CN114457024A - 一种表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用 - Google Patents
一种表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114457024A CN114457024A CN202011186002.6A CN202011186002A CN114457024A CN 114457024 A CN114457024 A CN 114457024A CN 202011186002 A CN202011186002 A CN 202011186002A CN 114457024 A CN114457024 A CN 114457024A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- shrna
- hla
- seq
- pluripotent stem
- derivative
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 115
- 108040006852 interleukin-4 receptor activity proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 239000002160 alpha blocker Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 119
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 104
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 35
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims abstract description 8
- 208000024711 extrinsic asthma Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 94
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 94
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 92
- 101001000998 Homo sapiens Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C Proteins 0.000 claims description 30
- 102100035620 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C Human genes 0.000 claims description 30
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 21
- 230000001064 anti-interferon Effects 0.000 claims description 20
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 20
- 101100382122 Homo sapiens CIITA gene Proteins 0.000 claims description 18
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 claims description 16
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 16
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 claims description 15
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 claims description 15
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 15
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 15
- 108700002010 MHC class II transactivator Proteins 0.000 claims description 14
- 102100026371 MHC class II transactivator Human genes 0.000 claims description 13
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 10
- 108010032038 Interferon Regulatory Factor-3 Proteins 0.000 claims description 9
- 108010032036 Interferon Regulatory Factor-7 Proteins 0.000 claims description 9
- 102100029843 Interferon regulatory factor 3 Human genes 0.000 claims description 9
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 claims description 9
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 8
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 claims description 8
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 claims description 8
- 102100038070 Interferon regulatory factor 7 Human genes 0.000 claims description 8
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 claims description 7
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 claims description 7
- 102100026965 RISC-loading complex subunit TARBP2 Human genes 0.000 claims description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 102100029966 HLA class II histocompatibility antigen, DP alpha 1 chain Human genes 0.000 claims description 6
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 claims description 6
- 102100036241 HLA class II histocompatibility antigen, DQ beta 1 chain Human genes 0.000 claims description 6
- 102100040505 HLA class II histocompatibility antigen, DR alpha chain Human genes 0.000 claims description 6
- 102100040482 HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 3 chain Human genes 0.000 claims description 6
- 102100028636 HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 4 chain Human genes 0.000 claims description 6
- 102100028640 HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 5 chain Human genes 0.000 claims description 6
- 102100040485 HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain Human genes 0.000 claims description 6
- 108010093061 HLA-DPA1 antigen Proteins 0.000 claims description 6
- 108010086786 HLA-DQA1 antigen Proteins 0.000 claims description 6
- 108010065026 HLA-DQB1 antigen Proteins 0.000 claims description 6
- 108010067802 HLA-DR alpha-Chains Proteins 0.000 claims description 6
- 108010039343 HLA-DRB1 Chains Proteins 0.000 claims description 6
- 108010061311 HLA-DRB3 Chains Proteins 0.000 claims description 6
- 108010040960 HLA-DRB4 Chains Proteins 0.000 claims description 6
- 108010016996 HLA-DRB5 Chains Proteins 0.000 claims description 6
- 101001125123 Homo sapiens Interferon-inducible double-stranded RNA-dependent protein kinase activator A Proteins 0.000 claims description 6
- 102100029408 Interferon-inducible double-stranded RNA-dependent protein kinase activator A Human genes 0.000 claims description 6
- 101000974349 Homo sapiens Nuclear receptor coactivator 6 Proteins 0.000 claims description 5
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 101150076800 B2M gene Proteins 0.000 claims description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 4
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 claims description 3
- 101150084233 ago2 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 claims description 2
- 102100031618 HLA class II histocompatibility antigen, DP beta 1 chain Human genes 0.000 claims description 2
- 108010045483 HLA-DPB1 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 101000847058 Homo sapiens Exportin-5 Proteins 0.000 claims description 2
- 108091060552 Pasha (protein) Proteins 0.000 claims description 2
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 claims description 2
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 claims description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 2
- 102000047351 Exportin-5 Human genes 0.000 claims 1
- 101000763328 Homo sapiens RISC-loading complex subunit TARBP2 Proteins 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 194
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 69
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 35
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 201000009961 allergic asthma Diseases 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 238000003198 gene knock in Methods 0.000 description 11
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 10
- 229940124308 alpha-adrenoreceptor antagonist Drugs 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 9
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 101100113084 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) mcs2 gene Proteins 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 7
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 7
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 6
- 101100545229 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ZDS2 gene Proteins 0.000 description 6
- 101100167209 Ustilago maydis (strain 521 / FGSC 9021) CHS8 gene Proteins 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 101100144701 Mus musculus Drosha gene Proteins 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 5
- 108091007428 primary miRNA Proteins 0.000 description 5
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 4
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- -1 Ago1 Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000869796 Homo sapiens Microprocessor complex subunit DGCR8 Proteins 0.000 description 3
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 3
- 102100032459 Microprocessor complex subunit DGCR8 Human genes 0.000 description 3
- 101100198353 Mus musculus Rnasel gene Proteins 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- LOTKRQAVGJMPNV-UHFFFAOYSA-N 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(F)C([N+]([O-])=O)=C1 LOTKRQAVGJMPNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007445 2',5'-Oligoadenylate Synthetase Human genes 0.000 description 2
- 108010086241 2',5'-Oligoadenylate Synthetase Proteins 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 102100023387 Endoribonuclease Dicer Human genes 0.000 description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000907904 Homo sapiens Endoribonuclease Dicer Proteins 0.000 description 2
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102100023085 Serine/threonine-protein kinase mTOR Human genes 0.000 description 2
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 108010027179 Tacrolimus Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018679 Tacrolimus Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- BKPRVQDIOGQWTG-ICOOEGOYSA-N [(1s,2r)-2-phenylcyclopropyl]azanium;[(1r,2s)-2-phenylcyclopropyl]azanium;sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O.[NH3+][C@H]1C[C@@H]1C1=CC=CC=C1.[NH3+][C@@H]1C[C@H]1C1=CC=CC=C1 BKPRVQDIOGQWTG-ICOOEGOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 2
- 238000002376 fluorescence recovery after photobleaching Methods 0.000 description 2
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 229940087824 parnate Drugs 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 210000003014 totipotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050629 1.8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 206010050685 Cytokine storm Diseases 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100032839 Exportin-5 Human genes 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 230000004668 G2/M phase Effects 0.000 description 1
- 101000609762 Gallus gallus Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000986084 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000780643 Homo sapiens Protein argonaute-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000043138 IRF family Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102100020791 Interleukin-13 receptor subunit alpha-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710112663 Interleukin-13 receptor subunit alpha-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 101100489688 Mus musculus Eif4enif1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102100027913 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP1A Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000009516 Protein Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010009341 Protein Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100034207 Protein argonaute-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020471 RNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 206010070835 Skin sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 108010006877 Tacrolimus Binding Protein 1A Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 108010009386 Type I Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009509 Type I Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010002120 Type II Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000535 Type II Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 101150036080 at gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 210000001726 chromosome structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000013373 clone screening Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 230000029036 donor selection Effects 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 229950003468 dupilumab Drugs 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000010468 interferon response Effects 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 231100001078 no known side-effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 231100000370 skin sensitisation Toxicity 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
- A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0608—Germ cells
- C12N5/0611—Primordial germ cells, e.g. embryonic germ cells [EG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0623—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Virology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Biophysics (AREA)
Abstract
本发明公开了一种表达IL‑4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用，该多能干细胞或其衍生物的基因组导入有IL‑4Rα阻断物的表达序列，所述IL‑4Rα阻断物为抗IL‑4Rα抗体。本发明提供的表达IL‑4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物，可用于自体细胞诱导iPSCs或分化成MSCs这类低免疫源性细胞进行运用，其可在体内持续表达IL‑4Rα阻断物，用于治疗过敏、特应性皮炎和/或哮喘及相关疾病。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用。
背景技术
IL-4最初由于具有促进B淋巴细胞增殖的作用而被命名为B细胞生长因子-1。有的实验室则称之为B细胞刺激因子-1、T细胞生长因子-2等。后来基因克隆成功才统一将其命名为白细胞介素4(Interleukin-4，IL-4)。人IL-4的基因的染色体定位于5q31，成熟人IL-4由129个氨基酸残基组成的，分子质量为18～19kDa。IL-4主要由活化的T细胞Th2亚群产生，另外一些其他细胞如肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜酸性粒细胞等也可分泌少量IL-4，并诱导初始CD4+T细胞向Th2亚群分化。IL-4与IL-13在支气管哮喘的炎症方面有重要的作用，同时，IL-13与IL-4还在过敏、特性性皮炎等方面有重要作用，但他们必须与靶细胞上的受体复合物结合才可以发挥其生物活性。IL-4受体(IL-4Receptor，IL-4R)分为I型IL-4受体和Ⅱ型IL-4受体两种亚型。I型IL-4R由IL-4Rα(IL-4Receptorα)链(CD124)和γc链(CD132)组成；Ⅱ型IL-4R由IL4Rα链(CD124)和IL-13Rα1链(CD213α1)组成，因此IL-13与IL-4共享Ⅱ型IL-4R受体即IL-4Rα进行信号传导。因此，IL-4Rα已成为治疗过敏、哮喘、特应性皮炎的新靶点，IL-4Rα阻断物(抗IL-4Rα抗体)可作为过敏、哮喘治疗药物。目前，处于临床阶段的IL-4Rα抗体有Dupixent、苏州康乃德生物的IL-4Rα抗体CBP-201等。然而，抗IL-4Rα抗体的作用时间短，需要长期进行注射，对于病人来说需要花费高昂的费用。
干细胞是一类具备自我更新能力及向特定功能体细胞分化能力的“种子”细胞，具有再生为各种组织器官和人体的潜力，在免疫应答、衰老、肿瘤发生等重大生物学活动中发挥着核心且不可替代的作用。依据干细胞特性的程度差异，主要将干细胞分为：全能干细胞(Totipotent stem cells)、多能干细胞(Pluripotent stem cells，PSCs)和成体干细胞(adult stem cell)。其中，多能干细胞PSCs具备几近无限的自我更新能力，以及在正常发育条件下向胚内所有胚层的器官、组织、细胞发育分化的潜能，典型的PSCs主要包括胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)、胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EGCs)、胚胎癌细胞(embryonic carcinoma cells，ECCs)，以及诱导多能干细胞(induced pluripotentstem cells，iPSCs)等，这类细胞由于其强大的功能，并且可以一定程度地通过伦理限制，因此具有十分深远和广泛的应用前景。
因此，开发一种可以在人体中表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物具有重要意义。
但是，无论是自体iPSCs细胞库，还是免疫配型PSCs细胞库的构思或建立都需要花费极大的财力、物力和人力。同种异基因供受体的器官、组织或细胞移植的分子免疫学基础主要是基于经典的主要组织相容性复合体MHC-I和MHC-II(人又作HLA-I、HLA-II)的配型。截至2019年6月，已鉴定和命名的HLA系统等位基因已超过20000个，仅经典的HLA-A、B、C的等位基因数分别都超过5000个，这些经典的HLA-I/II型等位基因各种可能的随机组合将是天文数字，并且随着新的等位基因的发现组合数随之增加，给器官、组织、细胞移植前的组织配型及供体选择带来极大的障碍，也给构建覆盖人群免疫配型PSCs细胞库带来巨大的困难。
于是，构建同种异体免疫兼容的通用型PSCs迫在眉睫。近年已有许多报道通过敲除B2M、CIITA等基因，实现HLA-I和HLA-II细胞表面或本身基因的缺失表达，进而使细胞具备免疫耐受或逃逸T/B细胞特异性免疫应答，产生免疫兼容的通用型PSCs，为更广泛的通用型PSCs源细胞、组织、器官应用奠定了重要的基础。也有报道细胞过表达CTLA4-Ig、PD-L1从而抑制同种异的免疫排斥。最近又有报道，在敲除B2M、CIITA的同时，敲入CD47，从而使细胞获得了逃逸除特异性免疫应答外，还具备免疫耐受或逃逸NK等细胞的固有免疫应答，从而使细胞具备了更加全面更强的免疫兼容特性。然而，这些方案要么免疫兼容不彻底，仍有通过其他途径发生同种异体的免疫排斥；要么彻底消除同种异体免疫排斥应答，但使供体源移植物的细胞本身同时丧失了抗原提呈的能力，这给受体带来了极大的致瘤性和病毒感染等疾病的风险。
为此，也有报道，不直接敲除B2M，而敲除HLA-A、HLA-B或一并敲除CIITA的同时，保留HLA-C，并构建12个覆盖人群超过90％的HLA-C免疫配型抗原，以此达到移植物的细胞仍具备一定程度的抗原提呈功能，并且同时能够通过HLA-C抑制NK细胞的固有免疫应答。但这类细胞，一来，HLA-I类抗原提呈的抗原类型缩小了三分之二以上，能够提呈的抗原完整性极大地不可逆的缩小，对于各种肿瘤、病毒以及其他疾病抗原的提呈具有极大的偏向性，仍然保留了相当程度的致瘤和病毒感染等疾病的风险，在CIITA同时敲除的情况下其致病风险更高；二来，12种高频率免疫配型的HLA-C抗原种族差异很大，通过我们核实计算部分地区仅能占到70％的比例，而中国、印度等人口大国目前尚未有权威的大样本量的HLA数据展示，这样制备出来的通用型PSCs使用仍受到巨大的配型空缺考验；第三，这种方法会经历数次反复的基因编辑工作，按每次基因编辑至少两轮单细胞分离培养计，整个过程至少需要六轮以上的单细胞分离培养，这些流程不可避免且极大概率地因多次基因编辑脱靶或染色质不稳定或因大量单细胞传代增殖造成细胞各种不可预测的突变，进而诱发致癌、代谢疾病等各种问题。由此可见，这类免疫兼容方案亦为“过渡时期”的权宜之计，仍有许多问题没有更好的解决。
此外，还有人设计通过诱导自杀基因在供体组织、细胞致病后诱导杀死，这样做的后果将产生严重的组织坏死、细胞因子风暴等不可预知的疾病风险问题，并且这类设计的细胞杀死后将不复存在合适的供体细胞、组织和器官又是一大难题。
发明内容
为了克服现有技术所存在的不足，本发明的第一方面的目的，在于提供一种表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物，包括表达IL-4Rα阻断物的非免疫兼容的多能干细胞或其衍生物、表达IL-4Rα阻断物的免疫兼容的多能干细胞或其衍生物、表达IL-4Rα阻断物的免疫兼容可逆的多能干细胞或其衍生物中的至少一种；其中，表达IL-4Rα阻断物的免疫兼容的多能干细胞或其衍生物可以通过如下方案实现：将多能干细胞或其衍生物基因组中的B2M和/或CIITA基因敲除和/或在多能干细胞或其衍生物的基因组导入免疫兼容分子的表达序列；表达IL-4Rα阻断物的免疫兼容可逆的多能干细胞或其衍生物通过如下方案实现：在多能干细胞或其衍生物的基因组导入免疫兼容分子及诱导型基因表达系统，多能干细胞或其衍生物基因组中导入的免疫兼容分子的表达通过诱导型基因表达系统调控，而诱导型基因表达系统的开启与关闭受外源诱导物的调控；当免疫兼容分子正常表达时，多能干细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达被抑制或过表达，可以消除或降低供体细胞和受体之间的同种异体免疫排斥应答；而当供体细胞发生病变时，可通过外源诱导物诱导关闭免疫兼容分子的表达，恢复供体细胞的抗原提呈能力，使受体能够清除病变的供体细胞。
本发明的第二个方面的目的，在于提供上述多能干细胞或其衍生物在制备抗过敏、特应性皮炎和/或抗哮喘治疗药物中的应用。
本发明的第三个方面的目的，在于提供一种制剂，包含上述多能干细胞或其衍生物。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物，所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有IL-4Rα阻断物的表达序列，所述IL-4Rα阻断物为抗IL-4Rα抗体。
所述抗IL-4Rα抗体的重链序列如SEQ ID NO.1所示，轻链序列如SEQ ID NO.2所示。
所述抗IL-4Rα抗体优选为分泌型抗体。
所述IL-4Rα阻断物的表达序列的导入位点为多能干细胞或其衍生物的基因组安全位点。
所述基因组安全位点包括AAVS1安全位点、eGSH安全位点、H11安全位点中的一种或多种。
作为本发明的另一个技术方案：所述多能干细胞或其衍生物的B2M和/或CIITA基因被敲除，从而得到一种表达IL-4Rα阻断物的免疫兼容的多能干细胞或其衍生物。
作为本发明的另一个技术方案：所述多能干细胞或其衍生物的基因组还导入一种或多种免疫兼容分子表达序列，所述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答(同种异体免疫排斥)相关的基因的表达，从而得到一种表达IL-4Rα阻断物的免疫兼容的多能干细胞或其衍生物。
所述与免疫应答相关的基因包括：
(1)主要组织相容性复合体基因，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；
(2)主要组织相容性复合体相关基因，包括B2M和CIITA中的至少一种。
所述免疫兼容分子表达序列的导入位点为多能干细胞或其衍生物的基因组安全位点。
所述基因组安全位点包括AAVS1安全位点、eGSH安全位点、H11安全位点中的一种或多种。
所述免疫兼容分子包括以下的任一种或多种：
(1)免疫耐受相关基因，包括CD47或HLA-G；
(2)HLA-C类分子，包括人群中比例合计超过90％的HLA-C复等位基因，或者超过90％的HLA-C复等位基因与B2M构成的融合蛋白基因；
(3)主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；
(4)主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体相关基因包括B2M和CIITA中的至少一种。
所述B2M的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.5中的至少一种；
所述CIITA的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.15中的至少一种；
所述HLA-A的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.18中的至少一种；
所述HLA-B的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.24中的至少一种；
所述HLA-C的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.30中的至少一种；
所述HLA-DRA的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.40中的至少一种；
所述HLA-DRB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.45中的至少一种；
所述HLA-DRB3的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.46～SEQ ID NO.47中的至少一种；
所述HLA-DRB4的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.48～SEQ ID NO.57中的至少一种；
所述HLA-DRB5的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.58～SEQ ID NO.66中的至少一种；
所述HLA-DQA1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.67～SEQ ID NO.73中的至少一种；
所述HLA-DQB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.74～SEQ ID NO.83中的至少一种；
所述HLA-DPA1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.84～SEQ ID NO.93中的至少一种；
所述HLA-DPB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.94～SEQ IDNO.103中的至少一种。
所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子。
所述shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因包括Drosha、Ago1、Ago2、Dicer1、Exportin-5、TRBP(TARBP2)、PACT(PRKRA)、DGCR8中的至少一种；所述抗干扰素效应分子为PKR、2-5As、IRF-3和IRF-7中的至少一种的shRNA和/或shRNA-miR。
所述shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子的导入位点为多能干细胞或其衍生物的基因组安全位点。
所述基因组安全位点包括AAVS1安全位点、eGSH安全位点、H11安全位点中的一种或多种。
所述PKR的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.104～SEQ ID NO.113中的至少一种；
所述2-5As的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.114～SEQ ID NO.143中的至少一种；
所述IRF-3的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.144～SEQ ID NO.153中的至少一种；
所述IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.154～SEQ ID NO.163中的至少一种。
所述主要组织相容性复合体基因、主要组织相容性复合体相关基因、PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR的表达框架如下所示：
(1)shRNA表达框架：由5’到3’依次包括shRNA靶序列、茎环序列、shRNA靶序列的反向互补序列、Poly T；两个反向互补靶序列由中间一茎环序列分隔组成发夹结构，最后连上Poly T作为RNA聚合酶III的转录终止子；
(2)shRNA-miR表达框架：使用上述主要组织相容性复合体基因、主要组织相容性复合体相关基因、PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA-miR靶序列替换microRNA-30或者microRNA-155中的靶序列得到。
所述shRNA表达框架中的茎环序列长度为3～9个碱基；所述Poly T长度为5～6个碱基。
上述表达框架可根据需要在5’端加上组成型启动子或诱导型启动子，例如U6启动子、H1启动子，以及配套的启动子调控元件。
作为本发明的另一个技术方案：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入诱导型基因表达系统，用于调控免疫兼容分子的表达，从而得到一种免疫兼容可逆的表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物。
所述诱导型基因表达系统为Tet-Off系统、二聚体诱导表达系统中的至少一种。
所述诱导型基因表达系统的导入位点为多能干细胞或其衍生物的基因组安全位点。
所述基因组安全位点包括AAVS1安全位点、eGSH安全位点、H11安全位点中的一种或多种。
以上所述IL-4Rα阻断物的表达序列、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统的导入采用病毒载体干扰、非病毒载体转染或基因编辑的方法。
所述基因编辑的方法包括基因敲入。
以上所述多能干细胞包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞、或者诱导多能干细胞；所述多能干细胞衍生物包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织。
所述成体干细胞包括间充质干细胞、神经干细胞。
本发明的第二个方面，提供上述多能干细胞或其衍生物在制备抗过敏、特应性皮炎和/或抗哮喘治疗药物中的应用。
本发明的第三个方面，提供一种制剂，包含上述多能干细胞或其衍生物。
所述制剂还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的有益效果是：
本发明提供的表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物，可用于自体细胞诱导iPSCs或分化成MSCs这类低免疫源性细胞进行运用，其可在体内持续表达IL-4Rα阻断物，用于治疗过敏、特应性皮炎和/或哮喘及相关疾病。
本发明提供的表达IL-4Rα阻断物的免疫兼容的多能干细胞或其衍生物，由于多能干细胞或其衍生物中的B2M、CIITA基因被敲除，或者其基因组中导入了免疫兼容分子表达序列，因而此类多能干细胞或其衍生物的免疫源性低，将其移植到受体中时，可以克服供体细胞和受体之间的同种异体免疫排斥问题，使得供体细胞能够在受体内长时间持续表达IL-4Rα阻断物。
本发明提供的表达IL-4Rα阻断物的免疫兼容可逆的多能干细胞或其衍生物的基因组中导入诱导型基因表达系统以及免疫兼容分子表达序列。诱导型基因表达系统受外源诱导物的调控，通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间、种类来控制诱导型基因表达系统的开启与关闭，从而控制疫兼容分子表达序列的表达量。而免疫兼容分子可调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。当免疫兼容分子正常表达时，多能干细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达被抑制或过表达，可以消除或降低供体细胞和受体之间的同种异体免疫排斥应答，使得供体细胞能够长时间在受体中持续表达IL-4Rα阻断物。而当供体细胞发生病变时，可通过外源诱导物诱导关闭免疫兼容分子的表达，从而可逆地使供体细胞表面重新表达HLA Ⅰ类分子，恢复供体细胞的抗原提呈能力，使受体能够清除病变的细胞，从而提高了这类通用型多能干细胞或其衍生物的临床安全性，极大地扩展其在临床应用的价值。
此外，还可以通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间，让移植物逐步表达低浓度的HLA分子来刺激受体，使得受体对移植物逐步产生耐受，最终达到稳定的耐受。此时，即使移植物细胞表面表达不匹配的HLA Ⅰ类分子，也能够被受体免疫系统兼容，这样可以使得在诱导关闭移植物细胞中免疫兼容分子的表达后，受体免疫系统一方面能够重新识别移植物中HLA Ⅰ类分子提呈的有基因突变的细胞，清除病变细胞；另一方面，未发生突变的部分由于被上述诱导物训练产生同种异体HLA Ⅰ类分子耐受而不会被受体免疫系统清除。从而使受体免疫系统仅清除有害突变的移植物，保留正常功能的移植物，当有害的移植物清除后，又可以转入移植物细胞表面HLAⅠ类分子沉默的模式。由外源诱导物介导的移植物免疫耐受程序还可以在受体彻底耐受后，植入无诱导或其他方式诱导开启或关闭HLAⅠ类分子表面表达的移植物。
附图说明
图1是AAVS1 KI(Knock-in，下同)Vector(shRNA,组成型)质粒图谱。
图2是AAVS1 KI Vector(shRNA,诱导型)质粒图谱。
图3是AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,组成型)质粒图谱。
图4是AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,诱导型)质粒图谱。
图5是sgRNA clone B2M-1质粒图谱。
图6是sgRNA clone B2M-2质粒图谱。
图7是sgRNA clone CIITA-1质粒图谱。
图8是sgRNA clone CIITA-2质粒图谱。
图9是Cas9(D10A)质粒图谱。
图10是sgRNA Clone AAVS1-1质粒图谱。
图11是sgRNA Clone AAVS1-2质粒图谱。
具体实施方式
以下结合具体的实施例及附图对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
1实验材料与方法
1.1IL-4Rα阻断物
抗IL-4Rα抗体的重链(HC)序列如SEQ ID NO.1所示，轻链(LC)序列如SEQ ID NO.2所示。
1.2多能干细胞或其衍生物
多能干细胞可选自胚胎干细胞(ESCs)、诱导多能干细胞(iPSCs)以及其他形式的多能干细胞，例如hPSCs-MSCs、NSCs、EBs细胞。其中：
ESCs：可选用HN4细胞，购自上海中科院。
iPSCs：使用我们所建立的第三代高效安全的episomal-iPSCs诱导系统(6F/BM1-4C)，pE3.1-OG--KS和pE3.1-L-Myc--hmiR302 cluster经电转进入体细胞中，RM1培养2天，含2uM Parnate的BioCISO-BM1培养2天，含2uM Parnate、0.25mM sodium butyrate、3uMCHIR99021和0.5uM PD03254901的BioCISO-BM1培养2天，在用干细胞培养基BioCISO培养到17天左右即可挑取iPSCs克隆，所挑取的iPSCs克隆经纯化、消化、传代以获得稳定的iPSCs。具体构建方法参见：Stem Cell Res Ther.2017 Nov 2；8(1):245。
hPSCs-MSCs：将iPSCs使用干细胞培养基(BioCISO，含10uM TGFβ抑制剂SB431542)培养25天，期间80-90汇合度进行消化传代(2mg/mL Dispase消化)，1:3传代到Matrigel包被的培养板中，接着ESC-MSC培养基(knockout DMEM培养基，含10％KSR、NEAA、双抗、谷氨酰胺、β-巯基乙醇、10ng/mL bFGF和SB-431542)进行培养，每天换液，80-90汇合度进行传代(1:3传代)，连续培养20天即可。具体构建方法参见：Proc Natl Acad Sci U S A.2015；112(2):530-535。
NSCs：将iPSCs使用诱导培养基(knockout DMEM培养基，含10％KSR，含TGF-β抑制剂，BMP4抑制剂)培养14天，挑取玫瑰花环状的神经细胞到低粘附培养板中进行培养，培养基使用比例为1:1的DMEM/F12(含1％N2，Invitrogen)和Neurobasal培养基(含2％B27，Invitrogen)，还含有20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF，进行培养，消化使用Accutase进行消化传代即可。具体构建方法参见：FASEB J.2014；28(11):4642-4656。
EBs细胞：将汇合度达到95％的iPSCs使用BioC-PDE1消化6min后使用机械刮传法将细胞刮成块状，沉降降细胞团块，沉降的细胞团块转移到低粘附培养板中使用BioCISO-EB1培养7天，隔天换液。7天后转移到Matrigel包被的培养板中继续使用BioCISO进行贴壁培养，7天后即可获得具有内、中、外三胚层结构的拟胚体(EBs)。具体构建方法参见：StemCell Res Ther.2017 Nov 2；8(1):245。
所述多能干细胞衍生物还包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织、器官；所述成体干细胞包括间充质干细胞或者神经干细胞。
1.3基因组安全位点
本发明技术方案中，基因敲入的基因组安全位点可选自AAVS1安全位点、eGSH安全位点，或者其它安全位点：
(1)AAVS1安全位点
AAVS1位点(别名“PPP1R2C位点”)位于人类基因组第19号染色体上，是一个经过验证、能够确保转入DNA片段预期功能的“安全港”位点。该位点是一个开放的染色体结构，能保证转入基因能被正常转录，且该位点插入外源目的片段对细胞无已知的副作用。
(2)eGSH安全位点
eGSH安全位点位于人类基因组第1号染色体上，是一个经过论文验证、能够确保转入DNA片段预期功能的另一个“安全港”位点。
(3)其它安全位点
H11安全位点(也叫Hipp11)，位于人的22号染色体，是Eif4enif1与Drg1这两个基因之间的一个位点，由Simon Hippenmeyer于2010年发现并命名，由于H11位点位于两个基因之间，故外源基因插入后影响內源基因表达的风险很小。H11位点被验证是一个基因间的安全的转录激活区域，是AAVS1、eGSH位点之外的一个新的“安全港”位点。
1.4诱导型基因表达系统
诱导型基因表达系统选自：tet-Off系统或者二聚体关闭表达系统：
(1)tet-Off系统
在没有四环素存在时，tTA蛋白持续作用在tet启动子上，使基因持续表达。在需要转基因保持在一个持续表达状态下，该系统是非常有用。加入四环素时，四环素可使tTA蛋白的结构变化，使其不能与启动子结合，从而使其驱动的基因表达水平下降。为了使该系统保持“关闭”状态，必须连续添加四环素。
本发明将tet-Off系统以及一种或多种免疫兼容分子的序列敲入多能干细胞的基因组安全位点处，通过四环素的添加与否精准开启或关闭免疫兼容分子的表达，从而可逆调控多能干细胞或其衍生物中主要组织相容性复合体相关基因的表达。
(2)二聚体关闭表达系统
二聚体介导的基因表达调控系统：化学调控靶基因转录的方法有很多种，最常见的是利用影响转录因子活性的别构调节物进行调控。其中的一个方法是运用二聚化的诱导剂或者二聚体在无活性的融合蛋白上重组有活性的转录因子。最常用的体系是将天然产物雷帕霉素(rapamydn)或者无生物活性的类似物作为二聚化的药物。雷帕霉素(或类似物)同胞质蛋白FKBP12(FKBP与FK506结合的蛋白)和一种大的丝-苏氨酸蛋白激酶，称为FRAP【FRBP-雷帕霉素相关蛋白，即mTOR(哺乳动物的雷帕霉素靶点)】有高度亲和性，又与这两种蛋白质相结合的功能，因此作为异源性二聚体将这两种蛋白质聚到一起。为调控靶基因转录，将DNA结合区域融合到一个或多个FKBP结构域，将转录抑制域融合到FRAP的93位氨基酸部位，称为FRB，这样足以结合FKBP-雷帕霉素复合物。只有在雷帕霉素存在的情况下，这两种融合蛋白才能发生二聚化。因而抑制具有与DNA结合区域相结合的位点的基因进行转录。
1.5免疫兼容分子
所述免疫兼容分子可以调控多能干细胞或其衍生物中同种异体免疫排斥相关基因的表达。
具体免疫兼容分子的种类及序列如表1所示。
表1免疫兼容分子
以上shRNA或shRNA-miR免疫兼容分子的靶序列如表2所示。
表2 shRNA或shRNA-miR的靶序列
下面表5-表6的免疫兼容分子敲入方案中，各实验组别的shRNA或shRNA-miR序列均为采用表2中的靶序列1构建得到的shRNA或shRNA-miR免疫兼容分子。本领域的技术人员可以理解：以其他靶序列构建得到的shRNA或shRNA-miR免疫兼容分子同样可以实现本发明的技术效果，均落入本发明权利要求的保护范围。
1.6shRNA/miRNA加工复合体基因和抗干扰素效应分子
在细胞核内的初级miRNA(pri-miRNA)经过复合物Drosha-DGCR8进行微处理，将pri-miRNA裂解成前体miRNA(pre-miRNA)，这时会形成发夹结构。接着，经Exportin-5-Ran-GTP复合物将pre-miRNA转运出核。在胞浆中与双链RNA结合蛋白TRBP(TARBP2)结合的RNaseDicer酶将pre-miRNA分解成成熟的长度，miRNA在这时还处于双链状态。最后被转运进AGO2，形成RISC(RNA诱导沉默复合体)。最终miRNA双链的一条链保留在RISC复合物中，另外一条则排出被迅速降解掉。而DGCR8作为Drosha的主要结合蛋白，可以通过其C末端的两个双链RNA结合区域与pri-miRNA结合，招募并指导Drosha在pri-miRNA的正确位置剪切，生产pre-miRNA，pre-miRNA进一步被Dicer和TRBP/PACT加工剪切，形成成熟的miRNA。DGCR8的缺失或异常表达会影响Drosha的剪切活性，进而影响miRNA的活性，导致疾病的发生。TRBP能够招募Dicer复合体miRNA形成RISC Ago2。
本发明利用基因敲入技术，在基因组安全位点敲入可诱导关闭表达的针对HLA I类分子和HLA II类分子等的shRNA-miR表达序列时，优选同时敲入可诱导关闭表达的shRNA和/或miRNA加工机器包括Drosha(Accession number:NM_001100412)、Ago1(Accessionnumber:NM_012199)、Ago2(Accession number:NM_001164623)、Dicer1(Accessionnumber:NM_001195573)、Exportin-5(Accession number:NM_020750)、TRBP(Accessionnumber:NM_134323)、PACT(Accession number:NM_003690)和DGCR8(Accession number:NM_022720)，以便细胞不占用其他miRNA的加工，影响细胞功能。
此外，在IFN诱生的过程中，双链RNA所依赖的蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent Protein Kinase,PKR)，它是整个细胞信号转导通路的关键因子，同时还有2’,5’寡腺苷酸合成酶(2,5-Oligoadenylate Synthetase,2-5As)，这两种酶与dsRNA诱生IFN密切相关。PKR能通过磷酸化真核细胞转录因子，从而抑制蛋白质合成，使细胞停滞于G0/G1和G2/M期，并诱导凋亡，而dsRNA可以促进2-5As合成，结果导致RNase即RNaseL的非特异性活化，降解细胞内所有的mRNA，致细胞死亡。I型干扰素的诱导特异性是通过IRF转录因子家族成员实现的，在细胞缺乏IRF-3和IRF-7的表达下，在很多病毒感染情况下I型干扰素是不能被诱导分泌的。缺乏IFN的应答，要使其恢复，需要上述两种蛋白质的共表达才行。
本发明利用基因敲入技术，在基因组安全位点处敲入免疫兼容分子shRNA-miR表达序列时，优选同时敲入可诱导关闭表达的针对抑制PKR、2-5As、IRF-3和IRF-7基因的shRNA和/或shRNA-miR表达序列，降低dsRNA诱发的干扰素反应，从而避免产生细胞毒性。
shRNA/miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、免疫兼容分子在基因组安全位点的插入位置顺序没有限定，它们之间可以以任何次序排列，而不会相互干扰或者影响基因组其它基因的结构和功能。
具体的抗干扰素效应分子的靶序列如表3所示。
表3抗干扰素效应分子的靶序列
下面表5-表6的抗干扰素效应分子敲入方案中，各实验组别的抗干扰素效应分子的靶序列均为采用表3中的靶序列1构建得到的抗干扰素效应分子。本领域的技术人员可以理解：以其他靶序列构建得到的抗干扰素效应分子同样可以实现本发明的技术效果，均落入本发明权利要求的保护范围。
1.7免疫兼容分子、抗干扰素效应分子的shRNA或shRNA-miR的通用框架
免疫兼容分子、抗干扰素效应分子的shRNA或shRNA-miR的通用框架序列如下所示：
(1)shRNA组成型表达框架为：
GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGCTAGCGCCACC(SEQ ID NO.164)N1...N21TTCAAGAGA(SEQ IDNO.165)N22...N42TTTTTT；
其中：
a、N1...N21为对应基因的shRNA靶序列，N22...N42为对应基因的shRNA靶序列的反向互补序列；
b、如果质粒需要表达多个基因的shRNA，则每个基因分对应一个shRNA表达框架，然后无缝连接起来；
c、带不同抗性基因的组成型shRNA质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样；
d、N表示A、T、G、C碱基；
e、SEQ ID NO.164为U6启动子序列；
f、SEQ ID NO.165为茎环序列。
(2)shRNA诱导型表达框架为：
GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGCTCGGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTGCTAGCGCCACC(SEQ ID NO.166)N1...N21TTCAAGAGA(SEQ ID NO.165)N22...N42TTTTTT；
其中：
a、N1...N21为对应基因的shRNA靶序列，N22...N42为对应基因的shRNA靶序列的反向互补序列；
b、如果质粒需要表达多个基因的shRNA，则每个基因分对应一个shRNA表达框架，然后无缝连接起来；
c、带不同抗性基因的组成型shRNA质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样；
d、N表示A、T、G、C碱基；
e、SEQ ID NO.166为H1 TO启动子序列；
f、SEQ ID NO.165为茎环序列。
(3)shRNA-miR组成型或诱导型表达框架为：
以shRNA-miR靶序列替换microRNA-30中的靶序列得到，具体序列如下：
GAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTAAAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG(SEQ ID NO.167)M1N1...N21TAGTGAAGCCACAGATGTA(SEQ ID NO.168)
N22...N42M2TGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAAT(SEQ ID NO.169)；
其中：
a、N1...N21为对应基因的shRNA-miR靶序列，N22...N42为对应基因的shRNA-miR靶序列的反向互补序列；
b、如果质粒需要表达多个基因的shRNA-miR，则每个基因分对应一个shRNA-miR表达框架，然后无缝连接起来；
c、带不同抗性基因的组成型shRNA-miR质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样；
d、M碱基表示A或C碱基，N表示A、T、G、C碱基；
e、如果N1为G碱基，则M1为A碱基；否则M1为C碱基；
f、M1碱基与M2碱基互补。
1.8基因编辑系统、基因编辑方法及检验方法
1.8.1基因编辑系统
本专利的基因编辑技术采用CRISPR-Cas9基因编辑系统。使用的Cas 9蛋白为Cas9(D10A)，Cas 9(D10A)与sgRNA结合，sgRNA负责特异识别靶序列(基因组DNA)，然后Cas9(D10A)对该靶序列进行单链切割。基因组DNA发生双链断裂(DNA Double Strand Break,DSB)，必须有两组Cas 9(D10A)/sgRNA分别对基因组DNA的两条链进行切割，且切割的距离不能太远。Cas 9(D10A)/sgRNA方案与Cas 9/sgRNA方案相比，优点是特异性更高，脱靶的概率更低。本基因编辑系统使用的质粒或Donor片段分别为：Cas9(D10A)质粒、sgRNA clone质粒、Donor片段。
(1)Cas9(D10A)质粒：表达Cas 9(D10A)蛋白的质粒，在sgRNA的引导下特异性单链切割基因组DNA。
(2)sgRNA质粒：表达sgRNA的质粒，sgRNA(small guide RNA)是向导RNA(guideRNA，gRNA)，在基因编辑负责引导表达Cas 9(D10A)蛋白的靶向切割。
(3)Donor片段：两头含有重组臂，分别位于基因组DNA断裂位置的左右两边，中间含有需要插入的基因、片段或者表达元件。在Donor片段存在的情况下，细胞在基因组断裂的位置发生同源重组(Homologous recombination，HR)反应。如果不添加Donor片段，细胞的基因组断裂位置发生非同源末端连接(Non-homologous End Joining-NHEJ)反应。该片段由KI(Knock-in，下同)Vector质粒酶切后回收获取。
1.8.2组成型质粒和诱导型质粒
组成型质粒：从组成型质粒获取的Donor片段，敲入基因组DNA后，该片段的表达功能不可以进行调控。
诱导型质粒：从诱导型质粒获取的Donor片段，敲入基因组DNA后，该片段的表达功能可以通过添加诱导物的方法来调控，相当于对表达功能添加了一个开启或者关闭的开关。
1.8.3质粒构建方法
(1)Cas9(D10A)质粒：该质粒不再需要构建，直接从Addgene(Plasmid 41816,Addgene)订购。
(2)sgRNA质粒：原始的空白质粒从Addgene(Plasmid 41824,Addgene)订购，然后在网站(URL:https://cctop.cos.uni-heidelberg.de)输入DNA序列设计靶序列，最后把不同的靶序列分别放入空白的sgRNA质粒完成构建。
(3)KI Vector质粒：
a.Amp(R)-pUC origin片段的获取：设计PCR引物，以pUC18质粒为模板使用高保真酶(南京诺唯赞生物,P505-d1)通过PCR的方法，把该片段扩增出来并回收；
b.AAVS1或者eGSH重组臂的获取：提取人细胞的基因组DNA并设计对应的引物，然后以人的基因组DNA为模板使用高保真酶(南京诺唯赞生物,P505-d1)通过PCR的方法，把这类片段扩增出来并回收；
c.各个质粒元件的获取：设计各元件的PCR扩增引物，然后以含该元件的质粒为模板使用高保真酶(南京诺唯赞生物,P505-d1)通过PCR的方法，分别把各个质粒元件扩增出来并回收；
d.组装成完整质粒：使用多片段重组酶(南京诺唯赞生物，C113-02)把前面步骤获取的片段连接起来，形成一个完整的质粒。
1.8.4基因编辑过程
一、AAVS1基因敲入的单细胞克隆操作步骤
(1)电转程序：
供体细胞准备：人多能干细胞。
试剂盒：Human Stem Cell
Kit 1。
仪器：电转仪。
培养基：BioCISO。
诱导质粒：Cas9D10A、sgRNA clone AAVS1-1、sgRNA clone AAVS1-2、AAVS1 neoVectoⅠ、AAVS1 neo VectorⅡ。
注：eGSH基因敲入使用的诱导质粒：Cas9D10A、sgRNA clone eGSH-1、sgRNA cloneeGSH-2、eGSH-neo/eGSH-puro(donor)这里的donor质粒与AAVS1的比较，只有左右重组臂不一样，其它元件都一样。由于eGSH的基因编辑过程与AAVS1的相同，后面就不再重复列举。
(2)电转后的人多能干细胞进行含G418和puro的双抗生素培养基进行筛选。
(3)进行单细胞克隆筛选及培养，获得单细胞克隆株。
二、AAVS1基因敲入的单细胞克隆株培养试剂
(1)培养基：BioCISO+300μg/mL G418+0.5μg/mL puro(应提前置于室温，避光条件放置30～60分钟，直至恢复到室温。注意：不应将BioCISO置于37℃进行预热，避免生物分子活性降低。)。
(2)基质胶：hESC级Matrigel(传代或复苏细胞前，将Matrigel工作液加入细胞培养瓶皿中并摇匀，确保Matrigel完全没过培养瓶皿底部，且在使用前任意一处Matrigel都不能干掉。为保证细胞能够更好的贴壁和存活，Matrigel放入37℃培养箱包被时间：1:100XMatrigel不能低于0.5小时；1:200X Matrigel不能低于2小时。)。
(3)消化液：使用DPBS溶解EDTA至终浓度为0.5mM，pH7.4(注意：EDTA不能使用水稀释，否则细胞会因渗透压降低而死亡。)。
(4)冻存液：60％BioCISO+30％ESCs级FBS+10％DMSO(冻存液最好现配现用。)。
三、常规维持传代培养过程
(1)传代的最佳时刻以及传代比例
a.传代最佳时刻：细胞整体汇合度达80％～90％；
b.传代最佳比例：1:4～1:7传代，次日最佳汇合度应维持在20％～30％。
(2)传代过程
a.事先将包被好的细胞培养瓶皿中的Matrigel吸走弃掉，加入适量培养基(BioCISO+300μg/mL G418+0.5μg/mL puro)，并放入37℃、5％CO2培养箱中孵育；
b.待细胞符合传代的要求，吸掉培养基上清，加入适量的0.5mM EDTA消化液到细胞瓶皿中；
c.将细胞放入37℃、5％CO2培养箱中孵育5～10分钟(消化至镜下观察到大部分细胞收缩变圆但还未漂浮即可，轻柔吹打细胞使其从壁上脱离，将细胞悬液吸到离心管内，200g离心5分钟；
d.离心后，弃上清，用培养基重悬细胞，轻柔反复吹打细胞数次至混匀，然后将细胞转移至事先准备好包被Matrigel的瓶皿中；
e.细胞转移至细胞瓶皿后，前后左右水平摇匀，镜下观察无异常后，摇匀置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养；
f.次日观察细胞贴壁存活状态，吸掉培养基每天正常按时换液。
四、细胞冻存
(1)按照常规传代的操作步骤，使用0.5mM EDTA消化细胞至大部分细胞收缩变圆但尚未漂浮，轻柔吹打细胞，收集细胞悬液，200g离心5分钟，弃上清，加入适量冻存液重悬细胞，将细胞转移至冻存管(建议六孔板汇合度80％冻存一支，冻存液体积为0.5mL/支)；
(2)将冻存管置于程序降温盒中，立即放入-80℃过夜(需保证冻存管每分钟温度下降1℃)；
(3)次日立即将细胞转移入液氮。
五、细胞复苏
(1)提前准备好Matrigel包被的细胞瓶皿，复苏细胞前，吸掉Matrigel，向细胞瓶皿中加入适量的BioCISO，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育；
(2)将冻存管从液氮中快速取出，立即放入37℃水浴锅中快速摇晃，使细胞快速融解，仔细观察待冰晶完全消失停止摇晃，将细胞转移至生物安全柜；
(3)提前加入10mL DMEM/F12(1:1)基础培养基至15mL离心管，并平衡至室温，使用巴氏吸管吸取1mL DMEM/F12(1:1)缓慢加入冻存管中，轻柔混匀，将细胞悬液转移到准备好的含有DMEM/F12(1:1)的15mL离心管中，200g离心5分钟；
(4)小心弃掉上清，加入适量BioCISO，轻轻混匀细胞，种到提前准备好的细胞瓶皿中，水平前后左右摇匀后，镜下观察无异常后，摇匀置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
(5)次日观察细胞贴壁存活状态，每天正常按时换液。若贴壁良好，则BioCISO更换为BioCISO+300μg/mL G418+0.5μg/mL puro。
1.8.5AAVS1基因敲入检测方法
一、单细胞克隆AAVS1基因敲入检测
(1)AAVS1基因敲入检测说明
a.试验目的：PCR检测经过基因敲入处理的细胞，测试该细胞是否为纯合子；由于两个Donor片段只有抗性基因的序列具有差异性，因此要判断该细胞是否为纯合子(两条染色体分别敲入不同抗性基因的Donor片段)，就需要检测该细胞的基因组是否含有两种抗性基因的Donor片段，只有双敲入的细胞才有可能是正确的纯合子；
b.试验方法:首先在Donor质粒内部(非重组臂部分)设计一条引物，然后在基因组PPP1R12C(非重组臂部分)设计另一条引物；如果Donor片段在基因组能够正确插入，就会有目的条带出现，否则无目的条带出现)；
c.试验方案引物序列及PCR方案如表4所示。
表4试验方案引物序列及PCR方案
二、eGSH基因敲入的检测方法跟AAVS1基因敲入检测原理和方法一样，这里不再描述。
1.8.6在基因组安全位点敲入基因方法的检验方法
(1)试验目的：PCR检测经过基因敲入处理的细胞，测试该细胞是否为纯合子。由于两个Donor片段只有抗性基因的序列具有差异性，因此要判断该细胞是否为纯合子(两条染色体分别敲入不同抗性基因的Donor片段)，就需要检测该细胞的基因组是否含有两种抗性基因的Donor片段，只有双敲入的细胞才有可能是正确的纯合子。
(2)试验方法：首先在Donor质粒内部(非重组臂部分)设计一条引物，然后在基因组(非重组臂部分)设计另一条引物。如果Donor片段在基因组能够正确插入，就会有目的条带出现，否则无目的条带出现。
1.9多能干细胞或其衍生物表达IL-4Rα阻断物的测定方法
使用ELISA(竞争法)对多能干细胞或其衍生物表达的抗IL-4Rα抗体进行检测。收集表达抗IL-4Rα抗体的多能干细胞或其衍生物培养上清，加样品稀释液稀释5倍，并与酶标的抗IL-4Rα抗体混合(1:1)，再在已经包被IL-4Rα抗原的酶标板上进行上样，对照组则加不表达抗IL-4Rα抗体的多能干细胞或其衍生物培养上清，轻轻混匀。封板后置于37℃温育30min，洗涤5次后加入显色液显色15min，加入终止液50uL读数测量450nm吸光度值(抗IL-4Rα抗体的表达量与颜色深浅成负相关)。
1.10小鼠过敏性哮喘模型的治疗方法
在人源化NSG小鼠(The Jackson Laboratory(JAX))中，注射同一供体的人免疫细胞来重建小鼠的免疫系统，2周后建立由氢氧化铝凝胶佐剂和鸡卵白蛋白诱导的小鼠过敏性哮喘模型。待小鼠的IgE明显增加后再进行治疗测试，进行尾静脉注射200uLPBS(含人免疫细胞和1×106的表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物)进行过敏性哮喘治疗，其中只注射含人免疫细胞的组作为对照组。Th2细胞因子水平增高是哮喘的重要特征之一，因此我们可以通过检测Th2细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)水平来判断哮喘的治疗效果。
1.11小鼠特应性皮炎模型的治疗方法
在人源化NSG小鼠(The Jackson Laboratory(JAX))中，注射同一供体的人免疫细胞来重建小鼠的免疫系统，2周后建立由2,4-二硝基氟苯(DNFB)对小鼠进行皮肤致敏产生的特应性皮炎模型小鼠。待小鼠的IgE明显增加后再进行治疗测试，进行尾静脉注射200uLPBS(含人免疫细胞和1×106的表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞衍生物)进行特应性皮炎治疗。
2.实验方案
将表达IL-4Rα阻断物的基因、一个或多个免疫兼容分子、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子敲入到多能干细胞基因组安全位点的实验方案如表5-表6所示，其中，“+”号表示基因或核酸序列的敲入，“-”号表示基因敲除。
表5组成型表达实验方案
选取的质粒以及具体的敲入位置情况如下：
总体原则：
抗IL-4Rα抗体为分泌型抗体，其结构为：IL-2sig信号肽(SEQ ID NO.183)+轻链(轻链的序列的末端添加终止密码子TGA)+EMCV IRESwt(SEQ ID NO.178)+IL-2sig信号肽+重链(重链的序列的末端添加终止密码子TGA)。
抗IL-4Rα抗体序列放入对应质粒的MCS2的位置(抗体的LC轻链、HC重链的前面均添加IL-2sig信号肽，抗体的LC轻链和HC重链序列中间使用EMCV IRESwt连接起来，排序顺序如下：LC轻链，EMCV IRESwt，HC重链)，shRNA放入对应质粒的shRNA表达框架内，shRNA-miR放入对应质粒的shRNA-miR表达框架内，其它基因放入对应质粒的MCS1的位置。各质粒的图谱如图1-图11所示。
注：sgRNA clone B2M质粒包含sgRNA clone B2M-1和sgRNA clone B2M-2质粒。sgRNA clone CIITA质粒包含sgRNA clone CIITA-1和sgRNA clone CIITA-2质粒。
(1)A1分组
AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒的MCS2放入IL-4Rα抗体序列。
(2)A2分组
AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒的MCS2放入IL-4Rα抗体序列。shRNA表达框架放入shRNA靶序列(若存在多个shRNA则无缝连接起来)。MCS1放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。
(3)A3分组
AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,组成型)质粒的MCS2放入IL-4Rα抗体序列。shRNA-miR表达框架放入shRNA-miR靶序列(若存在多个shRNA-miR则无缝连接起来)。MCS1放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。
(4)A4分组
AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒的MCS2放入IL-4Rα抗体序列，sgRNA cloneB2M质粒的靶序列放入B2M的sgRNA靶序列(SEQ ID NO.179和SEQ ID NO.180)，sgRNA cloneCIITA质粒的靶序列放入CIITA的sgRNA靶序列(SEQ ID NO.181和SEQ ID NO.182)。MCS1放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。
(5)A5分组
同A2分组的方法。
(6)A6分组
同A3分组的方法。
表6诱导型表达(免疫兼容可逆)实验方案
(1)B1分组：
AAVS1 KI Vector(shRNA,诱导型)质粒的MCS2放入IL-4Rα抗体序列。shRNA表达框架放入shRNA靶序列(若存在多个shRNA则无缝连接起来)。MCS1放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。
(2)B2分组：
AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,诱导型)质粒的MCS2放入IL-4Rα抗体序列。shRNA-miR表达框架放入shRNA-miR靶序列(若存在多个shRNA-miR则无缝连接起来)。MCS1放入基因序列(若存在多个基因则使用EMCV IRESwt连接起来)。
(3)B3分组：
同B1分组的方法。
(4)B4分组：
同B2分组的方法。
3.实验结果
3.1多能干细胞或其衍生物表达的IL-4Rα阻断物的阻断效果检测
将表5和表6各实验组方案敲入iPSCs、MSCs、EBs、NSCs的基因组安全位点AAVS1，37℃，0.5％CO2培养箱培养，收集培养基上清，加样品稀释液稀释5倍，并与酶标的抗IL-4Rα抗体混合(1:1)(对照组则加不表达抗IL-4Rα抗体的多能干细胞或其衍生物培养上清，轻轻混匀)，再在已经包被IL-4Rα抗原的酶标板上进行上样。封板后置于37℃温育30min，洗涤5次后加入显色液显色15min，加入终止液50uL,读数测量450nm吸光度值。各实验组的检测结果如表7所示。
表7各实验组表达的IL-4Rα抗体对IL-4Rα的阻断效果
从上表可以看出，本发明的多能干细胞或其衍生物所表达的抗IL-4Rα抗体能够有效阻断酶标的抗IL-4Rα抗体与细胞表面IL-4Rα的结合。而且其表达量在各组中表达相对恒定，所以多能干细胞或其衍生物所表达的IL-4Rα抗体不受细胞分化形态及其他外源基因(免疫兼容改造)所影响。
3.2表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物在治疗过敏性哮喘中的效果
我们选择表达阻断物方案组(A1)的细胞(iPSCs、MSCs、EBs、NSCs)中进行测试。在人源化NSG小鼠过敏性哮喘模型中，我们对其进行注射能够表达IL-4Rα抗体的hPSCs及hPSCs源衍生物(iPSCs、hPSCs-MSCs、hPSCs-NSCs、hPSCs-EBs)，通过检测支气管肺泡灌洗液中细胞因子水平(pg/ml)来观察其治疗过敏性哮喘的效果。注:为避免免疫兼容问题，我们所使用的免疫细胞与hPSCs及hPSCs源衍生物均来源于同一人的。实验结果如8所示。
表8表达IL-4Rα抗体的多能干细胞或其衍生物的过敏性哮喘治疗效果
注：对照组是指未注射表达IL-4Rα抗体的hPSCs或hPSCs源衍生物的NSG小鼠过敏性哮喘模型。
通过以上实验，可以证明本发明制备的表达IL-4Rα阻断物的干细胞或其衍生物在治疗过敏性哮喘模型的小鼠中，Th2细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)水平有所下降。因此注射表达IL-4Rα阻断物的hPSCs或hPSCs源衍生物能够起到治疗过敏性哮喘的作用。
3.3表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物在治疗特应性皮炎中的效果
我们选择表达阻断物方案组(A1)的细胞(iPSCs、MSCs、EBs、NSCs)中进行测试。在人源化NSG小鼠特应性皮炎模型中，我们对其进行注射能够表达IL-4Rα抗体的hPSCs及hPSCs源衍生物(iPSCs、hPSCs-MSCs、hPSCs-NSCs、hPSCs-EBs)，通过血液中IgE水平进行检测来观察其治疗特应性皮炎的效果。注:为避免免疫兼容问题，我们所使用的免疫细胞与hPSCs及hPSCs源衍生物均来源于同一人的。实验结果如9所示。
表9表达IL-4Rα抗体的多能干细胞或其衍生物的特应性皮炎治疗效果
注：对照组是指未注射表达IL-4Rα抗体的hPSCs或hPSCs源衍生物的NSG小鼠特应性皮炎模型。
通过以上实验，可以证明本发明制备的表达IL-4Rα阻断物的干细胞或其衍生物在治疗特应性皮炎模型的小鼠中，血液中IgE水平有所下降。因此注射表达IL-4Rα阻断物的hPSCs或hPSCs源衍生物能够起到治疗特应性皮炎的作用。
3.4免疫兼容分子诱导型表达组的可逆性表达测试
通过上述实施例，表达IL-4Rα阻断物的hPSCs或hPSCs源衍生物能有效阻断IL-4Rα而起到治疗过敏性哮喘的作用。我们还必须考虑hPSCs或hPSCs源衍生物的免疫兼容问题。因此我们选取一个合适的组合对免疫兼容进行测试。
我们利用MSCs的低免疫源性的特点，在人源化NSG小鼠疾病(过敏性哮喘)模型中，对其进行注射能够表达IL-4Rα阻断物(抗IL-4Rα抗体)的hPSCs源免疫兼容MSCs，通过检测支气管肺泡灌洗液中细胞因子水平(IL-13，pg/mL)来观察其治疗过敏性哮喘的效果。注:所使用的免疫细胞与hPSCs源MSCs来源于为非同一人。
对照组是指未注射MSCs细胞的NSG小鼠疾病(过敏性哮喘)模型。
加Dox组别的处理是：在小鼠饮食中添加0.5mg/mL的Dox，进行饲养小鼠，从注射表达阻断物细胞开始，一直使用，直到试验结束。结果如表10所示。
表10免疫兼容分子诱导型表达组的可逆性表达测试结果
以上实验表明：在进行治疗过敏性哮喘中，仅表达阻断物的MSCs(组2)，其具有低免疫源性，可以在异体内存在一定时间，所以其能够发挥一定的治疗效果，而进行免疫兼容改造的(组3-11，包括组成型和可逆诱导型免疫兼容)，其免疫兼容效果更佳，比没有经免疫兼容改造的MSCs在体内存在时间更长(或能做到长期共存)，其发挥治疗效果更佳，而组5为B2M和CIITA基因敲除组，其完全消除HLA-I和HLA-II类分子产生的影响，因此其治疗效果最佳。但由于其组成型免疫兼容改造(基因敲入/敲除)，无法在移植物产生变异或不需要时进行清除，从而有组8-15方案设定。组12-15中在进行注射表达阻断物细胞进入小鼠的同时，对小鼠使用Dox诱导剂(一直使用)，注射表达阻断物细胞的小鼠的免疫兼容效果将被消除，其在体内存在时间与未经免疫兼容改造的MSCs相当，其疗效果也与未经免疫兼容改造的MSCs相当。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 未来智人再生医学研究院（广州）有限公司；王淋立
<120> 一种表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用
<130>
<160> 183
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1353
<212> DNA
<213> human
<400> 1
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggagcagc ccggcggcag cctgaggctg 60
agctgcgccg gcagcggctt caccttcagg gactacgcca tgacctgggt gaggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcagc atcagcggca gcggcggcaa cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggacagg 300
ctgagcatca ccatcaggcc caggtactac ggcctggacg tgtggggcca gggcaccacc 360
gtgaccgtga gcagcgccag caccaagggc cccagcgtgt tccccctggc cccctgcagc 420
aggagcacca gcgagagcac cgccgccctg ggctgcctgg tgaaggacta cttccccgag 480
cccgtgaccg tgagctggaa cagcggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttccccgcc 540
gtgctgcaga gcagcggcct gtacagcctg agcagcgtgg tgaccgtgcc cagcagcagc 600
ctgggcacca agacctacac ctgcaacgtg gaccacaagc ccagcaacac caaggtggac 660
aagagggtgg agagcaagta cggccccccc tgccccccct gccccgcccc cgagttcctg 720
ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagcagg 780
acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccagg aggaccccga ggtgcagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagcccag ggaggagcag 900
ttcaacagca cctacagggt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aagggcctgc ccagcagcat cgagaagacc 1020
atcagcaagg ccaagggcca gcccagggag ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccag 1080
gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 1200
cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagca ggctgaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagg agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1320
tacacccaga agagcctgag cctgagcctg ggc 1353
<210> 2
<211> 657
<212> DNA
<213> human
<400> 2
gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga cccccggcga gcccgccagc 60
atcagctgca ggagcagcca gagcctgctg tacagcatcg gctacaacta cctggactgg 120
tacctgcaga agagcggcca gagcccccag ctgctgatct acctgggcag caacagggcc 180
agcggcgtgc ccgacaggtt cagcggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agcagggtgg aggccgagga cgtgggcttc tactactgca tgcaggccct gcagaccccc 300
tacaccttcg gccagggcac caagctggag atcaagagga ccgtggccgc ccccagcgtg 360
ttcatcttcc cccccagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 420
ctgaacaact tctaccccag ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480
agcggcaaca gccaggagag cgtgaccgag caggacagca aggacagcac ctacagcctg 540
agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgag 600
gtgacccacc agggcctgag cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgc 657
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 3
gggagcagag aattctctta t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 4
ggagcagaga attctcttat c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 5
gagcagagaa ttctcttatc c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 6
gctacctgga gcttcttaac a 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 7
ggagcttctt aacagcgatg c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 8
gggtctccag tatattcatc t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 9
gcctcctgat gcacatgtac t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 10
ggaagacctg ggaaagcttg t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 11
ggctaagctt gtacaataac t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 12
gcggaatgaa ccacatcttg c 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 13
ggccttctct gaaggacatt g 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 14
ggactcaatg cactgacatt g 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 15
ggtacccact gctctggtta t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 16
gctcccactc catgaggtat t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 17
ggtatttctt cacatccgtg t 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 18
aggagacacg gaatgtgaag g 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 19
gctcccactc catgaggtat t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 20
ggtatttcta cacctccgtg t 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 21
ggaccggaac acacagatct a 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 22
accggaacac acagatctac a 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 23
ggaacacaca gatctacaag g 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 24
gaacacacag atctacaagg c 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 25
ttcttacttc cctaatgaag t 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 26
aagttaagaa cctgaatata a 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 27
aacctgaata taaatttgtg t 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 28
acctgaatat aaatttgtgt t 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 29
aagcgttgat ggattaatta a 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 30
agcgttgatg gattaattaa a 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 31
gggtctggtg ggcatcatta t 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 32
ggtctggtgg gcatcattat t 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 33
gcatcattat tgggaccatc t 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 34
gcacatggag gtgatggtgt t 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 35
ggaggtgatg gtgtttctta g 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 36
gagaagatca ctgaagaaac t 21
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 37
gctttaatgg ctttacaaag c 21
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 38
ggctttacaa agctggcaat a 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 39
gctttacaaa gctggcaata t 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 40
gctccgtact ctaacatcta g 21
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 41
gatgaccaca ttcaaggaag a 21
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 42
gaccacattc aaggaagaac t 21
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 43
gctttcctgc ttggcagtta t 21
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 44
ggcagttatt cttccacaag a 21
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 45
gcagttattc ttccacaaga g 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 46
gcgtaagtct gagtgtcatt t 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 47
gacaatttaa ggaagaatct t 21
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 48
ggccatagtt ctccctgatt g 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 49
gccatagttc tccctgattg a 21
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 50
gcagatgacc acattcaagg a 21
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 51
gatgaccaca ttcaaggaag a 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 52
gaccacattc aaggaagaac c 21
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 53
gctttgtcag gaccaggttg t 21
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 54
gaccaggttg ttactggttc a 21
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 55
gaagcctcac agctttgatg g 21
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 56
gatggcagtg cctcatcttc a 21
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 57
ggcagtgcct catcttcaac t 21
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 58
gcagcaggat aagtatgagt g 21
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 59
gcaggataag tatgagtgtc a 21
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 60
ggttcctgca cagagacatc t 21
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 61
gcacagagac atctataacc a 21
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 62
gagacatcta taaccaagag g 21
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 63
gagtactgga acagccagaa g 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 64
gctttcctgc ttggctctta t 21
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 65
ggctcttatt cttccacaag a 21
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 66
gctcttattc ttccacaaga g 21
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 67
ggatgtggaa cccacagata c 21
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 68
gatgtggaac ccacagatac a 21
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 69
gtggaaccca cagatacaga g 21
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 70
ggaacccaca gatacagaga g 21
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 71
gagccaactg tattgcctat t 21
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 72
agccaactgt attgcctatt t 21
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 73
gccaactgta ttgcctattt g 21
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 74
gggtagcaac tgtcaccttg a 21
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 75
ggatttcgtg ttccagttta a 21
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 76
gcatgtgcta cttcaccaac g 21
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 77
gcgtcttgtg accagataca t 21
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 78
gcttatgcct gcccagaatt c 21
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 79
gcaggaaatc actgcagaat g 21
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 80
gctcagtgca ttggccttag a 21
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 81
ggtgagtgct gtgtaaataa g 21
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 82
gacatatata gtgatccttg g 21
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 83
ggaaagtcac atcgatcaag a 21
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 84
gctcacagtc atcaattata g 21
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 85
gccctgaaga cagaatgttc c 21
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 86
gcggaccatg tgtcaactta t 21
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 87
ggaccatgtg tcaacttatg c 21
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 88
gcgtttgtac agacgcatag a 21
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 89
ggctggctaa cattgctata t 21
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 90
gctggctaac attgctatat t 21
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 91
ggaccaggtc acatgtgaat a 21
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 92
ggaaaggtct gaggatattg a 21
<210> 93
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 93
ggcagattag gattccattc a 21
<210> 94
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 94
gcctgatagg acccatattc c 21
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 95
gcatccaata gacgtcattt g 21
<210> 96
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 96
gcgtcactgg cacagatata a 21
<210> 97
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 97
gctgtcacat aataagctaa g 21
<210> 98
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 98
gctaaggaag acagtatata g 21
<210> 99
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 99
gggatttcta aggaaggatg c 21
<210> 100
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 100
ggagttgaag agcagagatt c 21
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 101
gccagtgaac acttaccata g 21
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 102
gcttctctga agtctcattg a 21
<210> 103
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 103
ggctgcaact aacttcaaat a 21
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 104
ggatggattt gattatgatc c 21
<210> 105
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 105
ggaccttgga acaatggatt g 21
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 106
gctaattctt gctgaacttc t 21
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 107
gctgaacttc ttcatgtatg t 21
<210> 108
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 108
gcctcatctc tttgttctaa a 21
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 109
gctctggaga agatatattt g 21
<210> 110
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 110
gctcttgagg gaactaatag a 21
<210> 111
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 111
gggacggcat taatgtattc a 21
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 112
ggacaaacat gcaaactata g 21
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 113
gcagcaacca gctaccattc t 21
<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 114
gcagttctgt tgccactctc t 21
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 115
gggagagttc atccaggaaa t 21
<210> 116
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 116
ggagagttca tccaggaaat t 21
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 117
gagagttcat ccaggaaatt a 21
<210> 118
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 118
gcctgtcaaa gagagagagc a 21
<210> 119
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 119
gctcagcttc gtactgagtt c 21
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 120
gcttcacaga actacagaga g 21
<210> 121
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 121
gcatctactg gacaaagtat t 21
<210> 122
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 122
ggctgaatta cccatgcttt a 21
<210> 123
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 123
gctgaattac ccatgcttta a 21
<210> 124
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 124
gggttggttt atccaggaat a 21
<210> 125
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 125
ggatcagaag agaagccaac g 21
<210> 126
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 126
ggttcaccat ccaggtgttc a 21
<210> 127
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 127
gctctcttct ctggaactaa c 21
<210> 128
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 128
gctagagtga ctccatctta a 21
<210> 129
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 129
gctgaccacc aattataatt g 21
<210> 130
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 130
gcagaatatt taaggccata c 21
<210> 131
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 131
gcccacttaa aggcagcatt a 21
<210> 132
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 132
ggtcatcaat accactgtta a 21
<210> 133
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 133
gcattcctcc ttctcctttc t 21
<210> 134
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 134
ggaggaactt tgtgaacatt c 21
<210> 135
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 135
gctgtaagaa ggatgctttc a 21
<210> 136
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 136
gctgcaggca ggattgtttc a 21
<210> 137
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 137
gcagttcgag gtcaagtttg a 21
<210> 138
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 138
gccaattagc tgagaagaat t 21
<210> 139
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 139
gcaggtttac agtgtatatg t 21
<210> 140
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 140
gcctacagag actagagtag g 21
<210> 141
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 141
gcagttgggt accttccatt c 21
<210> 142
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 142
gcaactcagg tgcatgatac a 21
<210> 143
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 143
gcatggcgct ggtacgtaaa t 21
<210> 144
<211> 19
<212> DNA
<213> human
<400> 144
gcctcgagtt tgagagcta 19
<210> 145
<211> 19
<212> DNA
<213> human
<400> 145
agacattctg gatgagtta 19
<210> 146
<211> 19
<212> DNA
<213> human
<400> 146
gggtctgtta cccaaagaa 19
<210> 147
<211> 19
<212> DNA
<213> human
<400> 147
ggtctgttac ccaaagaat 19
<210> 148
<211> 19
<212> DNA
<213> human
<400> 148
ggaaggaagc ggacgctca 19
<210> 149
<211> 19
<212> DNA
<213> human
<400> 149
ggaggcagta cttctgata 19
<210> 150
<211> 19
<212> DNA
<213> human
<400> 150
cgctctagag ctcagctga 19
<210> 151
<211> 19
<212> DNA
<213> human
<400> 151
ccaccacctc aaccaataa 19
<210> 152
<211> 19
<212> DNA
<213> human
<400> 152
atttcaagaa gtcgatcaa 19
<210> 153
<211> 19
<212> DNA
<213> human
<400> 153
gaagatctga ttaccttca 19
<210> 154
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 154
ggacactggt tcaacacctg t 21
<210> 155
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 155
ggttcaacac ctgtgacttc a 21
<210> 156
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 156
acctgtgact tcatgtgtgc g 21
<210> 157
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 157
gctggacgtg accatcatgt a 21
<210> 158
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 158
ggacgtgacc atcatgtaca a 21
<210> 159
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 159
gacgtgacca tcatgtacaa g 21
<210> 160
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 160
acgtgaccat catgtacaag g 21
<210> 161
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 161
acgctatacc atctacctgg g 21
<210> 162
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 162
gcctctatga cgacatcgag t 21
<210> 163
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 163
gacatcgagt gcttccttat g 21
<210> 164
<211> 253
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 164
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgctagcgcc acc 253
<210> 165
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 165
ttcaagaga 9
<210> 166
<211> 686
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 166
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
ctttaccact ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca 300
gtgatagaga aaagtgaaag tcgagtttac cactccctat cagtgataga gaaaagtgaa 360
agtcgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc 420
ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact ccctatcagt gatagagaaa 480
agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga aaagtgaaag tcgagctcgg 540
tacccgggtc gaggtaggcg tgtacggtgg gaggcctata taagcagagc tcgtttagtg 600
aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccgg 660
gaccgatcca gcctgctagc gccacc 686
<210> 167
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 167
gaggcttcag tactttacag aatcgttgcc tgcacatctt ggaaacactt gctgggatta 60
cttcttcagg ttaacccaac agaaggctaa agaaggtata ttgctgttga cagtgagcg 119
<210> 168
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 168
tagtgaagcc acagatgta 19
<210> 169
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 169
tgcctactgc ctcggacttc aaggggctac tttaggagca attatcttgt ttactaaaac 60
tgaatacctt gctatctctt tgatacattt ttacaaagct gaattaaaat ggtataaat 119
<210> 170
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 170
ccatagctca gtctggtcta tc 22
<210> 171
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 171
tcaggatgat ctggacgaag ag 22
<210> 172
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 172
ccggtcctgg actttgtctc 20
<210> 173
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 173
ctcgacatcg gcaaggtgtg 20
<210> 174
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 174
cgcattggag tcgctttaac 20
<210> 175
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 175
cgagctgcaa gaactcttcc tcac 24
<210> 176
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 176
cacggcactt acctgtgttc tgg 23
<210> 177
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 177
cagtacaggc atccctgtga aag 23
<210> 178
<211> 590
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 178
cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60
tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120
gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180
aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240
aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300
ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360
cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420
ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 480
cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540
ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc cacaaccatg 590
<210> 179
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 179
cgcgagcaca gctaaggcca cgg 23
<210> 180
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 180
actctctctt tctggcctgg agg 23
<210> 181
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 181
acccagcagg gcgtggagcc agg 23
<210> 182
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 182
gtcagagccc caaggtaaaa agg 23
<210> 183
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 183
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60
Claims (20)
1.一种表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有IL-4Rα阻断物的表达序列，所述IL-4Rα阻断物为抗IL-4Rα抗体。
2.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的B2M和/或CIITA基因被敲除。
3.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组还导入一种或多种免疫兼容分子表达序列，所述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。
4.根据权利要求3所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述与免疫应答相关的基因包括：
(1)主要组织相容性复合体基因，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；
(2)主要组织相容性复合体相关基因，包括B2M和CIITA中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述免疫兼容分子包括以下的任一种或多种：
(1)免疫耐受相关基因，包括CD47或HLA-G；
(2)HLA-C类分子，包括人群中比例合计超过90％的HLA-C复等位基因，或者超过90％的HLA-C复等位基因与B2M构成的融合蛋白基因；
(3)主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；
(4)主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体相关基因包括B2M和CIITA中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：
所述B2M的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.5中的至少一种；
所述CIITA的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.15中的至少一种；
所述HLA-A的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.18中的至少一种；
所述HLA-B的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.24中的至少一种；
所述HLA-C的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.30中的至少一种；
所述HLA-DRA的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.40中的至少一种；
所述HLA-DRB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.45中的至少一种；
所述HLA-DRB3的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.46～SEQ ID NO.47中的至少一种；
所述HLA-DRB4的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.48～SEQ ID NO.57中的至少一种；
所述HLA-DRB5的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.58～SEQ ID NO.66中的至少一种；
所述HLA-DQA1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.67～SEQ ID NO.73中的至少一种；
所述HLA-DQB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.74～SEQ ID NO.83中的至少一种；
所述HLA-DPA1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.84～SEQ ID NO.93中的至少一种；
所述HLA-DPB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.94～SEQ ID NO.103中的至少一种。
7.根据权利要求3所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子。
8.根据权利要求7所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因包括Drosha、Ago1、Ago2、Dicer1、Exportin-5、TRBP(TARBP2)、PACT(PRKRA)、DGCR8中的至少一种；所述抗干扰素效应分子为PKR、2-5As、IRF-3和IRF-7中的至少一种的shRNA和/或shRNA-miR。
9.根据权利要求8所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：
所述PKR的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.104～SEQ ID NO.113中的至少一种；
所述2-5As的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.114～SEQ ID NO.143中的至少一种；
所述IRF-3的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.144～SEQ ID NO.153中的至少一种；
所述IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列为SEQ ID NO.154～SEQ ID NO.163中的至少一种。
10.根据权利要求6或9所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述主要组织相容性复合体基因、主要组织相容性复合体相关基因、PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR的表达框架如下所示：
(1)shRNA表达框架：由5’到3’依次包括权利要求6或9所述shRNA靶序列、茎环序列、权利要求6或9所述shRNA靶序列的反向互补序列、Poly T；两个反向互补靶序列由中间一茎环序列分隔组成发夹结构，最后连上Poly T作为RNA聚合酶III的转录终止子；
(2)shRNA-miR表达框架：使用权利要求6或9所述shRNA-miR靶序列替换microRNA-30或者microRNA-155中的靶序列得到。
11.根据权利要求10所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述shRNA表达框架中的茎环序列长度为3～9个碱基；所述Poly T长度为5～6个碱基。
12.根据权利要求3或7所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入诱导型基因表达系统。
13.根据权利要求12所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述诱导型基因表达系统为Tet-Off系统、二聚体诱导表达系统中的至少一种。
14.根据权利要求12中所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：
所述IL-4Rα阻断物的表达序列、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统的导入采用病毒载体干扰、非病毒载体转染或基因编辑的方法。
15.根据权利要求14中所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：
所述IL-4Rα阻断物的表达序列、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统的导入位点为多能干细胞或其衍生物的基因组安全位点。
16.根据权利要求15所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述基因组安全位点包括AAVS1安全位点、eGSH安全位点、H11安全位点中的一种或多种。
17.根据权利要求1～9、11、13～16中任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞、或者诱导多能干细胞；
所述多能干细胞衍生物包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织；
所述成体干细胞包括间充质干细胞、神经干细胞。
18.根据权利要求17所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述抗IL-4Rα抗体的重链序列如SEQ ID NO.1所示，轻链序列如SEQ ID NO.2所示。
19.权利要求1～18中任一项所述的多能干细胞或其衍生物在制备抗过敏、特应性皮炎和/或抗哮喘治疗药物中的应用。
20.一种制剂，其特征在于：包含权利要求1～18中任一项所述的多能干细胞或其衍生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011186002.6A CN114457024A (zh) | 2020-10-30 | 2020-10-30 | 一种表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011186002.6A CN114457024A (zh) | 2020-10-30 | 2020-10-30 | 一种表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114457024A true CN114457024A (zh) | 2022-05-10 |
Family
ID=81403991
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011186002.6A Pending CN114457024A (zh) | 2020-10-30 | 2020-10-30 | 一种表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114457024A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105764926A (zh) * | 2013-09-24 | 2016-07-13 | 梅迪塞纳医疗股份有限公司 | 白介素-4受体结合融合蛋白及其应用 |
| CN108368520A (zh) * | 2015-11-04 | 2018-08-03 | 菲特治疗公司 | 多能细胞的基因组工程改造 |
| CN110637083A (zh) * | 2017-03-20 | 2019-12-31 | 华盛顿大学 | 细胞及其使用和制备方法 |
| CN110951693A (zh) * | 2019-12-05 | 2020-04-03 | 北京兴元和济生命医学科技有限公司 | 一种利用CRISPR-Cas9系统对间充质干细胞定点敲入外源基因的方法 |
| CN111647082A (zh) * | 2018-12-27 | 2020-09-11 | 中山康方生物医药有限公司 | 抗人il-4ra的抗体及其用途 |
| CN114657133A (zh) * | 2020-12-22 | 2022-06-24 | 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 | 一种表达靶向IL-4 Rα的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞 |
-
2020
- 2020-10-30 CN CN202011186002.6A patent/CN114457024A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105764926A (zh) * | 2013-09-24 | 2016-07-13 | 梅迪塞纳医疗股份有限公司 | 白介素-4受体结合融合蛋白及其应用 |
| CN108368520A (zh) * | 2015-11-04 | 2018-08-03 | 菲特治疗公司 | 多能细胞的基因组工程改造 |
| CN110637083A (zh) * | 2017-03-20 | 2019-12-31 | 华盛顿大学 | 细胞及其使用和制备方法 |
| CN111647082A (zh) * | 2018-12-27 | 2020-09-11 | 中山康方生物医药有限公司 | 抗人il-4ra的抗体及其用途 |
| CN110951693A (zh) * | 2019-12-05 | 2020-04-03 | 北京兴元和济生命医学科技有限公司 | 一种利用CRISPR-Cas9系统对间充质干细胞定点敲入外源基因的方法 |
| CN114657133A (zh) * | 2020-12-22 | 2022-06-24 | 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 | 一种表达靶向IL-4 Rα的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| AKKOÇ T ET AL: "Asthma immunotherapy and treatment approaches with mesenchymal stem cells", IMMUNOTHERAPY, vol. 12, no. 9, 3 July 2020 (2020-07-03) * |
| SANTINI G ET AL: "Dupilumab for the treatment of asthma", EXPERT OPINION ON INVESTIGATIONAL DRUGS, vol. 26, no. 3, 4 September 2014 (2014-09-04) * |
| 余刚: "hIL-37基因修饰的骨髓间充质干细胞对哮喘治疗作用的研究 余刚", 万方数据, 29 December 2015 (2015-12-29) * |
| 黄世杰: "dupilumab长期治疗中重度特应性皮炎的Ⅲ期临床试验获阳性资料", 国际药学研究杂志, vol. 44, no. 4, 30 April 2017 (2017-04-30), pages 365 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110234762A (zh) | 用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法 | |
| CN110337493A (zh) | 用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法 | |
| EP2599859A1 (en) | Haploid cells | |
| US20230175009A1 (en) | Immunologically compatible and reversible universal pluripotent stem cell and application thereof | |
| CN114657133A (zh) | 一种表达靶向IL-4 Rα的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞 | |
| WO2022116591A1 (zh) | 一种多能干细胞及其衍生物 | |
| CN114457024A (zh) | 一种表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用 | |
| CN114426953A (zh) | 一种表达il-12的多能干细胞衍生物及应用 | |
| CN114657136A (zh) | 一种表达靶向PCSK9的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物 | |
| CN114645021A (zh) | 一种表达靶向cd47抑制因子的多能干细胞及其衍生物与应用 | |
| CN114457030A (zh) | 一种表达IgE阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用 | |
| CN114525255A (zh) | 一种表达il-11的多能干细胞衍生物及其应用 | |
| CN114525254A (zh) | 一种表达fgf-21的多能干细胞或其衍生物及应用 | |
| CN114457029A (zh) | 一种表达vegf-a阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用 | |
| CN114657131A (zh) | 一种表达尿酸氧化酶的多能干细胞或其衍生物 | |
| CN114525257A (zh) | 一种表达Tim-3阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用 | |
| CN114517184A (zh) | 一种表达adipsin的多能干细胞或其衍生物及应用 | |
| CN114457034A (zh) | 一种表达il-1阻断物的多能干细胞衍生物及其应用 | |
| CN114457031A (zh) | 一种表达b7-h5阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用 | |
| CN114525258A (zh) | 一种表达pcsk9阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用 | |
| CN114457035A (zh) | 一种表达lag-3阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用 | |
| CN114525256A (zh) | 一种表达Siglec-15阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用 | |
| CN114657134A (zh) | 一种表达靶向IgE的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物 | |
| CN114507643A (zh) | 一种表达il-2的多能干细胞衍生物及应用 | |
| CN114457026A (zh) | 一种表达4-1bb激活型抗体的多能干细胞及其衍生物与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |