CN1762967B - 甘草次酸衍生物、制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的甘草次酸衍生物，其水溶性好，吸收好，并且对血管无刺激性，可以制备成注射剂，还提供了该甘草次酸衍生物的制备方法和含有该衍生物的药物组合物、制剂。该甘草次酸衍生物对急慢性肝炎、细菌性肝炎、病毒性肝炎、脑缺血/再灌注损伤、脑外伤、心肌缺血/再灌注损伤均具有很好的治疗作用。
Description
技术领域
本发明涉及甘草次酸衍生物及其制备方法、用途和制剂。
背景技术
甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)，属豆科植物，生长于温带及亚热带地区，主产于我国西部，作为常用中草药首载于汉代《神农本草经》。中医理论认为：甘草性平、味甘，具有和中缓急、润肺、解毒、止咳、通经脉、利气血等功效，在传统中药处方中应用极其广泛，我国古代医学家喻之为“国老”。1932年，Ruzicka确定了甘草有效成分甘草酸的化学结构，从此揭开了用现代医药学研究甘草的序幕。此后的大量研究表明，甘草的主要药效成分为甘草酸和甘草次酸。
甘草次酸(简称GA)，又名甘草亭酸，收载于国家药品标准中，其标准号为WS-10001-(HD-1182)-2002，为白色结晶性粉末(C30H46O6)，熔点288～297℃，不溶于水。
陈晓光等研究表明GA能够抑制巴豆油诱发的小鼠耳肿胀和鸟氨酸脱羧酶(ODC)活性，同时降低强致癌剂苯并芘引起的非程序DNA合成，对由苯并芘所诱发的DNA损伤有一定的保护作用【陈晓光，韩锐.甘草次酸对苯并芘诱发DNA损伤及非程序DNA合成的影响.药学学报，1994，29(10)：725-729】。18β-甘草次酸可抑制β-葡糖苷酶(β-GD)的活性，对CCl4诱发的肝损伤具有保护作用【Sang-Bum Shim，Nam-Jae Kim，Dong-Hyun Kim.β-Glucuronidase Inhibitory Activity and Hepatoprotective Effect of 18-GlycyrrhetinicAcid from the Rhizomes of Glycyrrhiza urelensis.Planta Medica，2000，66(1)：40-43】。黄炜等研究发现：18β-GA和GL有抑制人肝癌细胞增殖和诱导其分化作用【黄炜，黄济群，张东方等.18β-甘草次酸和甘草酸对人肝癌细胞增殖的抑制和诱导分化作用.中国中医药科技，2002，9(2)：92-94】。
甘草次酸不溶于水，吸收差，并且其化学结构与皮质酮相似，具有去氧皮质酮样作用，可与盐皮质激素受体结合形成醛固酮样作用。由于醛固酮样作用过多，影响水、电解质代谢，促进水钠潴留，排钾增多，从而引起血钾降低、血压升高及浮肿等许多症状。
目前文献所报道的甘草次酸钠盐或钾盐虽然能改善其溶解性，但是仍然存在钠潴留，并且有血管刺激性，不能制备成注射剂，大大限制了甘草次酸的临床应用。
本发明人通过大量的实验研究，克服了甘草次酸的上述缺点，提供了制备简单、方便，水溶性好，吸收好，并且对血管无刺激性，毒副反应小的甘草次酸衍生物，解决了人们长期以来渴望解决的难题。
发明内容
本发明提供了式I所示的甘草次酸衍生物，
式I
其中甘草次酸为18α-甘草次酸、18β-甘草次酸或它们的混合物；M为碱性氨基酸或有机碱，所述的碱性氨基酸为精氨酸、组氨酸或赖氨酸，有机碱为葡甲胺或乙二胺，优选为精氨酸、葡甲胺或乙二胺，其中精氨酸可以是L-精氨酸、D-精氨酸或D、L-精氨酸。
本发明提供的式I所示衍生物的制备方法为在反应瓶中依次加入摩尔比为1∶1的甘草次酸和碱性氨基酸(或有机碱)、60-90％乙醇，搅拌反应2小时，减压蒸干溶剂，在残留物中加入乙酸乙酯，研磨得浅黄色沉淀，过滤，减压干燥，即得。
本发明提供了甘草次酸衍生物在制备治疗肝炎药物中的应用。
本发明提供了甘草次酸衍生物在制备治疗急性肝炎药物中的应用。
本发明提供了甘草次酸衍生物在制备治疗慢性肝炎药物中的应用。
本发明提供了甘草次酸衍生物在制备治疗细菌性肝炎药物中的应用。
本发明提供了甘草次酸衍生物在制备治疗病毒性肝炎药物中的应用。
本发明提供了甘草次酸衍生物在制备治疗或预防缺血性脑中风的药物中的应用。
本发明提供了甘草次酸衍生物在制备治疗或预防脑缺血/再灌注损伤的药物中的应用。
本发明提供了甘草次酸衍生物在制备治疗或预防脑外伤的药物中的应用。
本发明提供了甘草次酸衍生物在制备治疗或预防心肌缺血/再灌注损伤的药物中的应用。
本发明还提供了含有甘草次酸衍生物的药物组合物。该药物组合物可以以药物上常规的方法制备而成。
本发明所述的甘草次酸衍生物在用于上述任一用途时，其使用剂量为1mg～600mg/天，优选剂量为1mg～250mg，更优选剂量范围为20～200mg。
本发明提供的化合物可以以粉针剂、注射液、片剂、胶囊、软胶囊、滴丸或口服液的形式存在，优选以注射液的形式存在。本发明提供的各种剂型均可以采用药学常规方法制备而成。
本发明提供的甘草次酸衍生物注射液优选采用如下方法制备：称取甘草次酸衍生物，加热下溶于助溶剂中，加入缓冲剂及注射用水，调节pH至9.0～10.0，加活性炭搅拌，过滤，分装至安瓿中，115℃下灭菌，即得。
本发明提供的甘草次酸衍生物冻干粉针剂优选采用如下方法制备：称取甘草次酸衍生物，加热下溶于助溶剂中，加入缓冲剂、支撑剂及注射用水，调节pH至9.0～10.0，加活性炭搅拌，过滤，分装至安瓿中，冷冻干燥，即得。
上述助溶剂为丙二醇、乙醇、吐温80、聚氧乙烯蓖麻油、倍他环糊精中的一种或几种；缓冲剂为磷酸盐、枸橼酸盐、氯化铵、巴比妥中的一种或几种；支撑剂为甘露醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖、右旋糖酐、PVP中的一种或几种。
本发明提供的甘草次酸衍生物片剂包含甘草次酸衍生物、赋形剂、润滑剂，其中赋形剂为淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素中的一种或几种；润滑剂为滑石粉、硬脂酸镁中的一种或几种。
本发明提供的衍生物制备过程简单，一方面解决了甘草次酸在水中的溶解性，另一方面提高了用药的安全性，降低了刺激性及血管痉挛的发生，解决了制备注射剂的技术难题，填补了临床用药的空白。
本发明通过下列实施方式进一步阐明本发明技术，但不限于此。
具体实施方式：
实施例1：甘草次酸精氨酸的制备
在反应瓶中依次加入甘草次酸2.35g(0.005mol)、L-精氨酸0.87g(0.005mol)、90％乙醇(V/V)440mL，搅拌反应2小时，减压蒸干溶剂，在残留物中加入20mL乙酸乙酯，研磨得浅黄色沉淀，过滤，减压干燥，得浅黄色固体3.0g，收率为93％。用甘草次酸为对照品进行含量测定，产品含量为99.7％。
甘草次酸精氨酸显示如下物化特性：
性状：浅黄色粉末 mp：183～186℃。
ESI-MS m/z：644([M-H]+)。
元素分析％计算值(实测值)：C 67.05(67.48)，H9.38(9.27)，N8.69(8.81)。
分子式：(C36H60N4O4)
UVλmaxnm：258IR(KBr，vmax，cm-1)：3172(-NH2，-OH)，1647(-C＝C-C＝O)，2949，1645，1396(-CH3，-CH2-)，1545(-C＝C-，-C＝N)。
1H-NMR(DMSO，δ，ppm)：0.67-1.32(s，21H，7-CH3)，5.39(s，1H，Δ12-H)，13C-NMR(DMSO，δ，ppm)：38.72(C1)，26.15(C2)，76.56(C3)，38.87(C4)，54.12(C5)，17.11(C6)，31.43(C7)，42.14(C8)，61.06(C9)，36.62(C10)，198.99(C11)，126.96(C12)，170.88(C13)，44.79(C14)，24.83(C15)，26.03(C16)，29.30(C17)，48.10(C18)，40.13(C19)，42.87(C20)，28.91(C21)，37.95(C22)，26.92(C23)，15.92(C24)，16.13(C25)，18.34(C26)，23.04(C27)，28.08(C28)，28.57(C29)，173.79(C30)，179.99(Arg-COOH)，53.86(Arg-CH-COOH)，38.56(Arg-CH-CH2-CH2)，32.13(Arg-CH2-CH2-CH2)，43.66(Arg-CH2-CH2-NH-)，157.69(Arg-C＝NH)。
实施例2：甘草次酸精氨酸的制备
在反应瓶中依次加入甘草次酸2.35g(0.005mol)、L-精氨酸0.87g(0.005mol)、85％乙醇(V/V)440mL，搅拌反应2小时，减压蒸干溶剂，在残留物中加入20mL乙酸乙酯，研磨得浅黄色沉淀，过滤，减压干燥，得浅黄色固体3.1g，收率为96％。用甘草次酸为对照品进行含量测定，产品含量为99.6％。
实施例3：甘草次酸精氨酸注射液的制备
甘草次酸精氨酸盐(按照实施例1制备) 5g
丙二醇 150g
枸橼酸钠 10g
注射用水 加至1000ml
称取处方量甘草次酸精氨酸盐，加热下溶于丙二醇中，加入枸橼酸钠及注射用水，5％NaOH调pH至9.0，加0.1％活性炭搅拌30分钟，过滤，分装至安瓿中，每支1ml，115℃下灭菌30分钟，即得。
实施例4：甘草次酸葡甲胺注射液的制备
甘草次酸葡甲胺 5g
乙醇 100g
枸橼酸钠 10g
注射用水 加至1000ml
称取处方量甘草次酸葡甲胺，加热下溶于乙醇中，加入枸橼酸钠及注射用水，5％NaOH调pH至9.0，加0.1％活性炭搅拌30分钟，过滤，分装至安瓿中，每支1ml，115℃下灭菌30分钟即得。
实施例5：甘草次酸精氨酸冻干粉针剂的制备
甘草次酸精氨酸盐(按照实施例1制备) 5g
乙醇 50g
葡萄糖 25g
枸橼酸钠 10g
注射用水 加至1000ml
称取处方量甘草次酸精氨酸盐，加热下溶于乙醇中，加入处方量葡萄糖、枸橼酸钠及注射用水，5％NaOH调pH至9.0～10.0，加0.1％活性炭搅拌30分钟，过滤，分装至安瓿中，每支1ml，冷冻干燥即得。
实施例6：甘草次酸精氨酸片剂的制备
甘草次酸精氨酸盐(按照实施例1制备) 30g
微晶纤维素 150g
10％淀粉浆 适量
硬脂酸镁 1g
共制成1000片
称取粉碎过筛的处方量甘草次酸精氨酸盐，加入微晶纤维素，10％淀粉浆制粒，干燥，整粒，加处方量硬脂酸镁混匀，压片即得。
试验例1：本发明衍生物对四氯化碳引起小鼠急性肝损伤的影响
1.材料：昆明种小鼠，5-8周龄，体重18-22g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号：200203005。雌雄兼用，每批实验采用同一性别。
四氯化碳(分析纯，烟台三和化学试剂有限公司，批号990918)；
甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺：按本发明提供的方法制备；
甘利欣：江苏正大天晴药业股份有限公司批号DG0563；
ALT/GPT试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，批号020081)；
ASP/GOT试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，批号020101)
全自动生化分析仪(意大利)
2方法：取合格体重的单一性别小鼠，分9组并尾静脉注射给药(0.2ml/只)：空白对照组、模型组(给予含等量辅料的生理盐水溶液)，甘草次酸精氨酸I组(1mg/kg)，甘草次酸精氨酸II组(5mg/kg)，甘草次酸精氨酸III组(10mg/kg)，甘草次酸精氨酸IV组(20mg/kg)，甘草次酸葡甲胺I组(1mg/kg)，甘草次酸葡甲胺II组(20mg/kg)，甘利欣组(30mg/kg)，每组12只，连续给药3天，最后给药1h后用0.2％的四氯化碳溶液造模，禁食16h后眼眶采血，离心(4000rpm，10min)，收集血清，用药盒检测ALT/GPT、ASP/GOT活性。数据以数据用表示，以组间t检验进行统计学处理。
3结果：结果如表1所示，与模型组比较甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺、甘利欣均有明显的抑制ALT/GPT、ASP/GOT酶活的作用(P＜0.05)，且呈剂量相关性。
表1甘草次酸衍生物的抗CCL4肝损伤作用
| 组别 | ASP/GOT酶活(U/L) | ALT/GPT酶活(U/L) |
| 对照组模型组甘草次酸精氨酸I组甘草次酸精氨酸II组甘草次酸精氨酸III组甘草次酸精氨酸IV组甘草次酸葡甲胺I组甘草次酸葡甲胺II组甘利欣 | 159.58±66.831228.84±151.07905.63±61.07*826.81±95.01*719.81±65.01**467±169.66***897±76.09*477±89.66***453±114.73*** | 48.98±14.321120.20±126.23899±92.82*827.51±158.23*773±129.66**407±161.38***867±119.62*443±141.18***412±97.41*** |
*与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
试验例2：本发明衍生物对D-半乳糖胺致小鼠肝损伤的保护作用
1、材料：同试验例1材料
D-半乳糖胺(SIGMA公司生产)。
2、方法：取合格体重的单一性别小鼠，随机分为如下7组：空白对照组，模型组，甘草次酸精氨酸I组(5mg/kg)，甘草次酸精氨酸II组(10mg/kg)，甘草次酸葡甲胺I组(5mg/kg)，甘草次酸葡甲胺II组(10mg/kg)，甘利欣组(30mg/kg)，每组12只，尾静脉注射给药(0.2ml/只)，连续给药3天，末次给药1h后用150mg/kg的D-半乳糖胺造模，禁食16h后眼眶采血，离心(4000rpm，10min)，收集血清，用药盒检测ALT/GPT、ASP/GOT活性。数据以数据用
表示，以组间t检验进行统计学处理。
3结果；如表2所示，与模型组比较甘草次酸精氨酸I组、II组，甘草次酸葡甲胺I组、II组甘利欣组均能明显的降低ALT/GPT酶活、ASP/GOT酶活的作用(P＜0.01)，提示本发明衍生物对D-半乳糖胺致小鼠肝损伤具有保护作用。
表2甘草次酸衍生物对D-半乳糖胺致小鼠肝损伤的保护作用
| 组别 | ASP/GOT酶活(U/L) | ALT/GPT酶活(U/L) |
| 对照组模型组甘草次酸精氨酸I组甘草次酸精氨酸II组甘草次酸葡甲胺I组甘草次酸葡甲胺II组甘利欣组 | 162.58±69.83987.84±74.01526.81±156.11**345±173.38***506.48±182.25**321±163.59***307.5±151.21*** | 68.98±36.321008.84±58.07816.36±89.23**497±173.66***794±109.03**467±113.32***438.5±110.07*** |
*与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
试验例3：本发明衍生物对大鼠慢性肝损伤的防护作用
1.材料：普通级Wistar大鼠，雄性，体重200-230g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号：鲁动质字200106005号
IV型胶原(IV-C)酶联免疫测定试剂盒(上海中医药大学附属曙光医院中心实验室产品)；肿瘤坏死因子α(TNFα)放射免疫测定盒(上海长征医学科学有限公司产品)。
2.方法：60只大鼠随机分为6组：慢性肝损伤模型(M)组、甘草次酸精氨酸小剂量S1组(iv2.5mg/kg)、甘草次酸精氨酸大剂量L1组(iv 10mg/kg)、甘草次酸葡甲胺小剂量S2组(iv2.5mg/kg)、甘草次酸葡甲胺大剂量L2组(iv10mg/kg)、正常对照(N)组，各组均10只。除正常对照组外，其它各组均用50％CCL4-橄榄油1mL/kg后大腿sc，每周2次，共12周，造成大鼠慢性肝损伤；小剂量组和大剂量组分别iv 2.5mg/kg、10mg/kg，每日1次。M、N组iv等量生理盐水，每日1次。在实验的第4，9，12周各组随机处死6只。
标本的留取：腹腔注射3％戊巴比妥溶液(40mg/kg)麻醉，打开腹腔，从下腔静脉取血，分离血清，-20℃保存；取肝脏10％甲醛固定。血清学指标检测：用全自动生化测定仪检测。IV-C、TNFα检测均按试剂盒说明书进行。肝脏标本处理：常规石蜡包埋、切片，HE染色供常规光镜观察病理变化。统计学处理：数据以x±s表示，用F检验和t检验处理相应数据。
3.结果：同M组比较，小剂量组和大剂量组各项血清学指标的血清水平均明显降低，但以大剂量组降低显著(P＜0.01)。小剂量组：第4周肝小叶结构完整，肝细胞浊肿，散在空泡变，少量炎细胞浸润；第9周汇管区扩大，有弓形纤维形成，第12周肝小叶结构破坏，有纤维隔形成。大剂量组：第4和9周肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，偶见空泡变；第12周见汇管区扩大。可见，甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺均能抑制肝组织内炎症活动和纤维组织增生，从而对CCl4造成的大鼠慢性肝损伤具有防治作用。
表3甘草次酸衍生物对大鼠血清ALT、IV-C、TNFα含量的影响(n＝10，x±s)
| 指标 | 组别 | 实验时间(周) | |||
| 4 | 9 | 12 | |||
| ALT(U/L) | NMS1L1S2L2 | 78.70±20.16272.8±48.66221.33±53.54139.83±49.12**213.13±43.84*141.38±59.52** | 81.45±19.37261.00±52.44205.33±49.06134.67±44.27**198.71±85.16124.67±47.27** | 84.50±16.57296.17±43.13222.50±51.34149.33±53.32**218.50±47.21*161.15±40.22** | |
| IV-C(ng/ml) | NMS1L1S2L2 | 14.62±8.4339.17±14.3728.83±8.30*17.00±7.24**29.13±11.4120.52±10.24* | 16.58±6.8764.67±23.2832.17±14.54*21.33±11.74**34.21±13.04*23.67±9.98** | 15.33±6.2291.50±25.7251.83±24.86*24.33±11.48**54.33±22.34*21.67±19.38** | |
| TNFα(ng/ml) | NMS1L1S2L2 | 0.74±0.271.74±0.481.18±0.28*0.85±0.25**1.09±0.34*0.79±0.31** | 0.81±0.341.79±0.511.33±0.42*0.81±0.28**1.28±0.710.90±0.39** | 0.75±0.181.97±0.591.54±0.460.82±0.30**1.29±0.38*0.86±0.47** | |
与M组比较：*P＜0.05，**P＜0.01
试验例4：本发明衍生物的体外抗乙肝病毒作用
1.材料：
细胞：HBV DNA克隆转染的人肝癌细胞系，由天然药物工程技术研究中心药理研究室提供。能转录、翻译HBV基因，并产生HBsAg、HBeAg。
药物：按本发明提供的方法制备，溶于适量Hank液中，100℃水浴15min灭菌，用时以含10％小牛血清的DMEM倍比稀释至相应浓度。
试剂和主要仪器：DMEM培养基干粉由美国GBICO公司生产；小牛血清GBICO公司生产；3H-TdR购自中国原子能研究院同位素研究所；HBsAg、HBeAg检测试剂盒(ELISA法检测，上海科华产品)。医用净化工作台(苏州净化设备公司产品)；Napco 6100型CO2培养箱(美国杜帮公司产品)；EL-301型酶联免疫检测仪(美国BIO-TEK仪器公司产品)。LS-6500型液体闪烁计数仪(美国贝克曼公司产品)。
2.方法
(1)HBsAg、HBeAg的检测肝癌细胞以5×107/ml浓度接种于96孔培养板中，每孔100μl，甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺终浓度为(0.05、0.1、0.5、1、2mg/L)，和只加200μl含10％小牛血清DMEM培养液的细胞对照组，每组设3个复孔。贴壁培养24 h后弃上清，加入不同浓度的药物，终体积200μl。继续培养72 h后，换药至每孔200μl。继续培养48h，终止前6h，取培养液上清150μl分装，-20℃贮存分别检测HBsAg、HBeAg，按试剂盒说明书操作步骤进行。
HBsAg、HBeAg含量用P/N值表示
P/N＝标本A值/阴性对照A值
(2)细胞增殖的检测取过培养上清后，每孔加入培养液130μl，20μl3H-TdR(9250Bq)，继续培养6h后，弃培养液，用0 25％胰蛋白酶0 02％EDTA消化，多头细胞收集器收集细胞，抽滤在49型滤纸上，80℃恒温箱干燥6h。Beckman LS-6500型液闪计数仪读取dpm。结果以对细胞增殖抑制率表示，抑制率按下式计算：
抑制率＝(1-实验dpm/对照dpm)×100％
数据以x±s表示，用F检验和t检验处理相应数据。
3.结果
对肝癌细胞分泌HBsAg、HBeAg的影响：表4所示，本发明衍生物(0.1、0.5、1、2mg/L)能明显的抑制肝癌细胞分泌HBsAg、HbeAg；对肝癌细胞增殖的影响：表5所示，本发明衍生物(0.05、0.1、0.5、1、2mg/L)可显著的抑制肝癌细胞的增殖。
表4.本发明衍生物对肝癌细胞分泌HBsAg、HBeAg的影响(n＝6)
| 组别 | 浓度(mg/l) | HBeAg | HBsAg | ||
| P/N | 阻抑率(％) | P/N | 阻抑率(％) | ||
| 对照组甘草次酸精氨酸甘草次酸葡甲胺 | 0.050.10.5120.050.10.512 | 9.65±0.249.341±0.258.146±0.67*7.246±0.21*5.921±0.36**3.741±0.48**9.457±0.377.986±0.71*7.112±0.42*5.817±0.54**3.617±0.51** | 4.219.9831.9049.4378.282.621.9933.6450.7679.86 | 10.06±0.429.55±0.238.99±0.79*7.98±0.38*6.26±0.32**4.59±0.27**9.67±0.318.74±0.62*7.51±0.41*6.13±0.57**4.37±0.35** | 6.413.4726.1147.7068.714.916.5832.0349.3771.48 |
*与对照组比较：*P＜0 05，**P＜0 01
表5.本发明衍生物对肝癌细胞增殖的影响(n＝6)
| 组别 | 浓度(mg/l) | dpm | 阻抑率(％) |
| 对照甘草次酸精氨酸甘草次酸葡甲胺 | 0.050.10.510.050.10.51 | 3863.89±432.193240.26±235.06*3032.96±591.79*1704.41±208.13**1090.23±433.04**3314.37±217.693159.51±479.35*1797.38±301.21**1008.23±526.14** | 16.1421.5155.8971.7814.2218.2246.5273.91 |
*与对照组比较：*P＜0 05，**P＜0 01
试验例5：本发明所述化合物对醋酸诱发小鼠毛细血管通透性的影响
1.材料
甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺，由山东省天然药物工程技术研究中心提供；
昆明种小鼠，5-8周龄，体重18-22g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供。雌雄兼用，每批实验采用同一性别。
2.方法
选用雄性昆明种小鼠60只，实验前禁食16h(不禁水)。小鼠随机分6组，甘草次酸精氨酸高剂量组(iv衍生物10mg/kg)、低剂量组(iv衍生物1mg/kg)，甘草次酸葡甲胺高剂量组(iv衍生物10mg/kg)、低剂量组(iv衍生物1mg/kg)，对照组给预等体积的生理盐水，阳性药为消炎痛(10mg/kg)。给药后40min，小鼠尾iv注射2％伊文思兰溶液0.1mL/10g，30min后，ip1％醋酸溶液0.1mL/10g，20min后，脱颈椎处死小鼠，剪开腹部皮肤，用5mL生理盐水冲洗腹腔，收集洗涤液。用721型分光光度计在590nm处比色，测定吸光度，与标准曲线比较得到染料渗出量，并进行t检验。
3结果：与模型组比较衍生物具有显著抑制醋酸诱发血管通透性增高的作用，抑制率分别为44.7％(P＜0.01)和25.6％(P＜0.01)，且高剂量与10mg/kg消炎痛作用相当，结果见表6。
表6衍生物对毛细血管通透性的影响(x±s，n＝10)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 染料渗出量(μg)) | 抑制率(％) |
| 对照组甘草次酸精氨酸甘草次酸葡甲胺消炎痛 | -11011010 | 387.3±36.4288.3±10.5**214.1±15.6**278.2±12.8**220.0±17.9**215.8±24.5** | 25.644.728.1743.244.3 |
与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，
试验例6：本发明所述化合物对抗二甲苯致小白鼠耳廓肿胀作用的影响
1.材料
甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺，由山东省天然药物工程技术研究中心提供；
昆明种小鼠，体重22-24g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供。雌雄兼用，每批实验采用同一性别。
2方法
取昆明种小白鼠70只，随机分为7组。甘草次酸精氨酸高剂量组(iv衍生物20mg/kg)、中剂量组(iv衍生物5mg/kg)、低剂量组(iv衍生物1mg/kg)，甘草次酸葡甲胺高剂量组(iv衍生物20mg/kg)、中剂量组(iv衍生物5mg/kg)、低剂量组(iv衍生物1mg/kg)，七叶皂苷钠(iv 2mg/kg)，正常对照组给预等容量的生理盐水。给药1h后，将实验小鼠左耳两面涂以100％二甲苯0.02ml/只，右耳为对照，1h后处死小鼠，沿耳廓基线剪下两耳，用9mm打孔器制备小鼠耳片，用电子秤称湿重，以两耳重量之差作为肿胀度(炎症指标)。
3.结果
由表7可见甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺(1mg/kg、5mg/kg、20mg/kg)、七叶皂苷钠均可显著抑制二甲苯引起的耳廓肿胀。
表7衍生物对二甲苯致小白鼠耳廓肿胀的影响(x±s，n＝10)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 肿胀度(mg) | 抑制率(％) |
| 正常对照组甘草次酸精氨酸甘草次酸葡甲胺七叶皂苷钠 | -152015202 | 12.52±3.848.79±2.81*8.03±3.05*6.39±1.09**8.82±3.15*7.96±3.67*6.47±2.07**5.85±2.97** | 29.7935.8648.9629.5536.4248.3252.27 |
与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，
试验例7：本发明所述衍生物体外抑菌作用试验
1材料：甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺：按本发明提供方法制备
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎球菌、溶血连菌、卡他球菌(烟台市卫生防疫站提供)2方法：采用平板打孔法分别对甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺I组(0.01mg/ml)，II组(0.05mg/ml)、III组(0.25mg/ml)抑菌效果进行检测。
3结果：表8可见衍生物I、II、III组均具有显著的抑菌效果
表8衍生物抑菌作用
| 名称 | 抑菌圈大小(mm) | |||||
| 甘草次酸精氨酸 | 甘草次酸葡甲胺 | |||||
| I组 | II组 | III组 | I组 | II组 | III组 | |
| 金黄色葡萄球菌大肠杆菌肺炎球菌溶血连菌卡他球菌 | 6.55.5-1.52 | 871.5-133.5 | 1193-3.55.56 | 6.25.7-1.71.9 | 7.56.31.6-12.83.5 | 10.58.53-3.556.5 |
试验例8：甘草次酸衍生物对大鼠局部脑缺血损伤的影响
1.材料：按制备例制备甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺注射剂。红四氮唑：美国Sigma公司产品，临用前用生理盐水配成4％溶液。实验动物：普通级Wistar大鼠，雄性，体重280 g-350g，山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号：鲁动质字00106005号。
2.方法：动物随机分为假手术组(等容量溶剂)，模型对照组(等容量溶剂)，尼莫地平组(Nim，1.5mg/kg)，甘草次酸精氨酸低(1mg/kg)、中(5mg/kg)、高(20mg/kg)剂量组，甘草次酸葡甲胺低(1mg/kg)、中(5mg/kg)、高(20mg/kg)剂量组，每组10只。禁食12小时后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分离右侧颈总动脉，夹闭颈内、颈总动脉，颈外动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，将栓线(选用直径0.24mm尼龙线，长度5.0cm)由颈外动脉插入至颅内，遇轻微阻力时停止，插入深度约为2cm。结扎颈外动脉开口，并打开颈总动脉动脉夹，消毒缝合伤口，造成左侧大脑中动脉缺血模型；假手术组仅进行右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉的分离(以上实验均在23℃～25℃进行)。术后各组动物静脉注射相应药物(给药体积1ml/200g)。24小时后按文献【刘小光，徐理纳，一种能评价溶栓和抗溶栓的大鼠脑中动脉模型，药学学报，1995，30：662】所述方法及标准观察并记录大鼠的行为障碍：(A)提鼠尾观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面，计为0分，如手术对侧前肢出现腕屈曲计为1分，肘屈曲计为2分，肩内旋计为3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩内旋者，计为4分。(B)将动物置于平地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力，计为0分，如向手术对侧推动时阻力下降者，根据下降程度不同分为轻、中、重三度，分别计为1，2和3分。(C)将动物双前肢置一金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢肌张力对等且有力者计为0分。同样根据手术对侧肌张力下降程度不同计为1，2和3分。(D)动物有不停地向一侧转圈者，计为1分。根据标准评分，满分为11分，分数越高，表示动物行为障碍越严重。
行为评分后处死大鼠，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，冠状切成5片，脑片用红四氮唑(TTC)染色，正常组织经染色后呈红色，梗塞组织呈白色，染色后照相，用中国航空航天大学病理图像分析软件求梗塞面积比。数据用表示，以组间t检验进行统计学处理。
3.结果：如表9所示，缺血24小时后，大鼠表现出明显的行为障碍，大鼠脑组织也出现明显的灶状缺血区，达到全脑的25％左右；给予不同剂量的甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺，动物行为障碍有不同程度的减轻，大鼠脑缺血区也有明显好转，且呈剂量依赖性。
甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺10mg/kg抗脑缺血作用强于5mg/kg(P＜0.05)，但是与20mg/kg比较无明显差别(P＞0.05)。提示当剂量≥10mg/kg时，药效并没有继续增加。
表9甘草次酸衍生物对大鼠局部脑缺血损伤的影响(n＝10，
)
| 组别 | 行为障碍 | 缺血面积(％) |
| 假手术组模型对照组Nim组甘草次酸精 1mg/kg氨酸 5mg/kg20mg/kg甘草次酸葡 1mg/kg甲胺 5mg/kg20mg/kg | 010.10±1.376.90±2.33**7.90±1.24*7.50±3.03*5.34±1.28**7.70±2.44*7.31±4.08*6.23±1.13** | 024.26±4.1313.09±7.11**18.21±2.73*16.41±2.84*10.18±3.64**17.06±3.20*15.82±3.14*11.08±3.01** |
与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；。
试验例9：甘草次酸衍生物对大鼠脑缺血/再灌注损伤的影响
1.材料：
按制备例制备甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺注射剂。红四氮唑：美国Sigma公司产品，临用前用生理盐水配成4％溶液。实验动物：普通级Wistar大鼠，雄性，体重280g-350g，山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号：鲁动质字200106005号。
2.方法：
动物随机分为假手术组(等容量溶剂)，模型对照组(等容量溶剂)，尼莫地平组(Nim，1.5mg/kg)，甘草次酸精氨酸低(1mg/kg)、中(5mg/kg)、高(20mg/kg)剂量组，甘草次酸葡甲胺低(1mg/kg)、中(5mg/kg)、高(20mg/kg)剂量组，每组10只。禁食12小时后，按实验例1所述方法造成左侧大脑中动脉缺血；术后10min各组动物静脉注射相应药物(给药体积1ml/200g)。缺血2小时后，抽出尼龙线，造成大鼠脑缺血/再灌注损伤；再灌22小时后，按按实验例1所述方法进行行为评分、脑片染色。数据用
表示，以组间t检验进行统计学处理。
3.结果：
如表10所示，缺血2小时再灌22小时后，大鼠表现出明显的行为障碍，大鼠脑组织也出现明显的灶状缺血区，达到全脑的25％左右；给予不同剂量的甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺，动物行为障碍有不同程度的减轻，大鼠脑缺血区也有明显好转，且呈剂量依赖性。
表10甘草次酸衍生物对大鼠脑缺血/再灌注损伤的影响(n＝10，
)
| 组别 | 行为障碍 | 缺血面积(％) | |
| 假手术组模型对照组Nim组甘草次酸精氨酸甘草次酸葡甲胺 | 1mg/kg10mg/kg20mg/kg1mg/kg10mg/kg20mg/kg | 010.20±1.326.88±2.31**7.89±1.21*7.35±1.27**5.31±1.11**7.72±2.42*7.41±3.04*5.61±1.08** | 026.38±4.6713.55±7.19**18.56±2.77*13.24±3.35**10.38±3.21**17.56±3.78*14.34±2.12**11.42±2.54** |
与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；
试验例10：甘草次酸衍生物对小鼠闭合性脑外伤的保护作用
1.材料
按制备例制备(一)甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺注射剂
清洁级昆明系小鼠，18～22g，雌雄各半，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号：鲁动质字200106003号。
2.方法
取小鼠90只，随机分为正常对照组(等容量溶剂)，模型对照组(等容量溶剂)，甘草次酸精氨酸低(2mg/kg)、中(10mg/kg)、高(40mg/kg)剂量组，甘草次酸葡甲胺低(2mg/kg)、中(10mg/kg)、高(40mg/kg)剂量组，七叶皂苷钠组(2mg/kg)每组10只。按文献【王超云，蒋王林，智红英，等。黄芩苷对脑损伤的保护作用。中草药，2004，35(2)：188～190】所述方法造成小鼠闭合性脑外伤模型，各组静脉给药，24小时后剥取鼠脑，称量湿重，70℃烘干24小时，称干重，计算脑含水量；脑含水量高于正常值表示脑部水肿。
3.结果
如表11所示，闭合性脑外伤造成小鼠脑严重水肿，给予不同剂量的甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺盐后，小鼠脑水肿有不同程度的减轻，且呈剂量依赖性。
表11甘草次酸衍生物对闭合性脑外伤的影响(n＝10，
)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 脑含水量(％) |
| 正常对照组模型对照组甘草次酸精氨酸甘草次酸葡甲胺七叶皂苷钠 | --21040210402 | 79.1±0.3**82.5±1.381.1±0.6*80.9±0.5*79.4±0.4**81.6±0.7*80.7±0.4*78.8±0.6**79.1±0.4** |
与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
试验例11：甘草次酸衍生物对冠状动脉结扎大鼠生理指标的影响
1.材料
普通级SD大鼠，雄性，体重250～300g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号：鲁动质字200106005号。
红花注射液：山西万荣三九药业有限公司，批号040130
受试样品：按制备例制备甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺盐
心电图机：单道心电图机(FX-2111)，北京福田电子医疗仪器有限公司
2.方法
取雄性健康大鼠80只，随机分为8组，模型组给予等体积的生理盐水，甘草次酸精氨酸组、甘草次酸葡甲胺盐分别按1mg/kg、5mg/kg、20mg/kg剂量尾静脉注射给药，红花注射液(iv 780mg/kg)，给药5min后腹腔注射20％乌拉坦0.65g/kg麻醉，背位固定，记录正常心电图。胸部去毛、消毒、沿左锁骨中线纵行切开皮肤约2cm，在第四或第五肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，在动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉处结扎左冠状动脉后，把心脏放回胸腔，迅速缝合胸壁，该手术在30秒内完成。记录缺血后心电图变化。
数据用表示，并与模型组比较，以t检验进行统计学处理。
表12.甘草次酸衍生物对冠状动脉结扎大鼠心电图J点的影响
| 组别 | 剂量mg/kg | J点抬高数值(mv) | |||||
| 初始 | 30min | 60min | 90min | 180min | 240min | ||
| 模型组甘草次酸精氨酸2甘草次酸葡甲胺红花注射液 | -15201520780 | 0.27±0.100.21±0.03*0.20±0.05*0.16±0.05*0.22±0.06*0.21±0.04*0.17±0.06*0.26±0.09 | 0.26±0.040.20±0.04*0.19±0.04*0.16±0.05*0.21±0.05*0.20±0.07*0.17±0.07*0.23±0.06 | 0.26±0.040.19±0.07*0.18±0.08*0.15±0.06**0.20±0.07*0.19±0.07*0.16±0.08*0.20±0.05* | 0.25±0.050.18±0.09*0.18±0.09*0.15±0.09**0.19±0.06*0.19±0.08*0.17±0.08*0.19±0.09* | 0.25±0.040.20±0.080.16±0.10*0.17±0.06**0.19±0.080.18±0.09*0.15±0.12*0.21±0.08 | 0.25±0.050.21±0.070.17±0.09*0.15±0.04**0.21±0.040.17±0.06*0.15±0.08*0.21±0.07 |
*表示与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01
3.结果
如表12显示对J点的影响，与模型组比较甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺组(1mg/kg、5mg/kg、20mg/kg)在30min、60min、90min、180min、240min均能显著降低J点抬高的幅度(p＜0.05)。
4.结论
甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺对心肌具有保护作用，能降低缺血引起的心肌损伤。
试验例12：甘草次酸衍生物对冠状动脉结扎大鼠生化指标的影响
1.材料
普通级SD大鼠，雄性，体重250～300g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号：鲁动质字200106005号。
红花注射液：山西万荣三九药业有限公司，批号040130
受试样品：按制备例制备甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺注射液
AST/GOT试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司，批号020101
CK试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司，批号090091
LDH试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司，批号130051
紫外分析仪：722E型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司
离心机：台式高速离心机(TGL-16G)，上海医用分析仪器厂
2.方法
取雄性健康大鼠90只，随机分为9组，假手术组、模型组给予等体积的生理盐水，甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺注射液组分别按1mg、5mg、20mg/kg剂量尾静脉注射给药，红花注射液(iv 780mg/kg)，给药5min后腹腔注射20％乌拉坦0.65g/kg麻醉，背位固定。胸部去毛、消毒、沿左锁骨中线纵行切开皮肤约2cm，在第四或第五肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，在动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉处结扎左冠状动脉后，把心脏放回胸腔，迅速缝合胸壁，该手术在30秒内完成。6h后将大鼠固定与解剖板上，分离颈总动脉，抽取血液，静置10min后，4500rpm离心15min，吸取血清，利用试剂盒检测CK、LDH、AST酶活。
数据用
表示，并与模型组比较，以t检验进行统计学处理。
表13甘草次酸衍生物对冠状动脉结扎大鼠血液中酶活的影响
| 组别 | 剂量mg/kg | CK酶活U/L | AST酶活U/L | LDH酶活U/L |
| 假手术组模型组甘草次酸精氨酸甘草次酸葡甲胺红花注射液 | --15201520780 | 881.27±133.641213.98±96.31###1211.28±155.821100.38±117.25*1016.73±194.94*1224.78±147.271104.41±93.91*991.57±201.2*1098.49±93.11* | 80.14±22.00150.79±23.6###117.69±25.39*111.63±36.10*106.45±28.6**120.08±22.14*115.58±29.34*101.31±21.49**119.95±29.66* | 186.45±43.46420.94±27.04###364.16±66.67*348.35±79.62*304.91±47.83***391.42±63.34*363.71±53.51*314.87±56.78**367.24 ±55.00* |
*表示与模型组比较*p＜0.05，***p＜0.001；#表示与假手术组比较，###p＜0.001
3.结果
如表13显示，该心肌缺血模型能显著提高缺血大鼠血浆中CK、AST、LDH酶活的活性(p＜0.001)，与模型组比较甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺组均能显著降低上述三种酶的活性(p＜0.05)。
4.结论
甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺对心肌组织具有保护作用，能有效地改善机体因心肌缺血引起的组织损伤，使机体血浆中CK、AST、LDH酶活性显著降低。
试验例13：甘草次酸衍生物对冠状动脉结扎大鼠形态学指标的影响
1.材料
普通级SD大鼠，雄性，体重250～300g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号：鲁动质字200106005号。
红花注射液：山西万荣三九药业有限公司，批号040130
受试样品：按制备例制备甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺注射液
氯化硝基四氮唑兰，前进化学试剂厂(上海)，批号20010801
电子天平，BP 210 S，Sartorius(德国)
2.方法
取雄性健康大鼠80只，随机分为8组，模型组给予等体积的生理盐水，甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺分别按1mg、5mg/kg、20mg/kg剂量尾静脉注射给药，红花注射液组(iv 780mg/kg)，给药5min后腹腔注射20％乌拉坦0.65g/kg麻醉，背位固定。胸部去毛、消毒、沿左锁骨中线纵行切开皮肤约2cm，在第四或第五肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，该手术在30秒内完成。在动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉处结扎左冠状动脉后，把心脏放回胸腔，迅速缝合胸壁，6h后将大鼠固定与解剖板上，打开胸腔，剥离心脏，用生理盐水冲洗，除去血污，剔除血管脂肪等非心肌组织，沿冠状沟切除心房，留下心室，称重。顺房室沟从心尖到心基部平行将心室切成0.1cm厚的心肌片，将心肌片放在0.3％的NBT，在37℃孵育4min，染色后立即用水冲洗去多余的染料，减去各心肌片被染色的非梗死区心肌，称量未染色的梗死区心肌，利用下列公式算出心肌梗死面积(％)
数据用
表示，并与模型组比较，以t检验进行统计学处理。
表14.甘草次酸衍生物对冠状动脉结扎大鼠心肌梗死重量百分率的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 心肌梗死重量百分率(％) |
| 模型组甘草次酸精氨酸甘草次酸葡甲胺红花注射液 | -15201520780 | 26.12±1.7123.64±3.62*22.98±3.40*21.79±2.77**23.24±3.27*22.49±4.20*20.37±3.19**22.02±2.62* |
*表示与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01
3.结果
如表14显示，与模型组比较，甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺(1mg/kg、5mg/kg、20mg/kg)红花注射液(780mg/kg)均能显著降低心肌梗死百分率(p＜0.05)。
4.结论
甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺在一定剂量下具有保护心肌组织的作用，能缓解缺血对心肌细胞的损伤。
试验例14：甘草次酸衍生物对小鼠凝血时间的影响
1.材料
清洁级昆明种小鼠，雄性，体重20～22g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号：鲁动质字200106003号。
受试样品：按制备例制备甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺注射液。
2.方法
取雄性健康小鼠80只，随机分为8组，正常对照组按0.2ml/只尾静脉注射生理盐水，甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺分别按2mg/kg、10mg/kg、40mg/kg剂量尾静脉注射给药，红花注射液组(iv 1560mg/kg)给药0.5h后，眼眶采血，玻片法测定血液凝固时间。数据用
表示，并与模型组比较，以t检验进行统计学处理。
表15甘草次酸衍生物对小鼠凝血时间的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 凝血时间(s) |
| 正常组甘草次酸精氨酸甘草次酸葡甲胺红花注射液组 | -21040210401560 | 103±20.02154±26.89**152.5±31.9**176.6±33.40***149.0±24.97**157.9±29.67**179.2±41.31***164.3±32.7*** |
*表示与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01
3.结果：
如表15显示，甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺(2mg/kg、10mg/kg、40mg/kg)、红花注射液组(iv 1560mg/kg)与模型组比较具有显著的抗凝血作用(p＜0.05)。
4结论：
甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺在一定剂量下能显著延长凝血时间，有一定的活血化瘀作用。
试验例15：甘草次酸衍生物对小鼠的镇痛作用
1.材料
清洁级昆明种小鼠，雄性，体重18～22g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号：鲁动质字200106003号。
甘草次酸钠注射液(山东省天然药物工程技术研究中心提供)、盐酸吗啡(1mg/kg)。
受试样品：按制备例制备甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺注射液。
2.方法
取雄性健康小鼠140只，随机分为7组，正常对照组，甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺组(3mg/kg、12mg/kg)、甘草次酸钠注射液组(12mg/kg)、盐酸吗啡组(10mg/kg)，各组均腹腔给药。给药30min后，各鼠均腹腔注射0.5％醋酸0.2ml/只。观察10min内各组出现扭体反应(腹部内凹、伸展后肢、臀部抬高)小鼠只数，计算各药镇痛百分率。
表16甘草次酸衍生物对小鼠镇痛的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 出现扭体反应数(只) | 镇痛百分率(％) |
| 正常组甘草次酸精氨酸甘草次酸葡甲胺甘草次酸钠盐酸吗啡 | -2102101010 | 20106127110 | 05070***4065***45100*** |
*扭体反应抑制率达50％以上时，才认为有镇痛作用。
3.结果：
如表16显示，甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺(10mg/kg、)均能明显减少扭体反应鼠数，与正常组比较均有显著差异(p＜0.05)。
试验例16：本发明衍生物的急性毒性试验
1.材料
按制备例制备甘草次酸精氨酸、甘草次酸葡甲胺注射剂。清洁级昆明系小鼠，18～22g，雌雄各半，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号：鲁动质字200106003号。
2.方法
实验动物按SOP要求检疫一周，剔除不合格动物。试验室与饲养室条件一致。室温18-25℃，湿度40-60％，过滤送风，光照12小时。自由摄食和饮水，每日更换饮水瓶一次。取健康小鼠50只，雌雄各半。随机分为5组，每组10只。称重后，按120、90、67.5、50.6、35.5mg/kg的剂量尾静脉注射给药。给药后密切观察72小时，记录小鼠的死亡情况。
3.结果
甘草次酸精氨酸的LD50为71.52±1.85mg/kg，LD50的95％的可信限为63.64～80.42mg/kg。
甘草次酸葡甲胺LD50为75.68±1.88mg/kg，LD50的95％的可信限为66.21～86.76mg/kg。
Claims (2)
1.甘草次酸精氨酸盐在制备治疗或预防心肌缺血药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的甘草次酸为18α-甘草次酸、18β-甘草次酸或它们的混合物。
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