CN1341151A - 除草剂的靶基因和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分离自鼠耳芥属的编码幼苗生长必需蛋白质的基因。基于这些基因对于正常生长和发育的重要性,本发明还包括应用这些蛋白质开发新的除草剂的方法。本发明还可以用于鉴别是潜在除草剂的抑制剂的筛选分析方法中。还可以应用本发明开发除草剂耐受性植物、植物组织、植物种子和植物细胞。

Description

除草剂的靶基因和方法
本发明涉及从鼠耳芥属(Arabidopsis)分离的编码幼苗生长所必需的蛋白质的基因。基于该基因对于正常生长和发育的重要性，本发明还包括将这些蛋白质用作除草剂靶标的方法。本发明还可以用于鉴定是潜在除草剂的抑制剂的筛选方法。本发明还可以应用于开发除草剂耐受性植物、植物组织、植物种子和植物细胞。
应用除草剂控制农作物田间不需要的植物例如杂草几乎已成为一种全球性手段。每年除草剂的销售超过150亿美元。尽管有这种广泛应用，但杂草的控制对于农民而言仍然是一个重要而耗资很大的问题。
除草剂的有效应用需要合理的安排。例如，使用的时间和方法以及杂草植物的发育阶段对于使用除草剂获得良好的杂草控制是关键的。由于有多种杂草种类可以抵抗除草剂，所以制备有效的新除草剂变得越来越重要。目前可以采用以重组DNA技术进行的大批量筛选方法发现新的除草剂。植物的生长和发育所必需的代谢酶可以通过标准分子生物学技术来重组制备，并作为除草剂的靶标应用于新的该酶活性抑制剂的筛选中。通过此筛选发现的新抑制剂然后可以用作除草剂控制不需要的植物。
不幸的是，表现出更大的效力、更广的杂草范围以及能够更快地在土壤中降解的除草剂可能也具有更大的危害农作物的植物毒性。该问题的一个解决方法是开发抵抗或耐受除草剂的农作物。耐受除草剂的农作物杂种或品体使得可以应用这些除草剂来杀灭杂草而又不伴随对农作物造成伤害的危险。耐受性的开发能够允许除草剂应用于原先由于对该除草剂敏感而不能或限制性地(例如出苗前使用)使用该除草剂的农作物上。例如，Anderson等的美国专利4,761,373针对多种咪唑啉酮或磺胺类除草剂的抗性植物。一种改变的乙酰羟酸合成酶(AHAS)赋予了该抗性。Goodman等的美国专利4,975,374涉及到含有编码突变的谷氨酰胺合成酶(GS)的基因的植物细胞和植物，这些植物细胞和植物抵抗已知抑制GS的除草剂例如膦丝菌素和甲硫氨酸磺基肟(methionine sulfoximine)的抑制。Bedbrook等的美国专利5,013,659针对表达突变的乙酰乳酸合成酶的植物，该酶使得该植物能够抵抗磺酰脲除草剂的抑制。Somers等的美国专利5,162,602公开了耐受环己烷二酮和芳氧基苯氧基丙酸除草剂抑制的植物。该耐受性由改变的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)赋予。
尽管有以上描述的进展，但对于不需要或有害的植物生长(例如杂草)仍存顽固性和亟待解决的问题。而且，随着人口的持续生长，将出现日愈增加的食品短缺。因此，对于寻找新的有效而经济的除草剂，存在一种长期感受到但未满足的需求。
为了清楚起见，将本说明书中使用到的某些术语定义和介绍如下：
嵌合的：用以指DNA序列，例如载体或基因，是由一种以上不同来源的DNA序列组成的其中这些不同来源的DNA序列通过重组DNA技术融合在一起，形成一种天然不存在的，尤其是在待转化的植物中不存在的DNA序列。
辅因子：酶催化反应中所必需的天然反应物，例如有机分子或金属离子。辅因子例如NAD(P)、核黄素(包括FAD和FMN)、叶酸、钼蝶呤(molybdopterin)、硫胺素、生物素、硫辛酸、泛酸和辅酶A、S-腺苷甲硫氨酸、吡哆醛磷酸、辅酶Q、甲基萘醌类。任选地，辅因子可以再生和重利用。
DNA改组：DNA改组是一种快速容易并有效地在DNA分子中引入，优选随机地引入突变或重排，或在两种或多种DNA分子之间产生，优选随机地产生DNA序列交换的方法。从DNA改组获得的DNA分子是一种改组的DNA分子，该分子是来源于至少一种模板DNA分子的天然所不存在的DNA分子。该改组DNA编码就模板DNA所编码的酶而言修饰的酶，而且相对于模板DNA所编码的酶而言优选具有改变的生物学活性。
酶活性：在本文中指酶催化底物转化成产物的能力。酶的底物包含该酶的天然底物，还包含也能被该酶转化成产物或产物类似物的该天然底物的类似物。酶活性的测量通过在一个确定的时间段之后测定反应中的产物量，或在一个确定的时间段之后测定反应混合物中剩余的底物量来进行。还可以通过在一个确定的时间段之后测定反应混合物中剩余的未使用辅因子的量，或通过在一个确定的时间段之后测定反应混合物中用掉的辅因子的量来测量酶活性。还可以通过在一个确定的时间段之后测定反应混合物中剩余的自由能供体或富含能量分子(例如ATP、磷酸烯醇丙酮酸、乙酰磷酸或磷酸肌酸)的量，或通过在一个确定的时间段之后测定反应混合物中已用自由能供体或富含能量分子(例如ADP、丙酮酸、乙酸或肌酸)的量来测量酶活性。
表达：是指植物中内源性基因或转基因的转录和/或翻译。例如对于反义结构，表达可以仅指该反义DNA的转录。
基因：是指编码序列和相关的调节序列，其中该编码序列转录成RNA例如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA或反义RNA。调节序列的例子是启动子序列、5’和3’非翻译序列和终止序列。还可以存在的元件是例如内含子。
除草剂：用以杀死或抑制植物、植物细胞、植物种子或植物组织生长的化学制品。
异源DNA序列：天然情况下与所导入的宿主细胞不相关的DNA序列，包括天然存在DNA序列的非天然存在的多拷贝，以及其中本身同源的DNA序列可操作地与非天然的序列连接的遗传结构。
同源DNA序列：与其导入的宿主细胞天然相关的DNA序列。
抑制剂：通过例如失活对于植物的生长或生存所必需的生物合成酶等蛋白质的酶活性、受体、信号转导蛋白质、结构基因产物或运输蛋白，造成植物异常生长的化学制品。在本发明的上下文中，抑制剂是指改变植物的245基因、5283基因、2490基因、3963基因或4036基因所编码的酶活性的化学制品。更一般地，抑制剂通过与该245基因、5283基因、2490基因、3963基因或4036基因所编码的基因产物相互作用造成宿主细胞的异常生长。
等基因的：除了可能由于存在或不存在异源DNA序列而不同外，遗传上一致的植物。
分离的：在本发明的上下文中，分离的DNA分子或分离的酶是指通过人为操作使其脱离天然环境而存在并因此不是自然产物的DNA分子或酶。分离的DNA分子或酶可以以纯化形式存在，或可以存在于非天然环境中例如存在于转基因宿主细胞中。
标记基因：编码可筛选或可选择的性状的基因。
成熟蛋白质：正常定向到细胞器例如叶绿体，并且已从其中除去了转运肽的蛋白质。
最小启动子：在没有上游激活时无活性或具有大大降低的启动子活性的启动子元件，尤其是TATA元件。当存在适合的转录因子时，该最小启动子发挥功能允许转录。
修饰的酶活性：与天然存在于植物中的酶活性(即在没有人为地对这些活性进行直接或间接的操作的情况下天然存在的酶活性)不同的酶活性，该修饰的酶活性耐受抑制天然存在的酶活性的抑制剂。
植物：是指任何植物，尤其是种子植物。
植物细胞：植物的结构和生理单位，包含原生质和细胞壁。植物细胞可以是分离的单个细胞或培养细胞形式、或作为更高级的组织单位例如植物组织或植物器官等的部分。
植物材料：是指植物的叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、卵细胞、合子、胚、种子、插条、细胞或组织培养物、或任何其它的植物部分或植物产物。
前蛋白(pre-protein)：正常定向到细胞器例如叶绿体，并且仍含有其转运肽的蛋白质。
重组DNA分子：采用重组DNA技术连接在一起的DNA序列的组合。
选择标记基因：其表达并不赋予转化细胞选择优势，但其表达使得该转化细胞表型上不同于非转化细胞的基因。
显著增加：大于测量技术固有的误差范围的酶活性增加，优选在有抑制剂时比野生型酶的活性增加大约2倍或更多，更优选增加大约5倍或更多，最优选增加大约10倍或更多。
显著降低：是指酶反应产物量的降低超过测量技术固有的误差范围。优选在没有抑制剂时比野生型酶的活性降低大约2倍或更多，更优选降低大约5倍或更多，最优选降低大约10倍或更多。
术语“基本相似”当在本文中用于核苷酸序列时，以其最广泛的含义，是指相应于参考序列的核苷酸序列，其中该相应序列所编码的多肽具有与该参考核苷酸序列编码的多肽基本相似的结构和功能，例如仅在不影响多肽功能的氨基酸中发生改变。期望的是，该基本相似的核苷酸序列编码由该参考核苷酸序列编码的多肽。术语“基本相似”特别旨在包括其中序列已被修饰以优化其在特定细胞中的表达的核苷酸序列。该基本相似的核苷酸序列与参考核苷酸序列之间的一致性百分数希望是至少65％、更希望是至少75％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少99％。序列比较采用Smith-Waterman序列比对算法(见例如Waterman，M.S.，计算生物学入门：图谱、序列和基因组(Introduction to Computional Biology：Maps，Sequences andgenomes)，Chapman & Hall，伦敦：1995，ISBN 0-412-99391-0)进行。使用1.16版localS程序，参数如下：匹配：1，错配罚分：0.33，开始断缺区罚分：2，延长的断缺区罚分：2。与参考核苷酸序列“基本相似”的核苷酸序列可以与该参考核苷酸序列在如下条件下杂交：7％十二烷基磺酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中50℃杂交并在2×SSC、0.1％SDS中50℃进行洗涤，更期望的是在7％十二烷基磺酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中50℃杂交并在1×SSC、0.1％SDS中50℃进行洗涤，甚至更期望的是在7％十二烷基磺酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中50℃杂交并在0.5×SSC、0.1％SDS中50℃进行洗涤，优选在7％十二烷基磺酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中50℃杂交并在0.1×SSC、0.1％SDS中50℃进行洗涤，更优选在7％十二烷基磺酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mM EDTA中50℃杂交并在0.1×SSC、0.1％SDS中65℃进行洗涤。本文所用术语“245基因”、“5283基因”、“2490基因”、“3963基因”、或“4036基因”是指分别含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9，或分别含有与SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9基本相似的核苷酸序列的DNA分子。245基因、5283基因、2490基因、3963基因或4036基因的同系物分别包括编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10有至少30％一致性的氨基酸序列的核苷酸序列，一致性的测量采用以下描述的参数进行，其中由这些同系物编码的氨基酸序列分别具有245、5283、2490、3963或4036蛋白质的生物学活性。
术语“基本相似”，当在本文中用于蛋白质时，是指相应于参考蛋白质的蛋白质，其中该蛋白质具有与该参考蛋白质基本相同的结构和功能，例如仅在不影响该多肽功能的氨基酸序列中有改变。当用于蛋白质或氨基酸序列时，采用BLAST分析的默认参数值，基本相似的蛋白质或氨基酸序列和参考蛋白质或氨基序列之间的一致性百分数期望是至少65％、更期望至少75％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少99％。本文所用术语“245蛋白质”、“5283蛋白质”、“2490蛋白质”、“3963蛋白质”、或“4036蛋白质”分别是指由含有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9基本相似的核苷酸序列的DNA分子编码的氨基酸序列。245蛋白质、5283蛋白质、2490蛋白质、3963蛋白质或4036蛋白质的同系物分别是与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10有至少30％一致性的氨基酸序列，一致性的测量采用以下描述的参数进行，其中这些同系物分别具有245、5283、2490、3963或4036蛋白质的生物学活性。
本领域技术人员还熟悉确定“基本相似的”和参考的核苷酸序列、或蛋白质或氨基酸序列之间一致性百分数的其它分析工具，例如GAP分析。因此，在本发明中，“基本相似”也采用Wisconsin大学GCG，GAP的SEQWEB应用程序以及默认的GAP分析参数来确定，该GAP分析基于Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch(1970)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48：443-453)。
因此，对于“245基因”并采用上述GAP分析时，“基本相似”是指编码与SEQ ID NO：2有至少47％一致性、更优选至少60％一致性、甚至更优选至少75％一致性、甚至更优选至少85％一致性、甚至更优选至少95％一致性、甚至更优选至少99％一致性的蛋白质的核苷酸序列。
对于“5283基因”并采用上述GAP分析时，“基本相似”是指编码与SEQ ID NO：4有至少74％一致性、更优选至少80％一致性、甚至更优选至少85％一致性、甚至更优选至少90％一致性、甚至更优选至少95％一致性、甚至更优选至少99％一致性的蛋白质的核苷酸序列。而且，“基本相似”还优选指与SEQ ID NO：3有至少80％一致性、更优选至少90％一致性、甚至更优选95％一致性、甚至更优选至少99％一致性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列比较采用上述GAP分析进行。
对于“2490基因”并采用上述GAP分析时，“基本相似”是指编码与SEQ ID NO：6有至少82％一致性、更优选至少85％一致性、甚至更优选至少90％一致性、甚至更优选至少95％一致性、甚至更优选至少99％一致性的蛋白质的核苷酸序列。而且，“基本相似”还优选指与SEQ ID NO：5有至少87％一致性、更优选至少90％一致性、甚至更优选95％一致性、甚至更优选至少99％一致性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列比较采用上述GAP分析进行。
对于“3963基因”并采用上述GAP分析时，“基本相似”是指编码与SEQ ID NO：8有至少40％一致性、更优选至少60％一致性、更优选至少80％一致性、甚至更优选至少90％一致性、甚至更优选至少95％一致性、甚至更优选至少99％一致性的蛋白质的核苷酸序列。而且，“基本相似”还优选指与SEQ ID NO：7有至少49％一致性、更优选至少60％一致性、甚至更优选至少80％一致性、更优选至少90％一致性、更优选至少95％一致性、甚至更优选至少99％一致性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列比较采用上述GAP分析进行。
对于“4036基因”并采用上述GAP分析时，“基本相似”是指编码与SEQ ID NO：10有至少67％一致性、更优选至少80％一致性、更优选至少85％一致性、甚至更优选至少90％一致性、甚至更优选至少95％一致性、甚至更优选至少99％一致性的蛋白质的核苷酸序列。
而且，采用如上所述的GAP分析，“245基因的同系物”包括编码与SEQ ID NO：2有至少24％一致性、更优选至少30％一致性、甚至更优选至少40％一致性、甚至更优选至少45％一致性、甚至更优选至少55％一致性、甚至更优选至少65％一致性、甚至更优选至少75％一致性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中该同系物所编码的氨基酸序列具有245蛋白质的生物学活性。
而且，采用如上所述的GAP分析，“5283基因的同系物”包括编码与SEQ ID NO：4有至少23％一致性、更优选至少40％一致性、甚至更优选至少50％一致性、甚至更优选至少60％一致性、甚至更优选至少74％一致性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中该同系物所编码的氨基酸序列具有5283蛋白质的生物学活性。
而且，采用如上所述的GAP分析，“2490基因的同系物”包括编码与SEQ ID NO：6有至少30％一致性、更优选至少30％一致性、甚至更优选至少50％一致性、甚至更优选至少60％一致性、甚至更优选至少80％一致性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中该同系物所编码的氨基酸序列具有2490蛋白质的生物学活性。
而且，采用如上所述的GAP分析，“3963基因的同系物”包括编码与SEQ ID NO：8有至少34％一致性、更优选至少40％一致性、甚至更优选至少50％一致性、甚至更优选至少60％一致性、甚至更优选至少75％一致性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中该同系物所编码的氨基酸序列具有3963蛋白质的生物学活性。
而且，采用如上所述的GAP分析，“4036基因的同系物”包括编码与SEQ ID NO：10有至少44％一致性、更优选至少50％一致性、甚至更优选至少60％一致性、甚至更优选至少75％一致性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中该同系物所编码的氨基酸序列具有4036蛋白质的生物学活性。
当采用上述关于蛋白质或氨基酸序列的GAP分析时，对于“245基因”，“基本相似”的蛋白质或氨基酸序列与参考蛋白质或氨基酸序列(在此为SEQ ID NO：2)之间的一致性百分数为至少47％、更优选至少60％、甚至更优选至少75％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少99％。“245蛋白质的同系物”包括与SEQ ID NO：2有至少24％一致性、更优选至少30％一致性、甚至更优选至少40％一致性、甚至更优选至少45％一致性、甚至更优选至少55％一致性、甚至更优选至少65％一致性、甚至更优选至少75％一致性的氨基酸序列，其中该245蛋白质的同系物具有245蛋白质的生物学活性。
对于“5283基因”，当采用上述GAP分析时，基本相似的蛋白质或氨基酸序列与参考蛋白质或氨基酸序列(在此为SEQ ID NO：4)之间的一致性百分数为至少74％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少99％。“5283蛋白质的同系物”包括与SEQ ID NO：4有至少23％一致性、更优选至少40％一致性、甚至更优选至少50％一致性、甚至更优选至少60％一致性、甚至更优选至少74％一致性的氨基酸序列，其中该5283蛋白质的同系物具有5283蛋白质的生物学活性。
对于“2490基因”，当采用上述GAP分析时，基本相似的蛋白质或氨基酸序列与参考蛋白质或氨基酸序列(在此为SEQ ID NO：6)之间的一致性百分数为至少82％、更优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少99％。“2490蛋白质的同系物”包括与SEQ IDNO：6有至少30％一致性、更优选至少30％一致性、甚至更优选至少50％一致性、甚至更优选至少60％一致性、甚至更优选至少80％一致性的氨基酸序列，其中该2490蛋白质的同系物具有2490蛋白质的生物学活性。
对于“3963基因”，当采用上述GAP分析时，“基本相似”的蛋白质或氨基酸序列与参考蛋白质或氨基酸序列(在此为SEQ ID NO：8)之间的一致性百分数为至少40％、更优选至少60％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少99％。“3963蛋白质的同系物”包括与SEQ ID NO：8有至少34％一致性、更优选至少40％一致性、甚至更优选至少50％一致性、甚至更优选至少60％一致性、甚至更优选至少75％一致性的氨基酸序列，其中该3963蛋白质的同系物具有3963蛋白质的生物学活性。
对于“4036基因”，当采用上述GAP分析时，“基本相似”的蛋白质或氨基酸序列与参考蛋白质或氨基酸序列(在此为SEQ ID NO：10)之间的一致性百分数为至少67％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少99％。“4036蛋白质的同系物”包括与SEQ ID NO：10有至少44％一致性、更优选至少50％一致性、甚至更优选至少60％一致性、甚至更优选至少75％一致性的氨基酸序列，其中该4036蛋白质的同系物具有4036蛋白质的生物学活性。
底物：底物是在酶天然执行其功能的生物化学途径中被该酶天然识别并转化成产物的分子，或是在类似于天然存在的反应的酶反应中被该酶识别并转化成产物的该分子的修饰版本。
耐受性：当暴露于足以抑制天然未修饰植物正常生长或功能的量的抑制剂或除草剂时，保持基本正常的生长或功能的能力。
转化：将异源DNA引入细胞、组织或植物的程序。转化的细胞、组织或植物应理解为不仅包括转化程序的终产物，也包括其转基因后代。
转基因的：用优选含有可操作地与目的DNA序列连接的适合启动子的重组DNA分子稳定转化的。SEQ ID NO：1鼠耳芥属245基因的cDNA序列SEQ ID NO：2 SEQ ID NO：1所示鼠耳芥属245 DNA序列所编码的氨基序列SEQ ID NO：3鼠耳芥属5283基因的cDNA序列SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：3所示鼠耳芥属5283 DNA序列所编码的氨基序列SEQ ID NO：5鼠耳芥属2490基因的cDNA序列SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：5所示鼠耳芥属2490 DNA序列所编码的氨基序列SEQ ID NO：7鼠耳芥属3963基因的cDNA序列SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：7所示鼠耳芥属3963 DNA序列所编码的氨基序列SEQ ID NO：9鼠耳芥属4036基因的cDNA序列SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：9所示鼠耳芥属4036 DNA序列所编码的氨基序列SEQ ID NO：11寡核苷酸SLP346forSEQ ID NO：12鼠耳芥属245基因的部分基因组序列SEQ ID NO：13鼠耳芥属245基因cDNA序列的3’UTRSEQ ID NO：14鼠耳芥属5283基因的基因组序列SEQ ID NO：15寡核苷酸SLP328SEQ ID NO：16寡核苷酸LW60SEQ ID NO：17鼠耳芥属5283基因cDNA序列的5’UTRSEQ ID NO：18鼠耳芥属5283基因cDNA序列的3’UTRSEQ ID NO：19鼠耳芥属2490基因的基因组序列SEQ ID NO：20鼠耳芥属2490基因cDNA的5’UTRSEQ ID NO：21鼠耳芥属2490基因cDNA序列的3’UTRSEQ ID NO：22寡核苷酸SLP369SEQ ID NO：23寡核苷酸SLP370SEQ ID NO：24鼠耳芥属3963基因的基因组序列SEQ ID NO：25寡核苷酸-21SEQ ID NO：26鼠耳芥属3963基因cDNA序列的3’UTRSEQ ID NO：27鼠耳芥属4036基因的基因组序列SEQ ID NO：28鼠耳芥属4036基因的cDNA编码序列，包括来自载培品种Landsberg的cDNA和Columbia的基因组序列之间的差异。SEQ ID NO：29 SEQ ID NO：28所示鼠耳芥属4036 DNA序列所编码的氨基酸序列
本发明包括分离的DNA分子，其含有与选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的任意一个序列基本相似的核苷酸序列。优选根据本发明的DNA分子，其中该序列编码与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的任意一个序列基本相似的氨基酸序列。进一步优选根据本发明的DNA分子，其中该序列是选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQID NO：7和SEQ ID NO：9的任意一个序列。进一步优选根据本发明的DNA分子，其中该序列编码选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的任意一个序列的氨基酸序列。进一步优选根据本发明的DNA分子，其中所述核苷酸序列是植物的核苷酸序列。更优选根据本发明的DNA分子，其中该植物是鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)。进一步优选根据本发明的DNA分子，其中该蛋白质具有选自245活性、5283活性、2490活性、396活性和4036活性的任意一种活性。本发明还包括氨基酸序列，其含有与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的任意一个序列基本相似的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。优选根据本发明的氨基酸序列，其含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：9的任意一个序列所编码的氨基酸序列。本发明的再一个目标是含有与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：10的任意一个序列基本相似的氨基酸序列的氨基酸序列。优选根据本发明的氨基酸序列，其中该序列是选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的任意一个序列。进一步优选根据本发明的DNA序列，其中该蛋白质具有选自245、5283、2490、3963和4036活性的任意一种活性。本发明包括氨基酸序列，其含有选自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的任意一个序列所编码的氨基酸序列的至少20个连续氨基酸残基。本发明还包括含有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的至少20个连续氨基酸残基的氨基酸序列。本发明的一个目标是含有可操作地与本发明DNA分子连接的启动子的表达盒。本发明还包括含有根据本发明的表达盒的重组载体，其中所述载体能够被稳定地转化至宿主细胞中。本发明还包括含有根据本发明的表达盒的宿主细胞，其中所述核苷酸序列能够在所述细胞中表达。优选根据本发明的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。更优选根据本发明的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自昆虫细胞、酵母细胞和植物细胞。而且更优选根据本发明的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。更优选根据本发明的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞。本发明包括含有根据本发明的植物细胞的植物或种子。优选根据本发明的植物，其中所述植物耐受选自245活性、5283活性、2490活性、3963活性和4036活性的任意一种活性的抑制剂。
本发明还包括如下方法，该方法包括获得含有异源DNA分子的宿主细胞，其中所述异源DNA分子编码具有245活性、5283活性、2490活性、3963活性或4036活性的蛋白质；和在所述宿主细胞中表达所述蛋白质。优选该宿主细胞是细菌细胞、酵母细胞或昆虫细胞。
本发明还包括制备编码具有改变活性的基因产物的核苷酸序列的方法，其中所述活性选自245活性、5283活性、2490活性、3963活性和4036活性，该方法包括：
a)改组权利要求1的核苷酸序列，
b)表达所获得的改组核苷酸序列，和
c)选择与选自所述未修饰核苷酸序列的基因产物的245活性、5283活性、2490活性、3963活性和4036活性相比，改变的选自245活性、5283活性、2490活性、3963活性和4036活性的活性。
优选根据本发明的方法，其中该核苷酸序列是选自SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的任意一个序列。本发明包括通过根据本发明的该方法可以获得的改组DNA分子。本发明包括通过根据本发明的该方法制备的改组DNA分子。本发明还包括根据本发明的该方法获得的改组DNA分子，其中所述改组DNA分子编码的基因产物对选自245活性、5283活性、2490活性、3963活性和4036活性的任意一种活性的抑制剂具有增强的耐受性。本发明的再一个目标是含有可操作地与本发明核苷酸序列连接的启动子的表达盒。本发明还包括含有根据本发明的表达盒的重组载体，其中所述载体能够被稳定地转化至宿主细胞中。本发明的再一个目标是含有根据本发明的表达盒的宿主细胞，其中所述核苷酸序列能够在所述细胞中表达。优选根据本发明的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。还优选根据本发明的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自昆虫细胞、酵母细胞和植物细胞。还优选根据本发明的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。还优选根据本发明的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞。本发明的一个目标是含有根据本发明的植物细胞的植物或种子。优选根据本发明的植物，其中所述植物耐受选自抑制245活性、5283活性、2490活性、3963活性和4036活性的抑制剂。本发明还包括筛选与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的任意一个序列所编码的蛋白质相互作用的化合物的方法，包括：
a)表达分别含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的任意一个序列，或含有与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的任意一个序列基本相似的序列的DNA分子，以产生相应蛋白质，
b)对推测能够与步骤(a)中表达的蛋白质相互作用的化合物进行测试，和
c)选择在步骤(b)中与蛋白质相互作用的化合物。
本发明的另一个目标是鉴定选自245活性、5283活性、2490活性、3963活性和4036活性的任意一种活性的抑制剂的方法，包括：
(a)向植物细胞中分别引入含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的任意一个序列的核苷酸序列，并具有选自245活性、5283活性、2490活性、3963活性和4036活性的任意一种活性的DNA分子，或与其基本相似的核苷酸序列，或它们的同系物，以致所述序列能够以高于野生型表达水平的水平进行功能性表达，
(b)在有利于抑制的条件下将所述植物细胞与待测试化合物合并，以检测该化合物抑制选自245活性、5283活性、2490活性、3963活性和4036活性的任意一种活性的能力，
(c)在步骤(b)的条件下测量植物的生长，和
(d)在相同条件下，将所述植物细胞的生长与具有选自245活性、5283活性、2490活性、3963活性和4036活性的未改变活性的植物细胞之生长进行比较，和
(e)选择在步骤(d)中抑制植物细胞生长的所述化合物。
本发明包括根据本发明的方法能够鉴别的具有除草剂活性的化合物。本发明还包括鉴定具有除草剂活性的化合物的方法，包括：
(a)在有利于相互作用的条件下将根据本发明的蛋白质与待测试的化合物合并，以测试该化合物与所述蛋白质相互作用的能力，
(b)选择在步骤(a)中鉴定的能够与所述蛋白质相互作用的化合物，
(c)给植物施用步骤(b)中所鉴定的化合物，以检测除草剂活性，和
(d)选择具有除草剂活性的化合物。
本发明包括根据本发明的方法能够鉴定的具有除草剂活性的化合物。本发明的再一个目标是用于抑制植物生长的方法，包括给所述植物施用抑制本发明氨基酸序列的活性的化合物，施用量为足以抑制所述植物生长的量。
优选根据本发明的方法，其中该化合物是根据本发明的方法能够鉴定的具有除草剂活性的化合物。本发明包括改良农作物的方法，包括给根据本发明的除草剂耐受性植物或种子施用可根据本发明方法鉴定的具有除草剂活性的化合物，施用量是对不需要的植物产生抑制但又不显著抑制该除草剂耐受性植物或种子的生长的量。本发明的一个目标是含有与选自下组的任意一个序列基本相似的核苷酸序列的DNA分子：SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29。
本发明的一个目标是提供一种鉴定新除草剂的有效而有利的方法。本发明的一个特点是鉴定了表现出与肽释放因子2(Craigen等(1985)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，82：3616-3620；Craigen和Caskey(1987)Biochimie 69：1031-1041；Ito等(1998)美国国家科学院院刊，95：8165-8169)具有序列相似性的鼠耳芥属基因，在本文中称作245基因。本发明的另一个特点是发现该245基因是幼苗生长和发育所必需的。本发明的一个优点在于，该新发现的必需基因包含一种新的除草剂作用方式，其使得本领域的技术人员能够容易而快速地鉴定出新的除草剂。
本发明的另一个特点是鉴定了表现出与下列基因具有序列相似性的鼠耳芥属基因，在本文中称作5283基因：粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的一个未定性基因；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中编码mRNA前体拼接所必需的一个因子的PRP31基因(Weidenhammer等(1996)核酸研究(Nucleic Acids Res.)24：1164-1170；Weidenhammer等(1997)分子细胞生物学(Mol.CellBio1.)，17：3580-3585)；Pisum sativum中编码支架结构附着区(SAR)DNA结合蛋白的SARBP-1和SARBP-2(Rzepecki等(1995)Acta Biochim.Pol.，41：75-81)；酿酒酵母中编码能消除IKB之生长抑制性作用的蛋白质的SIK1基因(Morin等(1995)细胞生长和分化(Cell Growth &Differentiation)，6：789-798)。该SIK1基因产物又称作Nop56，其表现出是一种必需的核仁蛋白质(Gautier等(1997)，分子细胞生物学，17：7088-7098)。本发明的另一个特点在于，发现该5283基因是幼苗生长和发育所必需的。本发明的一个优点是，该新发现的必需基因包含一种新的除草剂作用方式，其使得本领域的技术人员能够容易而快速地鉴定出新的除草剂。
本发明的再一个特点是，鉴定了在鼠耳芥属中编码与叶绿体被膜蛋白具有序列相似性的蛋白质的基因，本文中称作2490基因(Ko等(1995)生物化学杂志(The Journal of Biological Chem.)270：28601-28608；Wu等(1994)生物化学杂志269：32264-32271；Pang等(1997)生物化学杂志272：25623-23627)。本发明的另一个特点在于，发现该2490基因是幼苗生长和发育所必需的。本发明的一个优点是，该新发现的必需基因包含一种新的除草剂作用方式，其使得本领域的技术人员能够容易而快速地鉴定出新的除草剂。
本发明的再一个特点是鉴定了在鼠耳芥属中编码与许多DNA修复蛋白质具有序列相似性的蛋白质的基因，在本文中称作3963基因，其中所述DNA修复蛋白质包括Schizosaccharomyces pombe的Rad32p(Genbank索取号Q09683)；人(Homo sapiens)的bMrell(Genbank索取号U37359)；和酿酒酵母的Mrellp(Genbank索取号U60829)(Johzuka和Ogawa(1995)遗传学(Genetics)，139：1521-1532；Paull和Gellert(1998)分子细胞(Molecular Cell)1：969-979)。本发明的另一个特点在于，发现该3963基因是幼苗生长和发育所必需的。本发明的一个优点是，该新发现的必需基因包含一种新的除草剂作用方式，其使得本领域的技术人员能够容易而快速地鉴定出新的除草剂。
本发明的再一个特点是，鉴定了在鼠耳芥属中编码与许多生物的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶(reductoisomerase)具有序列相似性的蛋白质的基因，本文中称作4036基因，其中所述生物包括集胞蓝细菌属(Synechocystis)(SWISS-PROTQ55663)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(SWISS-PROT 031753)、和大肠杆菌(Escherichia coli)(SWISS-PROT P45568)(Takahashi等(1998)美国国家科学院院刊，95：9879-9884)。本发明的一个重要而出乎意料的特点是，发现该4036基因是幼苗生长和发育所必需的。本发明的一个优点是，该新发现的必需基因包含一种新的除草剂作用方式，其使得本领域的技术人员能够容易而快速地鉴定出新的除草剂。
本发明的一个目标是为开发具有除草剂活性的化合物提供植物中的必需基因。遗传结果显示，当鼠耳芥属中245基因、5283基因、2490基因、3963基因或4036基因发生突变时，在纯合状态所获表型是幼苗致死的。这提示由该突变基因编码的基因产物具有着关键性作用。
采用T-DNA插入诱变，本发明的发明者已阐明，由鼠耳芥属245基因、鼠耳芥属5283基因、鼠耳芥属2490基因、鼠耳芥属3963基因或4036基因编码的活性(本文中称作245、5283、2490、3963或4036活性)在鼠耳芥属幼苗中是必需的。这意味着，抑制植物中该蛋白质功能的化学制品很可能对植物产生有害影响，并是潜在的良好除草剂候选物。因此本发明提供应用下述基因序列所编码的纯化的蛋白质鉴定其抑制剂的方法，该抑制剂然后可以用作除草剂以抑制例如农作物生长田间不需要植物的生长，所述农作物尤其是农业经济上重要的农作物例如玉米和其它谷类作物例如小麦、黑麦、燕麦、高粱、稻、大麦、黍、草皮草和饲料草等等，以及棉花、甘蔗、甜菜、产油料种子的欧洲油菜和大豆。
本发明公开了来源于鼠耳芥属的命名为245基因的核苷酸序列。该cDNA克隆的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：1，而相应的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：2。其部分基因组DNA序列的核苷酸序列显示于SEQ IDNO：12。本发明还包括与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列基本相似的核苷酸序列。本发明还包括其氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列基本相似的植物蛋白质。该蛋白质能够在鉴定是潜在除草剂的抑制剂的筛选试验中应用。
本发明还公开了来源于鼠耳芥属的命名为5283基因的核苷酸序列。该cDNA克隆的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：3，而相应的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：4。其基因组DNA序列的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：14。本发明还包括与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列基本相似的核苷酸序列。本发明还包括其氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列基本相似的植物蛋白质。该蛋白质能够在鉴定是潜在除草剂的抑制剂的筛选试验中应用。
本发明还公开了来源于鼠耳芥属的命名为2490基因的核苷酸序列。该cDNA克隆的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：5，而相应的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：6。其基因组DNA序列的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：19。本发明还包括与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列基本相似的核苷酸序列。本发明还包括其氨基酸序列与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列基本相似的植物蛋白质。该蛋白质能够在鉴定是潜在除草剂的抑制剂的筛选试验中应用。
本发明还公开了来源于鼠耳芥属的命名为3963基因的核苷酸序列。该cDNA克隆的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：7，而相应的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：8。其基因组DNA序列的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：24，它含有来自标注为MDK4.6的MDK4克隆部分和基于本发明人报道cDNA克隆的3’末端添加序列的基因组DNA序列。本发明还包括与SEQ ID NO：7所示核苷酸序列基本相似的核苷酸序列。本发明还包括其氨基酸序列与SEQ ID NO：8所示氨基酸序列基本相似的植物蛋白质。该蛋白质能够在鉴定是潜在除草剂的抑制剂的筛选试验中应用。
本发明还公开了来源于鼠耳芥属的命名为4036基因的核苷酸序列。该cDNA克隆的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：9，而相应的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：10。其基因组DNA序列的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：27。通过来自于栽培品种Landsberg的cDNA克隆和来自于栽培品种Columbia的基因组序列的比较，观察到13个核苷酸差异；下面的表1进一步明确了这些差异。除了这13个核苷酸差异外，SEQ ID NO：28与SEQ ID NO：9相同。SEQ ID NO：28的相应氨基酸序列显示于SEQ ID NO：29。本发明还包括与SEQ ID NO：9所示核苷酸序列基本相似的核苷酸序列。本发明还包括其氨基酸序列与SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：29所示氨基酸序列基本相似的植物蛋白质。该蛋白质能够在鉴定是潜在除草剂的抑制剂的筛选试验中应用。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于鉴定在植物中能够抑制245、5283、2490、3963或4036活性的化学制品的方法，优选包括步骤：a)获得转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞，优选稳定转化的转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞，其含有编码具有245、5283、2490、3963或4036活性的酶的非天然核苷酸序列并能够超量表达具有酶活性的245、5283、2490、3963或4036(全长的或截短但仍有活性的)基因产物；b)给该转基因植物、植物细胞、组织或部分和等基因非转化植物、植物细胞、组织或部分施用化学制品；c)测量在施用该化学制品之后该转基因和非转化植物、植物细胞、组织的生长和生活力；d)比较在施用化学制品后转基因和非转化植物、植物细胞、组织的生长和生活力；和e)选择抑制非转化植物、植物细胞、组织或部分的生活力或生长，但不显著抑制该等基因的转基因植物、植物细胞、组织或部分的生活力或生长的化学制品。在一个优选的实施方案中，具有245、5283、2490、3963或4036活性的酶由来源于植物，优选鼠耳芥的核苷酸序列编码，期望是该核苷酸序列分别与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示核苷酸序列一致或基本相似。在另一个实施方案中，具有245、5283、2490、3963或4036活性的酶分别由能够编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10的氨基酸序列的核苷酸序列所编码。在再一个实施方案中，具有245、5283、2490、3963或4036活性的酶分别具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示氨基酸序列一致或基本相似的氨基酸序列。
本发明还包含具有修饰的245、5283、2490、3963或4036活性，并因此耐受正常对天然存在的245、5283、2490、3963或4036活性具有抑制性的除草剂水平之抑制的植物、植物组织、植物种子和植物细胞。本发明所包含的除草剂耐受性植物包括那些本来将会是正常抑制性除草剂的潜在靶标的植物，尤其是以上提及的农业经济上重要的作物。根据该实施方案，用含有与编码修饰的245、5283、2490、3963或4036基因的核苷酸编码序列可操作地连接、并在植物中起作用的适合启动子的重组DNA分子转化，优选稳定转化植物、植物组织、植物种子或植物细胞，其中所述修饰的基因耐受正常情况下抑制野生型未修饰245、5283、2490、3963或4036基因产物活性的浓度的除草剂的抑制。还可以通过给植物提供多拷贝的野生型245、5283、2490、3963或4036基因，或通过在较野生型强的启动子控制下的野生型245、5283、2490、3963或4036基因的超量表达，增加除草剂敏感的野生型245、5283、2490、3963或4036蛋白质的表达，来赋予植物修饰的245、5283、2490、3963或4036活性。然后通过常规筛选技术对由此产生的转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞进行筛选，籍此分离、分析并开发出除草剂耐受性株系。作为替代方法，可以应用随机或位点特异性诱变产生除草剂耐受性株系。
因此，本发明提供用含有分离自植物编码具有245、5283、2490、3963或4036活性之酶的核苷酸序列的DNA分子转化的植物、植物细胞、植物种子或植物组织，其中该DNA表达245、5283、2490、3963或4036活性，并且其中该DNA分子赋予该植物、植物细胞、植物种子、或植物组织对正常抑制天然存在的245、5283、2490、3963或4036活性的除草剂量的耐受性。根据该实施方案的一个实施例，具有245、5283、2490、3963或4036活性的酶分别由与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9中所示核苷酸序列一致或基本相似的核苷酸序列编码，或分别具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10中所示氨基酸序列一致或基本相似的氨基酸序列。
本发明还提供用于抑制植物生长的方法，包括步骤：给该植物施用抑制植物中天然存在的245、5283、2490、3963或4036活性的化学制品。在一个相关方面，本发明指向用于在含有许多种植作物种子或植物的田间选择性地抑制不需要植物的生长的方法，包括步骤：(a)任选地种植除草剂耐受性农作物或农作物种子，它们是对抑制天然存在的245、5283、2490、3963或4036活性的除草剂具有耐受性的植物或植物种子；和(b)向田间的这些除草剂耐受性农作物或农作物种子以及不需要植物施用除草剂，施用量为抑制天然存在的245、5283、2490、3963或4036活性的除草剂量，其中该除草剂抑制杂草的生长，但不显著抑制农作物的生长。
在对本发明的以下描述和非限制性实施例进行研究之后，本领域的技术人员将明了本发明的其它目标和优点。
正如以下实施例所显示的，新基因结构的鉴定，以及245基因、5283基因、2490基因、3963基因或4036基因对于正常的植物生长和发育的重要性，采用T-DNA插入诱变在鼠耳芥属中首次获得阐明。由于已经确立了245、5283、2490、3963或4036功能在植物中的重要性，并已鉴定了编码这些必需活性的基因，由此发明人提供一种用于新除草剂开发的重要搜寻工具。
鉴定分离幼苗致死突变的鼠耳芥属插入突变株是鉴定必需基因的第一步。用收集自在其基因组中含有T-DNA插入片断的单一T1植株的T2种子作为起始材料，鉴定分离出纯合幼苗致死突变的那些株系。这些株系可以通过以下步骤发现：将种子置于含有杀真菌剂苯菌灵和maxim的基本植物生长培养基上，并于室温光照下培养7天和14天之后鉴别不能存活的幼苗。不能存活的表型包括改变的色素形成或改变的形态。这些表型可以直接在培养皿中或在幼苗移植后在土壤中观察到。
当一个株系被鉴定为分离幼苗致死后，确定T-DNA中的抗性标记是否与该致死性共分离(Errampalli等(1991)植物细胞(The Plant Cell)，3：149-157)。共分离分析通过将这些种子置于含有选择剂的培养基上，并给幼苗对于该试剂的抗性或敏感性进行评分来实现。应用的选择剂的例子有潮霉素或膦丝菌素。将大约35株抗性幼苗移植至土壤中，并在其后代中检测幼苗致死的分离。在T-DNA插入破坏必需基因的情况中，在每一个植株上都会出现该抗性表型与该幼苗致死表型的共分离。因此，在这种情况下，所有抗性植株在下一代中分离幼苗致死；这个结果表明每一个抗性植株对于引起这两个表型的DNA而言都是杂合的。
对于表现出T-DNA抗性标记与幼苗致死表型共分离的那些株系，进行Southern分析作为对每个插入片断的分子性质进行定性的最初步骤。Southern采用分离自杂合子的基因组DNA以及能够与T-DNA载体DNA杂交的探针来进行。应用该Southern分析的结果，选择适当的限制性酶进行质粒拯救，以分子克隆位于T-DNA插入片断一侧或两侧的鼠耳芥属基因组DNA。通过该方法获得的质粒通过限制性酶消化进行分析，以便根据质粒的消化图谱将它们分类。对于每一种类型的质粒克隆，确定其DNA序列。分析所获得的序列是否存在非T-DNA载体的序列。如果发现这样的序列，则将它们用于搜索DNA和蛋白质数据库，该搜索采用BLAST和BLAST2程序进行(Altschul等(1990)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215：403-410；Altschul等(1997)核酸研究25：3389-3402)。通过标准的分子生物学程序鉴定每个基因的其它基因组和cDNA序列。
鼠耳芥属245基因是通过从标记的幼苗致死系#245分离T-DNA边界侧翼的DNA鉴定的。位于T-DNA边界侧翼的鼠耳芥属DNA区域与基因组调查序列F17K7TR(索取号#B24357)99％一致。本发明人第一次阐明了该245基因产物是植物的正常生长和发育所必需的，并通过蛋白质同源性明确了245基因产物的功能。本发明公开了鼠耳芥属245基因的cDNA核苷酸序列，以及鼠耳芥属245蛋白质的氨基酸序列。相应于该cDNA克隆的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：1，而编码该蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：2。在SEQ ID NO：13’发现的UTR显示于SEQ ID NO：13。相应于其部分基因组DNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：12。本发明还包括来源于植物的分离氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列编码的氨基酸序列一致或基本相似，其中所述氨基酸序列具有245活性。采用BLAST和BLAST2程序以及默认的设定值，245基因的序列表现出与多种原核种类的肽释放因子2相似。显著的相似种类包括：大肠杆菌(RF-2)[Swiss-Prot索取号#P07012]；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(RF-2 Salty)[Swiss-Prot索取号#P28353]；和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(RF-2：prfB)[Swiss-Prot索取号#005782]。对以下蛋白质序列和245基因采用GAP分析，获得以下与245蛋白质的序列一致性：大肠杆菌(RF-2)[Swiss-Prot索取号#P07012](27.2％一致)；鼠伤寒沙门氏菌(RF-2 Salty)[Swiss-Prot索取号#P28353](24.6％一致)；和结核分枝杆菌(RF-2：prfB)[Swiss-Prot索取号#005782](27.2％一致)。此外，集胞蓝细菌属(GenPept索取号#BAA18577)(31.5％一致)；和鼠耳芥第5号染色体的P1克隆MAB16(索取号#AB018112NID)(46.2％一致)。
鼠耳芥属5283基因是通过从标记的幼苗致死系#5283分离T-DNA边界侧翼的DNA鉴定的。位于T-DNA边界侧翼的该鼠耳芥属DNA区域与鼠耳芥属一个已测序的BAC的内部区域(BAC T13D8，1号染色体)一致。该BAC克隆含有116，177bp序列，其中一个非常小的部分相应于含有该5283基因的基因组区域。尽管已有此BAC的信息，但本发明人第一次阐明了该5283基因产物是植物的正常生长和发育所必需的，并通过蛋白质同源性明确了5283基因产物的功能。本发明公开了鼠耳芥属5283基因的cDNA核苷酸序列，以及鼠耳芥属5283蛋白质的氨基酸序列。相应于该cDNA克隆的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：3，而编码该蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：4。相应于其基因组DNA的核苷酸序列显示于SEQID NO：14。相应于该cDNA序列的5’UTR的核苷酸序列显示于SEQ IDNO：17，而相应于该cDNA序列的3’UTR的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：18。本发明还包括来源于植物的分离氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与SEQID NO：3中所示核苷酸序列编码的氨基酸序列一致或基本相似，其中所述氨基酸序列具有5283活性。采用BLAST和BLAST2程序以及默认的设定值，5283蛋白质的序列表现出与如下序列的相似性：粟酒裂殖酵母的SPBC119.13c[GENPEPT索取号#CAA17928]；植物的SAR DNA结合蛋白[SARBP-1：Genbank索取号#AF061962和SARBP-2：Genbank索取号#AF061963]；和酿酒酵母的prp31和SIK1p(Nop56)[PRP31：Swiss Prot索取号#Q12460]。采用GAP分析以下蛋白质序列和5283蛋白质，获得以下与5283蛋白质的序列一致性：粟酒裂殖酵母的SPBC119.13c[GENPEPT索取号#CAA17928](40.5％一致)；植物的SAR DNA结合蛋白[SARBP-1：Genbank索取号#AF061962(23.5％一致)和SARBP-2：Genbank索取号#AF061963(24.2％一致)]；和酿酒酵母的prp31和SIK1p(Nop56)[PRP31：Swiss Prot索取号#Q12460](24.1％一致)。此外，鼠耳芥(GenPept索取号#AAC18800)与5283蛋白质获得73.8％的一致性。
鼠耳芥属2490基因是通过从标记的幼苗致死系#2490分离T-DNA边界侧翼的DNA鉴定的。位于T-DNA边界侧翼的该鼠耳芥属DNA区域与鼠耳芥属一个已测序的P1克隆的内部区域(P1 MTG13，第5号染色体)一致。该P1克隆含有50,641bp序列，其中的一小部分相应于含有该2490基因的基因组区域。通过测定144K24 EST克隆(获自Michigan州立大学)的序列，获得含有2490蛋白质完整编码序列的2490 cDNA序列。尽管已有此BAC和EST的序列信息，但本发明人第一个明确地确立了该完整基因序列，并阐明了该2490基因产物是植物的正常生长和发育所必需的，并且通过蛋白质同源性明确了2490基因产物的功能。本发明公开了鼠耳芥属2490基因的cDNA核苷酸序列，以及鼠耳芥属2490蛋白质的氨基酸序列。相应于该cDNA克隆的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：5，而编码该蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：6。在SEQ ID NO：5的5’端发现的UTR序列显示于SEQ ID NO：20，而在SEQ ID NO：5的3’端发现的UTR序列显示于SEQ ID NO：21。相应于其基因组DNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：19。本发明还包括来源于植物的分离氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO：5中所示核苷酸序列编码的氨基酸序列一致或基本相似，其中所述氨基酸序列具有2490活性。采用BLAST和BLAST2程序以及默认的设定值，2490蛋白质的序列表现出与欧洲油菜的叶绿体被膜Toc36(bce42B)(Ko等(1995)生物化学杂志270：28601-28608；Wu等(1994)生物化学杂志269：32264-32271；Pang等(1997)生物化学杂志272：25623-25627)的相似性。采用GAP分析2490蛋白和欧洲油菜的叶绿体被膜蛋白Toc36(bce42B)(Genbank索取号#X79091)，获得与2490蛋白质的81.7％一致性。
鼠耳芥属3963基因是通过从标记的幼苗致死系#3963分离T-DNA边界侧翼的DNA鉴定的。位于T-DNA边界侧翼的该鼠耳芥属DNA区域与第5号染色体的P1克隆MDK4(Genbank索取号AB010695)中的基因组序列100％一致。本发明人第一个阐明了该3963基因产物是植物的正常生长和发育所必需的，并通过蛋白质同源性明确了3963基因产物的功能。本发明公开了鼠耳芥属3963基因的cDNA核苷酸序列，以及鼠耳芥属3963蛋白质的氨基酸序列。相应于该cDNA克隆的核苷酸序列显示于SEQ IDNO：7，而编码该蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：8。在SEQ ID NO：7的3’端发现的UTR序列显示于SEQ ID NO：26。相应于其基因组DNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：24。本发明还包括来源于植物的分离氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO：7中所示核苷酸序列编码的氨基酸序列一致或基本相似，其中所述氨基酸序列具有3963活性。采用BLAST和BLAST2程序以及默认的设定值，3963基因序列表现出与许多DNA修复蛋白质的相似性，这些DNA修复蛋白质包括粟酒裂殖酵母的Rad32p(Genbank索取号Q09683)；人的hMre11(Genbank索取号U37359)；和酿酒酵母的Mre11p(Genbank索取号U60829)。采用GAP分析以下蛋白质序列和3963蛋白质，获得以下与5283蛋白质的序列一致性：粟酒裂殖酵母的Rad32p(Genbank索取号Q09683)(37.5％一致)；人的hMre11(Genbank索取号U37359)(39.4％一致)；和酿酒酵母的Mre11p(Genbank索取号U60829)(34.7％一致)。
鼠耳芥属4036基因是通过从标记的幼苗致死系#4036分离T-DNA边界侧翼的DNA鉴定的。位于T-DNA边界侧翼的该鼠耳芥属DNA区域与来自鼠耳芥属第5号染色体的P1克隆MQB2的公开基因组序列(Genbank索取号#AB009053)100％一致。本发明人第一个阐明了该4036基因产物是植物的正常生长和发育所必需的，并通过蛋白质同源性明确了4036基因的功能。本发明公开了鼠耳芥属4036基因的cDNA编码核苷酸序列，以及鼠耳芥属4036蛋白质的氨基酸序列。相应于栽培品种Landsberg的cDNA以及两个栽培品种的cDNA的核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：28。编码这些蛋白质的相应氨基酸序列显示于SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：29。相应于该基因组DNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：27。通过比较来源于栽培品种Lansberg的cDNA克隆和来源于栽培品种Columbia的基因组序列，观察到13个核苷酸序列差异，这些变异列于下表1中。
表1.在来源于栽培品种Lansberg的4036 cDNA克隆和来源于栽培品种Columbia的4036基因组序列之间所观察到的核苷酸差异
核苷酸#* 栽培品种Landsberg 栽培品种Columbia 含有核苷酸差异的密码子(栽培品种Landsberg中的氨基酸残基和栽培品种Columbia中的氨基酸残基)**
    115     G     A     GAT到AAT(Asp到Asn)
    207     T     C     GTT到GTC(Val到Val)
    273     C     T     TCC到TCT(Ser到Ser)
    276     C     T     ATC到ATT(Ile到Ile)
    321     T     C     TTT到TTC(Phe到Phe)
    393     G     A     GCG到GCA(Ala到Ala)
    485     T     A     CTA到CAA(Leu到Gln)
    464     C     T     CCC到CTC(Pro到Leu)
    559     A     C     AAG到CAG(Lys到Gln)
    963     T     G     CCT到CCG(Pro到Pro)
    1101     T     A     CCT到CCA(Pro到Pro)
    1254     T     C     TTT到TTC(Phe到Phe)
    1393     G     A     GAT到AAT(Asp到Asn)
*SEQ ID NO：9用作核苷酸编号的参考
**氨基酸残基：Ala(丙氨酸)；Asn(天冬酰胺)；Asp(天冬氨酸)；Gln(谷氨酰胺)；Ile(异亮氨酸)；Leu(亮氨酸)；Lys(赖氨酸)；Phe(苯丙氨酸)；Pro(脯氨酸)；Ser(丝氨酸)；和Val(缬氨酸)
本发明还包括来源于植物的分离氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO：9中所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列一致或基本相似，其中所述氨基酸序列具有4036活性。采用BLAST和BLAST2程序以及默认的设定值，4036基因序列表现出与多种生物的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶的相似性，这些生物包括集胞蓝细菌属(SWISS-PROTQ55663)、枯草芽孢杆菌(SWISS-PROT 031753)、和大肠杆菌(SWISS-PROT P45568)(Takahashi等(1998)美国国家科学院院刊95：9879-9884)。采用GAP分析以下蛋白质序列和4036蛋白质，获得以下与4036蛋白质的序列一致性：集胞蓝细菌属的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶(SWISS-PROTQ55663)(66.1％一致)、枯草芽孢杆菌的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶(SWISS-PROT 031753)(45.4％一致)、和大肠杆菌的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶(SWISS-PROT P45568)(Takahashi等(1998)美国国家科学院院刊95：9879-9884)(44.6％一致)。
为了在宿主生物中重组产生245、5283、2490、3963或4036活性，将编码具有245、5283、2490、3963或4036活性之蛋白质的核苷酸序列插入设计用于所选宿主的表达盒中，并将其导入待重组产生该活性的宿主细胞中。例如，SEQ ID NO：1或与作为3’UTR的SEQ ID NO：13相连的SEQ ID NO：1、与SEQ ID NO：1基本相似的核苷酸序列、或245编码序列的同系物可以用于重组产生具有245活性的蛋白质。对于适合所述宿主的特定调节序列例如启动子、信号序列、5’和3’非翻译序列、和增强子的选择属于本领域的常规技术水平范围内。可以将含有按正确阅读框可操作地连接在一起的单个元件的所获分子插入能够被转化至宿主细胞的载体中。对于宿主生物例如大肠杆菌、酵母和昆虫细胞，以及杆状病毒表达载体例如来源于苜蓿银纹夜蛾(Autographica californica)核型多角体病毒(AcMNPV)基因组的载体，用于重组产生蛋白质的适合表达载体和方法是熟知的(见例如Luckow和Summers，Bio/Technol.6：47(1988)。优选的杆状病毒/昆虫系统是pAcHLT(Phamingen，San Diego，CA)，用于存在线性苜蓿银纹夜蛾杆状病毒DNA(Pharmigen.San Diego，CA)时转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)sf9细胞(ATCC)。所获病毒用于转染HighFive Tricoplusia ni细胞(Invitrogen，La Jolla，CA)。以相似方式获得5283、2490、3963或4036活性的重组产生。
在一个优选实施方案中，编码具有245、5283、2490、3963或4036活性之蛋白质的核苷酸序列来源于真核生物，例如哺乳动物、蝇或酵母，但优选来源于植物。在再一个优选实施方案中，该核苷酸序列分别与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9中所示核苷酸序列一致或基本相似，或分别编码具有245、5283、2490、3963或4036活性的蛋白质，其氨基酸序列分别与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10中所示氨基酸序列一致或基本相似。SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9中所示核苷酸序列编码鼠耳芥属245蛋白质、鼠耳芥属5283蛋白质、鼠耳芥属2490蛋白质、鼠耳芥属3963蛋白质或鼠耳芥属4036蛋白质，其氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10。在另一个优选实施方案中，该核苷酸序列来源于原核生物，优选细菌例如大肠杆菌。
可以采用各种标准技术分离和纯化重组制备的具有245、5283、2490、3963或4036活性的蛋白质。可以采用的实际技术将取决于所选宿主生物、蛋白质是否设计为分泌的、以及本发明技术人员所熟知的其它因素(见例如Ausubel，F.等，“当代分子生物学实验指南(Current Protocols inMolecular Biology)”，第16章，John Wiley & Sons公司出版(1994))。
重组产生的具有245、5283、2490、3963或4036活性的蛋白质可以用于多种目的。例如，它们可以用于体外分析以对未鉴定出其靶标的已知除草剂化学制品进行筛选，以确定其是否对245、5283、2490、3963或4036活性产生抑制。这样的体外分析还可以用作更一般的筛选，以鉴定抑制该酶活性并由此成为新的除草剂候选分子的化学制品。或者，可以应用重组产生的具有245、5283、2490、3963或4036活性的蛋白质，阐明这些分子的复杂结构并进一步分析它们与抑制剂结合的特点，以便合理地设计新的抑制性除草剂以及酶的除草剂耐受形式。
体外抑制剂分析：发现分别与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9的基因产物相互作用的小分子配体
一旦一个蛋白质已被鉴定为潜在的除草剂靶标之后，下一步是开发允许对大量化学制品进行筛选的分析试验，以确定与该蛋白质相互作用的化学制品。尽管开发针对已知功能的蛋白质的分析试验是简单的，但开发关于未知功能的蛋白质的分析试验则较为困难。该难题可通过使用能在不了解蛋白质的生物学功能时检测蛋白质与化合物之间相互作用的技术来克服。本文给出了三种方法的简短描述，它们包括荧光相关光谱学、表面增强激光解吸/电离(surface-enhanced laser desorption/ionization)、和biacore技术。
荧光相关光谱学(FCS)的理论出现于1972年，但仅在近年才有了实施FCS的技术(Madge等，(1972)Phys.Rev.Lett.，29：705-708；Malti等(1997)美国国家科学院院刊，94：11753-11757)。FCS测量在小样品体积中荧光分子的平均扩散速率。该样品的大小可以低至103个荧光分子，该样品的体积可以低至单个细菌的细胞质。扩散速率是分子质量的函数，并随着质量的增加而降低。因此可以将FCS应用于蛋白质-配体的相互作用分析，方法是测量结合导致的质量改变以及由此引起的分子扩散速率的改变。在一个典型实验中，将待分析的目标表达成在N或C端插有序列标记物例如聚组氨酸序列的重组蛋白质。该表达在大肠杆菌、酵母或昆虫细胞中进行。通过层析纯化该蛋白质。例如，可以利用聚组氨酸标记物使表达的蛋白质与金属鏊合柱例如鏊合在亚氨基二乙酸琼脂糖上的Ni2+结合。然后用荧光标记物例如羧基四甲基罗丹明或BODIPY(Molecular Probes，Eugene，OR)标记该蛋白质。之后将该蛋白质在溶液中暴露给可能的配体，并采用可获自Carl Zeiss公司(Thornwood，NY)的仪器通过FCS测量其扩散速率。通过该蛋白质扩散速率的改变确定配体的结合。
表面增强激光解吸/电离(SELDI)是Hutchens和Yip在20世纪80年代后期发明的(Hutchens和Yip(1993)Rapid Commun.Mass Spectrom.7：576-580)。当与飞行时间质谱仪(TOF)偶联时，SELDI提供了一种快速分析保留在芯片上的分子的方法。通过将靶蛋白质共价结合在芯片上，并通过MS分析与该蛋白质结合的小分子，能够将SELDI应用于配体-蛋白质相互作用分析(Worrall等(1998)分析生物化学(Anal.Biochem.)70：750-756)。在一个典型的实验中，按用于FCS的所述方式表达待分析的目标。然后将纯化的蛋白质用于该分析，而不需要进一步制备。通过利用聚组氨酸标记物或通过其它相互作用例如离子交换或疏水相互作用，将该蛋白质与SELDI芯片结合。然后通过例如能够以顺序方式吸取配体的递送系统(自动进样器)，将由此制备的芯片暴露给可能的配体。然后对该芯片进行递增严紧度的洗涤，例如用含有递增离子强度的缓冲溶液进行一系列洗涤。每次洗涤之后，通过将该芯片送至SELDI-TOF，分析结合的物质。特异地与靶标结合的配体将通过需要洗脱它们的洗涤严紧性来鉴定。
Biacore以固定在表层的蛋白质与配体的结合导致的表层反射率的改变为基础。在该系统中，将大量小配体顺序地注入带有固定化蛋白质的一个2-5μl的小室中。通过表面等离子共振(surface plasmonresonance，SPR)记录该表面反射的激光，以检测结合。一般，针对表面层的给定质量浓度变化的反射率改变实际上对于所有蛋白质和肽都是相同的，这就允许可以将一个单一的方法应用于任何蛋白质(Liedberg等(1983)Sensors Actuators 4：299-304；Malmquist(1993)自然(Nature)361：186-187)。在一个典型的实验中，按用于FCS的所述方式表达待分析的目标。然后无需进一步制备即可将该纯化蛋白质用于该分析。通过利用聚组氨酸标记物或通过其它相互作用例如离子交换或疏水相互作用，使该蛋白质与Biacore芯片结合。然后通过整合在Biacore(Uppsala，瑞典)出售的仪器中用于以顺序方式吸取配体的递送系统(自动进样器)，将由此制备的芯片暴露给可能的配体。记录芯片上的SPR信号，反射率的改变反映了固定的靶标与配体之间的相互作用。信号动力学开关速率的分析使得可以区分非特异和特异相互作用。
而且，对于与多肽相互作用的小分子配体的分析也是抑制剂分析。例如，用于鉴定必需植物基因例如245、5283、2490、3963或4036基因的抑制剂的此类抑制剂分析包括步骤：
a)在存在如下蛋白质功能的可疑抑制剂的情况下，使植物的245、5283、2490、3963或4036蛋白质与其底物反应；
b)比较存在此可疑抑制剂时的酶活性速度和相同条件下不存在该可疑抑制剂时的酶活性速度；和
c)确定该可疑抑制剂是否抑制了245、5283、2490、3963或4036蛋白质。
例如，可以通过该分析中245、5283、2490、3963或4036活性的降低或完全抑制，确定对植物245、5283、2490、3963或4036蛋白质的抑制性作用。该确定可以通过比较在有和无该候选抑制剂的情况下反应过程中用掉的底物或产生的中间物或产物的量来实现。
在一个实施方案中，将例如通过体外筛选鉴定的可疑除草剂，以不同浓度施用给植物。优选将该可疑除草剂喷洒在植物上。在施用了该可疑除草剂之后，记录其对植物产生的影响，例如死亡或生长抑制。
在另一个实施方案中，针对245、5283、2490、3963或4036活性之抑制剂的体内筛选方法，应用能够超量表达具有245、5283、2490、3963或4036活性的核苷酸序列的转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞，其中该245、5283、2490、3963或4036基因产物在该转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞中具有酶活性。该核苷酸序列优选来自真核生物，例如酵母，但优选来自植物。在一个更优选的实施方案中，该核苷酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9中所示核苷酸序列一致或基本相似，或编码具有245、5283、2490、3963或4036活性的酶，其氨基酸序列分别与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10中所示氨基酸序列一致或基本相似。在另一个优选实施方案中，该核苷酸序列来源于原核生物，优选细菌例如大肠杆菌。
然后将化学制品施用于该转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞以及等基因的非转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞，并在施用了该化学制品后确定和比较该转基因和非转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞的生长或生活力。选择能够抑制非转基因植物的生长，但又不影响转基因植物的生长的化合物，作为245、5283、2490、3963或4036活性的抑制剂。
本发明还指向耐受如下除草剂的植物、植物组织、植物种子和植物细胞，该除草剂抑制这些植物中天然存在的245、5283、2490、3963或4036活性，其中该耐受性分别由改变的245、5283、2490、3963或4036活性赋予。改变的245、5283、2490、3963或4036活性可以根据本发明通过增加除草剂敏感的野生型245、5283、2490、3963或4036基因的表达赋予植物，例如通过提供额外的野生型245、5283、2490、3963或4036基因，和/或通过例如用强启动子驱动表达的方式分别超量表达内源性245、5283、2490、3963或4036基因来进行。还可以通过分别在植物中表达与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9基本相似的核苷酸序列或它们的同系物来获得改变的245、5283、2490、3963或4036活性。更进一步地，可以通过在植物中分别表达修饰的除草剂耐受性245、5283、2490、3963或4036基因，赋予该植物改变的245、5283、2490、3963或4036活性。还可以应用这些技术的组合。代表性植物包括为了达到其通常预期的目的而应用这些除草剂的任何植物。优选农业经济上重要的农作物例如棉花、大豆、产油料种子的欧洲油菜、甜菜、玉米、稻、小米、大麦、燕麦、黑麦、高粱、小米、草皮、饲料草、草皮草等等。
通过增加表达分别实现改变的245活性或5283、2490、3963或4036活性，结果分别导致植物细胞中245活性或5283、2490、3963或4036活性的水平可以至少足以克服由如下施用量的除草剂造成的生长抑制，所述施用量为足以抑制对照植物的正常生长的量。表达的酶水平一般是天然表达量的至少2倍，优选至少5倍，更优选至少10倍。增加的表达可以是由于植物细胞中分别多拷贝的野生型245基因或5283、2490、3963或4036基因；在该基因中编码序列的多次出现(即基因扩增)，或内源性基因的非编码调节序列中的突变造成的。具有该改变的基因活性的植物可以通过本领域已知的方法在植物中直接筛选获得(见例如美国专利5,162,602和美国专利4,761,373，以及其中引用的参考文献)。这些植物还可以通过本领域已知的遗传工程技术获得。除草剂敏感性245基因或5283、2490、3963或4036基因表达的分别增加还可以通过用如下重组或嵌合DNA分子转化植物细胞来实现，所述DNA分子含有能够在植物细胞中驱动相连的结构基因表达的启动子，而且该启动子可操作地与分别编码245蛋白质或5283、2490、3963或4036蛋白质的同源或异源结构基因或它们的同系物相连。优选地，该转化是稳定的，籍此提供可遗传的转基因性状。
根据该实施方案，用如下重组DNA分子稳定转化植物、植物组织、植物种子或植物细胞，该DNA分子含有可操作地与分别编码除草剂耐受形式245、5283、2490、3963或4036蛋白质的编码序列连接的并能在植物中起作用的适合启动子。该酶的除草剂耐受形式具有至少一个氨基酸替代、添加或缺失，它们赋予了对抑制该酶未修饰天然存在形式的除草剂的耐受性。然后通过常规筛选技术筛选由此产生的转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞，籍此分离除草剂耐受株系，并对其进行表征和开发。以下描述了分别用于获得编码除草剂耐受形式245、5283、2490、3963或4036蛋白质的基因的方法：
一个一般的策略涉及对微生物的直接或间接的诱变过程。例如，可以使用诱变剂例如UV光，或者乙基或甲基甲磺酸，对可遗传操作的微生物例如大肠杆菌或酿酒酵母进行体内随机诱变。诱变程序描述于例如Miller，分子遗传学实验(Experiments in Molecular Genetics)，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1972)；Davis等，高级细菌遗传学(Advanced Bacterial Genetics)，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1980)；Sherman等，酵母遗传学方法(Methods in Yeast Genetics)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1983)；和美国专利4,975,374。选择用于诱变的微生物分别含有正常的抑制剂敏感性245、5283、2490、3963或4036基因，并依赖于该基因所赋予的活性。在存在对未修饰基因产生抑制的抑制剂浓度时，生长该诱变细胞。选择存在抑制剂时比未诱变的微生物生长更好的诱变微生物菌落(即表现出对该抑制剂的抗性)，用于进一步分析。通过克隆或通过PCR扩增，从这些菌落分离出分别赋予对该抑制剂的耐受性的245、5283、2490、3963或4036基因，并阐明它们的序列。然后将编码改变的基因产物的序列克隆回该微生物，以验证它们赋予抑制剂耐受性的能力。
获得植物245、5283、2490、3963或4036基因的突变除草剂耐受性等位基因的方法，涉及在植物中进行直接筛选。例如，可以通过将经本领域已知方法消毒的种子置于含有递增浓度抑制剂的简单极限盐培养基平板上，确定诱变的245、5283、2490、3963或4036基因对鼠耳芥属、大豆或玉米等植物生长抑制的影响。所述浓度的范围是百万分之0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、110、300、1000和3000(ppm)。能够重复检测到显著生长抑制的最低剂量被用于随后的实验中。该最低剂量的确定在本领域中是常规的。
利用植物材料的诱变增加在所选择的群体中抗性等位基因发生的频率。诱变的种子材料来自各种来源，包括化学或物理诱变的种子，或化学或物理诱变的花粉(Neuffer，用于生物研究的玉米(Maize forBiological Research)Sheridan编，Univ.Press，Grand Forks，ND.，第61-64页(1982))，然后用此花粉对植物受精，并收集获得的M1突变种子。典型地，对于鼠耳芥属，从经化学制品例如乙基甲磺酸或经物理因素例如γ射线或快中子诱变的种子生长出的植物获得后代种子，即M2种子(Lehie Seeds，Tucson，AZ)，将该种子以高达10,000个种子/平板(直径10cm)的密度接种在含有合适抑制剂浓度的极限盐培养基上，以对耐受性进行筛选。将接种后持续生长并保持绿色7-21天的幼苗移植到土壤中，并使其生长至成熟并结籽。测试这些种子的后代对于该除草剂的耐受性。如果该耐受性性状是显性的，其种子以3∶1/抗性：敏感性的比例分离的植物被认为在M2代是抗性杂合的。产生所有抗性种子的植物被认为在M2代是抗性纯合的。这种在完整种子上进行的诱变并对它们的M2代种子进行筛选还可以在其它物种例如大豆上进行(见例如美国专利5,084,082)。或者，可以通过用经化学或物理方法诱变的花粉进行受精，获得用于除草剂耐受性筛选的突变种子。
按以下举例说明的方法，验证该除草剂耐受性的遗传基础分别是245、5283、2490、3963或4036基因。首先，采用PCR，以及分别基于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9中所示鼠耳芥属cDNA编码序列的引物，更优选基于用来产生耐受性等位基因的植物的未改变245、5283、2490、3963或4036基因序列的引物，从表现出对该除草剂具有抗性的植物分别分离出该245、5283、2490、3963或4036基因的等位基因。在对这些等位基因测序以确定编码序列中是否存在突变之后，用这些推测的赋予耐受性的等位基因转化植物，并测试这些等位基因赋予该植物耐受此抑制剂的能力。这些植物可以是鼠耳芥属植物，或可以是其生长分别对245、5283、2490、3963或4036的抑制剂敏感的任何其它植物。其次，相对于已知的限制性片断长度多态性(RFLP)(见例如Chang等，美国国家科学院院刊85：6856-6860(1988)；Nam等，植物细胞(Plant Cell)1：699-705(1989))、断裂的扩增多态序列(CAPS)(Konieczny和Ausubel(1993)植物杂志(The Plant Jounal)，4(2)：403-410)、或SSLPs(Bell和Ecker(1994)基因组(Genomics)，19：137-144)，对插入的245、5283、2490、3963或4036基因进行作图。采用相同的标记独立地对该245、5283、2490、3963或4036抑制剂耐受性性状分别作图。若耐受性分别是由于245、5283、2490、3963或4036基因中的突变引起的，则该耐受性性状在图谱上的位置将难以与245、5283、2490、3963或4036基因的位置区分开来。
获得245、5283、2490、3963或4036基因的除草剂耐受性等位基因的另一种方法是在植物细胞培养物中进行筛选。将目的植物的植物组织例如胚、叶盘等的外植体，或活跃生长的愈伤组织或悬浮培养物，生长在含有递增浓度的抑制性除草剂或适用于实验室环境的类似抑制剂的培养基上。记录不同培养物的生长改变程度。在某些培养物中，出现出甚至在有正常抑制性浓度的抑制剂情况下也能持续生长的快速生长变异集落。这种较快的生长变异体的发生频率能够通过在将该组织或细胞暴露给抑制剂之前用化学或物理诱变剂进行处理来提高。按前面段落中描述的方法分别分离并检测该245、5283、2490、3963或4036基因的推测赋予耐受性的等位基因。然后可以改造那些被鉴定为赋予除草剂耐受性的等位基因，以获得最佳表达，并用其转化植物。或者，可以从含有这些等位基因的组织或细胞培养物再生植物。
再一个方法涉及在细菌或酵母中分别对野生型除草剂敏感植物的245、5283、2490、3963或4036基因进行诱变，之后在含有抑制性浓度(即足以造成异常生长、抑制生长或引起细胞死亡的浓度)的该抑制剂的培养基上培养该微生物，然后筛选在该抑制剂存在时正常生长的那些集落。更具体地，将植物cDNA，例如分别编码245、5283、2490、3963或4036蛋白质的鼠耳芥属cDNA，克隆至本来缺少该245、5283、2490、3963或4036活性的微生物中。然后通过本领域已知的几种化学或酶学方法之任意一种，例如亚硫酸氢钠(Shortle等，酶学方法(Methods Enzymol.)100：457-468(1983))；甲氧胺(Kadonaga等，核酸研究13：1733-1745(1985))；寡核苷酸指导的饱和诱变(Hutchinson等，美国国家科学院院刊83：710-714(1986))；或各种聚合酶错误掺入策略(见例如Shortle等，美国国家科学院院刊79：1588-1892(1982)；Shiraishi等，基因(Gene)64：313-319(1988)；和Leung等，技术(Technique)1：11-15(1989))，对该转化的微生物进行体内诱变或体外诱变。挑取在存在正常抑制性浓度的抑制剂时生长正常的菌落，并通过重复再次划线进行纯化。纯化它们的质粒，并通过将其重新转化至分别缺少245、5283、2490、3963或4036活性的微生物中，测试其赋予对该抑制剂的耐受性的能力。然后确定通过该测试的质粒的cDNA插入片断的DNA序列。
也可以采用涉及体外重组，又称DNA改组的方法，分别获得除草剂抗性245、5283、2490、3963或4036蛋白质。通过DNA改组，分别向编码245、5283、2490、3963或4036活性的核苷酸序列中引入突变，优选随机突变。DNA改组还导致分别在245、5283、2490、3963或4036基因内的序列重组和重排，或分别在两个或多个不同的245、5283、2490、3963或4036基因之间的序列重组或交换。这些方法使得可以分别产生无数的突变245、5283、2490、3963或4036编码序列。对这些突变基因或改组基因进行筛选，以鉴别期望的性质例如改良的除草剂耐受性，或鉴别提供对不同类型抑制剂化学的广谱耐受性的突变。这些筛选完全属于本领域的常规技术范围之内。
在一个优选的实施方案中，分别从至少一个245、5283、2490、3963或4036基因模板分别形成诱变的245、5283、2490、3963或4036基因，其中分别将该模板245、5283、2490、3963或4036基因断裂成具有期望大小的双链随机片断，并包含步骤：向所获得的该双链随机片断群体加入一或多个单链或双链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有与该双链随机片断一致的区域和异源的区域；将获得的该双链随机片断和寡核苷酸混合物变性为单链片断；在导致所述单链片断在所述的一致区域退火以形成退火片断对的条件下，将获得的该单链片断群体与聚合酶一起孵育，所述一致区域足以使一对中的一个成员引发另一个的复制，由此形成诱变的双链多核苷酸；再重复第二步和第三步至少两个循环，其中下一个循环第二步中的所获混合物包括来自前一个循环第三步的诱变双链多核苷酸，并且此下一个循环形成进一步诱变的双链多核苷酸，其中该诱变多核苷酸分别是对于分别抑制天然存在的245、5283、2490、3963或4036活性的除草剂具有增强耐受性的突变245、5283、2490、3963或4036基因。在一个优选实施方案中，该双链随机片断群体中单个种类双链随机片断的浓度不少于总DNA重量的1％。在又一优选实施方案中，该模板双链多核苷酸含有至少大约100种多核苷酸。在另一个优选实施方案中，该双链随机片断的大小从大约5bp至大约5kb。在又一优选实施方案中，该方法的第四个步骤包括重复该第二和第三个步骤至少10个循环。该方法描述于例如Stemmer等(1994)自然370：389-391，美国专利5,605,793，美国专利5,811,238，和Crameri等(1998)自然391：288-291，以及WO97/20078，这些文献以参考文献方式并入本文。
在另一个优选实施方案中，按例如Zhao等(1998)自然生物技术(Nature Biotechnology)16：258-261中描述的方法，通过交错延伸方法(StEP)，对两个或多个不同的245基因的任意组合进行体外诱变。此两或多个245基因用作PCR扩增的模板，PCR反应的延伸循环优选在比聚合酶的最佳聚合温度低的温度下进行。以相似的方式，对5283、2490、3963或4036基因进行StEP。例如，当采用具有大约72℃最佳温度的热稳定聚合酶时，该延伸反应的温度期望低于72℃，更期望低于65℃，优选低于60℃，更优选该延伸反应的温度为55℃。此外，该PCR循环的延伸反应持续时间期望比本领域通常所用的短，更期望是少于30秒，优选少于15秒，更优选该延伸反应的持续时间为5秒。在每一个延伸反应中仅聚合一个短的DNA片断，使得每一个循环的变性和退火之后可以在起始DNA分子之间交换作为延伸产物的模板，籍此在延伸产物中产生多样性。PCR反应中循环的最佳数目分别取决于待诱变的245、5283、2490、3963或4036基因的长度，但期望大于40个循环，更期望大于60个循环，优选采用80个以上的循环。对于245、5283、2490、3963或4036基因各自的每种组合，最佳延伸条件和最佳的PCR循环数可以按本领域熟知方法进行确定。该PCR反应的其它参数与本领域通常采用的基本相同。用于该扩增反应的引物优选设计为能与位于该245、5283、2490、3963或4036基因之外的DNA序列，例如与分别含有该245、5283、2490、3963或4036基因的载体的DNA序列退火，籍此分别用于该PCR反应的不同245、5283、2490、3963或4036基因优选包含在不同的载体中。这些引物期望与分别位于245、5283、2490、3963或4036序列之外不足500bp，优选不足200bp，更优选分别距离245、5283、2490、3963或4036序列不足120bp的序列退火。优选该245、5283、2490、3963或4036序列分别被限制性位点围绕，这些限制性位点包括在PCR反应期间扩增的DNA序列中，籍此利于该扩增产物克隆至适合的载体中。在另一个优选的实施方案中，按WO98/05765中所描述的方法，分别制备带有粘性末端的245、5283、2490、3963或4036基因片断。可以通过将分别相应于245、5283、2490、3963或4036基因一部分的第一寡核苷酸与第二寡核苷酸相连，来制备该粘性末端，其中该第二寡核苷酸是该基因中所不存在的，或是与第一寡核苷酸所相应的基因部分不相邻的该基因一部分，并且该第二寡核苷酸含有至少一个核糖核苷酸。采用第一寡核苷酸作为模板，第二寡核苷酸作为引物，制备双链DNA。切割该核糖核苷酸，并将其除去。还除去位于该核糖核苷酸5’端的核苷酸，结果获得具有粘性末端的双链片断。这些片断通过连接被随机地重新组装起来，获得新的基因序列组合。
在本发明中，采用任何单个的245、5283、2490、3963或4036基因，或245、5283、2490、3963或4036基因的任何组合用于体外重组，例如，分别获自植物例如鼠耳芥的245、5283、2490、3968或4036基因，例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9中分别显示的245、5283、2490、3963或4036基因，或分别来自大肠杆菌的245样、5283样、2490样、3963样或4036样基因(Craigen等(1985)美国国家科学院院刊82：3616-3620；Craigen和Caskey(1987)Biochimie，69：1031-1041；Ito等(1998)美国国家科学院院刊95：8165-8169；所有这些文献均以参考文献方式并入本文)。在本发明中采用了单个的完整245、5283、2490、3963或4036基因或其部分。将分别通过以上描述的方法获得的突变245、5283、2490、3963或4036基因文库克隆至适合的表达载体中，并用该所获得的载体转化适当宿主，例如衣藻(chlamydomonas)等藻类、酵母或细菌。适当的宿主优选本身缺少245、5283、2490、3963或4036活性的宿主，例如大肠杆菌。将分别用含有245、5283、2490、3963或4036基因文库的载体转化的宿主细胞培养在含有抑制性浓度之抑制剂的培养基上，并筛选在存在抑制剂时生长的那些菌落。挑取存在正常抑制性浓度的抑制剂时生长的菌落，并通过重复再划线进行纯化。纯化它们的质粒，然后测定通过该测试的质粒中cDNA插入片断的DNA序列。
可以采用与用于分别鉴定245、5283、2490、3963或4036活性之抑制剂的方法(抑制剂分析实验，见上)相同的方法，分别对耐受抑制剂的修饰245、5283、2490、3963或4036基因进行鉴定，改动如下：首先，在一个反应混合物中分别用突变的245、5283、2490、3963或4036蛋白质替代抑制剂分析实验中的野生型245、5283、2490、3963或4036蛋白质。其次，两个反应混合物中都存在野生型酶的抑制剂。第三点，比较突变活性(存在抑制剂和突变酶时的活性)和未突变活性(存在抑制剂和野生型酶时的活性)，以确定当与未突变活性比较时，在突变活性中是否观察到酶活性的显著增加。突变活性是存在适合的底物和该抑制剂时以任何方式测量的突变酶活性。未突变活性是存在适合底物和该抑制剂时以任何方式测量的野生型酶活性。
除了用于产生除草剂耐受性植物外，分别编码除草剂耐受性245、5283、2490、3963或4036蛋白质的基因还可以用作植物细胞转化方法中的筛选标记。例如，经异源DNA序列转化的植物、植物组织、植物种子或植物细胞也可以用分别编码改变的245、5283、2490、3963或4036活性并能够被植物表达的序列转化。将该转化细胞转移至含有该酶抑制剂的培养基上，该抑制剂的量将足以抑制不表达该修饰编码序列的植物细胞的生长或存活，其中仅有转化细胞可以生长。该方法可以应用于能够被修饰的245、5283、2490、3963或4036基因转化的任何植物细胞，而且可以和任何目的异源DNA序列一起使用。该异源DNA序列和该修饰基因的表达可以由同一个在植物细胞中起作用的启动子驱动，或由不同的启动子驱动。
可以采用常规重组DNA技术分别将245、5283、2490、3963或4036基因的野生型或除草剂耐受性形式，或它们的同系物掺入植物或细菌细胞中。一般地，这涉及到采用本领域已知的标准克隆程序分别将编码该245、5283、2490、3963或4036基因的DNA分子插入表达系统中，对于该表达系统该DNA分子是异源的(即正常并不存在的)。该载体含有使该插入蛋白质编码序列在含有该载体的宿主细胞中转录和翻译的必需元件。本领域已知的大量载体系统都可以使用，例如质粒、噬菌体病毒和其它修饰病毒。还可以对该表达系统的成分进行修饰以增加表达。例如，可以使用截短序列、核苷酸替代、核苷酸优化或其它的修饰。在适合条件下本领域已知的表达系统均可用于转化实际上任何农作物植物细胞。分别含有野生型或除草剂耐受型245、5283、2490、3963或4036基因的异源DNA优选稳定转化并整合至宿主细胞的基因组中。在另一个优选实施方案中，分别含有野生型或除草剂耐受型245、5283、2490、3963或4036基因的异源DNA序列位于自我复制载体上。自我复制载体的例子是病毒，尤其是双生病毒。转化细胞可以再生成全株，以致该选择形式的245、5283、2490、3963或4036基因在该转基因植物中赋予除草剂耐受性。
首先将期望在转基因植物中表达的基因序列组装在表达盒中，位于能够在植物中表达的适合启动子之后。该表达盒还可以含有对于该异源DNA序列的表达所要求或可选择的任何其它序列。这些序列包括但不限于转录终止子、增强表达的外来序列(例如内含子)、关键序列、和旨在使该基因产物靶向特定细胞器和细胞区室的序列。然后可以容易地将这些表达盒转移到下文描述的植物转化载体上。以下描述了典型表达盒的各种成分。
用于表达盒的启动子的选择将决定该异源DNA序列在该DNA序列转化的植物中的空间和时间表达模式。所选启动子将使异源DNA序列在特定的细胞类型(例如叶的表皮细胞、叶肉细胞、根的皮层细胞)中或在特定的组织或器官(例如根、叶或花)中表达，并且该选择将反映出基因产物积累的期望定位。或者，该选择的启动子可以驱动该基因在各种诱导条件下表达。启动子的强度即其启动转录的能力是不同的。根据所用的宿主细胞系统，可以使用本领域已知的许多适合启动子之任意一种。例如，对于组成型表达，可以采用CaMV 35S启动子、水稻肌动蛋白启动子或泛素启动子。对于可调节的表达，可以采用来自烟草或鼠耳芥属的可化学诱导的PR-1启动子(见例如美国专利5,689,044)。
可以获得多种转录终止子用于表达盒中。这些转录终止子负责在该异源DNA序列之外的转录终止以及该DNA序列的正确聚腺苷酸化。适合的转录终止子是那些已知在植物中起作用的转录终止子，包括CaMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合成酶终止子和豌豆rbcS E9终止子。这些既可用于单子叶植物又可用于双子叶植物。
已经发现有许多序列可以增强转录单位中的基因表达，可以将这些序列与本发明的基因联合使用以增强这些基因在转基因植物中的表达。例如，各种内含子序列例如玉米Adhl基因的内含子已表现出可以增强表达，尤其是单子叶细胞中的表达。此外，还知道许多来源于病毒的非翻译前导序列可以增强表达，并且这些序列在双子叶细胞中尤其有效。
任选地，为了在目的农作物种中获得最佳表达可以通过改变所选基因的编码序列，以遗传改造该编码序列。修饰编码序列以实现在特定农作物种中最佳表达的方法是熟知的(见例如Perlak等，美国国家科学院院刊88：3324(1991)；和Koziel等，Bio/technol.11：194(1993)；Fennoy和Bailey-Serres，核酸研究21：5294-5300(1993))。考虑到植物基因中以及高等植物、绿藻和蓝细菌中密码子的选择而修饰编码序列的方法是熟知的(见Murray等，核酸研究17：477-498(1989)中表4；Campbell和Gowri植物生理学(Plant Physiol.)92：1-11(1990))。
存在于植物中用于基因产物定向的各种机制是已知的，并且已经对控制这些机制发挥作用的序列有了较详细的特性分析。例如，基因产物导向叶绿体是由在多种蛋白质氨基末端发现的信号序列控制的，这些蛋白质在输入叶绿体的过程中被裂解形成成熟蛋白质(例如Comai等，生物化学杂志263：15104-15109(1998))。其它基因产物定位于其它细胞器例如线粒体和过氧化物酶体(例如Unger等，植物分子生物学(PlantMolec.Biol.)13：411-418(1989))。还可以对编码这些产物的cDNA进行操作，以实现由DNA序列编码的异源产物向这些细胞器的定向。此外，也已经对引起DNA序列所编码的产物导向其它细胞区室的序列进行了表征。氨基末端序列负责导向ER、质外体、以及从糊粉细胞向细胞外分泌(Koehler & Ho，植物细胞(Plant Cell)2：769-783(1990))。此外，氨基端序列联合羧基端序列负责基因产物的液泡定向(Shinshi等，植物分子生物学(Plant Molec.Biol.)14：357-368(1990))。通过将上述的适合靶向序列与目的异源DNA序列融合在一起，可能指导该产物到达任何细胞器或细胞区室。
可以用于植物转化的许多转化载体是植物转化领域的普通技术人员所已知的，并且可以将本发明有关的基因联合任何这样的载体一起使用。载体的选择将取决于用于转化的优选转化技术和靶物种。对于某些靶物种，可能优选不同的抗生素或除草剂选择标记。常规用于转化的选择标记包括赋予卡那霉素以及相关抗生素抗性的nptll基因(Messing &Vierra，基因(Gene)19：259-268(1982)；Bevan等，自然304：184-187(1983))、赋予除草剂膦丝菌素抗性的bar基因(White等，核酸研究18：1062(1990)；Spencer等，理论应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)79：625-631(1990))、赋予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)4：2929-2931)、以及赋予氨甲蝶呤抗性的dhfr基因(Bourouis等，EMBO J.2(7)：1099-1104(1983))、和赋予草甘膦抗性的EPSPS基因(美国专利4,940,935和5,188,642)。
对于采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的转化，有许多载体可用。这些载体典型地带有至少一个T-DNA边界序列，包括载体例如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))。适用于农杆菌转化的典型载体包括二元载体pCIB200和pCIB2001，以及二元载体pCIB10及其潮霉素选择衍生物(见例如美国专利5,639,949)。
不使用根癌农杆菌的转化避免了在所选转化载体中对于T-DNA序列的要求，从而除了以上描述的含有T-DNA序列的那些载体之外，还可以利用缺少这些序列的载体。不依赖农杆菌的转化技术包括通过微粒轰击、原生质体摄取(例如PEG和电穿孔)和显微注射进行的转化。载体的选择很大程度上取决于对于转化物种的优选筛选方法。适用于非农杆菌转化的典型载体包括pCIB3064、pSOG19和pSOG35。(见例如美国专利5,639,949)。
一旦目的编码序列被克隆到表达系统中，即可将其转化植物细胞。植物转化和再生的方法是本领域所熟知的。例如，Ti质粒载体以及直接DNA摄取、脂质体、电穿孔、显微注射和微粒轰击已经被用于递送外源DNA。此外，还可以利用来自农杆菌属的细菌转化植物细胞。
用于双子叶植物的转化技术是本领域所熟知的，包括基于农杆菌的技术和不需农杆菌的技术。非农杆菌技术包括原生质体或细胞直接摄取外源遗传物质。这可以通过PEG或电穿孔介导的摄取、微粒轰击介导的递送或显微注射来完成。在所有情况下可以采用本领域已知的标准技术将转化细胞再生成全株。
大多数单子叶植物物种的转化目前也已成为常规技术。优选的技术包括采用PEG或电穿孔技术直接将基因转移至原生质体中、微粒轰击导入愈伤组织、以及农杆菌介导的转化。
在另一个优选实施方案中，将编码具有粪卟啉原氧化酶活性的多肽的核苷酸序列直接转化至质体基因组中。通过同源重组将基因插入在每个植物细胞中存在的几千个拷贝的环状质体基因组中，这样与核表达基因相比该质体表达利用了巨大拷贝数的优势，从而使表达水平可以容易地超过可溶性总植物蛋白质的10％。在一个优选的实施方案中，将所述核苷酸序列插入质体靶向载体中，并转化至期望植物宿主的质体基因组中。从而获得对于含有该核苷酸序列的质体基因组而言同质的植物，并且该植物优选能够高效表达该核苷酸序列。
质体转化技术广泛描述于例如美国专利5,451,513、5,545,817、5,545,818和5,877,462，PCR申请WO95/16783和WO97/32977，以及McBride等(1994)美国国家科学院院刊91，7301-7305，所有这些文献均完整地以参考文献方式并入本文。用于质体转化的基本技术包括采用例如生物轰击(biolistics)或原生质体转化(如氯化钙或PEG介导的转化)，将位于选择标记两侧的克隆质体DNA区域和所述核苷酸序列导入适合的靶组织中。该1-1.5kb的侧翼区域，又称靶向序列，有利于和质体基因组的同源重组，并因此使得可以对质体基因组的特定区域进行置换或修饰。最初，赋予壮观霉素和/或链霉素抗性的叶绿体16S rRNA和rps12基因中的点突变被用作转化的选择标记(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.，和Maliga，P.(1990)美国国家科学院院刊87，8526-8530；Staub，J.M.和Maliga，P.(1992)植物细胞(Plant Cell)4，39-45)。在这些标记之间存在的克隆位点使得可以构建用于引入外源基因的质体靶向载体(Staub，J.M.和Maliga，P.(1993)EMBO J.12，601-606)。通过用显性选择标记置换掉该隐性rRNA或r蛋白质抗生素抗性基因，可以获得实质性增加的转化频率，所述显性选择标记是编码壮观霉素脱毒酶氨基糖苷-3’-腺苷转移酶的细菌aadA基因(Svab，Z.，和Maliga，P.(1993)美国国家科学院院刊90，913-917)。其它对于质体转化有用的选择标记是本领域已知的，并包括在本发明的范围内。
可以分别利用本发明野生型或改变形式的245、5283、2490、3963或4036基因，赋予多种植物细胞除草剂耐受性，这些植物细胞包括裸子植物、单子叶植物和双子叶植物的植物细胞。尽管可以将该基因插入属于该广泛类型的任何植物细胞中，但在农作物植物细胞中尤其有用，这些农作物例如水稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、马铃薯、胡萝卜、甘著、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、卷心菜、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、夏南瓜、黄瓜、苹果、梨、温柏、甜瓜、李子、樱桃、桃子、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、木瓜、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱、甘蔗。
可以将赋予植物除草剂耐受性的野生型245、5283、2490、3963或4036基因的分别高水平表达，和/或除草剂耐受形式的245、5283、2490、3963或4036基因的分别表达，联合其它重要的生产和质量特性，通过本领域已知的育种方法和技术掺入植物株系中。
通过在农作物植物或可以再生出农作物植物的植物细胞培养物中直接筛选，分别获得除草剂耐受性245、5283、2490、3963或4036等位基因之后，可以采用传统的育种技术将这些等位基因引入商业品种中，以开发除草剂耐受性农作物，而无需对该等位基因进行遗传操作和用其转化该植物。
通过参考以下详细实施例，对本发明作了进一步描述。除非另行指出，提供这些实施例的目的仅在举例说明，而非旨在限制。
                  实施例
此处所用标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的，描述于Sambrook等编，分子克隆(Molecular Cloning)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)；和T.J.Silhavy，M.L.Berman，和L.W.Enquist，基因融合实验(Experiments With GeneFusions)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)；和Ausubel，F.M.等，当代分子生物学实验指南，GreenePublishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)；Relter等，鼠耳芥属研究方法(Methods in Arabidopsis Research)，World ScientificPress(1992)；和Schultz等，植物分子生物学手册(Plant MolecularBiology Manual)，Kluwer Academic Publishers(1998)。这些文献描述了用于从T-DNA诱变的鼠耳芥属群体中标记和克隆基因；植物感染和转化；筛选以鉴定幼苗突变体；共分离分析；和质粒拯救的所有步骤的标准技术。
实施例1：来自T-DNA诱变鼠耳芥属群体的标记幼苗致死系#245的序列分析
采用质粒拯救技术分子克隆T-DNA诱变所产生的位于T-DNA插入片段一侧或两侧的鼠耳芥属基因组DNA。通过限制性酶消化分析以该方式获得的质粒，以便基于消化图谱对这些质粒进行分类。对于每一类质粒克隆，确定其DNA序列。分析所获序列是否存在非T-DNA载体序列。采用slp346for引物(SEQ ID NO：11)对通过质粒拯救方法回收的质粒进行测序。引物slp346for提供了紧邻T-DNA左边界的侧翼序列的信息。通过对来自245突变纯合子的基因组DNA的PCR，确证质粒拯救。该PCR实验采用一个锚定在预测的侧翼序列中的引物和slp346for引物(锚定在T-DNA插入片断内)。基于质粒拯救克隆的序列，找到具有期望大小的PCR产物，证实了有效拯救。将从引物slp346for获得序列用于核苷酸序列数据库的BLASTx检索(Altschul等(1990)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215：403-410；Altschul等(1997)核酸研究25：3389-3402)。该BLAST检索结果显示，该回收的植物侧翼序列表现出与许多原核生物的肽释放因子2蛋白质的高度相似性。该BLAST结果指出，该T-DNA插入发生在第一个鉴定的植物来源肽释放因子2的ORF中。通过采用聚合酶链式反应扩增鼠耳芥属的基因组DNA，分离包含肽释放因子序列相似性的DNA片段。将该片段用于探测λYES载体中的鼠耳芥属cDNA文库(Elledge等，(1991)美国国家科学院院刊88：1731-1735)。采用标准分子生物学技术分离阳性噬菌体克隆，并对其进行特性分析。从该噬菌体切下所获cDNA克隆，并确定其核苷酸序列。该DNA序列显示于SEQ IDNO：1。采用BLASTx搜索核苷酸序列数据库，分析推导的氨基酸序列(Altschul等(1990)分子生物学杂志215：403-410；Altschul等(1997)核酸研究25：3389-3402)。该BLAST的搜索结果显示，该回收的245 cDNA表现出与同一套原核生物的肽释放因子的序列相似性。
实施例2：来自T-DNA诱变鼠耳芥属群体的标记幼苗致死系#5283的序列分析
采用质粒拯救技术分子克隆T-DNA诱变所产生的位于T-DNA插入片段一侧或两侧的鼠耳芥属基因组DNA。通过限制性酶消化分析以该方式获得的质粒，以便基于消化图谱对这些质粒进行分类。对于每一类质粒克隆，确定其DNA序列。分析所获序列是否存在非T-DNA载体序列。采用slp346for引物(SEQ ID NO：11)对通过质粒拯救方法回收的质粒进行测序。引物slp346for提供了紧邻T-DNA左边界的侧翼系列的信息。通过对来自5283突变杂合子的基因组DNA的PCR，确证质粒拯救。该PCR实验采用一个锚定在预测的侧翼序列中的引物和slp348for引物(SEQ IDNO：15)(锚定在T-DNA插入片段内)。基于质粒拯救克隆的序列，找到具有期望大小的PCR产物，证实了有效拯救。
将从引物slp346for获得序列用于对核苷酸序列数据库进行BLASTn检索(Altschul等(1990)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215：403-410；Altschul等(1997)核酸研究25：3389-3402)。该BLAST检索结果显示，该回收序列与位于鼠耳芥属第1号染色体中的基因组DNA BACT13D8(Genbank索取号AC004473)一致。设计与BAC T13D8序列中#32，964-32，987位核苷酸反向互补的引物LW60(SEQ ID NO：16)(5’-aaacgcttaccatatctctttcta-3’)，并用于确定该T-DNA插入片段下游的序列；该实验鉴定了右边界的连接处。该T-DNA插入所发生的基因组DNA区域包括标注的BAC T13D8序列的#32,879至#32,885位碱基，结果导致一个6碱基缺失。该插入发生在BAC T13D8上注释为编码与酿酒酵母SIK1P蛋白质相似的蛋白质(Genbank索取号U20237)的序列上游90个核苷酸处。通过采用聚合酶链式反应扩增鼠耳芥属的基因组DNA，分离包含BAC T13D8序列#33,025位碱基至#34,338位碱基的DNA片段。将该片段用于探测IYES载体中的鼠耳芥属cDNA文库(Elledge等，(1991)美国国家科学院院刊88：1731-1735)。采用标准分子生物学技术分离阳性噬菌体克隆，并对其进行特性分析。从该噬菌体切下所获cDNA克隆，并确定其核苷酸序列。鉴定了一个全长克隆。采用tBLASTn检索核苷酸序列数据库，分析推导的氨基酸序列(Altschul等(1990)分子生物学杂志215：403-410；Altschul等(1997)核酸研究25：3389-3402)。该BLAST的检索结果显示，该回收的5283 cDNA序列来源于位于鼠耳芥属第1号染色体的相同基因组序列BAC T13D8。除了以下不同之外，该cDNA序列的内含子/外显子边界与就鼠耳芥属SIK1P同系物(Genbank索取号AC004473)所预测的相同。对于5283 cDNA起始密码子由#32975位碱基-#32977位碱基编码，之后紧接一个从#32978至#33199位碱基的内含子。
实施例3：来自T-DNA诱变鼠耳芥属群体的标记幼苗致死系#2490的序列分析
采用质粒拯救技术分子克隆T-DNA诱变所产生的位于T-DNA插入片段一侧或两侧的鼠耳芥属基因组DNA。通过限制性酶消化分析以该方式获得的质粒，以便基于消化图谱对这些质粒进行分类。对于每一类质粒克隆，确定其DNA序列。分析所获序列是否存在非T-DNA载体序列。采用SLP346for引物(5’GCG6ACATCTACATTTTTGA3’：SEQ ID NO：11)，对通过质粒拯救方法回收的质粒进行测序。引物SLP346for提供了紧邻T-DNA左边界的侧翼序列的信息。作为含有T-DNA左边界的质粒，回收该T-DNA插入片段两端的克隆。通过Southern印迹分析比较来自植物2490突变杂合子的基因组DNA和来自植物野生型2490基因纯合子的基因组DNA，验证质粒拯救。从使用SLP369(5’CAGACCA CAATACCTTCAAAAATA3’：SEQ IDNO：22)和SLP370(5’CCATTGTGTCTCCCTCC CGCTGTT3’：SEQ ID NO：23)引物产生的PCR产物，制备Southern印迹的探针。在该2490杂合子中找到另一个BamH1片段，验证了有效拯救。
将从以上克隆获得的序列用于对核苷酸序列数据库进行BLASTn检索(Altschul等(1990)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215：403-410；Altschul等(1997)核酸研究25：3389-3402)。该检索结果显示，该回收序列与鼠耳芥属第5号染色体P1克隆MTG13(Genbank # AB008270)中的基因组DNA一致。当将该插入事件发生处的基因组DNA区域用于Genbank EST数据库的BLASTn检索时，鉴定了来源于两个EST末端的4个序列：144K24(144K24 T7 Genbank # T76608和144K24XP Genbank #AA404903)和GBGF153(5’端Genbank#F15182和3’端Genbank#F15181)。确定了144K24 EST的完整序列，该序列编码2490基因的完整可读框(ORF)。该EST的BLAST分析指出，该2490蛋白质与欧洲油菜(Brassicanapus)Toc36蛋白质(Genbank # X79091；Ko等(1995)生物化学杂志270：28601-28608；Wu等(1994)生物化学杂志269：32264-32271；Pang等(1997)生物化学杂志272：25623-25627)有序列相似性。该Toc36蛋白质还被称作bce44B、Com44和Cim44。由于含有该2490 ORF的基因组DNA直到目前仍没有被正确地标释，所以本发明人第一个提供了该2490基因的正确ORF和序列相似性的实验资料。
实施例4：来自T-DNA诱变鼠耳芥属群体的标记幼苗致死系#3963的序列分析
采用质粒拯救技术分子克隆T-DNA诱变所产生的位于T-DNA插入片段一侧或两侧的鼠耳芥属基因组DNA。通过限制性酶消化分析以该方式获得的质粒，以便基于消化图谱对这些质粒进行分类。对于每一类质粒克隆，确定其DNA序列。分析所获序列是否存在非T-DNA载体序列。采用-21引物(5’TGTAAAACGACGGCCAGT 3’：SEQ ID NO：25)，对通过质粒拯救方法回收的质粒进行测序。引物-21提供了紧邻T-DNA右边界的侧翼序列的信息。通过从3963突变杂合子PCR扩增基因组DNA，验证质粒拯救。该PCR实验采用一个锚定在预测的侧翼序列中的引物和-21引物(锚定在该T-DNA插入片段中)。基于该质粒拯救克隆的序列，找到具有期望大小的PCR产物，证实了有效拯救。将从引物-21获得的序列用于对核苷酸序列数据库进行BLASTn检索(Altschul等(1990)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215：403-410；Altschul等(1997)核酸研究25：3389-3402)。该BLAST检索结果显示，该回收的植物侧翼序列与第5号染色体上P1克隆MDK4(Genbank索取号AB010695)中的基因组序列100％一致。该T-DNA插入片段发生在标注的P1克隆MDK4序列的#36342位碱基处，在鉴定为MDK4.6的基因中。该回收侧翼序列的tBLASTX分析显示出与酿酒酵母DNA修复蛋白质Mre11p(Genbank索取号U60829)的序列相似性。通过采用聚合酶链式反应扩增鼠耳芥属基因组DNA，分离编码该鼠耳芥属3963蛋白质部分的片段。该片段被用于探测λYES载体中的鼠耳芥属cDNA文库(Elledge等(1991)美国国家科学院院刊88：1731-1735)。采用标准分子生物学技术分离阳性噬菌体克隆，并对其进行特性分析。从该噬菌体切下所获cDNA克隆，并确定其核苷酸序列。鉴定了一个cDNA克隆。该cDNA序列显示于SEQ ID NO：7。采用BLASTx检索核苷酸序列数据库，分析推导的氨基酸序列(Altschul等(1990)，分子生物学杂志215：403-410；Altschul等(1997)核酸研究25：3389-3402)。该BLAST结果显示，该回收的3963 cDNA表现出与许多DNA修复蛋白质的序列相似性，这些蛋白质包括粟酒裂殖酵母的Rad32p(Genbank索取号Q09683)；人的hMrell(Genbank索取号U37359)；和酿酒酵母的Mrellp(Genbank索取号U60829)。由于含有该3963开发阅读框(ORF)的基因组DNA就外显子/内含子边界而言在现有技术中未有正确标注，所以本发明人第一个提供了3963基因正确ORF的实验资料。现有技术指出这些外显子/内含子边界：35662-35817、36015-36172、36315-36405、36528-36647、36728-36796、36865-36956、37045-37 147、37247-37354、37476-37538、37785-37862、38060-38122、38211-38271、38753-38835、38979-39092、39468-39766、39879-40002、40161-40370。相应于本文公开的部分cDNA的外显子/内含子边界是：位置不详的5’末端(第一个知道的碱基在第36147位)、36147-36172、36315-36405、36528-36647、36728-36796、36865-36956、37045-37147、37247-37354、37476-37538、37610-37681、37785-39092、39212-39290、39377-39445、39532-39776、39879-40002、40161-40363、40478-40508(终止子开始于40509)。
实施例5：来自T-DNA诱变鼠耳芥属群体的标记幼苗致死系#4036的序列分析
采用质粒拯救技术分子克隆T-DNA诱变所产生的位于T-DNA插入片段一侧或两侧的鼠耳芥属基因组DNA。通过限制性酶消化分析以该方式获得的质粒，以便基于消化图谱对这些质粒进行分类。对于每一类质粒克隆，确定其DNA序列。分析所获序列是否存在非T-DNA载体序列。采用slp346引物(5’GCGGACATCTACATTTTTGA3’：SEQ ID NO：11)，对通过质粒拯救方法回收的质粒进行测序。引物slp346提供了紧邻T-DNA左边界的侧翼序列的信息。通过PCR扩增来自4036插入突变杂合子的模板基因组DNA，验证质粒拯救。该实验采用一个锚定在预测的侧翼序列中的引物和slp328引物(5’ACCTTAGGCGACTTTTGAAC3’；SEQ ID NO：15；锚定在该T-DNA插入片段中)。基于该质粒拯救克隆的序列，找到具有期望大小的PCR产物，证实了有效拯救。
将从上述克隆获得的序列用于对核苷酸序列数据库进行BLASTn检索(Altschul等(1990)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215：403-410；Altschul等(1997)核酸研究25：3389-3402)。该BLAST检索结果显示，该植物侧翼序列与来自鼠耳芥属第5号染色体的P1 MQB2公开基因组序列(Genbank索取号AB003053)100％一致。该T-DNA插入发生在标注的P1克隆的#31,380位碱基处，并中断了鉴定为MQB2.6的基因。由该中断的可读框(ORF)编码的蛋白质表现出与许多生物的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶的相似性，这些生物包括集胞蓝细菌属(Synechocystis sp.)(SWISS-PROTQ55663)、枯草芽孢杆菌(SWISS-PROTO31753)和大肠杆菌(SWISS-PROT P45568)(Takahashi等(1998)美国国家科学院院刊95：9879-9884)。用Web GeneMark软件(Borodovsky，M.和Mcininch J.(1993)计算机和化学(Computers & Chemistry)17：123-133)，对含有该ORF的基因组区域进行重新标注。然后针对该预测ORF的5’和3’末端设计引物，并采用来自pFL61鼠耳芥属cDNA文库的DNA(Minet等(1992)植物杂志(Plant J.)2：417-422)作为模板进行PCR。TA连接和克隆所获PCR产物(Original TA克隆试剂盒，Invitrogen)，并对其进行测序。由于含有该4036 ORF的基因组DNA就外显子/内含子边界而言在现有技术中未有正确标注，所以本发明人第一个提供了4036基因的正确ORF的实验资料。现有技术指出这些外显子/内含子边界：33490..33356、31293..31207、30971..30846、30780..30718、30622..30473、30345..30288、30194..30083、29996..29892、29805..29684、29394..29248、29162..28997。在本发明的序列中，第31928位碱基标记为该cDNA起始密码子的第一个碱基，第28996位碱基标记为该cDNA终止密码子的第一个碱基。含有该起始密码子的外显子的3’末端是31836，而含有该终止密码子的外显子的5’末端是29161。本文公开的该cDNA的内部外显子/内含子边界是：31640..31448、31294..31202、30965..30843、30777..30722、30636..30473、30355..30287、30193..30082、29995..29891、29804..29684、29394..29247。
实施例6a在大肠杆菌中表达重组245蛋白质
将相应于cDNA克隆SEQ ID NO：1的蛋白质编码区亚克隆至前面所描述的表达载体中，并采用厂家的条件转化大肠杆菌。具体的实例包括质粒例如pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)、pFLAG(International Biotechnologies，Inc.，New Haven，CT)、和pTrcHis(Invitrogen，La Jolla，CA)。培养大肠杆菌，并验证245活性的表达。采用标准技术分离赋予245活性的蛋白质。
实施例6b在大肠杆菌中表达重组5283蛋白质
将相应于cDNA克隆SEQ ID NO：3的蛋白质编码区亚克隆至前面所描述的表达载体中，并采用厂家的条件转化大肠杆菌。具体的实例包括质粒例如pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)、pFLAG(International Biotechnologies，Inc.，New Haven，CT)、和pTrcHis(Invitrogen，La Jolla，CA)。培养大肠杆菌，并验证5283活性的表达。采用标准技术分离赋予5283活性的蛋白质。
实施例6c在大肠杆菌中表达重组2490蛋白质
将相应于cDNA克隆SEQ ID NO：5的蛋白质编码区亚克隆至前面所描述的表达载体中，并采用厂家的条件转化大肠杆菌。具体的实例包括质粒例如pBluescr ipt(Stratagene，La Jolla，CA)、pFLAG(International Biotechnologies，Inc.，New Haven，CT)、和pTrcHis(Invitrogen，La Jolla，CA)。培养大肠杆菌，并验证2490活性的表达。采用标准技术分离赋予2490活性的蛋白质。
实施例6d在大肠杆菌中表达重组3963蛋白质
将相应于cDNA克隆SEQ ID NO：7的蛋白质编码区亚克隆至前面所描述的表达载体中，并采用厂家的条件转化大肠杆菌。具体的实例包括质粒例如pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)、pFLAG(International Biotechnologies，Inc.，New Haven，CT)、和pTrcHis(Invitrogen，La Jolla，CA)。培养大肠杆菌，并验证3963活性的表达。采用标准技术分离赋予3963活性的蛋白质。
实施例6e在大肠杆菌中表达重组4036蛋白质
将相应于cDNA克隆SEQ ID NO：9的蛋白质编码区亚克隆至前面所描述的表达载体中，并采用厂家的条件转化大肠杆菌。具体的实例包括质粒例如pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)、pFLAG(International Biotechnologies，Inc.，New Haven，CT)、和pTrcHis(Invitrogen，La Jolla，CA)。培养大肠杆菌，并验证4036活性的表达。采用标准技术分离赋予4036活性的蛋白质。
实施例7：通过DNA改组体外重组245、5283、2490、3963或4036基因
通过PCR分别扩增SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：9的核苷酸序列。基本上按已描述的方法(Stemmer等(1994)PNAS 91：10747-10751)通过DNasel处理消化该所获得的DNA片段，并从该反应混合物中除去PCR引物。在没有引物的情况下进行PCR反应，之后在有引物的情况下进行PCR反应，两者均按已描述的方法进行(Stemmer等(1994)PNAS 91：10747-10751)。将所获得的DNA片段克隆至用于大肠杆菌的pTRC99a(Phamacia，产品号：27-5007-01)中，或克隆至用于酵母的pESC载体中(Stratagene产品目录)中；然后采用Biorad Gene Pulser以及厂家的条件，通过电穿孔转化分别缺少245、5283、2490、3963或4036活性的细菌或酵母株。将该转化细菌或酵母培养在含有抑制性浓度的245、5283、2490、3963或4036活性抑制剂的培养基上，选择存在该抑制剂时生长的菌落。挑取在有正常抑制性浓度的抑制剂时生长的菌落，并通过重复再划线进行纯化。纯化它们的质粒，然后确定通过该测试的质粒cDNA插入片段的DNA序列。
在相似的反应中，将分别含有鼠耳芥245、5283、2490、3963或4036基因、编码蛋白质的PCR扩增DNA片段，和分别含有来自大肠杆菌的245、5283、2490、3963或4036基因的PCR扩增DNA片段在体外重组，并按以上所述回收获得的对抑制剂具有提高的耐受性的变异体。
实施例8a：通过交错延伸方法体外重组245基因
将编码245蛋白质的鼠耳芥245基因和大肠杆菌245基因各克隆至pBluescript载体的多位点接头中。采用“反向引物”和“M13-20引物”(Stratagene产品目录)，基本按已描述的方法(Zhao等(1998)自然生物技术16：258-261)，进行PCR反应。用适合的限制性酶消化扩增的PCR片段，并将其克隆至pTRC99a中，按实施例7所描述的方法筛选突变的245基因。
实施例8b：通过交错延伸方法体外重组5283基因
将编码5283蛋白质的鼠耳芥5283基因和大肠杆菌5283基因各克隆至pBluescript载体的多位点接头中。采用“反向引物”和“M13-20引物”(Stratagene产品目录)，基本按已描述的方法(Zhao等(1998)自然生物技术16：258-261)，进行PCR反应。用适合的限制性酶消化扩增的PCR片段，并将其克隆至pTRC99a中，按实施例7所描述的方法筛选突变的5283基因。
实施例8c：通过交错延伸方法体外重组2490基因
将编码2490蛋白质的鼠耳芥2490基因和大肠杆菌2490基因各克隆至pBluescript载体的多位点接头中。采用“反向引物”和“M13-20引物”(Stratagene产品目录)，基本按已描述的方法(Zhao等(1998)自然生物技术16：258-261)，进行PCR反应。用适合的限制性酶消化扩增的PCR片段，并将其克隆至pTRC99a中，按实施例7所描述的方法筛选突变的2490基因。
实施例8d：通过交错延伸方法体外重组3963基因
将编码3963蛋白质的鼠耳芥3963基因和大肠杆菌3963基因各克隆至pBluescript载体的多位点接头中。采用“反向引物”和“M13-20引物”(Stratagene产品目录)，基本按已描述的方法(Zhao等(1998)自然生物技术16：258-261)，进行PCR反应。用适合的限制性酶消化扩增的PCR片段，并将其克隆至pTRC99a中，按实施例7所描述的方法筛选突变的3963基因。
实施例8e：通过交错延伸方法体外重组4036基因
将编码4036蛋白质的鼠耳芥4036基因和大肠杆菌4036基因各克隆至pBluescript载体的多位点接头中。采用“反向引物”和“M13-20引物”(Stratagene产品目录)，基本按已描述的方法(Zhao等(1998)自然生物技术16：258-261)，进行PCR反应。用适合的限制性酶消化扩增的PCR片段，并将其克隆至pTRC99a中，按实施例7所描述的方法筛选突变的4036基因。
实施例9：体外结合分析
例如分别根据实施例6a、6b、6c、6d或6e，获得重组245、5283、2490、3963或4036蛋白质。采用本领域熟知的技术，将该蛋白质固定在适于配体结合分析的芯片上。根据本领域所熟知的方法将固定在该芯片上的蛋白质暴露于溶液中的样品化合物。当该样品化合物与该固定的蛋白质接触后，实施能够检测到蛋白质-配体相互作用的测量方法。这些测量方法的例子有以上描述的SELDI、biacore和FCS。以这种方式可以容易地发现与该蛋白质结合的化合物，并对其作进一步的特性分析。
以上公开的实施方案是举例说明用的。本发明的公开将使本领域的技术人员拥有许多本发明的变化。所有这些明显和可预见的变化均包含在所附的权利要求之内。
序列表<110>Novartis AG<120>除草剂的靶基因和方法<130>组合的除草剂靶基因<140><141><160>29<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1119<212>DNA<213>鼠耳芥<220><221>CDS<222>(1)..(1119)<400> 1atg gat gac atg gac acc gtc tac aag caa ttg gga ttg ttt tca cta   48Met Asp Asp Met Asp Thr Val Tyr Lys Gln Leu Gly Leu Phe Ser Leu1               5                  10                  15aag aag aag att aaa gat gtt gtt ctt aag gct gag atg ttt gca ccg   96Lys Lys Lys Ile Lys Asp Val Val Leu Lys Ala Glu Met Phe Ala Pro
         20                  25                  30gat gct ctt gag ctt gaa gaa gag cag tgg ata aag caa gaa gaa aca   144Asp Ala Leu Glu Leu Glu Glu Glu Gln Trp Ile Lys Gln Glu Glu Thr
     35                  40                  45atg cgt tac ttt gat tta tgg gat gat ccc gct aaa tct gat gag att   192Met Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Asp Asp Pro Ala Lys Ser Asp Glu Ile
 50                  55                  60ctt ctc aaa tta gct gat cga gct aaa gca gtc gat tcc ctc aaa gac   240Leu Leu Lys Leu Ala Asp Arg Ala Lys Ala Val Asp Ser Leu Lys Asp65                  70                  75                  80ctc aaa tac aag gct gaa gaa gct aag ctg atc ata caa ttg ggt gag   288Leu Lys Tyr Lys Ala Glu Glu Ala Lys Leu Ile Ile Gln Leu Gly Glu
             85                  90                  95atg gat gct ata gat tac agt ctc ttt gag caa gcc tat gat tca tca   336Met Asp Ala Ile Asp Tyr Ser Leu Phe Glu Gln Ala Tyr Asp Ser Ser
        100                 105                 110ctc gat gta agt aga tcg ttg cat cac tat gag atg tct aag ctt ctt   384Leu Asp Val Ser Arg Ser Leu His His Tyr Glu Met Ser Lys Leu Leu
    115                 120                 125agg gat caa tat gac gct gaa ggc gct tgt atg att atc aaa tct gga   432Arg Asp Gln Tyr Asp Ala Glu Gly Ala Cys Met Ile Ile Lys Ser Gly
130                 135                 140tct cca ggc gca aaa tct cag ata tgg aca gag caa gtt gta agt atg   480Ser Pro Gly Ala Lys Ser Gln Ile Trp Thr Glu Gln Val Val Ser Met145                 150                 155                 160tat atc aaa tgg gca gaa agg cta ggc caa aac gcg cgg gtg gct gag   528Tyr Ile Lys Trp Ala Glu Arg Leu Gly Gln Asn Ala Arg Val Ala Glu
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    195                 200                 205gtg cac cgc ctt atc ata agt tcc act tct aat gag gaa tgt tca gcg   672Val His Arg Leu Ile Ile Ser Ser Thr Ser Asn Glu Glu Cys Ser Ala
210                 215                 220act gtt gat atc ata cca cta ttc ttg aga gca tct cct gat ttt gaa   720Thr Val Asp Ile Ile Pro Leu Phe Leu Arg Ala Ser Pro Asp Phe Glu225                 230                 235                 240gta aag gaa ggt gat ttg att gta tcg tat cct gca aaa gag gat cac   768Val Lys Glu Gly Asp Leu Ile Val Ser Tyr Pro Ala Lys Glu Asp His
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370<210>3<211>1458<212>DNA<213>鼠耳芥<220><221>CDS<222>(1)..(1458)<400> 3atg gca act ctt gaa gat tct ttc ctt gct gat ttg gac gag tta tct   48Met Ala Thr Leu Glu Asp Ser Phe Leu Ala Asp Leu Asp Glu Leu Ser1               5                  10                  15gac aat gaa gca gaa ttg gac gag aat gat ggt gat gtt gga aag gaa   96Asp Asn Glu Ala Glu Leu Asp Glu Asn Asp Gly Asp Val Gly Lys Glu
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     35                  40                  45gat gat ctc gat aat gtt tct aag ctg cag aag agt cag aga tat gct   192Asp Asp Leu Asp Asn Val Ser Lys Leu Gln Lys Ser Gln Arg Tyr Ala
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370                 375                 380gaa gag agc tcc ctc ggt gat gga cta gga gaa ggt tat gga atg ctt   1200Glu Glu Ser Ser Leu Gly Asp Gly Leu Gly Glu Gly Tyr Gly Met Leu385                 390                 395                 400ggc cag gca gga agc aac agg ctg cga gta tcc agt gtt ccg agc aag   1248Gly Gln Ala Gly Ser Asn Arg Leu Arg Val Ser Ser Val Pro Ser Lys
            405                 410                 415ctt aag att aat gct aag gtc gcc aaa aag ctt aaa gaa agg cag tat   1296Leu Lys Ile Asn Ala Lys Val Ala Lys Lys Leu Lys Glu Arg Gln Tyr
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    435                 440                 445cct gtg cag gga ata gag ttg tgc aat cct cag cag gct tta gga tta   1392Pro Val Gln Gly Ile Glu Leu Cys Asn Pro Gln Gln Ala Leu Gly Leu
450                 455                 460gga agt ggg act caa agc act tac ttc tca gag tca gga acc ttc tcg   1440Gly Ser Gly Thr Gln Ser Thr Tyr Phe Ser Glu Ser Gly Thr Phe Ser465                 470                 475                 480aag ctg aag aag atc taa                                           1458Lys Leu Lys Lys Ile
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130                 135                 140Ile Gly Asn Glu Thr Asp Leu Ala Leu Val Asp Leu Ala Asp Leu Leu145                 150                 155                 160Pro Ser Ala Ile Ile Met Val Val Ser Val Thr Ala Leu Thr Thr Lys
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        180                 185                 190Asp Arg Ala Leu Asp Leu Asp Ser Ala Arg Lys Lys Val Leu Glu Phe
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    355                 360                 365Val Thr Asp Met Arg Lys Leu Ala Asn Arg Met Ala Phe Gly Thr Pro
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            405                 410                 415gag aac cca atg aac atc atg aag tac caa aac gac aaa gag gta atg   1296Glu Asn Pro Met Asn Ile Met Lys Tyr Gln Asn Asp Lys Glu Val Met
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        180                 185                 190ttt cag acc cca cat gct gtc caa tgg atg agg cct gaa gtt caa gaa   624Phe Gln Thr Pro His Ala Val Gln Trp Met Arg Pro Glu Val Gln Glu
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210                 215                 220agg gtg aaa tca aac ccc aaa aat gca ata agt gag cac ttt ctt cca   720Arg Val Lys Ser Asn Pro Lys Asn Ala Ile Ser Glu His Phe Leu Pro225                 230                 235                 240cgt ttc ctc gac ttc att gtg tgg ggc cat gag cat gaa tgc cta atc   768Arg Phe Leu Asp Phe Ile Val Trp Gly His Glu His Glu Cys Leu Ile
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        260                 265                 270tct tct gtg gca aca tca ctt att gat ggg gaa tcg aag cca aaa cat   864Ser Ser Val Ala Thr Ser Leu Ile Asp Gly Glu Ser Lys Pro Lys His
    275                 280                 285gtt ctt ctc tta gaa atc aag gga aat caa tat cgt cct acg aag ata   912Val Leu Leu Leu Glu Ile Lys Gly Asn Gln Tyr Arg Pro Thr Lys Ile
290                 295                 300cct ttg aca tct gtg agg cct ttt gag tat aca gag att gtt tta aag   960Pro Leu Thr Ser Val Arg Pro Phe Glu Tyr Thr Glu Ile Val Leu Lys305                 310                 315                 320gat gaa agt gat att gat ccc aat gat caa aac tca att ctg gaa cac   1008Asp Glu Ser Asp Ile Asp Pro Asn Asp Gln Asn Ser Ile Leu Glu His
            325                 330                 335ttg gat aaa gtg gtc aga aat cta ata gag aaa gct agc aaa aaa gct   1056Leu Asp Lys Val Val Arg Asn Leu Ile Glu Lys Ala Ser Lys Lys Ala
        340                 345                 350gtt aac aga tca gag atc aaa ctc cca ttg gtt cga atc aag gta gat   1104Val Asn Arg Ser Glu Ile Lys Leu Pro Leu Val Arg Ile Lys Val Asp
    355                 360                 365tat tct gga ttt atg acg ata aat cct caa aga ttt gga cag aaa tat   1152Tyr Ser Gly Phe Met Thr Ile Asn Pro Gln Arg Phe Gly Gln Lys Tyr
370                 375                 380gtg gga aag gtt gca aat ccc cag gac att ttg ata ttt tcc aag gct   1200Val Gly Lys Val Ala Asn Pro Gln Asp Ile Leu Ile Phe Ser Lys Ala385                 390                 395                 400tct aag aag ggt cgg agc gaa gcc aac atc gat gat tct gag cgg ctt   1248Ser Lys Lys Gly Arg Ser Glu Ala Asn Ile Asp Asp Ser Glu Arg Leu
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130                 135                 140Leu Val Asn Tyr Phe Gly Lys Met Val Leu Gly Gly Ser Gly Val Gly145                 150                 155                 160Gln Ile Thr Leu Tyr Pro Ile Leu Met Lys Lys Gly Ser Thr Thr Val
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210                 215                 220Arg Val Lys Ser Asn Pro Lys Asn Ala Ile Ser Glu His Phe Leu Pro225                 230                 235                 240Arg Phe Leu Asp Phe Ile Val Trp Gly His Glu His Glu Cys Leu Ile
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290                 295                 300Pro Leu Thr Ser Val Arg Pro Phe Glu Tyr Thr Glu Ile Val Leu Lys305                 310                 315                 320Asp Glu Ser Asp Ile Asp Pro Asn Asp Gln Asn Ser Ile Leu Glu His
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370                 375                 380Val Gly Lys Val Ala Asn Pro Gln Asp Ile Leu Ile Phe Ser Lys Ala385                 390                 395                 400Ser Lys Lys Gly Arg Ser Glu Ala Asn Ile Asp Asp Ser Glu Arg Leu
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        580                 585                 590Ser Leu Gly Phe Arg Gln Ser Gln Arg Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser
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210                 215                 220att ctt ccg gca gat tca gaa cat tct gcc ata ttt cag tgt att caa   720Ile Leu Pro Ala Asp Ser Glu His Ser Ala Ile Phe Gln Cys Ile Gln225                 230                 235                 240ggt ttg cct gaa ggc gct ctg cgc aag ata atc ttg act gca tct ggt   768Gly Leu Pro Glu Gly Ala Leu Arg Lys Ile Ile Leu Thr Ala Ser Gly
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    275                 280                 285gtg gac tct gct acg ctt ttc aac aag ggt ctt gag gtc att gaa gcg   912Val Asp Ser Ala Thr Leu Phe Asn Lys Gly Leu Glu Val Ile Glu Ala
290                 295                 300cat tat ttg ttt gga gct gag tat gac gat ata gag att gtc att cat   960His Tyr Leu Phe Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Ile Glu Ile Val Ile His305                 310                 315                 320cct caa agt atc ata cat tcc atg att gaa aca cag gat tca tct gtg   1008Pro Gln Ser Ile Ile His Ser Met Ile Glu Thr Gln Asp Ser Ser Val
            325                 330                 335ctt gct caa ttg ggt tgg cct gat atg cgt tta ccg att ctc tac acc   1056Leu Ala Gln Leu Gly Trp Pro Asp Met Arg Leu Pro Ile Leu Tyr Thr
        340                 345                 350atg tca tgg ccc gat aga gtt cct tgt tct gaa gta act tgg cct aga   1104Met Ser Trp Pro Asp Arg Val Pro Cys Ser Glu Val Thr Trp Pro Arg
    355                 360                 365ctt gac ctt tgc aaa ctc ggt tca ttg act ttc aag aaa cca gac aat   1152Leu Asp Leu Cys Lys Leu Gly Ser Leu Thr Phe Lys Lys Pro Asp Asn
370                 375                 380gtg aaa tac cca tcc atg gat ctt gct tat gct gct gga cga gct gga   1200Val Lys Tyr Pro Ser Met Asp Leu Ala Tyr Ala Ala Gly Arg Ala Gly385                 390                 395                 400ggc aca atg act gga gtt ctc agc gcc gcc aat gag aaa gct gtt gaa   1248Gly Thr Met Thr Gly Val Leu Ser Ala Ala Asn Glu Lys Ala Val Glu
            405                 410                 415atg ttt att gat gaa aag ata agc tat ttg gat atc ttc aag gtt gtg   1296Met Phe Ile Asp Glu Lys Ile Ser Tyr Leu Asp Ile Phe Lys Val Val
        420                 425                 430gaa tta aca tgc gat aaa cat cga aac gag ttg gta aca tca ccg tct   1344Glu Leu Thr Cys Asp Lys His Arg Asn Glu Leu Val Thr Ser Pro Ser
    435                 440                 445ctt gaa gag att gtt cac tat gac ttg tgg gca cgt gaa tat gcc gcg   1392Leu Glu Glu Ile Val His Tyr Asp Leu Trp Ala Arg Glu Tyr Ala Ala
450                 455                 460gat gtg cag ctt tct tct ggt gct agg cca gtt cat gca tga     1434Asp Val Gln Leu Ser Ser Gly Ala Arg Pro Val His Ala465                 470                 475<210>10<211>477<212>PRT<213>鼠耳芥<400>10Met Met Thr Leu Asn Ser Leu Ser Pro Ala Glu Ser Lys Ala Ile Ser1               5                  10                  15Phe Leu Asp Thr Ser Arg Phe Asn Pro Ile Pro Lys Leu Ser Gly Gly
         20                  25                  30Phe Ser Leu Arg Arg Arg Asp Gln Gly Arg Gly Phe Gly Lys Gly Val
     35                  40                  45Lys Cys Ser Val Lys Val Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Ala Trp
 50                  55                  60Pro Gly Arg Ala Val Pro Glu Ala Pro Arg Gln Ser Trp Asp Gly Pro65                  70                  75                  80Lys Pro Ile Ser Ile Val Gly Ser Thr Gly Ser Ile Gly Thr Gln Thr
             85                  90                  95Leu Asp Ile Val Ala Glu Asn Pro Asp Lys Phe Arg Val Val Ala Leu
        100                 105                 110Ala Ala Gly Ser Asn Val Thr Leu Leu Ala Asp Gln Val Arg Arg Phe
    115                 120                 125Lys Pro Ala Leu Val Ala Val Arg Asn Glu Ser Leu Ile Asn Glu Leu
130                 135                 140Lys Glu Ala Leu Ala Asp Leu Asp Tyr Lys Pro Glu Ile Ile Pro Gly145                 150                 155                 160Glu Leu Gly Val Ile Glu Val Ala Arg His Pro Glu Ala Val Thr Val
            165                 170                 175Val Thr Gly Ile Val Gly Cys Ala Gly Leu Lys Pro Thr Val Ala Ala
        180                 185                 190Ile Glu Ala Gly Lys Asp Ile Ala Leu Ala ASn Lys Glu Thr Leu Ile
    195                 200                 205Ala Gly Gly Pro Phe Val Leu Pro Leu Ala ASn Lys His Asn Val Lys
210                 215                 220Ile Leu Pro Ala Asp Ser Glu His Ser Ala Ile Phe Gln Cys Ile Gln225                 230                 235                 240Gly Leu Pro Glu Gly Ala Leu Arg Lys Ile Ile Leu Thr Ala Ser Gly
            245                 250                 255Gly Ala Phe Arg Asp Trp Pro Val Glu Lys Leu Lys Glu Val Lys Val
        260                 265                 270Ala Asp Ala Leu Lys His Pro Asn Trp Asn Met Gly Lys Lys Ile Thr
    275                 280                 285Val Asp Ser Ala Thr Leu Phe ASn Lys Gly Leu Glu Val Ile Glu Ala
290                 295                 300His Tyr Leu Phe Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Ile Glu Ile Val Ile His305                 310                 315                 320Pro Gln Ser Ile Ile His Ser Met Ile Glu Thr Gln Asp Ser Ser Val
            325                 330                 335Leu Ala Gln Leu Gly Trp Pro Asp Met Arg Leu Pro Ile Leu Tyr Thr
        340                 345                 350Met Ser Trp Pro Asp Arg Val Pro Cys Ser Glu Val Thr Trp Pro Arg
    355                 360                 365Leu Asp Leu Cys Lys Leu Gly Ser Leu Thr Phe Lys Lys Pro Asp Asn
370                 375                 380Val Lys Tyr Pro Ser Met Asp Leu Ala Tyr Ala Ala Gly Arg Ala Gly385                 390                 395                 400Gly Thr Met Thr Gly Val Leu Ser Ala Ala Asn Glu Lys Ala Val Glu
            405                 410                 415Met Phe Ile Asp Glu Lys Ile Ser Tyr Leu Asp Ile Phe Lys Val Val
        420                 425                 430Glu Leu Thr Cys Asp Lys His Arg Asn Glu Leu Val Thr Ser Pro Ser
    435                 440                 445Leu Glu Glu Ile Val His Tyr Asp Leu Trp Ala Arg Glu Tyr Ala Ala
450             455                     460Asp Val Gln Leu Ser Ser Gly Ala Arg Pro Val His Ala465             470                     475<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：
 寡核苷酸<400>11gcggacatct acatttttga                                             20<210>12<211>1353<212>DNA<213>鼠耳芥<400> 12gctgggtaag tagatcgttg catcactatg agatgtctaa gcttcttagg gatcaatatg 60acgctgaagg cgcttgtatg attatcaaat ctggatctcc aggcgcaaaa tctcaggtca 120gtttcatcat tctcaaggca cttacagttt ccaactcttt gcttgtaact tagtttctgt 180ttgttcttaa acatattttg aggatttgca gatatggaca gagcaagttg taagtatgta 240tatcaaatgg gcagaaaggc taggccaaaa cgcgcgggtg gctgagaaat gtagtttatt 300gagtaataaa agtggcgtaa gttcagccac gatagagttt gaattcgagt ttgcttatgg 360ttatctctta ggtgagcgag gtgtgcaccg ccttatcata agttccactt ctaatgaggt 420atacattata agttataact ctctttctcg taactaatca ctttcgtgtc cattatcatg 480gcccgggaaa gaattaaaag aggttttctt tgcgccagga atgttcagcg actgttgata 540tcataccact attcttgaga gcatctcctg attttgaagt aaaggaaggt gatttgattg 600tatcgtatcc tgcaaaagag gatcacaaaa tagctgagaa tatggtttgt atccaccata 660ttccgagtgg agtaacacta caatcttcag gtattcttga gtgtgttgtt agttgttaca 720ctttggttta ctgcatttta tgcagattat ataacatgag gtttttgatg caggagaaag 780aaaccggttt gcaaacagga tcaaagctct aaaccggttg aaggcgaagc tacttgtgat 840agcaaaagag caaaaggttt cggatgtaaa taaaatcgac agcaagaaca ttttggaacc 900gcgggaagaa accaggagtt atgtctctaa gggtcacaag atggtggttg atagaaaaac 960cggtttagag attctggacc tgaaatcggt cttggatgga aacattggac cactccttgg 1020agctcatatt agcatgagaa gatcaattga tgcgatttag gcttaatcaa ttggtacttt 1080aattgctttt tgttttgtat ccaaaaagca acaaatggtt gcttgtgtgt gtatatatat 1140aaccttcttg tccagaacca tatatgattc taaccatcaa acaaagataa gaattggtga 1200ctatgtgcta tactctacaa tatcaccatg aatacttcaa actagacttt tgataaattt 1260tgaaacggtt attaccaata aaacgaaaac catgaaactc ttgttttaat tatcagattc 1320gagaaagttg tgtacaaaca tagctgagaa ggg                              1353<210>13<211>184<212>DNA<213>鼠耳芥<400>13gcttaatcaa ttggtacttt aattgctttt tggtttgtat cccaaaagca acaaatggkt 60gcttgtgtgt gtatatatat aaccttcttg gccagaacca tatatgawtc taaccattaa 120accaagatta gaattggtga ctaaaaaaaa agaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180aaaa                                                              184<210>14<211>2170<212>DNA<213>鼠耳芥<400>14atggtaagcg tttctttaac tctattttct tcattgtttc agttattggc gattgtattc 60tctgtttatt gtaatcgtat tgtgttaatt ttgatttgac tcatcttctc taaagttcaa 120tttcaaaatt agggattccg agatcataga tattgctttg tttccgagat ttgagttatt 180cttaagcttg ttttactaac tttcaatatg ttggatttgt tataggcaac tcttgaagat 240tctttccttg ctgatttgga cgagttatct gacaatgaag cagaattggt gagtgttaaa 300acacttttga ttactattat ctgtttactt ggaggagcta tgattgtaat tgtagtttgt 360ttgattatac atatgcagga cgagaatgat ggtgatgttg gaaaggaaga agaagatgtt 420gatatggata tggctgattt agagacactt aactatgatg atctcgataa tgtttctaag 480ctgcagaaga gtcagagata tgctgatatt atgcataaag tagaggaggc tcttgggaaa 540gattctgatg gagctgagaa aggaactgtc ttggaagatg atcctgagta taagcttatt 600gtggattgta atcagctttc ggtcgatatt gagaatgaaa tcgttattgt ccacaacttt 660atcaaagaca agtacaagct taagtttcaa gagcttgagt cgttggttca tcaccctatt 720gactatgcat gtgttgtgaa gaagattggg aatgagacgg atttggctct tgttgatctc 780gctgaccttc ttccttcagc tattatcatg gttgtttcag ttactgcttt aactacgaaa 840gggagtgcac tgccagagga tgttttgcaa aaggtgttag aggcttgtga tcgggcttta 900gatcttgatt ccgcaaggaa gaaggtcctt gagtttgttg aaagtaagat gggatctatt 960gcacctaatc tttctgctat tgttgggagt gctgttgcag ccaaactcat ggggactgct 1020ggaggtttgt cagcacttgc taaaatgcct gcgtgtaatg ttcaagttct tggccacaag 1080aggaagaacc ttgctgggtt ttcttctgca acgtctcagt cccgtgtggg ttatctggag 1140cagacagaga tttaccaaag cacgcctcct ggacttcagg ctcgcgctgg caggctcgtg 1200gctgcaaaat caactttggc agcaagagtt gatgctacta gaggggatcc gttagggata 1260agtggaaaag ctttcaggga ggagatccgt aagaagattg agaaatggca agaacctcct 1320cctgcaagac agcctaagcc acttcctgtt cctgattctg aaccgaagaa aagaaggggt 1380ggtcgccgtc taagaaaaat gaaagaaagg tagccttttt catcctactt tgtgtcctta 1440attactgtag attgagttct attcacctgt atttattttg ttgcattctt acgtttctct 1500ttaaatcagg tatcaagtaa cagatatgag gaagctggcc aacagaatgg cgtttggtac 1560acctgaagag agctccctcg gtaatatatc ttgtagttac acttgttaat ggccacttat 1620aaggcactta gtctaatatc tactcttcat gatgataggt gatggactag gagaaggtta 1680tggaatgctt ggccaggcag gaagcaacag gctgcgagta tccagtgttc cgagcaagct 1740taagattaat gctaaggtcg ccaaaaagta agtgttcctc tatttctcct gtgttttttc 1800ggatttatca tgttaatatt tttactctta caaattatcc tgccctgttc ttcttccatc 1860atatctcatt tgcgtcttta tatcaattac tttttcaggc ttaaagaaag gcagtatgcg 1920ggtggtgcga ctacctctgg tttgacatcg agcctggctt tcactcctgt gcaggtacaa 1980acatttcatt cgattcttga caaaagtttg atcctgtgtt ccatttgcat cactgtctga 2040ctccaattgg ttatctattt gacagggaat agagttgtgc aatcctcagc aggctttagg 2100attaggaagt gggactcaaa gcacttactt ctcagagtca ggaaccttct cgaagctgaa 2160gaagatctaa                                                        2170<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：
 寡核苷酸<400>15accttaggcg acttttgaac                                             20<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：
 寡核苷酸<400>16aaacgcttac catatctctt tcta                                        24<210>17<211>113<212>DNA<213>鼠耳芥<400>17aaacactagt cgctcgctgc tcttcaattt tcttctcgaa tctaatcgat tgatttctcc 60ttcgattctt caggagaatc actgaagctt ttgcctccca agtagaaaga gat        113<210>18<211>218<212>DNA<213>鼠耳芥<400>18aatatggaag acagagatnc aagtcttgaa aagccgagca ctaaaagtgt aaaaatgaac 60caaaggtgga aagaaactgc tttctctatc tcatgtctgt tttaaggttt cttcggtcac 120ttaagagaca aaaggcattg ttttgatcac tctttggaaa cgttttataa attttatttt 180tgtattagag ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa                         218<210>19<211>4140<212>DNA<213>鼠耳芥<400>19cagtacactt agctacactg gatccaagtc tagtgctaaa ctcaaacctc gtggttttag 60accaaaatct cttcttcttc gtttccttct tcctcatcat atctttcatc ttctccacca 120gaatttgttt taggctctcc ttcttctgtt tctttttctc ccaaagaaac aattagatat 180ggagaacctt accctagttt cttgctcagc ttcttctcca aagctgttaa ttggatgcaa 240tttcacttcc tcgctgaaaa accctactgg gttttctcgt cggactccta atattgtcct 300ccggtgttcc aaaatatctg cctctgctca atctcaatct ccctcttcgc gtccggagaa 360cactggagaa atcggttagt ttgcaaattc cactcgacac tctattatag caaatgccaa 420aattttccgg aaaaatttcc agtttattac ttttatctat cttattgaaa ctcaaattgc 480gaaccctttt cgactggttt aatatgagct tatgaattgc tatatctctt aaaaaaatcc 540acactttgtg aatttgcaat ttgaattctt gtagaaacca ttcattgtta gaattgttta 600ctttaagttt atgttcgatt tgcagtggtt gtgaaacaga gaagcaaagc ttttgcaagt 660atattttctt cgagtcgtga tcaacagaca acttctgttg cttcccctag tgtgcctgtg 720ccaccaccat cttcatcaac catgtaattt tcctggtttt ggacaatgtg cttagtttgt 780atgtcgtttg attcttggtt attaaattgt gttttttctt ttttcttgta gaggatcacc 840acttttctgg attggtgttg gtgttggtct atcagctttg ttctcatatg tgagtatcaa 900gattccttcc taattttttt ttcctctata aatattcttt cttgcttcaa tattgattaa 960taagtgcttg accttttttc ttttctgatg gcattgcagg taacttcaaa tttaaaggta 1020cagatacttg gccctctggt tttacgggac ttttgttctc tagtctgttg cagaaccacg 1080attttatgct tcatgtcaac tctagtgtat tgtgctcatg tatctgagat agttttattc 1140actaaactgg ttatcttaac aaggtgaact gtttgctcac acttgttgaa ccgtttatat 1200aagcatcgaa cttttgcctc tctttttttg ggtagtcact tgattcgtag atggtaacct 1260acataccatt atggttttag tgatgcaact caggtattca gacttatagt cattttcgca 1320actccagtat ttgattgaaa tatattatac aagttgtcat tgctttctct cattattctc 1380taaccggctg ttactctctt tggatttttt tttttgcttt ggtttagaaa tatgcaatgc 1440aaacagctat gaagacgatg atgaaccaaa tgaatacgca aaatagccag tttaataatt 1500ctggattccc atcaggatca ccttttccgt ttccatttcc tcctcaaaca agtcctgctt 1560cctcgccatt ccaatctcaa tcccagtctt caggtgctac cgttgatgtg acagcgacaa 1620aagtagagac acctccttca actaaaccga aacctacacc tgcaaaggat atagaggtgg 1680ataagccaag tgttgtctta gaggcaagca aagagaagaa agaagaaaag aactatggta 1740gattcttttt ctgtttcaga aatcaacgtc ttttcatttg tattctcaat tttgactttc 1800ttcctttctc attttccaag cttctaactt ggaagctgat ttacttttgg atgcagcctt 1860tgaagacatt tcacccgagg aaaccacaaa agaaagccca tttagcaact atgcagaagt 1920ctctgaaact aattccccca aagaaactcg cttgtttgag gatgtaagtt tcgttttctt 1980ttgtatttcc acagcacacc aagtggtgat ttaaaaacgt gacatagttt tgctaacctt 2040ctatgctctc ttattgatct ctgggtgaag gtcttgcaaa atggagctgg tccggcaaat 2100ggtgccactg cttcagaggt ttttcaatct ttgggtgagt tattgaattt cagttttcat 2160cactatcagc gcactgtgca tgattcatga ttaaggctac ggatttcaat tttattttat 2220agcatatgcc aacaattata aacaaaggaa gatatgaaat tggtgataaa gaggaatgag 2280ttggcttcaa aaggatctac tccgttactt ttgtccttct gctagtcgtt gatctgtatt 2340ggtataacca tataagactt gcaggatatt accttggcaa tctgtttcat atctcatgtg 2400ttatgattct tttttcttat atgctcacgt tattgtctct cttttcctta ttctaaattt 2460aaaactgaat cctgagtctg tctattgttt acacaggtgg tgggaaagga gggccgggtt 2520tatctgtaga agctttagag aaaatgatgg aagatccaac agtccagaag atggtttacc 2580cgtaactcat cttccctagc acattgtctt taaatgcatc cattaagttt atctttaaaa 2640ctggttgctt agtggacatt tggtaacatt gcatgtataa atgcagatac ttgcctgagg 2700agatgaggaa cccagaaact ttcaaatgta agtcttttaa tatttaatcc tgctatcatt 2760cttttattag tcctcatttt tacatatttc taaagactaa aggttacatg actagctttt 2820gaatgatgta attcgtttat aggttgatcc aatggttatc taaatttaaa atacagtttg 2880gtacttattg tctccgcttg gaattttgta gggatgctta aaaatcctca gtaccgtcaa 2940caactacagg acatgttgta agagctccat tttacgaaca atttagttgt ttccattgct 3000tttaagaatg tctaaactat gtaattaaga aatactcttg tttgtttctt ttcatgaatt 3060taggaataat atgagtggga gtggtgaatg ggacaagcga atgacagata cattgaagaa 3120ttttgacctg aatagtcctg aagtgaagca acaattcagt aagacaaatc tcagtttgta 3180ccaagttaat agtacgttaa ataggtctga tactcaatga ttgaatctgt atttgtcaga 3240tcaaatagga ctaactccag aagaagtcat atctaagatc atggagaacc ctgatgttgc 3300catggcattc cagaatccta gagtccaagc agcgttaatg gaagtacgtt ttcttttaac 3360ctgaataaga gaattgctta attttacccc acttctttct tcatacaaaa cagaaaccaa 3420ttacattctt gttgttgttg cagtgctcag agaacccaat gaacatcatg aagtaccaaa 3480acgacaaaga ggtaataata ctgccacttc tccattgccc aaaaaggcga ttactttttt 3540aagaaatttg aggttattat acattgattg caggtaatgg atgtgttcaa caagatatcg 3600cagctcttcc caggaatgac gggttgaaaa agctcacgtc tttggttcta tcaaaaatgt 3660cacattgtct ttagcttttt gtagggagaa aaaaatgttt ttttttttgc aaagagtctt 3720cagttttggt cagatcagag aattgtgtac catgttaatc ttaaacgcgg tcgggaattg 3780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 寡核苷酸<400>22cagaccacaa taccttcaaa aata                                        24<210>23<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：
 寡核苷酸<400>23ccattgtgtctccctcccgc tgtt                                         24<210>24<211>5077<212>DNA<213>鼠耳芥<400>24atgattgtaa aacttgacag ggaggatttt agtgatacac ttcgagtact tgttgcaact 60gattgccact tgggctacat ggagaaggat gaaattaggc ggcatgattc atttaaggct 120ttcgaagaga tatgttctat agctgaggag aaacaggtct ggtattcagt atctatccct 180tgccagtatt atcttgcgtt tgaatcatct aacatattat cttaaataaa aatcttctcc 240caatattatg agtagtaaac agtgttctac ctaattttaa caaaaattca accaattgcg 300aggaagaatt ctcagaaagt ttcatatctt cttttttcac tcttttgaaa caggtggact 360tcttactcct cggaggtgat ctttttcatg agaataaacc ctctagaact acgttagtta 420aagccattga aattcttcgt cgccactgtc tgaatgataa accagtgcag tttcaagtag 480tcagcgacca gacagtaaat tttcagaatg cgtgagactc tatcctttct gctattaatc 540taatcataac aggaaataat ttcaactgaa ctaattaatt ggcaaattgg ctcaaattcg 600tgtatagatc tacgtattct tattaatccc ttgacattat tttctggcta caggtttggt 660caagtcaatt acgaggatcc acacttcaat gtaggcttgc ccgtgttcag tattcatgga 720aaccatgatg atccagccgg agtggtacat cacttacatc tgcatgctct tgttatgcaa 780actcatttga ataggtatat agaactggat tagttagtga ataggtattt tattgtgttt 840ttgttctatg tctcttatgg ctacaggaca atctttctgc aattgatatt ctttccgcat 900gcaaccttgt gaactatttt ggaaagatgg ttcttggtgg ttctggtgtt ggccagatta 960ctctctaccc tatacttatg aagaaggttg gtgtaaagaa tttctaacct agacacctgg 1020ctccccctga cttcttggac tatcatttaa tcaaattaat gtttagggct caacaaccgt 1080ggctctctat ggtttaggaa acatcaggga tgaacgtctc aatagaatgt ttcaggtaat 1140ccagaggacc ctcacctttt gctatacaat tgttaattgt gttaatattt attggtttca 1200cagaccccac atgctgtcca atggatgagg cctgaagttc aagaaggatg tgatgtttct 1260gactggttca acattctggt gcttcatcaa aataggttga ttccattgct ataacatctt 1320ttagatcgtt ttcttactca ttctgtatca gaaaatttga tactgtattc atatgacttg 1380cagggtgaaa tcaaacccca aaaatgcaat aagtgagcac tttcttccac gtttcctcga 1440cttcattgtg tggggccatg agcatgaatg cctaatcgac ccccaggtcc atgaaaaatt 1500tgatttttgg agttattgca tttaaataag agtgagccac aatgttactt gcctctttga 1560gctaaaagct attaaacttt tgaaggaggt atctggaatg ggcttccaca tcacacaacc 1620aggatcttct gtggcaacat cacttattga tggggaatcg aagccaaaac atgttcttct 1680cttagaaatc aaggttcttc agcaaacaat ctgaaatttc atcttcactt tattcgtact 1740tcattttctg gtcttttttc ctccttttca atcaagcatg taagcttgag tgacttaaaa 1800tatatgactt acagggaaat caatatcgtc ctacgaagat acctttgaca tctgtgaggc 1860cttttgagta tacagaggta aagtttactt ttccttaata tgttatggtg gtggcagact 1920tctttgctta catattttca aagtgcagat tgttttaaag gatgaaagtg atattgatcc 1980caatgatcaa aactcaattc tggaacactt ggataaagtg gtacctattc cctcttctca 2040tagttcatgt ggatatcttt tctcctgccc tttttgaata accagtcact gaatgtctct 2100actaatatct acaaaattgt taggtcagaa atctaataga gaaagctagc aaaaaagctg 2160ttaacagatc agagatcaaa ctcccattgg ttcgaatcaa ggtaacttgt ttccaagttt 2220tcttcaaact gctgcaaatt ctagcaacac tcatataatt aaacctttat tttctaaccc 2280aactctagag gctaggcttt gccagtttga tgcatgcaca cccatagcca caaacagata 2340attgttatta agaatattaa atgactgaca aaagactaag atctgcttca tctttcaggt 2400agattattct ggatttatga cgataaatcc tcaaagattt ggacagaaat atgtgggaaa 2460ggtacctaga aattagttac tgtaacatga tggtcaccat acttctttga atgttggcta 2520actaatgaca aagtcccaaa cacttacagg ttgcaaatcc ccaggacatt ttgatatttt 2580ccaaggcttc taagaagggt cggagcgaag gtaagggcat tggtgtacta gtaatttata 2640caattttgtt tggattagat tgatgcacgt gcttttactc taacttgtaa tagcttatct 2700ggcaaaaatt acggttaagt agtgtatctg agatatagta atgtagaaca atatgggcct 2760atgataacct cctttgttgt tttattgtcg gtattataat tctcgtcata tatatcatga 2820ctactaactt tctgttgtgt ggagcttgat attgatgtat tgagtgttaa ttttctttct 2880gttccacttt tcttgttata gttcatgttt cttcgtgtgt aacctatagc atcaaaattt 2940tgcgaatctt atggattatc tctagttagt atatattgga aatttgccat tttgataatt 3000tttttgtcta gtgaattgaa tggcaatgat gcatgtcctg atggttgtcc agtgatccag 3060ttatgatata tttcaatctt ccatttcaca gccaacatcg atgattctga gcggcttcgt 3120ccagaagaac tgaaccagca gaatatagaa gctttagtag ctgaaagcaa cctggtacat 3180cctgcaacct tctttcctta tgattgtgtt attatcgtca acccctgtag aactttgcca 3240cagaatgata tagacttggg tagttaccaa atgggcatga gtacactatg ggatgatcat 3300tctattttct tccgcagaaa atggagatcc ttccagttaa cgatctggat gttgctcttc 3360acaattttgt gaacaaggat gataaactag ccttctactc atgcgttcag tacaatcttc 3420aagagactcg tgtatgtact attttttact tcaccattca atacaaagtt ctgcatagga 3480tattattttt atttcgtagc acgtccttgt tattgctttt atgatttatc tcttccctct 3540ttttgtacag ggtaaacttg caaaggattc agatgccaag aaatttgagg aagatgactt 3600gattcttaaa gtgggagagt gcttagaggc aagaagatat agattcagtt agttctgccg 3660cagattatga gaaccagcag aatattgatc tcacttgcat tattgttcgt gcaggaacgc 3720ttgaaagata ggtccactcg acccactggt tcctcacagt ttttatccac tggattgact 3780tcagaggttt aaattctctt ttttagattt tccttgcctc tgtccttccg ttggtttctc 3840acagtgctat tttctacctg agattggtac agaatttgac aaaaggaagc agtggcatcg 3900cgaatgcttc gttcagtgat gatgaagaca caactcagat gtctggttta gctcctccca 3960ctagaggacg aagaggttca tccactgcta atacaactcg tggtagagct aaagccccaa 4020ccagaggacg aggccgtggt aaggcctcaa gtgcgatgaa gcaaaccact cttgatagtt 4080ctcttggttt ccgccagtct caaaggtaac tttttgacag cacatttaac cagtttaggg 4140taggattcac ggacgtgcaa ggaaatgatt ggcatcacta gctagctaat gttatgtccc 4200taatttgtct ttcatagatc tgcttcggct gctgcttcag ctgccttcaa aagtgcttcc 4260accattggag aagatgatgt agattctcct tcaagcgaag aagtcgagcc tgaagatttt 4320aacaaacctg acagcagttc ggtatggact attccttaca ctgttattca tttgttcact 4380accataagaa agcccatgta aaaacttgac aacatataac ttttggcatt cttatttctc 4440tatttgaagt aaattttgcg tttttacttt tcctgattct tgtttgatat ccactaaagg 4500aggacgatga gagcactaaa ggcaaaggac gtaaaagacc agctactact aagagaggca 4560gaggtagagg ttctgggact tcaaaacgtg gtagaaaaaa cgaaagctct tcttcactta 4620ataggctact cagtagcaaa gacgatgacg aggacgaaga tgatgaagac agagaaaaga 4680agcttaacaa atctcagcct cgggtttgtt aatcacatct attttccctt ctttcgctgc 4740ttattagcag gttttagtaa gttgttgtta accatttgag atcaaagctc acttaatagt 4800acaatttgaa tatgcaggtt acaaggaact atggagctct aagaagataa atacatatca 4860aaccccaatc tctgacatca caacgaagct tcatttttct gttattttct agcgacctct 4920caagcggaac aacttctgaa gaagagaaat tagtactaac aagagttctg tgagatgatg 4980tacagagaat tttgtagtgt ttttttttct tgctcttttt aaggttacgt tgttgatgaa 5040tgaggcaata tgattaacgt cagtaagaag tctaaaa                          5077<210>25<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：
 寡核苷酸<400>25tgtaaaacga cggccagt                                               18<210>26<211>255<212>DNA<213>鼠耳芥<400>26atacatatca aaccccaatc tctgacatca caacgaagct tcatttttct gttattttct 60agcgacctct caagcggaac aacttctgaa gaagagaaat tagtactaac aagagttctg 120tgagatgatg tacagagaat tttgtagtgt ttttttttct tgctcttttt aaggttacgt 180tgttgatgaa tgaggcaata tgattaacgt cagtaagaag tctaaaaaaa aaaaaaaaaa 240aaaaaaaaaa aaaaa                                                  255<210>27<211>2935<212>DNA<213>鼠耳芥<400>27tcatgcatga actggcctag caccagaaga aagctgcaca ttcgcggcat attcacgtgc 60ccacaagtca tagtgaacaa tctcttcaag agacggtgat gttaccaact cgtttcgatg 120tttatcgcat gttaattcca caaccttgaa gatatccaaa tagcttatcc tgtaaacaaa 180agtgagaata taaacaattg tgattcgtat caagaacttc attgagatgc tcaaaactga 240aaaataattc ttacttttca tcaatgaaca tttcaacagc tttctcattg gcggcgctga 300gaactccagt cattgtgcct ccagctcgtc cagcagcata agcaagatcc atggatgggt 360atttcacatt gtctggtttc ttgaaagtca atgaaccgag tctgccaaaa tccacaattg 420taaacaactt ttggttttag gtgctgaatg ctgatagata aggcagtggt cctaacccag 450tttaactgat ccacaccaaa acagtagcaa aataaccaat tgcaaaacca aaccgaagac 540cgattcggtt tcatttttta tcttatctaa acaacctaaa accaaactga aaacaagatt 600ggggaacttt tcttggtgat aattaaaatt ttcaactaag cttagcttca cacttgataa 660acagagagta tataaatgtg gttagcttac ttgcaaaggt caagtcttgg ccaagttact 720tcagaacaag gaactctatc gggccatgac atggtgtaga gaatcggtaa acgcatatca 780ggccaaccca attgagcaag cacagatgaa tcctgtggaa caaaacaaat acatgttata 840cagttatttt tttaaaaccg gaaaaataat aatttagtta gtaatgtttc agcaagacct 900gtgtttcaat catggaatgt atgatacttt gcggatgaat gacaatctct atatcgtcat 960actcagctcc aaacaaataa tgcgcttcaa tgacctcaag accctgtttc aaaaaatcaa 1020gaactcatct accttgatca aaggtatttt caaaatcaga gtttaacctt aggagaaaat 1080aatcttaacc ttgttgaaaa gcgtagcaga gtccacagtg attttctttc ccatgttcca 1140gtttggatgc ttcaacgcat ccgctacttt aacttccttt agcttttcga caggccaatc 1200cctttttcaa aatccagtga aaagtttcca ttaaccaaac gagaattgag aagaaaaaaa 1260gtctatgcag agagagaaga atatcgaaac aaacctaaaa gctccaccag atgcagtcaa 1320gattatcttg cgcagagcgc cttcaggcaa accttgaata cactagagaa cataaaagaa 1380gatttttcac tcaaattgcc agaggttgaa cttgcattaa gaccaacgct gaactcaata 1440tgaaagttga ggtacttaat tctatgtgat ttgtgatacc tgaaatatgg cagaatgttc 1500tgaatctgcc ggaagaatct ttacattatg tttgttggca agcggaagca cgaaaggacc 1560acctgcgatt aatgtctctt tgtttgcaag agcaatgtcc tttcctgctt caattgcagc 1620aaccgtaggc tgcagtaaaa ataagcaaca agctttatca tctgcaactt tcttttttca 1680tatcctctta ataaggttta ataacaaaaa attagagtat atacctttag tcccgcacaa 1740cctactattc cggtaacaac ggttacagct tcaggatgtc gggcaacctg ttgatgaaca 1800taataagtaa aaacctatct acactacaat caaaactaac aaatgaacta acctcaatca 1860ctccttgctc tcctggaata atctcgagtt tatagtccaa atcagctaaa gcctctttaa 1920gctcattaat cagtgactcg tttctaacag caaccaatgc aggcttaaat ctccttacct 1980gccaccattc aaaatagaat cacagaacca tactatagag atttcttgag attgcagaag 2040caaaagccta aaccagaacc tgatttctct ggtttgatct gatacataac gagttaatac 2100tatcttgctt atgatactac cactgaactg agaattaaac tgaattccaa gtggtctgaa 2160tgacaaattg gagagactca atactaattt ttttacaaat gaagccaact tacctgatca 2220gcaagtagag taacattcga accagcagct agagccacaa ctctgaattt gtcaggattc 2280tcagccacaa tatccaatgt ctgcaaaatg gaagttcttg tcgataaaaa tgatgcaaca 2340ataactcagt aagaaaaaaa tatcattctt ctatgagtct agtcattcat aagacaaact 2400taaagtctgg tcatactcaa gaactgcaca ataatgcctt aatcgaaata aaacctgagt 2460gccaatagaa ccagtagatc caacgataga gatgggtttt ggtccatccc aagattgacg 2520aggcgcctca gggacagctc tcccaggcca tgctggagga ggttgttgtt gctgctgcac 2580tttcactgaa cacttaacac cttttccaaa acctctccct tgattcctcc tcctcaaact 2640aaacccacct gtgaaacact ccaaagatgt aaaatttaaa actctacgac ctaaagcaaa 2700ccaaaaaaaa tcgaattgaa gaaataacag attacctaga tagagaaatt cacaagagcc 2760taagacaact aatgaaagtt tgcaacttta atcgaaaaga gagttgacca aggaggagga 2820aagaagagag gaagaagaag aaacctgaga gtttagggat tggattgaac ctggaggtat 2880ccaagaaaga aatagctttg gattcagctg gagatagtga gtttaatgtc atcat      2935<210>28<211>1434<212>DNA<213>鼠耳芥<220><221>CDS<222>(1)..(1434)<400>28atg atg aca tta aac tca cta tct cca gct gaa tcc aaa gct att tct   48Met Met Thr Leu Asn Ser Leu Ser Pro Ala Glu Ser Lys Ala Ile Ser1               5                  10                  15ttc ttg gat acc tcc agg ttc aat cca atc cct aaa ctc tca ggt ggg   96Phe Leu Asp Thr Ser Arg Phe Asn Pro Ile Pro Lys Leu Ser Gly Gly
         20                  25                  30ttt agt ttg agg agg agg rat caa ggg aga ggt ttt gga aaa ggt gtt   144Phe Ser Leu Arg Arg Arg Xaa Gln Gly Arg Gly Phe Gly Lys Gly Val
     35                  40                  45aag tgt tca gtg aaa gtg cag cag caa caa caa cct cct cca gca tgg   192Lys Cys Ser Val Lys Val Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Ala Trp
 50                  55                  60cct ggg aga gct gty cct gag gcg cct cgt caa tct tgg gat gga cca   240Pro Gly Arg Ala Xaa Pro Glu Ala Pro Arg Gln Ser Trp Asp Gly Pro65                  70                  75                  80aaa ccc atc tct atc gtt gga tct act ggt tcy aty ggc act cag aca   288Lys Pro Ile Ser Ile Val Gly Ser Thr Gly Xaa Xaa Gly Thr Gln Thr
             85                  90                  95ttg gat att gtg gct gag aat cct gac aaa tty aga gtt gtg gct cta   336Leu Asp Ile Val Ala Glu Asn Pro Asp Lys Phe Arg Val Val Ala Leu
        100                 105                 110gct gct ggt tcg aat gtt act cta ctt gct gat cag gta agg aga ttt   384Ala Ala Gly Ser Asn Val Thr Leu Leu Ala Asp Gln Val Arg Arg Phe
    115                 120                 125aag cct gcr ttg gtt gct gtt aga aac gag tca ctg att aat gag ctt   432Lys Pro Xaa Leu Val Ala Val Arg Asn Glu Ser Leu Ile Asn Glu Leu
130                 135                 140aaa gag gct tta gct gat ttg gac tat aaa cyc gag att att cca gga   480Lys Glu Ala Leu Ala Asp Leu Asp Tyr Lys Xaa Glu Ile Ile Pro Gly145                 150                 155                 160gag cwa gga gtg att gag gtt gcc cga cat cct gaa gct gta acc gtt   528Glu Xaa Gly Val Ile Glu Val Ala Arg His Pro Glu Ala Val Thr Val
            165                 170                 175gtt acc gga ata gta ggt tgt gcg gga ctg mag cct acg gtt gct gca   576Val Thr Gly Ile Val Gly Cys Ala Gly Leu Xaa Pro Thr Val Ala Ala
        180                 185                 190att gaa gca gga aag gac att gct ctt gca aac aaa gag aca tta atc   624Ile Glu Ala Gly Lys Asp Ile Ala Leu Ala Asn Lys Glu Thr Leu Ile
    195                 200                 205gca ggt ggt cct ttc gtg ctt ccg ctt gcc aac aaa cat aat gta aag   672Ala Gly Gly Pro Phe Val Leu Pro Leu Ala Asn Lys His Ash Val Lys
210                 215                 220att ctt ccg gca gat tca gaa cat tct gcc ata ttt cag tgt att caa   720Ile Leu Pro Ala Asp Ser Glu His Ser Ala Ile Phe Gln Cys Ile Gln225                 230                 235                 240ggt ttg cct gaa ggc gct ctg cgc aag ata atc ttg act gca tct ggt   768Gly Leu Pro Glu Gly Ala Leu Arg Lys Ile Ile Leu Thr Ala Ser Gly
            245                 250                 255gga gct ttt agg gat tgg cct gtc gaa aag cta aag gaa gtt aaa gta   816Gly Ala Phe Arg Asp Trp Pro Val Glu Lys Leu Lys Glu Val Lys Val
        260                 265                 270gcg gat gcg ttg aag cat cca aac tgg aac atg gga aag aaa atc act   864Ala Asp Ala Leu Lys His Pro Asn Trp Asn Met Gly Lys Lys Ile Thr
    275                 280                 285gtg gac tct gct acg ctt ttc aac aag ggt ctt gag gtc att gaa gcg   912Val Asp Ser Ala Thr Leu Phe Asn Lys Gly Leu Glu Val Ile Glu Ala
290                 295                 300cat tat ttg ttt gga gct gag tat gac gat ata gag att gtc att cat   960His Tyr Leu Phe Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Ile Glu Ile Val Ile His305                 310                 315                 320cck caa agt atc ata cat tcc atg att gaa aca cag gat tca tct gtg   1008Xaa Gln Ser Ile Ile His Ser Met Ile Glu Thr Gln Asp Ser Ser Val
            325                 330                 335ctt gct caa ttg ggt tgg cct gat atg cgt tta ccg att ctc tac acc   1056Leu Ala Gln Leu Gly Trp Pro Asp Met Arg Leu Pro Ile Leu Tyr Thr
        340                 345                 350atg tca tgg ccc gat aga gtt cct tgt tct gaa gta act tgg ccw aga   1104Met Ser Trp Pro Asp Arg Val Pro Cys Ser Glu Val Thr Trp Xaa Arg
    355                 360                 365ctt gac ctt tgc aaa ctc ggt tca ttg act ttc aag aaa cca gac aat   1152Leu Asp Leu Cys Lys Leu Gly Ser Leu Thr Phe Lys Lys Pro Asp Asn
370                 375                 380gtg aaa tac cca tcc atg gat ctt gct tat gct gct gga cga gct gga   1200Val Lys Tyr Pro Ser Met Asp Leu Ala Tyr Ala Ala Gly Arg Ala Gly385                 390                 395                 400ggc aca atg act gga gtt ctc agc gcc gcc aat gag aaa gct gtt gaa   1248Gly Thr Met Thr Gly Val Leu Ser Ala Ala Asn Glu Lys Ala Val Glu
            405                 410                 415atg tty att gat gaa aag ata agc tat ttg gat atc ttc aag gtt gtg   1296Met Phe Ile Asp Glu Lys Ile Ser Tyr Leu Asp Ile Phe Lys Val Val
        420                 425                 430gaa tta aca tgc gat aaa cat cga aac gag ttg gta aca tca ccg tct   1344Glu Leu Thr Cys Asp Lys His Arg Asn Glu Leu Val Thr Ser Pro Ser
    435                 440                 445ctt gaa gag att gtt cac tat gac ttg tgg gca cgt gaa tat gcc gcg   1392Leu Glu Glu Ile Val His Tyr Asp Leu Trp Ala Arg Glu Tyr Ala Ala
450                 455                 460rat gtg cag ctt tct tct ggt gct agg cca gtt cat gca tga           1434Xaa Val Gln Leu Ser Ser Gly Ala Arg Pro Val His Ala465                 470                 475<210>29<211>477<212>PRT<213>鼠耳芥<400>29Met Met Thr Leu Asn Ser Leu Ser Pro Ala Glu Ser Lys Ala Ile Ser1               5                  10                  15Phe Leu Asp Thr Ser Arg Phe Asn Pro Ile Pro Lys Leu Ser Gly Gly
         20                  25                  30Phe Ser Leu Arg Arg Arg Xaa Gln Gly Arg Gly Phe Gly Lys Gly Val
     35                  40                  45Lys Cys Ser Val Lys Val Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Ala Trp
 50                  55                  60Pro Gly Arg Ala Xaa Pro Glu Ala Pro Arg Gln Ser Trp Asp Gly Pro65                  70                  75                  80Lys Pro Ile Ser Ile Val Gly Ser Thr Gly Xaa Xaa Gly Thr Gln Thr
             85                  90                  95Leu Asp Ile Val Ala Glu Asn Pro Asp Lys Phe Arg Val Val Ala Leu
        100                 105                 110Ala Ala Gly Ser Asn Val Thr Leu Leu Ala Asp Gln Val Arg Arg Phe
    115                 120                 125Lys Pro Xaa Leu Val Ala Val Arg Asn Glu Ser Leu Ile Asn Glu Leu
130                 135                 140Lys Glu Ala Leu Ala Asp Leu Asp Tyr Lys Xaa Glu Ile Ile Pro Gly145                 150                 155                 160Glu Xaa Gly Val Ile Glu Val Ala Arg His Pro Glu Ala Val Thr Val
            165                 170                 175Val Thr Gly Ile Val Gly Cys Ala Gly Leu Xaa Pro Thr Val Ala Ala
        180                 185                 190Ile Glu Ala Gly Lys Asp Ile Ala Leu Ala Asn Lys Glu Thr Leu Ile
    195                 200                 205Ala Gly Gly Pro Phe Val Leu Pro Leu Ala Asn Lys His Asn Val Lys
210                 215                 220Ile Leu Pro Ala Asp Ser Glu His Ser Ala Ile Phe Gln Cys Ile Gln225                 230                 235                 240Gly Leu Pro Glu Gly Ala Leu Arg Lys Ile Ile Leu Thr Ala Ser Gly
            245                 250                 255Gly Ala Phe Arg Asp Trp Pro Val Glu Lys Leu Lys glu Val Lys Val
        260                 265                 270Ala Asp Ala Leu Lys His Pro Asn Trp Asn Met Gly Lys Lys Ile Thr
    275                 280                 285Val Asp Ser Ala Thr Leu Phe Asn Lys Gly Leu Glu Val Ile Glu Ala
290                 295                 300His Tyr Leu Phe Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Ile Glu Ile Val Ile His305                 310                 315                 320Xaa Gln Ser Ile Ile His Ser Met Ile Glu Thr Gln Asp Ser Ser Val
            325                 330                 335Leu Ala Gln Leu Gly Trp Pro Asp Met Arg Leu Pro Ile Leu Tyr Thr
        340                 345                 350Met Ser Trp Pro Asp Arg Val Pro Cys Ser Glu Val Thr Trp Xaa Arg
    355                 360                 365Leu Asp Leu Cys Lys Leu Gly Ser Leu Thr Phe Lys Lys Pro Asp Asn
370                 375                 380Val Lys Tyr Pro Ser Met Asp Leu Ala Tyr Ala Ala Gly Arg Ala Gly385                 390                 395                 400Gly Thr Met Thr Gly Val Leu Ser Ala Ala Asn Glu Lys Ala Val Glu
            405                 410                 415Met Phe Ile Asp Glu Lys Ile Ser Tyr Leu Asp Ile Phe Lys Val Val
        420                 425                 430Glu Leu Thr Cys Asp Lys His Arg Asn Glu Leu Val Thr Ser Pro Ser
    435                 440                 445Leu Glu Glu Ile Val His Tyr Asp Leu Trp Ala Arg Glu Tyr Ala Ala
450                 455                 460Xaa Val Gln Leu Ser Ser Gly Ala Arg Pro Val His Ala465                 470                 475

Claims (46)

1.分离的DNA分子，其含有与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的任意一个序列基本相似的核苷酸序列。
2.权利要求1的DNA分子，其中该序列编码与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的任意一个序列基本相似的氨基酸序列。
3.权利要求1的DNA分子，其中该序列是选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的任意一个序列。
4.权利要求1的DNA分子，其中该序列编码选自SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的任意一个序列的氨基酸序列。
5.根据权利要求1的DNA分子，其中所述核苷酸序列是植物的核苷酸序列。
6.权利要求5的DNA分子，其中该植物是鼠耳芥。
7.权利要求1的DNA分子，其中该蛋白质具有选自245活性、5283活性、2490活性、3963活性和4036活性的任意一种活性。
8.氨基酸序列，其含有与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的任意一个序列基本相似的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
9.权利要求8的氨基酸序列，其含有由选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的任意一个序列编码的氨基酸序列。
10.氨基酸序列，其含有与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的任意一个序列基本相似的氨基酸序列。
11.权利要求10的氨基酸序列，其中该序列是选自SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的任意一个序列。
12.权利要求8的氨基酸序列，其中该蛋白质具有选自245、5283、2490、3963和4036活性的任意一种活性。
13.氨基酸序列，其含有由选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的任意一个序列所编码的氨基酸序列的至少20个连续氨基酸残基。
14.氨基酸序列，其含有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的至少20个连续氨基酸残基。
15.含有可操作地与根据权利要求1的DNA分子连接的启动子的表达盒。
16.含有根据权利要求15的表达盒的重组载体，其中所述载体能够被稳定地转化至宿主细胞中。
17.含有根据权利要求15的表达盒的宿主细胞，其中所述核苷酸序列能够在所述细胞中表达。
18.根据权利要求17的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
19.根据权利要求17的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自昆虫细胞、酵母细胞和植物细胞。
20.根据权利要求17的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
21.根据权利要求17的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
22.含有权利要求19的植物细胞的植物或种子。
23.权利要求22的植物，其中所述植物对选自245活性、5283活性、2490活性、3963活性和4036活性的任意一种活性的抑制剂具有耐受性。
24.制备编码具有改变活性的基因产物的核苷酸序列的方法，所述活性选自245活性、5283活性、2490活性、3963活性和4036活性，该方法包括
a)改组权利要求1的核苷酸序列，
b)表达获得的改组核苷酸序列，和
c)与选自所述未修饰核苷酸序列基因产物的245活性、5283活性、
  2490活性、3963活性和4036活性的活性比较，选择改变的选自
  245活性、5283活性、2490活性、3963活性和4036活性的活性。
25.权利要求24的方法，其中该核苷酸序列是选自SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的任意一个序列。
26.通过权利要求24的方法可以获得的改组DNA分子。
27.通过权利要求24的方法制备的改组DNA分子。
28.通过权利要求24的方法获得的改组DNA分子，其中所述改组DNA分子编码对选自245活性、5283活性、2490活性、3963活性和4036活性的任意一种活性的抑制剂具有增强耐受性的基因产物。
29.表达盒，其含有可操作地与根据权利要求26的核苷酸序列连接的启动子。
30.含有根据权利要求29的表达盒的重组载体，其中所述载体能够被稳定地转化至宿主细胞中。
31.含有根据权利要求29的表达盒的宿主细胞，其中所述核苷酸序列能够在所述细胞中表达。
32.根据权利要求31的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
33.根据权利要求31的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自昆虫细胞、酵母细胞和植物细胞。
34.根据权利要求31的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
35.根据权利要求31的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
36.含有权利要求33的植物细胞的植物或种子。
37.权利要求36的植物，其中所述植物对选自抑制245、5283、2490、3963和4036活性的抑制剂具有耐受性。
38.筛选与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：9的任意一个序列所编码的蛋白质相互作用的化合物的方法，包括：
a)表达含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID
  NO：7和SEQ ID NO：9的任意一个序列，或与选自SEQ ID NO：1、
  SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的任
  意一个序列基本相似的序列的DNA分子，以产生相应的蛋白质，
b)测试怀疑能够与步骤(a)中表达的蛋白质相互作用的化合物，和
c)选择在步骤(b)中与所述蛋白质相互作用的化合物。
39.鉴定选自245活性、5283活性、2490活性、3963活性和4036活性的任意一种活性的抑制剂的方法，包括：
a)将含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID
  NO：7和SEQ ID NO：9的任意一个序列的核苷酸序列并具有选自
  245活性、5283活性、2490活性、3963活性和4036活性的任
  意一种活性的DNA分子，或与之基本相似的核苷酸序列，或它
  们的同系物，导入植物细胞，以致所述序列能够以高于野生型
  表达水平的水平进行功能性表达，
b)在有利于抑制发生的条件下将所述植物细胞与待测试的化合物
  合并，以检测该化合物对选自245活性、5283活性、2490活性、
  3963活性和4036活性的任意一种活性的抑制能力，
c)在步骤b)的条件下测量植物细胞的生长，和
d)在相同条件下，比较所述植物细胞的生长和具有选自245活性、
  5283活性、2490活性、3963活性和4036活性的未改变活性的
  植物细胞的生长，和
e)选择在步骤d)中抑制植物细胞生长的所述化合物。
40.根据权利要求39的方法可鉴定的具有除草剂活性的化合物。
41.鉴定具有除草剂活性的化合物的方法，包括：
a)在有利于相互作用的条件下，使权利要求8的蛋白质与待测化合
  物混合，以测试该化合物与所述蛋白质相互作用的能力，
b)选择在步骤(a)中鉴定的能够与所述蛋白质相互作用的化合物。
c)给植物施用步骤(b)中鉴定的化合物，以测试其除草剂活性，和
d)选择具有除草剂活性的化合物。
42.根据权利要求41的方法可鉴定的具有除草剂活性的化合物。
43.抑制植物生长的方法，包括以足以抑制所述植物生长的量给所述植物施用抑制权利要求8的氨基酸序列的活性的化合物。
44.权利要求41的方法，其中该化合物是根据权利要求39的方法可鉴定的具有除草剂活性的化合物。
45.改良农作物的方法，包括给选自权利要求23的植物或种子和权利要求37的植物或种子的除草剂耐受性植物或种子，施用根据选自权利要求38的方法、权利要求39的方法和权利要求41的方法的方法可鉴定的具有除草剂活性的化合物，施用量为抑制不需要的植物的生长但不显著抑制该除草剂耐受性植物或种子的生长的量。
46.DNA分子，其含有与选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29的任意一个序列基本相似的核苷酸序列。
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