CN112867502A - Herv-k衍生抗原作为共有肿瘤抗原用于抗癌疫苗 - Google Patents
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Abstract
一种组合物或疫苗，其包含至少一种肽，或在体内诱导所述至少一种肽的表达的表达载体，所述肽由共享的HERV‑K衍生的抗原组成或包含共享的HERV‑K衍生的抗原，以及药学上可接受的媒介物或赋形剂。一种组合物，其包含用这种肽处理的患者的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，或包含识别这种肽的T细胞受体(TCR)工程化的T细胞。
Description
本发明涉及对衍生自HERV-K抗原的表位或新表位的鉴定，所述表位或新表位在某些肿瘤亚型中共有并且可以用于诊断、预后和免疫监测，以及用于抗原组合物、免疫原性组合物、抗癌疫苗或基于T细胞的免疫疗法中。因此，本发明涉及癌症和免疫疗法领域，并涉及基于肽的抗原性免疫原性组合物的开发，所述组合物包括这些表位的一种或多种(优选地几种)，并且可用于诊断、预后和免疫监测以及治疗和预防癌症，以及包括一种或多种，优选地几种这些表位的免疫组合物和疫苗的开发，其用于癌症的治疗和预防。作为替代，本发明的组合物包括一种或多种在体内执行或导致所述肽的表达的载体，例如载体可以是DNA或RNA载体，或者细菌或病毒载体。
发明背景
人类内源性逆转录病毒(HERV)占人类基因组的8％。它们可能对应于外源逆转录病毒的古代种系感染的残留物。由于DNA重组、突变和缺失，大多数HERV基因无功能，但有些产生功能蛋白质，包括组群特异性抗原(Gag)，具有逆转录酶的聚合酶(Pol)和包膜(Env)表面单元。HERV表达通过表观遗传机制在正常细胞中被抑制。
HERV具有与“病毒拟态”相联系的强免疫原性性质，并且由于脱甲基作用，它们在某些实体瘤中的表达增加。人们认为，HERV可能代表了致癌作用中的潜在致病剂，在这种情况下，它们可能通过插入性诱变或参与染色体畸变而发挥作用。一些HERV蛋白，例如HERV-KRec和Np9，也是推定的癌基因。
HERV在癌症中的表达已与对免疫系统的不同作用关联起来：
-通过Env单元的免疫抑制结构域的免疫调节
-通过HERV dsRNA(触发先天I型干扰素信号传导)激活先天免疫
-诱导针对HERV抗原的适应性免疫应答。
发明概述
因此，根据本发明，提供了分离的或纯化的肽以及包含至少一种这样的肽的组合物，或在体内诱导所述至少一种这样的肽的表达的表达载体，肽由表位组成或包含表位，所述表位由选自下组的序列组成：序列FLQFKTWWI(SEQ ID NO：1)、RLIPYDWEI(SEQ ID NO：2)、KLIDCYTFL(SEQ ID NO：3)、YLSFIKILL(SEQ ID NO：4)、AMIPKDWPL(SEQ ID NO：5)、YAMSNLFSI(SEQ ID NO：6)、SMDDQLNQL(SEQ ID NO：7)。组合物可以进一步包含适当的液体、缓冲剂或媒介物。在用于人类治疗的组合物中，组合物还包含药学上可接受的媒介物、载体或赋形剂。
特别地，提供了一种免疫原性组合物，其包含至少一种肽，或在体内诱导所述至少一种肽的表达的表达载体，肽由表位组成或包含表位，所述表位由选自由序列FLQFKTWWI(SEQ ID NO：1)、RLIPYDWEI(SEQ ID NO：2)、KLIDCYTFL(SEQ ID NO：3)、YLSFIKILL(SEQ IDNO：4)、AMIPKDWPL(SEQ ID NO：5)、YAMSNLFSI(SEQ ID NO：6)、SMDDQLNQL(SEQ ID NO：7)组成的组的序列组成，和药学上可接受的媒介物、载体或赋形剂。
还提供了疫苗或抗癌疫苗，其包含至少一种肽，或在体内诱导所述至少一种肽的表达的表达载体，所述肽由表位组成或包含表位，所述表位由选自由序列FLQFKTWWI(SEQID NO：1)、RLIPYDWEI(SEQ ID NO：2)、KLIDCYTFL(SEQ ID NO：3)、YLSFIKILL(SEQ ID NO：4)、AMIPKDWPL(SEQ ID NO：5)、YAMSNLFSI(SEQ ID NO：6)、SMDDQLNQL(SEQ ID NO：7)组成的组的序列组成，和药学上可接受的媒介物、载体或赋形剂。
根据本发明的组合物可具体包括：
2、3、4、5、6或7种肽，或者在体内诱导所述2、3、4、5、6或7种肽的表达的一种或多种表达载体，肽具有9至100个氨基酸残基，每一种包含序列SEQ ID NO：1-7的表位中的至少一种，特别是一种，以及每种肽相对于其他肽包含至少一个不同的表位；或
至少一种肽，或在体内诱导所述至少一种肽的表达的表达载体，所述肽具有9至100个氨基酸残基并且包含SEQ ID NO：1-7的表位中的2、3、4、5、6或7种。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物可具体包括：
2、3、4、5、6或7种肽，或者在体内诱导所述2、3、4、5、6或7种肽的表达的一种或多种表达载体，肽具有9至100个氨基酸残基，其中一种包含序列SEQ ID NO：1或6的表位并且至少另一种包含序列SEQ ID NO：1-7的其他表位中的至少一种，以及每种肽相对于其他肽包含至少一个不同的表位；或
至少一种肽，或在体内诱导所述至少一种肽的表达的表达载体，所述肽具有9至100个氨基酸残基并且包含序列SEQ ID NO：1-7的表位中的2、3、4、5、6或7种，包括序列SEQID NO：1或6的表位，特别是两者。
如在本文中将在之后呈现的，根据本发明的组合物可以包括以下实施方案(但是，其他实施方案也将从描述的其余部分显现)：
-组合物包括序列SEQ ID NO：1至7的2、3、4、5、6或7种肽；或其包括诱导这些肽的体内表达的一种或多种表达载体；在实施方案中，序列SEQ ID NO：1或6的肽或这两种肽均存在或表达；
-组合物包括肽，其包含9至100个氨基酸残基和序列SEQ ID NO：1至7的至少一种所述肽；肽可包含公开的表位中的2、3、4、5、6或7种；在实施方案中，组合物可包括本文公开的gag表位和/或pol表位，或者gag和/或pol的这些表位中的至少两种或三种；或其包含诱导该肽或这些肽的体内表达的一种或多种表达载体；在实施方案中，包含或表达的肽包括序列SEQ ID NO：1或6的肽，或这两种肽；
-组合物包括具有9至100个氨基酸残基的2、3、4、5、6或7种肽，每一种包含序列SEQID NO：1至7的表位中的至少一种，优选为一种，并且每一种肽相对于其它肽包含至少一个不同的表位；或者其包括诱导这些肽的体内表达的一种或多种表达载体；在实施方案中，序列SEQ ID NO：1或6的肽，或两者都存在或表达；
-9至100个氨基酸残基的每一种包含或表达的肽包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6或7的一种特定(不同于组合物中的其他肽)表位；
-一种或多种包含或表达的肽包含HERV gag或pol的9至50个氨基酸残基，其包括序列SEQ ID NO：1至7的所述肽的至少一种；
-组合物包括从由SEQ ID NO：8至14的肽组成的组中选择的1、2、3、4、5、6或7种肽；或其包括诱导该肽或这些肽的体内表达的一种或多种表达载体；在实施方案中，序列SEQID NO：8或13的肽，或者这两种肽都存在或表达。
序列SEQ ID NO：4、2和1的表位来自HERV-K gag。序列SEQ ID NO：5、3、6和7的表位来自HERV-K pol。这些是MHCⅠ类HLA-A2表位。在一个实施方案中，组合物包括或表达1、2或3种HERV-K gag表位。在一个实施方案中，组合物包括或表达1、2、3或4种HERV-K pol表位。
在根据本发明的组合物、免疫原组合物或疫苗的上下文中，包含或表达的肽可包含9至100，特别是9至70，或9至50、40、30、25、20个连续残基，优选地那些残基来自HERV-Kgag和/或pol，更优选地是天然共有HERV-K gag和/或pol序列，包括上述表位中的至少一个。肽可以是小于50个残基的长度，例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或45个残基的长度。
根据本发明的组合物、免疫原性组合物或疫苗(除非另有相反指示，否则在下文中称为“组合物”)可包含HERV-K的这些肽中的超过一种(特别是来自gag和/或pol)，或诱导HERV-K的这些肽的超过一种(特别是来自gag和/或pol)的体内表达的表达载体，或几种(超过一种)表达载体，每种表达载体诱导HERV-K的(这些肽中的)不同肽(特别是来自gag和/或pol)的体内表达。
在一个实施方案中，肽(具有多于9个残基)是天然HERV-K片段，其包含9聚体表位和在N-末端和/或C-末端的邻近氨基酸，形成给定长度的肽。在实施方案中，肽包含两种以上的HERV-K表位(例如公开的表位中的2、3、4、5、6或7种)。
在一个实施方案中，肽(具有多于9个残基)是天然HERV-K片段，其包含9聚体表位和在N-末端和/或C-末端处的邻近氨基酸，以及另外的外源氨基酸，形成给定长度的肽。在实施方案中，肽包含两种以上的HERV-K表位(例如公开的表位中的2、3、4、5、6或7种)。
在另一实施方案中，组合物中包含或表达的肽的全部或部分肽序列对HERV-K是外源的。在该实施方案中，肽可容易地包含超过两种HERV-K表位，例如所公开的表位中的2、3、4、5、6或7种。肽的长度适合于包含表位的数量和可能的另外的氨基酸。因此，肽可以是9或10至69的肽长度或更长。
优选地，组合物包含或载体诱导2、3、4、5、6或7种不同肽的表达，每一种肽包含不同的表位或由不同的表位组成，所述表位由选自由序列FLQFKTWWI(SEQ ID NO：1)、RLIPYDWEI(SEQ ID NO：2)、KLIDCYTFL(SEQ ID NO：3)、YLSFIKILL(SEQ ID NO：4)、AMIPKDWPL(SEQ ID NO：5)、YAMSNLFSI(SEQ ID NO：6)、SMDDQLNQL(SEQ ID NO：7)组成的组的序列组成。
在一个实施方案中，组合物包含或载体诱导至少一种肽的表达，所述至少一种肽包含至少两种不同的表位或由至少两种不同的表位组成，所述表位由选自由序列FLQFKTWWI(SEQ ID NO：1)、RLIPYDWEI(SEQ ID NO：2)、KLIDCYTFL(SEQ ID NO：3)、YLSFIKILL(SEQ ID NO：4)、AMIPKDWPL(SEQ ID NO：5)、YAMSNLFSI(SEQ ID NO：6)、SMDDQLNQL(SEQ ID NO：7)组成的组的序列组成。在一个实施方案中，所述肽包含所述表位中的2、3、4、5、6或7个；或表达载体诱导包含所述表位中的2、3、4、5、6或7个的肽的表达。
存在几种办法以使得在组合物中或在同一患者体内的表达产物中代表不同的表位。组合物可包含或载体诱导包含所述组的一个或多个不同表位的一个或多种肽的表达，使得所述表位FLQFKTWWI(SEQ ID NO：1)、RLIPYDWEI(SEQ ID NO：2)、KLIDCYTFL(SEQ IDNO：3)、YLSFIKILL(SEQ ID NO：4)、AMIPKDWPL(SEQ ID NO：5)、YAMSNLFSI(SEQ ID NO：6)，SMDDQLNQL(SEQ ID NO：7)的2、3、4、5、6或7种在组合物中存在或表达。
当谈到诱导根据本发明的超过一种肽的表达的表达载体时，可以使组合物包括诱导几种肽的表达的载体(其中肽可包含组的一个表位或多于1个，例如2、3、4、5、6、7个所述表位)，或至少两种表达载体，其中几种载体各自诱导至少一种肽的表达。在一个实施方案中，组合物包括一种单一载体或几种载体，并且载体诱导一种或多种肽和所述表位中的2、3、4、5、6或7个的表达。
根据本发明，包含表位和其它gag或pol氨基酸残基的分离或纯化的29聚体肽的实例为：
KSKIKSKYASYLSFIKILLKRGGVKVSTK(SEQ ID NO：8)、
TLLDSIAHGHRLIPYDWEILAKSSLSPSQ(SEQ ID NO：9)、
LAKSSLSPSQFLQFKTWWIDGVQEQVRRN(SEQ ID NO：10)、
GPLQPGLPSPAMIPKDWPLLIIIDLKDCF(SEQ ID NO：11)、
KLIDCYTFLQAEVANAGLAIASDKIQTST(SEQ ID NO：12)、
WIRPTLGIPTYAMSNLFSILRGDSDLNSK(SEQ ID NO：13)，和
RDVETALIKYSMDDQLNQLFNLLQQTVRK(SEQ ID NO：14)。每一种的这些分离或纯化的29聚体肽或片段或28至10个氨基酸残基，包括9聚体表位，并且在分离或纯化形式下，是本发明的目的。肽可以是小于29个残基的长度，例如那些序列SEQ ID NO：8-14的9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个残基，包括9聚体表位。有趣的是，添加到表位的氨基酸序列可以如在SEQ ID NO：8-14的肽的情况下那样包括其他潜在的CD4和/或CD8 T表位。本发明提供了以下肽，其包含本文公开的表位和在C-末端和/或N-末端的“其他氨基酸”。这些其他氨基酸可以是与序列1-16一起在本文公开的gag或pol序列。然而，本发明包括在这些gag/pol序列内这些“其他氨基酸”水平上的氨基酸的变化。因此，本发明包括那些序列，包括序列1-16，其中其他氨基酸序列与那些gag/pol序列具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的同一性百分比。
在一个实施方案中，本发明的组合物包括或表达SEQ ID NO：8的肽或SEQ ID NO：13的肽，或SEQ ID NO：8和13的肽两者，以及SEQ ID NO：8-14的其他肽中的1、2、3、4、5种。
在一个实施方案中，组合物还包括佐剂。
以分离或纯化形式的肽RLIPYDWEI(SEQ ID NO：2)是本发明的目的。
以分离或纯化形式的肽KLIDCYTFL(SEQ ID NO：3)是本发明的目的。
以分离或纯化形式的肽YLSFIKIL(SEQ ID NO：4)是本发明的目的。
以分离或纯化形式的肽AMIPKDWPL(SEQ ID NO：5)是本发明的目的。
以分离或纯化形式的肽YAMSNFSI(SEQ ID NO：6)本发明的目的。
以分离或纯化形式的肽SMDDQLNQL(SEQ ID NO：7)是本发明的目的。
以分离或纯化形式的至少包含SEQ ID NO：1-7的所述肽中的至少一个的10至100个氨基酸的肽是本发明的目的。
以分离或纯化形式的包含FLQFKTWWI(SEQ ID NO：1)、RLIPYDWEI(SEQ ID NO：2)、KLIDCYTFL(SEQ ID NO：3)、YLSFIKILL(SEQ ID NO：4)、AMIPKDWPL(SEQ ID NO：5)、YAMSNLFSI(SEQ ID NO：6)和SMDDQLNQL(SEQ ID NO：7)表位中的2、3、4、5、6或7个的肽是本发明的目的。所述肽优选地包含FLQFKTWWI(SEQ ID NO：1)和/或YAMSNLFSI(SEQ ID NO：6)。
在一个实施方案中，该肽可包含9至100，特别是9至70，或9至50，40、30、25、20，或甚至10至30，12-25，优选地14-18，例如14、15、16、17或18个连续残基，优选地是HERV-K gag和/或pol的，更优选是天然共有HERV-K gag和/或pol序列的，包括上述表位中的至少一个，除了序列SEQ ID NO：1-7的对应表位之外的氨基酸是如本文所公开的HERV-K gag或pol中存在的天然氨基酸，并且在所述表位的5’、3’或5’和3’延伸。肽可以小于50个残基的长度，例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或45个残基的长度，通常为14、15、16、17或18个。本发明的另一个目的是表达载体，其包含编码选自由FLQFKTWWI(SEQ IDNO：1)RLIPYDWEI(SEQ ID NO：2)KLIDCYTFL(SEQ ID NO：3)YLSFIKILL(SEQ ID NO：4)，AMIPKDWPL(SEQ ID NO：5)，YAMSNLFSI(SEQ ID NO：6)，SMDDQLNQL(SEQ ID NO：7)组成的组的氨基酸序列，和它们中的至少两种(尤其是它们中的2、3、4、5、6或7种)的核酸，以及留给在患者内核酸(多核苷酸)的体内表达所需的元件。
包含3种gag表位的HERVK-gag多肽的实例：
MGQTKSKIKSKYASYLSFIKILLKRGGVKVSTKNLIKLFQIIEQFCPWFPEQGTLDLKDWSQKETEGLHCEYVAEPVMAQSTQNVDYNQLQEVIYPETLKLEESKPRGTSPLPAGQVPVTLQPQKQVKENKTQPPVAYQYWPPAELQYRPPPESQYGYPGMPPAPQGRAPYPQPPTRRLNPTAPPSRQGSKLHEIAQEGEPPTVEARYKSFSIKKLKDMKEGVKQYGPNSPYMRTLLDSIAHGHRLIPYDWEILAKSSLSPSQFLQFKTWWIDGVQEQVRRNRAANPPVNIDADQLLGIGQNWSTISQQALMQNEAIEQVRAICLRAWEKIQDPSKEPYPDFVARLQDVAQKSIADEKARKVIVELMAYENANPECQSAIKPLKGKVPAGSDVISEYVKACDGIGGAMHKAMLMAQAITGVVLGGQVRTFGRKCYNCGQIGHLKKNCPVLNKQNITIQATTTGREPPDLCNEQRGQPQAPQQTGAFPIQPFVPQGFQGQQPPLSQVFQGISQLPQYNNCPPP(SEQ ID NO：15)
包含4种pol表位的HERVK-pol多肽的实例：
NKSRKRRNRESLLGAATVEPPKPIPLTWKTEKPVWVNQWPLPKQKLEALHLLANEQLEKGHIEPSFSPWNSPVFVIQKKSGKWRMLTDLRAVNAVIQPMGPLQPGLPSPAMIPKDWPLIIIDLKDCFFTIPLAEQDCEKFAFTIPAINNKEPATRFQWKVLPQGMLNSPTICQTFVGRALQPVREKFSDCYIIHCIDDILCAAETKDKLIDCYTFLQAEVANAGLAIASDKIQTSTPFHYLGMQIENRKIKPQKIEIRKDTLKTLNDFQKLLGDINWIRPTLGIPTYAMSNLFSILRGDSDLNSKRMLTPEATKEIKLVEEKIQSAQINRIDPLAPLQLLIFATAHSPTGIIIQNTDLVEWSFLPHSTVKTFTLYLDQIATLIGQTRLRIIKLCGNDPDKIVVLTKEQVRQAFINSGAWKIGLANFVGIIDNHYPKTKIFQFLKLTTWILPKITRREPLENALTVFTDGSSNGKAAYTGPKERVIKTPYQSAQRAELVAVITVLQDFDQPINIISDSAYVVQATRDVETALIKYSMDDQLNQLFNLLQQTVRKRNFPFYITHIRAHTNLPGPLTKANEQADLLVSSALIKAQELHALTHVNAAGLKNKFDVTWKQAKDIVQHCTQCQVLHLPTQEAGVNPRGLCPNALWQMDVTHVPSFGRLSYVHVTVDTYSHFIWATCQSTSHVKKHLLSCFAVMGVPEKIKTDNGPGYCSKAFQKFLSQWKISHTTGIPYNSQGQAIVERTNRTLKTQLVKQKEGGDSKCTTPQMQLNLALYTLNFLNIYRNQTTTSAEQHLTGKKSPGENQLPVWIPTRHLKFYNEPIRDAKKSTSA(SEQ ID NO：16)
分离或纯化的SEQ ID NO：15和16的多肽是本发明的目的，如本文所定义并包含或表达SEQ ID NO：15和/或SEQ ID NO：16的多肽的组合物、免疫原性组合物和抗癌疫苗也是本发明的目的。
在一个实施方案中，表达载体包含编码9至100、特别是9至70或9至50、40、30、25、20个氨基酸肽的核酸(编码的肽可以小于50个残基的长度，例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或45个残基的长度)，包含选自由FLQFKTWWI(SEQ ID NO：1)、RLIPYDWEI(SEQ ID NO：2)、KLIDCYTFL(SEQ ID NO：3)、YLSFIKILL(SEQ ID NO：4)、AMIPKDWPL(SEQ ID NO：5)、YAMSNLFSI(SEQ ID NO：6)、SMDDQLNQL(SEQ ID NO：7)组成的组的表位，和在患者内核酸(多核苷酸)的体内表达所需的元件。如上所述，载体可包含核酸序列，使得载体诱导包含2、3、4、5、6或7个表位的肽的表达，或诱导包含2、3、4、5、6或7个所述表位的肽的表达。此外，如上所述，载体可包含编码肽的核酸，所述肽包含这些表位中的一个或几个，和除相关表位之外的氨基酸残基，其中另外的残基可来自pol或gag，或对于gag或pol是外源的。
表达构建体或载体可以是非病毒表达构建体，例如细菌表达构建体、DNA或RNA表达构建体或者病毒表达构建体。表达构建体可以位于抗原呈递细胞中。构建体可导致表达构建体整合到细胞的基因组中。
本发明还涉及用于治疗癌症的这些组合物。与此用途有关的癌症可特别地(但不限于)从以下癌症中选择：乳腺癌包括三阴性乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肉瘤、畸胎癌、膀胱癌、肺癌(非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、头颈癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤和白血病等，例如乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、卵巢癌、黑色素瘤、肉瘤、畸胎癌、膀胱癌和白血病。
用途可旨在激活患者(例如乳腺癌患者)中的T细胞应答、B细胞应答或两者。
本发明还涉及如本文所公开的一种9聚体表位或几种9聚体表位、或如本文所公开的一种肽或几种肽、或如本文所公开的一种表达载体或几种表达载体、或如本文所公开的组合物的用途，用于制造如本文所公开的治疗癌症的免疫原性组合物或疫苗。
本发明的另一个目的是治疗癌症的方法，包括向有此需要的患者施用治疗有效量的如本文所公开的免疫原性组合物或疫苗。如上所述，组合物可包含一种或多种肽、或者一种或多种表达载体或构建体。方法可包括施用疫苗多于一次。施用的肽的治疗有效每日量(根据本发明的一种肽或多种肽的总量)可在0.01mg至10mg、0.025mg至5.0mg或0.025mg至1.0mg的范围内。
本发明的另一个目的是治疗患者中癌症的方法，包括(a)将需要癌症治疗的患者的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)与根据本发明的组合物或免疫原性组合物接触；和(b)向患者施用治疗有效量的步骤(a)的CTL。方法还可包括在施用前通过离体或体内方法扩增所述CTL。接触可包括提供负载有本发明肽(一种或多种)或者从表达构建体表达所述肽或多肽(一种或多种)的抗原呈递细胞。提供治疗益处所需的CTL细胞的治疗有效量可为每千克受试者体重约0.1×104至约5×109个细胞。方法可以包括执行步骤(b)超过一次。
本发明还涉及制备CTL的方法，包括将需要癌症治疗的患者的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)与根据本发明的组合物或免疫原性组合物接触，并且可能离体扩增所述CTL。接触可包括提供负载有本发明的肽(一种或多种)的抗原呈递细胞或从表达构建体表达所述肽或多肽(一种或多种)。
如上文所述制备的包含在药物媒介物中的此类CTL的组合物也是本发明的目的。
本发明的另一个目的是识别本发明表位肽的T细胞受体(TCR)工程化的T细胞和包含在药物载体中的此类T细胞的组合物。制备这些T细胞的过程是本领域技术人员已知的。它可以是以下(并且该方法也是本发明的目的)：(i)从识别本发明表位肽的T细胞分离TCRα和β链并插入载体(例如慢病毒或逆转录病毒)；(ii)从患者或供体的外周血分离的T细胞用这种载体(例如慢病毒或逆转录病毒)修饰以编码所需的TCRαβ序列；(iii)然后在体外扩增这些修饰的T细胞以获得足够的数量用于治疗并施用给患者。值得注意的是，可以修饰TCR序列以优化TCR亲和力。这些T细胞的使用方法(例如癌症的治疗)是本发明的另一个目的，并且包括向有此需要的受试者施用有效量的那些T细胞。提供治疗益处所需的T细胞的治疗有效量可为每千克受试者体重约0.1×104至约5×109个细胞。
在一个实施方案中，癌症是三阴性乳腺癌(TNBC)、其他乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肉瘤、畸胎癌、膀胱癌、肺癌(非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、头颈癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤和白血病，例如乳腺癌包括三阴性乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肉瘤、畸胎癌、膀胱癌和白血病。
制备的或包含如本文所公开的表位的抗原也可用于生成抗HERV-K抗体和检测HERV-K+癌症患者中抗HERV-K抗体的存在。
根据本发明的包含至少一种抗原肽的表位和组合物可用于诊断、预后或免疫监测方法中。具体而言，本发明还涉及用于免疫监测患者中免疫应答的方法。免疫疗法(使用本发明表位或组合物的疫苗或诱导适应性抗肿瘤T细胞应答的任何其他免疫疗法)后抗肿瘤适应性应答的诱导将通过测量针对本发明HERV表位的特异性T细胞应答来评估。例如，可通过使用含有本发明所述表位的多聚体直接地或在用本发明所述肽进行离体刺激之后执行测量。也可以在用本发明的肽进行离体刺激后，通过使用FACS分析、ELISA、ELISPOT或其他检测特异性T细胞活化的方法来进行T细胞应答的测量。
在一个实施方案中，生物样品是血液、含有来自肿瘤的循环细胞或淋巴细胞的血液衍生物。优选地，方法包括确定血液中的一些淋巴细胞在体外刺激时能够特异性识别目标肽和/或针对目标肽被特异性地重新激活。
普通的技术人员将知道各种测定法以确定是否生成针对肿瘤相关肽的免疫应答。“免疫应答”一词包括细胞和体液免疫应答两者。各种B淋巴细胞和T淋巴细胞分析是众所周知的，例如ELISA、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定法，例如铬释放测定法、使用外周血淋巴细胞(PBL)的增殖测定法、四聚体测定法和细胞因子产生测定法。参见Benjamini等人(1991)，通过引用并入。
发明详述
本发明人在人类基因组上定位了HERV序列，并开发了HERV的RNAseq分析。利用公共数据库中84例乳腺癌的RNAseq数据，其中42例三阴性乳腺癌(TNBC)和42例ER+亚型，他们将其表达与来自正常乳腺组织样品的RNAseq(其中51例来自瘤周区和5例来自哺乳动物缩减样品)进行了比较。19例HERV在TNBC中特定地过表达，其中大部分属于HERV-K家族。
多组分分析表明HERV可用于表征三阴性亚型。HERV表达与TNBC中较高的OCT4(POU5F1)和较低的TRIM28水平相关，这两个因子分别对HERV的转录起正调控和负调控作用。也观察到与EMT签名(signature)的联系，这可能与TNBC中的干细胞特征有关。有趣的是，HERV表达与T细胞和细胞毒性淋巴细胞转录组学签名显著相关，这可能是由Ⅰ型干扰素(IFN)应答和抗原呈递细胞签名的存在所解释的。免疫调节签名(包括阴性免疫检查点和IDO1/2)和抑制细胞(包括调节性T细胞和MDSC)抵消了效应T细胞签名。
HERV的多态性经常被认为是表征T细胞针对特定HERV抗原的应答或将其用于癌症疫苗接种策略的主要障碍。基于表征TNBC的有限数量的HERV的特异性表达，提出了一个假设，即可以确定在TNBC中表达的不同HERV之间共有的Gag和Pol蛋白质中的共同区域，并然后确定这些结构域中存在的T细胞表位。有效地发现了来自在TNBC中过表达的几种HERV-K的Gag和Pol中并且含有每种蛋白质的完整ORF的共同区域。有趣的是，使用不同的表位预测工具(包括NetMHCⅠ和Ⅱ)，这些共有结构域包含几个区域，这些区域富含最常见的MHCⅠ类和Ⅱ类等位基因的潜在强表位结合物。
合成与预测的HLA-A2表位相对应的9聚体肽，并用于体外方案，包括刺激外周血单核细胞(PBMC)以诱导针对目标肽的特异性应答。通过多聚体染色评估特异性CD8+ T细胞的存在，并且针对用同类(cognate)肽脉冲的T2细胞进一步评估功能性应答(IFNγ产生和脱粒)，显示CD8+ T细胞针对根据本发明制备的HERV肽的特异性激活。此外，利用对肽SEQ IDNO：1特异性的CD8+ T细胞证实了HERV特异性CD8+T细胞针对表达HERV的肿瘤细胞系的细胞毒性，证实了由这些肽生成的T细胞的功能性抗肿瘤性质。
考虑到在肿瘤细胞中的HERV表达增强以及获得的结果，可以得出以下结论：
-HERV在肿瘤中优先表达，有19种HERV亚型表征三阴性乳腺癌(TNBC)，大多数属于HERV-K家族。
-在这19种HERV亚型之间，可以发现含有T细胞表位的共同序列。
-7种9聚体肽被鉴定为强HLA-A2结合物并能够引发特异性CD8+ T细胞应答，针对用同类脉冲的T2细胞或针对表达HERV的肿瘤细胞系具有特异性细胞毒性应答：FLQFKTWWI(SEQ ID NO：1)、RLIPYDWEI(SEQ ID NO：2)、KLIDCYTFL(SEQ ID NO：3)、YLSFIKILL(SEQ IDNO：4)、AMIPKDWPL(SEQ ID NO：5)、YAMSNLFSI(SEQ ID NO：6)、SMDDQLNQL(SEQ ID NO：7)。
-因此，HERV产物代表了能够诱导功能性T细胞应答的共有的肿瘤抗原。HERV衍生的肿瘤抗原可用于开发肿瘤疫苗和监测适应性免疫应答。
定义
短语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指实质上或基本上不含通常在其自然状态下发现伴随着材料的成分的材料。因此，根据本发明的分离的肽优选地不包含通常在其原位环境中与肽相关联的材料。
“主要组织相容性复合物”或“MHC”是在控制负责生理学免疫应答的细胞相互作用中发挥作用的基因簇。在人类中，MHC复合物也称为HLA复合物。对于MHC和HLA复合物的详细描述。
“人类白细胞抗原”或“HLA”是人I类或II类主要组织相容性复合物(MHC)蛋白。
短语“药物可接受的”或“药理学可接受的”是指当施用给人时不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。制备含有蛋白质作为活性成分的水性组合物在本领域中是众所周知的。典型地，将这类组合物制备为可注射的，具有药物可接受的常用媒介物或赋形剂或运载体，作为液体溶液或悬浮液；也可制备适于在注射前在液体中溶解或悬浮的固体形式。
如本文所用，“媒介物、赋形剂、运载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、媒介物、涂层、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、运载体溶液、悬浮液、胶体等。将这种介质和试剂用于药物活性物质在本领域中是众所周知的。
“免疫原性肽”指这样的肽，一旦呈递给患者的免疫系统，可以诱导体液和/或细胞免疫应答，并且这种应答是免疫原性的，但不一定具有保护性。这适用于“免疫原性组合物”。
“免疫原性应答”是指对衍生自传染剂的抗原或肿瘤抗原的CTL和/或HTL应答。免疫应答还可以包括通过刺激辅助T细胞而得到促进的抗体应答。
特别是，免疫原性组合物可诱导CD8+ T细胞的体内激活，其针对组合物中存在的HERV肽和/或针对包含肿瘤细胞中表达的类似表位的HERV肽或多肽。
“疫苗组合物”或“疫苗肽”指一旦施用给患者，分别呈递给患者的免疫系统，组合物或肽可诱导体液和/或细胞免疫应答，并且这种免疫应答是保护性的。
“保护性免疫应答”是指对衍生自传染剂的抗原或肿瘤抗原的CTL和/或HTL应答，这防止或至少部分地中止疾病症状或进展。免疫应答还可以包括通过刺激辅助T细胞而促进的抗体应答。
“免疫原性”指这样的肽或表位，其一旦出现在患者体内，特别是在患者的血液、组织或器官中，能够诱导体液和/或细胞介导的免疫应答。
通过组合物或载体“诱导表达”，意指其包含一种表达载体或多种表达载体，所述表达载体包含编码一种或多种肽的核酸、DNA或RNA。载体尤其可以是RNA载体、DNA载体或质粒、病毒载体或细菌载体。表达盒可以整合到宿主细胞基因组中，也可以不整合，这取决于载体的性质，并且这是本领域技术人员所熟知的。表达载体或表达盒可进一步包含在患者内核酸(多核苷酸)的体内表达所需的元件。至少，这包括起始密码子(ATG)、终止密码子和启动子，以及某些载体(例如质粒和除痘病毒以外的病毒载体)的多腺苷酸化序列。ATG位于阅读框的5’，并且终止密码子位于3’。众所周知，可能存在能够控制表达的其它元件，例如增强子序列、稳定化序列和允许肽分泌的信号序列。
蛋白质或肽可由本领域技术人员已知的任何技术制备，包括通过标准分子生物学技术来表达蛋白质、多肽或肽，从天然来源分离蛋白质或肽，或蛋白质或肽的化学合成。合成肽一般是约多至35个残基长，这是自动化肽合成机器的大约长度上限，例如可从AppliedBiosystems(Foster City,Calif.)获得的机器。也可制备更长的肽，例如通过重组手段。
“肽表位”或“表位”是包含等位基因特异性基序或超基序的肽，使得肽将结合HLA分子并诱导CTL和/或HTL应答。因此，包含至少一个“肽表位”的本发明免疫原性或疫苗肽能够结合至适当的HLA分子，并且随后诱导对衍生免疫原性或疫苗肽的抗原的细胞毒性T细胞应答或辅助T细胞应答。
预期本发明的肽可进一步使用氨基酸序列变体，例如取代、插入或缺失变体。缺失变体缺少天然蛋白的一个或多个残基。插入突变体通常涉及在多肽的非末端位点处添加材料。取代是对现有氨基酸的改变。这些序列变体可能生成截短、点突变和移码突变。如本领域技术人员所知的，可通过这些突变生成合成肽。
还应理解，氨基酸序列变体可以包括另外的残基，例如另外的N-或C-末端氨基酸，但只要该序列符合上述标准(包括维持生物活性)，则仍基本上如本文公开的序列之一所列出的。
下面是基于改变蛋白质(例如本发明的肽或蛋白质)的氨基酸来创建突变、截短或修饰的蛋白质的讨论。例如，在肿瘤相关肽或蛋白质中，某些氨基酸可取代为其他氨基酸，从而产生更大的CTL免疫应答。因为蛋白质的相互作用能力和性质定义了蛋白质的生物功能活性，可以在蛋白质序列中进行某些氨基酸取代，以及在其潜在核酸编码序列中，从而产生突变、截短或修饰的蛋白质。
在进行这种变化时，可以考虑氨基酸的亲水性指数。本领域普遍理解了亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质以相互作用生物功能方面的重要性。人们认为，氨基酸的相对亲水性特征促成所得蛋白质的二级结构，进而限定了蛋白质与其他分子，例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。
本领域还理解，可以基于亲水性有效地进行类似氨基酸的取代。美国专利号4,554,101(通过引用并入本文)说明了受其邻近氨基酸的亲水性控制的蛋白质的最大局部平均亲水性与蛋白质的生物学性质相关。对氨基酸残基赋予了以下亲水性值：碱性氨基酸：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)和组氨酸(-0.5)；酸性氨基酸：天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、天冬酰胺(+0.2)和谷氨酰胺(+0.2)；亲水性非离子氨基酸：丝氨酸(+0.3)、天冬氨酸(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)和苏氨酸(-0.4)，含硫氨基酸：半胱氨酸(-1.0)和蛋氨酸(-1.3)；疏水性、非芳香族氨基酸：缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)和甘氨酸(0)；疏水性芳香族氨基酸：色氨酸(-3.4)、苯丙氨酸(-2.5)和酪氨酸(-2.3)。
据了解，氨基酸可以取代为具有类似亲水性的氨基酸并产生生物学或免疫学修饰的蛋白。在这种变化中，其亲水性值在±2以内的氨基酸的取代是优选的，在±1以内的氨基酸是特别优选的，且在±0.5以内的氨基酸是甚至更特别优选的。
如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到上述各种特征的示例性取代是本领域技术人员熟知的并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
其他组合物成分
在本发明的其它实施方案中，组合物可包含另外的免疫刺激剂或编码这类剂的核酸。免疫刺激剂包括但不限于另外的抗原、免疫调节剂、抗原呈递细胞或佐剂。在其它实施方案中，一种或多种另外的试剂共价结合至肽。其他免疫增强化合物也预期与本发明组合物一起使用，例如多糖，包括壳聚糖。多个(一个以上)表位或肽可彼此交联(例如，聚合)。
将小肽用于免疫或疫苗接种，通常也可能需要将肽与运载体肽、多肽或蛋白质缀合，从而赋予最终产物或靶肽或表位以免疫原性或最强免疫原性。因此，在本发明的一个实施方案中，FLQFKTWWI(SEQ ID NO：1)、RLIPYDWEI(SEQ ID NO：2)、KLIDCYTFL(SEQ ID NO：3)、YLSFIKILL(SEQ ID NO：4)、AMIPKDWPL(SEQ ID NO：5)、YAMSNLFSI(SEQ ID NO：6)和SMDDQLNQL(SEQ ID NO：7)中的每一种所选肽通过肽连接缀合或连接至赋予本发明缀合的产物或肽以免疫原性或最强免疫原性的肽、多肽或蛋白质(另外的氨基酸残基)。
在一个实施方案中，肽或表位FLQFKTWWI(SEQ ID NO：1)、RLIPYDWEI(SEQ ID NO：2)、KLIDCYTFL(SEQ ID NO：3)、YLSFIKILL(SEQ ID NO：4)、AMIPKDWPL(SEQ ID NO：5)、YAMSNLFSI(SEQ ID NO：6)和/或SMDDQLNQL(SEQ ID NO：7)存在于较长的肽或多肽中，尤其是HERV-K肽或多肽，并且优选地它是包含表位所来源的HERV-K中的表位的天然较长肽或多肽。因此，以序列SEQ ID NO：8-14为例呈现较长的序列。在一个变体中，几个表位是同一较长肽的部分。本发明还包括将那些较长的肽缀合至赋予缀合的终产物以免疫原性或最强免疫原性的肽、多肽或蛋白质中。
在根据本发明的免疫原性组合物或疫苗中，包含在其中或由载体(一种或多种)表达的肽具有免疫原性或能够诱导保护性免疫应答。
如果组合物或肽或表位用于诊断或测定目的，例如免疫监测，则肽或表位可以是抗原性的。因此，在组合物的一个实施方案中，肽或表位FLQFKTWWI(SEQ ID NO：1)、RLIPYDWEI(SEQ ID NO：2)、KLIDCYTFL(SEQ ID NO：3)、YLSFIKILL(SEQ ID NO：4)、AMIPKDWPL(SEQ ID NO：5)、YAMSNLFSI(SEQ ID NO：6)和/或SMDDQLNQL(SEQ ID NO：7)或者包含该表位的肽或表位是抗原性的。抗原肽或表位可呈非缀合形式(其由表位序列SEQ IDNO：1-7组成)或者可与肽或多肽部分缀合，如本文所公开的。
普通的技术人员将知道各种测定法以确定是否生成针对肿瘤相关肽的免疫应答。短语“免疫应答”包括细胞和体液免疫应答。各种B淋巴细胞和T淋巴细胞测定法是众所周知的，例如ELISA，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定法，例如铬释放测定法，使用外周血淋巴细胞(PBL)的增殖测定法，四聚体测定法和细胞因子产生测定法。参见Benjamini等人(1991)，在此通过引用并入。
佐剂
如本领域还公知的，特定免疫原组合物的免疫原性可通过使用免疫应答的非特异性刺激物(称为佐剂)来增强。一些佐剂影响抗原的呈递方式。例如，当蛋白质抗原被明矾沉淀时，免疫应答得到增强。抗原的乳化也延长了抗原呈递的持续时间。合适的分子佐剂包括所有可接受的免疫刺激化合物，例如细胞因子、毒素或合成组合物。
示例性的、通常优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(含有杀死的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的免疫应答的非特异性刺激剂)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。也可使用的其它佐剂包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、干扰素、GM-CSF、BCG、氢氧化铝、MDP化合物例如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂质A和单磷酰基脂质A(MPL)。也考虑RIBI，其含有在2％角鲨烯/吐温80乳液中的从细菌中提取的三种组分，MPL、海藻糖双霉菌酸(TDM)和细胞壁骨架(CWS)。甚至可以使用MHC抗原。
在一方面中，通过使用在磷酸盐缓冲盐水中以约0.05％至约0.1％溶液使用试剂(例如明矾)来实现佐剂效果。替代地，抗原作为与以约0.25％溶液使用的糖的合成聚合物
的混合物制成。佐剂效果也可通过在约70°至约101℃的温度范围内分别进行30秒至2分钟的热处理使抗原在疫苗中聚集而制成。也可使用通过以下的聚集，经胃蛋白酶处理(Fab)的白蛋白抗体重新激活，与细菌细胞(如细小梭状芽胞杆菌(C.parvum))、革兰氏阴性菌的内毒素或脂多糖成分混合，在生理上可接受的油媒介物(如mannide单油酸酯(Aracel A))中乳化，或用作为嵌段取代物的全氟化碳的20％溶液(Fluosol
)乳化。
一些佐剂，例如从细菌中获得的某些有机分子，作用于宿主而不是抗原。实例是胞壁酰二肽(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺[MDP])，一种细菌肽聚糖。MDP刺激巨噬细胞，但似乎也直接刺激B细胞。
在某些实施方案中，血蓝蛋白和血赤藓红蛋白也可用于本发明中。在某些实施方案中优选使用匙孔戚血蓝蛋白(KLH)，尽管可以使用其他软体动物和节肢动物的血蓝蛋白和血赤藓血红蛋白。
也可使用各种多糖佐剂。例如，已经描述了各种肺炎球菌多糖佐剂对小鼠抗体应答的使用。尤其优选多糖的多胺品种，例如壳多糖和壳聚糖，包括脱乙酰的壳多糖。
另一组佐剂是细菌肽聚糖的胞壁酰二肽(MDP，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺)组。还考虑胞壁酰二肽的衍生物，例如氨基酸衍生物苏氨酸-MDP和脂肪酸衍生物MTPPE。美国专利号4,950,645描述了胞壁酰二肽的亲脂性双糖-三肽衍生物，其描述用于由磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油形成的人工脂质体。
BCG(卡介苗，分支杆菌的减毒株)和BCG-细胞壁骨架(CWS)也可用作佐剂，含有或不含有海藻糖双霉菌酸。海藻糖双霉菌酸可以独自使用。由于其免疫刺激性质，BCG是一种重要的临床工具。
两亲性和表面活性的试剂，例如皂甙和衍生物，例如QS21(Cambridge Biotech)，形成与本发明免疫原一起使用的又一组佐剂。也可使用非离子嵌段共聚物表面活性剂。寡核苷酸是另一组有用的佐剂。Quil A和lentinen是可在本发明的某些实施方案中使用的其它佐剂。
另一组佐剂是解毒内毒素，如美国专利号4,866,034的精制的解毒内毒素。
本领域技术人员将知道可以缀合至根据本发明的细胞疫苗的不同种类的佐剂，并且这些佐剂包括烷基溶血磷脂(ALP)；BCG；和生物素(包括生物素化的衍生物)等等。某些特别考虑使用的佐剂是来自革兰氏细胞的磷壁酸。这些物质包括脂磷壁酸(LTA)、核糖醇磷壁酸(RTA)和甘油磷壁酸(GTA)。它们的合成对应物的活性形式也可结合本发明使用。
佐剂可由核酸(例如DNA或RNA)编码。涵盖这种佐剂也可以编码在编码抗原的核酸(例如，表达载体)中，或者编码在单独的载体或其他构建体中。编码佐剂的核酸可直接递送，例如与脂质体或脂质体一起递送。这种佐剂的一个例子是poly-ICLC。
表达载体
根据本发明的肽可在患者的身体中体内产生。
免疫原性组合物或疫苗可包含编码如上所述的一种或多种肽的RNA或DNA，使得肽在原位产生。RNA或DNA可存在于本领域普通技术人员已知的各种递送系统中的任何内，包括核酸表达系统(裸DNA或质粒、RNA载体)、细菌或病毒表达系统。合适的核酸表达系统包含用于在患者内表达的所需RNA或DNA序列(例如合适的启动子和终止信号)。细菌递送系统涉及施用细菌(如卡介苗)，所述细菌诱导多肽的免疫原性部分在其细胞表面上表达。在优选的实施方案中，可使用病毒表达系统(例如，牛痘或其他痘病毒、逆转录病毒或腺病毒)引入RNA或DNA，其可涉及使用非致病性(缺陷的)具备复制能力的病毒。将RNA或DNA并入此类表达系统的技术为本领域普通技术人员所熟知。DNA也可能是“裸的”，如例如Ulmer等人，Science 259:1745-1749(1993)所述，并由Cohen，Science 259:1691-1692(1993)综述。裸DNA的摄取可通过将DNA包被在可生物降解的珠上而得到增加，珠被有效地运输到细胞中。
优选的载体包括DNA载体、RNA载体、病毒载体例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘病毒例如牛痘病毒和减毒痘病毒例如Ankara(MVA)、NYVAC、ALVAC、TROVAC，其他病毒载体(例如辛德比斯病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒)，以及细菌载体。
术语“表达”根据本发明以其最一般的含义使用，并且包括例如通过转录和/或翻译产生RNA和/或肽或多肽。关于RNA，术语“表达”或“翻译”尤其涉及肽或多肽的产生。它还包括核酸的部分表达。此外，表达可以是瞬时的或稳定的。
有许多方法可以将表达载体导入细胞。在本发明的某些实施方案中，表达载体包含病毒或衍生自病毒基因组的工程化的载体。某些病毒通过受体介导的内吞作用进入细胞，整合到宿主细胞基因组中并稳定高效地表达病毒基因的能力使其成为将外源基因转移入哺乳动物细胞的有吸引力的候选。最早用作基因载体的病毒是DNA病毒，包括乳头多瘤空泡病毒(猿猴病毒40、牛乳头状瘤病毒和多瘤病毒)和腺病毒。
用于递送核酸的特定方法涉及使用腺病毒表达载体。尽管已知腺病毒载体整合到基因组DNA的能力低，但这些载体提供的高效基因转移抵消了这一特点。“腺病毒表达载体”意指包括那些含有足以(a)支持构建体的包装和(b)最终表达已克隆在其中的组织或细胞特异性构建体的腺病毒序列的构建体。对腺病毒(一种36kb的线性双链DNA病毒)的遗传组织的了解可以用多至7kb的外源序列取代大块的腺病毒DNA。
可使用腺病毒辅助转染将核酸引入细胞。据报道，在使用腺病毒偶联系统的细胞系统中提高了转染效率(Kelleher和Vos，1994；Cotten等人，1992；Curiel，1994)。腺相关病毒(AAV)是用于本发明疫苗中的有吸引力的载体系统。AAV具有感染性的广泛宿主范围。关于rAAV载体的生成和使用的细节在美国专利号5,139,941和4,797,368中描述，每个都通过引用并入本文。
由于逆转录病毒能够将其基因整合到宿主基因组中，转移大量外源遗传物质，感染广谱的物种和细胞类型，并被包装在特殊的细胞系中，因此有望是疫苗中的基因传递载体。为了构建逆转录病毒载体，将核酸(例如，编码目标抗原的核酸)插入病毒基因组中以代替某些病毒序列从而产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒粒子，构建含有gag、pol和env基因但不含LTR和包装组分的包装细胞系。当将含有cDNA连同逆转录病毒LTR和包装序列的重组质粒引入特定的细胞系(例如通过磷酸钙沉淀)时，包装序列允许将重组质粒的RNA转录物包装成病毒颗粒，然后分泌到培养基中。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地浓缩，并用于基因转移。
慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还含有其他具有调节或结构功能的基因。慢病毒载体在本领域是众所周知的(例如，参见美国专利号6,013,516和5,994,136)。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。慢病毒载体通过多次减弱HIV毒力基因而产生，例如，删除基因env、vif、vpr、vpu和nef使得载体在生物学上是安全的。
重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞，并可用于体内和离体基因转移和核酸序列的表达。例如，在美国专利号5,994,136中描述了能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中合适的宿主细胞被转染有两种或更多种携带包装功能(即gag、pol和env以及rev和tat)的载体，该专利通过引用并入本文。可以通过将包膜蛋白与用于靶向特定细胞类型的受体的抗体或特定配体连接来靶向重组病毒。例如，通过将目标序列(包括调控区)连同另一个编码特定靶细胞上受体的配体的基因一起插入病毒载体中，载体现在是靶特异性的。
免疫原性组合物或疫苗施用
为了杀死细胞、抑制细胞生长、抑制转移、减小肿瘤或组织大小以及以其他方式逆转或减少肿瘤细胞的恶性表型，使用本发明的方法和组合物一般将施用本发明的肽(或使其表达)来诱导能够识别和杀死所靶向的癌细胞的T细胞。施用途径自然会因病变部位和性质而异，并且包括例如皮内、经皮、肠胃外、静脉内、肌肉内、鼻内、皮下、经皮、气管内、腹膜内、肿瘤内、灌注、灌洗、直接注射和口服施用。
肿瘤内注射，或注射到肿瘤血管系统是特别考虑用于离散、实体、可及的肿瘤的。局部、区域或系统性施用也可能是适当的。对于>4cm的肿瘤，待施用的体积将为约4-10ml(优选地10ml)，而对于<4cm的肿瘤，将使用约1-3ml的体积(优选地3ml)。以单剂量递送的多次注射包含约0.1至约0.5ml体积。可通过向肿瘤施用间隔约1cm的多个注射来有利地接触病毒粒子。
在手术介入的情况下，本发明可在术前使用，以使不能手术的肿瘤接受切除。替代地，本发明可在手术时和/或之后用于治疗残余的或转移性疾病。例如，可对切除的肿瘤床进行注射或灌注包含肿瘤相关肽、多肽或编码其的构建体的制剂。在切除后可以继续灌注，例如，通过在手术部位留下植入的导管。定期的术后治疗也在设想之中。
在适当的情况下，也可应用连续施用，例如，在切除肿瘤并且治疗肿瘤床以消除残余的微观疾病的情况下。
通过注射器或导管递送是优选的。这种连续灌注可在开始治疗后进行从约1-2hr起至约2-6hr、至约6-12hr、至约12-24hr、至约1-2天、至约1-2周或更长时间的时段。通常，经由连续灌注的治疗组合物的剂量将等同于单次或多次注射所给予的剂量，在灌注发生期间的一段时间内进行调整。进一步考虑肢体灌注可用于施用本发明的治疗组合物，特别是用于治疗黑色素瘤和肉瘤。
治疗方案也可能有所不同，并通常取决于肿瘤类型、肿瘤位置、疾病进展以及患者的健康和年龄。显然，某些类型的肿瘤需要更积极的治疗，而同时，某些患者不能忍受更繁重的方案。临床医生将最适合根据治疗配方的已知功效和毒性(如果有的话)作出此类决定。
药物免疫原性或疫苗组合物的有效量通常被定义为足以可检测和重复地缓解、减少、最小化或限制疾病或病况或其症状的程度的量。对疫苗组合物可应用更严格的定义，包括消除、根除或治愈疾病。
在某些实施方案中，治疗中的肿瘤可以至少在最初是不可切除的。用治疗性病毒构建体进行治疗可能由于边缘的收缩或通过消除某些特别侵袭的部分而增加肿瘤的可切除性。治疗后，切除可以成为可能。切除后的另外治疗将用于消除肿瘤部位的微观残留疾病。
对于原发性肿瘤或切除后肿瘤床，一个典型的治疗过程将涉及多个剂量。施用的肽的治疗有效每日量(根据本发明的一种肽或多种肽的总量)可在0.01mg至10mg的范围内，尤其是0.025mg至5.0mg，或在0.025mg到1.0mg的范围内。
治疗可包括各种“单位剂量”。单位剂量定义为含有预定量的治疗组合物。待施用的量，以及特定途径及配方在临床技术人员的技术范围内且可根据组合物的性质(作为肽组合物或表达载体组合物)而变化。单位剂量无需作为单次注射施用，但可包括在设定时间段内的连续输注。本发明的单位剂量可以方便地用病毒构建体的噬菌斑形成单位(pfu)来描述。单位剂量范围为103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013pfu及更高。替代地，根据载体的种类和可获得的滴度，将1至100、10至50、100至1000或多至约1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014或1×1015或更高的传染性病毒颗粒(vp)递送至患者或患者的细胞。
附图说明
图1：A.TNBC中过表达的19种HERV亚型的表达与免疫签名的相关性，显示与抗原呈递、细胞毒性和免疫调节途径的相关性；每个点(浅灰色或深灰色)指示正相关性；B.例如，HERV-K 10表达与T细胞签名的相关性。
图2：A.未经或经CMV pp65肽刺激(分别地，上象限)以及未经或经HERV肽P5刺激(分别地，下象限)的CD8+ T细胞的dextramer染色的代表性图。B.在几个供体的PBMC上，未经或经特定HERV肽(P1至P7–SEQ ID NO：1至7)或对照刺激，在第12天的dextramer阳性CD8+T细胞的百分比。
图3：A.与用阴性和阳性对照(上象限)和HERV肽P1、P2、P3(SEQ ID NO：1、2和3)(下象限)脉冲的T2细胞接触后，由CD8+ T细胞产生IFN-γ的代表性图。B.未经或经特定HERV肽(P1、P2和P3(SEQ ID NO：1、2和3)或对照刺激，在几个供体的PBMC上在第12天的IFN-γ阳性CD8+ T细胞的百分比。
图4:A.未经或经CMV pp65肽(分别地，上象限)以及未经或经HERV肽P1(SEQ IDNO：1)(分别地，下象限)刺激的CD8+ T细胞的dextramer染色的代表性图。
B.第12天在几个供体的PBMC上，肽刺激条件下对比非刺激(P1至P7–SEQ ID NO：1至7)的dextramer阳性特异性CD8+ T细胞的百分比之间的倍数变化比率。
C.刺激12天后和接触用同类肽脉冲的T2细胞24小时后，IFN-γ+和颗粒酶β+斑点的数量的代表性直方图。
图5:A.在供体a上，CD8+ T细胞与用阴性和阳性对照物(上象限)以及HERV肽P1、P2、P3(SEQ ID NO：1至3)(下象限)脉冲的T2细胞接触后产生IFN-γ的代表性图；
A(续).对于供体b，CD8+ T细胞与用阴性和阳性对照(上象限)以及HERV肽P4、P5、P6和P7(SEQ ID NO：4至7)(下象限)脉冲的T2细胞接触后产生IFN-γ的代表性图；
B.在几个供体的PBMC上，未经或经特定HERV肽(P1至P7–SEQ ID NO：1至7)或对照刺激，在第12天的IFN-γ阳性CD8+ T细胞的百分比。
图6:A.特异性P1 CD8+ T细胞(右象限)及其阴性对应物(左象限)分选和扩增后，针对P1(SEQ ID NO：1)的dextramer染色的代表性图。
B.P1(SEQ ID NO：1)特异性CD8+ T细胞与用P1或阴性对照(没有带电肽)脉冲的T2细胞培养24小时后，IFN-γ+和颗粒酶β+斑点的数量的代表性直方图。
C.在MDA-MB-231细胞系(用目标肽脉冲或不脉冲)与P1(SEQ ID NO：1)特异性CD8+T细胞或其阴性对应物的共培养中，实时细胞死亡定量的代表性曲线。
D.与用或不用目标肽脉冲的MDA-MB-231细胞系共培养6h后，P1(SEQ ID NO：1)特异性CD8+ T细胞(黑色)相比于其阴性对应物(非特异性CD8+T细胞，白色)的IFN-γ的细胞内染色(PE)百分比的代表性直方图。加入HLA-A2阻断抗体作为对照。
图7：A.在从TNBC撕裂物扩增的CD8 T细胞中发现的dextramer阳性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的代表性模式(黑色象限)。P1至P7(SEQ ID NO：1至7)代表肽1至7的dextramer，TNBC 1至4代表4个不同的患者B。在从卵巢肿瘤撕裂物扩增的CD8 T细胞中发现的dextramer阳性TIL的代表性模式(黑色象限)。P1至P7(SEQ ID NO：1至7)代表肽1至7的dextramer，卵巢1至3代表3个不同的患者。
现在将参考附图使用非限制性实施例来描述本发明。
实施例：
HERV序列的鉴定
从Genbank数据库中提取了不同家族(包括HERV-K、HERV-H、HERV-W、HERV-E和ERV3)的HERV DNA序列。使用BLAST将这些序列定位在人基因组(GRCH37)上，在至少85％的查询序列上保持位置有至少98％的相似性且无缺口。因此鉴定出66个功能性HERV序列。
TNBC中HERV序列的分析
在包含42个TNBC的84份乳腺癌样品的现有数据库中分析了HERV表达。与56份正常乳腺样品(51份瘤周围样品和5份哺乳动物缩减样品)比较。从新鲜的肿瘤活检样品中提取RNA，进行DNA酶处理和poly A选择。如果表现出足够的质量(RNA完整性数>6.5)，则功能性HERV序列与RNAseq数据进行比对。
对66种人类内源性逆转录病毒(HERV)亚型进行了多组分分析。表达了42种HERV。19种HERV相对于正常组织和ER+亚型特异性表征了三阴性乳腺癌(TNBC)：HERVK_10、17、22、7、6、21、25、11、20、16、23、1、5；HERVH_4，7；和HERV3_1。
肽选择与合成
在参考基因组上的读段比对后，鉴定了19个过表达的HERV之间共有的Gag和Pol中共同区域。使用不同的表位预测工具(NetMHC I&II)，鉴定了最常见的MHC I和II等位基因的潜在强表位结合物。其中，选择并合成了HLA-A*0201的7种预测的9聚体强结合物：4种Gag和3种Pol肽(JPT peptide technology,Berlin,Germany)。肽鉴定由销售商通过质谱法确认。预期纯度>95％，并通过高效液相色谱法测定。将冻干的肽溶于＜5％DMSO的去离子水中，等分并在-20℃保存直至使用。
鉴定和分析了29聚体GMX肽(SEQ ID NO：8-14)以进行合成，其包含I类MHC的9聚体肽强结合物(SEQ ID NO：1-7)，加上II类基序的侧序列(每侧10聚体，除了对于肽SEQ IDNO：12，其中序列SEQ ID NO：5在C末端)。
HERV表达与T细胞签名之间相关性的生物信息学分析
使用了不同的签名来评估肿瘤的免疫特性：MCP counter签名(参考https://cit.ligue-cancer.net/？p＝1338&lang＝en)用于T细胞、CD8 T细胞、NK细胞、细胞毒性淋巴细胞，以及成纤维细胞、嗜中性粒细胞和内皮细胞用于对照分析；Estimate软件包(https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/index.html)用于ImmuneScore，StromalScore；Immunophenogram15用于效应细胞，免疫调节剂(免疫检查点)，抑制细胞(调节性T细胞和MDSC)。还将评估特定基因(如OCT4、TRIM28、SETDB1)以及EMT签名(SSGSEA和Jean-Paul Thierry签名)以及与肿瘤亚型特异性相关的签名。这些签名和HERV之间的相关性将使用经典的统计方法进行分析。图1A显示了19种HERV与作为抗原呈递相关的、细胞毒性或免疫调节签名的特定免疫签名之间的显著相关性。例如，HERV-K 10表达与乳腺癌中的T细胞签名密切相关(图1B)。
PBMC培养用于特定CD8+HERV+刺激
来自HLA-A2供体的PBMC在AIM-V培养基(Thermo Fisher Scientific)中培养12天，其中补充有5％AB人血清(来自EFS Lyon的5个供体的集合，过滤)和20UI/mL IL-2(PROLEUKIN aldesleukine，Prometheus，Vevey，Switzerland)富含5μg/mL的R848(InvivoGen,San Diego,USA)和10μg/mL的Poly-IC(InvivoGen)和目标肽(10μM)。在U形底96孔板中进行培养，每孔1.5x105个细胞，每种肽条件下进行20个孔。更换100μL培养基，并富集R848、Poly-IC、IL-2和目标肽(序列SEQ ID NO：1-7的肽)，以在第3天达到相同的终浓度。仅在第6天和第10天添加IL-2和目标肽。在dextramer实验中，将阳性对照与0.1μg/mL的PP65(JPT肽技术)一起培养，其为由MHC I类呈递并特异性刺激CD8+ T细胞的CMV肽。对于IFN-y实验，使用0.4μg/mL CEF肽(Mabtech)，包含来自人CMV、EBV和流感病毒的23种MHC I类限制性病毒肽的集合，这些肽刺激CD8+ T细胞优先地合成IFN-y。
Dextramer测定和分选
在第12天，将来自相同条件的细胞汇集在聚丙烯试管中，用2mL的FACS缓冲液洗涤并重悬于FACS缓冲液中。在室温在黑暗中，将条件用10μL相应的dextramer(Immudex，Copenhague，Danemark)染色15分钟。以1/400使用Zombie近红外(NIR)可固定活力试剂盒(Zombie NIR，biolegend，Paris,France)来评估活力。然后将抗CD3(BV421，Biolegend)和抗CD8(FITC，Beckman coulter，Brea，USA)抗体添加到每种条件中(图2的测定法中为1/10，图4中为1/25)，并在4℃黑暗中静置20分钟。然后将细胞用2ml的FACS缓冲液洗涤两次，并重悬于350μL的FACS缓冲液中直至分析。在FACS Fortessa(BD)上进行分析以区分多聚体特异性HERV CD8+ T细胞。
图2A中的结果显示了在非特异性(左图)和特异性(右图)肽脉冲的PBMC中被dextramer染色的群体。在上方图中，用来自CMV的阳性对照pp65肽刺激后，多至72％的CD8+T细胞为阳性，而未刺激的PBMC中则为2.02％(表明由于先前的感染，可能存在针对CMV的记忆T细胞)。有趣的是，用HERV肽(例如下方图的SEQ ID NO：5)刺激的PBMC产生了34.2％的dextramer阳性CD8+ T细胞，而在未刺激的条件下为0.04％。在四个不同的供体上获得的结果总结在图2B中。
图4A中的结果显示了在非特异性(左图)和特异性(右图)肽脉冲的PBMC中被dextramer染色的群体。在上方图中，用来自CMV的阳性对照pp65肽刺激后，多至23.40％的CD8+ T细胞为阳性，而未刺激的PBMC中则为3.63％(表明由于先前的感染，可能存在针对CMV的记忆T细胞)。有趣的是，用HERV肽(例如，下方图的SEQ ID NO：1)刺激的PBMC产生了0.63％的dextramer阳性CD8+ T细胞，而在未刺激的条件下为0.091％。在12个不同供体上获得的结果汇总在图4B中，显示P1、P4和P6(例如SEQ ID NO：1、4、6)的dextramer阳性CD8+T细胞显著增加，而P2和P3(例如SEQ ID NO：2，3)程度轻微。
培养12天后，使用经过肽刺激的PBMC进行针对IFN-γ和颗粒酶β的ELISPOT测定法(图2C)。将每孔2.105个细胞与特异于目的肽的T2细胞以10∶1的比例共培养。ELISPOT在24小时后显示出针对P1和P6(例如SEQ ID NO：1、6)的特异性IFN-γ和颗粒酶β斑点。
用T2细胞接触的细胞毒性测定
在PBMC培养的第12天，将T2细胞在RPMI中洗涤并重悬于AIM-V培养基(ThermoFisher Scientific)中。T2(SD细胞系)是一种在抗原加工(TAP)蛋白相关的转运蛋白中有缺陷的淋巴母细胞系，因此不能在I类MHC上呈递内源肽，但可用于监测在非竞争性环境中对目标外源抗原的CTL应答。首先通过在37℃向2M T2细胞中添加10μg/mL的相应肽达2小时，用HERV肽对T2细胞进行脉冲。汇集PBMC并计数，并将其与相应的T2细胞以1∶5的相应浓度在新的96U孔板中共培养。
在37℃孵育4小时后，将共培养的细胞洗涤并根据其在FACS缓冲液中的染色条件汇集在V型孔板中。以1/400使用Zombie NIR(Biolegend)评估活力。将1/10的抗CD3(PercP，Biolegend)和抗CD8(FITC，Beckman coulter)抗体加入到每种条件，并在4℃放置25分钟。再次洗涤细胞，并然后按照制造商的说明，用固定/通透溶液试剂盒(Invitrogen，Carlasbad，USA)在室温固定15分钟。将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次并保持在4℃。
在第13天，在室温用透化溶液试剂盒(Invitrogen)透化细胞5分钟，并将1/20的抗IFN-γ(PE，Biolegend)抗体加入溶液中在4℃另外25分钟。将细胞洗涤两次并在FACS分析之前重悬于350μL的FACS缓冲液中。在FACS Fortessa(BD)上进行了分析，以研究针对表达HERV序列的T2细胞的特异性细胞毒性和脱粒作用。
图3A中的结果显示，针对未脉冲的(P0：左上图)，用不同肽(Pneg：上中图)或用每种同类肽(阳性对照Ppos：上/右图，SEQ ID NO 1、2和3的HERV肽在下方图)脉冲的T2细胞的经刺激CD8+ T细胞的IFN-y产生；结果显示针对表达HERV肽的T2细胞的特异性IFN-γ产生。5个不同供体的结果总结在图3B中，显示在用P1(SEQ ID NO：1)刺激的CD8+ T细胞中有～10％(中位)和在用P2或P3(SEQ ID NO：2和3)刺激的CD8+ T细胞中有～5％(中位)产生IFN-y。
图5A中的结果显示，针对未脉冲的(P0：供体a和供体b象限的左上图)，用不同的肽脉冲(Pneg：供体a和供体b两者象限的中上图)，或用每种同类肽脉冲(阳性对照Ppos：上/右图，下方图SEQ ID NO 1至3的HERV肽用于供体a和下方图SEQ ID NO 4至7的HERV肽用于供体b)的T2细胞的经刺激CD8+ T细胞的IFN-y产生；结果显示针对表达HERV肽的T2细胞的特异性IFN-γ产生。12个不同供体的结果总结在图5B中，显示了在用P1(SEQ ID NO：1)、P2和P3(SEQ ID NO：2和3)刺激的显著数量CD8+ T细胞中和在用P6(SEQ ID NO：6)刺激的中等数量CD8+ T细胞中产生IFN-γ。
P1特异性CD8+
T细胞的细胞毒性
通过FACS Aria(BD)对dextramer染色的细胞进行分选，以从非特异性对应物中分离出肽特异性CD8+ T细胞。收集两个级分并在96圆孔板中的饲养细胞上分别扩增14天。在第14天评估特异性对比非特异性级分的纯度(图6A)，导致阳性级分中＞90％的dextramer阳性CD8+ T细胞对比阴性级分中＜5％。这些细胞用于细胞毒性实验。
通过ELISPOT测定法(Cellular technology limited，CTL)评估分选和扩增的CD8+ T细胞的细胞毒性潜力。将4.104个P1特异性CD8+ T细胞与预先用肽P1脉冲的T2细胞共培养。计数的斑点数量表明，与阴性对照相比，P1特异性CD8+ T细胞对用同类肽脉冲的靶细胞产生IFN-γ和颗粒酶-β(两种细胞因子均为～800个斑点)(图6B)。这些实验表明，这些细胞是特异性和功能性的。
在细胞系HMEC(HLA-A2人乳腺上皮细胞)和MDA-MB-231(HLA-A2三阴性乳腺癌细胞系)上进行的HERV表达的计算机分析，显示了与HMEC相比，在MDA-MB-231细胞系中HERV的过表达。
HLA-A2 TNBC细胞系MDA-MB-231用作实时分析被P1特异性CD8+ T细胞诱导的细胞死亡的靶标。将5.103个MDA-MB-231细胞用肽P1脉冲或不脉冲，并使其粘附在96孔板中。粘附后，将P1 CD8+ T细胞或它们的阴性对应物(对照)添加到孔中。共培养是在Cytotox绿色染料(Essenbioscience)存在下进行的，该染料在质膜完整性下降时进入细胞，结合脱氧核糖核酸(DNA)后荧光增加100-1000倍。与它们的阴性对应物相比，当MDA-MB-231与P1特异性T细胞共培养时，动力学显示出细胞死亡的非常显著增加。如预期的那样，当靶标MDA-MB-231细胞用P1脉冲并与P1特异性T细胞共培养时，观察到细胞死亡进一步增加(可能是由于靶标细胞上HLA-肽1复合物的数量的增加)(图6C)。
此外，在P1特异性CD8+ T细胞或其阴性对应物与MDA-MB-231 HLA-A2 TNBC细胞系之间共培养6小时后，通过FACS对IFN-γ进行了细胞内染色(图6D)。结果显示，与用阴性对应物的共培养物相比，当P1特异性细胞处于共培养物中时，产生IFN-γ的细胞百分比增加。当MDA-MB-231事先用P1脉冲时，该百分比会略有增加。抗HLA-A2特异性阻断抗体的使用可以逆转此效应，证明其特异性。
总而言之，这些实验表明，P1特异性CD8+ T细胞特异性地识别呈递同类肽的靶细胞(在本实验中为T2细胞)并对其起作用，并且特异性地识别并杀死表达内源性HERV衍生抗原的肿瘤细胞(本实验中为MDA-MB-231 TNBC细胞系)。
TNBC和卵巢癌的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的dextramer染色
将肿瘤切成小块，并用胶原酶IV和DNAse消化45分钟。将获得的细胞重悬于5％人血清RPMI中并分布在96孔中(每孔5.104个细胞)。在存在IL-2(F.C.100IU/ml)的情况下，将抗CD3/CD28微珠(Miltenyi biotech)与细胞以1:4的比例添加到孔中。通过在第5、7、9和12天更换培养基将TIL培养14天，并将细胞数调整为.5×106个细胞/ml。
在第14天，对7种目标肽(P1至P7–SEQ ID NO：1至7)进行了dextramer染色(参见dextramer测定法段落)，并通过TNBC(图7A)和卵巢癌(图7B)中的FACS分析鉴定了dextramer特异性CD8+ T细胞。结果表明，可以在肿瘤中发现针对所有目标肽的特异性CD8+T细胞，并且根据样品的不同而有所差异。这证实了肽的体内免疫原性，并表明这些肽可以自然加工并可以在肿瘤发展过程中引发可检测的免疫应答。对P1和P6具有特异性的CD8+T细胞在肿瘤中更为常见，并且是作为疫苗或免疫原性组合物的基础选择的肽。这些结果还有利于几种肽的组合，以提供可用于关于该反应性处于未知状态的患者中的疫苗或免疫原性组合物，且优选包含P1和/或P6。
Claims (13)
1.一种组合物，其包含
-2、3、4、5、6或7种肽，或者在体内诱导所述2、3、4、5、6或7种肽的表达的一种或多种表达载体，所述肽具有9至100个氨基酸残基，每一种包含序列SEQ ID NO：1-7的表位中的至少一个，并且每一种肽相对于其他肽包含至少一个不同的表位；或者
-至少一种肽，或在体内诱导所述至少一种肽的表达的表达载体，所述肽具有9至100个氨基酸残基并包含序列SEQ ID NO：1-7的表位中的2、3、4、5、6或7种；
和药学上可接受的媒介物或赋形剂。
2.权利要求1的组合物，其包含或表达一种或多种包含序列SEQ ID NO：1和/或6的表位的肽。
3.权利要求1或2的组合物，其包含或表达3、4、5、6或7种包含序列SEQ ID NO：1至7的表位的肽。
4.权利要求1的组合物，其中所述肽包含9至100、70、50、40、30、25或20个氨基酸残基和序列SEQ ID NO：1至7的所述表位中的至少一个。
5.权利要求4的组合物，其中9至100、70、50、40、30、25或20个氨基酸残基的每一种肽包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6或7中的一个特定表位。
6.权利要求1至5中任一项的组合物，其中所述一种或多种肽包含HERV gag或pol的9至100、70、50、40、30、25或20个连续的氨基酸残基，包括序列SEQ ID NO：1至7的所述表位中的至少一个。
7.权利要求1至5中任一项的组合物，其中所述一种或多种肽包含HERV gag或pol的13、14、15、16、17或18个连续的氨基酸残基，包括序列SEQ ID NO：1至7的所述表位中的至少一个。
8.权利要求1的组合物，其中所述肽选自由SEQ ID NO：8-14组成的组并且组合物包含它们的2、3、4、5、6或7种。
9.权利要求1的组合物，其中所述肽由序列SEQ ID NO：8-14的9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个连续氨基酸残基组成，包括9聚体表位，并且组合物包含它们的2、3、4、5、6或7种。
10.疫苗或免疫原性组合物，其包含权利要求1至9中任一项的组合物和药学上可接受的媒介物或赋形剂以及优选地佐剂。
11.组合物，其包含用权利要求1至9中任一项所述的肽处理的患者的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，或包含识别权利要求1-7中任一项所述的肽的T细胞受体(TCR)工程化的T细胞，和药物媒介物。
12.权利要求1至11中任一项的组合物，用于治疗癌症，特别是乳腺癌，包括三阴性乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肉瘤、畸胎癌、膀胱癌、肺癌(非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、头颈癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤和白血病。
13.分离的肽，其选自由序列SEQ ID NO：2-14的肽组成的组，并且肽具有10至100、70、50、40、30、25或20个氨基酸且包含SEQ ID NO：2-7的所述肽的至少一种。
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