CN115894719B - 一种人血清白蛋白胰岛素偶联物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一种人血清白蛋白胰岛素偶联物，具有如下结构：HSA‑Linker‑Insulin；其中：HSA为重组人血清白蛋白，Linker为具有双官能团的小分子连接子，Insulin为胰岛素；与现有的胰岛素相比，本发明的胰岛素人血清白蛋白偶联产物半衰期及降糖维持时间显著延长，未来可减少给药频次，提高患者的顺从性。

Description

一种人血清白蛋白胰岛素偶联物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体的说，本发明涉及一种人血清白蛋白胰岛素偶联物，及其制备方法。
背景技术
专利WO2016178905A1“融合蛋白”描述了一种Fc融合胰岛素类似物的制备方法，它是将一个工程化的单链胰岛素类似物融合到IgG Fc区域，以此达到每周一次的长效目的，其相关产品LY3209590注射液已于2022年3月获得中国国家药监局药品审评中心的临床申请受理。Iocdec是诺和诺德开发的的周胰岛素制剂，根据公开资料，Icodec是一种长效基础胰岛素类似物，其半衰期为196小时。在注射进人体后，Icodec会与人血清白蛋白(HSA)紧密但可逆的结合在一起,形成“循环存储库”。这一结果可在一周时间内连续、缓慢且稳定地降低血糖。基于其浓缩配方，每周注射一次的icodec胰岛素用量与每日注射一次的甘精胰岛素U100相当。
HSA是人体血液中含量最高的单一组分蛋白质，血液中的含量约为50g/L，占血浆总蛋白的40％～60％，半衰期长达19天。HSA半衰期长一方面归于FcRn受体介导的HSA回收机制(pH依赖型，防止溶酶体途径降解)，另一方面也与其可以避免肾清除有关(HSA可以通过肾近曲小管中受体介导的内吞作用而被重吸收，从而避免被肾脏清除)。HSA以其稳定的惰性在人体血液中起着不可替代的功能，近年来在临床治疗药物研发中利用HSA延长药物的半衰期越来越受到重视。如德谷胰岛素及icodec均是利用内源性HSA达到延长药物作用时间的目的。而Idelvion(重组人血清白蛋白/凝血因子-IX融合蛋白)、阿必鲁肽(重组人血清白蛋白/GLP-1融合)则是利用外源性HSA延长药物的半衰期。
然而，利用内源性HSA，无法预估药物在体内与HSA的真实结合情况；而HSA融合则存在生物活性降低、表达产物不均一、易降解、表达水平低、成本高等问题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种人血清白蛋白胰岛素偶联物。
本发明的另一个目的是提供上述人血清白蛋白胰岛素偶联物的制备方法。
根据本发明的一方面，一种人血清白蛋白胰岛素偶联物，具有如下结构：
HSA-Linker-Insulin
其中：
HSA为重组人血清白蛋白(HSA)，Linker为具有双官能团的小分子连接子，Insulin为胰岛素；
所述的具有双官能团的小分子连接子为下述一种6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(EMCS)、6-(3-溴马来酰亚胺)己酸琥珀酰亚胺酯(Br-EMCS)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、4-马来酰亚胺苯甲酸琥珀酰亚胺酯(SMB)、3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)或者它们的衍生物。
本发明所述的人血清白蛋白胰岛素偶联物，优选其中所述重组人血清白蛋白为植物源重组人血清白蛋白，特别是所述的重组人血清白蛋白来源于水稻胚乳细胞表达的重组人血清白蛋白(OsrHSA)。
本发明的所述的胰岛素可以是天然的或重组胰岛素，可以是各种来源，例如为猪胰岛素、牛胰岛素、人胰岛素。优选的是人胰岛素。
本发明所述的人血清白蛋白胰岛素偶联物，优选所述连接子为6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(EMCS)或N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)。
根据本发明的另一方面，制备本发明所述的人血清白蛋白胰岛素偶联物的方法，包括下述步骤：
1)使胰岛素与双官能团连接子进行偶联反应，得到胰岛素-双官能团连接子中间偶联产物；
2)将步骤1)得到的胰岛素-双官能团连接子中间偶联产物与重组人血清白蛋白反应，获得重组人血清白蛋白与胰岛素的终极偶联产物；
3)纯化步骤2)得到的终极偶联产物，获得所述的人血清白蛋白胰岛素偶联物。
本发明所述的方法，优选地，所述双冠能团连接子为EMCS或SPDP，步骤1)和步骤2)的偶联反应中，胰岛素、双冠能团连接子及重组人血清白蛋白的反应摩尔比为胰岛素：双冠能团连接子：重组人血清白蛋白＝1:5:2。
本发明所述的方法，其中在所述步骤1)之后进一步包括将步骤1)的胰岛素-双冠能团连接子反应液通过脱盐或者超滤浓缩去除过量的双官能团连接子和反应中的有机溶剂的步骤，获得胰岛素-双官能团连接子中间偶联产物。
本发明所述的方法，其中所述步骤3)包括：
3a)将步骤2)获得的终极偶联产物，用疏水层析介质进行纯化，所述疏水层析介质为Phenyl HP；
3b)用超滤膜浓缩步骤3a)获得的纯化液，得到人血清白蛋白胰岛素偶联物。
更优选地，本发明所述的方法，包括下述步骤：
(1)胰岛素与EMCS偶联
按照胰岛素与EMCS摩尔比1:5的比例，在胰岛素溶液中加入EMCS溶液中进行偶联反应，反应结束后，加入甘氨酸终止反应；
(2)过量EMCS去除
采用G-25脱盐柱，去除步骤(1)反应后过量的EMCS；
(3)胰岛素-EMCS与重组人血清白蛋白偶联
将步骤(2)脱盐后的胰岛素-EMCS，按照胰岛素-EMCS：人血清白蛋白摩尔比1：2的比例，加入重组人血清白蛋白进行偶联反应，反应结束后加入Cys终止反应；
(4)OsrHSA-EMCS-Insulin偶联产物的纯化
将步骤(3)得到的偶联产物采用Phenyl HP层析柱进行纯化，层析条件为：
平衡液：10mmol/LPB，0.5M硫酸铵，pH6.5；
洗脱液：10mmol/LPB，0.025M硫酸铵，pH7.2；
CIP：H2O；
将洗脱收集液用50kDa超滤膜包浓缩后，加入pH7.2的10mmol/LPB浓缩透析，重复，获得OsrHSA-EMCS-Insulin偶联物。
本发明的第三方面提供了含有本发明人血清白蛋白与胰岛素偶联物的药物组合物，可以将本发明的偶联物添加药学上或生理学上可接受的辅料或赋形剂等，形成药物组合物，所述药物组合物作为长效胰岛素在治疗糖尿病上有应用的价值。
本发明提供了一种基于人血清白蛋白和胰岛素的偶联物和其制备方法，所述的人血清白蛋白胰岛素偶联物具有明显降血糖效果，且作用时间大大延长，可减少给药频次，提供患者的顺从性；同时，本制备方法工艺简单，一致性良好，易于后期生产放大。
附图说明
图1为Insulin与EMCS不同偶联条件下，偶联产物的SDS-PAGE检测；
图2为OsrHSA与Insulin-EMCS偶联液SDS-PAGE检测结果(以OsrHSA点样量一致)；左图为：Insulin与EMCS偶联比例为1:1右图为：Insulin与EMCS偶联比例1:5。
图3为Phenyl HP载量测定层析图谱(A)及电泳检测结果(B)；
(B)中L表示上样液，1-6表示上样1-6个柱体积时的穿透液。
图4为不同上样量层析图谱及SDS-PAGE检测结果；
A和B，上样量5mg/ml填料层析图谱(A)及SDS-PAGE检测结果(B)；
C及D，上样量3mg/ml填料层析图谱(C)及SDS-PAGE检测结果(D)；
图中M表示分子量Marker，L表示上样液；FT1—FT4分别表示A和C图中所示位置的穿透液；Elu1表示洗脱收集液主峰，Elu2表示洗脱收集峰拖尾部分；CIP表示再生液。
图5为低载量3批工艺验证。A层析图谱，B，SDS-PAGE检测结果(1-3表示不同批次，M为分子量Marker)；
图6为高电导上样穿透液SDS-PAGE检测结果；L表示上样液，M为分子量Marker，17-25表示上样17-25个柱体积时的穿透液。
图7为高载量3批工艺验证层析图谱及SDS-PAGE检测结果；A，层析图谱。B，SDS-PAGE检测结果(01-03分别表示3个不同批次)
图8为不同膜包超滤液SDS-PAGE检测结果；M为分子量makrer；INS为Insulin对照；“前”表示超滤浓缩前样品；“透过”表示第一次浓缩时膜包的穿透液；“合”表示超滤1-4次的膜包透过液；5-7表示超滤5-7次的膜包透过液；后表示最终超滤浓缩后的样品。
图9为不同浓度硫酸铵上样层析图谱及SDS-PAGE检测结果；A，上样液硫酸铵浓度0.35mol/L；B，上样液硫酸铵浓度为0.4mol/L；C，上样液硫酸铵浓度为0.45mol/L；D，SDS-PAGE检测结果。M表示分子量Marker；L表示上样液；Re表示再平衡穿透液；W表示洗杂液；Elu表示洗脱收集液；CIP表示再生液。
图10不同Linker偶联，Phenyl HP纯化层析图谱及SDS-PAGE检测结果。A，OsrHSA-SMB-Insulin层析图谱；B，OsrHSA-SMB-Insulin层析样品SDS-PAGE检测结果；C，OsrHSA-Br-EMCS-Insulin层析图谱；D，OsrHSA-Br-EMCS-Insulin层析样品SDS-PAGE检测结果。M表示分子量Marker；Load表示上样液；FT1表示至上样结束时的穿透液；FT2为上样结束再平衡时穿透液；Wash表示洗杂液；Elu1表示洗脱收集液；Elu2表示洗脱收集液拖尾部分；CIP表示再生液。
图11为大鼠葡萄糖耐量试验。A，采血时间示意图；B，不同时间血糖浓度曲线)；
图12为非禁食条件下单次给药大鼠血糖(A)及血药浓度(B)曲线；
图13为OsrHSA-SPDP-Insulin偶联产物纯化层析图谱(A)及电泳检测结果(B)；M表示分子量Marker；Load表示上样液；FT表示上样穿透液；Wash表示洗杂液；Elu表示洗脱收集液；CIP表示再生液；非还原表示Elu制样过程中不加还原剂；还原表示Elu制样过程中加入还原剂。
图14为糖尿病小鼠皮下注射OsrHSA-SPDP-Insulin血糖变化曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应指出的是，所提供的这些实施例仅是对本发明内容的举例说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
下列实施例中未特别说明的实验方法均为常规操作或者按照制造厂所提供的操作说明进行。本发明中所用水稻种子表达的重组人血清白蛋白(OsrHSA)：根据专利CN100540667C及CN103880947A制备；GMP级重组人胰岛素购自东抗生物(货号：GMP-045)；其余试剂，若非特别说明，均为市售或常规的产品。
实施例1胰岛素(Insulin)与OsrHSA的偶联工艺
(1)Insulin与EMCS偶联
取7ml Insulin溶液(0.4mmol/L)3支，按照Insulin与EMCS分子摩尔比1：1、1:2.5、1:5的比例，搅拌条件下，缓慢滴加28μl、70μl、140μl EMCS溶液(100mmol/L，DMSO配制)，25℃搅拌反应。在反应0.5h、1h、2h时，分别取2ml样品，加入10倍EMCS摩尔量的Glycine终止反应。采用G-25脱盐柱(柱体积25ml，流速5ml/min)去除过量的EMCS。将脱盐后的Insulin-EMCS，按照OsrHSA与Insulin-EMCS分子摩尔比1:1的比例加入0.186ml OsrHSA注射液(3mmol/L),室温反应1h。反应结束后，取适量反应液进行SDS-PAGE检测。结果如图1所示，EMCS与Insulin的偶联比例越高，目标产物(红色(下方)箭头所示)的产率越高，当两者的偶联比为5:1时，OsrHSA的偶联效率接近50％。而EMCS与Insulin的偶联时间在0.5-2h内对目标蛋白的产率无显著影响。另外需要注意的是，随着EMCS与Insulin偶联比的增加，非目标组分如二聚体(黄色(上方)箭头所示)等也随之增加。
(2)Insulin-EMCS与OsrHSA偶联工艺的确定
分别取11ml Insulin溶液(0.4mmol/L)2支，按照Insulin与EMCS摩尔量比为1:1、1:5，搅拌条件下缓慢滴加44μl、220μl EMCS溶液(100mmol/L)，25℃搅拌反应0.5h。加入10倍EMCS摩尔量的Glycine终止反应。采用G-25脱盐柱(柱体积52ml，流速4ml/min)去除过量的EMCS。将脱盐后的Insulin-EMCS样品每组分3支，各5ml，按照OsrHSA与Insulin-EMCS摩尔分子比1:2、1:1、2:1的比例，分别加入0.103ml、0.205ml、0.411ml的OsrHSA(3mmol/L)，25℃反应，在反应1h和2h时，各取2ml样品，加入10倍OsrHSA摩尔量的L-半胱氨酸终止反应。将所有反应液稀释至相同浓度(以OsrHSA计)，在相同点样体积下进行SDS-PAGE检测。结果如图2所示，OsrHSA与Insulin-EMCS反应时间对偶联效率影响较小；在相同的OsrHSA偶联比下，Insulin与EMCS偶联比1:1，偶联产物的得率低于1:5偶联；当Insulin与EMCS的偶联比为1:5时，与OsrHSA与Insulin-EMCS的偶联比例为0.5:1和1:1时偶联产物在电泳中的比率比较一致，但是由于1:1偶联产物的反应体积是0.5:1的2倍，故1:1反应最终获得OsrHSA-EMCS-Insulin的量比0.5:1的多；同样，从电泳上看，OsrHSA与Insulin-EMCS的偶联比为2:1时，OsrHSA-EMCS-Insulin略低于1:1，但由于其体积是1:1的2倍，其最终产物的量高于1:1偶联。
综上，Insulin、EMCS及OsrHSA最佳的反应比例为1:5:2，其中Insulin与EMCS的反应时间为0.5h，Insulin-EMCS的反应时间为1h。
实施例2OsrHSA-EMCS-Insulin纯化工艺
取9ml Insulin溶液(4mg/ml，0.689mmol/L)，按照Insulin与EMCS摩尔量比1:5(换算为质量比1：0.265)，搅拌条件下，缓慢滴加310μl EMCS溶液(100mmol/L)，室温搅拌反应30min，反应结束后，加入5倍EMCS摩尔量的Glycine终止反应。采用G-25脱盐柱(柱体积170ml，流速20ml/min)去除过量的EMCS。
将脱盐后的Insulin-EMCS，按照Insulin-EMCS：OsrHSA分子摩尔比1:2的比例，加入4ml的OsrHSA注射液(3mmol/L)，室温反应30-60min。反应45min后加入5倍OsrHSA摩尔量的Cys终止反应。
(1)Phenyl HP载量测定
将Insulin-EMCS与OsrHSA的反应液采用3mol/L硫酸铵调节电导至36mS/cm，然后采用平衡液(10mmol/LPB，0.2M硫酸铵，pH6.5)稀释至约2mg/ml(以OsrHSA蛋白含量计)，采用稀盐酸调节pH至6.5，0.22μm微孔滤膜过滤后即为上样液。将上样液以3ml/min的流速上至已平衡的柱体积(CV)15ml的Phenyl HP层析柱(C10/40，柱高20cm)，采用分布收集器按照15ml/管(即1CV/管)进行收集。共上样约12CV。采用10mmol/LPB进行洗脱及H2O进行再生。如图3所示，当上样液蛋白质含量约为2mg/ml，电导约36mS/cm(约相当于0.2mol/L硫酸铵)，Phenyl HP的载量仅约为3CV，即约相当于6mg蛋白质/ml填料。
(2)载量确认
为了进一步确定Phenyl HP的载量，将上样液稀释至约1mg/ml，采用XK16/40层析柱(柱体积40ml)按照5mg/ml填料的上样量进行确认。结果如图4-A-B所示，在上样结束再平衡过程中，穿透峰(FT2)有较为明显抬升，继续平衡，可见明显的目标蛋白脱落(FT3)，随着平衡体积增加，穿透峰基本维持在20mAu左右(FT4)，目标蛋白开始大量脱落。洗脱液中(Elu)纯度相对较高。考虑到按照5mg/ml填料上样过载，上样量降低至3mg/ml填料，结果如图4-C-D所示。当上样量降低至3mg/ml填料，再平衡过程无明显的目标蛋白穿透。洗脱液主峰(Elu1)目标蛋白的纯度相对较高。经计算，按照上样5mg/ml填料上样，Insulin的收率为17.7％，而按照3mg/ml填料上样，则Insulin的收率为32.3％。
(3)低载量工艺验证
根据已确定的偶联及层析纯化工艺，Insulin按照70mg的投料量进行3批验证，结果如图5所示，三批工艺一致性良好。
实施例3OsrHSA-EMCS-Insulin高载量纯化工艺
实施例2的OsrHSA-EMCS-Insulin制备工艺一致性较好，但是Phenyl HP的载量仅为3mg/ml填料，不利于后期工艺的放大。故通过提高上样液的电导来提高Phenyl HP的载量。
根据实施例2制备OsrHSA与Insulin-EMCS反应液，然后将反应液的电导用硫酸铵调节与平衡液(10mmol/LPB，0.5M硫酸铵，pH6.5)一致，采用16ml的Phenyl HP层析柱(C10/40)进行载量测定。结果如图6所示，第23管(15ml/管)可见较为明显的OsrHSA-EMCS-Insulin偶联产物，每管收集样品为15ml，即载量为(23×15ml)/16ml＝21.56，即最大上样量为20CV(管道残留约1CV)，即20mg(以OsrHSA计)/ml填料，相比实施例2显著提高。
实施例4OsrHSA-EMCS-Insulin高载量制备工艺验证
(1)Insulin与EMCS偶联
称取400mg Insulin干粉，加入约20ml 4mmol/L稀盐酸(pH2.0)充分溶解后，搅拌条件下，采用0.5mol/L NaOH溶液缓慢调节pH至7.2(pH不能超过8.0)，然后补加偶联缓冲液(20mmol/LPB，2mmol/LEDTA，pH7.2)至100ml。然后按照Insulin与EMCS质量比1：0.266(摩尔比1:5)的比例，搅拌条件下，缓慢滴加3.43ml EMCS溶液(31mg/ml)，25℃搅拌反应30min，反应结束后，加入5倍EMCS摩尔量的Glycine终止反应。
(2)过量EMCS去除
采用G-25脱盐柱(柱体积490ml，流速25-40ml/min)去除过量的EMCS。所用缓冲液为偶联缓冲液。
(3)Insulin-EMCS与OsrHSA偶联
将脱盐后的Insulin-EMCS，采用偶联缓冲液稀释至约1600ml，然后按照Insulin-EMCS：OsrHSA质量比1:22.9(摩尔比1：2)的比例，加入50.9ml的OsrHSA(153mg/ml)(OsrHSA加入后在体系中终浓度为5mg/ml)。25℃反应50min后加入5倍OsrHSA摩尔量的Cys终止反应。
(4)OsrHSA-EMCS-Insulin偶联产物的纯化
将偶联产物的反应液稀释至约1mg/ml(以OsrHSA计算)，采用Phenyl HP层析柱进行纯化。层析条件如下：层析柱：GCC-50-400；柱高20cm；柱体积(CV)390ml；流速35ml/min。上样体积：约7.8L，20CV；平衡液：10mmol/LPB，0.5M硫酸铵，pH6.5(再平衡体积：3CV，1170ml)；洗脱液：10mmol/LPB，0.025M硫酸铵，pH7.2(收集至UV 30mAu)；CIP：H2O；将洗脱收集液用50kDa超滤膜包浓缩至较小体积，然后加入至少2倍体积的10mmol/LPB(pH7.2)，浓缩透析，重复7次，即得OsrHSA-EMCS-Insulin原液。
验证结果显示，层析图谱及电泳检测结果一致性良好；3批验证收率(表1)及纯度一致(表2及图7)。
表1高载量3批工艺验证层析收率
表2OsrHSA-EMCS-Insulin三批原液SEC-HPLC检测结果汇总
实施例5Linker去除工艺
Insulin与Linker偶联后，过量的Linker需要去除，以避免过量的Linker与OsrHSA直接反应。由于Linker分子量一般较小，可通过脱盐、透析、超滤等方式去除，由于透析不利于工业化放大，故选择脱盐及超滤方式进行比较研究。具体如下：称取320mg Insulin干粉，加入约20ml 4mmol/L稀盐酸(pH2.0)充分溶解后，搅拌条件下，采用0.5mol/L NaOH溶液缓慢调节pH至7.2(pH不能超过8.0)，然后补加偶联缓冲液(20mmol/LPB，2mmol/LEDTA，pH7.2)至80ml，搅拌混匀，蛋白质含量为4mg/ml。然后将上述Insulin溶液等分为2份，每份为40ml，按照Insulin与EMCS质量比摩尔比1:5，搅拌条件下，分别缓慢滴加1.38ml EMCS溶液(31mg/ml)，25℃搅拌反应30min，反应结束后，加入5倍EMCS摩尔量的Glycine终止反应。分别采用10kDa和5kDa超滤膜包，将40ml Insulin-EMCS反应产物初始浓缩至最小体积(管道残留-15ml)。初始浓缩结束后，加入50ml偶联缓冲液，继续浓缩至最小体积，换液之后，用适量透析液进行润洗膜后恢复体积至80ml(初始体积的2倍)。结果如图8所示，不论是5kDa膜包还是10kDa膜包，超滤透析后聚集体增加；5kDa膜包收率约为80％，而10kDa膜包收率仅为64％，均低于G-25脱盐柱90％收率；一方面膜包收率低与所选取的膜包截留分子量及膜包材质有关，为提高收率，可选择1-3kDa的超滤膜包；但截留分子量更小的膜包超滤所需时间更长；从收率及操作时间上考虑，选择脱盐柱如G-25更合适。
实施例6OsrHSA-EMCS-Insulin多聚体去除工艺
实施例2中，Phenyl HP采用0.25M硫酸铵上样，收集液的二聚体含量仅为2-2.5％左右，但其最大上样量仅3mg/ml，实例4将上样液中硫酸铵浓度提高至0.5M，载量提高至20mg/ml(提高了5-6倍)，但二聚体增加至5-6％。
基于前期上述结果，对上样液中硫酸铵浓度进行优化，以期获得载量较高、多聚体及二聚体含量较低的工艺。根据前述实施例制备OsrHSA与Insulin-EMCS反应液，按照如下条件进行纯化条件优化：(1)0.45mol/L硫酸铵上样，0.4mol/L硫酸铵洗杂；(2)0.4mol/L硫酸铵上样，0.35mol/L硫酸铵洗杂；(3)0.35mol/L硫酸铵上样，0.3mol/L硫酸铵洗杂。结果如图9所示，由于上样液中硫酸铵的浓度降低，最大上样量也随着降低，其中0.35mol/L和0.4mol/L硫酸铵上样其最大上样量约12mg/ml填料，而0.45mol/L硫酸铵上样其最大上样量约为20mg/ml填料；将各条件下的洗杂液及洗脱收集液进行SEC-HPLC检测，其中0.45mol/L硫酸铵上样，其洗杂液中聚集体为11.6％，洗脱液多聚体含量为4.0％；0.4mol/L硫酸铵上样，其洗杂液多聚体含量为7.6％，洗脱液多聚体含量为3.6％；0.35mol/L硫酸铵上样，其洗杂液多聚体含量为7.6％，洗脱液多聚体含量为3.6％。以上结果表明，上样液中硫酸铵浓度越低，洗脱液中二聚体及多聚体的含量越低；虽然洗杂液的电泳条带显示其主要为目标蛋白，但SEC-HPLC结果显示，其聚集体的含量相显著高于洗脱液。由于增加洗杂步骤，Insulin的收率有所降低，约为25％；通过以上优化可知，二聚体及多聚体主要是通过上样穿透和洗杂去除，其含量与层析收率及上样量呈负相关。
实施例7Insulin不同Linker偶联工艺
上述实施例均采用EMCS作为Linker，为了证明其它Linker也具有相同或者更优的偶联效果，选择EMCS的类似物Br-EMCS及SMCC的类似物SMB作为测试对象。
称取340mg Insulin干粉，加入34ml 4mmol/L稀盐酸(pH2.0)充分溶解后，搅拌条件下，采用0.5mol/L NaOH溶液缓慢调节pH至7.2，然后补加PB-1至85ml(Insulin终浓度4mg/ml)，调节pH至7.10-7.20，搅拌混匀；将上述Insulin溶液分为2份，分别按照Insulin与SMB或者Br-EMCS摩尔比1:5的比例，搅拌条件下，缓慢滴加1.242mlSMB溶液(100mmol/L)或者Br-EMCS溶液(100mmol/L)，室温下，搅拌反应30min，反应结束后，加入Glycine终止反应。采用G-25脱盐柱(XK26/40,柱体积175ml；流速15ml/in)去除过量的SMB或者Br-EMCS。
采用偶联缓冲液将脱盐后的Insulin-SMB或者Insulin-Br-EMCS稀释至约715ml，然后按照Insulin：OsrHSA质量比1:21的比例，加入15ml的OsrHSA(240mg/ml)(OsrHSA加入后在体系中终浓度为4-5mg/ml),室温下，搅拌反应2h。采用硫酸钠将反应液的电导调节至77±2mS/cm，然后用平衡液稀释至约1mg/ml(以OsrHSA计算，总计约3570ml)，稀盐酸调节pH至6.0-6.1，0.22μm微孔滤膜过滤后即为Phenyl HP层析上样液。Phenyl HP层析(GCC-40-200；柱高14cm；柱体积175ml；流速30ml/min)步骤如下：平衡：用3-5CV平衡液(10mmol/PB，0.5mol/L硫酸铵，电导75-79mS/cm，pH6.0)冲洗平衡层析柱，直至基线、洗脱pH及电导稳定；上样：将样品加载至层析柱，加载体积约3500ml(20CV)；再平衡：用5CV平衡液冲洗层析柱，直至基线、洗脱pH及电导稳定；洗杂：用3CV的洗杂液(10mM PB，0.45mol/L硫酸铵，电导62-66mS/cm，pH6.0)冲洗层析柱；洗脱：用洗脱液(10mmol/L，50mmol/L硫酸铵，电导10-12mS/cm，pH6.0)冲洗层析柱，降低至20-30mAu停止收集；
收集液采用50kDa超滤膜包(赛多利斯，vivaflow200，PES材质)将收集液(-700ml)浓缩至约20ml，然后加入至少2倍体积的透析液，混合均匀后再次浓缩至20ml，重复7次。透析结束后将浓缩液浓缩至较小体积(约15ml)，然后排空膜包，收集浓缩液，置于-80℃保存备用。以Br-EMCS或者SMB为Linker的OsrHSA与Insulin的偶联产物及纯化电泳图谱如图10所示。
实施例8葡萄糖耐量试验(IPGTT)
对OsrHSA-EMCS-Insulin(根据实施例4制备)进行大鼠葡萄糖耐量实验(IPGTT)。实验分为3组，对照组和实验组，每组6只SD大鼠。实验组按照125nmol/kg剂量一次皮下注射给药，对照组给同体积安慰剂生理盐水。糖耐量实验前16h，禁食不禁水。采用大鼠眼眶静脉丛取血，取血时间点分别为-0.5h,0h,0.5h,1h,2h,4h,6h；其中-0.5h为给药前空腹血糖浓度，0h为给药0.5h后，腹腔注射20g/kg葡萄糖前的血糖浓度，在葡萄注射后的0.5h,1h,2h,4h,6h测定血糖浓度。结果显示(图11)，与Insulin组和阴性对照组相比，OsrHSA-EMCS-Insulin药效可以持续到45-49h，提示OsrHSA-EMCS-Insulin具有较长的药效；在5轮IPGTT后，OsrHSA-EMCS-Insulin血糖浓度与对照组基本一致，说明OsrHSA-EMCS-Insulin在大鼠体内的作用时间约为24h。
实施例9OsrHSA-EMCS-Insulin在SD大鼠中药效及药代动力学研究。
为了证明OsrHSA-EMCS-Insulin的长效性及有效性，选择SD大鼠为研究对象进行测试。具体操作如下：将7周龄体重200g-250g的SD雄性大鼠随机分组，在非禁食的条件下，单次皮下注射不同剂量的OsrHSA-EMCS-Insulin(按照实施例4制备)及同等体积的生理盐水(阴性对照)，然后在给药后4h、8h、24h、32h及48h分别从大鼠眼眶静脉丛取血，37℃处理30min，然后4000rpm离心15min，取上清置于-80℃保存。采用血糖测定试纸条(Roche)及Insulin ELISA试剂盒(R&D，DY8056-05)进行血糖及胰岛素含量测定。结果如图12所示，OsrHSA-EMCS-Insulin呈现明显的剂量效应，给药剂量越大，降糖效果越佳，持续时间越久；最高剂量1000nmol/kg下，SD大鼠体内降糖药效可维持32-48h。血药(Insulin)浓度测定结果显示，血液中Insulin浓度在0-32h内与给药剂量成正相关，48h后，三组血液中Insulin含量趋于本底水平；血液中Insulin含量变化与血糖浓度变化趋势基本保持一致。
【实施例10】重组人血清白蛋白重组人胰岛素偶联物(OsrHSA-SPDP-Insulin)的制备
重组人胰岛素(Insulin)与SPDP偶联
取42ml Insulin溶液(合肥天麦生物科技发展有限公司，0.4mmol/L，偶联液溶解)，然后按照Insulin与SPDP分子摩尔比1:5的比例，缓慢滴加8ml的N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)溶液(100mmol/L，DMSO溶解)，室温下搅拌反应1h，然后加入5倍SPDP摩尔量的Glycine溶液终止反应。
Insulin-SPDP与OsrHSA偶联
反应结束后，采用Bestdex G-25M脱盐柱去除过量的SPDP及DMSO。将脱盐后获得Insulin-SPDP按照其与OsrHSA分子摩尔比1:1的比例加入3.88mlOsrHSA溶液(3mmol/L)，充分混匀后，4℃静置反应18h。
OsrHSA-SPDP-Insulin偶联产物的纯化
将上述反应液采用3M的硫酸铵调节电导与平衡液(10mM PB，0.2M硫酸铵，pH6.5)一致，然后用平衡液稀释至约1mg/ml(以OsrHSA计)，以15ml/min的流速上样至装填有176mlPhenyl Bestrose HP层析介质，柱高25cm的层析柱。上样结束后，用平衡液再次平衡层析柱至UV与基线基本一致。采用10mM PB，0.18M硫酸铵，pH6.5的洗杂液进行二聚体的去除，最后采用10mM PB，pH7.2的洗脱液进行目标蛋白的洗脱。将洗脱收集液采用50kDa超滤膜包浓缩换液后即获得OsrHSA-SPDP-Insulin偶联物原液。OsrHSA-SPDP-Insulin偶联产物纯化层析图谱(A)及电泳检测结果(B)如图13。
【实施例11】OsrHSA-SPDP-Insulin在糖尿病小鼠模型中降血糖效果研究
为了证明OsrHSA-SPDP-Insulin的长效性，选择雄性BSK-DB糖尿病小鼠模型进行研究。根据实施7制备OsrHSA-SPDP-Insulin。小鼠过夜禁食不禁水，每试验组5只小鼠。采用皮下注射的方式单次给药，其中OsrHSA-SPDP-Insulin给药剂量设定为25IU/kg，50IU/kg(假定Insulin偶联OsrHSA后活性保持不变，Insulin活性为28IU/mg)，阳性对照Insulin的给药剂量为10IU/kg，阴性对照组给同等体积的生理盐水。分别在给药前及给药后8h取小鼠尾静脉血并采用Roche血糖仪及试纸条测定血糖。根据不同时间点血糖值(Tn)相对初始血糖值(T0)的变化值(Tn/T0)绘制血糖变化曲线。如图14所示，Insulin对照组在给药2h后血糖降低至最低，4h左右恢复与生理盐水组一致；而OsrHSA-SPDP-Insulin(图例中OsrHSA-Insulin)呈现一定的剂量效应，且降血糖作用更明显，作用时间显著延长(大于8h)。本实施例证明HSA偶联物可显著延长所偶联药物的作用时间。
本发明通过上述实施例来说明胰岛素类似物的详细制备方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细制备方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明中连接子、胰岛素的替换等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (7)

1.一种人血清白蛋白胰岛素偶联物，具有如下结构：
HSA-Linker-Insulin
其中：
HSA为水稻种子表达的重组人血清白蛋白，Linker为具有双官能团的小分子连接子，Insulin为胰岛素；
所述的具有双官能团的小分子连接子为6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯EMCS。
2.制备权利要求1所述的人血清白蛋白胰岛素偶联物的方法，包括下述步骤：
1)使胰岛素与双官能团连接子进行偶联反应，得到胰岛素-双官能团连接子中间偶联产物；
2)将步骤1)得到的胰岛素-双官能团连接子中间偶联产物与重组人血清白蛋白反应，获得重组人血清白蛋白与胰岛素的终极偶联产物；
3)纯化步骤2)得到的终极偶联产物，获得所述的人血清白蛋白胰岛素偶联物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤1)和步骤2)的偶联反应中，胰岛素、双官能团连接子及重组人血清白蛋白的反应摩尔比为胰岛素：双官能团连接子：重组人血清白蛋白＝1:5:2。
4.根据权利要求2所述的方法，其中在所述步骤1)之后进一步包括将步骤1)的胰岛素-双冠能团连接子反应液通过脱盐或者超滤浓缩去除过量的双官能团连接子和反应中的有机溶剂的步骤，获得胰岛素-双官能团连接子中间偶联产物。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤3)包括：
3a)将步骤2)获得的终极偶联产物，用疏水层析介质进行纯化，所述疏水层析介质为Phenyl HP；
3b)用超滤膜浓缩步骤3a)获得的纯化液，得到人血清白蛋白胰岛素偶联物。
6.根据权利要求2所述的方法，包括下述步骤：
(1)胰岛素与EMCS偶联：
按照胰岛素与EMCS摩尔比1:5的比例，在胰岛素溶液中加入EMCS溶液中进行偶联反应，反应结束后，加入甘氨酸终止反应；
(2)过量EMCS去除：
采用G-25脱盐柱，去除步骤(1)反应后过量的EMCS；
(3)胰岛素-EMCS与重组人血清白蛋白偶联：
将步骤(2)脱盐后的胰岛素-EMCS，按照胰岛素-EMCS：人血清白蛋白摩尔比1：2的比例，加入重组人血清白蛋白进行偶联反应，反应结束后加入Cys终止反应；
(4)偶联产物的纯化：
将步骤(3)得到的偶联产物采用Phenyl HP层析柱进行纯化，层析条件为：
平衡液：10mmol/LPB，0.5M硫酸铵，pH6.5；
洗脱液：10mmol/LPB，0.025M硫酸铵，pH7.2；
CIP：H2O；
将洗脱收集液用50kDa超滤膜包浓缩后，加入pH7.2的10mmol/L PB浓缩透析，重复，获得人血清白蛋白胰岛素偶联物。
7.一种药物组合物，含有权利要求1所述的人血清白蛋白胰岛素偶联物。
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