秒，37℃120秒，72℃180秒的25个循环。0.48kb的PCR产物由HindII和BamHI消化，并连接进入质粒pBST+(见WO97/24445，用HindIII和BamHI作类似消化)，产生质粒pAYE440(图2)。通过两条单链寡核苷酸AT19R和通用的-40引物进行PCR诱变进一步修饰ADH1终止子，所述引物序列如下：
AT19R
HindIII
5’-AGTCCAAGCTTAATTCTTATGATTTATGAT-3’
                        -40
3’-CAGCACTGACCCTTTTG-5’
PCR条件为94℃30秒，50℃40秒，72℃50秒的25个循环，然后一个72℃10分钟循环，采用pAYE440中的ADH1终止子为模板(图2)。使用的仪器为Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600。获得正确大小的产物，约为0.33kb，并用HindIII和BamHI消化。质粒pAYE309(EP 431880)用NotI和HindIII消化，0.84kb DNA片段包含PRBI启动子片段和用于引导成熟HSA分泌的HSA/MFα-1前导序列(WO 90/01063)之一部分，将此DNA片段连接至NotI和HindIII消化的pBST+(WO97/24445)，产生质粒pAYE438(图3)。受体质粒pAYE438由HindIII和BamHI消化，经过修饰的ADH1终止子被成功克隆进此载体，产生质粒pDB2241(图4)。此质粒包含pBST+(WO97/24445)骨架，PRB1启动子和修饰过的ADH1终止子。
为便于在HSA编码区域末端引入两个翻译终止密码子，以及产生所需HindIII位点，改变了HSA编码区域的3’末端。
双链寡核苷酸接头AT21/AT22被连接至AflII/HindIII酶切的pDB2241，在其5’末端包含一个AflII位点，一个填充片段区域，随后是编码HSA的DNA的Bsu36I至HindIII序列，但是多加入一个TAA翻译终止密码子。插入了接头的克隆子经DNA测序确认，正确的质粒指定为pDB2242(图5)。
接头AT21/22
AT21
AflII    Bsu36I    HindIII
TTAAGA GTC CAA GCC TTA GGC TTA TAA TA
CT CAG GTT CGG AAT CCG AAT ATT ATTCGA
            A L G L终止密码 终止密码
为产生最终的rHA表达盒，将pAYE309(图1)的AflII/Bsu36I片段连接至AflII/Bsu36I消化的pDB2242，得到质粒pDB2243(图6)。最终，通过将pDB2243的NotI表达盒连接进入NotI酶切的pSAC35(Sleep等，1991，生物/技术9，183-187和EP 431880)可产生质粒pDB2244(图7)，其中rHA的转录方向与LEU2基因的相同，这样就得到了rHA表达解离(disintegration)载体。
因此质粒pDB2244可由解离载体pSAC3(Chinery和Hinchliffe(1989)当代遗传学16，21-25)得到，其包括整个所述2μm质粒，用于补充宿主leu2突变的LEU2基因，表达盒和细菌质粒pUC9，所述表达盒中PRB1启动子驱动HSA序列的表达。所述细菌质粒由酿酒酵母2μm FLP重组酶系统从pDB2244中切除，使生产rHA的生物(Chinery和Hinchliffe，op cit.)中不含细菌DNA。
所述表达载体利用酿酒酵母PRB1启动子和ADH1转录终止子来控制表达，利用HSA/MFα-1前导序列(WO 90/01063)来引导成熟HSA的分泌。
采用Hinnen等人，(1978)P.N.A.S.75，1929，所述方法将质粒pDB2244引入酿酒酵母菌株leu2，yap3，hsp150，pmt1[cir·]。pmt1突变体可由WO94/04687的方法得到。在缺乏亮氨酸的已缓冲基本培养基(0.15％(w/v)无氨基酸和硫酸铵(Difco)的酵母氮源，0.5％(w/v)硫酸铵，0.1M柠檬酸/Na2HPO4.12H2O pH6.5，2％(w/v)蔗糖))中筛选转化体。转化体于50ml烧瓶中30℃，200rpm生长72小时，所述烧瓶中含10ml复合液(YEP，1％(w/v)酵母浸膏，2％(w/v)细菌用蛋白胨和2％(w/v)蔗糖)或已缓冲的基本培养液，后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和/或火箭凝胶免疫电泳可以在不含细胞的培养上清中检测到rHA。
用缓冲的基本培养基中的细胞培养物母种制备加工酵母的工作种(工作细胞库)，所述酵母适于制备摇瓶培养物，其方式是在有20％(w/v)海藻糖的情况下将所述培养物冷冻分装。
发酵方法在本质上与WO 96/37515和US 5728553(均引入本文为参考)中描述的相同，以下是不同之处：
种子发酵
在把用于rHA生产的培养基加入到种子发酵容器中后，设定操作温度为30℃，同时还设定达到均匀所需的最低搅拌速度，通过如此搅拌可无需诸如氧或碳等营养成分。起始pH用设定为6.40的pH控制计以氨水(比重0.901)调节，控制在6.40±0.10的范围。
可选地，pH可保持在5.50到5.90，设定的较低控制点为5.50。初始pH可用氨(例如氨水，比重0.880)调节。此较低发酵pH可使rHA的质谱特性增强。
因为在线仪器可观察到的生长的最初信号就是pH的降低，所以为方便观察早期代谢，优选初始pH在前述范围的高端附近。
尤其对于一个或多个PMT基因缺陷株，发酵在比通常所需更高的pH下进行是有利的。因此与控制pH在5.5附近相比，设定在pH6.20到pH6.70之间较为有利，优选在pH6.3到6.5。在这类较高pH下，由于细胞分裂的减少，离心液(centrate)的质量得到显著改善。对发酵液的离心只足以从上清中除去所有完整细胞，但细胞分裂产生的细胞碎片将留在悬浮液中。这一点在表1中证实，表中可见酵母在pH6.3到6.5培养比在pH5.5培养，其上清液湿重显著降低。
  发酵pH   上清液湿重(g/L-1)
5.5   9.9(2.4，6)
6.3-6.5   3.4(1.0，13)
表1：种子发酵容器中发酵pH和离心液的关系。括号内的值是标准差和样本数。
2M H2SO4也用作pH矫正试剂。容器中加入蔗糖20g.L-1，MW10分批维生素，Breox FMT30消泡剂0.04g.L-1。
经过过滤除菌的空气以0.5v/v/m(即0.5升未压缩的空气每升培养基每分钟)引入容器中，从无污染摇瓶培养液中取＞10mg细胞干重.L-1接种培养基，启动计算机监控系统。接种浓度为12mg.L-1的批次培养期预计为62±10h。在每批培养期结束前加入MW10(体积等于批体积)。
发酵控制算法的特点包括：由溶解氧张力(DOT)在30分钟内升高＞15％可指示培养期的结束；流加初始速度为每升分批培养液0.05ml；底物流加速度由如下公式确定，SF＝SF0eμk，其中SF是底物流加速度(mL.min-1)；SF0是初始流加速度(mL.min-1)，μ是比生长速率(h-1)(例如0.06h-1)，k是计算变量，以0开始，如果所有的条件都满足的话，每一分钟增长0.0167；DOT＜15％和/或呼吸商(RQ)≥1.2可使底物流加速度(通过k调控)减小。
如果pH＜6.20或如果温度＜29.0℃或＞31.0℃时停止流加。这也可通过所述控制算法自动完成。如果平均RQ＞1.13的时间超过2h，或如果证据显示有乙醇或乙酸积累，SF减小
提高搅拌速度以保持DOT＞20％空气饱和度。一旦流加开始，BreoxFMT30的浓度就提高到0.3g.L-1(以终体积计算)。培养期取决于容器的传递性能限制，预计为期65±17h。
发酵进程中增加通气量以保持氧摄入速率(OUR)和二氧化碳释放速率(CER)，使它们足以提供准确的气体分析。一般发酵通气量为1v/v/m。每天进行检查确定培养的纯度和CDW。保留适当的样品。流加的末期，将培养液转移到生产容器中。
生产发酵
在生产性发酵容器中接种0.25-1.00g.cdw.L-1。初始pH用氨水调节(SG0.901)，所用pH控制仪设定在pH6.40；控制范围6.40±0.10。
可选地，pH可保持在5.50到5.90，设定的较低控制点为5.50。初始pH可用氨(例如氨水，比重0.880)调节。此较低的发酵pH会产生一个增强的rHA质谱图。
因为在线仪器可观察到的生长的最初信号就是pH的降低，所以为方便观察早期代谢，优先选择初始pH在前述范围的高端附近。
尤其对于一个或多个PMT基因缺陷株，发酵在比通常所需更高的pH进行是有利的。因此与控制pH在5.5附近相比，设定在pH6.20到pH6.70之间较为有利，优选在pH6.3到6.5。在这类较高pH下，由于细胞分裂减少，离心液的质量得到显著改善。对发酵液的离心只足以从上清中除去所有完整细胞，但细胞分裂产生的细胞碎片将留在悬浮液中。这一点在表2中证实，该表中酵母在pH6.5培养比在pH5.5培养，其上清液湿重显著降低。
  发酵pH   上清液湿重(g/L-1)
  5.5   36.3
  6.5   4.7
表2：生产容器中发酵pH和离心液的关系。
2M H2SO4也用作pH矫正试剂。容器中加入蔗糖20g.L-1，MW10分批维生素，Breox FMT30消泡剂0.04g.L-1。
初始底物流加速度由如下公式确定：
Figure S051A8658520051031D000221
其中SF0是初始底物流加速度，μ是比生长速率(例如0.06h-1)，V批是批体积(L)，Y x/s是细胞产量(g.L-1)，[蔗糖]是蔗糖浓度(g.L-1)，[CDW]是细胞干重浓度(g.L-1)。底物流加速度按照如下公式确定，SF＝SF0eμk，其中SF是底物流加速度(mL.min-1)；SF0是初始底物流加速度(mL.min-1)，μ是比生长速率(h-1)(例如0.06h-1)，k是计算变量，以0开始，如果所有的条件都满足的话，每一分钟增长0.0167。几个条件在发酵进程中不断进行评估，并用于通过k的操作调整SF；DOT＜15％和/或呼吸商(RQ)≥1.2可使SF减小。pH＜6.2或温度＜29.0℃或＞31.0℃时停止流加。这也可通过控制算法自动完成。如果平均RQ＞1.13持续2h，或如果证据显示有乙醇或乙酸积累，SF减小。
提高搅拌速度以保持DOT＞20％空气饱和度，达到最大值后保持以利于混合。一旦流加开始，培养液处于碳的限制下，Breox FMT30的浓度提高到0.2-0.32g.L-1(以终体积计算)。培养期取决于容器传递性能的限制，8,000升规模通常为90-120h。
发酵进程中通气量渐增以保持氧摄入速率(OUR)和二氧化碳释放速率(CER)在足以提供准确气体分析的水平。容器增压以加强OTR。一般发酵的通气量为1v/v/m。每天进行检查确定培养物的纯度和CDW。保留适当的样品。
流加末期保存培养液供下游处理。
生产培养液的维持
生产培养液在适当条件下维持以便能对其分批处理。保存时间应最短，但可延长至48小时且必要时可超出(如达5天)。应理解在分批处理的情况下，在此表示的保存时间的限制适用于培养液待处理的最后部分。
制备或调节发酵物离心液或其它任何来源的不纯的白蛋白溶液(如血浆)以便在阳离子交换介质上进行层析，并同时保护rHA免于聚合和被蛋白酶裂解。优选加入辛酸钠(层析液14(CS14)-表3)至终浓度1-10mM，例如5mM左右。pH用乙酸调整到pH4.3-4.8，优选4.50±0.1(最优选±0.05)，导电率经检测为＜5.5mScm-1。
层析
所有操作可以在室温(20±5℃)下进行。由SDS-PAGE(在第一步)或GP-HPLC(对于所有其他的柱子)测定上样于层析柱的白蛋白滴度(g/L)。每一步骤由UV吸收值在线监测，例如在254或280nm处监测。
在本发明特别优选例子中，纯化过程包括以下步骤：阳离子交换层析(SP-FF)；阴离子交换层析(DE-FF)；亲和层析(DBA)；超滤和渗滤；第二次亲和层析(PBA)；超滤和渗滤；第二次阳离子交换层析(SP-FF2)；第二次阴离子交换层析(DE-FF2)。优选这些纯化步骤后均进行最终的超滤/渗滤，接着是一个配制步骤，和/或将溶液倒入最终的容器。
在此描述的层析步骤的次序在几个方面是新颖的和创造性的。如本文所述氨基苯硼酸盐(boronate)(PBA)介质及改进型缓冲液的使用，和小体积上样已显示增强了酵母抗原的清除，如ELISA所测(约4-20倍)。氨基苯硼酸盐(PBA)介质使用的缓冲液被意外地发现是特别有益的，它代表了具有广泛组成和性质的多种缓冲液的深入实验结果。与WO96/37515的PBA层析步骤使用的缓冲液相比，该缓冲液极大地增强了对酵母抗原的去除。
将高度浓缩的白蛋白溶液如100±10g.L-1上样到氨基苯硼酸盐介质上，意味着rHA和酵母抗原分辨率可因小体积上样而获得改善。
WO 96/37515在第一次亲和层析后包括一个S200凝胶通透步骤。凝胶过滤步骤使该白蛋白在酵母抗原，色素和白蛋白二聚体方面得到纯化。由于我们对氨基苯硼酸盐亲和层析步骤的改进和另引入了阳离子和阴离子交换步骤，我们发现此步骤不再是必需的。
氨基苯硼酸盐亲和层析后，优选将白蛋白浓缩和渗滤以便进行被动方式的阳离子交换。我们发现此渗滤步骤和阳离子交换步骤的组合显著降低镍离子的相对浓度。特别地，置rHA于低pH能有效地降低镍离子水平。结果是，依照本发明纯化的白蛋白有着令人惊异地低镍离子含量(低于100ng/g白蛋白)。
在此描述的被动方式阳离子交换步骤，用于除去伴刀豆球蛋白A结合物质(cbm)，其为少量被认为是糖基化修饰了的rHA。已发现被动方式阳离子交换步骤使由重组pmt1-突变型酿酒酵母产生的cbm成分减少了大约1.3倍。用非-pmt1突变体得到的rHA产生了更大效应(2-3倍清除)。
与其他市售的酵母相比，酿酒酵母产生相对低水平的修饰的rHA。相应地，如果rHA由除酿酒酵母以外的重组宿主产生，被动方式阳离子交换步骤和具有一种或多种PMT基因缺陷的细胞的使用可能更为重要。
白蛋白纯化中使用的层析液详述在表3中。由于对白蛋白极大规模生产，以及产物的相对较低消耗，这些缓冲盐最适于本方法，因为它们可由工业规模生产得到高纯品，而且相较于其它常用缓冲液，如tris，HEPES或MOPS，它们的消耗较低。除了表3所列，也可使用其它缓冲液，如具有相似pKa的缓冲液(如用苹果酸代乙酸)，但在大多数事例中，大规模生产的成本和易得性限制了它们的使用。其它盐形式只要是可溶的，能以工业规模提供且成本低则也可以使用。
缓冲液可按照下面描述的浓度配制，或者可在线配制高浓度储备液并在使用时再混合或稀释。
表3：白蛋白纯化所用层析液
Figure S051A8658520051031D000261
具体到本实施例，所有重量均为±2％。
阳离子交换层析
浓缩白蛋白，并通过阳离子交换层析使其在至少酵母蛋白(如果该白蛋白为酵母发酵产生的rHA)和其它抗原、低分子量杂质及色素化合物方面得到纯化。该方法使用市售阳离子交换介质，如SP-Sepharose FF，SP-Spherosil，CM-Sepharose FF，CM-Cellulose，SE-Cellulose或S-Spherodex。优选介质是SP-Sepharose FF(Pharmacia)，如果所用为轴流向柱，柱床高5-25cm，优选10-15cm，如12.5cm。如果所用为径流向柱，合适的柱床流道长度是11.0±1.0cm。柱上样量为10到50g白蛋白/L，优选40+10g白蛋白/L介质较合适。用缓冲液平衡介质以除去碱性贮存液；优选该缓冲液应足够强，可将pH降低到pH6.0。使用缓冲液，如CS01以除去柱中的贮存液CS07；然而可以使用任何pH＜6.0的缓冲液。当柱中流出物接近pH6.0时，可判断平衡已完全。
制备或调节好发酵离心液以便在保护rHA免于聚合和被蛋白酶裂解的情况下进行阳离子交换层析。但是，如果该酵母菌株并非在纯化rHA所需pH下能够降解rHA的蛋白酶的缺陷型，应对培养上清进行加热处理，例如50-70℃热处理30分钟到5小时，如WO 94/03636描述的。通常1-10mM辛酸钠足以保护rHA免于热变性，60-80℃下30秒到10分钟足够使蛋白酶在分批次或流通处理中失活。如果使用HSA也需要加热处理。
然后将调节好的离心液以例如0.07-0.75柱床体积/min，优选0.3-0.6柱床体积/min，在本例中0.5柱床体积/min的流速上样，接着用一种或多种溶液淋洗，以除去残留的杂质。柱首先可以8倍体积的10-100mM，优选30-70mM，例如50mM乙酸，pH3.9-4.1，0.6-0.8mS.cm-1(CS02)淋洗。接着用4倍体积的高盐缓冲液如含1-3M NaCl，优选2M NaCl的乙酸钠缓冲液(例如10-50mM乙酸钠，优选约27mM，pH3.5-4.5，优选pH4.0)(CS03)洗柱，接着用10倍体积的CS01洗柱。用乙酸盐/辛酸盐缓冲液(例如40-120，优选60-100，如85mM乙酸盐和2-50mM，优选2-20mM，如5mM辛酸盐，如在CS04中)洗脱和收集白蛋白。白蛋白的收集始于UV信号超过0.6A254/cm，止于UV信号低于0.36A254/cm。接着柱子用0.25-3.0M NaCl和0.05-2％去污剂(CS05)清洗，然后用0.1-1.0M NaOH(CS06)清洗，保存于稀释的(10-50mM)NaOH(CS07)中。本例中，平衡，上样和淋洗步骤的流速是每分钟0.5柱床体积。洗脱白蛋白时流速0.04-0.6柱床体积/min，优选0.15-0.35，本例中采用0.25柱床体积/min。
阴离子交换层析
阳离子交换剂的洗脱液稀释到10mS.cm-1以下，优选5mS.cml-1以下，特别是2.5mS.cm-1以下，接着上样到阴离子交换树脂，如QMA-Spherosil，DEAE-Spherodex，Q-Hyper D，DEAE-cellulose，QAE-cellulose，或TMAE，DMAE，或DEAE Fractogel上。优选介质是市售的阴离子交换介质DEAESepharose-FF(Pharmacia)，柱床流道长度11.0±1.0cm，用阳离子洗脱缓冲液(CS04)预平衡，再用3倍柱体积的CS01平衡。白蛋白以每升介质30±10g单体白蛋白上样在介质上，接着介质用稀释的四硼酸盐缓冲液淋洗，如15-25mM四硼酸钾或四硼酸钠(CS08)，它能影响pH上升到9.2左右，然后白蛋白用更高浓度的四硼酸盐缓冲液(例如80-150mM四硼酸钾，优选110mM四硼酸钾(CS09))洗脱。介质在稀释的NaOH(CS07)中保存前，先用盐/去污剂(CS05)再用NaOH(CS06)清洗。然后，该阴离子交换介质的洗脱液上样到亲和介质上。
亲和层析
此步骤在45kDa N-末端白蛋白片段，酵母抗原和色素方面进一步纯化rHA。亲和介质可以包括结合白蛋白的任何Cibacron蓝型染料，例如ReactiveBlue 2，Procion Blue HB，Blue Sepharose，Blue Trisacryl和其他蒽醌型化合物。优选介质是“Delta Blue”Matrix(DBA)，如WO 96/37515所述制备。
该方法采用柱床流道长度为11.0±1.0cm的DBA。DBA在乙酸铵缓冲液(100-300mM，优选200-275mM，例如CS10中250mM)中平衡。白蛋白用量7.0-14.0g/L，优选8.0-12.0g/L，本例中10.0±1.0g/L。平衡、上样和淋洗步骤以流速0.05-0.30柱床体积/min，优选0.15-0.27，本例中0.25柱床体积/min进行。所有其他步骤以流速0.20柱床体积/min进行。上样完成后，用1-5倍体积乙酸铵缓冲液10-30mScm-1(优选15-25mScm-1)进行淋洗以除去杂质，如CS10优选5倍柱床体积。白蛋白采用强盐和磷酸盐溶液(1.0-3.0MNaCl，例如1.5-2.5M NaCl或2.0M NaCl，和5-100mM，如50mM磷酸盐，如CS11中一样)洗脱。接着用CS06清洗柱，并保存在CS07中。
接着使DBA柱的洗脱液浓缩并渗滤，准备采用苯硼酸盐琼脂糖(PBA)层析进行纯化。DBA超滤用超滤膜进行，这些超滤膜适用于蛋白质浓缩，截留分子量为30,000或更小，优选标定截留分子量10,000的聚醚砜膜(如Filtron Omega系列)。将DBA浓缩至≈100g rHA.L-1，接着对至少5倍体积的水渗滤，然后对5倍体积的CS20渗滤。渗滤结束时可根据要求进一步浓缩滞留液，并用CS20清洗该设备以增加该步骤的回收率。滞留液的最终浓度范围应为20-120g rHA.L-1，优选70-120g.L-1，或如在本例中的100±10grHA.L-1。使用后，膜用水冲洗出残余蛋白质，用CS06洗净，并保存在CS07中。
PBA是除去糖共轭物如糖蛋白，糖脂和多-，寡-和单糖的亲和步骤，其利用固相化氨基苯硼酸作为配基。氨基苯硼酸通过一个间隔臂共价偶合到不溶性介质，比如聚丙烯酰胺，琼脂糖，纤维素聚合物或有机聚合物上。美国专利4562251(在此引入作为参考)描述了制备二硼酸三嗪(diborotriazine)或单硼酸三嗪(monoborotriazine)琼脂糖的合适方法：(1)三嗪先O-连到琼脂糖上，接着在第二个反应中与3-氨基苯硼酸(APBA)连接。(2)三嗪先与APBA反应以产生单或二硼酸三嗪。这些再通过三嗪上的自由氯O-连到-ONa活化的琼脂糖上，可产生单或二取代的琼脂糖。
较早的美国专利4269605涉及多种的活化方法，包括琼脂糖的表氯代醇活化，为本文优选。市售的介质包括Amicon的PBA30和Sigma的丙烯酸珠状氨基苯硼酸盐。
已发现使用含甘氨酸(10-500mM，如25-200mM，优选50-150mM，本例中100mM)，NaCl(0-500mM，例如25-200mM，优选50-150mM，本例中100mM)和CaCl2(5-25mM，优选10-100mM，本例中50mM)，pH8.0-9.5优选pH8.0-9.0，本例中pH8.5(CS20)的缓冲液特别有利。
PBA柱采用流道长度11.0±1.0cm，且由如上所述用缓冲液，如CS20预平衡。柱上样量小于1倍柱体积，优选小于0.5倍柱体积，本例中≤0.35倍柱体积。PBA以被动方式进行，因此在流通液和淋洗液中收集白蛋白。所有的层析步骤都可在流速0.005-0.3柱床体积/min下进行。优选柱的平衡和清洗在比白蛋白溶液的上样和收集流速(优选0.01-0.05，更优选在0.025柱床体积/min)更高的流速(如0.19柱床体积/min)下进行。接着此柱用盐(CS03)，硼酸盐缓冲液(CS09)，NaOH(CS06)清洗，然后保存在稀释的NaOH(CS07)中。
PBA层析后，浓缩并渗滤白蛋白溶液以备被动方式阳离子交换。此超滤步骤和被动方式阳离子交换层析的结合可极大地减小镍离子相对浓度。
PBA超滤用适于蛋白质浓缩的任何超滤膜进行，这些超滤膜的截留分子量为30,000或更小，优选标定截留分子量10,000的聚醚砜膜(如FiltronOmega系列)。收集的PBA流通液用CS21调到pH5.3±0.5，浓缩至≈100grHA.L-1然后对至少7倍体积的CS19渗滤。渗滤结束后用CS19清洗该设备，再按要求加入CS19使滞留液浓度为50±10g rHA.L-1。最终，加入辛酸钠使浓度为2-15左右，优选5-10，更优选6-9，本例中6mM，如加入CS14至3mL.L-1。使用后，膜用水冲洗出残存蛋白，用CS06洗净，用CS07保存。
然后用，例如SP-FF Sepharose(Pharmacia)以被动方式进行第二次阳离子交换层析白蛋白液，即白蛋白通过介质，而不是被截。所用条件使甘露糖基化的白蛋白结合到介质上。缓冲液优选是乙酸钠缓冲液(5-110mM乙酸盐，优选10-50mM，本例中30mM)，pH5.2-5.4，CS19)。可以使用其他能在合适范围内起缓冲作用的缓冲液，比如柠檬酸盐磷酸盐缓冲液。合适缓冲液的导电率为约2mS.cm-1。柱流道长度11.0±1.0cm，白蛋白上样量为10-250g.L-1，优选20-70g.L-1，本例中50±15g或50±10g.L-1介质。由于这是被动步骤，在流通液和淋洗液中收集白蛋白。
在这一阳离子交换步骤后，对白蛋白进行被动方式阴离子交换层析。此步除去可由ELISA和Western印迹法检测到的酵母抗原。收集第二次阳离子交换的流通液和淋洗液，用CS21调pH到4.60±0.10，用水稀释到1.05±0.1mS.cm-1，用如下条件纯化rHA。此步用阴离子交换介质例如DE-FFSepharose(Pharmacia)，流道长度11.0±1.0cm，白蛋白上样量为50-250g.L-1，优选150±50g.L-1介质。由于这是一个被动步骤，在流通液和淋洗液中收集白蛋白。然后流通液和淋洗液的pH用CS22调到7.0±0.1。
或者，如实施例9所述，pH的调整可以在最后的UF进液容器中进行，而不是在DEAE流通液和淋洗液中进行。
虽然实施例1是以pmt1突变体举例说明的，应理解本发明的纯化方法可同样应用于非此位点突变或非任何其它pmt位点突变的宿主细胞。
实施例2
用两种检验方法检验离心液的质量。离心液质量越差，酵母细胞的“活性(robustness)”就越差。
两种检验方法是：
1.测定离心液在600nm(A600)处的吸收值。
2.测定离心液中颗粒的湿重(WW)。
两种方法中，测定值越高，离心液的质量就越差。
三种不同酵母菌株在两种不同pH条件下补料分批发酵的离心液质量进行对比。
表4：三种不同rHA生产株在两种不同pH条件下补料分批发酵的A600和WW值。第一列标明了特异性基因缺失。括号内的值是标准差和样本数。
从上表中可以得出结论，在pH5.5，多基因缺失株产生较差的离心液，而在pH6.4或6.5下，避免了这更多基因缺失的不利影响。
实施例3
此例的实施方式与实施例1相同，但是使用的菌株不是pmt1突变体。此菌株也在两种不同的pH控制值下培养，其离心液湿重的测定方法与实施例1相同。在提高的pH控制点下培养的优势也体现在此菌株上；如表5所示，酵母在pH6.3到6.5下比在pH5.5下所得培养上清的湿重显著降低。
  发酵pH   上清液湿重含量(g.L-1)
  5.5   10.0(2.3，4)
  6.3-6.5   4.6(1.4，7)
表5：非-pmt1菌株离心液质量与发酵pH的关系。括号中的值是标准差和样本数。
因此，将pH控制在6.20-6.70，优选pH6.3-6.5比pH约5.5更为有利。在这种较高pH下，离心液质量因细胞分裂的减少而显著改善。
实施例4
本实施例以类似于实施例1的方式实施，有以下不同。巴斯德毕赤酵母GS115株(Invitrogen)用上述相同条件和培养基培养，但pH设定在5.90；控制范围5.90±0.20，以葡萄糖为碳源的比生长速率为0.10h-1。分批培养期为28h，连续培养期(feed phase)为42h。一旦连续培养开始，就加入重组人白蛋白，使发酵末期rHA终浓度为3.8g.L-1培养液。用于穿刺毕赤酵母培养基的rHA已纯化，但并非使用本发明的纯化方法。
然后按实施例1所述纯化方法纯化毕赤酵母补料分批培养所得rHA。
实施例5
本实施例描述了按实施例4所述从毕赤酵母培养液中纯化的rHA的分析方法。
免疫试验资料
对以下物质进行免疫试验：(i)纯化自毕赤酵母培养基的rHA；(ii)用于穿刺该培养基的rHA；(iii)酿酒酵母所产生并已依本发明方法纯化的白蛋白。
Western印迹简述
抗体批号    Ig9601
胶类型      4-12％SDSNR NOVEX GELS
奶粉类型    UHT
暴露时间    20秒
Ig9601针对非-白蛋白生产型酿酒酵母菌株，并因此可用于检测酵母抗原。
Western印迹表明，由毕赤酵母培养基得到的白蛋白比用于穿刺毕赤酵母发酵液的物质，在酵母抗原图谱中所含区带较少，且强度较弱。由毕赤酵母得到的白蛋白其酵母抗原图谱非常近似于由糖酵母得到的图谱。
ELISA印迹简述
在由毕赤酵母培养基纯化得到的白蛋白和用于毕赤酵母培养液穿刺的白蛋白中，酵母抗原杂质度用Ig9601通过ELISA定量。
由毕赤酵母培养基纯化的白蛋白的酵母菌抗原含量低于此试验的检测水平(约0.004μg.g-1)，用于毕赤酵母培养液穿刺的白蛋白的相应抗原含量是0.62μg.g-1。
结合Con A的物质
对纯化自毕赤酵母培养基的白蛋白，和用于毕赤酵母培养液穿刺的白蛋白进行实施例9所述Con A试验。结合Con A的物质的含量在前者中是0.22％(w/w)，在后者中是0.57％(w/w)。
在纯化自毕赤酵母培养基的白蛋白中结合Con A的物质的水平近似于用本发明方法纯化自酿酒酵母的白蛋白中的(参见表6)，而后者并非由pmt1突变体产生。
纯度分析证实，本发明的方法能成功用于纯化除酿酒酵母以外的酵母(如毕赤酵母)的白蛋白，还确认可以得到与纯化自酿酒酵母的白蛋白有相似纯度的白蛋白。
实施例6
实施例1中第二次阳离子交换层析步骤(SP-FF2)之后为被动方式阴离子交换层析步骤(DE-FF2)。在另一纯化方法中，所述第二次阳离子交换层析步骤之后可以进行主动方式阴离子交换层析。
来自于SP-FF2的洗脱液在pH5.3附近，需要升高到pH7。以下详述两种方式，pH调整和渗滤。后者似乎产物质量较高。
DE-FF2(A)
用0.5M磷酸氢二钠将SP-FF2流通液和淋洗液的pH调到pH7.0。在标准主动方式的条件下将此物质上样于DEAE，上样量为40g rHA.L-1介质，所上样的样品的pH和导电率分别是7.0和1.29mS.cm-1。
DE-FF2(B)
SP-FF2流通液和淋洗液对10倍体积10mM磷酸钠pH7.0渗滤，浓缩，用缓冲液稀释到50g.L-1，再在标准主动方式条件下上样于DEAE。所上样品的pH和导电率分别是7.0和1.43mS.cm-1。
DE-FF2A/DE-FF2B的白蛋白适于用45-55mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗脱。
实施例7
对经低pH处理从rHA中去除镍的动力学进行了研究(参见表9)。结果显示在pH4-4.5，除镍的速度和程度都与pH无关，但在pH5除镍速度轻微放缓。当pH升至5-6.5之间时，除镍的速度和程度都降低，当pH6.5以上时，很少或不能除镍。
实施例8
应用实施例1中详述的纯化程序，可以纯化不耐寒(cryo-poor)血浆膏样品(Centeon Pharma GmbH)中的人血清白蛋白。
每一层析步骤的HSA回收率明显与同一步骤中rHA的预期回收率相当，PBA柱例外。此时，回收率比预期低很多，这可能是由于去除了糖化白蛋白。
实施例9
本实施例举例说明将高度纯化的rHA浓缩，渗滤并配制成适当的产品，本例中为20％(w/v)白蛋白。此步骤分两步进行，即最终超滤(UF)和配制。
最终UF通过在低pH渗滤减少了镍浓度，并用适当级别的水，使rHA处于限定的水环境中。
最终UF始于将DEAE流通液和淋洗液转移至最终UF进液容器。如下所述，然后对白蛋白进行浓缩，渗滤并将pH调至7.0，然后再次浓缩。
如果DE-FF2以主动方式进行，除DEAE流通液和淋洗液之外，可使用DE-FF2洗脱液，或完全替代。
转移DE-FF2流通液和淋洗液(或洗脱液，当DE-FF2以主动方式进行时)之后，含rHA的加工物质流(process stream)在配备了截留分子量10,000之纤维素膜的超滤系统中依次经过初步浓缩，渗滤和再次浓缩。初始的浓缩步骤将rHA浓度提高到约100g.L-1，然后经连续渗滤而迅速下降，这期间使rHA对至少5倍，优选至少7倍滞留液体积的注射用水等价物渗滤，优选用50mM盐溶液去除氨。渗滤之后，将pH调整到7.0，再次浓缩使rHA浓度进一步提高到275-325g.L-1。UF结束后，将滞留液移至大批量产品配料容器中。
在最终UF进液容器中进行pH调整，代替对DEAE流通液和淋洗液的行PH调整，优选在渗滤和再次浓缩之间。优选用EX04调整渗滤滞留液到pH7±1.0。如果pH超过7.1，但保持≤8.5，可用EX05调低pH值。
配制步骤使rHA处于合适的化学环境和合适的浓度，以适于大量产品的除菌过滤和灌装。对已转移的最终UF滞留液进行分析以确定白蛋白，钠和辛酸盐的浓度。配制大批量制剂时考虑这些量，以及氯化钠和辛酸钠赋形剂原液的任何所需添加量，和相应级别水的添加量。最终白蛋白的浓度可以是150-250g.L-1，或235-265g.L-1，其中钠浓度是130-160mM。可配制任何其他可行的白蛋白浓度，但是，最小浓度至少为4％(w/v)，优选4-25％(w/v)。在添加合适的常规可药用赋形剂，例如，polysorbate 80或在美国药典中规定可用于人白蛋白的那些，以及稀释用水后可完成配制。
预计最终每克白蛋白含0.08mmoles辛酸钠。产品是无菌的，无热源的。可能有多达1％的二聚体白蛋白，但是检测不到更大的聚合物或凝集物。
实施例10
本实施例中举例说明了用于确定按本发明纯化之白蛋白的纯度的分析方法。除非声明，否则所有检测方法都是针对按照实施例1纯化和按照实施例9配制的白蛋白。
rHA的糖基化
对糖化蛋白的显微分析表明按照本发明纯化的rHA基本没有被非酶的糖基化(糖化)作用修饰。显微试验通过用高碘酸盐氧化AP的C-1羟基测定了糖化蛋白形成的稳定的Amadori产物(AP)。由高碘酸盐氧化释放的甲醛，通过在氨中与乙酰丙酮反应转化成载色物质，二乙酰基二氢二甲基吡啶(DDL)，可以加以定量。DDL然后通过比色测定。样品检测之前先用Pharmacia PD-10(G25Sephadex)柱脱盐，然后由Bradford方法重新定量样品中的白蛋白，检测到10mg白蛋白。采用果糖阳性对照，在Shimadzu UV 2101分光光度计上于412nm读出吸收值。每摩尔己糖形成一摩尔Amadori产物。
  样品   Amadori产品摩尔数/摩尔白蛋白
  A   0.79
  B   0.76
  C   0.41
  D   0.48
  E   0.46
  F   0.22
  G   0.41
  H   0.37
  I   0.54
  J   0.76
  K   0.84
  L   0.50
  M   0.43
  N   0.59
  O   0.41
  P   0.18
  Q   0.24
  R   0.04
样品A-Q为美国、欧洲和日本的市售HSA产品(平均值＝0.49±0.20)。样品R为根据本发明纯化的rHA。
C-末端的分析
重组蛋白质量控制的一个重要方面是预定第一次结构的构象和稳定性。通过N-端测序和FAB质谱，对市售HSA和根据本发明纯化的rHA的C-末端色氨酸肽进行分析，显示存在一个截短的肽，其在HSA中缺少C-末端的亮氨酸。在市售HSA中检测到Des-Leu C-末端色氨酸肽为约5-10％(未定量)，但在本发明的rHA中即使经过30℃6个月也不能检测到所述肽。经过30℃12周在HSA中不能检测到Des-Leu肽，与其他样品相比，全长C-末端肽的峰值大大降低，表明可能有进一步C-末端降解。
这些结果指示依本发明方法纯化的rHA有稳定而全长羧基-末端，而市售HAS经比较似乎是不均一的。
根据本发明制备的rHA的镍离子含量
测量仪器：
SIMAA 6000，Perkin Elmer Furnace：CTT(恒温管)在232nm，2470℃检测。
校验：
此方法根据三点校验(Perkin E1mer 18/30/60μg/L标准溶液)。校验后，测定纯水空白样。测定空白样并完成每一系列实验后，测定对照标准样(镍标准样20μg/L，Perkin Elmer指定标准)。
样品准备：
每一试验均为双份测定的结果，对校验和对照标准样同样如此。根据预计的镍浓度，对样品进行稀释使镍浓度落在校验范围之内。任何时候蛋白质浓度≥10％的样品应至少按1∶5稀释。稀释使用纯水。
样品毛细管漂洗溶液：
2L纯水与0.5ml Triton X100混合。每一实验系列都有一个系统适用性实验。
要求：
1.校验的相关系数至少为0.99000。如果不是，需重复校验一次。如果第二次仍不符合要求，必须进行错误分析。
2.用30μg/L标准样测定的特征质量不能超过20pg/0.0044A-s理论值的20％。
特征质量m0：
分析物可产生1％吸收的皮克级的量。每1％吸收对应与0.0044A-s(安培秒)。
Figure S051A8658520051031D000371
3.所测对照标准样的浓度须落在可信区间(2s/3s标准)内。
计算：
测量仪按照下式计算结果：
A：吸收度
斜率：标准曲线的斜率(线性回归)
V：稀释
未使用修正因子。
Figure S051A8658520051031D000372
培养基和长链脂肪酸的分析
本发明白蛋白和市售HSA的脂肪酸图谱，通过对游离脂肪酸的酸性溶剂提取和气相色谱以C17:0的内标进行分析。本发明的白蛋白经此方法未检出异常脂肪酸，但FHA和HAS的脂肪酸图谱有很大差异。正如预计的，两者都显示了大量的添加的稳定剂，辛酸盐(C8:O)。除此之外，市售HAS以显著的C16:0，C16:1，C18:0，C18:1和C18:2为特征，而本发明的白蛋白主要包括C10:0和C12:0，偶见C14:0。进一步的实验显示rHA终产物中C10:0和C12:0的水平与纯化方法后期所用辛酸中的这些污染物的水平相关。
优选C18脂肪酸的整体水平没有超过辛酸盐水平的1.0％(摩尔/摩尔)，优选不超过0.5％。而且，本发明的白蛋白中，C18:2，C18:3和C20脂肪酸一般是检测不到的。在市售HSA中，每摩尔白蛋白通常有大约0.4摩尔的C18脂肪酸。在本发明的产物中，通常测不到C20脂肪酸，而且每摩尔白蛋白只有大约0.02摩尔C18脂肪酸。
SDS还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳
本试验如WO 96/37515所述进行。试验显示，本发明的rHA由一条多肽链组成，当用还原性试剂(β-巯基乙醇)处理时，它在SDS还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳上迁移为单一区带(单体)，这表明白蛋白中单体至少占99.9％。
凝胶通透高压液相色谱
将根据本发明纯化的白蛋白配制成25％w/v溶液，取25μl 10mg/ml的该溶液，注射至Shimadzu LC6A HPLC的TSK3000SWXL柱，检测发现含有不到0.1％的白蛋白多聚体。此结果说明，本文所述配方对纯化的白蛋白的多聚体/凝聚体含量没有不利影响。
双向凝胶电泳
对根据本发明方法制备的白蛋白的2μg rHA采用Milllipore Investigator系统进行双向电泳。第一向采用pH3-10的等电聚焦凝胶分离，接着在第二向上采用10％聚丙烯酰胺/SDS凝胶分离。用考马斯亮蓝使凝胶染色，只见到一个点，这指示只存在一种蛋白质。
甘露糖基化白蛋白/ConA检测
伴刀豆球蛋白A(Con A)与含α-D-吡喃型甘露糖基，α-D-吡喃型葡萄糖基和位阻相关残基的分子结合。在Con A检测中，采用重组人白蛋白(rHA)和/或人血清白蛋白(HAS)的Con A Sepharose(Pharmacia，批号17-0440-01)亲和层析测定甘露糖基化白蛋白的含量。
重组人白蛋白(rHA)用145mM氯化钠稀释到5％(w/v)，接着与Con A稀释液(200mM乙酸钠，85mM氯化钠，2mM氯化镁，2mM氯化锰，2mM氯化钙，pH5.5)1∶1混合。然后将100mg rHA上样到平衡过的2ml Con ASepharose柱上，接着用Con A平衡缓冲液(100mM乙酸钠，100mM氯化钠，1mM氯化镁，1mM氯化锰，1mM氯化钙，pH5.5)淋洗(5×4ml)。柱用6ml ConA洗脱液(100mM乙酸钠，100mM氯化钠，0.5M甲基-α-D-甘露糖吡喃糖苷，pH5.5)洗脱。
Con A上样物(稀释到大约0.1mg.mL-1)和洗脱液(经检验为纯品)中的单体白蛋白通过GP.HALC用0-0.2mg.mL-1 rHA标准曲线定量，洗脱液中回收的与Con A结合的白蛋白单体表示为上样量的百分比。
表6：通过此方法对Con A结合的rHA的去除。第1-4批来自pmt1突变体，第5批来自非突变株。(FT&W＝流通液和淋洗液)
ConA结合的rHA进一步通过电喷射质谱分析(图8)。这指示，除了conA结合rHA的数量减少了，其修饰程度也减小。
颜色分析
在350nm，403nm和500nm下测量5％(w/v)终产品溶液在1cm比色皿中的吸光度，按照每克白蛋白/升每cm光路长度(即ABS.L.g-1.cm-1)计算吸光度。本发明的白蛋白有如下数据：
波长        平均吸光度(n＝4批)
(nm)        (L.g-1.cm-1)
350         5.75×10-3
403         1.7×10-3
500         0.4×10-3
通常本发明的白蛋白在上述三种波长下吸光度分别不会超过8.0×10-3，3.0×10-3和0.75×10-3。
几种市售HSA制品经分析在这些波长下显示更高的吸光度(见表7)。
  样品   A350   A403   A500
  1   9.95×10-3   4.10×10-3   0.8×10-3
  2   9.25×10-3   5.36×10-3   1.1×10-3
  3   7.40×10-3   3.26×10-3   0.6×10-3
  4   7.20×10-3   3.60×10-3   0.6×10-3
  5   8.68×10-3   4.08×10-3   0.8×10-3
  6   11.45×10-3   6.26×10-3   1.2×10-3
  7   7.20×10-3   3.70×10-3   0.8×10-3
  8   6.82×10-3   4.78×10-3   1.8×10-3
表7：现有技术HSA制品的吸光度(L.g-1.cm-1)
内毒素
药物产品溶液于36.5-37.5℃用鲎阿米巴细胞裂解物在340nm进行动态浊度检测，采用自动内毒素检测系统(例如LAL 5000E)。用已知浓度的标准内毒素制品建立标准曲线，试验中还包含阴性对照和插入了(spiked)已知量校准内毒素的待检物溶液。反应混合物的浊度变化按时间检测并进行log-log回归。药品中任何内毒素都按标准曲线定量并且证实内毒素增量(spike)的回收。未检测到内毒素。
自由硫醇
Ellman’s试剂，5，5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)是检测游离巯基(sulfydryl)如cys-SH(rHA中Cys-残基34)的具体方法。该反应释放出5-硫-2-硝基苯甲酸根TNB2-，它在412nm有最大吸收。通过测量在412nm吸收度的增长并除以TNB2-基团在412nm的摩尔消光系数，可以计算出rHA的自由巯基含量。
  样品   mol.mol-1
  A   0.82
  B   0.77
  C   0.77
  D   0.85
  E   0.90

Claims (41)

1.用于降低白蛋白溶液中镍离子水平的方法，此方法包括：
(1)将白蛋白溶液置于pH2.5-6.0；
(2)除去镍离子；并
(3)将步骤(2)的产物不进行进一步纯化步骤就放置于最后的治疗用容器中。
2.权利要求1的方法，其中步骤(1)是将白蛋白溶液置于pH4.0-pH6.0。
3.权利要求1的方法，其中该方法的步骤(1)和/或(2)包括渗滤或凝胶通透层析。
4.权利要求1的方法，其中步骤(2)包括使用镍螯合剂除去镍离子。
5.权利要求1的方法，其中所述白蛋白是重组白蛋白。
6.权利要求2的方法，其中所述白蛋白是重组白蛋白。
7.权利要求3的方法，其中所述白蛋白是重组白蛋白。
8.权利要求4的方法，其中所述白蛋白是重组白蛋白。
9.权利要求5的方法，其中所述起始白蛋白溶液源自酵母培养基，所述酵母培养基是在发酵培养基中培养经白蛋白编码核苷酸序列转化的酵母而获得的，其中所述酵母表达白蛋白并将其分泌到培养基中。
10.权利要求6的方法，其中所述起始白蛋白溶液源自酵母培养基，所述酵母培养基是在发酵培养基中培养经白蛋白编码核苷酸序列转化的酵母而获得的，其中所述酵母表达白蛋白并将其分泌到培养基中。
11.权利要求7的方法，其中所述起始白蛋白溶液源自酵母培养基，所述酵母培养基是在发酵培养基中培养经白蛋白编码核苷酸序列转化的酵母而获得的，其中所述酵母表达白蛋白并将其分泌到培养基中。
12.权利要求8的方法，其中所述起始白蛋白溶液源自酵母培养基，所述酵母培养基是在发酵培养基中培养经白蛋白编码核苷酸序列转化的酵母而获得的，其中所述酵母表达白蛋白并将其分泌到培养基中。
13.权利要求9的方法，其中所述酵母属于糖酵母属。
14.权利要求10的方法，其中所述酵母属于糖酵母属。
15.权利要求11的方法，其中所述酵母属于糖酵母属。
16.权利要求12的方法，其中所述酵母属于糖酵母属。
17.权利要求13的方法，其中所述酵母是酿酒酵母。
18.权利要求14的方法，其中所述酵母是酿酒酵母。
19.权利要求15的方法，其中所述酵母是酿酒酵母。
20.权利要求16的方法，其中所述酵母是酿酒酵母。
21.权利要求9的方法，其中所述酵母属于毕赤酵母属或克鲁维酵母属。
22.权利要求10的方法，其中所述酵母属于毕赤酵母属或克鲁维酵母属。
23.权利要求11的方法，其中所述酵母属于毕赤酵母属或克鲁维酵母属。
24.权利要求12的方法，其中所述酵母属于毕赤酵母属或克鲁维酵母属。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中至少某些白蛋白是用生产重组白蛋白的方法生产的，此方法包括：培养能表达重组白蛋白编码序列的真菌细胞并获得所述白蛋白，其中所述细胞带一种基因修饰，该修饰能使该细胞对重组表达之白蛋白实施甘露糖基化的能力至少降低，其中培养基为至少1,000L且pH5.3-6.8。
26.权利要求25的方法，其中所述修饰包括任何抑制，取代，缺失，添加，破坏和/或突变型插入。
27.权利要求26的方法，其中所述修饰是稳定遗传的和/或是非回复的和/或是非渗漏的。
28.权利要求25的方法，其中所述修饰位于基因编码区或与基因表达有关的区域。
29.权利要求28的方法，其中所述基因是PMT基因。
30.权利要求29的方法，其中所述PMT基因是PMT1基因。
31.权利要求25的方法，其中所述真菌细胞在至少5,000L的培养基中培养。
32.权利要求31的方法，其中所述真菌细胞在至少7,500L的培养基中培养。
33.权利要求31的方法，其中所述真菌细胞在pH6.2-6.7培养。
34.权利要求33的方法，其中所述真菌细胞在pH6.3-6.5培养。
35.权利要求1至24中任一项的方法，其中将所述白蛋白产物进行一种或多种以下处理：浓缩，稀释，pH调节，加热，冷却，用还原剂处理，和/或配制成非肠道给药至人的制剂，然后放置于最后容器中。
36.权利要求25的方法，其中将所述白蛋白产物进行一种或多种以下处理：浓缩，稀释，pH调节，加热，冷却，用还原剂处理，和/或配制成非肠道给药至人的制剂，然后放置于最后容器中。
37.权利要求1-24中任一项的方法，其中至少部分白蛋白是由包含重组白蛋白编码序列的细胞生产的，其中所述重组白蛋白编码序列的3’端包括两个或多个框架内翻译终止密码子。
38.权利要求25的方法，其中至少部分白蛋白是由包含重组白蛋白编码序列的细胞生产的，其中所述重组白蛋白编码序列的3’端包括两个或多个框架内翻译终止密码子。
39.权利要求35的方法，其中至少部分白蛋白是由包含重组白蛋白编码序列的细胞生产的，其中所述重组白蛋白编码序列的3’端包括两个或多个框架内翻译终止密码子。
40.权利要求36的方法，其中至少部分白蛋白是由包含重组白蛋白编码序列的细胞生产的，其中所述重组白蛋白编码序列的3’端包括两个或多个框架内翻译终止密码子。
41.权利要求37的方法，其中所述重组白蛋白编码序列的3’端包括三个框架内翻译终止密码子。
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