CN118922209A - 交联抗体 - Google Patents

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CN118922209A
CN118922209A CN202280092390.2A CN202280092390A CN118922209A CN 118922209 A CN118922209 A CN 118922209A CN 202280092390 A CN202280092390 A CN 202280092390A CN 118922209 A CN118922209 A CN 118922209A
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CN
China
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uaa
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unsubstituted
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赛尔吉奥·杜龙
詹森·罗兰
杰罗德·普塔钦
阿纳利亚·海特
刘君
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Enzraza Treatment Co
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Enzraza Treatment Co
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Abstract

本文提供了用缀合物将单域抗体交联至靶标的组合物和方法。本文进一步提供了包含靶向域的缀合物，其中靶向域包含非天然氨基酸。本文进一步提供了用交联单域抗体和多特异性抗体治疗疾病的方法。

Description

交联抗体
交叉引用
本申请要求于2021年12月22日提交的美国临时专利申请号63/293,025；于2022年5月27日提交的美国临时专利申请号63/346,799；和于2022年7月11日提交的美国临时专利申请号63/388,072的权益，其通过引用整体并入本文。
背景技术
蛋白质主要使用蛋白质内部或蛋白质之间的非共价相互作用，因为蛋白质的氨基酸侧链通常不能相互形成共价键，半胱氨酸除外，半胱氨酸会产生相对较弱的可逆的二硫键。因此，能够与靶蛋白上的多个天然氨基酸残基特异性反应的潜在生物活性非天然氨基酸(UAA)将扩大在体内可共价键合的蛋白质的多样性，这可以通过利用新的共价键来增强现有的蛋白质性质或演化新的功能。此外，蛋白质之间的共价键将允许在体内不可逆地捕获蛋白质-蛋白质相互作用，这可用于蛋白质鉴定、药物发现、不可逆拮抗剂和有效负荷递送。
发明内容
本文提供了包含靶向域和有效负荷的缀合物，其中靶向域包含至少一个非天然氨基酸(UAA)残基，其中靶向域被配置为结合至靶标，并且其中当靶向域结合时，UAA残基足够接近以与靶标形成共价键。本文进一步提供了其中有效负荷附接至相对于UAA残基处于位置n+x的氨基酸的缀合物，其中n为氨基酸的位置，并且x为至少1。本文进一步提供了其中有效负荷附接至相对于UAA残基处于位置n-x的氨基酸的缀合物，其中n为氨基酸的位置，并且x为至少1。本文进一步提供了其中当靶向域结合至靶标时UAA残基在靶标的5-20埃内的缀合物。本文进一步提供了其中靶向域结合至细胞表面分子的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基被配置为与靶标的组氨酸、赖氨酸或酪氨酸残基形成共价键的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基包含氟代硫酸酯部分的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基包含芳基氟代硫酸酯部分的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基包含式I：的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基的UAA具有结构：的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基的UAA具有结构：的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基包含式II：的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基的UAA具有结构：的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基的UAA具有结构：的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基包含式III：的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基的UAA具有结构：的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基的UAA具有结构：的缀合物。
本文进一步提供了其中UAA残基的UAA具有式(IA)的结构的缀合物：
其中，
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；
L为-(CH2)p-或-C(O)NH-(CH2)p-；p为1至6的整数；并且
其中当Y为-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
本文进一步提供了其中式(IA)的UAA具有式(IA-a)：的结构的缀合物。本文进一步提供了其中式(IA)的UAA具有式(IA-b)：的结构的缀合物。本文进一步提供了其中式(IA)的UAA具有式(IB)：的结构的缀合物。本文进一步提供了其中式(IA)的UAA具有式(IC)：的结构的缀合物。
本文进一步提供了其中式(IA)的UAA具有式(ID)：的结构的缀合物，
其中：
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
本文进一步提供了其中式(IA)的UAA具有式(IE)的结构的缀合物：
其中：
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
本文进一步提供了其中式(IA)的UAA具有式(IIA)的结构的缀合物：
其中：
X独立地为O或NR’；并且
当存在时，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。
本文进一步提供了其中式(IA)的UAA具有式(IIB)的结构的缀合物：
其中：
X独立地为O或NR’；并且
当存在时，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。
本文进一步提供了其中UAA残基的UAA具有式(IV)的结构的缀合物，
其中，
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
环A为5至6元芳基或杂芳基；
每个RA独立地为-OH、-ORX、卤素、NHRX、N(RX)2或任选取代的烷基；每个RX为任选取代的烷基；
L为-(CH2)p-或-C(O)NH-(CH2)p-；p为1至6的整数；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
本文进一步提供了其中有效负荷包括显像剂、放射性配体试剂或细胞毒性试剂的缀合物。本文进一步提供了其中细胞毒性部分包括小分子药物或化疗药物的缀合物。本文进一步提供了其中放射性配体试剂选自153Sm、177Lu、90Y、131I、149Tb、211At、212Pb/212Bi、213Bi、223Ra、225Ac和227Th的缀合物。本文进一步提供了其中放射性配体试剂进一步包括螯合剂的缀合物。本文进一步提供了其中放射性配体试剂选自99mTc、131I、201Tl、111In和67Ga的缀合物。本文进一步提供了缀合物，其中有效负荷用连接体附接至缀合物。本文进一步提供了其中连接体包括聚合物的缀合物。本文进一步提供了其中连接体为可切割或不可切割连接体的缀合物。本文进一步提供了其中连接体为0.01kDa至2.5kDa的缀合物。本文进一步提供了其中连接体为0.01kDa至2.5kDa的缀合物。本文进一步提供了其中连接体为线性、支链、多聚体或树枝状大分子的缀合物。本文进一步提供了其中连接体为双官能或多官能连接体或双官能或多官能聚合物的缀合物。本文进一步提供了其中连接体包括水溶性聚合物的缀合物。本文进一步提供了其中水溶性聚合物为聚乙二醇(PEG)的缀合物。本文进一步提供了其中PEG的分子量在0.1kDa和2.5kDa之间的缀合物。本文进一步提供了其中PEG包含1-8个单体的缀合物。本文进一步提供了其中靶向域包括抗体、抗体片段或抗原结合域的缀合物。本文进一步提供了其中靶向域包含抗原结合域的缀合物，缀合物包含CDR区，并且至少一个UAA残基在CDR区内或附近。本文进一步提供了其中UAA残基包含在CDR区内的缀合物。本文进一步提供了其中靶向域包含单域抗体(sdAb)的缀合物。本文进一步提供了其中细胞表面分子选自PSMA、EGFR、EGFRviii、MSLN、CEA、DLL3、FAP、CD33、HER3、PD-L1、EphA2、EphA4、HER2、SIRPa、DLK1、Muc16、LRP5、LRP6、endo180、LIV-1、SLAMF7、PTK7、GPR20、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3 rec、NaPi2b、CD16、GCC、SSTR2、CAIX、CAXII、MC1R、CXCR4、B1R、GRPR、STEAP1、CD70、CD46、CD166、CLL-1、ADAM9、cKIT、CD36、CD73、ITGaVb3、ITGaVb6、GPC-1、CD38、CD51、FGFR3、Ly6E、CD44v6、ENPP3、CXCR3、CXCR5、FcRH5、VEGF、VEGFR2、CD45、CCR4、CD25、5T4、ROR1、TROP-2、NECTIN4、cMET、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CD79b、AXL、RON、B7-H3、B7-H4、KAAG1、Muc1、ADAM-9、GPNMB、EDB纤连蛋白、组织因子、GPNMB、FolRa、ALPP、ALPPL2、MT1-MMP、CLDN18.2、CLDN6、CLDN9、p钙黏着蛋白、CEACAM6、CD47和EpCAM的缀合物。
本文还提供了包含(i)有效负荷和(ii)工程化单域抗体(sdAb)的缀合物，该工程化单域抗体包括具有CDR区和CDR区内或附近的至少一个非天然氨基酸(UAA)残基的sdAb，其中sdAb包含SEQ ID NO:1-4或16-64中的任何一个。本文进一步提供了其中UAA残基包含氟代硫酸酯部分的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基包含芳基氟代硫酸酯部分的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基包含式I：的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基的UAA具有结构：的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基的UAA具有结构：的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基包含式II：的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基的UAA具有结构：的缀合物。本文进一步提供了其中UAA具有结构：的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基包含式III：的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基的UAA具有结构：的缀合物。本文进一步提供了其中UAA残基的UAA具有结构：的缀合物。
本文进一步提供了其中UAA残基的UAA具有式(IA)的结构的缀合物：
其中，
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；
L为-(CH2)p-或-C(O)NH-(CH2)p-；p为1至6的整数；并且
其中当Y为-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
本文进一步提供了其中式(IA)的UAA具有式(IA-a)：的结构的缀合物。本文进一步提供了其中式(IA)的UAA具有式(IA-b)：的结构的缀合物。本文进一步提供了其中式(IA)的UAA具有式(IB)：的结构的缀合物。本文进一步提供了其中式(IA)的UAA具有式(IC)：的结构的缀合物。
本文进一步提供了其中式(IA)的UAA具有式(ID)：的结构的缀合物，
其中：
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
本文进一步提供了其中式(IA)的UAA具有式(IE)：的结构的缀合物：
其中：
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
本文进一步提供了工程化sdAb，其中式(IA)的UAA具有式(IIA)：的结构，
其中：
X独立地为O或NR’；并且
当存在时，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。
本文进一步提供了工程化sdAb，其中式(IA)的UAA具有式(IIB)：的结构，其中：
X独立地为O或NR’；并且
当存在时，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。
本文进一步提供了其中UAA残基的UAA具有式(IV)的结构的缀合物，
其中，
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
环A为5至6元芳基或杂芳基；
每个RA独立地为-OH、-ORX、卤素、NHRX、N(RX)2或任选取代的烷基；每个RX为任选取代的烷基；
L为-(CH2)p-或-C(O)NH-(CH2)p-；p为1至6的整数；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
本文进一步提供了缀合物，其中工程化sdAb包含SEQ ID NO:1，并且其中UAA残基包含在SEQ ID NO:5、6和7中的任何一个中。本文进一步提供了缀合物，其中UAA残基相对于SEQ ID NO:1存在于选自26、28、29、30、99、102、103、105、108、110、111、112、113、114和115的氨基酸位置。本文进一步提供了缀合物，其中工程化sdAb包含SEQ ID NO:2，并且其中UAA残基包含在SEQ ID NO:8、9和10中的任何一个中。本文进一步提供了缀合物，其中UAA残基相对于SEQ ID NO:2存在于选自50、52、53、54、56、58和100的氨基酸位置。本文进一步提供了缀合物，其中工程化sdAb包含SEQ ID NO:3，并且其中UAA残基包含在SEQ ID NO:11、12和13中的任何一个中。本文进一步提供了缀合物，其中UAA残基相对于SEQ ID NO:3存在于选自58、62、101、103和107的氨基酸位置。本文进一步提供了缀合物，其中工程化sdAb包含SEQID NO:16，并且其中UAA相对于SEQ ID NO:16存在于109的氨基酸位置。本文进一步提供了缀合物，其中工程化sdAb包含SEQ ID NO:23，并且其中UAA相对于SEQ ID NO:23存在于选自52、53、54、55、56、58、60、62和64的氨基酸位置。本文进一步提供了缀合物，其中工程化sdAb包含SEQ ID NO:24，并且其中UAA相对于SEQ ID NO:24存在于选自53、55、56、57、58、60、64和67的氨基酸位置。
本文进一步提供了其中有效负荷不经由UAA残基侧链连接的缀合物。本文进一步提供了其中有效负荷包括显像剂、放射性配体试剂或细胞毒性试剂的缀合物。本文进一步提供了其中细胞毒性部分包括小分子药物或化疗药物的缀合物。本文进一步提供了其中放射性配体试剂选自153Sm、177Lu、90Y、131I、149Tb、211At、212Pb/212Bi、213Bi、223Ra、225Ac和227Th的缀合物。本文进一步提供了其中放射性配体试剂进一步包括螯合剂的缀合物。本文进一步提供了其中显像剂包括荧光团或选自99mTc、131I、201Tl、111In和67Ga的放射性配体试剂的缀合物。
本文提供了包括施用本文所述的缀合物的方法，其中缀合物共价地结合细胞的表面上的靶标。本文进一步提供了其中细胞包括肿瘤细胞的方法。本文进一步提供了其中缀合物杀死肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞生长的方法。本文进一步提供了其中靶标选自PSMA、EGFR、EGFRviii、MSLN、CEA、DLL3、FAP、CD33、HER3、PD-L1、EphA2、EphA4、HER2、SIRPa、DLK1、Muc16、LRP5、LRP6、endo180、LIV-1、SLAMF7、PTK7、GPR20、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3 rec、NaPi2b、CD16、GCC、SSTR2、CAIX、CAXII、MC1R、CXCR4、B1R、GRPR、STEAP1、CD70、CD46、CD166、CLL-1、ADAM9、cKIT、CD36、CD73、ITGaVb3、ITGaVb6、GPC-1、CD38、CD51、FGFR3、Ly6E、CD44v6、ENPP3、CXCR3、CXCR5、FcRH5、VEGF、VEGFR2、CD45、CCR4、CD25、5T4、ROR1、TROP-2、NECTIN4、cMET、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CD79b、AXL、RON、B7-H3、B7-H4、KAAG1、Muc1、ADAM-9、GPNMB、EDB纤连蛋白、组织因子、GPNMB、FolRa、ALPP、ALPPL2、MT1-MMP、CLDN18.2、CLDN6、CLDN9、p钙黏着蛋白、CEACAM6、CD47和EpCAM的方法。本文提供了治疗疾病或病况的方法，包括施用本文所述的缀合物。本文进一步提供了其中疾病包括PCa(前列腺癌)、CRPCa(去势抵抗性前列腺癌)、实体瘤(新血管系统)、NSCLC(非小细胞肺癌)、HNSCC(头颈部鳞状细胞癌)、ESCC(食管癌)、GC(胃癌)、CRC(结直肠癌)、SCLC(小细胞肺癌)、MPM(间皮瘤)、PDAC(导管胰腺腺癌)、ALL(急性成淋巴细胞性白血病)、AML(急性髓系白血病)、MDS(骨髓增生异常综合征)、MSI-高肿瘤、黑色素瘤、DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、BrCa(乳腺癌)、TNBC(三阴性乳腺癌)、NE-PCa(神经内分泌前列腺癌)、GBM(胶质母细胞瘤)和RCC(肾细胞癌)中的一种或多种的方法。
本文提供了制造本文所述的缀合物的方法，包括：生成包含至少一个非天然氨基酸的靶向域；和任选地经由连接体将靶向域缀合到有效负荷。本文进一步提供了其中在体内合成包含至少一个非天然氨基酸的靶向域的方法。本文进一步提供了其中生成包括使用正交tRNA合成酶/抑制型tRNA对的方法。本文进一步提供了其中生成包括正交tRNA合成酶/抑制型tRNA对(衍生自吡咯赖氨酸tRNA合成酶/tRNAPyl)的方法。本文进一步提供了其中正交tRNA合成酶包含SEQ ID NO:84、87、92或其变体的方法。
本文提供了将细胞毒性有效负荷递送至细胞的方法，包括施用本文所述的缀合物，其中缀合物共价地结合细胞的表面上的靶标，从而递送细胞毒性有效负荷。本文进一步提供了其中细胞为肿瘤细胞的方法。本文进一步提供了其中细胞包含在肿瘤微环境中的方法。本文进一步提供了将细胞包含在哺乳动物对象内的方法。本文进一步提供了将细胞包含在人类对象内的方法。本文进一步提供了其中缀合物杀死肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞生长的方法。本文进一步提供了其中靶标选自PSMA、EGFR、EGFRviii、MSLN、CEA、DLL3、FAP、CD33、HER3、PD-L1、EphA2、EphA4、HER2、SIRPa、DLK1、Muc16、LRP5、LRP6、endo180、LIV-1、SLAMF7、PTK7、GPR20、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3 rec、NaPi2b、CD16、GCC、SSTR2、CAIX、CAXII、MC1R、CXCR4、B1R、GRPR、STEAP1、CD70、CD46、CD166、CLL-1、ADAM9、cKIT、CD36、CD73、ITGaVb3、ITGaVb6、GPC-1、CD38、CD51、FGFR3、Ly6E、CD44v6、ENPP3、CXCR3、CXCR5、FcRH5、VEGF、VEGFR2、CD45、CCR4、CD25、5T4、ROR1、TROP-2、NECTIN4、cMET、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CD79b、AXL、RON、B7-H3、B7-H4、KAAG1、Muc1、ADAM-9、GPNMB、EDB纤连蛋白、组织因子、GPNMB、FolRa、ALPP、ALPPL2、MT1-MMP、CLDN18.2、CLDN6、CLDN9、p钙黏着蛋白、CEACAM6、CD47和EpCAM的方法。本文进一步提供了其中人类对象患有或被诊断患有选自PCa(前列腺癌)、CRPCa(去势抵抗性前列腺癌)、实体瘤(新血管系统)、NSCLC(非小细胞肺癌)、HNSCC(头颈部鳞状细胞癌)、ESCC(食管癌)、GC(胃癌)、CRC(结直肠癌)、SCLC(小细胞肺癌)、MPM(间皮瘤)、PDAC(导管胰腺腺癌)、ALL(急性成淋巴细胞性白血病)、AML(急性髓系白血病)、MDS(骨髓增生异常综合征)、MSI-高肿瘤、黑色素瘤、DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、BrCa(乳腺癌)、TNBC(三阴性乳腺癌)、NE-PCa(神经内分泌前列腺癌)、GBM(胶质母细胞瘤)和RCC(肾细胞癌)的疾病或病况的方法。
本文提供了包含(i)第一靶向域、(ii)第二靶向域和(iii)有效负荷的缀合物，其中第一靶向域包含至少一个第一非天然氨基酸(UAA)，由此第一靶向区域能够在UAA的位点共价地结合至第一靶标，并且第二靶向域被配置为结合第二靶标。在一些实施方案中，第一靶标和第二靶标位于同一细胞上。在一些实施方案中，第一靶向域包括抗体、抗体片段或抗原结合域。在一些实施方案中，第一靶向域包含单域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，第一UAA包含在第一靶向域的与第一靶标相接的区域内或附近。在一些实施方案中，第二靶向域包括抗体、抗体片段或抗原结合域。在一些实施方案中，第二靶向域包含单域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，第一靶向域和第二靶向域连接以形成融合蛋白。在一些实施方案中，第一靶向域和第二靶向域通过化学缀合连接。在一些实施方案中，第一靶向域和第二域通过连接体连接。在一些实施方案中，第一靶向域和第二靶向域结合同一靶标。在一些实施方案中，第一靶向域和第二靶向域结合至同一靶标的不同表位。在一些实施方案中，第一靶向域和第二靶向域结合至同一靶标的同一表位。在一些实施方案中，同一靶标为单体。在一些实施方案中，同一靶标为多聚体分子。在一些实施方案中，第一靶向域和第二靶向域结合不同的靶标。在一些实施方案中，第一靶为第一细胞表面分子。在一些实施方案中，第二靶标为第二细胞表面分子。在一些实施方案中，至少一个第一UAA包含氟代硫酸酯部分。在一些实施方案中，至少一个UAA包含芳基氟代硫酸酯部分。在一些实施方案中，至少一个第一UAA包含式I：在一些实施方案中，至少一个第一UAA具有结构：在一些实施方案中，至少一个第一UAA具有结构：(FSY)。在一些实施方案中，至少一个第一UAA包含式II：在一些实施方案中，至少一个第一UAA具有结构：在一些实施方案中，至少一个第一UAA具有结构：在一些实施方案中，至少一个第一UAA包含式III： 在一些实施方案中，至少一个第一UAA具有结构：在一些实施方案中，至少一个第一UAA具有结构：在一些实施方案中，至少一个第一UAA具有式(IA)：的结构，其中，每个X独立地为O或NR’；Y为键、-O-、-NR-或-N＝；A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；L为-(CH2)p-或-C(O)NH-(CH2)p-；p为1至6的整数；并且其中当Y为-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。在一些实施方案中，至少一个第一UAA具有式(IA-a)：的结构。在一些实施方案中，至少一个第一UAA具有式(IA-b)：的结构。在一些实施方案中，至少一个第一UAA具有式(IB)：的结构。在一些实施方案中，至少一个第一UAA具有式(IC)：的结构。在一些实施方案中，至少一个第一UAA具有式(ID)：的结构，其中：每个X独立地为O或NR’；Y为键、-O-、-NR-或-N＝；A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；并且其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。在一些实施方案中，至少一个第一UAA具有式(IE)：的结构，其中：每个X独立地为O或NR’；Y为键、-O-、-NR-或-N＝；A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；并且其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。在一些实施方案中，至少一个第一UAA具有式(IIA)：的结构，其中：X独立地为O或NR’；并且当存在时，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。在一些实施方案中，至少一个第一UAA具有式(IIB)：的结构，其中：X独立地为O或NR’；并且当存在时，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。在一些实施方案中，至少一个第一UAA具有式(IV)的结构，其中，每个X独立地为O或NR’；Y为键、-O-、-NR-或-N＝；A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；环A为5至6元芳基或杂芳基；每个RA独立地为-OH、-ORX、卤素、NHRX、N(RX)2或任选取代的烷基；p为0、1、2、3或4；每个RX为任选取代的烷基；L为-(CH2)p-或-C(O)NH-(CH2)p-；p为1至6的整数；并且其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。在一些实施方案中，第一细胞表面分子选自PSMA、EGFR、EGFRviii、MSLN、CEA、DLL3、FAP、CD33、HER3、PD-L1、EphA2、EphA4、HER2、SIRPa、DLK1、Muc16、LRP5、LRP6、endo180、LIV-1、SLAMF7、PTK7、GPR20、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3 rec、NaPi2b、CD16、GCC、SSTR2、CAIX、CAXII、MC1R、CXCR4、B1R、GRPR、STEAP1、CD70、CD46、CD166、CLL-1、ADAM9、cKIT、CD36、CD73、ITGaVb3、ITGaVb6、GPC-1、CD38、CD51、FGFR3、Ly6E、CD44v6、ENPP3、CXCR3、CXCR5、FcRH5、VEGF、VEGFR2、CD45、CCR4、CD25、5T4、ROR1、TROP-2、NECTIN4、cMET、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CD79b、AXL、RON、B7-H3、B7-H4、KAAG1、Muc1、ADAM-9、GPNMB、EDB纤连蛋白、组织因子、GPNMB、FolRa、ALPP、ALPPL2、MT1-MMP、CLDN18.2、CLDN6、CLDN9、p钙黏着蛋白、CEACAM6、CD47和EpCAM。在一些实施方案中，第二细胞表面分子选自PSMA、EGFR、EGFRviii、MSLN、CEA、DLL3、FAP、CD33、HER3、PD-L1、EphA2、EphA4、HER2、SIRPa、DLK1、Muc16、LRP5、LRP6、endo180、LIV-1、SLAMF7、PTK7、GPR20、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3 rec、NaPi2b、CD16、GCC、SSTR2、CAIX、CAXII、MC1R、CXCR4、B1R、GRPR、STEAP1、CD70、CD46、CD166、CLL-1、ADAM9、cKIT、CD36、CD73、ITGaVb3、ITGaVb6、GPC-1、CD38、CD51、FGFR3、Ly6E、CD44v6、ENPP3、CXCR3、CXCR5、FcRH5、VEGF、VEGFR2、CD45、CCR4、CD25、5T4、ROR1、TROP-2、NECTIN4、cMET、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CD79b、AXL、RON、B7-H3、B7-H4、KAAG1、Muc1、ADAM-9、GPNMB、EDB纤连蛋白、组织因子、GPNMB、FolRa、ALPP、ALPPL2、MT1-MMP、CLDN18.2、CLDN6、CLDN9、p钙黏着蛋白、CEACAM6、CD47和EpCAM。在一些实施方案中，第二域包含第二UAA，由此第二域能够在第二UAA的位点共价地结合至第二靶标。在一些实施方案中，第二UAA不同于第一靶向域中包含的至少一个UAA。在一些实施方案中，第二UAA与第一靶向域中包含的至少一个UAA相同。在一些实施方案中，第二UAA包含氟代硫酸酯部分。在一些实施方案中，第二UAA包含芳基氟代硫酸酯部分。在一些实施方案中，第二UAA包括式I：在一些实施方案中，第二UAA具有结构：在一些实施方案中，第二UAA具有结构：在一些实施方案中，第二UAA包含式II：在一些实施方案中，第二UAA具有结构：在一些实施方案中，第二UAA具有结构：在一些实施方案中，第二UAA包含式III：在一些实施方案中，第二UAA具有结构：在一些实施方案中，第二UAA具有结构：在一些实施方案中，第二UAA具有式(IA)：的结构，其中，每个X独立地为O或NR’；Y为键、-O-、-NR-或-N＝；A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；L为-(CH2)p-或-C(O)NH-(CH2)p-；p为1至6的整数；并且其中当Y为-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。在一些实施方案中，第二UAA具有式(IA-a)：的结构。在一些实施方案中，第二UAA具有式(IA-b)：的结构。在一些实施方案中，第二UAA具有式(IB)：的结构。在一些实施方案中，第二UAA具有式(IC)： 的结构。在一些实施方案中，第二UAA具有式(ID)：的结构，其中：每个X独立地为O或NR’；Y为键、-O-、-NR-或-N＝；A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；并且其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。在一些实施方案中，第二UAA具有式(IE)：的结构，其中：每个X独立地为O或NR’；Y为键、-O-、-NR-或-N＝；A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；并且其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。在一些实施方案中，第二UAA具有式(IIA)：的结构，其中：X独立地为O或NR’；并且当存在时，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。在一些实施方案中，第二UAA具有式(IIB)：的结构，其中：X独立地为O或NR’；并且当存在时，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。在一些实施方案中，第二UAA具有式(IV)的结构，其中，每个X独立地为O或NR’；Y为键、-O-、-NR-或-N＝；A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；环A为5至6元芳基或杂芳基；每个RA独立地为-OH、-ORX、卤素、NHRX、N(RX)2或任选取代的烷基；p为0、1、2、3或4；每个RX为任选取代的烷基；L为-(CH2)p-或-C(O)NH-(CH2)p-；p为1至6的整数；并且其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。在一些实施方案中，第一靶向域包含SEQ ID NO:1-4或16-64中的任何一个。在一些实施方案中，第一靶向域包含与SEQ ID NO:1-4或16-64中的任何一个具有至少70％序列同一性的序列。在一些实施方案中，第二靶向域包含SEQ IDNO:1-4或16-64中的任何一个。在一些实施方案中，第二靶向域包含与SEQ ID NO:1-4或16-64中的任何一个具有至少70％同一性的序列。在一些实施方案中，缀合物包括SEQ ID NO:66-72。在一些实施方案中，缀合物包含与SEQ ID NO:66-72具有至少70％序列同一性的序列。在一些实施方案中，缀合物包括SEQ ID NO:1-4或16-64中的任何一个。在一些实施方案中，缀合物包含与SEQ ID NO:1-4或16-64中的任何一个具有至少70％序列同一性的序列。在一些实施方案中，缀合物包含与SEQ ID NO:66-72具有至少70％序列同一性的序列。在一些实施方案中，第一靶向域和第二靶向域中的至少一个包含SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，UAA相对于SEQ ID NO:1存在于选自26、28、29、30、99、102、103、105、108、110、111、112、113、114和115的氨基酸位置。在一些实施方案中，第一靶向域和第二靶向域中的至少一个包含SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，UAA相对于SEQ ID NO:2存在于选自50、52、53、54、56、58和100的氨基酸位置。在一些实施方案中，第一靶向域和第二靶向域中的至少一个包含SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，UAA相对于SEQ ID NO:3存在于选自58、62、101、103和107的氨基酸位置。在一些实施方案中，第一靶向域和第二靶向域中的至少一个包含SEQ IDNO:16。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:16的第一靶向域和第二靶向域中的至少一个在相对于SEQ ID NO:16的位置109处进一步包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，第一靶向域和第二靶向域中的至少一个包含SEQ ID NO:18。在一些实施方案中，有效负荷包括显像剂、放射性配体试剂或细胞毒性试剂。在一些实施方案中，细胞毒性部分包括小分子药物或化疗药物。在一些实施方案中，放射性配体试剂选自153Sm、177Lu、90Y、131I、149Tb、211At、212Pb/212Bi、213Bi、223Ra、225Ac和227Th。在一些实施方案中，放射性配体试剂进一步包括螯合剂。在一些实施方案中，放射性配体试剂选自99mTc、131I、201Tl、111In和67Ga。在一些实施方案中，有效负荷用连接体附接至缀合物。在另一方面，本文提供了包括施用本文提供的缀合物的方法，其中缀合物共价地结合第一细胞的表面上的第一靶标。在一些实施方案中，缀合物结合第一细胞的表面上的第二靶标。在一些实施方案中，第一靶向域和第二靶向域结合至同一靶标。在一些实施方案中，第一靶向域和第二靶向域结合至同一靶标的同一表位。在一些实施方案中，第一靶向域和第二靶向域结合至同一靶标的不同表位。在一些实施方案中，第一靶向域和第二靶向域结合至第一细胞的表面上的不同靶标。在一些实施方案中，第二域包含第二UAA，并且其中第二UAA共价地结合至第二靶标。在一些实施方案中，第一细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，当结合至第一靶标时，缀合物杀死肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞的生长。在一些实施方案中，当结合至第二靶标时，缀合物杀死肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞的生长。在一些实施方案中，当结合至第一靶标和第二靶标时，缀合物杀死肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞的生长。在一些实施方案中，第一靶标选自PSMA、EGFR、EGFRviii、MSLN、CEA、DLL3、FAP、CD33、HER3、PD-L1、EphA2、EphA4、HER2、SIRPa、DLK1、Muc16、LRP5、LRP6、endo180、LIV-1、SLAMF7、PTK7、GPR20、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3 rec、NaPi2b、CD16、GCC、SSTR2、CAIX、CAXII、MC1R、CXCR4、B1R、GRPR、STEAP1、CD70、CD46、CD166、CLL-1、ADAM9、cKIT、CD36、CD73、ITGaVb3、ITGaVb6、GPC-1、CD38、CD51、FGFR3、Ly6E、CD44v6、ENPP3、CXCR3、CXCR5、FcRH5、VEGF、VEGFR2、CD45、CCR4、CD25、5T4、ROR1、TROP-2、NECTIN4、cMET、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CD79b、AXL、RON、B7-H3、B7-H4、KAAG1、Muc1、ADAM-9、GPNMB、EDB纤连蛋白、组织因子、GPNMB、FolRa、ALPP、ALPPL2、MT1-MMP、CLDN18.2、CLDN6、CLDN9、p钙黏着蛋白、CEACAM6、CD47和EpCAM。在一些实施方案中，第二靶标选自PSMA、EGFR、EGFRviii、MSLN、CEA、DLL3、FAP、CD33、HER3、PD-L1、EphA2、EphA4、HER2、SIRPa、DLK1、Muc16、LRP5、LRP6、endo180、LIV-1、SLAMF7、PTK7、GPR20、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3rec、NaPi2b、CD16、GCC、SSTR2、CAIX、CAXII、MC1R、CXCR4、B1R、GRPR、STEAP1、CD70、CD46、CD166、CLL-1、ADAM9、cKIT、CD36、CD73、ITGaVb3、ITGaVb6、GPC-1、CD38、CD51、FGFR3、Ly6E、CD44v6、ENPP3、CXCR3、CXCR5、FcRH5、VEGF、VEGFR2、CD45、CCR4、CD25、5T4、ROR1、TROP-2、NECTIN4、cMET、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CD79b、AXL、RON、B7-H3、B7-H4、KAAG1、Muc1、ADAM-9、GPNMB、EDB纤连蛋白、组织因子、GPNMB、FolRa、ALPP、ALPPL2、MT1-MMP、CLDN18.2、CLDN6、CLDN9、p钙黏着蛋白、CEACAM6、CD47和EpCAM。在一些实施方案中，有效负荷是放射性标记剂或细胞毒性试剂。在一些实施方案中，有效负荷是显像剂。在一些实施方案中，当缀合物结合至第一细胞上的第一靶标和第二靶标时，该方法对第一细胞进行成像或鉴定。在仍另一方面，本文提供了制造本文提供的缀合物的方法，包括：(a)在体内合成包含至少一个非天然氨基酸的第一靶向域；和(b)任选地经由连接体将有效负荷缀合至第一靶向域或第二靶向域。在一些实施方案中，方法进一步包括在体内合成第二靶向域作为与第一靶向域的融合蛋白。在一些实施方案中，合成包括使用正交tRNA合成酶/抑制型tRNA对。在一些实施方案中，合成包括正交tRNA合成酶/抑制型tRNA对，其衍生自吡咯赖氨酸tRNA合成酶/tRNAPyl。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同具体且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下详细说明和附图将更好地理解本发明的特征和优点，在详细说明中阐述了利用本发明的原理的说明性实施方案，其中：
图1A-1E显示了在37℃下，具有不同位置处的FSY的FSY修饰的sdAb和PSMA之间的交联的各种SDS-PAGE分析，其中sdAb与PSMA的摩尔比为约7:1(PSMA最终浓度为0.125mg/mL，1.25uM)。图1A描绘了显示了在存在或不存在靶PSMA的情况下包含FSY的C1构建体的凝胶。PSMA-C1-FSY交联、PSMA和C1-FSY被标记。图1B描绘了显示了在存在或不存在靶PSMA的情况下包含FSY的C1构建体的凝胶。PSMA-C1-FSY交联、PSMA和C1-FSY被标记。图1C描绘了显示了在存在或不存在靶PSMA的情况下包含FSY的C1构建体的凝胶。PSMA-C1-FSY交联、PSMA和C1-FSY被标记。图1D描绘了显示了在存在或不存在靶PSMA的情况下包含FSY的C1构建体的凝胶。PSMA-C1-FSY交联、PSMA和C1-FSY被标记。图1E描绘了显示了在存在或不存在靶PSMA的情况下包含FSY的C1构建体的凝胶。PSMA-C1-FSY交联、PSMA和C1-FSY被标记。
图2A-2C显示了在37℃下C2(PSMA特异性sdAb)和PSMA之间的交联的各种SDS-PAGE分析，其中sdAb:PSMA的摩尔比为8:1。图2A描绘了一种凝胶，显示了在存在靶PSMA以及PSMA和野生型C2-CDR2库对照的情况下在位置50-61处包含FSY的C2构建体。粗箭头表示交联产物的存在。PSMA和C2用细箭头标记。图2B描绘了显示了在存在靶PSMA的情况下包含FSY的C2构建体的凝胶。图2C描绘了显示了在存在靶PSMA以及野生型C2-CDR3库对照的情况下包含FSY的C2构建体的凝胶。粗箭头表示交联产物的存在。PSMA和C2-FSY用细箭头标记。
图3A显示了37℃下180分钟内FSY修饰的sdAb(C1的位置28或102处的FSY)和PSMA之间的交联动力学的SDS-PAGE分析，其中sdAb与PSMA的摩尔比为5:1(PSMA最终浓度为0.125mg/mL，1.25uM)。
图3B显示了FSY修饰的sdAb和PSMA之间的交联实验的PSMA交联百分比与时间的动力学图表。y轴标记为交联PSMA％(0至60，间隔10个单位)，并且x轴标记为时间(min，0至180，间隔30min)。测试的构建体为C1-28FSY(圆圈)、C1-102FSY(方形)、C1-112FSY(三角形)、C1-113FSY(倒三角形)。
图4显示了单体C1相关sdAb构建体的图。C1(包含两个半胱氨酸二硫键的野生型序列)、C39(C1-C101A/C104A，一个半胱氨酸二硫键被两个丙氨酸替换，从而去除二硫键)、C1-102FSY(构建体C1，组氨酸102被非天然氨基酸FSY替换)和C39-102FSY(C1-C101A/C104A/H102(FSY)，C101和C104半胱氨酸两者被丙氨酸替换，组氨酸102被FSY替换)。
图5A显示了在37℃下，双互补位构建体C40-102FSY(通过将C39-102FSY序列与不含FSY的C39拷贝连接而产生)或C39-102FSY的单互补位构建体与PSMA在180分钟内的交联动力学的SDS-PAGE分析。标记与C39-102FSY、C40-102FSY、受体和交联物种相对应的带。与单互补位构建体相比，双互补位构建体的偶联速率增加。
图5B显示了对于双互补位构建体C40-102FSY或单互补位构建体C39-102FSY与PSMA之间的交联，PSMA交联与时间的动力学图。
图6A和6B显示了各种FSY修饰的C3构建体之间交联的SDS-PAGE分析。图6A显示了在位置26-35和50-60处具有FSY的C3构建体的结果；构建体C3-58FSY的交联产物用星号表示。图6B显示了在位置61-66和99-113处具有FSY的C3构建体的结果)；至少对构建体C3-62FSY、C3-101FSY、C3-103FSY、C3-107FSY观察了交联产物。
图7A显示了各种合并的FSK修饰的C8构建体与FAP受体之间交联的SDS-PAGE分析。图7B显示了各种单个FSK修饰的C8构建体与FAP受体之间交联的SDS-PAGE分析。
图7C显示了各种FSK修饰的C8构建体与FAP受体之间的交联动力学的SDS-PAGE分析。
图8A-8D显示了各种FSY修饰的C9构建体与Her3受体之间交联的SDS-PAGE分析。图8A显示了在各种位置具有FSY的C9构建体与Her3受体的库的结果。图8B显示了在位置52-68处具有FSY的C9构建体与Her3受体的结果。图8C显示了在位置53、55、56、57、58、60、64或67具有FSY的C9构建体与Her3受体的结果。图8D显示了FSY修饰的C9构建体(C9-55FSY)与Her3受体之间的交联动力学的SDS-PAGE分析。
图9显示了使用流式细胞术对C2-54FSY和C2-54TYR sdAb与人前列腺肿瘤细胞系LNCaP(PSMA+)和PC3(PSMA-)的结合测定的结果。
图10A和10B显示了FSY修饰的sdAb与细胞交联的SDS-PAGE分析。图10A显示了使用在不同浓度和时间点孵育的LNCaP细胞和C2-54 FSY的蛋白质印迹。使用抗PSMA抗体(上图)、抗sdAb抗体(中图)和抗GAPDH(下图)作为装载对照来分析印迹。图10B显示了使用LNCaP细胞和C2-54TYR的蛋白质印迹，并且显示与PSMA没有交联。最右侧的泳道是对照，显示了在1uM下与LNCaP细胞孵育9小时的C2-54FSY的样品。图10C显示了在不同时间点不同浓度的C2-54FSY的交联动力学图。
图11A显示了不同时间的LNCaP细胞中C2-54FSY和C3-101FSY在1uM和24nM下与PSMA的交联动力学的蛋白质印迹分析。上图显示了抗PSMA抗体的印迹，而下图显示了抗GAPDH对照。图11B显示了LNCaP细胞上C2-54FSY和C3-101FSY与PSMA的交联动力学图。
图12A和12B显示了体内交联测定的研究设计和结果。图12A显示了来自被施用C2-54 TYR和C2-54 FSY的小鼠的LNCaP和PC3肿瘤组织样品的研究设计和蛋白质印迹。上图显示了用抗VHH抗体印迹的凝胶的PSMA区域，中图显示了用抗VHH抗体印迹的凝胶的游离VHH区域，并且下图显示了抗GAPDH印迹。左图显示了来自LNCaP肿瘤携带动物的样品，而右图显示了PC3样品。仅在LNCaP(PSMA+)肿瘤中以及在C2-54FSY存在的情况下观察到交联。图12B显示了给药后C2-54 TYR和C2-54 FSY的血浆浓度图。
图13显示了C8-54FSY、C8-55FSY和C8-56FSY的交联动力学的SDS-PAGE分析(从左到右)。标记了代表交联和C8-FSY的带位置。对于每个构建体，泳道表示(从左到右)0、15、30、60、120、180分钟和梯。
图14显示了各种含C15-FSY构建体的交联的SDS-PAGE分析。左凝胶：泳道(从左到右)表示在位置：2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、33、34、35、梯和Her2处具有FSY替换的构建体。右凝胶：泳道(从左到右)表示在位置：36、37、66、67、68、69、wt梯和Her2处具有FSY替换的构建体。标记表示交联的带位置和包含FSY的构建体。
图15显示了双互补位构建体C38-FSY与Her2-Fc交联的SDS-PAGE分析。泳道(从左到右)为0、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5小时的时间、Her2和梯。标记表示交联、Her2-Fc和C38-FSY的带位置。
图16描绘了经由流式细胞术对A431和Colo320DM细胞中的构建体进行结合研究得出的荧光与浓度的关系图：A431-C23-TYR，实心方块；A431-C23-FSY，实心三角形；Colo320DM-C23-TYR，“x”符号；以及Colo320DM-C23-FSY，空心圆。y轴标记为以40,000个单位为间隔从0至200,000的AF680 GeoMean。x轴标记为以10为底的对数刻度从10-11至10-5的浓度(M)。
图17显示了A431(EGFR+)和COLO320DM(EGFR-)肿瘤中的时间依赖性方式的肿瘤内游离和EGFR交联的AF680标记的化合物C23-TYR和C23-FSY。在约15kD区域检测到游离AF-680标记的C23-TYR和C23-FSY(下图)，并且在约175kD区域检测到EGFR交联的sdAb带(上图)。在EGFR+A431肿瘤中观察到EGFR与C23-FSY的时间依赖性交联，但没有观察到EGFR与C23-TYR的时间依赖性交联。在EGFR-COLO320DM肿瘤中既没有观察到游离sdAb保留也没有观察到交联。
图18A描绘了衍生自被施用C23-TYR或C23-FSY试验制品的动物的A431肿瘤的三次生物复制中的光子/s/g组织的图。显示了来自个体动物的值，中心条显示了平均强度，并且误差条表示SEM(通过配对t检验，*表示p＝0.024，**表示p＝0.002)。在8小时和24小时的时间点，与不含FSY的C23-TYR蛋白质相比，A431肿瘤中C23-FSY存在的水平显著更高。y轴以0.5x1010的间隔标记为0到1.5x1010的光子/s/g组织。x轴标记为给药后8小时和24小时时间(hr)。经由配对t检验(双尾)，星号表示统计显著性(*＝p≤0.05，**＝p≤0.005)。
图18B描绘了给药后8小时和24小时施用C23-FSY的动物的A431和COLO320DM肿瘤的定量离体荧光强度的图。图显示了三次生物复制中的光子/s/g组织。显示了来自个体动物的值，中心条显示了平均强度，误差条表示SEM。在8小时和24小时的时间点，C23-FSY在A431肿瘤中的水平显著高于在EGFR-COLO320DM肿瘤中的量，表明了C23-FSY蛋白质的肿瘤锁定的特异性。y轴以0.5x1010的间隔标记为0到1x 1010的光子/s/g组织。对于每组柱状图，x轴标记为给药后时间8和24hr的时间(hr)。左侧组为A431模型肿瘤，并且右侧为Colo320DM模型肿瘤。
图19显示了SDS PAGE凝胶的荧光图像，显示了以时间依赖的方式的肿瘤相关的游离sdAb和PSMA交联的sdAb。携带LNCaP肿瘤的小鼠被施用C30-TYR或C30-FSY，一式三份。在治疗后的指定时间点，收获肿瘤并进行凝胶电泳，以检测荧光团缀合的sdAb试验制品。在约20kD区域检测到游离(非交联)sdAb-AF680(下图)，并且C30-FSY的PSMA交联的sdAb-AF680物种在100kD区域迁移(上图)。标有*的泳道显示了媒介物样品。
图20显示了肿瘤相关游离和PSMA交联的试验制品C30-TYR和C30-FSY的定量分析。经由密度测定法定量上述凝胶中游离和PSMA交联的物种带的荧光带强度，并与标准曲线进行比较。绘制肿瘤内试验制品总浓度(游离和PSMA交联，pg/mg肿瘤组织)与时间(h)的关系图。用*表示的数据点表示低于检测和定量限的样品。相对于非共价C30-TYR相比，C30-FSY的肿瘤暴露增加到约3x。
图21A描绘了C26-54TYR和C26-54FSY试验制品在PC3PIP(PSMA阳性)和PC3flu(PSMA阴性)细胞系中的细胞毒性比较图，显示了缀合至MMAE的sdAb的浓度与细胞生存力曲线。y轴以20个单位间隔标记为0至120的生存力％。x轴标记为以10为底的对数间隔从10-11至10-6的试验制品浓度(M)。
图21B描绘了C28-101TYR和C28-101FSY试验制品在PC3PIP(PSMA阳性)和PC3flu(PSMA阴性)细胞系中的细胞毒性比较图，显示了缀合至MMAE的sdAb的浓度与细胞生存力曲线。y轴以20个单位间隔标记为0至120的生存力％。x轴标记为以10为底的对数间隔从10-11至10-6的试验制品浓度(M)。
图22描述了FSY交联动力学的SDS-PAGE分析，其中C17的52FSY和54FSY变体与Her2受体一起孵育，并检查了交联效率。泳道1-5表示0、30、60、120和180min时的C17-52FSY；泳道6-10表示0、30、60、120和180min时的C17-54FSY；泳道11和12分别是FcHer2和梯。标记与C17-FSY、受体和交联产物对应的带位置。
图23A描绘了使用C33-52TYR、C33-52FSY、C33-54TYR和C33-54FSY试验制品的5小时洗出后的细胞毒性比较图，显示了BT474细胞中缀合至MMAE的sdAb的浓度与细胞生存力曲线。y轴标记为以20个单位间隔从-20至120的生存力％。x轴标记为以10为底的对数间隔从10-3至103的试验制品浓度(nM)。
图23B描绘了使用连续6天暴露于C33试验制品的细胞毒性比较图，显示了BT474细胞中缀合至MMAE的sdAb的浓度与细胞生存力曲线。y轴标记为以20个单位间隔从-20至120的生存力％。x轴标记为以10为底的对数间隔从10-2至102的试验制品浓度(nM)。
图24A描绘了单互补位和双互补位构建体(C3-101FSY，方形；C34-FSY，三角形；C36-FSY，圆形)的PSMA交联图。y轴标记为以20个单位间隔从0至100的交联PSMA(总％)。x轴标记为以10为底的对数间隔从0.01至1000的试验制品浓度(nM)。该图对应于在1小时的交联。
图24B描绘了单互补位和双互补位构建体(C3-101FSY，方形；C34-FSY，三角形；C36-FSY，圆形)的PSMA交联图。y轴标记为以20个单位间隔从0至100的交联PSMA(总％)。x轴标记为以10为底的对数间隔从0.01至1000的试验制品浓度(nM)。该图对应于在6小时的交联。
图25A描述了不同浓度的C3-101FSY和C34-FSY构建体在1小时和6小时时间点的FSY交联动力学的蛋白质印迹分析。泳道1-6表示在1小时的C3-101FSY；泳道7-12表示在1小时的C34-FSY；泳道13-18表示在6小时的C3-101FSY，并且泳道19-24表示在6小时的C34-FSY。每组六条泳道描绘了构建体浓度的增加(从左到右)：UTC、0.1、1、10、100、1000nM。顶部的印迹组描绘了a-PSMA，并且底部的印迹组描述了a-GAPDH。标记了GAPDH、PSMA、交联单体和交联二聚体的带位置。
图25B描述了不同浓度C3-101FSY和C36-FSY构建体在1小时和6小时时间点的FSY交联动力学的蛋白质印迹分析。泳道1-6表示在1小时的C3-101FSY；泳道7-12表示在1小时的C36-FSY；泳道13-18表示在6小时的C3-101FSY，并且泳道19-24表示在6小时的C36-FSY。每组六条泳道描绘了构建体浓度的增加(从左到右)：UTC、0.1、1、10、100、1000nM。顶部的印迹组描绘了a-PSMA，并且底部的印迹组描述了a-GAPDH。标记了GAPDH、PSMA、交联单体和交联二聚体的带位置。
图26A描述了EGFR和单互补位构建体C4-109FSY之间交联动力学的SDS-PAGE分析。半最大时间为约120分钟。标记了与交联产物、EGFR和sdAb单体相对应的带。右边显示了与含有FSY的sdAb单体衔接的受体的插图。
图26B描述了EGFR和双互补位构建体C37-FSY之间交联动力学的SDS-PAGE分析。标记了与交联产物、EGFR和sdAb二聚体相对应的带。右侧显示了描绘与含有FSY的sdAb双互补位构建体衔接的受体的插图。
图27描绘了单互补位构建体C4-109FSY(方形)或双互补位构建体C37-FSY(圆形)的EGFR交联动力学图。y轴标记为从0至100％的EGFR交联％。x轴标记为以100分钟的间隔从0至400的时间(分钟)。
图28A-C描述了本文所述的示例性缀合物，其包含第一靶向域(例如，构建体C1-C4)和第二靶向域(例如，构建体C1-C4)，其中缀合物包含非天然氨基酸(例如，FSY)。一个示例性缀合物还包含有效负荷。示例性缀合物可以包括第一靶向域、第二靶向域或两个靶向域上的非天然氨基酸。
具体实施方式
抗体、抗体片段和抗体相关构建体，诸如抗体药物缀合物(ADC)，可以成为研究和临床应用的有用工具。然而，在一些情况下，这些分子的使用受到靶标的开/关速率以及稳定性的限制。本文提供了用于将缀合物特异性且共价地结合至靶标的组合物和方法。在一些情况下，缀合物包含至少一个靶向域，在靶标和靶向域之间的界面附近具有至少一个非天然氨基酸(UAA)残基，使得当靶向域和靶标结合时，在靶标和UAA残基之间形成共价键。在一些情况下，缀合物包含至少一个靶向域和至少一个有效负荷。在一些情况下，靶向域在靶标和靶向域之间的界面附近包含至少一个非天然氨基酸(UAA)残基，使得当靶向域和靶标结合时，在靶标和UAA残基之间形成共价键。在一些情况下，一旦缀合物到达其靶细胞/肿瘤，有效负荷现在经由靶向域共价地结合至靶标。在一些情况下，共价相互作用消除或降低了缀合物结合至靶标的速率，增加了与附接有效负荷的接触。
在一些情况下，缀合物包含(i)第一靶向域和(ii)第二靶向域，其中第一靶向域或第二靶向域包含至少一个非天然氨基酸(UAA)。在一些情况下，第一靶向域或第二靶向域包含存在于靶标与第一靶向域或第二靶向域之间的界面附近的至少一个UAA，并且当第一靶向域或第二靶向域与靶标结合时，在靶标和至少一个UAA之间形成共价键。在一些情况下，缀合物还包含有效负荷。在一些情况下，当缀合物到达其靶细胞时，诸如肿瘤或肿瘤微环境中的细胞，有效负荷现在经由靶向域中的一个(例如第一靶向域或第二靶向域)共价地结合至靶标。
在一些情况下，共价相互作用消除或降低了缀合物结合至靶标的速率，或以其他方式稳定了与靶标的接触。在进一步的情况下，本文提供的缀合物中的第一靶向域和第二靶向域靶向相同或不同的靶标。在一些情况下，仅第二靶向域而不是第一靶向域包含UAA。在一些情况下，仅第一靶向域而不是第二靶向域包含UAA。在一些情况下，第一靶向域和第二靶向域二者均包含UAA。在一些情况下，有效负荷可以被附接至第一靶向域或第二靶向域。在一些情况下，有效负荷被附接至第一靶向域。在一些情况下，有效负荷被附接至第二靶向域。
缀合物
缀合物可以包含靶向域和有效负荷。在一些实施方案中，有效负荷用连接体附接至缀合物。在一些情况下，缀合物包含至少一个非天然氨基酸。在一些情况下，靶向域被配置为结合至靶标，并且靶向域内的一种非天然氨基酸与靶标形成共价键。
本文提供的缀合物可以包含(i)第一靶向域和(ii)第二靶向域。本文提供的缀合物可以包含(i)第一靶向域、(ii)第二靶向域和(iii)有效负荷。本文的缀合物可以包括第一靶向域和第二靶向域，其中第一靶向域和第二靶向域被配置为结合至同一细胞。在一些情况下，缀合物包含至少一个非天然氨基酸(UAA)，该非天然氨基酸包含在第一靶向域中、第二靶向域中，或者第一靶向域和第二靶向域中的每一个都包含至少一个UAA。在一些情况下，靶向域被配置为结合至靶标，并且靶向域内的UAA中的一个(例如，第一和/或第二靶向域)与靶标形成共价键。在一些情况下，第一靶向域包含UAA，并被配置为与第一靶标形成共价键，使得至少一个UAA存在于第一靶向域中，位于第一靶标和第一靶向区域之间的界面附近。在一些情况下，第一靶标和第一靶向域结合，并在第一靶标和缀合物第一靶向域中的UAA之间形成共价键。在一些情况下，第二靶向域包含UAA，并被配置为与第二靶标形成共价键，使得至少一个UAA存在于第二靶标和第二靶向域之间的界面附近的第二靶向域中。在一些情况下，第二靶标和第二靶向域结合，并在第二靶标与缀合物的第二靶向域中的UAA之间形成共价键。在一些情况下，第一靶标与第二靶标相同。在一些情况下，第一靶标和第二靶标位于同一细胞的表面上。
在一些实施方案中，第一靶向域和第二靶向域结合同一靶标，诸如在细胞的表面上，并且其中一个靶向域的衔接使另一靶向域接近其相应的靶标。在一些情况下，第一靶向域结合至第一靶标，并且第二靶向域结合至第二靶标，并且第一和第二靶向域中的至少一个包含UAA，并且UAA与相应的靶标形成共价键。在一些情况下，一个靶向域与其相应的靶标形成共价键，并且另一靶向域与其相应的靶标非共价地结合。在一些情况下，第一靶向域和第二靶向域均与其相应的靶标共价地结合。
本文提供的缀合物可以被配置为结合多于一个靶标。在一些情况下，第二靶向域可以结合与第一靶向域不同的靶标。在一些情况下，缀合物包含至少2、3、4、5、6或多于7个靶向域。在一些情况下，靶向域(例如，第一靶向域和第二靶向域)经由连接体(例如，化学连接体、融合蛋白或本文提供的其他连接体)彼此附接。在一些情况下，本文提供的缀合物中的多个靶向域(例如，第一靶向域和第二靶向域)可以提供单互补位或双互补位构建体。在一些情况下，第一靶向域和第二靶向域结合同一靶标。在一些情况下，第一靶向域和第二靶向域结合同一靶标的不同表位。在一些情况下，第一靶向域和第二靶向域结合不同的靶标。在一些情况下，第一靶向域和第二靶向域连接以形成融合蛋白。
靶向域(例如，第一靶向域或第二靶向域)可以将附接至缀合物的有效负荷引导至靶标。在一些情况下，靶向域包括抗体或其片段。在一些情况下，靶向域包括单特异性Fab2、双特异性Fab2、三特异性Fab3、单价IgG、scFv、双特性双抗体、三特性三抗体、scFv-Fc、纳米抗体(即，单域抗体，sdAb)、微抗体、IgNAR、V-NAR、hcIgG、VhH或肽体(peptibody)、Darpin、单体/FN3、VNAR、Repebody、Darpin。在一些情况下，靶向域包括纳米抗体。在一些实施方案中，靶向域包括单域抗体(sdAb)。在一些情况下，靶向域包括一个或多个CDR区。在一些实施方案中，靶向域结合细胞表面分子。在一些情况下，缀合物是双互补位的。在一些实施方案中，第一靶向域和第二靶向域各自包含抗体或抗原结合片段，并且这种抗体或抗原结合片段的结构可以相同或不同。在一些情况下，第一靶向域可以是单链(例如，Fv)抗体片段，并且第二靶向域可以是sdAb，或者在其他情况下，第一靶向域可以为sdAb，并且第二靶向域可以为sdAb。
在一些情况下，靶向域(例如，第一靶向域和/或第二靶向域)是抗体模拟物，诸如affibody、DARPin或迷你结合剂。
在一些情况下，靶标包括细胞表面蛋白。在一些情况下，靶标包括PSMA。在一些情况下，靶向域(例如，第一靶向域和/或第二靶向域)包含SEQ ID:1-4或16-64中的任何一个。在一些情况下，靶向域包含与SEQ ID:1-4或16-64中的任何一个具有至少99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、70％或至少65％同一性的序列。在一些情况下，靶向域包含与SEQID:1-4或16-64中的任何一个具有至少99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、70％或至少65％同一性的序列和至少一个非天然氨基酸。
非天然氨基酸可以位于缀合物中的任何位置。在一些情况下，第一靶向域或第二靶向域中的一个或两个(例如，第一靶向域或第二靶向域)包含非天然氨基酸。在一些情况下，靶向域为包含一个或多个互补决定区(CDR)的抗体或抗原结合片段。在一些情况下，一个或多个非天然氨基酸包含在仅一个或两个靶向域中的CDR内或附近。在一些情况下，靶向域包含非天然氨基酸。在一些情况下，靶向域包含C1、C2或C3。在一些情况下，缀合物包含C1，其在CDR1、CDR2或CDR3中具有非天然氨基酸。在一些情况下，缀合物包含C1，其在位置26、28、29、30、99、102、103、105、108、110、111、112、113、114和115中的任何一个处具有非天然氨基酸。在一些情况下，缀合物包含C1，其在位置28、102、112和113中的任何一个处具有非天然氨基酸。在一些情况下，缀合物包含C2，其在CDR1、CDR2或CDR3中具有非天然氨基酸。在一些情况下，缀合物包含C2，其在位置50、52、53、54、56、58或100中的任何一个处具有非天然氨基酸。在一些情况下，缀合物包含C4，其在CDR1、CDR2或CDR3中具有非天然氨基酸。在一些情况下，缀合物包含在位置109具有非天然氨基酸的C4。在一些情况下，缀合物包含在CDR1、CDR2或CDR3中具有非天然氨基酸的C3。在一些情况下，缀合物包含在位置58、62、101、103或107中的任何一个处具有非天然氨基酸的C3。在一些情况下，缀合物包含在位置52、53、54、55、56、58、60、62、64中的任何一个处具有非天然氨基酸的C8。在一些情况下，缀合物包含在位置53、55、56、57、58、60、64、67中的任何一个处具有非天然氨基酸的C9。在一些情况下，缀合物包含单域抗体(sdAb)，该sdAb包括具有CDR区和在CDR区内或附近的至少一个非天然氨基酸(UAA)残基的sdAb，其中sdAb包含SEQ ID No.1-4或16-64中的任何一个。在一些情况下，缀合物包含单域抗体(sdAb)，该sdAb包括具有CDR区和在CDR区内或附近的至少一个非天然氨基酸(UAA)残基的sdAb，其中sdAb包含与SEQ ID No.1-4或16-64中的任何一个具有99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、70％或至少65％同一性的序列。在一些实施方案中，CDR区包含一个或多个SEQ ID No.5-13。在一些实施方案中，CDR区包含与一个或多个SEQ ID No.5-13具有至少99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、70％或至少65％同一性的序列。
在一些情况下，缀合物包含标签，诸如用于纯化的标签(例如，His6标签)。在一些情况下，缀合物不包含标签，或者在施用前去除标签。在一些情况下，缀合物包含前导序列，诸如用于表达或分泌。在一些情况下，缀合物不包含前导序列，或者在形成缀合物之前、在附接有效负荷之前或在施用缀合物之前，从第一靶向域或第二靶向域去除前导序列。
在一些情况下，缀合物包含信号序列。信号序列可以允许缀合物在细菌细胞中表达、折叠或氧化。在一些情况下，信号序列可以允许细菌细胞中表达的缀合物被运输到另一位置或环境，以促进缀合物的折叠或功能。在一些情况下，信号序列可以是PelB序列。在一些情况下，信号序列可以允许缀合物运输到细菌细胞的周质。在一些情况下，环境可以是氧化或还原的，以允许二硫化物的形成或二硫化物的还原。
靶标
本文提供的缀合物可以被配置为与一个或多个靶标结合。在一些情况下，缀合物被配置为具有包含UAA的单一靶向域，并且缀合物结合至靶标。在一些情况下，缀合物被配置为具有两个(或至少两个)靶向域，并且第一靶向域和第二靶向域结合至一个或多个靶标。在一些情况下，第一靶向域结合至第一靶标，并且第二靶向域结合至第二靶标。在一些情况下，靶向域(例如，单一靶向域或第一靶向域或第二靶向域)中包含的UAA在靶向域(例如，单一靶向域，或第一靶向域或第二靶向域)和靶标(靶向域的相应靶标，例如，第一或第二靶标)之间形成共价键。在一些情况下，缀合物包含包含第一UAA的第一靶向域和包含第二UAA的第二靶向域。这些UAA在一些情况下是相同的，或在其他情况下是不同的。在一些情况下，靶标是细胞表面分子(即全部或部分存在于细胞外表面)。在一些情况下，第一靶向域和第二靶向域结合至同一靶标，诸如同一细胞表面分子。在一些情况下，第一靶向域和第二靶向域各自结合至不同的靶标，诸如结合至不同的细胞表面分子。不同的细胞表面分子可以在同一细胞上。
在一些情况下，靶标是肿瘤细胞上存在的细胞表面分子。在一些情况下，靶标是单体。在一些情况下，靶标包含在同质或异质单元的多聚体结构中。在一些情况下，靶标选自PSMA、EGFR、EGFRviii、MSLN、CEA、DLL3、FAP、CD33、HER3、PD-L1、EphA2、EphA4、HER2、SIRPa、DLK1、Muc16、LRP5、LRP6、endo180、LIV-1、SLAMF7、PTK7、GPR20、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3rec、NaPi2b、CD16、GCC、SSTR2、CAIX、CAXII、MC1R、CXCR4、B1R、GRPR、STEAP1、CD70、CD46、CD166、CLL-1、ADAM9、cKIT、CD36、CD73、ITGaVb3、ITGaVb6、GPC-1、CD38、CD51、FGFR3、Ly6E、CD44v6、ENPP3、CXCR3、CXCR5、FcRH5、VEGF、VEGFR2、CD45、CCR4、CD25、5T4、ROR1、TROP-2、NECTIN4、cMET、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CD79b、AXL、RON、B7-H3、B7-H4、KAAG1、Muc1、ADAM-9、GPNMB、EDB纤连蛋白、组织因子、GPNMB、FolRa、ALPP、ALPPL2、MT1-MMP、CLDN18.2、CLDN6、CLDN9、p钙黏着蛋白、CEACAM6、CD47和EpCAM。
在一些情况下，缀合物包含第一靶向域和第二靶向域，并且这两个靶向域均结合至同一靶标，其中靶标是肿瘤细胞上的细胞表面分子。例如，两个靶向域均结合至选自PSMA、EGFR、EGFRviii、MSLN、CEA、DLL3、FAP、CD33、HER3、PD-L1、EphA2、EphA4、HER2、SIRPa、DLK1、Muc16、LRP5、LRP6、endo180、LIV-1、SLAMF7、PTK7、GPR20、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3rec、NaPi2b、CD16、GCC、SSTR2、CAIX、CAXII、MC1R、CXCR4、B1R、GRPR、STEAP1、CD70、CD46、CD166、CLL-1、ADAM9、cKIT、CD36、CD73、ITGaVb3、ITGaVb6、GPC-1、CD38、CD51、FGFR3、Ly6E、CD44v6、ENPP3、CXCR3、CXCR5、FcRH5、VEGF、VEGFR2、CD45、CCR4、CD25、5T4、ROR1、TROP-2、NECTIN4、cMET、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CD79b、AXL、RON、B7-H3、B7-H4、KAAG1、Muc1、ADAM-9、GPNMB、EDB纤连蛋白、组织因子、GPNMB、FolRa、ALPP、ALPPL2、MT1-MMP、CLDN18.2、CLDN6、CLDN9、p钙黏着蛋白、CEACAM6、CD47和EpCAM的靶标。在一些情况下，缀合物包含结合至不同靶标的第一靶向域和第二靶向域，其中一个或多个不同的靶标是肿瘤细胞上的细胞表面分子。例如，第一靶向域和第二靶向域结合至不同的靶标，每个靶标选自PSMA、EGFR、EGFRviii、MSLN、CEA、DLL3、FAP、CD33、HER3、PD-L1、EphA2、EphA4、HER2、SIRPa、DLK1、Muc16、LRP5、LRP6、endo180、LIV-1、SLAMF7、PTK7、GPR20、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3 rec、NaPi2b、CD16、GCC、SSTR2、CAIX、CAXII、MC1R、CXCR4、B1R、GRPR、STEAP1、CD70、CD46、CD166、CLL-1、ADAM9、cKIT、CD36、CD73、ITGaVb3、ITGaVb6、GPC-1、CD38、CD51、FGFR3、Ly6E、CD44v6、ENPP3、CXCR3、CXCR5、FcRH5、VEGF、VEGFR2、CD45、CCR4、CD25、5T4、ROR1、TROP-2、NECTIN4、cMET、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CD79b、AXL、RON、B7-H3、B7-H4、KAAG1、Muc1、ADAM-9、GPNMB、EDB纤连蛋白、组织因子、GPNMB、FolRa、ALPP、ALPPL2、MT1-MMP、CLDN18.2、CLDN6、CLDN9、p钙黏着蛋白、CEACAM6、CD47和EpCAM。在一些情况下，当第一或第二靶标(或两者)结合时，缀合物将有效负荷携带至细胞表面。在一些情况下，缀合物没有有效负荷，并且当共价地结合至第一靶标、第二靶标或第一和第二靶标时，缀合物充当阻断剂或拮抗剂。
在一些情况下，缀合物包含单一靶向域，并且该靶向域结合至靶标，其中靶标为肿瘤细胞上的细胞表面分子。例如，靶向域结合至选自PSMA、EGFR、EGFRviii、MSLN、CEA、DLL3、FAP、CD33、HER3、PD-L1、EphA2、EphA4、HER2、SIRPa、DLK1、Muc16、LRP5、LRP6、endo180、LIV-1、SLAMF7、PTK7、GPR20、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3 rec、NaPi2b、CD16、GCC、SSTR2、CAIX、CAXII、MC1R、CXCR4、B1R、GRPR、STEAP1、CD70、CD46、CD166、CLL-1、ADAM9、cKIT、CD36、CD73、ITGaVb3、ITGaVb6、GPC-1、CD38、CD51、FGFR3、Ly6E、CD44v6、ENPP3、CXCR3、CXCR5、FcRH5、VEGF、VEGFR2、CD45、CCR4、CD25、5T4、ROR1、TROP-2、NECTIN4、cMET、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CD79b、AXL、RON、B7-H3、B7-H4、KAAG1、Muc1、ADAM-9、GPNMB、EDB纤连蛋白、组织因子、GPNMB、FolRa、ALPP、ALPPL2、MT1-MMP、CLDN18.2、CLDN6、CLDN9、p钙黏着蛋白、CEACAM6、CD47和EpCAM的靶标。在一些情况下，单一靶向域携带靶标的有效负荷。在一些情况下，单一靶向域没有有效负荷，并且缀合物在共价地结合至靶标时充当阻断剂或拮抗剂。
由靶向域衔接的靶标可以包括各种结构。在一些情况下，靶标包含可被靶向域衔接的一个或多个表位。在一些情况下，靶标包含多个表位，并且可以被多个靶向域衔接，例如，诸如通过第一靶向域结合至第一表位和通过第二靶向域结合至第二表位。在一些情况下，靶标包括单体。在一些情况下，靶标包括单链肽。在一些情况下，靶标包括多聚体分子。在一些情况下，多聚体分子包含两个或更多个子单元。在一些情况下，子单元具有相同的结构。在一些情况下，子单元是不同的结构，或相同和不同结构的组合。在一些情况下，多聚体分子包含由复合物中的两个或更多个分子。在一些情况下，多聚体分子包含两种相互复合或相互作用的蛋白质组成。
示例性靶向域和示例性缀合物
本文提供的缀合物包含可由与靶标衔接的分子组装的靶向域。在一些情况下，靶向域(单一靶向域或第一靶向域和/或第二靶向域)包含抗原结合区，其中抗原结合区与特异性靶标衔接。此类抗原结合区可以包含CDR，诸如通常在抗体的重链或轻链中发现的3个CDR。在一些情况下，靶向域包含抗原结合片段，该抗原结合片段包含CDR，诸如VHH(也称为纳米抗体或单域抗体)。在一些情况下，单域抗体包含一个或多个UAA。在一些情况下，单一靶向域或对于具有多个靶向域的缀合物，其中一个靶向域(例如，第一靶向域或第二靶向域)选自表1的单域抗体，诸如C1、C2、C3、C4或C5。在一些情况下，如果与多于一个靶向域缀合，则每个靶向域(例如，第一靶向域和第二靶向域)独立地选自表1的单域抗体，诸如C1、C2、C3、C4或C5中的任何一个，并且一个或多个UAA存在于单域抗体的CDR中或CDR附近。在一些情况下，第一靶向域选自表1的单域抗体，诸如C1、C2、C3、C4或C5中的任何一个。在一些情况下，第二靶向域选自表1的单域抗体，诸如C1、C2、C3、C4或C5中的任何一个。
在一些情况下，缀合物包含单一靶向域、第一靶向域、第二靶向域或包含构建体C1的两个靶向域。在一些情况下，缀合物包含在CDR1、CDR2或CDR3中具有非天然氨基酸的构建体C1。在一些情况下，缀合物包含在SEQ ID NO:1、4、19或73中的位置26、28、29、30、99、102、103、105、108、110、111、112、113、114和115中的任何一个处具有非天然氨基酸的构建体C1。在一些情况下，缀合物包含在SEQ ID NO:1、4、19或73中的位置28、102、112和113中的任何一个处具有非天然氨基酸的构建体C1。在一些情况下，缀合物包含单域抗体(sdAb)和sdAb内CDR区内或附近的至少一个非天然氨基酸(UAA)。在一些情况下，这种sdAb包含SEQ IDNO:1。在一些情况下，缀合物包含单域抗体(sdAb)和sdAb内CDR区内或附近的至少一个非天然氨基酸(UAA)，其中sdAb包含与SEQ ID NO:1具有至少99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、70％或至少65％序列同一性的序列。在一些情况下，缀合物包含与SEQ ID NO:1具有至少99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、70％或至少65％同一性的单一靶向域、第一靶向域或第二靶向域，或两者。
在一些情况下，缀合物包含单一靶向域、第一靶向域、第二靶向域或包含构建体C2的两个靶向域。在一些情况下，缀合物包含在CDR1、CDR2或CDR3中具有非天然氨基酸的构建体C2。在一些情况下，缀合物包含在SEQ ID NO:2或22的位置50、52、53、54、56、58或100中的任何一个具有非天然氨基酸的构建体C2。在一些情况下，缀合物包含单域抗体(sdAb)，其包含sdAb和sdAb内CDR区内或附近的至少一个非天然氨基酸(UAA)，其中sdAb包含SEQ ID NO:2。在一些情况下，缀合物包含单域抗体(sdAb)和sdAb内CDR区内或附近的至少一个非天然氨基酸(UAA)，其中sdAb包含与SEQ ID NO:2具有至少99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、70％或至少65％序列同一性的序列。在一些情况下，缀合物包含与SEQ ID NO:2具有至少99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、70％或至少65％序列同一性的单一靶向域、第一靶向域或第二靶向域，或两者。
在一些情况下，缀合物包含单一靶向域、第一靶向域、第二靶向域或包含构建体C3的两个靶向域。在一些情况下，缀合物包含在CDR1、CDR2或CDR3中具有非天然氨基酸的构建体C3。在一些情况下，缀合物包含在SEQ ID NO:3的位置58、62、101、103或107中的任何一个具有非天然氨基酸的构建体C3。在一些情况下，缀合物包含C3的CDR1、CDR2或CDR3中的非天然氨基酸。在一些情况下，缀合物在位置109处包含非天然氨基酸。在一些情况下，缀合物包含单域抗体(sdAb)和sdAb内CDR区内或附近的至少一个非天然氨基酸(UAA)，其中sdAb包含SEQ ID NO:3。在一些情况下，缀合物包含单域抗体(sdAb)和sdAb内CDR区内或附近的至少一个非天然氨基酸(UAA)，其中sdAb包含与SEQ ID NO:3具有至少99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、70％或至少65％序列同一性的序列。在一些情况下，缀合物包含与SEQ IDNO:3具有至少99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、70％或至少65％序列同一性的单一靶向域、第一靶向域或第二靶向域或两者。
在一些情况下，缀合物包含单一靶向域、第一靶向域、第二靶向域或包含构建体C4的两个靶向域。在一些情况下，缀合物包含在CDR1、CDR2或CDR3中具有非天然氨基酸的构建体C4。在一些情况下，缀合物包含单域抗体(sdAb)和sdAb内CDR区内或附近的至少一个非天然氨基酸(UAA)，其中sdAb包含SEQ ID NO:16。在一些情况下，缀合物包含单域抗体(sdAb)和sdAb内CDR区内或附近的至少一个非天然氨基酸(UAA)，其中sdAb包含与SEQ ID NO:16具有至少99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、70％或至少65％序列同一性的序列。在一些情况下，缀合物包含与SEQ ID NO:16具有至少99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、70％或至少65％序列同一性的单一靶向域、第一靶向域或第二靶向域，或两者。
在一些情况下，缀合物包含单一靶向域、第一靶向域、第二靶向域或包含构建体C5的两个靶向域。在一些情况下，缀合物包含在CDR1、CDR2或CDR3中具有非天然氨基酸的构建体C5。在一些情况下，缀合物包含单域抗体(sdAb)和sdAb内CDR区内或附近的至少一个非天然氨基酸(UAA)，其中sdAb包含SEQ ID NO:18。在一些情况下，缀合物包含单域抗体(sdAb)和sdAb内CDR区内或附近的至少一个非天然氨基酸(UAA)，其中sdAb包含与SEQ ID NO:18具有至少99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、70％或至少65％序列同一性的序列。在一些情况下，缀合物包含与SEQ ID NO:18具有至少99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、70％或至少65％序列同一性的单一靶向域、第一靶向域或第二靶向域，或两者。
本文所述的缀合物可以包含两个或更多个靶向域。在一些情况下，两个或更多个靶向域(例如，第一个靶向或第二个靶向)经由连接体相互附接。在一些情况下，缀合物是融合蛋白。在一些情况下，连接体包括连接体L1(SEQ ID NO:14)。在一些情况下，缀合物包含SEQ ID NO:65-72中的任何一种。在一些情况下，缀合物与SEQ ID NO:65-72中的任何一个具有至少99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、70％或至少65％的序列同一性。
在一些情况下，第一靶向域包含SEQ ID NO:1-4或16-64中的任何一个。在一些情况下，第一靶向域包含与SEQ ID NO:1-4或16-64中的任何一个具有至少70％序列同一性的序列。在一些情况下，第二靶向域包含SEQ ID NO:1-4或16-64中的任何一个。在一些情况下，第二靶向域包含与SEQ ID NO:1-4或16-64中的任何一个具有至少70％序列同一性的序列。在一些情况下，缀合物被配置有单一靶向域，并且该单一靶向域包含SEQ ID NO:1-4或16-64中的任何一个。在一些情况下，单一靶向域包含与SEQ ID NO:1-4或16-64中的任何一个具有至少70％序列同一性的序列。
在一些情况下，缀合物包含SEQ ID NO:65-72。在一些情况下，缀合物包含与SEQID NO:65-72中的任何一个具有至少70％序列同一性的序列。在一些情况下，缀合物包含SEQ ID NO:1-4或16-64中的任何一个。在一些情况下，缀合物包含与SEQ ID NO:1-4或16-64中的任何一个具有至少70％序列同一性的序列。在一些情况下，缀合物包含与SEQ IDNO:65-72具有至少70％序列同一性的序列。
在一些情况下，与本文所述的缀合物相关的氨基酸序列在表1A中。
表1A：氨基酸序列
X表示FSY并入位点的位置。表中具有His6纯化标签和/或PelB前导序列的序列也体现在本文中。
在一些情况下，与本文所述的缀合物相关的DNA序列在表2中。
表2：DNA序列
有效负荷
缀合物可以包含有效负荷。在一些情况下，缀合物中包含的靶向域(例如，单一靶向域或第一靶向域或第二靶向域)可以将有效负荷引导到靶标。在一些情况下，靶向域(例如，单一靶向域或第一靶向域或第二靶向域)包含将有效负荷引导至细胞(诸如肿瘤细胞)的抗体或其片段。在一些实施方案中，有效负荷包括显像剂、放射性配体试剂或细胞毒性试剂。在一些实施方案中，细胞毒性部分包括小分子药物、肽、蛋白质或化疗药物。在一些实施方案中，有效负荷包括放射性配体试剂。在一些实施方案中，放射性配体试剂选自35S、3H、111In、112In、14C、186Re、188Re、32P、153Sm、177Lu、86Y、88Y、90Y、131I、123I、124I、125I、149Tb、211At、212Pb/212Bi、213Bi、223Ra、225Ac、64Cu、67Cu和227Th。在一些实施方案中，放射性配体试剂进一步包括螯合剂。螯合剂的实例包括DOTA、DOTAGA、NOTA、MACROPA、THP和TRAP。在一些实施方案中，放射性配体试剂选自99mTc、131I、201Tl、111In和67Ga。在一些情况下，显像剂包括染料。在一些情况下，缀合物包含两个或更多个有效负荷。例如，缀合物包含用于可视化组织穿透的有效负荷染料和用于杀死肿瘤的有效负荷化疗剂。
有效负荷可以附接至缀合物。有效负荷可以共价地附接至缀合物。在一些情况下，有效负荷不经由非天然氨基酸(UAA)残基附接至缀合物。在一些实施方案中，有效负荷附接至相对于UAA残基的氨基酸n+x(朝向C末端)。在一些实施方案中，附接的位点被定义为与非天然氨基酸位置n距离x个氨基酸的位置。在一些实施方案中，有效负荷附接至相对于UAA残基的氨基酸n-x(朝向n末端)。在一些实施方案中，UAA残基包含在与靶标相接的靶向域(例如，单一靶向域或第一靶向域或第二靶向域)的区域内或附近。在一些情况下，有效负荷与缀合物中的非天然氨基酸相距至少2、5、10、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或至少125个氨基酸。
非天然氨基酸(UAA)
非天然氨基酸(UAA)可以被并入本文所述的缀合物。在一些情况下，UAA残基存在于缀合物的靶向域中。在一些情况下，UAA被配置为与靶标共价地结合。在一些情况下，UAA被配置为共价地结合靶标中存在的氨基酸。在一些情况下，缀合物包含一个、两个、三个、四个或更多个UAA。在一些情况下，缀合物包含包含第一UAA的第一靶向域和包含第二UAA的第二靶向域。在一些情况下，UAA被配置在靶向域(例如，第一靶向域或第二靶向域时)内，以在靶向域与靶标衔接时共价地结合靶标中存在的氨基酸。在一些情况下，此类氨基酸包括亲核氨基酸。在一些情况下，UAA残基与赖氨酸、组氨酸或酪氨酸形成共价键。在一些情况下，UAA残基位于靶标结合域中。在一些情况下，一旦并入至缀合物中，UAA就位于靶向域的CDR中，诸如包含抗体或抗原结合片段的靶向域，例如单域抗体。在一些实施方案中，UAA残基包括芳基氟代硫酸酯部分。在一些情况下，UAA残基被基因编码到本文所述的缀合物中。在一些情况下，UAA残基包括酪氨酸或赖氨酸的变体。在一些实施方案中，非天然氨基酸残基包含式I：的结构。在一些实施方案中，非天然氨基酸残基包含式II：的结构。在一些实施方案中，UAA残基来自本文所述的UAA的并入。在一些实施方案中，非天然氨基酸为2-氨基-3-(4-((氟磺酰基)氧基)苯基)丙酸在一些实施方案中，非天然氨基酸为氟磺酰基酪氨酸(FSY):在一些实施方案中，非天然氨基酸是N6-(4-((氟磺酰基)氧基)苯甲酰基)赖氨酸：在一些实施方案中，非天然氨基酸为氟磺酰基氧基苯甲酰基-L-赖氨酸(FSK)：在一些实施方案中，非天然氨基酸残基包含式III：的结构。在一些实施方案中，非自然氨基酸为在一些实施方案中，非天然氨基酸为
在一些实施方案中，UAA残基的非天然氨基酸(UAA)具有式(IA)的结构：
(IA)，
其中，
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；
L为-(CH2)p-或-C(O)NH-(CH2)p-；p为1至6的整数；并且
其中当Y为-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
在一些实施方案中，式(IA)的UAA具有式(IA-a)：的结构。在一些实施方案中，式(IA)的UAA具有式(IA-b)：的结构。
在一些实施方案中，式(IA)的UAA具有式(IB)：的结构。
在一些实施方案中，式(IB)的UAA具有式(IB-a)：的结构。在一些实施方案中，式(IB)的UAA具有式(IB-b)：的结构。
在一些实施方案中，式(IA)的UAA具有式(IC)：的结构：
在一些实施方案中，式(IC)的UAA具有式(IC-a)：的结构。在一些实施方案中，式(IB)的UAA具有式(IB-b)：的结构。在一些优选实施方案中，R为氢。
在一些实施方案中，式(IA)的UAA具有式(ID)：的结构，
其中每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
在一些实施方案中，式(ID)的UAA具有式(ID-a)：的结构。在一些实施方案中，式(ID)的UAA具有式(ID-b)：的结构。
在一些实施方案中，式(IA)的UAA具有式(IE)：的结构，
其中每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
在一些实施方案中，式(IE)的UAA具有式(IE-a)：的结构。在一些实施方案中，式(IE)的UAA具有式(IE-b)：的结构。
在一些实施方案中，Y为键、-O-或-NR-，m为1。在其他实施方案中，Y为-N＝，m为2。在某些优选实施方案中，Y为-O-并且m为1。在其他实施方案中，Y为-NR-并且m为1。在其他实施方案中，Y为键并且m为1。在其他实施方案中，Y为O-或-NR-，m为1。
在一些实施方案中，式(IA)的UAA具有式(IIA)：的结构，
其中：
X独立地为O或NR’；并且
当存在时，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。
在一些实施方案中，式(IIA)的UAA具有式(IIA-a)：的结构。在一些实施方案中，式(IIA)的UAA具有式(IIA-b)：的结构。
在一些实施方案中，式(IA)的UAA具有式(IIB)：的结构，
其中：
X独立地为O或NR’；并且
当存在时，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。
在一些实施方案中，式(IIB)的UAA具有式(IIB-a)：的结构。在一些实施方案中，式(IIB)的UAA具有式(IIB-b)：的结构。
在一些实施方案中，非天然氨基酸(UAA)具有式(IV)的结构，
其中，
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
环A为5至6元芳基或杂芳基；
每个RA独立地为-OH、-ORX、卤素、NHRX、N(RX)2或任选取代的烷基；每个RX为任选取代的烷基；
L为-(CH2)p-或-C(O)NH-(CH2)p-；p为1至6的整数；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
在一些实施方案中，A为键。在其他实施方案中，A为-(CH2)n-。在一些实施方案中，n为1、2、3或4。在一个实施方案中，n为1。在另一实施方案中，n为2。在另一实施方案中，n为3。在另一实施方案中，n为4。
在一些实施方案中，环A为5元环。在一些实施方案中，在一些实施方案中，环A为6元环。在一些实施方案中，环A为芳基。在一些实施方案中，环A为杂芳基。在一些实施方案中，环A为6元芳基。在一些实施方案中，环A为6元杂芳基。在一个优选实施方案中，环A为苯基。
在一些实施方案中，p为0。在一些实施方案中，p为1至4的整数。在一些实施方案中，p为1至3的整数。在一个实施方案中，p为1。在另一实施方案中，p为2。在另一实施方案中，p为3。在另一实施方案中，p为4。
在一些实施方案中，每个RA独立地为-OH、-ORX、卤素、NHRX、N(RX)2或任选取代的烷基；每个RX为任选取代的烷基。在一些实施方案中，每个RA独立地为-OH、卤素或任选取代的烷基。在一些实施方案中，每个RA独立地为卤素或任选取代的烷基。在一些实施方案中，每个RA独立地为-OH或任选取代的烷基。在一些实施方案中，每个RA独立地为任选取代的烷基。在一些实施方案中，每个RA独立地为取代的烷基。在一些实施方案中，每个RA独立地为未取代的烷基。在一个实施方案中，每个RA都为碘。在另一实施方案中，每个RA为甲基。在一个具体实施方案中，其中p为1，RA为碘。在另一具体实施方案中，其中p为2，每个RA为甲基。
在一些实施方案中，Y为键、-O-、-NR-或-N＝。在一些实施方案中，Y为-O-、-NR-或-N＝。在一些实施方案中，Y为键、-O-或-NR-。在一些实施方案中，Y为键、-O-或-N＝。在一些实施方案中，Y为键、-NR-或-N＝。在一些实施方案中，Y为-O-或-NR-。在一些实施方案中，Y为-O-或-N＝。在一些实施方案中，Y为-NR-或-N＝。在一个实施方案中，Y为键。在另一实施方案中，Y为-O-。在另一实施方案中，Y为-NR-。在另一实施方案中，Y为-N＝。
在一些实施方案中，L为-(CH2)p-。在其他实施方案中，L为-C(O)NH-(CH2)p-。在一些实施方案中，p为1至6、1至5、1至4、1至3或1至2的整数。在一个实施方案中，p为1至4。在另一实施方案中，p为1或2。在另一实施方案中，p为1或4。在一个优选实施方案中，L为-CH2-。在另一优选实施方案中，L为-C(O)NH-(CH2)4-。
在一些实施方案中，R为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。在一些实施方案中，R为氢或取代的或未取代的烷基。在一个优选实施方案中，R为氢。在另一实施方案中，R为取代的或未取代的C1-6烷基。在另一实施方案中，R为未取代的C1-6烷基。在一个实施方案中，R为甲基。在另一优选实施方案中，R为氢或甲基。
在一些实施方案中，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。在一些实施方案中，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、或者取代的或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。在一些实施方案中，R’为氢、取代的或未取代的烷基、或取代或未被取代的芳基。在实施方案中，R’为氢。在另一实施方案中，R’为取代的或未取代的。在另一实施方案中，R’为取代的或未取代的芳基。
在一些实施方案中，R1为氢。在一些实施方案中，R1为氟。在一些实施方案中，R1为碘。在一些实施方案中，R2为氢。在其他实施方案中，R2为甲基。在一些实施方案中，R1为氢并且R2为氢。在一些实施方案中，R1为氟并且R2为氢。在一些实施方案中，R1为氢并且R2为甲基。在一些实施方案中，R1为碘并且R2为氢。
连接体
在一些实施方案中，本文提供的缀合物包含多于一个连接体。在一些实施方案中，靶向域(例如，第一靶向域和第二靶向域)经由第一连接体连接。第一连接体和第二连接体可以是本文所述的任何连接体。在一些实施方案中，有效负荷经由第二连接体连接至靶向域中的一个(第一或第二靶向域)。在一个优选实施方案中，第一连接体是肽连接体。在另一优选实施方案中，第二连接体是通过化学缀合形成的。在一些实施方案中，第二连接体是用于化学缀合的双官能连接体。在另一优选实施方案中，第二连接体是非肽连接体。
在一些实施方案中，用于将靶向域缀合或结合至本文所述的有效负荷的有用功能性反应性基团包括，例如，零或更高阶连接体。在一些情况下，缀合部分包括与本文所述的连接体(任选地预先附接至有效负荷、靶向域或缀合物的其他部分)反应的功能性反应性基团。在一些实施方案中，连接体包含与本文所述的有效负荷或靶向域中的天然氨基酸反应的反应性基团。靶向域(例如，第一靶向域和第二靶向域)或靶向域中的一个(例如，第一靶向域或第二靶向域)和有效负荷可以通过使第一靶向域上的亲核反应性部分与第二靶向域上的亲电反应性部分反应，或通过使靶向域上的亲核反应性部分与有效负荷上的亲电反应性部分反应而缀合在一起。在替代实施方案中，第一靶向域和第二靶向域，或靶向域(例如，第一靶向域或第二靶向域)和有效负荷通过使第一靶向域上的亲电反应性部分与第二靶向域上的亲核部分反应，或通过使靶向域上的亲电反应性部分与有效负荷上的亲核部分反应而缀合在一起。在一些实施方案中，当靶向域上的胺(例如赖氨酸残基的ε-胺)与另一靶向域上的羧基反应，或靶向域上的胺与有效负荷上的羧基反应时，可形成酰胺键。在替代实施方案中，靶向域和或有效负荷在缀合之前用衍生剂衍生化。
在一些情况下，高阶连接体包括双官能连接体，诸如同双官能连接体或异双官能连接体。示例性同双官能连接体包括但不限于Lomant试剂二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)DSP、3′3′-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺酯)辛二酸酯(BS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(磺基DST)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、戊二酸二琥珀酰胺酯(DSG)、碳酸N,N′-二琥珀酰亚胺酯(DSC)、己二亚氨酸二甲酯(DMA)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP)、辛二亚氨酸二甲酯(DMS)、二甲基-3,3′-二硫代双丙亚氨酸酯(DTBP)、1,4-二-3′-(2′-吡啶基二硫代)丙酰胺基)丁烷(DPDPB)、双马来酰亚胺己烷(BMH)、含芳基卤化物的化合物(DFDNB)，诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯、4,4′-二氟-3,3′-二硝基苯砜(DFDNPS)、双-[β-(4-叠氮基水杨酰胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、己二酸二酰肼、碳酰肼、邻甲苯胺、3,3′-二甲苯胺、联苯胺、α,α′-对二氨基联苯、二碘-对二甲苯磺酸、N,N′-亚乙基双(碘乙酰胺)，或N,N′-六亚甲基双(碘乙酰胺)。
在一些实施方案中，双官能连接体包括异双官能连接体。示例性异双官能连接体包括但不限于胺反应性和巯基交联剂，诸如3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(sPDP)、长链3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(LC-sPDP)、水溶性长链3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(硫代-LC-sPDP)、琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(sMPT)、磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯酰胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBs)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBs)、N-琥珀酰亚胺(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(sIAB)、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨苯甲酸酯(磺基-sIAB)、琥珀酰亚胺-4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBs)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBs)、6-((碘乙酰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯(sIAX)、6-[6-(((碘乙酰基)氨基)己酰基)氨基]己酸琥珀酰亚胺酯(sIAXX)、4-(((碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(sIAC)、6-((((4-碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-羰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯(sIACX)、对硝基苯碘乙酸酯(NPIA)、羰基反应性和巯基反应性交联剂，诸如4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼-8(M2C2H)、3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基肼(PDPH)、胺反应性和光反应性交联剂，诸如N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(NHs-AsA)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-(4-叠氮基水杨酰氨基)己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(ρ-叠氮基水杨酰氨基)乙基-1,3′-二硫代丙酸酯(sAsD)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(HsAB)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀酰亚胺基-6-(4′-叠氮基-2′-硝基苯基氨基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基-6-(4-叠氮基-2′-硝基苯基氨基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰基氧基琥珀酰亚胺(ANB-NOs)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(间-叠氮基-邻-硝基苯甲酰胺基)-乙基-1,3′-二硫代丙酸酯(sAND)、N-琥珀酰亚胺基4(4-叠氮基苯基)-1,3′-二硫代丙酸酯(sADP)、N-磺基琥珀酰亚胺基(4-叠氮基苯基)-1,3′-二硫代丙酸酯(磺基-sADP)、4-(ρ-叠氮基苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sAPP)、2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3′-二硫代丙酸磺基琥珀酰亚胺酯(sAED)、7-叠氮-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sAMCA)、重氮基丙酮酸ρ-对硝基苯酯(ρNPDP)、ρ-对硝基苯基-2-重氮基-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)、巯基反应性和光反应性交联剂，诸如1-(ρ-叠氮基水杨酰胺基)-4-(碘乙酰胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(ρ-叠氮基水杨酰胺基)丁基]-3′-(2′-吡啶基二硫代)丙酰胺(APDP)、二苯甲酮-4-碘乙酰胺、二苯甲酮-4-马来酰亚胺羰基反应性和光反应性交联剂，诸如ρ-叠氮基苯甲酰肼(ABH)、羧酸酯反应性和光反应性交联剂，诸如4-(ρ-叠氮基水杨酰胺基)丁胺(AsBA)和精氨酸反应性和光反应性交联剂如诸ρ-叠氮基苯基乙二醛(APG)。
在一些情况下，反应性官能团包括亲核基团，该亲核基团与存在于结合部分上(例如，有效负荷部分上或靶向域上)的亲电基团反应。示例性亲电基团包括羰基——诸如醛、酮、羧酸、酯、酰胺、烯酮、酰卤或酸酐。在一些实施方案中，反应性官能团是醛。示例性亲核基团包括酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳酰肼。在一些实施方案中，并入本文所述的缀合物中的非天然氨基酸包含亲电基团。
在一些实施方案中，连接体为可切割连接体。在一些实施方案中，可切割连接体为二肽连接体。在一些实施方案中，二肽连接体为缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)、苯丙氨酸-赖氨酸(Phe-Lys)、缬氨酸-丙氨酸(Val-Ala)和缬氨酸-赖氨酸(Val-Lys)。在一些实施方案中，二肽连接体为缬氨酸-瓜氨酸。连接体可以包含可切割序列或由蛋白酶识别的序列。
在各种实施方案中，靶向域(例如，第一靶向域和第二靶向域)包含多肽连接体序列。连接体可以在靶向域的C末端。连接体可以经由重组技术表达，并且可以使用核酸序列连同靶向域的表达进行编码。连接体可以连接靶向域以形成融合蛋白。缀合物中连接体的存在可以使靶向域恰当地发挥作用，而不会受到其他靶向域的空间干扰。连接体可以将靶向域连接至标签，诸如表达标签或纯化标签。连接体可以是柔性连接体。连接体的柔性可以允许靶向域采用独立的构象，受其他靶向域的干扰最小。在一些实施方案中，连接体为肽连接体，其包含例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多的氨基酸。在一些情况下，肽连接体包含最多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、35、40、45、50个或更少的氨基酸。在另外的情况下，肽连接体包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。在另外的情况下，多肽连接体包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。在一些情况下，多肽连接体包含(GGGGSGGGS)x(SEQ ID NO:14)，其中x为1-10。在一些实施方案中，连接体为长度为1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12个氨基酸和更长长度的多肽连接体。连接体可以包含SPSTPPTPSPSTPP，多肽连接体可以是(GGGGS)x、(GGGS)x的重复。连接体可以包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或脯氨酸。在一些实施方案中，一个靶向域的N末端融合至连接体多肽的C末端，并且连接体多肽的N末端融合至另一靶向域的N末端。
在各种实施方案中，靶向域(例如，第一靶向域和第二靶向域)通过连接体连接或分离。连接体可以是多肽连接体。连接体可以经由重组技术表达，并且可以使用核酸序列连同靶向域的表达进行编码。连接体可以连接靶向域以形成融合蛋白。缀合物中连接体的存在可以使靶向域恰当地发挥作用，而不会受到其他靶向域的空间干扰。连接体可以是柔性连接体。连接体的柔性可以允许靶向域采用独立的构象，受其他靶向域的干扰最小。在一些实施方案中，连接体为肽连接体，其包含例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多的氨基酸。在一些情况下，肽连接体包含最多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、35、40、45、50个或更少的氨基酸。在另外的情况下，肽连接体包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。在另外的情况下，多肽连接体包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。在一些情况下，多肽连接体包含(GGGGSGGGS)x(SEQ ID NO:14)，其中x为1-10。在一些实施方案中，连接体为长度为1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12个氨基酸和更长长度的多肽连接体。连接体可以包括SPSTPPTPSPSTPP，多肽连接体可以是(GGGGS)x、(GGGS)x的重复。连接体可以包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或脯氨酸。在一些实施方案中，一个靶向域的N末端融合至连接体多肽的C末端，并且连接体多肽的N末端融合至另一靶向域的N末端。
在一些实施方案中，连接体包括自分解(self-immolative)连接体部分。在一些实施方案中，自分解连接体部分包括对氨基苯甲醇(PAB)、对氨基苯氧羰基(PABC)或其衍生物或类似物。在一些实施方案中，连接体包括二肽连接体部分和自分解连接体部分。在一些实施方案中，自分解连接体部分如美国专利号9089614和WIPO申请号WO2015038426中所描述。
在一些实施方案中，可切割连接体为葡糖苷酸。在一些实施方案中，可切割连接体为酸可切割连接体。在一些实施方案中，酸可切割连接体为肼。在一些实施方案中，可切割连接体为可还原的连接体。
在一些实施方案中，连接体包含马来酰亚胺基团。在一些情况下，马来酰亚胺基团也称为马来酰亚胺间隔物。在一些情况下，马来酰亚胺基团还包括形成马来酰亚胺基己酰基(mc)的己酸。在一些情况下，连接体包括马来酰亚胺基己酰基(mc)。在一些情况下，连接体为马来酰亚胺基己酰基(mc)。在其他情况下，马来酰亚胺基团包括马来酰亚胺甲基基团，诸如上述琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)或磺基琥珀酰胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)。
在一些实施方案中，马来酰亚胺基团是自稳定的马来酰亚胺。在一些情况下，自稳定的马来酰亚胺利用二氨基丙酸(DPR)并入与马来酰亚胺相邻的碱性氨基，以为硫代琥珀酰亚胺环水解提供分子内催化，从而通过逆迈克尔反应消除马来酰亚胺的消除反应。在一些情况下，自稳定的马来酰亚胺为Lyon等人,“Self-hydrolyzing maleimides improvethe stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates,”Nat.Biotechnol.32(10):1059-1062(2014)所述的马来酰亚胺基团。在一些情况下，连接体包括自稳定的马来酰亚胺。在一些情况下，连接体为自稳定的马来酰亚胺。
在一些情况下，连接体包含羰基或二羰基、肟基、羟胺基或其受保护形式中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或十种或更多种。TLR激动剂连接体衍生物或靶向域可以相同或不同，例如，衍生物中可以有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个不同的位点，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个不同的反应性基团。
如本文所述，本公开提供了偶联至具有式“靶向域-L-有效负荷”的另一分子的靶向域，其中L为连接基团或化学键。在一些实施方案中，L在体内是稳定的。在一些实施方案中，L在体内是可水解的。在一些实施方案中，L在体内是亚稳态的。
使用本领域技术人员已知的标准连接剂和程序，可以通过L将靶向域和有效负荷连接在一起。在一些方面，靶向域与有效负荷直接融合，并且L为键。在其他方面，靶向域和有效负荷通过连接基团L融合。例如，在一些实施方案中，靶向域和有效负荷经由肽键连接在一起，任选地通过肽或氨基酸间隔物连接在一起。在一些实施方案中，靶向域和有效负荷通过化学缀合连接在一起，任选地通过连接基团(L)连接在一起。在一些实施方案中，L直接缀合至靶向域和有效负荷中的每一个。
化学缀合可以通过使一种化合物的亲核反应性基团与另一化合物的亲电反应性基团反应而发生。在一些实施方案中，当L为键时，通过使靶向域上的亲核反应性部分与连接体上的亲电反应性部分反应，或通过使靶向域上的亲电反应性部分与有效负荷上的亲核反应性部分反应，使靶向域与有效负荷缀合。在实施方案中，当L为将靶向域和有效负荷连接在一起的基团时，靶向域和/或有效负荷可以通过使靶向域和/或有效负荷上的亲核反应性部分与L上的亲电反应性部分反应，或者通过使靶向域和/或有效负荷上的亲电反应性部分与L上的亲核反应性部分反应而与L缀合。亲核反应性基团的非限制性实例包括氨基、硫醇和羟基。亲电反应性基团的非限制性实例包括羧基、酰氯、酸酐、酯、琥珀酰亚胺酯、烷基卤化物、磺酸酯、马来酰亚胺基、卤代乙酰基和异氰酸酯。在通过羧酸与胺反应将靶向域和有效负荷缀合在一起的实施方案中，可以使用活化剂形成羧酸的活化酯。
羧酸的活化酯可以是，例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、甲苯磺酸酯(Tos)、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯、碳二亚胺或六氟磷酸酯。在一些实施方案中，碳二亚胺是1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)、1,1'-羰基二咪唑(CDI)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)或1,3-二异丙基碳二亚胺(DICD)。在一些实施方案中，六氟磷酸酯选自六氟磷酸酯苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)六氟磷酸鏻(BOP)、苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷六氟磷酸鏻(PyBOP)、2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和邻苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸酯(HBTU)。
在一些实施方案中，靶向域(例如，第一靶向域和第二靶向域)包含能够与有效负荷或L上的亲电反应性基团缀合的亲核反应性基团(例如，赖氨酸、半胱氨酸或丝氨酸的侧链的氨基、硫醇或羟基)。在一些实施方案中，靶向域包含能够与有效负荷或L上的亲核反应性基团缀合的亲电反应性基团(例如，Asp或Glu的侧链的羧酸酯基团)。在一些实施方案中，靶向域被化学修饰以包含能够直接与有效负荷或L缀合的反应性基团。在一些实施方案中，靶向域在N末端或C末端被修饰以包含具有亲核侧链的天然氨基酸。在示例性实施方案中，靶向域的N末端或C末端氨基酸选自赖氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和同型半胱氨酸。例如，靶向域的N末端或C末端氨基酸可以被修饰以包含赖氨酸残基。在一些实施方案中，靶向域在N末端或C末端氨基酸处被修饰，以包含具有亲电侧链的天然氨基酸，诸如例如Asp和Glu。在一些实施方案中，靶向域的内部氨基酸被具有亲核侧链的天然氨基酸替换，如本文前面所述。在示例性实施方案中，被替换的靶向域的内部氨基酸选自赖氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和同型半胱氨酸。例如，靶向域的内部氨基酸可以被赖氨酸残基替换。在一些实施方案中，靶向域的内部氨基酸被具有亲电侧链的天然氨基酸替换，诸如例如Asp和Glu。
在一些实施方案中，有效负荷包括能够直接缀合至靶向域或L的反应性基团。在一些实施方案中，有效负荷包含能够与靶向域或L上的亲电反应性基团缀合的亲核反应性基团(例如，胺、硫醇、羟基)。在一些实施方案中，有效负荷包含能够与靶向域或L上的亲核反应性基团缀合的亲电反应性基团(例如，羧基、羧基的活化形式、具有离去基团的化合物)。在一些实施方案中，有效负荷被化学修饰以包含能够与靶向域或L上的亲电反应性基团缀合的亲核反应性基团。在一些实施方案中，有效负荷被化学修饰以包含能够与靶向域或L上的亲核反应性基团缀合的亲电反应性基团。
在一些实施方案中，缀合可以通过有机硅烷进行，例如，用戊二醛处理的氨基硅烷、硅烷醇基团的羰基二咪唑(CDI)活化或利用树枝状大分子。多种树枝状大分子在本领域是已知的，并且包括聚(酰胺基胺)(PAMAM)树枝状大聚合物，其通过发散法从氨或乙二胺引发剂核心试剂开始合成；基于三氨基乙烯亚胺核心的PAMAM树枝状大分子的亚类；径向分层的聚(酰胺基胺-有机硅)树枝状大分子(PAMAMOS)，其为由亲水性、亲核性聚酰胺基胺(PAMAM)内部和疏水性有机硅(OS)外部组成的反向单分子胶束；聚(丙烯亚胺)(PPI)树枝状大分子，其通常是具有伯胺作为端基的聚烷基胺，而树枝状大分子内部由许多叔三丙烯胺组成；聚(丙烯胺)(POPAM)树枝状大分子；二氨基丁烷(DAB)树枝状大分子；两亲性树枝状大分子；胶束树枝状大分子，其为水溶性超支化聚亚苯基的单分子胶束；聚赖氨酸树枝状大分子；和基于聚苄基醚超支化骨架的树枝状大分子。
在一些实施方案中，共轭可以通过烯烃复分解进行。在一些实施方案中，有效负荷和靶向域、有效负荷和L或靶向域和L两者包含能够进行复分解的烯烃或炔烃部分。在一些实施方案中，使用合适的催化剂(例如，铜、钌)来加速复分解反应。本领域中描述了进行烯烃复分解反应的合适方法。参见例如，Schafmeister等人,J.Am.Chem.Soc.122:5891-5892(2000)，Walensky等人,Science 305:1466-1470(2004)和Blackwell等人,Angew,Chem.,Int.Ed.37:3281-3284(1998)。
在一些实施方案中，可以使用点击化学进行缀合。“点击反应”范围广，易于实施，仅使用容易获得的试剂，并且对氧气和水不敏感。在一些实施方案中，点击反应是炔基和叠氮基之间以形成三唑基的环加成反应。在一些实施方案中，点击反应使用铜或钌催化剂。本领域中描述了进行点击反应的合适方法。参见例如，Kolb等人,Drug Discovery Today 8:1128(2003)；Kolb等人,Angew.Chem.Int.Ed.40:2004(2001)；Rostovtsev等人,Angew.Chem.Int.Ed.41:2596(2002)；Tornoe等人,J.Org.Chem.67:3057(2002)；Manetsch等人,J.Am.Chem.Soc.126:12809(2004)；Lewis等人,Angew.Chem.Int.Ed.41:1053(2002)；Speers,J.Am.Chem.Soc.125:4686(2003)；Chan等人Org.Lett.6:2853(2004)；Zhang等人,J.Am.Chem.Soc.127:15998(2005)；和Waser等人,J.Am.Chem.Soc.127:8294(2005)。
也可考虑经由高亲和力特异性结合伴侣(例如，链霉抗生物素蛋白/生物素或抗生物素蛋白/生物素或凝集素/碳水化合物)进行间接缀合。
用于缀合的反应性残基
在一些实施方案中，靶向域和/或有效负荷被官能化，以包含具有有机衍生剂的亲核反应性基团或亲电反应性基团。这种衍生剂能够与靶向域上的靶向氨基酸和有效负荷上的官能团的选定的侧链或N或C末端残基反应。靶向域和/或有效负荷上的反应性基团包括，例如，醛、氨基、酯、硫醇、a-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基。衍生剂包括，例如，马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐或本领域已知的其他试剂。可选地，靶向域和/或有效负荷可以通过中间载体(诸如多糖或多肽载体)间接相互连接。多糖载体的实例包括氨基葡聚糖。合适的多肽载体的实例包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、其共聚物以及这些氨基酸和其他氨基酸(例如，丝氨酸)的混合聚合物，以赋予所得负载载体上所需的溶解度。
半胱氨酸残基最常见的是与a-卤代乙酸酯(和相应的胺)诸如氯乙酸或氯乙酰胺反应，得到羧甲基或羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酸残基也通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸酯、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑反应而衍生化。
组氨酸残基通过在pH 5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应衍生化，因为该试剂对组氨酰基侧链相对特异。对溴苯乙酰基溴也是有用的；反应优选在pH 6.0的0.1M二甲胂酸钠中进行。
赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸酐或其他羧酸酐反应。用这些试剂衍生化具有逆转赖氨酰残基电荷的效果。用于衍生含α-氨基的残基的其他合适试剂包括亚胺酯，诸如甲基吡啶亚胺甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氢化物、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2,4-戊二酮和转氨酶催化的与乙醛酸酯的反应。
精胺酰基残基通过与一种或多种常规试剂反应进行修饰，其中包括苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮。由于胍官能团的高pKa，精氨酸残基的衍生化需要在碱性条件下进行反应。此外，这些试剂可以与赖氨酸的基团以及精氨酸ε氨基反应。
可以对酪氨酰基残基进行特定的修饰，特别是通过与芳香重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记引入酪氨酰基残基。最常见的是，N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别用于形成O-乙酰基酪氨酰基物质和3-硝基衍生物。
羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R')反应被选择性地修饰，其中R和R'是不同的烷基，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰基和谷氨酰基残基通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。
其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structureand Molecular Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,pp.79-86(1983))、天冬酰胺或谷氨酰胺的去酰胺化、N-末端胺的乙酰化和/或C末端羧酸基团的酰胺化或酯化。
另一类型的共价修饰涉及将糖苷类化学地或酶促地偶联至肽。糖可以附接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基，诸如半胱氨酸的巯基，(d)游离羟基，诸如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基，(e)芳香族残基，诸如酪氨酸或色氨酸的残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法在WO1987/05330和Aplin和Wriston CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306页(1981)中有描述。
在一些实施方案中，L为键。在这些实施方案中，通过使靶向域上的亲核反应性部分与有效负荷上的亲电反应性部分反应，使靶向域和有效负荷缀合在一起。在可选实施方案中，通过使靶向域上的亲电反应性部分与有效负荷上的亲核部分反应，使靶向域和有效负荷缀合在一起。在示例性实施方案中，L为在靶向域上的胺(例如赖氨酸残基的ε-胺)与M上的羧基反应时形成的酰胺键。在可选实施方案中，靶向域和或有效负荷在缀合之前用衍生剂衍生化。
在一些实施方案中，L为连接基团。在一些实施方案中，L为双官能连接体，并且在与靶向域和有效负荷缀合之前仅包含两个反应性基团。在靶向域和有效负荷均具有亲电反应性基团的实施方案中，L在与靶向域和有效负荷缀合之前包含两个相同或两个不同的亲核基团(例如胺、羟基、硫醇)。在靶向域和有效负荷均具有亲核反应性基团的实施方案中，L在与靶向域和有效负荷缀合之前包含两个相同或两个不同的亲电基团(例如羧基、羧基的活化形式、具有离去基团的化合物)。在靶向域或有效负荷中的一个具有亲核反应性基团并且靶向域或有效负荷的另一个具有亲电反应性基团的实施方案中，L在与靶向域和有效负荷缀合之前包含一个亲核反应性基团和一个亲电基团。
L可以是具有能够与靶向域和有效负荷中的每一个反应的至少两个反应性基团的任何分子(在与靶向域和有效负荷缀合之前)。在一些实施方案中，L仅具有两个反应性基团并且是双官能的。L(在与肽缀合之前)可以由式VI：A-L-B表示，其中A和B独立地为亲核或亲电反应性基团。在一些实施方案中A和B均为亲核基团或均为亲电基团。在一些实施方案中A或B中的一个为亲核基团，而A或B的另一个为亲电基团。
在一些实施方案中，A和B可以包括适用于烯烃复分解反应的烯烃和/或炔烃官能团。在一些实施方案中，A和B包括适合点击化学的部分(例如烯烃、炔烃、腈、叠氮化物)。反应性基团(A和B)的其他非限制性实例包括吡啶基二巯基、芳基叠氮化物、二氮丙啶、碳二亚胺和酰肼。
在一些实施方案中，L为疏水的。疏水性连接体在本领域中是已知的。参见例如，Bioconjugate Techniques,G.T.Hermanson(Academic Press,San Diego,CA,1996)，其通过引用整体并入本文。本领域已知的合适的疏水性连接基团包括，例如，8-羟基辛酸和8-巯基辛酸。在与组合物的肽缀合之前，疏水性连接基团包含至少两个反应性基团(A和B)，如本文所述并且如下所示：A-(疏水性连接基团)-B。
在一些实施方案中，疏水性连接基团包括马来酰亚胺基或碘乙酰基，和羧酸或活化的羧酸(例如NHS酯)作为反应性基团。在这些实施方案中，马来酰亚胺基或碘乙酰基可以与靶向域或有效负荷上的硫醇部分偶联，并且羧酸或活化的羧酸可以在使用或不使用偶联试剂的情况下与靶向域或有效负荷上的胺偶联。本领域技术人员已知的任何偶联剂可用于将羧酸与游离胺偶联，诸如例如DCC、DIC、HATU、HBTU、TBTU和本文所述的其他活化剂。在具体实施方案中，亲水性连接基团包括2至100个亚甲基的脂肪族链，其中A和B为羧基或其衍生物(例如琥珀酸)。在其他具体实施方案中，L为碘乙酸。
在一些情况下，在与组合物的肽缀合之前，亲水性连接基团包括至少两个反应性基团(A和B)，如本文所述并且如下所示：A-(亲水性连接基团)-B。在具体实施方案中，连接基团为聚乙二醇(PEG)。在某些实施方案中，PEG的分子量为约100道尔顿至约10,000道尔顿，例如约500道尔顿至约5000道尔顿。在一些实施方案中，PEG的分子量为约10,000道尔顿至约40,000道尔顿。
在一些实施方案中，亲水性连接基团包括马来酰亚胺基或碘乙酰基，和羧酸或活化的羧酸(例如NHS酯)作为反应性基团。在这些实施方案中，马来酰亚胺基或碘乙酰基可以与靶向域或有效负荷上的巯基部分偶联，并且羧酸或活化的羧酸可以在使用或不使用偶联试剂的情况下与靶向域或有效负荷上的胺偶联。本领域技术人员已知的任何合适的偶联剂可用于将羧酸与胺偶联，诸如例如，DCC、DIC、HATU、HBTU、TBTU和本文所述的其他活化剂。在一些实施方案中，连接基团为马来酰亚胺基-聚合物(0.1-2.5kDa)-COOH、碘乙酰基-聚合物(0.1-2.5kDa)-COOH、马来酰亚胺基-聚合物(0.1-2.5kDa)-NHS或碘乙酰基-聚合物(0.1-2.50kDa)-NHS。
在一些实施方案中，连接基团由氨基酸、二肽、三肽或多肽组成，其中氨基酸、二肽、三肽、或多肽包含至少两个活化基团，如本文所述。在一些实施方案中，连接基团(L)包括选自氨基、醚、硫醚、马来酰亚胺、二硫化物、酰胺、酯、硫酯、烯烃、环烯烃、炔烃、三唑、氨基甲酸酯、碳酸酯、组织蛋白酶B可裂解物和腙的部分。
在一些实施方案中，L包含1至约60个、或1至30个或更长、2至5个、2至10个、5至10个或10至20个原子长的原子链。在一些实施方案中，链原子都是碳原子。在一些实施方案中，连接体的骨架中的链原子选自C、O、N和S。在一些情况下，链原子和连接体根据其预期的溶解度(亲水性)进行选择，以提供更易溶解的缀合物。在一些实施方案中，L提供了可被酶或其他催化剂或在靶组织或器官或细胞中发现的水解条件切割的官能团。在一些实施方案中，L的长度足以降低空间位阻的可能性。
在一些实施方案中，L在血液或血液组分等生物流体中是稳定的。在一些实施方案中，L在血清中稳定至少5分钟，例如，当在血清中孵育5分钟的时间段时，少于25％、20％、15％、10％或5％的缀合物被切割。在其他实施方案中，L在血清中稳定至少10、或20、或25、或30、或60、或90、或120分钟，或3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18或24小时。在这些实施方案中，L不包含能够在体内进行水解的官能团。在一些示例性实施方案中，L在血清中稳定至少约72小时。不能在体内进行显著水解的官能团的非限制性实例包括酰胺、醚和硫醚。
在一些实施方案中，L在体内是可水解的。在这些实施方案中，L包含能够在体内进行水解的官能团。能够在体内进行水解的官能团的非限制性实例包括酯、酸酐和硫酯。
在一些示例性实施方案中，L为不稳定的，并且在37℃的血浆中在3小时内进行大量水解，在6小时内完全水解。在一些示例性实施方案中，L不是不稳定的。
在一些实施方案中，L在体内是亚稳态的。在这些实施方案中，L包含能够在体内，任选在一段时间内被化学地或酶促地切割的官能团(例如，酸不稳定、还原不稳定或酶不稳定的官能团)。在这些实施方案中，L可以包括例如腙部分、二硫化物部分或组织蛋白酶可切割部分。当L是亚稳态的，并且不旨在受任何特定理论的约束，靶向域-L-M缀合物在细胞外环境中是稳定的，例如在上述时间段内在血清中是稳定的，但在细胞内环境或模拟细胞内环境的条件下是不稳定的，以便它在进入细胞时会裂解。在一些实施方案中，当L处于亚稳态时，L在血清中稳定至少约24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、42或48小时，例如至少约48、54、60、66或72小时，或约24-48、48-72、24-60、36-48、36-72或48-72小时。
在一些情况下，合适的聚合物骨架具有式X-聚合物-LY，其中聚合物为聚乙二醇，并且X为不与叠氮基团反应的官能团，并且Y为合适的离去基团。合适的官能团的实例包括但不限于羟基、受保护的羟基、缩醛、烯基、胺、氨基氧基、受保护的胺、受保护的酰肼、受保护的硫醇、羧酸、受保护的羧酸、马来酰亚胺、二硫代吡啶和乙烯基吡啶，以及酮。合适的离去基团的实例包括但不限于氯化物、溴化物、碘化物、甲磺酸酯、三氟乙基磺酸酯(tresylate)和甲苯磺酸酯。
连接体可以具有宽范围的分子量或分子长度。较大或较小的分子量的连接体可用于在靶向域和连接的实体之间或连接的实体和其结合伴侣之间(如果有的话)提供所需的空间关系或构象。具有较长或较短分子长度的连接体也可用于在靶向域和连接的实体之间，或在连接的实体和其结合伴侣之间提供所需的空间或柔性。
在一些实施方案中，连接体包括水溶性双官能连接体，其具有哑铃结构，包括：a)叠氮化物、炔烃、肼、酰肼、羟胺或聚合物骨架的至少第一端上的含羰基部分；和b)在聚合物骨架的第二端上的至少第二官能团。第二官能团可以与第一官能团相同或不同。在一些实施方案中，第二官能团不与第一官能团反应。在一些实施方案中，水溶性化合物包含支链分子结构的至少一个臂。例如，支链分子结构可以是树枝状的。
在示例性实施方案中，聚合物通过连接体连接至靶向域或修饰的靶向域。例如，连接体可以包含一个或两个氨基酸，其一端与聚合物结合，诸如白蛋白结合部分，并且另一端与多肽骨架上的任何可用位置结合。另外的示例性连接体包括亲水性连接体，诸如包含至少5个非氢原子的化学部分，其中这些的30-50％为N或O。
任选地，多个靶向域或修饰的靶向域分子可以通过连接体多肽连接，其中所述连接体多肽的长度任选地为1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12个氨基酸，并且更长，其中任选地，一个靶向域的N末端融合至连接体多肽的C末端，并且连接体多肽的N末端与另一靶向域的N末端融合。
本文使用的术语“亲电基团”、“亲电体”等是指可以接受电子对以形成共价键的原子或原子组。本文使用的“亲电基团”包括但不限于卤化物、羰基和含环氧化物的化合物。常见的亲电体包括卤化物，诸如硫光气、二氯甘油、邻苯二甲酰氯、琥珀酰氯、氯乙酰氯、氯琥珀酰氯等；酮类，诸如氯丙酮、溴丙酮等；醛，诸如乙二醛等；异氰酸酯，诸如六亚甲基二异氰酸酯、甲苯二异氰酸酯、间苯二甲基异氰酸酯、环己基甲烷-4,4-二异氰酸酯，以及这些化合物的衍生物。
本文使用的术语“亲核基团”、“亲核体”等是指具有能够形成共价键的电子对的原子或原子组。这种类型的基团可以是可电离的基团，它们作为阴离子基团反应。本文使用的“亲核基团”包括但不限于羟基、伯胺、仲胺、叔胺和硫醇。
一般来说，碳亲电体容易受到互补亲核体的攻击，包括碳亲核体，其中攻击的亲核体给碳亲电体带来电子对，以便在亲核体和碳亲电体之间形成新的键。
碳亲核体的非限制性实例包括但不限于烷基、烯基、芳基和炔基格氏试剂、有机锂、有机锌、烷基锡试剂、烯基锡试剂、芳基锡试剂和炔基锡试剂(有机锡)、烷基硼烷试剂、烯基硼烷试剂、芳基硼烷试剂和炔基硼烷试剂(有机硼烷和有机硼酸酯)；这些碳亲核体具有在水或极性有机溶剂中动力学稳定的优点。碳亲核体的其他非限制性实例包括磷叶立德、烯醇和烯醇化物试剂；这些碳亲核体具有相对容易由合成有机化学领域技术人员熟知的前体生成的优点。当碳亲核体与碳亲电体结合使用时，会在碳亲核体和亲电体之间产生新的碳-碳键。
适合用于偶联至碳亲电体的非碳亲核体的非限制性实例包括但不限于伯胺和仲胺、硫醇、硫醇盐和硫醚、醇、醇盐、叠氮化物、氨基脲等。当与碳亲电体结合使用时，这些非碳亲核体通常会产生杂原子键(C-X-C)，其中X为杂原子，包括但不限于氧、硫或氮。
在一些情况下，本文使用的聚合物在一端终止于羟基或甲氧基，即X为H或CH3(“甲氧基PEG”)。可选地，聚合物可以以反应性基团终止，从而形成双官能聚合物。典型的反应性基团可以包括通常用于与20种常见氨基酸中发现的官能团反应的那些反应性基团(包括但不限于马来酰亚胺基团、活化的碳酸酯(包括但不仅限于对硝基苯酯)、活化的酯(包括但不仅限于N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)，以及对20种常见的氨基酸惰性但与互补官能团特异性反应的官能团(包括但并不限于叠氮化物基团、炔烃基团)。值得注意的是，聚合物的另一端(在上式中用Y表示)将经由氨基酸直接或间接附接至靶向域。例如，Y为与多肽的胺基(包括但不限于赖氨酸的ε胺或N末端)连接的酰胺、氨基甲酸酯或脲。可选地，Y为与硫醇基团(包括但不限于半胱氨酸的硫醇基团)连接的马来酰亚胺。可选地，聚合物上的炔基可以与靶向域中存在的叠氮化物基团反应以形成类似的产物。在一些实施方案中，强亲核体(包括但不限于肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可以与靶向域中存在的醛或酮基团反应，形成腙、肟或缩氨基脲(如适用)，在一些情况下，其可以通过用适当的还原剂处理被进一步还原。可选地，强亲核体可以经由氨基酸被并入靶向域，并用于优先与水溶性聚合物中存在的酮或醛基团反应。
聚合物的任何分子质量都可以根据实际需要使用，包括但不限于约0.1道尔顿(Da)至2,500Da或更高。聚合物的分子量可以是宽范围的，包括但不限于在约100Da和约5000Da之间或更大。在一些情况下，聚合物为50-5000Da、50-3000Da、50-2500Da、100-2500Da、250-2500Da、250-5000Da或500-5000Da。支链聚合物，包括但不限于每条链的分子量范围为0.1-5kDa、0.1-4kDa、0.1-3kDa、0.1-2.5kDa、0.1-1.5kDa的聚合物分子。
聚合物可以包括含叠氮化物和乙炔的聚合物衍生物，其包含平均分子量为约800Da至约100,000Da的水溶性聚合物骨架。水溶性聚合物的聚合物骨架可以为聚(乙二醇)。然而，应当理解，各种各样的水溶性聚合物，包括但不限于聚(乙二醇)和其他相关聚合物，包括聚(葡聚糖)和聚(丙二醇)，也是水溶性的，并且术语PEG或聚(乙二醇)的使用旨在涵盖和包括所有这种分子。术语PEG包括但不限于其任何形式的聚(乙二醇)，包括双官能PEG、多臂PEG、衍生化PEG、分叉PEG、支链PEG、悬垂PEG(即具有一个或多个悬垂于聚合物骨架的官能团的PEG或相关聚合物)，或其中具有可降解键的PEG。
除了这些形式的聚合物外，聚合物还可以在骨架中制备有弱或可降解的键。例如，聚合物可以在聚合物骨架中制备有酯键，其进行水解。如下所示，这种水解导致聚合物裂解成较低分子量的片段：-聚合物-CO2-聚合物-+H2Oà聚合物-CO2H+HO-聚合物-。
连接体可以包括聚合物，诸如包含水溶性骨架的那些。在一些实施方案中，水溶性的聚合物骨架包含2至约300个末端。合适的聚合物的实例包括但不限于其他聚(亚烷基二醇)，诸如聚(丙二醇)(“PPG”)、其共聚物(包括但不限于乙二醇和丙二醇的共聚物)、其三元共聚物、其混合物等。虽然聚合物骨架的每条链的分子量可以变化，但其通常在约800Da至约100,000Da的范围内，通常在约6,000Da至约80,000Da的范围内。聚合物骨架的每条链的分子量可在约100Da和约100,000Da之间，包括但不限于100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施方案中，聚合物骨架的每条链的分子量在约100Da和约50,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物骨架的每条链的分子量在约100Da和约40,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物骨架的每条链的分子量在约1,000Da和约40,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物骨架的每条链的分子量在约5,000Da和约40,000Da之间。在一些实施方案中，聚合物骨架的每条链的分子量在约10,000Da和约40,000Da之间。
适当的生理上可切割的键包括但不限于酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、磷酸酯、酰氧基烷基醚、缩醛和缩酮。此类缀合物应具有生理上可切割的键，其在储存和施用时是稳定的。例如，与聚合物连接的靶向域或修饰的靶向域应在制造最终药物组合物时、在适当的递送媒介物中溶解时(如果使用的话)以及在无论何种途径施用时保持其完整性。
本发明还包括US2017/0182181中公开的具有可调稳定性的基于磷酸的连接体，用于药物缀合物的细胞内递送，该专利通过引用并入本文。基于磷酸的连接体包括共价地连接至连接体臂的远端的单磷酸、二磷酸、三磷酸或四磷酸基团(磷酸基团)，连接臂从远端到近端方向包括可调节元件、任选的间隔物元件和反应性官能团。基于磷酸的连接体的磷酸基团能够与有效负荷缀合，并且反应性官能团能够与细胞特异性靶向配体(诸如抗体)缀合。基于磷酸的连接体的一般结构为：磷酸基团-可调节元件-任选的间隔物元件-功能性反应性基团。缀合至有效负荷的基于磷酸的连接体具有一般结构：有效负荷-磷酸基团-可调节元件-任选的间隔物元件-功能性反应性基团，并且当与靶向配体缀合时具有一般结构：有效负荷-磷酸基团-可调节元件-任选的间隔物元件-靶向配体。这些基于磷酸的连接体在血液中与细胞内环境(如溶酶体隔室)中具有分化的和可调节的稳定性。磷酸基团在细胞内环境中裂解以释放天然或活性形式的有效负荷的速率可能受到可调节元件的结构的影响，进一步的影响由磷酸基团的取代以及磷酸基团是单磷酸、二磷酸、三磷酸还是四磷酸介导。此外，这些基于磷酸的连接体提供了构建缀合物的能力，诸如抗体-药物缀合物，其中与使用本文公开的非基于磷酸的连接体将相同有效负荷缀合至抗体或靶向配体的缀合物相比，缀合物形成聚集体的倾向降低。
在一些情况下，靶向域经由本文所述的方法经由水溶性聚合物与有效负荷连接。在一些实施方案中，该方法包括使包含反应性氨基酸侧链的分离的靶向域与连接体接触。在一些情况下，通过使靶向域上存在的官能团与连接体上存在的反应性基团反应来合成缀合物。在一些情况下，通过使连接体上存在的官能团与有效负荷上存在的反应性基团反应来合成缀合物。在一些情况下，有效负荷-连接体部分缀合至靶向域。在一些情况下，靶向域-连接体部分缀合至有效负荷。在一些实施方案中，靶向域连接至包含水溶性聚合物的连接体。
在其他实施方案中，靶向域经由连接体与有效负荷缀合。在一些情况下，连接体包括聚合物。在一些实施方案中，靶向域直接或间接与连接体、聚合物或生物活性分子缀合。在一些实施方案中，连接体是可切割或不可切割连接体。
在一些实施方案中，连接体为0.1kDa至5kDa。在其他实施方案中，连接体为0.1kDa至2.5kDa。在其他实施方案中，连接体或聚合物为线性、支链、多聚体或树枝状大分子。在另一实施方案中，连接体或聚合物为双官能或多官能连接体或双官能或多官能聚合物。
在其他实施方案中，聚合物为水溶性聚合物。在其他实施方案中，水溶性聚合物为聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，PEG的分子量在0.1kDa和10kDa之间。在其他实施方案中，PEG的分子量在0.1kDa和5kDa之间。在其他实施方案中，PEG的分子量在0.1kDa和4kDa之间。在其他实施方案中，PEG的分子量在0.1kDa和3kDa之间。在其他实施方案中，PEG的分子量在0.1kDa和2kDa之间。在其他实施方案中，PEG的分子量在0.1kDa和2.5kDa之间。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子的分子量为约0.1kDa至约10kDa。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子的分子量为0.1kDa至50kDa。在一些实施方案中，聚(乙二醇)的分子量为0.1kDa至2.5kDa，或0.2至2.2kDa，或在0.5kDa和2kDa之间。例如，在一些情况下，聚(乙二醇)聚合物的分子量为约0.5kDa、或约1kDa、或约2kDa或约2.5kDa。例如，在一些情况下，聚(乙二醇)聚合物的分子量为0.1kDa或0.5kDa或1kDa或2.5kDa。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子为支链PEG。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子为支链1K PEG。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子为支链2.5K PEG。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子为支链5K PEG。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子为线性PEG。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子为线性2.5K PEG。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子为线性10K PEG。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子为线性2K PEG。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子为线性0.5K PEG。在一些实施方案中，聚(乙二醇)聚合物的分子量为平均分子量。在某些实施方案中，平均分子量为数均分子量(Mn)。平均分子量可以使用GPC或SEC、SDS-PAGE分析、RP-HPLC、质谱或毛细管电泳来测定或测量。
治疗方法
本文所述的缀合物可用于治疗病况和/或疾病。在一些情况下，疾病包括增殖性疾病。在一些情况下，增殖性疾病包括癌症。在一些情况下，癌症包括一种或多种肿瘤。在一些情况下，癌症包括实体或液体肿瘤。在一些情况下，施用缀合物以杀死快速分裂细胞(诸如肿瘤细胞)或抑制快速分裂细胞的生长。在一些情况下，治疗有需要的对象的增殖性疾病或病况的方法包括向对象施用治疗有效量的本文所述的缀合物。在一些实施方案中，增殖性疾病或病况是癌症。在一些实施方案中，癌症是实体肿瘤癌症。在一些实施方案中，实体肿瘤癌症是膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、结直肠癌、食管癌、眼癌、头颈部癌、肾癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。在一些情况下，疾病包括PCa(前列腺癌)、CRPCa(去势抵抗性前列腺癌)、实体瘤(新血管系统)、NSCLC(非小细胞肺癌)、HNSCC(头颈部鳞状细胞癌)、ESCC(食管癌)、GC(胃癌)、CRC(结直肠癌)、SCLC(小细胞肺癌)、MPM(间皮瘤)、PDAC(导管胰腺腺癌)、ALL(急性成淋巴细胞性白血病)、AML(急性髓系白血病)、MDS(骨髓增生异常综合征)、MSI-高肿瘤、黑色素瘤、DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、BrCa(乳腺癌)、TNBC(三阴性乳腺癌)、NE-PCa(神经内分泌前列腺癌)、GBM(胶质母细胞瘤)和RCC(肾细胞癌)。
在一些情况下，本文靶向的肿瘤细胞过表达一个或多个靶标。在一些情况下，靶标包括表面标志物或受体。在一些情况下，靶标选自PSMA、EGFR、EGFRviii、MSLN、CEA、DLL3、FAP、CD33、HER3、PD-L1、EphA2、EphA4、HER2、SIRPa、DLK1、Muc16、LRP5、LRP6、endo180、LIV-1、SLAMF7、PTK7、GPR20、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3 rec、NaPi2b、CD16、GCC、SSTR2、CAIX、CAXII、MC1R、CXCR4、B1R、GRPR、STEAP1、CD70、CD46、CD166、CLL-1、ADAM9、cKIT、CD36、CD73、ITGaVb3、ITGaVb6、GPC-1、CD38、CD51、FGFR3、Ly6E、CD44v6、ENPP3、CXCR3、CXCR5、FcRH5、VEGF、VEGFR2、CD45、CCR4、CD25、5T4、ROR1、TROP-2、NECTIN4、cMET、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CD79b、AXL、RON、B7-H3、B7-H4、KAAG1、Muc1、ADAM-9、GPNMB、EDB纤连蛋白、组织因子、GPNMB、FolRa、ALPP、ALPPL2、MT1-MMP、CLDN18.2、CLDN6、CLDN9、p钙黏着蛋白、CEACAM6、CD47和EpCAM中的一种或多种。在一些情况下，靶标选自PSMA、EGFR、EGFRviii、MSLN、CEA、DLL3、FAP、CD33、HER3、PD-L1、EphA2、EphA4、HER2、SIRPa、DLK1、Muc16、LRP5、LRP6、endo180、LIV-1、SLAMF7、PTK7、GPR20、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3rec、NaPi2b、CD16、GCC、SSTR2、CAIX、CAXII、MC1R、CXCR4、B1R、GRPR、STEAP1、CD70、CD46、CD166、CLL-1、ADAM9、cKIT、CD36、CD73、ITGaVb3、ITGaVb6、GPC-1、CD38、CD51、FGFR3、Ly6E、CD44v6、ENPP3、CXCR3、CXCR5、FcRH5、VEGF、VEGFR2、CD45、CCR4、CD25、5T4、ROR1、TROP-2、NECTIN4、cMET、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CD79b、AXL、RON、B7-H3、B7-H4、KAAG1、Muc1、ADAM-9、GPNMB、EDB纤连蛋白、组织因子、GPNMB、FolRa、ALPP、ALPPL2、MT1-MMP、CLDN18.2、CLDN6、CLDN9、p钙黏着蛋白、CEACAM6、CD47和EpCAM中的两种或更多种。在一些情况下，当缀合物结合至肿瘤细胞上的一个或多个靶标并且有效负荷杀死肿瘤细胞、抑制或减缓肿瘤细胞的生长时，缀合物会将有效负荷带到肿瘤细胞。
在一些情况下，施用本文的缀合物用于对特定细胞或细胞群进行成像。在一些情况下，细胞或细胞群为肿瘤细胞，或存在于肿瘤微环境中。在一些情况下，当缀合物结合至肿瘤细胞上的一个或多个靶标并且有效负荷为显像剂(诸如视觉染料或放射性标记)时，缀合物会给肿瘤细胞带来有效负荷，并且由于缀合物与肿瘤细胞的结合，肿瘤细胞被成像。
药物组合物以适合待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的适当剂量、适当持续时间和频率将由患者的病况、患者疾病的类型和严重程度、活性成分的特定形式以及施用方法等因素决定。一般来说，适当的剂量和治疗方案以足以提供治疗和/或预防益处(例如，改善的临床结果)，或减轻症状严重程度的量提供组合物。最佳剂量通常使用实验模型和/或临床试验来确定。最佳剂量取决于患者的身体质量、重量或血容量。
在一个实施方案中，本文所述的可注射药物组合物用于制备治疗哺乳动物中疾病或病况的药物，这些疾病或病况将受益于所公开的缀合物的任何一种可注射药物组合的施用。在需要这种治疗的哺乳动物中治疗本文所述的任何疾病或病况的方法涉及向所述哺乳动物施用药物组合物，所述药物组合物以治疗有效量包含至少一种本文所述的化合物或其药学上可接受的盐、活性代谢物、前药或药学上可接受的溶剂化物。
在某些实施方案中，施用含有本文所述的化合物的组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在某些治疗性应用中，组合物以足以治愈或至少部分缓解疾病或病况的至少一种症状的量施用给已经患有该疾病或病况的患者。这种用法的有效量取决于疾病或病况的严重程度和病程、之前的治疗、患者的健康状况、体重和对药物的反应，以及主治医生的判断。治疗有效量可选地通过包括但不限于剂量递增和/或剂量范围临床试验的方法确定。
在预防性应用中，将含有本文所述的化合物的组合物施用于易感于特定疾病、病症或病况或处于特定疾病、病症或病况的风险中的患者。这样的量被定义为“预防有效量或剂量”。在这种使用中，精确的量也取决于患者的健康状况、体重等。当用于患者时，这种使用的有效量将取决于疾病、病症或病况的严重程度和病程、之前的治疗、患者的健康状况和对药物的反应以及主治医生的判断。在一个方面，预防性治疗包括向哺乳动物施用包含本文所述的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，以防止疾病或病况的症状的复发，其中该哺乳动物先前经历过所治疗疾病的至少一种症状，并且目前处于缓解期。
在某些实施方案中，化合物的施用为长期施用，即持续延长的时间段，包括贯穿患者生命的持续时间，以改善或以其他方式控制或限制患者疾病或病况的症状。
制造方法
本文所述的缀合物可以使用体内或体外方法或方法的组合来合成。在一些情况下，方法为体内方法。在一些情况下，方法为体外方法。在一些情况下，体内合成包含非天然氨基酸的靶向域，并使用体外化学方法附接有效负荷。
在一些情况下，方法为离体方法。在一些情况下，重组生产或化学合成本文所述的包含天然氨基酸突变或非天然氨基酸突变的缀合物。在一些情况下，本文所述的靶向域是重组产生的，例如通过宿主细胞系统或无细胞系统。
一般来说，制备包含非标准氨基酸的靶多肽的方法是已知的。在一些情况下，与非天然氨基酸同源的氨基酰基tRNA合成酶/tRNA对与使用它的细胞的细胞成分正交。外源性氨基酰基tRNA合成酶/tRNA对的正交性(并且因此适合性)取决于宿主生物的类型。已经开发了四种主要的正交氨基酰基tRNA合成酶用于遗传密码扩展：詹氏甲烷球菌(Methanococcus janaschii)酪氨酰-tRNA合成酶(MjTyrRS)/tRANCUA对、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)酪氨酰-tRNA合成酶(EcTyrRS)/tRANCUA对、大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶(EcLeuRS)/tRNACUA对和来自某些甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)/tRANCUA对。PylRS/tRANCUA对在细菌、真核细胞和动物中是正交的(参见，例如，Chin,Jason W."Expanding and reprogramming the genetic code of cells andanimals."Annual review of biochemistry 83(2014):379-408)。
在一些情况下，使用吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNApyl)并入本文提供的非天然氨基酸(UAA)。非天然氨基酸(UAA)被引入转移RNA分子(tRNA)上，使其可用于翻译。然而，非天然氨基酸与tRNA的附接不一定是由天然存在的氨基酰基-tRNA合成酶完成的。因此，工程化氨基酰基tRNA合成酶诸如从生成的tRNApyl突变体文库中制备和选择的工程化tRNApyl可用于将所需的UAA附接至tRNA，从而可以将所需UAA以诱变并入。
在一些实施方案中，可以使用能够附接这种UAA的工程化突变tRNApyl变体将本文提供的UAA(例如，式(IA)的UAA)附接至tRNA。在一些实施方案中，突变tRNApyl变体引入一个氨基酸突变(即，并入UAA)。在其他实施方案中，突变tRNApyl变体引入了多个氨基酸突变。在一些实施方案中，本领域技术人员制备并筛选tRNApyl变体的文库，以选择合适的tRNApyl变体用于附接所需的UAA。在一些实施方案中，用于在本文提供的缀合物中引入UAA的tRNApyl变体为US 8,735,093、US 9,133,449、WO2020206341中描述的tRNApyl变体，其中每一个都通过引用并入本文。
在各种实施方案中，可以使用突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶。突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶可以衍生自巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)、肠甲烷八叠球菌(Methanosarcina alvus)或詹氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina jannaschii)的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，或是其变体，或是其嵌合体。
在一些实施方案中，本文提供的突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶在突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的底物结合位点内包含至少5个氨基酸残基替换。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶在SEQ ID NO:90的氨基酸序列中包含至少5个氨基酸残基替换。在一些实施方案中，底物结合位点包括SEQ ID NO:90的氨基酸序列中阐述的302位丙氨酸、305位亮氨酸、306位酪氨酸、309位亮氨酸、322位异亮氨酸、346位天冬酰胺、348位半胱氨酸、384位酪氨酸、401位缬氨酸和417位色氨酸残基。在一些实施方案中，至少5个氨基酸残基替换选自SEQ ID NO:90的氨基酸序列中阐述的302位丙氨酸替换、346位天冬酰胺替换、348位半胱氨酸替换、384位酪氨酸替换和417位色氨酸替换。在一些实施方案中，至少5个氨基酸残基替换为SEQ ID NO:90的氨基酸序列中阐述的302位丙氨酸替换为异亮氨酸、346位天冬酰胺替换为苏氨酸、348位半胱氨酸替换为异亮氨酸、384位酪氨酸替换为亮氨酸和417位色氨酸替换为赖氨酸。
在一些实施方案中，本文提供的突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:84具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:84具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:84具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:84具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:84具有至少91％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:84具有至少92％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ IDNO:84具有至少93％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:84具有至少94％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:84具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:84具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:84具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:84具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:84具有至少99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:87具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:87具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:87具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:87具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:87具有至少91％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:87具有至少92％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ IDNO:87具有至少93％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:87具有至少94％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:87具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:87具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:87具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:87具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:87具有至少99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由SEQ ID NO:85的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由包含SEQ ID NO:85序列的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:85具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ IDNO:85具有至少80％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:85具有至少85％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:85具有至少90％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:85具有至少91％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:85具有至少92％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:85具有至少93％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:85具有至少94％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:85具有至少95％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:85具有至少96％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:85具有至少97％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:85具有至少98％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:85具有至少99％同一性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，本文提供的突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由SEQ ID NO:88的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由包含SEQ ID NO:88序列的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:88具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ IDNO:88具有至少80％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:88具有至少85％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:88具有至少90％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:88具有至少91％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:88具有至少92％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:88具有至少93％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:88具有至少94％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:88具有至少95％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:88具有至少96％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:88具有至少97％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:88具有至少98％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:88具有至少99％同一性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，本文提供的突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:92具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:92具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:92具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:92具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:92具有至少91％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:92具有至少92％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ IDNO:92具有至少93％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:92具有至少94％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:92具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:92具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:92具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:92具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶具有与SEQ ID NO:87具有至少99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由SEQ ID NO:91的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由包含SEQ ID NO:91序列的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:91具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ IDNO:91具有至少80％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:91具有至少85％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:91具有至少90％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:91具有至少91％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:91具有至少92％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:91具有至少93％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:91具有至少94％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:91具有至少95％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:91具有至少96％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:91具有至少97％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:91具有至少98％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶由与SEQ ID NO:91具有至少99％同一性的核酸序列编码。
在一些情况下，与本文的突变的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶相关的序列在表1B中。
表1B
在一些情况下，靶向域由宿主细胞系统重组产生。在一些情况下，宿主细胞是真核细胞(例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或植物细胞)或原核细胞(如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌)。在一些情况下，真核宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。在一些情况下，哺乳动物宿主细胞是稳定的细胞系，或者是将感兴趣的遗传物质并入其自身基因组并能够在多代细胞分裂后表达该遗传物质的产物的细胞系。在其他情况下，哺乳动物宿主细胞是瞬时细胞系，或者是将感兴趣的遗传物质并入其自身基因组并且在多代细胞分裂后没有表达遗传物质产物的能力的细胞系。
示例性哺乳动物宿主细胞包括293T细胞系、293A细胞系、293FT细胞系、293F细胞、293H细胞、A549细胞、MDCK细胞、CHO DG44细胞、CHO-S细胞、CHO-K1细胞、Expi293F cellTM细胞、Flp-InTMT-RExTM293细胞系、Flp-InTM-293细胞系、Flp-InTM-3T3细胞系、Flp-InTMBHK细胞系、Flp-InTM-CHO细胞系、Flp-InTM-CV-1细胞系、Flp-InTMThe Jurkat细胞系、FreeStyleTM293-F细胞、FreeStyleTMCHO-S细胞、GripTiteTM293MSR细胞系、GS-CHO细胞系、HepargTM细胞、T-RExTMJurkat细胞系、Per.C6细胞、T-RExTM-293细胞系、T-RExTM-CHO细胞系和T-RExTMHeLa细胞系。
在一些实施方案中，真核宿主细胞是昆虫宿主细胞。示例性昆虫宿主细胞包括果蝇(Drosophila)S2细胞、Sf9细胞、Sf21细胞和Cellular High FiveTM细胞。
在一些实施方案中，真核宿主细胞是酵母宿主细胞。示例性酵母宿主细胞包括毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株，诸如GS115、KM71H、SMD1168H和X-33，以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株，诸如INVSCl。
在一些实施方案中，真核宿主细胞是植物宿主细胞。在一些情况下，植物细胞包括来自藻类的细胞。示例性植物细胞系包括来自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)137c或细长聚球藻(Synechococcus elongatus)PPC 7942的菌株。
在一些实施方案中，宿主细胞是原核宿主细胞。示例性原核宿主细胞包括BL21、BL21(DE3)、Mach1TM、DH10BTM、TOP10、DH5α、DH10BacTM、OmniMaxTM、MegaXTM、DH12STM、INV110、TOP10F’、INVαF、TOP10/P3、ccdB存活、PIR1、PIR2、Stbl2TM、Stbl3TM或Stbl4TM。
在一些情况下，用于产生本文所述的靶向域的合适的核酸分子或载体包括衍生自真核或原核来源的任何合适的载体。示例性核酸分子或载体包括来自细菌(例如，大肠杆菌)、昆虫、酵母(例如毕赤酵母)、藻类或哺乳动物来源的载体。细菌载体包括，例如，pACYC177、pASK75、pBAD系列载体、pBADM系列载体、pET系列载体、pETM系列载体、pGEX系列载体、pHAT2、pMal-C2、pMal-p2、pQE系列载体、pRSET A、pRSET B、pRSET C、pTrcHis2系列、pZA31-Luc、pZE21-MCS-1、pFLAG ATS、pFLAG CTS、pFLAG MAC、pFLAG Shift-12C、pTAC-MAT-1、pFLAG CTC或pTAC-MAT-2。
昆虫载体包括，例如，pFastBac1、pFastBac DUAL、pFastBac ET、pFastBac HTa、pFastBac HTb、pFastBac HTc、pFastBac M30a、pFastBac M30b、pFastBac、M30c、pVL1392、pVL1393M 10、pVL1393M11、pVL1393M 12、FLAG载体诸如pPolh-FLAG1或pPolh-MAT2或MAT载体诸如pPolh-MAT1或pPolh-MAT 2。
酵母载体包括，例如，pDESTTM14载体、pDESTTM15载体、pDESTTM17载体、pDESTTM24载体、pYES-DEST52载体、pBAD-DEST49Target载体、pAO815毕赤酵母载体、pFLD1毕赤酵母载体、pGAPZA、毕赤酵母C载体、毕赤酵母pPIC3.5K载体、pPIC 6A、B和毕赤酵母C载体、pPIC9K载体、pTEF1/Zeo、pYES2酵母载体、pYES2/CT酵母载体、pYES2/NT A、B和C酵母亲本或pYES3/CT酵母载体。
藻类载体包括，例如，pChlamy-4载体或MCS载体。
哺乳动物载体包括，例如，瞬时表达载体或稳定表达载体。示例性哺乳动物瞬时表达载体包括p3xFLAG-CMV 8、pFLAG-Myc-CMV19、pFLAG-Myc-CMV 23、pFLAG-CMV 2、pFLAG-CMV 6a、b、c、pFLAG-CMV 5.1、pFLAG-CMV 5a、b、c、p3xFLAG-CMV 7.1、pF-CMV 20、p3xFLAG-Myc-CMV 24、pCMV-FLAG-MAT1、pCMV-FLAG-MAT2、pBICEP-CMV 3或pBICCMV-4。示例性哺乳动物稳定表达载体包括pFLAG-CMV 3、p3xFLAG-CMV 9、p3xFLAG-CMV 13、pFLAG-Myc-CMV 21、p3xFLAG-Myc-CMV 25、pFLAG-CMV 4、p3xFLAG-CMV 10、p3xFLAG-CMV14、pFLAG-Myc-CMV 22、p3xFLAG-Myc-CMV 26、pBICEP-CMV 1或pBICEP-CMV 2。在一些情况下，使用无细胞系统产生本文所述的靶向域。在一些情况下，无细胞系统包括来自细胞的细胞质和/或核组分的混合物，并且适用于体外核酸合成。在一些情况下，无细胞系统利用原核细胞组分。在其他情况下，无细胞系统利用真核细胞组分。核酸合成是在基于例如果蝇细胞、爪蟾(Xenopus)卵、古生菌或HeLa细胞的无细胞系统中实现的。示例性无细胞系统包括大肠杆菌S30提取物系统、大肠杆菌T7S 30系统或XpressCF和XpressCF+。
无细胞翻译系统不同地包括成分，诸如质粒、mRNA、DNA、tRNA、合成酶、释放因子、核糖体、分子伴侣、翻译起始和延长因子、天然和/或非天然氨基酸和/或用于蛋白质表达的其他组分。这些组分任选地被修饰以提高收率、增加合成速率、增加蛋白质产物的保真度或并入非天然氨基酸。在一些实施方案中，本文所述的含有非天然氨基酸的靶向域是使用US8,778,631、US2017/0283469、US2018/0051065、US 2014/0315245或US 8,778,631中描述的无细胞翻译系统合成的。在一些实施方案中，无细胞翻译系统包括修饰的释放因子，或者甚至从系统中去除一个或多个释放因子。在一些实施方案中，无细胞翻译系统包括降低的蛋白酶浓度。在一些实施方案中，无细胞翻译系统包括具有编码非天然氨基酸的重新分配密码子的修饰的tRNA。在一些实施方案中，本文所述的用于并入非天然氨基酸的合成酶用于无细胞翻译系统。在一些实施方案中，在将tRNA添加到无细胞翻译系统之前，使用酶促或化学过程用非天然氨基酸预装载tRNA。在一些实施方案中，用于无细胞翻译系统的组分从修饰的生物体获得，诸如修饰的细菌、酵母或其他生物体。
在一些实施方案中，靶向域经由表达宿主系统或由无细胞系统以圆形排列产生。
正交或扩增的遗传密码可用于生成本文所述的靶向域，其中靶向域的核酸序列中存在的一个或多个特定密码子被分配来编码非天然氨基酸，使得可以通过使用正交tRNA合成酶/tRNA对将其遗传并入缀合物(例如，靶向域)。正交tRNA合成酶/tRNA对能够用非天然氨基酸装载tRNA，并且能够响应密码子将非天然氨基酸并入多肽链。
在一些情况下，密码子是琥珀密码子、赭石密码子、乳白密码子或四联密码子。在一些情况下，密码子对应于将用于携带非天然氨基酸的正交tRNA。在一些情况下，密码子是琥珀密码子。在其他情况下，密码子是正交密码子。
在一些情况下，密码子是四联密码子，其可以通过正交核糖体核糖-Q1解码。在一些情况下，四联密码子如Neumann等人,"Encoding multiple unnatural amino acidanalysis of a quadruplet-decoding ribosome,"Nature,464(7287):441-444(2010)中所描述。
在一些情况下，本公开中使用的密码子是重新编码的密码子，例如，被替换密码子替换的同义密码子或罕见密码子。在一些情况下，重新编码的密码子如Napolitano等人,"Emergent rules for codon choice isolated by editing of a ray array code inEscherichia coli,"PNAS,113(38):E5588-5597(2016)中所描述。在一些情况下，重新编码的密码子如Ostrov等人,"Design,synthesis,and testing translated a 57-codegene,"Science 353(6301):819.sub.822(2016)中所描述。
定义
术语“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的氨基酸，例如，羟脯氨酸、g-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以类似于天然氨基酸的方式起作用的化合物。
术语“非天然存在的氨基酸”和“非天然氨基酸”是指自然界中没有的氨基酸类似物、合成氨基酸和氨基酸模拟物，例如含有芳基酰胺、乙烯基磺酰胺、磺酰氟、芳基磺酰氟和4-磺基四氟苯基(STP)酯的氨基酸残基。
本文中，氨基酸可以通过其常见的三字母符号或IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号来指代。同样，核苷酸也可以通过其普遍接受的单字母代码来指代。
术语“氨基酸侧链”是指氨基酸上含有的功能取代基。例如，氨基酸侧链可以是天然存在的氨基酸的侧链。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸(例如，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸)，以及后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、g-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。在一些方面，氨基酸侧链可以是非天然氨基酸侧链。在一些方面，氨基酸侧链是H、 在一些实施方案中，非天然氨基酸侧链是在一些实施方案中，非天然氨基酸侧链是
术语“非天然氨基酸侧链”或“非天然氨基酸侧链”或“Uaa”是指与天然氨基酸具有相同基本化学结构的化合物的功能替代物，即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍、烯丙基丙氨酸、2-氨基异丁酸。非天然氨基酸是天然存在或化学合成的非蛋白氨基酸。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然氨基酸相同的基本化学结构。非限制性实例包括外-顺-3-氨基二环[2.2.1]庚-5-烯-2-甲酸盐酸盐、顺-2-氨基环庚烷甲酸盐酸盐、顺-6-氨基-3-环己烯-1-甲酸盐酸盐、顺-2-氨基-2-甲基环己烷羧酸盐酸盐、顺-2-氨基-2-甲基环戊烷甲酸盐酸盐、2-(Boc氨基甲基)、苯甲酸、2-(Boc氨基)辛二酸、Boc-4,5-脱氢-Leu-OH(二环己基铵盐)、Boc-4-(Fmoc-氨基)-L-苯丙氨酸、Boc-P-Homopyr-OH、Boc-(2-茚基)-Gly-OH、4-Boc-3-吗啉乙酸、4-Boc-3-吗啉乙酸、Boc五氟-D-苯丙氨酸、Boc-五氟-L-苯丙氨酸、Boc-Phe(2-Br)-OH、Boc-Phe(4-Br)-OH、Boc-D-Phe(4-Br)-OH、Boc-D-Phe(3-Cl)-OH、Boc-Phe(4-NH2)-OH、Boc-Phe(3-NH2)-OH、Boc-Phe(3,5-F2)-OH、2-(4-Boc-哌嗪基)-2-(3,4-二甲氧基苯基)乙酸purum、2-(4-Boc-哌嗪基)-2-(2-氟苯基)乙酸purum、2-(4-Boc-哌嗪基)-2-(3-氟苯基)乙酸purum、2-(4-Boc-哌嗪基)-2-(4-氟苯基)乙酸purum、2-(4-Boc-哌嗪基)-2-(4-甲氧基苯基)乙酸purum、2-(4-Boc-哌嗪基)-2-苯基乙酸purum、2-(4-Boc-哌嗪基)-2-(3-吡啶基)乙酸purum、2-(4-Boc哌嗪基-2-[4-(三氟甲基)苯基]乙酸purum、Boc-P-(2-喹啉基)-Ala-OH、NBoc-1,2,3,6-四氢-2-吡啶甲酸、Boc-P-(4-噻唑基)-Ala-OH、Bo-b(2-噻吩基)-D-Ala-OH、Fmoc-N-(4-Boc-氨基丁基)-Gly-OH、Fmoc-N-(2-Boc-氨基乙基)-Gly-OH、Fmoc-N-(2,4-二甲氧基苄基)-Gly-OH、Fmoc-(2-二茚基)-Gly-OH、Fmoc-五氟-L-苯丙氨酸、Fmoc-Pen(Trt)-OH、Fmoc-Phe(2-Br)-OH、Fmoc-Phe(4-Br)-OH、FmocPhe(3,5-F2)-OH、Fmoc-P-(4-噻唑基)-Ala-OH、Fmoc-P-(2-噻吩基)-Ala-OH、4-(羟基甲基)-D-苯丙氨酸。在一些实施方案中，非天然氨基酸包含式I：的结构。在一些实施方案中，非天然氨基酸包含式II：的结构。在一些实施方案中，非天然氨基酸为2-氨基-3-(4-(氟磺酰基)氧基)苯基)丙酸：在一些实施方案中，非天然氨基酸为氟磺酰基酪氨酸(FSY)：在一些实施方案中，非天然氨基酸为N6-(4-((氟磺酰基)氧基)苯甲酰基)赖氨酸：在一些实施方案中，非天然氨基酸为氟磺酰基氧基苯甲酰基-L-赖氨酸(FSK)：
“保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列二者。对于特定的核酸序列，“保守修饰变体”是指编码相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸。由于遗传密码的简并性，许多核酸序列将编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每个位置，密码子可以改变为所述的任何相应密码子，而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，其为保守修饰变异的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(AUG和TGG除外，AUG通常是蛋氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)都可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异都隐含在每个所述序列中。
至于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个替换、缺失或添加是“保守修饰变体”，其中这种改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸替换。提供功能相似氨基酸的保守替换表在本领域中是众所周知的。这种保守修饰的变体是本公开的多态性变体、种间同源物和等位基因的补充，并不排除它们。
以下八组各含有彼此为保守取代的氨基酸：(1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；(2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；(3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；(5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；(7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和(8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)。(参见例如，Creighton,Proteins(1984))。
在一些实施方案中，本文所述的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNApyl)是一种氨基酰基-tRNA合成酶，它催化将α-氨基酸吡咯赖氨酸或类似的非天然氨基酸附接至同源tRNA所需的反应，从而允许在琥珀终止密码子(即UAG)的蛋白质发生过程中并入吡咯赖氨酸或相似的非天然氨基酸。来自甲烷八叠球菌物种的野生型tRNApyl(其天然并入吡咯赖氨酸)与大肠杆菌和真核细胞中的内源性tRNA和氨基酰基tRNA合成酶正交。利用这一对及其合成进化的衍生物或变体，我们和其他人指导了在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中所需蛋白质的特定位点处非天然氨基酸的有效并入，包括翻译后修饰的氨基酸、化学手柄和光控(photocaged)氨基酸。
在一些实施方案中，本文所述的tRNApyl包括任何重组或天然存在形式的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶或其变体、同源物或同种型，其保持tRNApyl活性(例如，与野生型tRNApyl相比，在至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的活性范围内)。在一些实施方案中，与天然存在的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶相比，变体、同源物或同种型在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续的氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，突变的tRNApyl催化非天然氨基酸(UAA)(例如，式(IA)的UAA，诸如氟代硫酸酯L-酪氨酸(FSY))附接至tRNApyl，以便并入非天然氨基酸。
在一些实施方案中，本文提供的tRNApyl是可被本领域技术人员工程化的tRNApyl衍生物或变体。在一些实施方案中，本文所提供的tRNApyl是含有约70至90个核苷酸的单链RNA分子，它们经由链内碱基配对折叠以形成特征性的三叶草结构，该结构携带特定的氨基酸(例如，式(IA)的UAA，诸如FSY)，并在蛋白质合成过程中将其与mRNA上的相应密码子匹配。
“成像配体”或“可检测试剂”是一种可通过适当手段(诸如光谱、光化学、生化、免疫化学、化学、磁共振成像或其他物理手段)可检测的组合物。例如，有用的可检测试剂包括3H、14C、18F、33P、35S、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、77As、86Y、90Y、89Sr、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、99Mo、105Pd、105Rh、111Ag、111In、112In、123I、124I、125I、131I、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、154-158Gd、161Tb、166Dy、166HO、169Er、175Lu、177Lu、186Re、188Re、189Re、194Ir、198Au、199Au、211At、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra、225Ac、153Sm、177Lu、86Y、88Y、90Y、123I、124I、125I、131I、149Tb、212Pb/212Bi和227Th、Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、32P、荧光团(例如荧光染料)、电子致密试剂、酶(例如，ELISA中常用的)、生物素、地高辛、顺磁性分子、顺磁性纳米颗粒、超小超顺磁性铁氧化物(“USPIO”)纳米颗粒、USPIO纳米颗粒聚集体、超顺磁性铁氧化物(“SPIO”)纳米颗粒、SPIO纳米颗粒聚集体、单晶铁氧化物纳米颗粒、单晶铁氧化物、纳米颗粒造影剂、脂质体或其他含有钆螯合物(“Gd螯合物”)分子的递送媒介物、钆、放射性同位素、放射性核素(例如碳-11、氮-13、氧-15、氟-18、铷-82)、氟脱氧葡萄糖(例如氟-18标记的)、任何γ射线发射放射性核素、正电子发射放射性核素、放射性标记的葡萄糖、放射性标记的水、放射性标记的氨、生物胶体、微泡(例如包括包含白蛋白、半乳糖、脂质和/或聚合物的微泡壳；包含空气、重气体、全氟化碳、氮、八氟丙烷、全氟己烷脂质微球、全氟丙烷等的微泡气体核心)、碘化造影剂(例如碘海醇、碘克沙醇、碘佛醇、碘异酞醇、碘昔兰、碘普罗胺、泛影酸盐、甲泛影酸和碘克酸)、硫酸钡、二氧化钍、金、金纳米颗粒、金纳米颗粒聚集体、荧光团、双光子荧光团或半抗原和蛋白质或其他可检测的实体，它们例如通过将放射性标记并入与靶肽特异性反应的肽或抗体中。可检测部分是单价可检测试剂或能够与另一种组合物形成键的可检测试剂。
根据本公开的实施方案，可用作显像剂和/或标记剂的放射性物质(例如，放射性同位素)包括但不限于3H、14C、18F、33P、35S、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、77As、86Y、90Y、89Sr、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、99Mo、105Pd、105Rh、111Ag、111In、112In、123I、124I、125I、131I、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、154-158Gd、161Tb、166Dy、166HO、169Er、175Lu、177Lu、186Re、188Re、189Re、194Ir、198Au、199Au、211At、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra、225Ac、153Sm、177Lu、86Y、88Y、90Y、123I、124I、125I、131I、149Tb、212Pb/212Bi和227Th。根据本公开的实施方案，可用作额外显像剂的顺磁性离子包括但不限于过渡金属和镧系金属离子(例如原子序数为21-29、42、43、44或57-71的金属)。这些金属包括Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu的离子。
本文使用的术语“键”或“连接体”是指由连接体的官能团与另一分子之间的化学反应形成的键或化学部分。此类键可以包括但不限于共价键和非共价键，而此类化学部分可以包括但不仅限于酯、碳酸酯、亚胺磷酸酯、腙、缩醛、原酸酯、肽键和寡核苷酸键。水解稳定的键意味着这些键在水中基本稳定，在有用的pH值下不会与水反应，包括但不限于在生理条件下延长的时间段，可能甚至无限期地。水解不稳定或可降解的键意味着这些键在水中或水性溶液(包括例如血液)中是可降解的。酶促不稳定或可降解的键意味着该键可以被一种或多种酶降解。仅作为实例，PEG和相关聚合物可以在聚合物骨架或聚合物骨架与聚合物分子的一个或多个末端官能团之间的连接基团中包括可降解的键。这种可降解的键包括但不限于由PEG羧酸或活化的PEG羧酸与生物活性剂上的醇基团反应形成的酯键，其中这些酯基团通常在生理条件下水解以释放生物活性剂。其他水解可降解的键包括但不限于碳酸酯键；由胺和醛的反应产生的亚胺键；由醇与磷酸基团反应形成的磷酸酯键；腙键，其为酰肼和醛的反应产物；缩醛键，其为醛和醇的反应产物；原酸酯键，其为甲酸酯和醇的反应产物；由胺基形成的肽键，包括但不限于在聚合物诸如PEG的末端和肽的羧基；以及由亚磷酰胺基团形成的寡核苷酸键，包括但不限于聚合物末端处的亚磷酰胺基团和寡核苷酸的5'羟基。连接体包括但不限于短的线性、支化、多臂或树枝状大分子，诸如聚合物。在一些实施方案中，连接体可以是分支的。在其他实施方案中，连接体可以是双官能连接体。在一些实施方案中，连接体可以是三官能连接体。试剂从这些连接体基团释放的机制包括，例如，光不稳定键的照射和酸催化的水解。连接体的长度可以根据多肽和与其连接的分子之间所需的空间关系预先确定或选择。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物，其中在实施方案中，聚合物可以与不由氨基酸组成的部分缀合。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，也适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。“融合蛋白”是指编码两个或更多个单独蛋白质序列的嵌合蛋白，这些序列作为单个部分重组表达。
氨基酸或核苷酸碱基“位置”由数字表示，该数字基于其相对于N末端(或5'末端)的位置顺序标识参考序列中的每个氨基酸(或核苷酸碱基)。由于在确定最佳比对时必须考虑缺失、插入、截短、融合等，一般来说，通过从N末端简单计数确定的测试序列中的氨基酸残基数字不一定与其在参考序列中的相应位置的数字相同。例如，在变体相对于比对的参考序列具有缺失的情况下，变体中不会有与参考序列中缺失的位点对应的氨基酸。如果在比对的参考序列中有插入，则该插入将不对应于参考序列中编号的氨基酸位置。在截短或融合的情况下，参考序列或比对序列中的氨基酸段可能与相应序列中的任何氨基酸都不对应。
当用于给定氨基酸或多核苷酸序列的编号的上下文中时，术语“参考……编号的”或“对应于”是指当将给定氨基酸或多核苷酸序列与参考序列进行比较时，对指定参考序列的残基进行编号。
当蛋白质中的氨基酸残基在蛋白质中占据与给定残基相同的必需结构位置时，它“对应”于给定残基。例如，当所选残基与PylRS蛋白中的Ala302具有相同的必需空间或其他结构关系时，所选蛋白质中的所选残基对应于PylRS蛋白质的Ala302。在实施方案中，当所选蛋白质与PylRS蛋白质进行最大同源性比对时，与Ala302比对的经比对的所选蛋白质中的位置被认为对应于Ala302。除了一级序列比对外，还可以使用三维结构比对，例如，对所选蛋白质的结构进行对齐，用于与PylRS蛋白质和比较的整体结构最大程度地对应。在这种情况下，在结构模型中与Ala302占据相同必需位置的氨基酸被认为对应于Ala302残基。
“序列同一性百分比”是通过在比较窗口内比较两个最佳对齐的序列来确定的，其中与参考序列(其不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包含添加或缺失(即，空位)，用于两个序列的最佳对齐。该百分比是通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量，以产生匹配的位置的数量，将匹配的位置的数量除以比较窗口中的位置总数，然后将结果乘以100，得到序列同一性的百分比来计算的。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性百分比”是指使用具有以下描述的默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动对齐和目视检查(参见例如，NCBI网站ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等)测量的相同的或具有相同氨基酸残基或核苷酸的指定百分比(即，当在比较窗口或指定区域上进行最大对应性比较和比对时在指定区域上约60％的同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)的两个或更多个序列或子序列。则这样的序列被称为“基本相同”。这个定义也指或可以应用于测试序列的互补序列。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有替换的序列。如下所述，优选的算法可以考虑空位等。优选地，同一性存在于长度至少为约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选地存在于长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。
“抗体”是具有复杂内部结构的大型复杂蛋白质。天然抗体分子包含两对相同的多肽链，每对具有一条轻链和一条重链。每个轻链和重链又由两个区域组成：参与结合靶抗原的可变(“V”)区，和与免疫系统的其他组分相互作用的恒定(“C”)区。轻链和重链可变区在三维空间中聚集在一起，以形成结合抗原(例如，细胞的表面上的受体)的可变区。在每个轻链或重链可变区内，存在称为互补决定区(“CDR”)的三个短片段(平均长度为10个氨基酸)。抗体可变域中的六个CDR(三个来自轻链，并且三个来自重链)在三维空间中折叠在一起，形成与靶抗原对接的实际抗体结合位点。Kabat，E.等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1983,1987精确定义了CDR的位置和长度。不包含在CDR中的可变区的部分称为框架(“FR”)，其形成了CDR的环境。
术语“抗体”根据其在本领域中的公知含义使用。抗体例如作为完整的免疫球蛋白或通过各种肽酶消化产生的许多特征明确的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键下方的抗体，以产生F(ab)'2——Fab的二聚体，其本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab)'2可以在温和条件下被还原，以破坏铰链区中的二硫键，从而将F(ab)'2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体本质上是具有部分铰链区的Fab(参见FundamentalImmunology(Pauled.,3d ed.1993))。虽然各种抗体片段是根据完整抗体的消化来定义的，但本领域技术人员将理解，这些片段可以化学地或通过使用重组DNA方法从头合成。因此，本文使用的术语抗体还包括通过修饰全抗体产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段(例如，单链Fv)，或使用噬菌体展示文库(例如，McCafferty等人,Nature348:552-554(1990))鉴定的抗体片段。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端定义了主要负责抗原识别的约100至110个或更多氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。Fc(即片段可结晶区)是免疫球蛋白的“碱基”或“尾部”，并且通常由两条重链组成，根据抗体的类别，它们贡献两个或三个恒定域。通过与特定蛋白质结合，Fc区确保每种抗体对给定抗原产生适当的免疫应答。Fc区还与各种细胞受体(诸如Fc受体)和其他免疫分子(诸如补体蛋白)结合。
本文提供的抗体“变体”是指能够结合至抗原并且包括抗体或其片段的一个或多个结构域的多肽。抗体变体的非限制性实例包括单域抗体(纳米抗体)、affibody(比单克隆抗体小并且能够以高亲和力结合抗原并模仿单克隆抗体的多肽(例如，约6kDa))、单特异性Fab2、双特异性Fab2、三特异性Fab3、单价IgG、scFv、双特性双抗体、三特性三抗体、scFv-Fc、微抗体、IgNAR、V-NAR、hcIgG、VhH或肽体。本文提供的“肽体”是指(通过共价或非共价连接体)附接至抗体的Fc域的肽部分。本领域已知的抗体变体的其他非限制性实例包括软骨鱼或骆驼科动物产生的抗体。骆驼科动物的抗体及其可变区及其生成、分离和使用方法的一般描述可见于参考文献WO 97/49805和WO 97/49805，其出于所有目的均通过引用整体并入本文。同样，来自软骨鱼的抗体及其可变区及其生产、分离和使用方法可见于WO2005/118629，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
“单域抗体”或“纳米抗体”是指具有单个单体可变抗体域的抗体片段。像完整的抗体一样，它能够选择性地结合至特定的抗原。在一些实施方案中，单域抗体是人或人源化单域抗体。在一些实施方案中，单域抗体是骆驼科单域抗体。单域抗体可以是工程化单域抗体，并且可以包含非天然氨基酸。
本文提供的术语“抗原”是指能够结合至本文提供的抗体结合域的分子。本文提供的“抗原结合域”是抗体中与抗原(表位)结合的区域。如上所述，抗原结合域可以包括重链和轻链(分别为VL、VH、CL和CH1)中的每一个的一个恒定域和一个可变域。在实施方案中，抗原结合域包括轻链可变域和重链可变域。在实施方案中，抗原结合域包括轻链可变域，并且不包括重链可变域和/或重链恒定域。互补位或抗原结合位点在抗原结合域的N末端形成。抗原结合域的两个可变域可以结合抗原的表位。例如，抗体以完整的免疫球蛋白或通过各种肽酶消化产生的许多特征明确的片段的形式存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中的二硫键下方的抗体以产生F(ab)’2，这是Fab的二聚体，其本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab)’2可以在温和条件下被还原，以破坏铰链区中的二硫键，从而将F(ab)’2二聚体转化为Fab’单体。Fab’单体本质上是具有部分铰链区的抗原结合部分(参见FundamentalImmunology(Pauled.,3d ed.1993))。虽然各种抗体片段是根据完整抗体的消化来定义的，但本领域技术人员将理解，这些片段可以化学地或通过使用重组DNA方法从头合成。因此，本文使用的术语抗体还包括通过修饰全抗体产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段(例如，单链Fv)，或使用噬菌体展示文库(参见例如，McCafferty等人,Nature348:552-554(1990))鉴定的抗体片段。
实施例
实施例1——PSMA sdAb偶联位点的鉴定
为了评估PSMA作为使用单域抗体(sdAb)C1(SEQ ID NO:1)与含有FSY的靶向分子偶联的靶标的相容性，通过用TAG终止密码子替换CDR1、CDR2和CDR3区域内的每个选定密码子并产生编码的蛋白以将FSY并入适当位置来筛选FSY位点。大约鉴定出19个潜在位点，其中大多数聚集在CDR1和CDR3区域。这些TAG位点位于CDR1(位点26-35:GYTDSNYYMS，SEQ IDNO:5)；CDR2(50-66:VNTGRGSTSYADSVKG，SEQ ID NO:6)、CDR3(99-116，不包括Cys101、Cys104 AACHFCDSLPKTQDEYIL，SEQ ID NO:7)中。针对FSY修饰位点对第二个sdAb C2(SEQID NO:2)进行了类似的评估。在C2 CDR中发现了大约8个位点作为FSY的潜在位置，其中大多数聚集在CDR2和CDR3中。这些TAG位点位于CDR1(位点26-35RFMISEYSMH，SEQ ID NO:8)；CDR2(50-65:TINPAGTTDYAESVKG，SEQ ID NO:9)，CDR3(96-100DGYGY，SEQ ID NO:10)中。
实施例2——FSY修饰的sdAb的表达
分别用正向引物(SEQ ID NO:80)和反向引物(SEQ ID NO:81)PCR扩增缺少ORF插入的载体pBAD序列(Invitrogen#43001)。
使用Zymo PCR纯化试剂盒(Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒Cat#D4002)对所得PCR扩增的载体进行凝胶提取和纯化。将C2 WT His和C1 WT His的dsDNA序列与PCR扩增的pBAD骨架连接，并转化到大肠杆菌DH10b化学感受态细胞(Fisher Thermo ScientificTMDH10B感受态细胞；高效；FEREC0113)中。使用pBAD正向引物对克隆进行小型制备和序列验证。表达盒还并入了PelB前导序列和His6标签。C1和C2 wt的DNA序列分别为SEQ ID NO:73和SEQ IDNO:74。对于并入FSY残基的构建体，将TAG密码子工程化到DNA序列中sdAb或双互补位构建体的开放阅读框内氨基酸替换的所需位置。
C1 TAG文库的构建。通过IDT合成了含有TAG密码子的多核苷酸(dsDNA序列)，以代替C1的CDR区中鉴定的位点内的每个密码子(参见实施例1)。这些TAG位点位于CDR1(位点26-35)；CDR2(50-66)、CDR3(99-116，不包括Cys101、Cys104)中。这些位点在以下序列中加了下划线：
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTAPGYTDSNYYMSWFRQAPGKERE
WVAGVNTGRGSTSYADSVKGRFTISQDNAKNTMFLQMNSLKPEDT
AIYYCAVAACHFCDSLPKTQDEYILWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYG(SEQ ID NO:1)
如上所述，将含有这些TAG突变体中的每一个的多核苷酸克隆到pBAD骨架中，并验证序列。
C2 TAG文库的构建。通过IDT合成了含有单个TAG密码子的多核苷酸序列，该密码子替换了实施例1中鉴定的C2的CDR区中的每个残基。C2 WT His蛋白序列的氨基酸序列中的这些区域在以下序列中加了下划线：
EVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASRFMISEYSMHWVRQAPGKGLE
WVSTINPAGTTDYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCDGYGYRGQGTQVTVSS(SEQID NO:2)
如上所述，将含有这些TAG突变体中的每一个的多核苷酸克隆到pBAD骨架中，并验证序列。
文库菌株生成。表达工程化Mb FSYRS氨基酰基-tRNA合成酶的pEVOL-FSYRS质粒由Genscript合成(订单号U168NGE200；U168NGE200；Cat#SC1010)(参考文献：J.Am.Chem.Soc.2018,140,15,4995–4999)，使用标准方法将其转化为化学感受态DH10b感受态细胞，以生成亲本菌株FSYRS-DH10b。使用标准方法将编码每个C1 CDR TAG或C2 CDRTAG变体的单个质粒转化到化学感受态FSYRS-DH10b中。将单个菌落接种到含有100ug/ml氨苄青霉素和34ug/ml氯霉素的2xYT培养基(Teknova#Y0166)中，并在37℃下在约220rpm的振荡下生长过夜。将过夜培养物与无菌50％甘油1:1混合，并在-80℃下储存。
表达和纯化。在100ug/ml氨苄青霉素和34ug/ml氯霉素的存在下，在2xYT培养基(Teknova#Y0166)中培养携带编码sdAb的质粒的菌株，该sdAb在FSYRS-DH10b亲本背景中具有突变为TAG的单个CDR残基。在诱导之前，细胞在37℃的温度下生长。在OD600为0.6时，向培养物补充1mM FSY，并通过添加0.2％的阿拉伯糖进行诱导。在诱导时，将培养物移至25℃，同时以220RPM震荡过夜，持续共16小时。
通过在4℃下以2200xg对细胞沉淀30分钟来收集表达。去除上清液，称量细胞沉淀物并在-80℃下储存。通过以4mL/g沉淀物加入B-PER蛋白提取试剂(ThermoFisher#78243)，将细胞沉淀物重新悬浮以进行裂解。通过在室温下将样品以中速放置在轨道振荡器上15分钟，使重新悬浮的沉淀物裂解。然后将裂解的细胞以2200xg的速率旋转30分钟。去除上清液中的可溶部分以进一步纯化。
为了纯化可溶的部分，使用HisPur-Ni-NTA树脂(ThermoFisher#88222)从裂解物中捕获可溶的物质。移除树脂储存缓冲剂，并通过在洗涤缓冲剂(40mM磷酸钠，pH 7.2，300mM NaCl，20mM咪唑)中分批洗涤来平衡。重复分批洗涤，总计50x树脂体积。将上述澄清的裂解物加入洗涤过的Ni-NTA树脂中，并在室温下用恒定旋转结合1小时。结合后，在洗涤缓冲剂中以50x树脂体积分批洗涤蛋白质结合的树脂，以去除未结合的污染物。然后将蛋白质结合的树脂转移到离心柱，并在700xg下短暂旋转以去除剩余的洗涤缓冲剂。然后使用具有洗脱缓冲剂(40mM磷酸钠，7.2，300mM NaCl，500mM咪唑)的缓冲剂洗脱靶蛋白。以2x树脂体积加入洗脱缓冲剂，并在室温下孵育5分钟。将样品短暂地旋转，并且洗脱的蛋白质被收集在新的管中。使用相同的条件重复洗脱程序两次。将洗脱部分合并，并在Nanodrop 2000上通过A280定量，用洗脱缓冲剂进行空白对照。然后使用0.5mL、3kDa MWCO PES旋转过滤器(ThermoFisher#88512)浓缩Ni-NTA纯化的蛋白质，并经由在8-10x体积的样品和浓度下重复稀释将缓冲剂交换为1xPBS。
实施例3——FSY修饰的sdAb和PSMA的共价相互作用
在37℃下，将来自实施例2的半纯化sdAb产物在1xPBS中与商业PSMA(Sino Bio，cat#15877-H07H)以约7:1的摩尔比孵育过夜(sdAb:PSMA，PSMA最终浓度为0.125mg/mL，1.25uM)。通过还原SDS-PAGE分析交联(图1A-1E)。
在C1 sdAb的CDR1和CDR3中评估的位点表明了对PSMA的交联能力谱，如以下表3所示。
相对于SEQ ID NO:1列出了位点位置。
使用类似于实施例1的方法的方法评估第二PSMA特异性sdAb C2的交联效率，改变之处在于sdAb:PSMA摩尔比为约8:1。交联结果如图2A-2C所示。C2 sdAb的CDR2和CDR3中评估的位点表明了对PSMA的交联能力谱，如以下表4所示。
相对于SEQ ID NO:2列出了位点位置。
实施例4——交联的动力学
选择FSY修饰的sdAb子集来评估PSMA交联的动力学。将sdAb与PSMA以5:1的摩尔比孵育(PSMA最终浓度为0.125mg/mL，1.25uM)。在0-180分钟的时间点取样，并通过SDS-PAGE评估交联PSMA的百分比。如图3A和3B所示，修饰的sdAb表现出一系列偶联动力学。通过量化sdAb PSMA交联带来计算交联带百分比，并使用ImageJ量化PSMA带强度。
实施例5——具有修饰的CDR3的PSMA靶向构建体
通过将C1(SEQ ID NO:1)的CDR3(SEQ ID NO:7)中的两个半胱氨酸残基修饰为丙氨酸(C101A和C104A)以产生C39，去除这些残基，从而生成靶向PSMA的sdAb C1构建体。然后进一步修饰该构建体以在残基102处安装FSY(C1-C101A/C104A/H102(FSY)，SEQ ID NO:4，以下称为C39-102FSY)。这些sdAb构建体的图如图4所示。构建体用从成熟蛋白上切割下来的pelB前导序列(SEQ ID NO:15)合成，并使用六个C末端组氨酸进行His-Tag纯化。使用实施例3的方法评估这些构建体的交联能力。SDS-PAGE分析表明，在这些条件下，所有构建体的交联水平是相当的。
如实施例2所述，克隆并表达含有FSY的PSMA靶向sdAb C39-FSY C1。通过将C39-FSY C1与C1-C101A/C104A/H102H(SEQ ID NO:71，不含FSY)的额外拷贝连接，创建了双互补位构建体(C1-C101A/C104A/H102(FSY)-L1-C1-C39，SEQ ID NO:21，以下简称C40-FSY)。通过在两个sdAb氨基酸序列之间添加GGGGSGGGGS连接体来设计构建体。然后将双互补位构建体克隆到pBAD载体中，并如实施例2中所述进行表达。构建体用从成熟蛋白上切割下来的pelB前导序列(SEQ ID NO:15)合成，并使用六个C末端组氨酸进行His-Tag纯化。
通过SDS-PAGE和时间过程评估了单互补位sdAb和双互补位构建体与PSMA的交联。SDS-PAGE分析表明，二聚形式C40-102FSY的交联速率是单体C39-102FSY的两倍(二聚体的t1/2最大交联时间为约30分钟，相比之下单体的t1/2最大交联时间为约60分钟)。
(图5A-5B)
C39-102FSY氨基酸序列(*是102FSY位置，SEQ ID NO:4，丙氨酸修饰加了下划线)：
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTAPGYTDSNYYMSWFRQAPGKEREWVAGVNTGRGSTSYADSVKGRFTISQDNAKNTMFLQMNSLKPEDTAIYYCAVAAA*FADSLPKTQDEYILWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSCHHHHHH
实施例6——构建体的合成
经由工程化C末端半胱氨酸残基的位点特异性缀合。为了实现与sdAb化合物的位点特异性生物缀合，在构建体的C末端附近设计了额外的Cys残基。制备sdAb-Cys化合物，并在1xPBS，pH 7.4，5mM EDTA中配制至1mg/ml。将TCEP加入至10mM进行轻度还原，并在室温下孵育15分钟。然后使用Zeba离心柱对样品进行缓冲剂交换，以去除TCEP，并交换成1xPBS，pH7.4，1mM EDTA。然后以10x摩尔过量加入马来酰亚胺反应性有效负荷化合物(诸如AZDye647马来酰亚胺cat#:1122-5)，并在37℃下孵育2小时，或在4℃下孵育16小时。使用尺寸排阻色谱、脱盐柱、透析或TFF从样品去除未反应的马来酰亚胺化合物。在还原和非还原条件下对样品进行SDS-PAGE，以观察标记效率，并使用LC-MS进行分析，以定量标记的和未标记的物种的完整质量和相对比例。
实施例7——交联活性的测定
测定分子与靶肿瘤抗原的特异性结合和交联。为了评估PSMA靶向构建体的细胞结合能力，使用特定的含FSY或Tyr的sdAb来测试共价交联对特定感兴趣抗原的影响。将这些试验制品进行连续稀释，并与体外培养的前列腺癌细胞系LnCAP(PSMA+)和PC3(PSMA-)相关联。在37℃下孵育不同时间后，洗涤细胞并更换培养基以去除未结合的材料。使用抗His标签抗体或抗VHH通过流式细胞术分析样品，以测量作为输入浓度的函数的结合的群体。为了测量交联效率和特异性，收集细胞，裂解细胞，并使用抗his或抗VHH抗体进行蛋白质印迹，以经由凝胶位移测量共价地结合的群体，并与使用抗PSMA抗体的凝胶位移蛋白质印迹进行比较，以测量交联至sdAb试验制品的总靶抗原。
另外测定了缀合物分子的功能活性，在这种情况下，是指在体外特异性地向表达靶抗原的肿瘤细胞递送有毒有效负荷的能力。使用实施例8中描述的一般方法，将含有工程化C末端或近端Cys残基的构建体偶联至细胞毒性有效负荷，诸如MMAE或其他类别的高度细胞毒性化合物。生成剂量反应曲线，并将样品与LnCAP和PC3细胞在体外孵育。在孵育不同时间后，洗涤细胞以去除游离化合物，并使用测定(诸如Promega CytoxGreen)或其他经由报告化合物检测测量细胞生存力、通过Presto Blue、CCK-8或类似试剂检测活细胞和/或经由膜联蛋白V-FITC、碘化丙啶染色或类似试剂测量凋亡的测定来测量细胞生存力。
实施例8——体内递送
为了测量构建体在体内向肿瘤组织特异性递送有效负荷的能力，并比较构建体与非共价sdAb缀合物的肿瘤暴露，荧光团标记被用作代表有效负荷，以实现随时间的跟踪/生物分布测量。具有被Tyr或FSY替换的单个残基的sdAb构建体(例如，C1、C2或C3)经由工程化半胱氨酸残基提供马来酰亚胺化学与化学荧光团(Alexa647或类似物)缀合，并如实施例6所述纯化。在携带PSMA+或-肿瘤的雄性NSG小鼠中，经由尾静脉IV注射施用荧光团标记的sdADC缀合物分子，并使用AmiX成像仪或类似设备经由全动物成像来观察试验制品随时间的生物分布。经由图像密度测定法定量肿瘤特异性和外周暴露，并在FSY和Tyr版本的sdAb之间进行比较。
实施例9：另外的FSY修饰的SdAb的设计
通过NdeI和HindIII限制性内切酶将C3 wt序列(由IDT合成，SEQ ID NO:3)克隆到消化载体(由Genscript合成)中，构建了C3
wt抗PSMA sdAb。表达盒还并入了PelB前导序列和His6标签。C3wt DNA序列如SEQID NO:75所示。
在选择用于FSY修饰的位点处，CDR区的氨基酸序列被改为质粒中的TAG密码子。ORF中的这些TAG突变体由Genscript经由定向位点突变制备。
C3 CDR1(26-35:GWPYSTYSMN,SEQ ID NO:11)；CDR2(50-65:GISSTMSGIIFAESKAG,SEQ ID NO:12)；CDR3(99-113:RRDYSLSSSSDDFDY,SEQ ID NO:13)。
实施例10——FSY修饰的sdAb的筛选
如实施例2所述，将来自实施例9的C3构建体与pEVOL FSYRS共转化到DH10b感受态细胞中。从转化中挑选单个菌落，并接种到在220rpm、37℃下振荡的24深孔板中的1mL 2xYT中，该24深孔板补充100ug/mL Amp+34ug/mL Cm。当OD达到0.5时，温度降至25℃。通过添加0.2％的阿拉伯糖+1mM FSY诱导每个孔的表达。产品在25℃下表达过夜。过夜后，将细胞转移到1.5mL Eppendorf管中，并用台式离心机离心。去除上清液。用50uL B-per(ThermoFisher#78243)处理沉淀物进行细胞裂解15分钟。之后，用4℃台式离心机以最大速度旋转细胞裂解物。
通过将3uL上清液与3uL PBS或3uL 0.25mg/mL PSMA孵育来引发交联反应。将反应在37℃下孵育较短的时间窗口3小时。之后，用2XSDS-负载染料处理孵育混合物。通过用考马斯蓝染色的SDS-PAGE跑胶来研究交联。结果如图6A和6B所示，并总结在如下表5中。
相对于SEQ ID NO:3列出了位点位置。
实施例11——FSK修饰的FAP sdAb的鉴定和动力学
序列分析(abYsis)用于定义Fap抗体序列中的互补决定区(CDR)环位置。构建文库以用TAG密码子单独替换每个CDR残基，并在每个位置并入非天然氨基酸FSK的条件下表达所得的蛋白质。
C8 FAP文库生成。为了评估sdAb中不同的FSK并入位点，如下构建了载体pBAD-C8WT(SEQ ID NO:82)：C8 WT序列(SEQ ID ID:23)针对大肠杆菌表达进行了密码子优化，并由IDT公司合成。通过NdeI和HindIII限制性内切酶将C8 WT gblock序列(SEQ ID NO:78)克隆到消化的pBAD载体(Genscript)中，来构建pBAD-C8 WT载体。
文库菌株生成。为了表达相应的合成酶，合成了pEVOL-FSKRS质粒(Genscript)，其编码工程化Ma FSKRS氨基酰基tRNA合成酶(SEQ ID NO:87)。将pEVOL-FSKRS(SEQ ID NO:89)转化到化学感受态DH10b感受态细胞中，以生成亲本菌株FSKRS-DH10b。将编码每个C8CDR TAG变体的单个质粒转化到化学感受态FSKRS-DH10b细胞中。将单个菌落接种到含有100ug/ml氨苄青霉素和34ug/ml氯霉素的Superbroth培养基(Teknova#S1530)中，并在37℃下在约220rpm振荡下生长过夜。
表达和纯化。在100ug/ml氨苄青霉素和34ug/ml氯霉素的存在下，在Superbroth培养基中培养携带编码sdAb的质粒的菌株，该sdAb具有在FSKRS-DH10b亲本背景中突变为TAG的单个CDR残基。将每个库中的单个菌落接种到含有相关抗生素的5mL Superbroth培养基中，并在37℃下生长过夜。第二天，将细胞以1:10的比例稀释到30mL(3mL至30mL稀释)Superbroth培养基，该培养基含有100ug/mL氨苄青霉素和34ug/mL氯霉素、1mM FSK、0.2％阿拉伯糖。在30℃和220rpm下诱导细胞进行FSK并入6小时。表达后，按照实施例2中描述的方法收获FSK修饰的sdAb(C8-FSK)并纯化。
交联动力学。FAP受体(Acrobiosystem#AP-H5263-100ug)与合并的抗体混合物(表6)以约(抗体：受体)8:1的摩尔比在37℃、1XPBS、pH 7.4下孵育1小时、2小时或过夜。孵育后，通过加入含有100mM DTT的1X Laemmli样品缓冲剂来停止交联反应。将样品在95℃下加热5分钟，然后进行Tris-glcyine SDS-PAGE(4–20％ TGXTM)。随后使用ImageJ软件量化相对带强度。FSK合并移位的结果表明，FAP受体经由库2和3内的交联活性发生移位(图7A)。
表6.为表达C8 FSK混合物设计的CDR库
库编号 CDR区
1 CDR1(26-35)
2 CDR2(50-57)
3 CDR2(58-65)
4 CDR3(98-106)
负责与FAP交联的单个FSK位点的鉴定。为了鉴定负责交联的单个FSK位点，将每个TAG突变体与pEVOL-FSKRS共转化到DH10b细胞中，如上所述进行表达和纯化。将候选库中的每个个体FSK突变体与FAP受体一起孵育，用于研究凝胶位移(图7B)。发现CDR2中的9个FSK突变体与FAP交联(52、53、54、55、56、58、60、62、64)。发现一个位点(56)在1小时内具有所有交联位点中最高的交联产率。
C8-FSK与FAP受体的交联动力学的测量。为了评估FSK交联动力学，将C8-54FSK和C8-56FSK与FAP受体孵育15、30、60和120分钟，并检查交联产率。发现56FSK位点与其他位点相比具有最高的交联速率，表明C8-56FSK具有最快的交联率(2小时内交联>50％)(图7C)。
实施例12——FSY修饰的Her3-SdAb的鉴定和动力学
C9文库生成。使用序列分析(abYsis)来确定Her-3抗体序列中的互补决定区(CDR)环位置。构建文库以用TAG密码子单独替换每个CDR残基，并在每个位置并入非天然氨基酸FSY的条件下表达。
构建了载体pBAD-C9 WT。C9 WT序列(SEQ ID NO:24)针对大肠杆菌表达进行了密码子优化。通过NdeI和HindIII限制性内切酶将C9-gblock序列(SEQ ID NO:79)克隆到消化的pBAD载体(Genescript cat#SC1010)中，来构建pBAD-C9 WT载体(SEQ ID NO:83)。如实施例2所述创建C9-FSY变体的文库，不同之处在于pEVOL-FSYRS质粒和单个突变体pBAD-C9突变体在BL21细胞而不是DH10b细胞中转化和表达。FSY修饰的C9-sdAb(C9-FSY)的表达遵循实施例2中描述的方法，不同之处在于FSY-修饰的C9-sdAb在亲本菌株FSYRS-BL21中表达并纯化。
负责交联的库的鉴定。为了初步鉴定含有交联可相容FSY位点的CDR区，最初将含有在多个CDR区具有TAG位点的质粒的菌株合并(表7)。如实施例2所述，通过Ni-NTA亲和力表达和纯化合并的菌株，对浓度进行归一化，并经由SDS-PAGE凝胶位移评估交联。C9-FSY库混合物与Her3(Acrobiosystem#ER3-H5223-100ug)以3:1的比例(3ug C9 FSY比1ug Her3受体)在37℃、1XPBS、pH 7.4下孵育过夜。反应在4-20％的TGXTM上进行，然后用考马斯蓝染色。合并移位的结果显示了库2、3和4内的Her3受体交联活性(图8A)。
表7.为表达C9 FSY混合物设计的CDR库
库编号 CDR区
1 CDR1(28-37)
2 CDR2(52-58)
3 CDR2(59-63)
4 CDR2(64-68)
5 CDR3(101-106)
6 CDR3(107-112)
7 CDR3(113-118)
负责与Her3交联的单个FSY位点的鉴定。为了鉴定负责交联的每个单独的FSY位点，将每个TAG突变体与pEVOL-FSYRS共转化到BL21细胞中，如上所述进行表达和纯化。将候选库中的每个FSY突变体与Her3受体在37℃下孵育过夜。通过在4-20％的 TGXTM上用考马斯蓝染色进行反应来评估交联。(图8B)。发现CDR2中的八个C9-FSY突变体支持与Her3的交联(53、55、56、57、58、60、64、67)。发现两个位点(55、57)在所有交联位点中具有最高的交联产率。
以最快的速率鉴定C9-FSY交联位点。为了以最快的速率鉴定FSY交联位点，将具有以上鉴定的FSY位点的C9与Her3受体(Acrobiosystem)一起孵育，并测定交联产率。C9-FSY突变体与Her3受体以8:1的摩尔比在pH 7.4的1x PBS中孵育。1小时后，通过添加至含有100mM DTT的最终1X SDS负载染料中来停止孵育，并通过4-20％的Mini TGXTM用考马斯蓝染色来分析反应。
与其他位点相比，发现独特的55FSY位点具有最高的交联产率(1小时内>50％)，表明55FSY具有最快的交联速率(图8C)。通过将C9-55FSY与Her3受体孵育并在0、15、30、60、120和180分钟的时间过程中停止反应，进一步分析了C9-55FS。如图8D所示，交联迅速进行，并在15分钟内检测到，1小时内交联超过50％。
实施例13——FSY修饰和未修饰的C2 sdAb的结合亲和力
选择在位置54具有FSY的C2 sdAb(C2-54FSY)，以比较与在相同位置具有酪氨酸的C2 sdAb(C2-54TYR)的结合亲和力。如实施例2所述制备蛋白质，并且然后经由FPLC尺寸排阻色谱法(HiLoad16/600Superdex 200pg尺寸排阻柱Cytiva#28989335)进一步纯化。1xDPBS用作运行缓冲剂，并通过等度洗脱收集蛋白质。对于每种C2sdAb，通过还原SDS-PAGE分析单体峰部分，并将其合并并且透析到阴离子交换运行缓冲剂(20mM Tris、7.5和20mMNaCl)中，在4℃下过夜。为了去除内毒素，透析的样品库在HiTrap Q XL 1ml柱(Cytiva#17515801)上以流通模式运行，其中内毒素与柱结合。收集流通液并检查内毒素水平。最后，将完全纯化的样品透析到1x DPBS中作为最终制剂缓冲剂。样品被等分并在-80℃下储存。
使用具有AHC传感器(Sartorius项目#18-5060)的生物层干涉法测量结合动力学。PSMA(50nM)，带有Fc标签(Acrobiosystem PSA-H5264-100ug)，带有C2-54FSY或C2-54TYRsdAb(蛋白质浓度400nM、200nM、100nM、50nM)。进行OCET测量的步骤作为基线：60秒；装载受体：300秒，洗脱非结合受体：300秒；装载关联的sdAb：100秒；解离：600秒。C2-54TYR的KD为9.1nM，并且C2-54FSY的KD为10.9nM，表明在位置54并入FSY代替酪氨酸不会改变结合亲和力。
实施例14——细胞结合测定
使用流式细胞术评估C2-54FSY和C2-54TYR sdAb与人前列腺肿瘤细胞系LNCaP(PSMA+)和PC3(PSMA-)的结合。将来自实施例13中的蛋白质用FACS缓冲剂(1xPBS+2％ HI-FBS)配制至3μM(1000μL)，并且然后连续稀释5x(200μL sdAb至800μL FACS缓冲剂)，以生成8个浓度点用于测定，最低浓度为0.0000384μM。对照sdAb(人Alexa Fluor Alexa 647-缀合的抗体)用FACS缓冲剂(1xPBS+2％ HI-FBS)配制至1μM(450μL)，并且然后连续稀释3x(150μL试验制品至300μL FACS缓冲剂)，最低浓度为0.00045μM。
结合测定。LNCaP和PC3细胞系(ATCC)在37℃、5％ CO2的加湿环境中，在补充有10％热灭活胎牛血清(Thermo Fisher)的RPMI-1640和F12K培养基中维持。在指数生长阶段收获细胞，计数并等分至v-底96孔板，每孔100μL细胞。通过离心将细胞沉淀。将C2 sdAb和对照sdAb样品加入细胞中，并在冰上孵育一小时。对于用C2 sdAb处理的细胞，孵育后，用FACS缓冲剂洗涤细胞两次，并在冰上用100μL含有5μg/mL二抗的冰冷FACS缓冲剂(AlexaFluor 647AffiniPure山羊抗羊驼IgG，VHH域)孵育30分钟。然后用FACS缓冲剂洗涤细胞两次，并用4℃固定缓冲剂(Thermofisher，Cat.No.0082249)固定30分钟。对于用对照sdAb处理的细胞，孵育后，用FACS缓冲剂洗涤细胞两次，并用4℃固定缓冲剂(Thermofisher，Cat.No.0082249)固定30分钟。固定后，洗涤细胞两次，并用Attune流式细胞术(ThermoFisher)进行分析。
分析原始数据(FCS文件)(Flowjo 10.7.2)。FSC-A和SSC-A用于分离总细胞，并且完整细胞用FSC-A和SSC-A门控。然后用FSC-A针对FSC-H门控单峰。用Alexa Fluror-647分离单峰。样品的Alexa Fluror-647信号强度的几何平均强度用于进一步分析和绘图。计算了样品的Alexa Fluror-647的几何平均强度的平均值和STDEV值(用于Microsoft 365MSOVersion 2202Build 16.0.14931.2012864-位的)。曲线拟合和绘图采用‘log(激动剂)与反应-可变斜率(四个参数)’(GraphPad Prism 9.2.0)进行。
以剂量依赖的方式与LNCaP细胞结合的C2-54TYR和C2-54FSY未表现出与PSMA阴性PC3细胞结合(图9)。根据LNCaP细胞流动染色后的EC50值测量C2-54TYR和C2-54FSY的结合亲和力(表8)。
表8.C2 sdAb在LNCaP细胞中的结合亲和力
C2-54TYR C2-54FSY
EC50 14.88nM 12.25nM
EC50范围 8.83nM至27.05nM 8.98nM至16.88nM
平方R 0.978 0.99
实施例15——FSY修饰的sdAb与靶细胞的交联
比较了C2-54TYR、C2-54FSY和C3-101FSY的交联对细胞结合的影响。如实施例14所述培养LNCaP和PC3细胞。将细胞以500,000个细胞/孔的密度铺板在它们的生长培养基中的6孔板中。接种后48小时，去除培养基，并在指定浓度和时间点加入0.8mL含sdAb的培养基(见表9和表10)。将细胞漂洗两次(1mL/孔1xPBS)，并加入0.2mL/孔0.25％ EDTA-胰蛋白酶(Gibco，Cat.No.25200-056)。在培养箱中孵育五分钟后，加入1ml完全培养基以中和胰蛋白酶。细胞被冲洗并沉淀。
细胞在补充有蛋白酶抑制剂混合物(Santa Cruz Biotechnology，Cat.No.SC-24948A)的RIPA缓冲剂中裂解。变性的样品通过在4-20％标准TGX凝胶(Bio-Rad，Cat.No.5671095)中电泳，然后用试剂盒(Bio-Rad，Cat.No.1704271)和Pierce Fast蛋白质印迹法试剂盒(Thermo Scientific,Cat.No.35060,35061)进行蛋白质印迹，并使用一抗抗人PSMA(Invitrogen，Cat.No.37-3900)或抗羊驼VHH(Jackson ImmunoResearch，Cat.No.128-035-232)、内标抗GAPDH(Cell Signaling Technology，Cat.No.CST-2118)进行分析。
图像由Azure Biosystem C600采集。GIMP 2.10.28用于处理图像。按照说明(imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html#infobox:Densitometry，第30.13节)用ImageJ 1.51j8测定蛋白质印迹中带的密度。交联PSMA与总PSMA的百分比用以下式计算：交联PSMA的密度/(交联PSMA的密度+未交联PSMA的密度)x 100％。
在LNCaP细胞的蛋白质印迹中观察到用抗PSMA抗体检测到的主要带(约100kD)(图10A)，但在PC3细胞中没有检测到分子量相似的带(图10B)，这证明了抗PSMA抗体的特异性，并证实了LNCaP细胞中PSMA表达的特异性。在用C2-54FSY处理的LNCaP细胞中，检测到PSMA上方的额外带。带的强度以时间和浓度依赖的方式增加，表明特定的交联。然而，在用不同浓度的C2-54TYR处理不同时间的LNCaP细胞中，观察到类似强度的非交联PSMA带，但没有交联带，表明没有FSY的sdAb在LNCaP细胞中没有与PSMA交联(图10B)。交联的定量表明，C2-54TYR在LNCaP细胞中以时间和剂量依赖的方式与PSMA交联。(表9和图10C)
表9.C2-54FSY与PSMA在LNCaP细胞中的交联动力学
在用C3-101FSY处理的LNCaP细胞中，观察到类似的模式，交联带(PSMA-sdAb)的强度以时间和浓度依赖的方式增加。由于C3-101FSY的分子量高于C2-54FSY，迁移的交联带的表观分子量比C2-54FSY的交联带高(图11A)。C2-54FSY和C3-101FSY的交联动力学的比较如表10和图11B所示。
表10.C2-54FSY和C3-101FSY与PSMA在LNCaP细胞中的交联动力学
实施例16-体内交联测定
本研究在两种小鼠异种移植肿瘤模型LNCaP和PC3中评估了C2-54TYR和C2-54FSY与PSMA的体内交联、全身和瘤内暴露。LNCaP和PC3细胞系(ATCC)分别在37℃、5％ CO2的加湿环境中补充有10％热灭活胎牛血清(Thermo Fisher)的RPMI-1640和F12K培养基中维持。在指数生长阶段收获细胞，并在冷冻离心机中以335xg离心，并吸出培养基。对于细胞接种，将细胞沉淀物重新悬浮在100μL无血清F-12K培养基(用于PC3)或RPMI(用于LNCaP)再加上100μL Matrigel中。将含有500万个PC3细胞或300万个LNCaP细胞的200μL植入雄性NSG小鼠(Jackson Labs)的胁腹。当肿瘤尺寸达到约200mm3时，通过尾静脉注射C2-54TYR和C2-54FSY。通过颊出血采集外周血样品。6小时后，处死小鼠，并采集外周血样品和肿瘤二者，称重并在-80℃下冷冻。
向肿瘤样品(约30至40mg)中加入含有蛋白酶抑制剂混合物的1ml RIPA缓冲剂(Santa Cruz Biotechnology，Cat.No.SC-24948A)，然后用Qiagen Tissuelyser II样品粉碎机均质化。均质化后，样品在4℃下以12,000rpm离心10分钟。保留上清液，并丢弃沉淀物。重复一次离心过程(总共两次)。
使用BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific，Cat.No.23225)定量肿瘤裂解物的蛋白质浓度。样品用RIPA缓冲剂配制至相同浓度，然后在加入6x还原装载缓冲剂(AlfaAesar，Cat.No.J61337)后在100℃下加热10分钟。变性的样品通过在4-20％标准TGX凝胶(Bio-Rad，Cat.No.5671095)中电泳，然后使用抗PSMA和抗VHH进行蛋白质印迹(Bio-Rad，Cat.No.1704271和Thermo Scientific，Cat.No.35060,35061)以检测交联和抗GAPDH抗体作为装载对照进行分析。图像由Azure Biosystem C600采集。GIMP 2.10.28用于处理图像。对血浆进行ELISA，并对数据进行处理和绘制(GraphPad Prism 9.2.0)。计算平均值和STDEV，并使用非配对双尾学生t检验评估血浆浓度的显著性。
如上所述制备源自施用C2-FSY或C2-TYR的动物的LNCaP和PC3肿瘤的样品，并用抗VHH抗体进行蛋白质印迹，以检测非交联的C2化合物(印迹的15kD区域)和交联的C2化合物(PSMA上方约100kD区域)。在来自施用C2-54FSY的动物的LNCaP肿瘤样品中，抗VHH蛋白质印迹在所有样品中检测到PSMA区域上方的带(约100kD)，而在C2-54TYR或媒介物样品中没有观察到交联带(图12A)，表明C2-54FSY具有特异性和可重复的交联。在PC3肿瘤样品中没有观察到抗VHH信号，而在用C2-54TYR和C2-54FSY处理的LNCaP样品中观察到不同的带模式。在印迹的约15kD区域中显示了未交联/游离的sdAb，C2-54TYR和C2-54FSY处理的LNCaP样品二者均显示了相似强度的带，表明存在相似水平的未交联sdAb。在C2-54FSY处理的LNCaP肿瘤组织中，观察到一条额外的带在约100kD处时特异性迁移，而在来自C2-54TYR处理动物的PC3样品或LNCaP样品中，在该区域没有观察到带，表明C2-54FSY与PSMA交联。
为了估算和比较sdAb的全身暴露，使用ELISA在给药后30分钟和6小时测量了C2-54TYR和C2-54FSY的血浆浓度(表11和图12B)。
表11.C2-54TYR和C2-54FSY的血浆浓度(ng/ml)
结果表明，单次IV剂量后，C2-54TYR和C2-54FSY进入肿瘤并以PSMA依赖的方式积聚。然而，在肿瘤中，只有C2-54FSY与PSMA特异性交联。
实施例17用于靶标特异性交联的FSK修饰的和FSY修饰的sdAb的构建
按照实施例2和11的一般方法构建、表达和纯化文库和文库菌株。为了初步鉴定含有与FSY或FSK插入相容的位点的CDR区，构建了含有CDR区的编码区内的TAG密码子的质粒的菌株。表12显示了用于筛选的sdAb和CDR序列。
表12：具有FSY和FSK插入的sdAb
筛选。在库中筛选含有CDR区的编码区内具有TAG密码子的质粒的菌株，并按照实施例11和12的一般方法测定交联。通过评估单个FSY或FSK突变体的交联，进一步分析了显示对靶标具有交联活性的库。显示交联的单个突变体显示在表13中。
表13：针对交联sdAb的FSY和FSK插入的鉴定
用于交联测定的靶标的试剂。CEACAM5购自Acrobiosystem(#CE5-HF255-25μg)和Sinobiological(#11077-H02H-100μg)。FAP受体购自Acrobiosystem(#AP-H5263-100ug)。人FolRa(叶酸受体α)受体购自Acrobiosystem(#FO1-H5253-100ug)。MSLN(间皮素)购自Sinobiological(Cat:13128-HNCH，Cat:13128-H01H-B)和Acrobiosystem(#MSN-H526x-100ug)。人MSLN胞外域购自Acrobiosystem(#MSN-H5253-100ug，#MSN-HF223-25ug)。Her3胞外域购自Acrobiosystem(#ER3-H5223-100ug)。人CD123蛋白胞外域购自SinoBiological(#10518-H02H-50ug)。人5T4细胞外域购自Acrobiosystem(#TPG-H5253-100ug)。
对于C8 FSY sdAb，按照实施例11的方法分析交联动力学。图13显示了0-180分钟的交联。发现C8-54 FSY位点与其他位点相比具有最高的交联速率(2小时内交联约50％)。类似地，比较了C18-FSY和C18-FSK sdAb与HER3受体的交联速率。在位置33、101和103之间，观察到位置101FSY实现了最高的交联效率和速率。对于位置30、32、35的C18 sdAb FSK变体，观察到位置35FSK对Her3实现了最高的交联效率和速率。对C20 FSY sdAb中3个位点的评估表明，位置57对CD123实现了最高的交联效率和速率。
实施例18FSY修饰的DARPin的鉴定和动力学
筛选Her2结合DARPin(C15)的通过插入FSY氨基酸进行交联的能力。按照实施例2的一般方法构建、表达和纯化文库和文库菌株。C15 WT序列(SEQ ID NO 29)如表14所示，通过FSY插入筛选的区域以粗体显示，而FSY替换的氨基酸位置如表的第二行所示。
表14.用于将FSY替换至HER2 DARPin中的氨基酸位置
按照实施例11的一般方法，为了交联效率将每个单独的C15-FSY突变体与Her2受体一起孵育。C15中的位点9、12、37、66、68显示与Her2受体交联，如图14所示。为了以最快的速率鉴定FSY交联位点，将具有以上鉴定的FSY位点的DARPin与Fc标记的Her2(Acrobiosystem：Acrobiosystem：#HER2-H5253-100ug)一起孵育，并在15分钟和30分钟时检查交联。发现C15-66 FSY位点与其他位点相比具有较高的交联产率。
通过用5个氨基酸的GGGGS连接体将一个没有FSY替换C16的DARPin拷贝(SEQ IDNO 30)融合至C15-66FSY的C末端以制备融合蛋白，来构建双互补位DARPin(C15-66FSY-C16，下文称为C38-FSY)。将C38-FSY蛋白与Fc标记的Her2一起孵育，并按照实施例11的一般方法检查交联。双互补位C38-FSY以时间依赖的方式交联Her2，在2.5小时内交联50％，如图15所示。
实施例19与靶向成像有效负荷的细胞结合
按照实施例2的一般方法表达和纯化C22-TYR和C22-FSY(分别为SEQ ID No.39和40)，不同之处在于，从Ni-NTA树脂洗脱后，将纯化的蛋白质缓冲剂交换到阴离子交换运行缓冲剂(20mM Tris、7.5和20mM NaCl)中，在4C下使用1:100的稀释因子过夜。透析的样品库以流通模式通过HiTrap Q XL 5ml柱(Cytiva#17515801)，其中内毒素与柱结合。通过还原SDS-PAGE分析sdAb单体流通部分并将其合并。然后将纯化的C22-TYR和C22-FSY与AZ Dye680缀合(Click Chemistry Tools，Catalog#1578-25)。
使用分选酶介导的连接将AZ Dye680(Click Chemistry Tools，Catalog#1578-25)缀合至C22-FSY和C22-TYR，以产生C23-TYR和C23-FSY。通过IDT对分选酶gblock序列进行密码子优化和排序，克隆到pBAD载体中，并如描述制备(PubMed：21697512)。为了将sdAb构建体与AZ Dye 680缀合，在30℃下将20mg在pH 7.4的PBS中纯化的蛋白质与1mM CaCl2、0.5mM AZ Dye 680、2mg分选酶在振荡器中一起孵育(sdAb的最终浓度为约0.7mg/mL)。2小时后，加入2mM MTSET以淬灭反应。将淬灭的反应分批结合至2mL(PBS平衡的)Ni树脂上，以去除分选酶和未缀合的物质，在室温下回转30分钟。旋转珠子以促进树脂与未结合部分的分离(700g x 10min，20℃)，并且通过装入玻璃柱并用PBS洗涤珠子来收集剩余的蛋白质，从而收集流通液。将流通液和洗涤液合并并浓缩(5K MWCO，4k rcf，10C，1.5h)，然后装载到HiLoad 26/600Superdex 75pg(Cytiva，#28-9893-34)上，以去除未缀合的染料。收集各部分，并通过SDS-PAGE进行分析，并且合并，并在-80℃下储存。
通过流式细胞术评估所得缀合物C23-TYR和C23-FSY与人表皮样鳞状细胞癌系A431(EGFR+)和人结直肠癌细胞系COLO320DM(EGFR-)的结合。用FACS缓冲剂(1xPBS+2％HI-FBS+5mM EDTA)将蛋白质配制至30μM(10x最终浓度)，并且然后连续稀释5x(20μL sdAb至80μL FACS缓冲剂)，以生成8个浓度点用于测定，最低浓度为0.000384μM(10x最终浓度)。A431和COLO320DM细胞系(ATCC)均在37℃、5％ CO2的加湿环境中，在补充了10％热灭活胎牛血清(Thermo Fisher)的RPMI-1640中维持。在指数生长阶段收获细胞，计数，以1.1x106/mL重新悬浮在冰冷的FACS缓冲剂中，并以90μL/孔等分到v底96孔板(Corning 3897)中。将C23-TYR和C23-FSY蛋白质添加到A431细胞中，10uL/孔，使最终浓度达到1x。为了控制与EGFR+细胞结合的特异性，将相同稀释范围的试验制品加入COLO320DM细胞中。在冰上孵育2小时后，以2000rpm将细胞沉淀两分钟，然后用200μL FACS缓冲剂洗涤两次，然后重新悬浮在100μL冰冷的FACS缓冲剂中，并用NovoCyte流式细胞仪(ACEA/Aglient)进行分析。
使用FlowJo 10.7.2分析原始数据(FCS文件)。使用FSC-A和SSC-A鉴定总完整细胞，然后用FSC-A对FSC-H筛选出单峰。使用样品的AZ680几何平均荧光强度进行进一步分析和绘图。使用‘log(激动剂)与反应-可变斜率(四个参数)’，AZ680通道的几何平均荧光强度(GeoMean或GeoMFI)用于计算GraphPad Prism(V9.3.1)中的EC50。
如图16所示，以剂量依赖的方式与A431细胞结合的C23-FSY和C23-TYR未显示与EGFR阴性COLO320DM细胞结合。如表15所示，根据A431细胞的染色和流式细胞术后的EC50值测量C23-FSY和C23-TYR的结合亲和力。
表15.C23-FSY和C23-TYR AF680缀合物对A431细胞的结合亲和力
C23-TYR C23-FSY
EC50(nM) 95 18
EC50范围 415.2-613.1 444.7-618.2
平方R 0.99 1.00
实施例20使用靶向成像有效负荷进行体内肿瘤锁定
本研究评估了荧光标记的sdAb的体内交联。按照实施例19的方法对C22-FSY和C22-TYR进行修饰，以产生AZ680缀合物C23-FSY和C23-TYR(分别为SEQ ID No.42、41)。在A431表皮样鳞状细胞癌异种移植肿瘤模型中评估了C23-FSY和C23-TYR与EGFR的体内交联。人结直肠癌异种移植模型COLO320DM作为EGFR对照。根据供应商的方案(ATCC)培养两种细胞系。在注射当天，收获细胞，在无血清培养基中洗涤，计数，并重新悬浮在冷的无血清培养基中。将A431细胞沉淀物重新悬浮在100mL无血清DMEM和COLO320DM 100μL RPMI1640中，然后将细胞与100mL Matrigel混合，使最终浓度为5x 106活细胞/100μL。将含有1000万个A431或COLO 320DM细胞的200mL体积植入6-8周龄雌性Balb/c裸小鼠的右上胁腹(CharlesRiver)。当肿瘤尺寸达到约200mm3时，通过尾静脉以10mL/kg的体积注射5mg/kg的C23-FSY、C23-TYR或媒介物对照(PBS)。给药后0.5小时经由颊出血采集外周血样品，以确认给药准确性。
如表16所示，在2个不同时间点研究了试验制品的生物分布。对动物实施安乐死，收获肿瘤，称重并放置在冰上进行离体IVIS成像，并且然后快速冷冻进行蛋白质印迹分析。
表16.生物分布分析的时间点
组织处理。称取一块肿瘤(约30至50mg)，用剃须刀片切成小块。将切下的肿瘤组织放入CK28-R管(Bertin Instruments，Cat.P000916LYSK0-A)中，并加入0.5ml含有Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo Scientific Cat.78446)的T-PER缓冲剂(ThermoScientific Cat.78510)。然后用Precellys 24组织匀浆器将组织均质化。均质化后，将样品在4℃下以12,000x rpm离心10分钟。然后保留上清液，并丢弃沉淀物。再一次重复离心过程(总共两次)。
凝胶成像。按照制造商的说明，使用Pierce Rapid Gold BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific Cat.A53225)定量肿瘤裂解物的蛋白质浓度。使用从试剂盒中以1mg/mL BSA开始的7点2倍稀释的BSA作为标准。用T-PER缓冲剂将样品配制成相同的浓度(3.6mg/mL)，并且然后在1x还原的装载缓冲剂中在95℃下加热10分钟，产生3mg/mL的最终浓度。接下来，将每个样品的30ug总蛋白装载到4-20％的标准TGX凝胶(Bio-Rad，Cat.5671085)上进行电泳。图像由Azure Biosystem C600利用NIR-700通道采集。GIMP2.10.28用于处理图像。
图17显示了A431(EGFR+)和COLO320DM(EGFR-)肿瘤中肿瘤内游离和EGFR交联的sdAb的时间依赖性方式。在约15kD区域检测到游离sdAb(下图，标记为游离VHH)，在约175kD区域检测到EGFR交联的sdAb带(上图，标记为VHH-EGFR交联)。在EGFR+A431肿瘤中，观察到EGFR与C23-FSY的时间依赖性交联，但没有观察到与C23-TYR的时间依赖性交联。在EGFR-COLO320DM肿瘤中既没观察到游离sdAb保留也没观察到交联。
离体IVIS成像数据分析：肿瘤被解剖并用AMI HTX成像；使用Aura软件(SpectralInstruments imaging，版本4.0.7)分析成像数据。通过在单个肿瘤周围创建ROI来获得平均辐射效率值(Aura中的Ellipse ROI工具)。测量并记录总发射(光子/s)。将总发射值归一化为组织重量(光子/s/g)。使用配对T检验(*＝p≤0.05，**＝p≤0.005)在Prism(v 9.1.0(221))中确定统计显著性。图18显示了施用C23-FSY和C23-TYR后8小时和24小时，A431和COLO320DM肿瘤组织的离体成像。
图18A显示了三次生物复制中的光子/s/g肿瘤组织。显示了来自单个动物的值，中心条显示了平均强度，并且误差条表示SEM(通过配对t检验，*表示p＝0.024，**表示p＝0.002)。在8小时和24小时的时间点，与C23-TYR蛋白质相比，C23-FSY在A431肿瘤中的水平均明显更高。24小时后，在A431肿瘤组织中在非常低的水平观察到C23-TYR，而C23-FSY，特别是EGFR-VHH交联物种，是突出的(图17，18A)。由于试验制品具有相似的亲和力(图16)，这些结果共同表明，含有FSY的sdAb的肿瘤AUC可以通过共价性增加。
图18B显示了给药后8小时和24小时施用C23-FSY的动物的A431和COLO320DM肿瘤的定量离体荧光强度。图显示了三次生物复制中的光子/s/g肿瘤组织。显示了来自单个动物的值，中心条显示了平均强度，误差条表示SEM。在8小时和24小时的时间点，A431肿瘤中C23-FSY的水平均显著高于EGFR-COLO320DM肿瘤中的量，表明了C23-FSY蛋白质的肿瘤锁定的特异性。
这些结果表明，具有交联相容的非天然氨基酸的靶向域(诸如sdAb)可以以靶向特异性将有效负荷(这里是成像染料)携带到肿瘤中，并且与没有交联相容的非天然氨基酸的靶向域相比，还可以提高有效负荷在靶位点的保留。
实施例21使用靶向成像有效负荷进行体内PSMA肿瘤锁定
本研究评估了LNCaP小鼠前列腺癌异种移植肿瘤模型中荧光标记的sdAb的体内PSMA交联、全身和肿瘤内暴露。
按照实施例19的方法使用C29-101TYR和C29-101FSY(SEQ ID NO:53或54)(在位置101处具有TYR或FSY)，制备与AZ Dye680缀合的PSMA靶向sdAb，以产生C30-TYR和C30-FSY(分别为SEQ ID NO:55、56)。LNCaP细胞在37℃、5％ CO2的加湿环境中维持在补充有10％热灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基中。在植入当天，收获细胞，在无血清培养基中洗涤，计数，并重新悬浮在冷的无血清培养基中。将细胞沉淀物重新悬浮在50μL无血清RPMI中，并与50μL Matrigel混合，使最终浓度为5x 106个活细胞/100μL。将含有500万个LNCaP细胞的100μL体积植入雄性NU/J小鼠(Jackson Labs)的右上胁腹。当肿瘤尺寸达到约200mm3时，以10mL/kg的体积通过尾静脉注射5mg/kg的C30-TYR或C30-FSY。给药后0.5小时经由颊出血采集外周血样品，以确认给药准确性。如表17所示，在8个不同时间点(给药前、给药后15分钟、1h、6h、24h、48h、72h和96h)研究了试验制品的生物分布。安乐死后，收获集肿瘤组织，称重，IVIS离体成像，并且然后快速冷冻进行蛋白质印迹分析。
表17PK采样的时间点
使用实施例20的方法进行组织处理、蛋白质定量和归一化。为了定量游离和PSMA交联的sdAb试验制品，在T-PER缓冲剂中从500ng/mL开始制备C30-FSY的2倍16点标准曲线。标准品在1x还原装载缓冲剂中在95℃下加热10分钟。基于样品中试验制品浓度的估计，对不同的凝胶使用不同范围的标准品。使用Excel中的线性拟合函数，使用标准品的带面积相对于其浓度生成标准曲线。按照说明(https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html#infobox:Densitometry，第30.13节)用ImageJ 1.51j8测定图像中带的密度。在用ImageJ获得样品的带的面积后，用从标准曲线的线性拟合推导的式计算泳道中的TA量。当装载30μg总蛋白质时，泳道中的TA量也是30μg总蛋白质中的TA量。肿瘤sdAb浓度(pg sdAb/mg肿瘤组织)＝泳道中的sdAb量(pg)*(蛋白质浓度(mg/ml)*(0.5ml*1000/30μg)/肿瘤组织重量(mg)。所得标准曲线包含至少5个R2>0.99的点。采用GraphPad Prism使用梯形规则计算曲线下面积(AUC)，其中两个相邻点之间的面积计算为ΔX*([(Y1+Y2)/2]-基线](https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/statistics/stat_area_under_the_curve.htm)。C30-TYR的AUC为1676，并且C30-FSY的AUC为4902。
图19显示了SDS-PAGE凝胶的荧光图像，显示了施用C30-TYR和C30-FSY后肿瘤相关的游离sdAb和PSMA交联的sdAb的时间依赖性方式。在治疗后的指定时间点，收集肿瘤并进行凝胶电泳处理，以检测荧光团缀合的sdAb试验制品。在约20kD区域检测到游离(非交联)sdAb-AF680(下图)，并且C30-FSY的PSMA交联的sdAb-AF680物种在100kD区域迁移(上图)。标有*的泳道显示了媒介物样品。
图20显示了肿瘤相关游离和PSMA交联试验制品的定量分析。经由密度测定法定量来自以上凝胶的游离和PSMA交联物种带的荧光带强度，并与标准曲线进行比较。绘制肿瘤内试验制品总浓度(游离和交联PSMA，pg/mg肿瘤组织)与时间(h)的关系图。用*表示的数据点表示低于检测和定量限的样品。相对于非共价C30-TYR相比，C30-FSY的肿瘤暴露量增加到约3x。
实施例22细胞毒性有效负荷的递送
在有和没有FSY替换的情况下制备C25和C27 sdAb，以生成C25-54TYR、C25-54FSY、C27-101TYR和C27-101FSY(分别为SEQ ID NO:45、46、49、50)。按照实施例2的一般方法表达和纯化蛋白质，不同之处在于从Ni-NTA树脂洗脱后，将纯化的蛋白质缓冲剂交换到阴离子交换运行缓冲剂(20mM Tris，7.5和20mM NaCl)中，在4C下使用1:100的稀释因子过夜。透析的样品库以流通模式通过HiTrap Q XL 5ml柱(Cytiva#17515801)，其中内毒素与柱结合。通过还原SDS-PAGE分析sdAb单体流通部分并将其合并。
将sdAb构建体缀合至MC-PEG8-VC-PABC-MMAE(结构如下图所示)，形成C26-54TYR、C26-54 FSY、C28-101TYR和C28-101FSY。首先用1mM EDTA和1.5当量TCEP(10mM在脱氧水中)还原样品，并在室温下孵育1小时。还原后，使用Zeba Spin脱盐柱(Thermo P/N89891，7K MWCO)去除任何残留的TCEP，使用1X PBS中的1mM EDTA作为平衡缓冲剂。将丙二醇(PG)和二甲基乙酰胺(DMA)加入反应混合物(Cf＝10％v/v)中以提高连接体有效负荷溶解度，并加入1.5当量的连接体有效负荷。轻轻涡旋混合反应，并在4℃下孵育过夜。将缀合物混合物加入预水合透析盒(约1ml样品：3500mL缓冲剂体积)中，并透析至少2小时。更换透析缓冲剂，并在移除样品进行通过A280和分析SEC的分析之前，在4℃下透析样品过夜。按照标准PD-10旋转方案(平衡缓冲剂：1xPBS，pH 7.4)，使用Cytiva PD-10柱(每个柱4.3mLSephadex G-25吸附剂)移除未缀合的连接体有效负荷。收集洗脱液后，用另外1mL pH 7.4的1X PBS冲洗柱。在PD-10上纯化后，使用Thermo Scientific Slide-A-Lyzer迷你透析装置(3.5k MWCO)使用50mL 1xPBS对样品进行最后的透析步骤。所有样品都通过0.2μm无菌PES过滤器，并在-20℃下储存。
MC-PEG8-VC-PABC-MMAE：
为了测量含FSY的sdAb缀合物与非共价sdAb缀合剂相比在体外特异性递送细胞毒性有效负荷至表达永生化PSMA的肿瘤细胞系的能力，将细胞可渗透有效负荷单甲基奥瑞他汀以1的药物抗体比(DAR)缀合至sdAb。工程化用于表达PSMA的PC3pip细胞系和PC3 fluPSMA阴性细胞系(由Case Western Reserve University，Cleveland，OH的XinningWang教授和Warren D.Heston教授提供)在37℃、5％CO2的加湿环境中，在由补充有10％热灭活胎牛血清(Thermo Fisher，FB-12)的RPMI-1640(Thermo Scientific，11875-903)组成的生长培养基中维持。使用TrypLE Express(Thermo Scientific，14175-095)在指数生长阶段收获细胞，并在黑色96孔平透明底板(Costar，3603)中以800个细胞/孔接种在100μL生长培养基中。然后将细胞在37℃、5％CO2的加湿环境中孵育过夜，使细胞粘附在板上。下表所列的sdAb-MMAE缀合物在生长培养基中稀释至50x最终浓度，并以3倍的增量稀释，形成10点稀释系列。将每个50x试验制品稀释系列的各2μL体积的溶液加入孔中，一式三份，以达到1x最终浓度(表18中指示每个系列的最高浓度)。
表18.试验制品缀合物
名称 剂量响应中的最高浓度(1X)
C26-54TYR 158nM
C26-54FSY 137nM
C28-101TYR 208nM
C28-101FSY 127nM
将板放回培养箱中4天，其后评估细胞生存力。将CellTiter G1o(Promega，G5737)以50μL/孔添加到所有板中，然后在室温下以1000rpm摇晃板一分钟。然后在Victor X5读板器(PerkinElmer)上读取发光，并报告为相对发光单位(RLU)。在Excel中计算生存力(适用于Microsoft 365MSO，Version 2202Build 16.0.14931.20128，64-位的)，生存力％＝100*(处理的RLU/未处理的RLU)。在GraphPad Prism(V9.3.1)中以试验制品的生存力％与浓度绘制数据，并且使用1og[抑制剂]与反应-可变斜率(四个参数)计算IC50。
观察到sdAb-PEG8-VC-PABC-MMAE缀合物对PC3flU细胞系具有极低水平的细胞毒性活性，这与该细胞系上缺乏PSMA靶表达一致。C26-54TYR对PMSA的估计的亲和力为14.9nM(如实施例14中针对LNCaP细胞上的非缀合化合物所示)，显示了对PC3pip细胞的细胞毒性呈剂量依赖性增加，这与经由PSMA结合和内化靶向递送有效负荷一致。如表19所示，C26-54FSY在递送有效负荷方面的效力是C26-54TYR的3.57x，表明共价性增强了单域抗体药物缀合物的细胞效力。在第二个实例中，对PSMA的亲和力>500nM的C28-101TYR对PC3pip细胞的细胞毒性活性较低，而C28-101FSY的交联活性使效力偏移了超过400x，证实了共价性对细胞效力的影响。图21A(C26构建体)和图21B(C28构建体)显示了试验制品的细胞毒性比较，该比较显示了与MMAE缀合的sdAb的浓度与细胞生存力率曲线。用sdAb-PEG8-VC-PABC-MMAE缀合物孵育4天后，通过CellTiter-Glo测定评估PSMA+PC3pip和PSMA-PC3flu细胞的生存力。进行剂量反应分析，一式三份，符号表示平均值，并且误差条表示STDEV。
表19.sdAb-PEG8-VC-PABC-MMAE缀合物的细胞毒性的IC50值
实施例23向HER2靶标递送细胞毒性有效负荷
评估HER2靶向的sdAb(C17；SEQ ID NO:31)，以鉴定提供与HER2靶标的交联的FSY插入的独立位置。通常根据实施例2的方法克隆表达和纯化sdAb，不同之处在于选择特定的单个位点进行修饰和测试，而不是使用合并的筛选。FSY插入的选定的位点如表20所示。
表20.与靶标HER2的关注的FSY插入sdAb文库
位置52和54被鉴定为与HER2靶标交联。为了评估FSY交联动力学，将C17的52FSY和54FSY变体与Her2受体一起孵育，并检查交联效率。如图22所示，发现54FSY位点具有最高的交联速率，在一小时内交联>90％，而52FSY在2小时内交联达到90％。选择了这两种构建体，及其非FSY(TYR)对应物与细胞毒性有效负荷缀合。
表21基于C17变体的缀合物
名称
C33-54FSY
C33-52FSY
C33-52TYR
C33-54TYR
为了将sdAb构建体与GGG-PEG8-vc-PABC-MMAE缀合，如上所述纯化C32-54TYR、C32-54 FSY、C32-52TYR和C32-52FSY化合物。化合物在pH 7.4的PBS中孵育，与1mM CaCl2、10当量的连接体有效负荷(10％ DMA中10mM的储备溶液)和分选酶(2mg分选酶/10mg sdAb)一起孵育，并在4℃下孵育过夜。将反应分批结合至2mL(PBS平衡的)Ni树脂，以去除分选酶和未缀合的材料，在室温下回转30分钟。旋转珠子以促进树脂与未结合部分的分离(700g x10min，20C)，并通过装入玻璃柱并用PBS洗涤珠子以收集剩余的蛋白质，收集流通液。将流通液和洗涤液合并并浓缩(5K MWCO，4k rcf，10C，1.5h)，并且装载到HiLoad 26/600Superdex 75pg(Cytiva，#28-9893-34)上，以去除未缀合的染料。收集各部分，并通过SDS-PAGE进行分析，将其合并，并在-80℃下储存。
GGG-PEG8-VC-PABC-MMAE：
评估含有52和54位TYR或FSY的C33缀合物(表21)与人乳腺癌系BT-474(HER2+)的结合。将蛋白质在FACS缓冲剂(1xPBS+2％ HI-FBS+5mM EDTA)中稀释至3μM(1x最终)，然后连续稀释3x以生成8个浓度点用于测定，最低浓度为0.00384μM(1x最终)。
BT-474细胞系(ATCC HTB-20)在37℃、5％ CO2的加湿环境中，在由补充有10％热灭活胎牛血清(Thermo Fisher，FB-12)的RPMI-1640(Thermo Scientific，11875-903)组成的生长培养基中维持。在指数生长阶段收获细胞，并以1.0x106/mL将其重新悬浮在冰冷的pH 6.0的FACS缓冲剂(PBS pH6.0/2％ FBS/5mM EDTA)中，并以100μL/孔等分到v底96孔板(Corning 3897)中。以2000rpm将细胞沉淀2分钟，然后重新悬浮在pH6.0 FACS缓冲剂中的试验制品的滴定液中，一式两份，100μL/孔。在冰上孵育2小时后，以2000rpm将细胞沉淀2分钟，然后用200μL FACS缓冲剂洗涤两次。然后将细胞重新悬浮在100μL冰冷的FACS缓冲剂(pH 7.4)中，该缓冲剂含有1:100稀释的AF488山羊抗羊驼VHH抗体(JacksonImmunoResearch 128-547-232)。在冰上孵育30分钟后，以2000rpm将细胞沉淀两分钟，用200μL FACS缓冲剂洗涤两次，然后重新悬浮在100μL pH 7.4的FACS缓冲剂中，并用NovoCyte流式细胞仪(ACEA/Aglient)分析。
使用FlowJo 10.7.2分析原始数据(FCS文件)。FSC-A和SSC-A用于鉴定总的完整细胞，然后用FSC-A针对FSC-H门控单峰。样品AF488的几何平均荧光强度用于进一步分析和绘图。使用‘log(激动剂)与反应-可变斜率(四个参数)’，AF488通道的几何平均荧光强度(GeoMean或GeoMFI)用于在GraphPad Prism(V9.3.1)中计算EC50。试验制品以剂量依赖的方式与BT-474细胞结合。如表22所示，根据BT-474细胞的染色和流式细胞术后的EC50值测量试验制品的结合亲和力。
表22.BT-474细胞的结合亲和力
试验制品(缀合物) EC50(nM)pH6.0
C33-54FSY4 .6
C33-54TYR2 .5
C33-52FSY 49
C33-52TYR 160
然后将缀合物用于基于细胞的测定，以测量共价sdAb缀合物与非共价sdAb缀合物在体外向永生化HER2表达肿瘤细胞系特异性递送细胞毒性有效负荷的能力。如上所述维持BT-474细胞系。使用TrypLE Express(Thermo Scientific,14175-095)在指数生长阶段收获细胞，并在黑色96孔平透明底板(Costar，3603)中的100μL生长培养基中以5000个细胞/孔接种。然后将细胞在37℃、5％ CO2的加湿环境中孵育过夜，以使细胞粘附在板上。第二天，通过CTG分析一块板以确定背景。剩余的板用C33-TYR和C33-FSY缀合物处理如下：将表23中列出的缀合物在生长培养基中稀释至11x最终浓度(1.1μM)，并且然后以5倍的增量稀释，以形成10点稀释系列。将10uL体积的11x试验制品稀释系列中的每一个加入到孔中，一式三份，以达到1x最终浓度。将一组板放回培养箱中5小时，之后用100μL生长培养基轻轻冲洗每个孔一次，然后更换生长培养基(100μL/孔)，并在37℃、5％ CO2的加湿环境中培养细胞6天，从而洗掉试验制品。另一组平板与试验制品在37℃、5％ CO2的加湿环境中孵育整6天。在第6天，为了评估细胞生存力，移除所有培养的板的生长培养基，将CellTiter Glo(Promega，G5737)与等体积的PBS混合，并以100μL/孔加入所有板中，然后在室温下以1000rpm摇动板一分钟。然后在Victor X5读板器(PerkinElmer)上读取发光，并报告为相对发光单位(RLU)。在Excel中计算生存力(适用于Microsoft 365MSO,Version 2202Build16.0.14931.20128,64位的)，生存力％＝100*(处理的RLU-背景RLU/未处理的RLU-背景RLU)。在GraphPad Prism(V9.3.1)中以试验制品的生存力％与浓度绘制数据，并且使用log[抑制剂]与反应-可变斜率(四个参数)计算IC50。
结果如图23和表23所示。图23A显示了5h的洗出，并且图23B显示了连续6天的暴露。所有剂量反应分析都进行一式三份，符号表示平均值，并且误差条表示STDEV。在5小时洗出研究和6天连续暴露实验中，FSY变体相对于其TYR对应物表现出增加的细胞毒性，显示了共价形式的优越细胞效力。
表23.5小时洗出和6天暴露的细胞毒性的IC50值。
名称 IC50(nM)-5h IC50(nM)-6天
C33-52TYR ＞100 8.417
C33-52FSY ＞100 1.599
C33-54TYR 21.56 0.3279
C33-54FSY 1.00 0.106
实施例24双互补位构建体的评估-结合
如表24所示，制备了一系列具有和不具有FSY的单互补位sdAb和双互补位sdAb，并比较了它们交联PSMA靶标的能力。按照实施例2的一般方法表达蛋白质，并在实施例19中进行了修饰。
表24单互补位和双互补位构建体
按照实施例14的一般方法，使用流式细胞术评估试验制品与PSMA+LNCaP人前列腺肿瘤细胞的结合，并进行以下修饰。
C34-TYR、C35-TYR和C2-54TYR用FACS缓冲剂配制至3uM(1x最终)，并且然后连续稀释5x，以生成12个浓度点用于测定，最低浓度为0.06pM(1x最终)。在单独的实验中，C24-101TYR用FACS缓冲剂配制，并且然后连续稀释5x，以生成8个浓度点用于测定，最低浓度为38.4pM(1x最终)。除C24-101TYR为160,000/孔外，该测定中的LNCaP细胞均为120,000个细胞/孔。在冰上与试验制品孵育两小时后，每次用200μL/孔FACS缓冲剂洗涤细胞两次(500xg，3min)，然后在黑暗中用100μL冰冷的FACS缓冲剂在冰上孵育30分钟，该缓冲剂含有5μg/ml的Alexa Fluor 488AffiniPure山羊抗羊驼IgG，VHH域(Jackson ImmunoResearch，代码：128-545-230)二抗。然后用FACS缓冲剂洗涤细胞两次(200μL/洗涤)，并将其重新悬浮在100μL FACS缓冲剂中，使用NovoExpress软件版本1.5.0在Novocyte 2060(s/n 45-1-1511-2036-9)流式细胞仪上采集。分析原始数据(FCS 3.1文件)以确定Alexa Fluor-488(在FITC通道中)的几何平均强度(FlowJo v.10.8.1,Windows)。在GraphPad Prism(v 9.3.1)中绘制了样品的Alexa Fluor-488几何平均强度的平均值和STDEV与试验制品对数浓度的关系图。EC50是用方程‘log(激动剂)与反应-可变斜率(四个参数)’计算的。为了可视化数据，在Prism中对每个试验制品的结合曲线进行归一化，其中每个试验制品的最低值的平均值设置为0％，并且每个试验制品的平均最高值设置为100％。试验制品的结合亲和力由LNCaP细胞流动染色后的EC50值测量，如表25所示。双互补位蛋白以剂量依赖的方式结合LNCaP细胞。数据表明，与亲本单体化合物相比，观察到亲和力增加，因此双互补位化合物的结合具有亲和力效应。
表25.LNCaP细胞中的结合亲和力
实施例25FSY修饰的双互补位构建体与靶细胞的交联
将C34-FSY和C36-FSY与表达PSMA的细胞的交联与单价C24-101FSY进行了比较。将生长培养基中的LNCaP细胞以250,000个细胞/孔的密度接种在涂有聚-L-赖氨酸的12孔板中。接种后48小时，去除培养基，并加入含有表26所示浓度的试验化合物的0.4mL培养基1或6小时。用0.5mL/孔冰冷的1xPBS冲洗细胞两次，并加入具有1x蛋白酶抑制剂混合物的0.15mL/孔RIPA缓冲剂。在冰上孵育10分钟后，用修剪的200μL移液管尖端刮擦板，收集细胞裂解物。将裂解物转移到1.5mL Eppendorf管中，并在4℃下以12,000rpm离心10分钟。离心后，将上清液转移到新的1.5mL Eppendorf管中，并加入0.2mL/孔0.25％ EDTA-胰蛋白酶(Gibco，Cat.No.25200-056)。
变性的样品通过电泳分析，然后使用一抗抗人PSMA(Invitrogen,Cat.No.37-3900)或内标抗GAPDH(Cell Signaling Technology,Cat.No.CST-2118)进行蛋白质印迹。图像由Azure Biosystem C600采集。GIMP 2.10.28用于处理图像。按照说明，用ImageJ1.51j8测定蛋白质印迹中的带密度(https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html#infobox:Densitometry，第30.13节)。交联PSMA与总PSMA的百分比用以下式计算：交联PSMA的密度/(交联PSMA的密度+未交联的PSMA的密度)x 100％。每种试验制品(构建体)的密度与浓度图如图24A和24B所示。
蛋白质印迹结果如图25A和25B所示。所有3个测试的构建体都能够交联到PSMA。双互补位构建体C34-FSY显示出迁移的表观分子量高于单体的交联带，反映了复合物质量的增加，而C36-FSY构建体显示出表观分子量更高的交联带，表明两个PSMA分子的交联。所有FSY化合物的带的强度都以时间和浓度依赖的方式增加，表明存在特定的交联。交联的定量表明，两种双互补位构建体与PSMA的交联比单互补位构建体更有效并且更有力。(表26和图25A和25B)。
表26.LNCaP细胞中的交联动力学
实施例26具有细胞毒性有效负荷的双互补位缀合物
按照实施例24和25中一般地描述的方法制备含有与双互补位sdAb化合物缀合的细胞毒性有效负荷的试验制品，并进行以下修饰。为了实现PEG8-VC-PABC-MMAE连接体有效负荷与双互补位化合物的半胱氨酸-马来酰亚胺缀合，编码化合物C34-FSY或C34-TYR的质粒序列被修饰为在C末端处或附近含有cys残基，该化合物被表达为在位置101并入FSY或TYR，进行缀合和纯化。
为了使PEG8-VC-PABC-MMAE连接体有效负荷能够与双互补位化合物能够进行sortag介导的缀合，编码化合物C34-FSY或C34-TYR的序列被修饰为包含C末端分选酶鉴定和His标签序列，并且该化合物被表达为在位置101并入FSY或TYR，进行缀合和纯化。
如实施例22所述，维持、接种和制备工程化为表达PSMA的PC3pip细胞系和PC3fluPSMA阴性细胞系用于研究。将双互补位sdAb MMAE缀合物在生长培养基中稀释至50x最终浓度，并且然后以3倍的增量稀释，以形成10点稀释系列。将每个试验制品稀释系列添加到孔中，一式三份，以实现每个系列的1x的最终浓度(最高浓度)。
将一组板放回培养箱中5小时，之后用100μL生长培养基轻轻冲洗每个孔一次来洗出试验制品，并且然后更换生长培养基(100μL/孔)，并在37℃下5％ CO2的加湿环境中培养细胞6天。另一组板与试验制品在37℃下5％ CO2的加湿环境中孵育整个6天。在第6天，为了评估细胞生存力，移除所有培养板的生长培养基，将CellTiter Glo(Promega，G5737)与等体积的PBS混合，并以100μL/孔添加到所有板中，然后在室温下以1000rpm摇动板一分钟。然后在Victor X5读板器(PerkinElmer)或类似设备上读取发光，并报告为相对发光单位(RLU)。在Excel或类似程序中计算生存力为生存力％＝100*(处理的RLU-背景RLU/未处理过的RLU-背景RLU)。在GraphPad Prism(V9.3.1)或类似程序中以试验制品的生存力％与浓度绘制数据，并且使用log[抑制剂]与反应-可变斜率(四个参数)计算IC50。
实施例27用于治疗PSMA+肿瘤的小鼠异种移植模型
为了评估含酪氨酸和FSY的单互补位和双互补位缀合物在小鼠异种移植肿瘤模型中控制肿瘤生长的效果，采用了细胞系LNCaP(PSMA+)和PC3(PSMA-)。如实施例20和21所述，将细胞系维持、扩增并植入Balb/C裸小鼠体内。当肿瘤尺寸达到约200mm3时，通过尾静脉以不同的剂量和时间表注射双互补位C34-TYR或C34-FSY缀合物(实施例25)、单互补位C26-54TYR或C26-54FSY缀合剂(实施例22)或媒介物，诸如每天5mg/kg，持续7天。经由卡尺测量每天测量肿瘤尺寸，以跟踪肿瘤随时间的生长。处死携带的肿瘤体积达到1000mm3的动物，并记录存活时间。
实施例28-EGFR-靶向双互补位构建体
如实施例2所述，构建、克隆和表达具有FSY的EGFR靶向sdAb(C4-109FSY，SEQ IDNO:17)和具有两个EGFR靶向sdAb的双互补位构建体，这两个EGFR靶向sdAb由连接体(C4-109 TYR或FSY)-L1-C5连接，以下称为C37-TYR或C37-FSY，SEQ ID NO:69。构建体用从成熟蛋白质上切割下来的pelB前导序列(SEQ ID NO:15)合成，并使用六个C末端组氨酸进行His-Tag纯化。双互补位构建体C37在第一sdAb C4和第二sdAb C5之间包含GGGGSGGGGS(SEQID NO:14)连接体。
评估了FSY修饰的sdAb的EGFR交联的动力学。将蛋白质与EGFR以8:1的摩尔比孵育(EGFR最终浓度为0.125mg/mL，1.25μM)。在0-180分钟的时间点取样，并通过SDS-PAGE评估EGFR交联的百分比。通过量化sdAb EGFR交联带计算交联带百分比，并使用Image J量化EGFR带强度。
从时间零到360分钟采集样品。偶联的动力学如图26-27所示。将双互补位构建体与仅包含具有FSY修饰的sdAb C4(C4-109FSY)的单互补位构建体进行比较。如图27所示，如通过与单互补位构建体相比半最大交联的缩短的时间来测量的，双互补位构建体C37-FSY比单互补位C4-109FSY序列更快地偶联至EGFR。
实施例29：异多特异性结合缀合物的构建
构建了靶向多种不同抗原的含异双特异性FSY的化合物，其具有靶标的sdAb(“靶sdAb1”)，诸如肿瘤细胞抗原，通过连接体连接至靶向在同一细胞上表达的不同肿瘤细胞抗原(“靶sdAb2”)的sdAb。在每种情况下，靶sdAb1、靶sdAb2或两者均可以包含FSY。然后将双特异性构建体克隆到pBAD载体中，并如实施例2中所述进行表达。
通过将来自实施例2的C4-109FSY(或其变体)与靶向Her3的sdAb(不含FSY)连接，产生靶向EGFR和Her3细胞外域的含异双特异性FSY的化合物。生成了包括与C4(无FSY)连接的靶向Her3的sdAb(有FSY)的替代构建体。通过在两个sdAb氨基酸序列之间添加含有序列GGGGS或类似序列的重复的连接体来设计构建体。然后将双特异性构建体克隆到pBAD载体中，并如实施例2中所述进行表达。双特异性构建体的实例预期氨基酸序列如下所示。
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMGQVQLVQSGGGLVQAGGSLR
LSCAFSGRTFSMYTMGWFRQAPGKEREFVAANRGRGLSPDIADSVN
GRFTISRDNAKNTLYLQMDSLKPEDTAVYYCAADLQYGSSWPQRSS
AEYDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVKLEESGGGSVQT
GGSLRLTCAASGRTSRSYGMGWFRQAPGKEREFVSGISWRGDSTGY
ADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAIYYCAAAAGSAWYG
TLXEYDYWGQGTQVTVSSHHHHHH
X表示FSY并入位点的位置；粗体的N末端残基是从成熟蛋白质上切割下来的pelB前导序列。C末端6个组氨酸包含用于亲和纯化的His-Tag。其他用于生成的双特异性构建体可以包括Her3-EGFR、EGFR-Her2、Her2-Her3、Her3-Her3(相同或不同的表位)、EGFR-cMET和EGFR-CEA。
通过工程化用于连接体/有效负荷的化学偶联的独特的缀合位点来制备使用双特异性FSY修饰的sdAb的缀合物。对上述双特异性FSY修饰的构建体进行修饰，以在构建体的C末端或构建体内的在修饰时不会破坏与各自靶标结合的其他允许位点上含有游离Cys残基。替代方法可以包括连接体/有效负荷的分选酶介导或转谷氨酰胺酶介导的连接、NHS酯与赖氨酸残基的缀合，或本领域常见的其他方法。生成与连接体有效负荷的缀合物，以连接靶向域(sdAb或其他结合蛋白)、连接体和有效负荷，其可以包括有毒有效负荷、螯合的放射性金属、肽或蛋白质毒素或其他功能性细胞毒性化合物。
评估双特异性FSY修饰的sdAb或其缀合物分别与EGFR和Her3的体外生化交联。蛋白质与EGFR或Her3受体域以过量化学计量比(诸如5:1或8:1)孵育。孵育样品，使用SDS-PAGE经由凝胶位移评估与sdAb FSY化合物交联的EGFR或Her3的百分比，并通过密度测定法进行定量。
使用ELISA评估双特异性FSY修饰的sdAb或其缀合物是否同时结合至EGFR和Her3。Her3或EGFR的细胞外域被吸附至微量滴定板的表面并被广泛洗涤。该板被阻断用于进行非特异性相互作用，并加入双特异性FSY修饰的sdAb并孵育以允许结合。然后洗涤孔以去除未结合的物质，并且然后加入第二受体亚基并孵育以允许结合。再次洗涤板以去除未结合的化合物，并使用抗受体抗体检测第二受体。可选地，第二受体亚基作为受体域和检测系统(诸如HRP或荧光染料)之间的融合物或缀合物加入，并通过标准比色或荧光检测进行检测。作为特异性的对照，从程序中省略了添加第一受体、双特异性化合物或第二受体。抗受体抗体的结合可以经由抗物种HRP二抗、用链霉抗生物素蛋白-HRP检测的生物素化抗受体抗体、荧光染料缀合的二抗或ELISA检测的其他类似方法标准来检测。
使用表面等离子体共振(SPR)评估双特异性FSY修饰的sdAb或其缀合物是否同时结合至EGFR和Her3。Her3或EGFR受体的细胞外域经由NHS酯化学或其他标准方法固定在SPR芯片的表面。然后，在洗涤以去除未结合的物质之前，将双特异性FSY修饰的sdAb化合物与受体1表面结合。为了组装和检测三元复合物，然后注射第二受体亚基并测量信号。作为特异性的对照，由于在受体亚基之间可以观察到一些亲和力，因此从程序中省略了添加第一受体、双特异性化合物或第二受体。
评估双特异性FSY修饰的sdAb或其缀合物与EGFR和Her3阳性细胞的特异性结合。将一系列不同浓度的试验制品施用于细胞，并且可以通过流式细胞术或通过基于细胞的ELISA或类似方法检测试验制品的剂量依赖性结合。为了确定每种受体特异性对观察到的结合信号的贡献，以大的化学计量过量添加竞争性抗体(冷竞争者)，以拮抗EGFR、Her3或两种受体的试验制品衔接。孵育和洗涤以去除未结合的拮抗剂抗体后，将双特异性试验制品的浓度系列加入细胞中并允许结合。孵育和洗涤以去除未结合的试验化合物后，用对化合物特异的抗体检测试验制品，诸如抗表位标签或抗sdAb抗体或其他方法。抗试验样品抗体的结合可以经由流式细胞术，也可以通过经由抗物种HRP二抗的ELISA、用链霉抗生物素蛋白HRP检测的生物素化抗受体抗体、荧光染料缀合的二抗或ELISA检测的其他类似的方法标准来检测。
评估双特异性FSY修饰的sdAb或其缀合物在体外特异性地向表达一种或多种靶抗原的肿瘤细胞递送毒性有效负荷的情况。使用上述一般方法将含有工程化C末端Cys残基的构建体偶联至细胞毒性有效负荷，诸如MMAE或其他类别的高度细胞毒性化合物。生成剂量反应曲线，并将样品与SKBR3和Colo320DM细胞在体外孵育。作为特异性的对照，将针对第一受体、第二受体或两者的交叉反应抗体添加到某些样品中。在孵育不同时间段后，洗涤细胞以去除游离化合物，并使用测定诸如Promega CytoxGreen，或经由报告化合物检测测量细胞生存力的其他测定、通过Presto Blue、CCK-8或类似试剂检测活细胞和/或经由膜联蛋白V-FITC、碘化丙啶染色或类似试剂测量凋亡来测量细胞生存力。
评估双特异性FSY修饰的sdAb或其缀合物在体内向肿瘤组织递送有效负荷的情况。为了比较构建体与非共价sdAb缀合物的肿瘤暴露，荧光团标记被用作代表有效负荷，以实现随时间的跟踪/生物分布测量。具有单个残基取代Tyr或FSY的sdAb构建体通过马来酰亚胺化学或上述其他方法通过工程化半胱氨酸残基与化学荧光团(Alexa680或类似物)缀合，并如上所述纯化。荧光团标记的sdADC缀合物分子通过尾静脉IV注射施用于携带肿瘤抗原+或-异种移植肿瘤的雄性裸小鼠，并使用AmiX、IVIS光谱成像仪或类似设备经由全动物成像观察试验制品随时间的生物分布。经由图像密度测定法定量肿瘤特异性和外周的暴露，并在FSY和Tyr版本的sdAb之间进行比较。除了成像外，收集肿瘤样品并进行基于凝胶的检测方法处理，诸如蛋白质印迹或荧光成像，以检测施用后肿瘤组织中随时间变化的交联sdAb受体复合物和游离sdAb。
虽然本文已经示出和描述了本公开的优选实施方案，但对本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅作为实例提供。在不脱离本公开的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实践本公开时可以采用本文所述的本公开的实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本公开的范围，并且因此涵盖这些权利要求及其等价形式的范围内的方法和结构。

Claims (216)

1.一种包含靶向域和有效负荷的缀合物，其中所述靶向域包含至少一个非天然氨基酸(UAA)残基，其中所述靶向域被配置为结合至靶标，并且其中当所述靶向域结合时，所述UAA残基足够接近以与所述靶标形成共价键。
2.如权利要求1所述的缀合物，其中所述有效负荷附接至相对于所述UAA残基处于位置n+x的氨基酸，其中n为所述氨基酸的位置，并且x为至少1。
3.如权利要求1所述的缀合物，其中所述有效负荷附接至相对于所述UAA残基处于位置n-x的氨基酸，其中n为所述氨基酸的位置，并且x为至少1。
4.如权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其中当所述靶向域与所述靶标结合时，所述UAA残基在所述靶标的5-20埃内。
5.如权利要求4所述的缀合物，其中所述靶向域结合至细胞表面分子。
6.如权利要求5所述的缀合物，其中所述细胞表面分子为肿瘤相关抗原。
7.如权利要求1-6中任一项所述的缀合物，其中所述UAA残基被配置为与所述靶标的组氨酸、赖氨酸或酪氨酸残基形成共价键。
8.如权利要求1-7中任一项所述的缀合物，其中所述UAA残基包含氟代硫酸酯部分。
9.如权利要求1-7中任一项所述的缀合物，其中所述UAA残基包含芳基氟代硫酸酯部分。
10.如权利要求9所述的缀合物，其中所述UAA残基包含式I：
11.如权利要求9所述的缀合物，其中所述UAA残基的所述UAA具有结构：
12.如权利要求9所述的缀合物，其中所述UAA残基的所述UAA具有结构：
13.如权利要求9所述的缀合物，其中所述UAA残基包含式II：
14.如权利要求9所述的缀合物，其中所述UAA残基的所述UAA具有结构：
15.如权利要求9所述的缀合物，其中所述UAA残基的所述UAA具有结构：
16.如权利要求9所述的缀合物，其中所述UAA残基包含式III：
17.如权利要求9所述的缀合物，其中所述UAA残基的所述UAA具有结构：
18.如权利要求9所述的缀合物，其中所述UAA残基的所述UAA具有结构：
19.如权利要求1-7中任一项所述的缀合物，其中所述UAA残基的所述UAA具有式(IA)的结构：
其中，
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；
L为-(CH2)p-或-C(O)NH-(CH2)p-；p为1至6的整数；并且
其中当Y为-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
20.如权利要求19所述的缀合物，其中式(IA)的所述UAA具有式(IA-a)：的结构。
21.如权利要求19所述的缀合物，其中式(IA)的所述UAA具有式(IA-b)：的结构。
22.如权利要求19所述的缀合物，其中式(IA)的所述UAA具有式(IB)的结构：
23.如权利要求19所述的缀合物，其中式(IA)的所述UAA具有式(IC)的结构：
24.如权利要求19所述的缀合物，其中式(IA)的所述UAA具有式(ID)的结构：
其中：
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
25.如权利要求19所述的缀合物，其中式(IA)的所述UAA具有式(IE)的结构：
其中：
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
26.如权利要求19所述的缀合物，其中式(IA)的所述UAA具有式(IIA)的结构：
其中：
X独立地为O或NR’；并且
当存在时，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。
27.如权利要求19所述的缀合物，其中式(IA)的所述UAA具有式(IIB)的结构：
其中：
X独立地为O或NR’；并且
当存在时，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。
28.如权利要求1-7中任一项所述的缀合物，其中所述UAA残基的所述UAA具有式(IV)的结构，
其中，
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
环A为5至6元芳基或杂芳基；
每个RA独立地为-OH、-ORX、卤素、NHRX、N(RX)2或任选取代的烷基；每个RX为任选取代的烷基；
L为-(CH2)p-或-C(O)NH-(CH2)p-；p为1至6的整数；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
29.如权利要求1-28中任一项所述的缀合物，进一步包含至少一个另外的靶向域。
30.如权利要求1-29中任一项所述的缀合物，其中所述有效负荷包括显像剂、放射性配体试剂或细胞毒性试剂。
31.如权利要求30所述的缀合物，其中所述细胞毒性部分包括小分子药物或化疗药物。
32.如权利要求30所述的缀合物，其中所述放射性配体试剂选自35S、3H、111In、112In、14C、186Re、188Re、32P、153Sm、177Lu、86Y、88Y、90Y、131I、123I、124I、125I、149Tb、211At、212Pb/212Bi、213Bi、223Ra、225Ac、64Cu、67Cu和227Th。
33.如权利要求31或权利要求32所述的缀合物，其中所述放射性配体试剂进一步包括螯合剂。
34.如权利要求30或权利要求33所述的缀合物，其中所述放射性配体试剂选自99mTc、131I、201Tl、111In和67Ga。
35.如权利要求1-34中任一项所述的缀合物，其中所述有效负荷用连接体附接至所述缀合物。
36.如权利要求35所述的缀合物，其中所述连接体包括聚合物。
37.如权利要求35所述的缀合物，其中所述连接体为可切割或不可切割连接体。
38.如权利要求35所述的缀合物，其中所述连接体为0.01kDa至50kDa。
39.如权利要求35所述的缀合物，其中所述连接体为0.01kDa至10kDa。
40.如权利要求35-39中任一项所述的缀合物，其中所述连接体为线性、支链、多聚体或树枝状大分子。
41.如权利要求40所述的缀合物，其中所述连接体为双官能或多官能连接体或双官能或多官能聚合物。
42.如权利要求35-41中任一项所述的缀合物，其中所述连接体包括水溶性聚合物。
43.如权利要求42所述的缀合物，其中所述水溶性聚合物为聚乙二醇(PEG)。
44.如权利要求43所述的缀合物，其中所述PEG的分子量在0.1kDa和2.5kDa之间。
45.如权利要求43所述的缀合物，其中所述PEG包含1-8个单体。
46.如权利要求1-45中任一项所述的缀合物，其中所述靶向域包括抗体、抗体片段或抗原结合域。
47.如权利要求46所述的缀合物，其中所述靶向域包含抗原结合域，所述缀合物包含CDR区，并且所述至少一个UAA在所述CDR区内或附近。
48.如权利要求47所述的缀合物，其中所述UAA包含在所述CDR区内。
49.如权利要求46-48中任一项所述的缀合物，其中所述靶向域包含单域抗体(sdAb)。
50.如权利要求5-49中任一项所述的缀合物，其中所述细胞表面分子选自PSMA、EGFR、EGFRviii、MSLN、CEA、DLL3、FAP、CD33、HER3、PD-L1、EphA2、EphA4、HER2、SIRPa、DLK1、Muc16、LRP5、LRP6、endo180、LIV-1、SLAMF7、PTK7、GPR20、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3 rec、NaPi2b、CD16、GCC、SSTR2、CAIX、CAXII、MC1R、CXCR4、B1R、GRPR、STEAP1、CD70、CD46、CD166、CLL-1、ADAM9、cKIT、CD36、CD73、ITGaVb3、ITGaVb6、GPC-1、CD38、CD51、FGFR3、Ly6E、CD44v6、ENPP3、CXCR3、CXCR5、FcRH5、VEGF、VEGFR2、CD45、CCR4、CD25、5T4、ROR1、TROP-2、NECTIN4、cMET、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CD79b、AXL、RON、B7-H3、B7-H4、KAAG1、Muc1、ADAM-9、GPNMB、EDB纤连蛋白、组织因子、GPNMB、FolRa、EphA2、ALPP、ALPPL2、MT1-MMP、CLDN18.2、CLDN6、CLDN9、p钙黏着蛋白、CEACAM6、CD47和EpCAM。
51.一种缀合物，其包含(i)有效负荷和(ii)工程化单域抗体(sdAb)，所述工程化单域抗体包括具有CDR区和在所述CDR区内或附近的至少一个非天然氨基酸(UAA)残基的sdAb，其中所述sdAb包含SEQ ID NO:1-4或16-64中的任何一个。
52.如权利要求51所述的缀合物，其中所述UAA残基包含氟代硫酸酯部分。
53.如权利要求52所述的缀合物，其中所述UAA残基包含芳基氟代硫酸酯部分。
54.如权利要求53所述的缀合物，其中所述UAA残基包含式I：
55.如权利要求53所述的缀合物，其中所述UAA残基的所述UAA具有结构：
56.如权利要求53所述的缀合物，其中所述UAA残基的所述UAA具有结构：
57.如权利要求53所述的缀合物，其中所述UAA残基包含式II：
58.如权利要求53所述的缀合物，其中所述UAA残基的所述UAA具有结构：
59.如权利要求53所述的缀合物，其中所述UAA残基的所述UAA具有结构：
60.如权利要求53所述的缀合物，其中所述UAA残基包含式III：
61.如权利要求53所述的缀合物，其中所述UAA残基的所述UAA具有结构：
62.如权利要求53所述的缀合物，其中所述UAA残基的所述UAA具有结构：
63.如权利要求53所述的缀合物，其中所述UAA残基的所述UAA具有式(IA)的结构：
其中，
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；
L为-(CH2)p-或-C(O)NH-(CH2)p-；p为1至6的整数；并且
其中当Y为-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
64.如权利要求63所述的缀合物，其中式(IA)的所述UAA具有式(IA-a)：的结构。
65.如权利要求63所述的缀合物，其中式(IA)的所述UAA具有式(IA-b)：的结构。
66.如权利要求63所述的缀合物，其中式(IA)的所述UAA具有式(IB)的结构：
67.如权利要求63所述的缀合物，其中式(IA)的所述UAA具有式(IC)的结构：
68.如权利要求63所述的缀合物，其中式(IA)的所述UAA具有式(ID)的结构：
其中：
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
69.如权利要求62所述的缀合物，其中式(IA)的所述UAA具有式(IE)的结构：
其中：
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
70.如权利要求63所述的缀合物，其中式(IA)的所述UAA具有式(IIA)的结构：
其中：
X独立地为O或NR’；并且
当存在时，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。
71.如权利要求63所述的缀合物，其中式(IA)的所述UAA具有式(IIB)的结构：
其中：
X独立地为O或NR’；并且
当存在时，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。
72.如权利要求51所述的缀合物，其中所述UAA残基的所述UAA具有式(IIV)的结构，
其中，
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
环A为5至6元芳基或杂芳基；
每个RA独立地为-OH、-ORX、卤素、NHRX、N(RX)2或任选取代的烷基；每个RX为任选取代的烷基；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
73.如权利要求51-72中任一项所述的缀合物，其中所述工程化sdAb包含SEQ ID NO:1，并且其中所述UAA包含在SEQ ID NO:5、6和7中的任何一个中。
74.如权利要求73所述的缀合物，其中所述UAA相对于SEQ ID NO:1存在于选自26、28、29、30、99、102、103、105、108、110、111、112、113、114和115的氨基酸位置。
75.如权利要求51-72中任一项所述的缀合物，其中所述工程化sdAb包含SEQ ID NO:2，并且其中所述UAA包含在SEQ ID NO:8、9和10中的任何一个中。
76.如权利要求75所述的缀合物，其中所述UAA相对于SEQ ID NO:2存在于选自50、52、53、54、56、58和100的氨基酸位置。
77.如权利要求51-72中任一项所述的缀合物，其中所述工程化sdAb包含SEQ ID NO:3，并且其中所述UAA包含在SEQ ID NO:11、12和13中的任何一个中。
78.如权利要求77所述的缀合物，其中所述UAA相对于SEQ ID NO:3存在于选自58、62、101、103和107的氨基酸位置。
79.如权利要求51-72中任一项所述的缀合物，其中所述工程化sdAb包含SEQ ID NO:16，并且其中所述UAA相对于SEQ ID NO:16存在于109的氨基酸位置。
80.如权利要求51-72中任一项所述的缀合物，其中所述工程化sdAb包含SEQ ID NO:25，并且其中所述UAA相对于SEQ ID NO:23存在于选自52、53、54、55、56、58、60、62和64的氨基酸位置。
81.如权利要求51-72中任一项所述的缀合物，其中所述工程化sdAb包含SEQ ID NO:26，并且其中所述UAA相对于SEQ ID NO:24存在于选自53、55、56、57、58、60、64和67的氨基酸位置。
82.如权利要求51-81中任一项所述的缀合物，其中所述有效负荷不经由所述UAA侧链连接。
83.如权利要求51-82中任一项所述的缀合物，其中所述有效负荷包括显像剂、放射性配体试剂或细胞毒性试剂。
84.如权利要求83所述的缀合物，其中所述细胞毒性部分包括小分子药物或化疗药物。
85.如权利要求83所述的缀合物，其中所述放射性配体试剂选自35S、3H、111In、112In、14C、186Re、188Re、32P、153Sm、177Lu、86Y、88Y、90Y、131I、123I、124I、125I、149Tb、211At、212Pb/212Bi、213Bi、223Ra、225Ac、64Cu、67Cu和227Th。
86.如权利要求83或权利要求85所述的缀合物，其中所述放射性配体试剂进一步包括螯合剂。
87.如权利要求83所述的缀合物，其中所述显像剂包括荧光团或选自99mTc、131I、201Tl、111In和67Ga的放射性配体试剂。
88.一种方法，其包括施用如权利要求1-87中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物共价地结合细胞的表面上的靶标。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述细胞包括肿瘤细胞。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述缀合物杀死所述肿瘤细胞或抑制所述肿瘤细胞的生长。
91.如权利要求88-90中任一项所述的方法，其中所述靶标为肿瘤相关抗原。
92.如权利要求88-91中任一项所述的方法，其中所述靶标选自PSMA、EGFR、EGFRviii、MSLN、CEA、DLL3、FAP、CD33、HER3、PD-L1、EphA2、EphA4、HER2、SIRPa、DLK1、Muc16、LRP5、LRP6、endo180、LIV-1、SLAMF7、PTK7、GPR20、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3rec、NaPi2b、CD16、GCC、SSTR2、CAIX、CAXII、MC1R、CXCR4、B1R、GRPR、STEAP1、CD70、CD46、CD166、CLL-1、ADAM9、cKIT、CD36、CD73、ITGaVb3、ITGaVb6、GPC-1、CD38、CD51、FGFR3、Ly6E、CD44v6、ENPP3、CXCR3、CXCR5、FcRH5、VEGF、VEGFR2、CD45、CCR4、CD25、5T4、ROR1、TROP-2、NECTIN4、cMET、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CD79b、AXL、RON、B7-H3、B7-H4、KAAG1、Muc1、ADAM-9、GPNMB、EDB纤连蛋白、组织因子、GPNMB、FolRa、EphA2、ALPP、ALPPL2、MT1-MMP、CLDN18.2、CLDN6、CLDN9、p钙黏着蛋白、CEACAM6、CD47和EpCAM。
93.一种治疗疾病或病况的方法，其包括向有需要的对象施用如权利要求1-92中任一项所述的缀合物。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述疾病包括PRAD(前列腺腺癌)、mCRPC(转移性去势抵抗性前列腺癌)、实体瘤(新血管系统)、LUAD(肺腺癌)、LUSC(肺鳞状细胞癌)、HNSC(头颈部鳞状细胞癌、THCA(甲状腺癌)、ESCA(食道癌)、STAD(胃腺癌)、GIST(胃肠道间质瘤)、COAD(结肠腺癌)、READ(直肠腺癌)、SARC(肉瘤)、SCLC(小细胞肺癌)、MESO(间皮瘤)、PAAD(胰腺腺癌)、B细胞恶性肿瘤、T细胞恶性肿瘤、ALL(急性成淋巴细胞性白血病)、NHL(非霍奇金淋巴瘤)、HL(霍奇金淋巴瘤)、CLL(慢性淋巴细胞白血病)、AML(急性髓系白血病)、MDS(骨髓增生异常综合征)、MSI-高肿瘤、SKCM(皮肤黑色素瘤)、UVM(葡萄膜黑色素瘤)、DLBC(弥漫性大B细胞淋巴瘤)、子宫内膜癌、CESC(宫颈癌)、骨癌、BLCA(膀胱尿路上皮癌)、BRCA(浸润性乳腺癌)、TNBC(三阴性乳腺癌)、LIHC(肝细胞癌)、OV(卵巢浆液性囊腺癌)、UCEC(子宫体子宫内膜癌)、NE-PCa(神经内分泌前列腺癌)、GBM(多形性胶质母细胞瘤)和KIRC(肾透明细胞癌)中的一种或多种。
95.一种制造如权利要求1-87中任一项所述的缀合物的方法，其包括：
(a)生成包含至少一个非天然氨基酸的所述靶向域；和
(b)任选地经由连接体将所述靶向域缀合至有效负荷。
96.如权利要求95所述的方法，其中包含至少一个非天然氨基酸的所述靶向域是在体内合成的。
97.如权利要求96所述的方法，其中生成包括使用正交tRNA合成酶/抑制型tRNA对。
98.如权利要求97所述的方法，其中生成包括所述正交tRNA合成酶/抑制型tRNA对，其衍生自吡咯赖氨酸tRNA合成酶/tRNAPyl。
99.如权利要求97所述的方法，其中所述正交tRNA合成酶包含SEQ ID NO:84、87、92或其变体。
100.一种将细胞毒性有效负荷递送至细胞的方法，其包括施用如权利要求30-33、35-50或83-86中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物共价地结合所述细胞的所述表面上的靶标，从而递送所述细胞毒性有效负荷。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述细胞为肿瘤细胞。
102.如权利要求100所述的方法，其中所述细胞包含在肿瘤微环境内。
103.如权利要求100所述的方法，其中所述细胞包含在哺乳动物对象内。
104.如权利要求100所述的方法，其中所述细胞包含在人类对象内。
105.如权利要求100-104中任一项所述的方法，其中所述缀合物杀死所述肿瘤细胞或抑制所述肿瘤细胞的生长。
106.如权利要求100-105中任一项所述的方法，其中所述靶标选自PSMA、EGFR、EGFRviii、MSLN、CEA、DLL3、FAP、CD33、HER3、PD-L1、EphA2、EphA4、HER2、SIRPa、DLK1、Muc16、LRP5、LRP6、endo180、LIV-1、SLAMF7、PTK7、GPR20、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3 rec、NaPi2b、CD16、GCC、SSTR2、CAIX、CAXII、MC1R、CXCR4、B1R、GRPR、STEAP1、CD70、CD46、CD166、CLL-1、ADAM9、cKIT、CD36、CD73、ITGaVb3、ITGaVb6、GPC-1、CD38、CD51、FGFR3、Ly6E、CD44v6、ENPP3、CXCR3、CXCR5、FcRH5、VEGF、VEGFR2、CD45、CCR4、CD25、5T4、ROR1、TROP-2、NECTIN4、cMET、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CD79b、AXL、RON、B7-H3、B7-H4、KAAG1、Muc1、ADAM-9、GPNMB、EDB纤连蛋白、组织因子、GPNMB、FolRa、ALPP、ALPPL2、MT1-MMP、CLDN18.2、CLDN6、CLDN9、p钙黏着蛋白、CEACAM6、CD47和EpCAM。
107.如权利要求100-106中任一项所述的方法，其中所述人类对象患有或被诊断患有选自PCa(前列腺癌)、CRPCa(去势抵抗性前列腺癌)、实体瘤(新血管系统)、NSCLC(非小细胞肺癌)、HNSCC(头颈部鳞状细胞癌)、ESCC(食管癌)、GC(胃癌)、CRC(结直肠癌)、SCLC(小细胞肺癌)、MPM(间皮瘤)、PDAC(导管胰腺腺癌)、ALL(急性成淋巴细胞性白血病)、AML(急性髓系白血病)、MDS(骨髓增生异常综合征)、MSI-高肿瘤、黑色素瘤、DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、BrCa(乳腺癌)、TNBC(三阴性乳腺癌)、NE-PCa(神经内分泌前列腺癌)、GBM(胶质母细胞瘤)和RCC(肾细胞癌)的疾病或病况。
108.一种缀合物，其包含(i)第一靶向域、(ii)第二靶向域和任选的(iii)有效负荷，其中所述第一靶向域包含至少一个第一非天然氨基酸(UAA)，由此所述第一靶向域能够在所述UAA的位点共价地结合至第一靶标，并且所述第二靶向域被配置为结合第二靶标。
109.如权利要求108所述的缀合物，其中所述第一靶标和所述第二靶标位于同一细胞上。
110.如权利要求108或权利要求109所述的缀合物，其中所述第一靶向域包括抗体、抗体片段或抗原结合域。
111.如权利要求110所述的缀合物，其中所述第一靶向域包括单域抗体(sdAb)。
112.如权利要求108-111中任一项所述的缀合物，其中所述第一UAA包含在所述第一靶向域的与所述第一靶标相接的区域内或附近。
113.如权利要求108-112中任一项所述的缀合物，其中所述第二靶向域包括抗体、抗体片段或抗原结合域。
114.如权利要求113所述的缀合物，其中所述第二靶向域包括单域抗体(sdAb)。
115.如权利要求108-114中任一项所述的缀合物，其中所述第一靶向域和所述第二靶向域连接以形成融合蛋白。
116.如权利要求108-114中任一项所述的缀合物，其中所述第一靶向域和所述第二靶向域通过化学缀合连接。
117.如权利要求115或权利要求116所述的缀合物，其中所述第一靶向域和所述第二域通过连接体连接。
118.如权利要求108-117中任一项所述的缀合物，其中所述第一靶向域和所述第二靶向域结合同一靶标。
119.如权利要求118所述的缀合物，其中所述第一靶向域和所述第二靶向域结合至同一靶标的不同表位。
120.如权利要求118所述的缀合物，其中所述第一靶向域和所述第二靶向域结合至同一靶标的同一表位。
121.如权利要求118-120中任一项所述的缀合物，其中所述同一靶标为单体。
122.如权利要求118-120中任一项所述的缀合物，其中所述同一靶标为多聚体分子。
123.如权利要求108-117中任一项所述的缀合物，其中所述第一靶向域和所述第二靶向域结合不同的靶标。
124.如权利要求108-123中任一项所述的缀合物，其中所述第一靶标为第一细胞表面分子。
125.如权利要求108-124中任一项所述的缀合物，其中所述第二靶标为第二细胞表面分子。
126.如权利要求108-125中任一项所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA包含氟代硫酸酯部分。
127.如权利要求108-125中任一项所述的缀合物，其中所述至少一个UAA包含芳基氟代硫酸酯部分。
128.如权利要求127所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA包含式I：
129.如权利要求127所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA具有结构：
130.如权利要求127所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA具有结构：
131.如权利要求127所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA包含式II：
132.如权利要求127所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA具有结构：
133.如权利要求127所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA具有结构：
134.如权利要求127所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA包含式III：
135.如权利要求127所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA具有结构：
136.如权利要求127所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA具有结构：
137.如权利要求108-125中任一项所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA具有式(IA)的结构：
其中，
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；
L为-(CH2)p-或-C(O)NH-(CH2)p-；p为1至6的整数；并且
其中当Y为-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
138.如权利要求137所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA具有式(IAa)：的结构。
139.如权利要求137所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA具有式(IAb)：的结构。
140.如权利要求137所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA具有式(IB)的结构：
141.如权利要求137所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA具有式(IC)的结构：
142.如权利要求137所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA具有式(ID)的结构：
其中：
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
143.如权利要求137所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA具有式(IE)的结构：
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
144.如权利要求137所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA具有式(IIA)的结构：
其中：
X独立地为O或NR’；并且
当存在时，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。
145.如权利要求137所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA具有式(IIB)的结构：
其中：
X独立地为O或NR’；并且
当存在时，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。
146.如权利要求108-125中任一项所述的缀合物，其中所述至少一个第一UAA具有式(IV)的结构，
其中，
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
环A为5至6元芳基或杂芳基；
每个RA独立地为-OH、-ORX、卤素、NHRX、N(RX)2或任选取代的烷基；p为0、1、2、3或4；每个RX为任选取代的烷基；
L为-(CH2)p-或-C(O)NH-(CH2)p-；p为1至6的整数；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
147.如权利要求124-146中任一项所述的缀合物，其中所述第一细胞表面分子选自PSMA、EGFR、HER2、HER3、PD-L1、EphA4、纤连蛋白ED-B、EpCAM、CCR4、CD25、VEGF、VEGFR2、endo180、LIV-1、PTK7、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3 rec、NaPi2b、DLK1、Muc16、cMET、CEA、LRP5和LRP6。
148.如权利要求125-147中任一项所述的缀合物，其中所述第二细胞表面分子选自PSMA、EGFR、HER2、HER3、PD-L1、EphA4、纤连蛋白ED-B、EpCAM、CCR4、CD25、VEGF、VEGFR2、endo180、LIV-1、PTK7、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3 rec、NaPi2b、DLK1、Muc16、cMET、CEA、LRP5和LRP6。
149.如权利要求108-148中任一项所述的缀合物，其中所述第二靶向域包含第二UAA，由此所述第二靶向域能够在所述第二UAA的位点共价地结合至所述第二靶标。
150.如任意权利要求149所述的缀合物，其中所述第二UAA与所述第一靶向域中包含的所述至少一个UAA不同。
151.如权利要求149所述的缀合物，其中所述第二UAA与所述第一靶向域中包含的所述至少一个UAA相同。
152.如权利要求149-151中任一项所述的缀合物，其中所述第二UAA包含氟代硫酸酯部分。
153.如权利要求149-151中任一项所述的缀合物，其中所述第二UAA包含芳基氟代硫酸酯部分。
154.如权利要求153所述的缀合物，其中所述第二UAA包含式I：
155.如权利要求153所述的缀合物，其中所述第二UAA具有结构：
156.如权利要求153所述的缀合物，其中所述第二UAA具有结构：
157.如权利要求153所述的缀合物，其中所述第二UAA包含式II：
158.如权利要求153所述的缀合物，其中所述第二UAA具有结构：
159.如权利要求153所述的缀合物，其中所述第二UAA具有结构：
160.如权利要求153所述的缀合物，其中所述第二UAA包含式III：
161.如权利要求153所述的缀合物，其中所述第二UAA具有结构：
162.如权利要求153所述的缀合物，其中所述第二UAA具有结构：
163.如权利要求149-151中任一项所述的缀合物，其中所述第二UAA具有式(IA)的结构：
其中，
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；
L为-(CH2)p-或-C(O)NH-(CH2)p-；p为1至6的整数；并且
其中当Y为-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
164.如权利要求163所述的缀合物，其中所述第二UAA具有式(IA-a)：的结构。
165.如权利要求163所述的缀合物，其中所述第二UAA具有式(IA-b)：的结构。
166.如权利要求163所述的缀合物，其中所述第二UAA具有式(IB)的结构：
167.如权利要求163所述的缀合物，其中所述第二UAA具有式(IC)的结构：
168.如权利要求163所述的缀合物，其中所述第二UAA具有式(ID)的结构：
其中：
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
169.如权利要求163所述的缀合物，其中所述第二UAA具有式(IE)的结构：
其中：
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
R1为氢、氟或碘；R2为氢或甲基；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
170.如权利要求163所述的缀合物，其中所述第二UAA具有式(IIA)的结构：
其中：
X独立地为O或NR’；并且
当存在时，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。
171.如权利要求163所述的缀合物，其中所述第二UAA具有式(IIB)的结构：
其中：
X独立地为O或NR’；并且
当存在时，R’为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基。
172.如权利要求149-151中任一项所述的缀合物，其中所述第二UAA具有式(IV)的结构，
其中，
每个X独立地为O或NR’；
Y为键、-O-、-NR-或-N＝；
A为键或-(CH2)n-；m为1或2；n为1至4的整数；
当存在时，每个R和R’独立地为氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基或取代的或未取代的杂环烷基；
环A为5至6元芳基或杂芳基；
每个RA独立地为-OH、-ORX、卤素、NHRX、N(RX)2或任选取代的烷基；p为0、1、2、3或4；每个RX为任选取代的烷基；
L为-(CH2)p-或-C(O)NH-(CH2)p-；p为1至6的整数；并且
其中当Y为键、-O-或-NR-时，m为1；当Y为-N＝时，m为2。
173.如权利要求108-172中任一项所述的缀合物，其中所述第一靶向域包含SEQ IDNO:1-4或16-64中的任何一个。
174.如权利要求108-172中任一项所述的缀合物，其中所述第一靶向域包含与SEQ IDNO:1-4或16-64中的任何一个具有至少70％序列同一性的序列。
175.如权利要求108-173中任一项所述的缀合物，其中所述第二靶向域包含SEQ IDNO:1-4、16-64中的任何一个。
176.如权利要求108-173中任一项所述的缀合物，其中所述第二靶向域包含与SEQ IDNO:1-4、16-64中的任何一个具有至少70％同一性的序列。
177.如权利要求1-87或108-172中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物包含SEQ IDNO:65-72。
178.如权利要求1-87或108-172中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物包含与SEQID NO:65-72具有至少70％序列同一性的序列。
179.如权利要求1-87或108-172中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物包含SEQ IDNO:1-4、16-64中的任何一个。
180.如权利要求1-87或108-172中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物包含与SEQID NO:1-4、16-64中的任何一个具有至少70％序列同一性的序列。
181.如权利要求1-87或108-172中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物包含与SEQID NO:65-72具有至少80％序列同一性的序列。
182.如权利要求108-172中任一项所述的缀合物，其中所述第一靶向域和所述第二靶向域中的至少一个包含SEQ ID NO:1。
183.如权利要求182所述的缀合物，其中所述UAA相对于SEQ ID NO:1存在于选自26、28、29、30、99、102、103、105、108、110、111、112、113、114和115的氨基酸位置。
184.如权利要求108-172中任一项所述的缀合物，其中所述第一靶向域和所述第二靶向域中的至少一个包含SEQ ID NO:2。
185.如权利要求184所述的缀合物，其中所述UAA相对于SEQ ID NO:2存在于选自50、52、53、54、56、58和100的氨基酸位置。
186.如权利要求108-172中任一项所述的缀合物，其中所述第一靶向域和所述第二靶向域中的至少一个包含SEQ ID NO:3。
187.如权利要求186所述的缀合物，其中所述UAA相对于SEQ ID NO:3存在于选自58、62、101、103和107的氨基酸位置。
188.如权利要求108-172中任一项所述的缀合物，其中所述第一靶向域和所述第二靶向域中的至少一个包含SEQ ID NO:16。
189.如权利要求188所述的缀合物，其中包含SEQ ID NO:16的所述第一靶向域和所述第二靶向域中的所述至少一个在相对于SEQ ID NO:16的位置109处进一步包含非天然氨基酸。
190.如权利要求108-172所述的缀合物，其中所述第一靶向域和所述第二靶向域中的至少一个包含SEQ ID NO:18。
191.如权利要求108-190中任一项所述的缀合物，其中所述有效负荷包括显像剂、放射性配体试剂或细胞毒性试剂。
192.如权利要求191所述的缀合物，其中所述细胞毒性部分包括小分子药物或化疗药物。
193.如权利要求191所述的缀合物，其中所述放射性配体试剂选自35S、3H、111In、112In、14C、186Re、188Re、32P、153Sm、177Lu、86Y、88Y、90Y、131I、123I、124I、125I、149Tb、211At、212Pb/212Bi、213Bi、223Ra、225Ac、64Cu、67Cu和227Th。
194.如权利要求192或权利要求193所述的缀合物，其中所述放射性配体试剂进一步包括螯合剂。
195.如权利要求192所述的缀合物，其中所述放射性配体试剂选自99mTc、131I、201Tl、111In和67Ga。
196.如权利要求108-195中任一项所述的缀合物，其中所述有效负荷用连接体附接至所述缀合物。
197.一种方法，其包括施用如权利要求108-196中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物共价地结合第一细胞的表面上的所述第一靶标。
198.如权利要求197所述的方法，其中所述缀合物结合所述第一细胞的所述表面上的所述第二靶标。
199.如权利要求197或权利要求198所述的方法，其中所述第一靶向域和所述第二靶向域结合至同一靶标。
200.如权利要求199所述的方法，其中所述第一靶向域和所述第二靶向域结合至同一靶标的同一表位。
201.如权利要求199所述的方法，其中所述第一靶向域和所述第二靶向域结合至同一靶标的不同表位。
202.如权利要求197或权利要求198所述的方法，其中所述第一靶向域和所述第二靶向域结合至所述第一细胞的所述表面上的不同靶标。
203.如权利要求197-202中任一项所述的方法，其中所述第二域包含第二UAA，并且其中所述第二UAA共价地结合至所述第二靶标。
204.如权利要求197-203中任一项所述的方法，其中所述第一细胞为肿瘤细胞。
205.如权利要求204所述的方法，其中当结合至所述第一靶标时，所述缀合物杀死所述肿瘤细胞或抑制所述肿瘤细胞的生长。
206.如权利要求204所述的方法，其中当结合至所述第二靶标时，所述缀合物杀死所述肿瘤细胞或抑制所述肿瘤细胞的生长。
207.如权利要求204所述的方法，其中当结合至所述第一靶标和所述第二靶标时，所述缀合物杀死所述肿瘤细胞或抑制所述肿瘤细胞的生长。
208.如权利要求197-207中任一项所述的方法，其中所述第一靶标选自PSMA、EGFR、EGFRviii、MSLN、CEA、DLL3、FAP、CD33、HER3、PD-L1、EphA2、EphA4、HER2、SIRPa、DLK1、Muc16、LRP5、LRP6、endo180、LIV-1、SLAMF7、PTK7、GPR20、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3 rec、NaPi2b、CD16、GCC、SSTR2、CAIX、CAXII、MC1R、CXCR4、B1R、GRPR、STEAP1、CD70、CD46、CD166、CLL-1、ADAM9、cKIT、CD36、CD73、ITGaVb3、ITGaVb6、GPC-1、CD38、CD51、FGFR3、Ly6E、CD44v6、ENPP3、CXCR3、CXCR5、FcRH5、VEGF、VEGFR2、CD45、CCR4、CD25、5T4、ROR1、TROP-2、NECTIN4、cMET、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CD79b、AXL、RON、B7-H3、B7-H4、KAAG1、Muc1、ADAM-9、GPNMB、EDB纤连蛋白、组织因子、GPNMB、FolRa、EphA2、ALPP、ALPPL2、MT1-MMP、CLDN18.2、CLDN6、CLDN9、p钙黏着蛋白、CEACAM6、CD47和EpCAM。
209.如权利要求197-208中任一项所述的方法，其中所述第二靶标选自PSMA、EGFR、EGFRviii、MSLN、CEA、DLL3、FAP、CD33、HER3、PD-L1、EphA2、EphA4、HER2、SIRPa、DLK1、Muc16、LRP5、LRP6、endo180、LIV-1、SLAMF7、PTK7、GPR20、CDH6、CSP-1、CD71、PRLR、SEZ6、DLL1、NOTCH3 rec、NaPi2b、CD16、GCC、SSTR2、CAIX、CAXII、MC1R、CXCR4、B1R、GRPR、STEAP1、CD70、CD46、CD166、CLL-1、ADAM9、cKIT、CD36、CD73、ITGaVb3、ITGaVb6、GPC-1、CD38、CD51、FGFR3、Ly6E、CD44v6、ENPP3、CXCR3、CXCR5、FcRH5、VEGF、VEGFR2、CD45、CCR4、CD25、5T4、ROR1、TROP-2、NECTIN4、cMET、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CD79b、AXL、RON、B7-H3、B7-H4、KAAG1、Muc1、ADAM-9、GPNMB、EDB纤连蛋白、组织因子、GPNMB、FolRa、EphA2、ALPP、ALPPL2、MT1-MMP、CLDN18.2、CLDN6、CLDN9、p钙黏着蛋白、CEACAM6、CD47和EpCAM。
210.如权利要求197-209中任一项所述的方法，其中所述有效负荷为放射性标记剂或细胞毒性试剂。
211.如权利要求198-209中任一项所述的方法，其中所述有效负荷为显像剂。
212.如权利要求211所述的方法，其中当所述缀合物结合至所述第一细胞上的所述第一靶标和所述第二靶标时，所述方法对所述第一细胞进行成像或鉴定。
213.一种制造如权利要求108-196中任一项所述的缀合物的方法，其包括：
(a)在体内合成包含至少一个非天然氨基酸的所述第一靶向域；和
(b)任选地经由连接体将所述有效负荷缀合至所述第一靶向域或所述第二靶向域。
214.如权利要求213所述的方法，进一步包括在体内合成所述第二靶向域作为与所述第一靶向域的融合蛋白。
215.如权利要求213或权利要求214所述的方法，其中合成包括使用正交tRNA合成酶/抑制型tRNA对。
216.如权利要求215所述的方法，其中合成包括所述正交tRNA合成酶/抑制型tRNA对，其衍生自吡咯赖氨酸tRNA合成酶/tRNAPyl。
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