CN112225797B - 一种抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白的单克隆抗体及应用 - Google Patents

一种抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白的单克隆抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗SARS‑CoV‑2核衣壳蛋白的单克隆抗体及应用。所述单克隆抗体包括轻链和重链，其特征在于，轻链的可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为RASENIYSSLA、VATDLA和QHFWGTPWT；重链的可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为TDHYII、EIYPGNGHTYYNERFKG和SRYYGPFAYWG。本发明抗SARS‑CoV‑2核衣壳蛋白的单克隆抗体为IgG1亚型，抗体的亲和力可达5.28×10‑11，免疫能力强，具有稳定性好，活性高、亲和力强等优点，检测特异性强、灵敏度高、准确性好，可以用于全自动免疫分析仪的试剂盒中，也应用于免疫层析试纸条检测SARS‑CoV‑2核衣壳蛋白，能够有效推动SARS‑CoV‑2检测的推广与应用。

Description

一种抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白的单克隆抗体及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白的单克隆抗体及应用。
背景技术
新型冠状病毒肺炎是由严重急性呼吸系统综合症2型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的新型呼吸系统疾病。SARS-CoV-2是第七种能够感染人类具有包膜的正链RNA病毒。SARS-CoV-2的基因组学鉴定表明它是一种双核病毒，与蝙蝠冠状病毒RaTG13的同源性为96%，但不同于SARS-CoV。SARS-CoV-2有与SARS-CoV相似的受体结合域（RBD）结构。SARS-CoV-2功能性的开放阅读框（ORF）包括ORF1a和ORF1b，主要的结构蛋白包括刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N）。根据已有的研究，M和E蛋白为病毒组装所必须。S蛋白与病毒黏附宿主细胞相关，其中S蛋白的RBD结构介导了与血管紧张素酶2的相互作用。S蛋白定位在病毒颗粒的表面，并具有高度的免疫原性。N蛋白病毒的主要结构之一，与病毒RNA的转录和复制有关，其功能为包装病毒的基因组形成病毒粒子和干扰细胞的循环过程。在许多冠状病毒中，包括SARS-CoV，N蛋白都具有很高的免疫原性并在感染期间被大量表达。因此S蛋白和N蛋白是COVID-19血清学诊断潜在的抗原。
目前，COIVD-19的诊断主要通过实时定量PCR（RT-PCR）检测病毒的RNA。研究显示SARS-CoV-2主要感染下呼吸道，通过鼻咽拭纸和支气管的样本检测。然而下呼吸道样本的采集需要专门的装置和专业的技术人员。既往研究表明，RT-PCR确诊患者的痰液样本的阳性率为74.4%-88.9%；鼻拭纸样本额阳性率为53.6%-73.3%；发病后大于8天的咽拭纸检测阳性率极低。由于病毒主要感染位置在下呼吸道，采集的不同呼吸道样本引起了很高的阴性率。因此，迫切需要一种准确、高效的检测方法对有疑似症状的患者进行评估。
公开号为CN111187354A的发明公开了一种胶体金捕获法检测SARS-CoV-2抗体的检测试纸，包括底板、样品垫、结合垫、包被膜和吸收垫，沿待测液体样本流动方向，样品垫、结合垫、包被膜和吸收垫依次固定于底板上；结合垫负载有金标蛋白，金标蛋白包括nCOVAg01；包被膜设有检测区和质控区，检测区负载有鼠抗人IgM/IgG抗体，质控区负载有羊抗兔多抗；nCOVAg01包括所述的重组抗原。
公开号为CN111426844A的发明公开了一种新型冠状病毒SARS-CoV-2 IgG-IgM抗体联检的荧光免疫层析试纸条，该试纸条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾衔接粘贴在底板上，结合垫上包被有SARS-CoV-2结构蛋白-标记物和羊抗兔IgG-标记物，硝酸纤维素膜上设有包被鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、包被鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2和包被兔IgG的质控线C。
上述两篇现有技术中均是用于检测人血清中是否含有抗SARS-CoV-2的抗体，而体内抗体水平可能是由于之前感染过SARS-CoV-2，所以，无法用于作为实时的诊断方式。
血清学诊断是一种筛选病原体的精确且高效的方法，具有样本一致性好的优点。单克隆抗体为血清学诊断提供了有力的支持，在血清学诊断上具有特异性好、灵敏度高的优点，用于检测样本中是否含有SARS-CoV-2，能够为新型冠状病毒肺炎的防控提供准确、快速的诊断手段。
公开号为CN111303254A的发明公开了一种抗SARS-CoV-2的抗体，所述抗体特异性地与所述的抗原结合；所述抗体为单克隆抗体；采用由SEQ ID NO.2-SEQID NO.11中任一种所示氨基酸序列组成的蛋白质作为抗原，与佐剂制备免疫原，免疫动物后得到抗体。然而，该文件中全文均未提供抗体的具体信息，也即该现有技术中并未实际制备相应的抗体。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白的单克隆抗体及应用。
一种抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白的单克隆抗体，包括轻链和重链，轻链的可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为RASENIYSSLA、VATDLA和QHFWGTPWT；重链的可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为TDHYII、EIYPGNGHTYYNERFKG和SRYYGPFAYWG。
优选的，所述的单克隆抗体，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选的，所述单克隆抗体为全长 抗体、Fab抗体或F(ab’) 2抗体。
本发明又提供了编码所述单克隆抗体的基因。优选的，编码轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO. 2所示；编码重链可变区的基因序列如SEQ ID NO. 3所示。
本发明又提供了所述单克隆抗体在制备用于检测SARS-CoV-2的试剂盒中的应用。优选的，所述的应用中，检测方式为血清学检测。
本发明还提供了一种用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，包括所述单克隆抗体。优选的，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒或使用免疫层析试纸条的免疫层析诊断试剂盒。更优选的，所取待检测样本为静脉血。
本发明抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白的单克隆抗体为IgG1亚型，抗体的亲和力可达5.28×10-11，免疫能力强，具有稳定性好，活性高、亲和力强等优点，检测特异性强、灵敏度高、准确性好，可以用于全自动免疫分析仪的试剂盒中，也应用于免疫层析试纸条检测SARS-CoV-2核衣壳蛋白，能够有效推动SARS-CoV-2检测的推广与应用。
附图说明
图1为实施例1中诱导SARS-CoV-2-N蛋白的SDS-PAGE分析图；M：蛋白Marker。
图2为实施例1中纯化SARS-CoV-2-N蛋白的SDS-PAGE分析图。
图3为实施例2中单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图；M：蛋白Marker，1：N10，2：N15。
图4为实施例3中单克隆抗体的效价检测图。
图5为实施例4中单克隆抗体亚型鉴定图。
图6为实施例5中抗体亲和力测定图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。
实施例1：SARS-CoV-2-N重组蛋白的制备
N蛋白基因序列如SEQ ID NO：1所示，设计引物如下：
N-F：5’-GCCGGATCCATGTCTGATAATGGACCCCAAAA-3’（带有BamHI酶切位点）；
N-R：5’-GCCGTCGACAGGCCTGAGTTGAGTCAGCAC-3’（带有SalI酶切位点），
采用上述引物，以人工合成的N蛋白基因为模板进行PCR，产物用BamHI和SalI限制性内切酶进行双酶切之后，插入到用相同两个酶切处理的pET-28a(+)原核表达载体，获得插入有N蛋白基因序列的重组质粒pET28a-SARS-CoV-2-N。
将测序验证正确的pET28a（+）-SARS-CoV-2-N表达载体质粒转化至大肠杆菌BL21中，涂布于含100μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落，用含有相同浓度的硫酸卡那霉素的300ml LB培养基37℃培养至OD600达0.6左右，用终浓度为0.4~1mM的IPTG进行诱导表达，诱导条件为25-37℃，转速250rpm，5-8h。诱导之后，将培养液4℃7000rpm离心10min收集菌体。取1mL培养液离心后加入上样缓冲液煮沸10min，离心去除细菌碎片。取上清液进行SDS-PAGE分析，SARS-CoV-2-N融合蛋白以包涵体的形式表达，结果如图1所示，显示获得较高纯度的融合蛋白。
菌体沉淀用包涵体结合缓冲液溶解，使用蛋白纯化镍柱纯化重组SARS-CoV-2-N蛋白，用不同浓度的尿素溶液洗脱收集，SDS-PAGE检测显示用300mM咪唑洗脱时进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图2所示，在45KDa处出现浓度较高的单一目的蛋白条带。
将纯化后的重组蛋白用透析缓冲液于4℃透析，每隔12h换一次透析液。取出透析后的蛋白液，经聚乙二醇-20000进行浓缩，于-20℃保存备用。
实施例2：SARS-CoV-2-N单克隆抗体的制备
以重组抗原SARS-CoV-2-N蛋白为免疫原，首次免疫时，将50-100μg/只重组抗原SARS-CoV-2-N蛋白与等体积的完全弗氏佐剂共同乳化，于BALB/c小鼠背部皮下进行多点注射免疫。第二次、第三次使用50-100μg/只重组抗原SARS-CoV-2-N蛋白与等体积的不完全弗氏佐剂共同乳化，免疫间隔为15d。在免疫三次后，于小鼠的尾部静脉采血，分离血清并采用间接ELISA检测小鼠血清抗重组抗原SARS-CoV-2-N蛋白的效价。
在细胞融合前7d于小鼠腹腔注射50-100μg/只重组抗原SARS-CoV-2-N蛋白，进行加强免疫。融合前一天准备饲养层细胞，取健康小鼠一只分离脾脏，制作细胞悬液，均匀铺于细胞板中静置培养过夜使其贴壁。融合当天于无菌环境分离免疫老鼠的脾脏，制备细胞悬液于IMDM培养基中混匀。将状态良好的SP2/0细胞与小鼠脾细胞1：5~1：10混合，用于37℃预热的无血清的IMDM培养基洗涤混合细胞3次，弃去洗涤液，于37℃加入PEG1500使细胞进行融合。融合后的细胞离心后加入80mL培养液（IMDM 62mL、HAT 2mL、胎牛血清16mL），轻柔混匀后，加入铺有饲养层细胞的96孔板中，于培养箱中培养。在融合11d时，对有杂交瘤细胞生长的培养孔的上清通过间接ELISA进行效价检测，获得两株阳性值最高的杂交瘤细胞株N10和N15。通过有限稀释法对ELISA检测阳性孔进行3次亚克隆，将杂交瘤细胞株扩大培养，于液氮保存。
选取8-10周龄的BALB/c小鼠腹腔注射石蜡油，一周后分别接种复苏后的杂交瘤细胞，接种量为1×106/只。待小鼠腹部明显膨大，用无菌针筒抽取小鼠腹水，离心后收集腹水。利用饱和硫酸铵溶液沉淀粗提单克隆抗体，并进行经SDS-PAGE电泳鉴定抗体纯度，结果如图3所示，编号N10和N15的两株单克隆抗体在55KDa和25KDa处清晰的出现了两条目的条带，表明成功制备了较高纯度的抗SARS-CoV-2-N单克隆抗体。
实施例3：间接法ELISA法检测单克隆抗体效价
将实施例1中纯化的SARS-CoV-2-N蛋白以1μg/ml，100μl/孔包被酶标板，置于4℃孵育过夜。用PBST洗净ELISA板，加入200μl/孔5％的脱脂奶粉，于37℃封闭2h。洗板后，加入倍比稀释浓度的实施例2中的单克隆抗体，分别为1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000、1∶256000、1∶512000、1∶1024000，100μl/孔，置于37℃孵育1h。洗板后，加入适当稀释度的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，置于37℃孵育1h。加入TMB显色底物100μl/孔反应10min，加入50μl 2mol/L硫酸终止液终止反应，酶标仪于450nm处，读取各孔OD值。检测结果如图4所示，编号N10和N15的抗SARS-CoV-2-N蛋白单克隆抗体效价分别可达到512000和1024000，抗体灵敏度高。
实施例4：抗SARS-CoV-2-N蛋白单克隆抗亚型测定
使用ELISA快速定性试剂盒（试剂号：062020，江苏宝莱酶免生物科技有限公司）鉴定单克隆抗体的类型，结果如图5所示，编号N10和N15的抗SARS-CoV-2-N单克隆抗体重链鉴定结果显示，两种单克隆抗体均为IgG1亚类。
实施例5：抗体亲和力测定
重组抗原SARS-CoV-2-N蛋白稀释后进行生物素标记，用脱盐柱脱去未结合的生物素后，将SA传感器末端润湿后置于处理好的上述抗原中进行固化。将待测抗SARS-CoV-2-N单克隆抗体用PBS稀释至浓度为0.3125nmol/L，0.625nmol/L，1.25nmol/L，2.5nmol/L，5nmol/L，10nmol/L，20nmol/L，每组样品总体积200μL。将稀释后的待测抗SARS-CoV-2-N单克隆抗体样品和空白对照置于96孔板中，采用ForteBio Octet Red生物分子互作仪对待检样品进行检测。利用Octet数据分析软件CFR Part 11 Version 6.x对得到的数据进行分析，经过数据拟合后得到编号N10和N15的抗SARS-CoV-2-N单克隆抗体的亲和常数KD值分别为3.39×10-11和5.28×10-11（图6）。
实施例6：单克隆抗体编码基因序列分析
提取亲和力较高的编号N15的抗SARS-CoV-2-N单克隆抗体的杂交瘤细胞RNA，逆转录成cDNA。根据抗体重链和轻链的恒定区设计2对简并引物，分别进行PCR扩增，目的片段回收测序。解析得到轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，编码轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO. 4所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，编码重链可变区的基因序列如SEQ ID NO. 5所示。
序列表
<110> 杭州医学院
<120> 一种抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白的单克隆抗体及应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1258
<212> DNA
<213> 严重急性呼吸系统综合症2型冠状病毒(SARS-CoV-2)
<400> 1
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gtctatttct gtgcaagatc gaggtactac ggtccctttg cttactgggg ccaagggact 360
ctggtcactg tctctgcggc gcgcctagat 390
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 4
Asp Ile Gln Met Ile Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Val Ala Thr Asp Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser
115
<210> 5
<211> 130
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 5
Phe Thr Ser Pro Ala Ser Ser Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly
1 5 10 15
Pro Asp Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala
20 25 30
Ser Gly Asp Thr Phe Thr Asp His Tyr Ile Ile Trp Val Lys Gln Arg
35 40 45
Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Asn Gly
50 55 60
His Thr Tyr Tyr Asn Glu Arg Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala
65 70 75 80
Asp Asp Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser
85 90 95
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Arg Tyr Tyr Gly Pro
100 105 110
Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Arg
115 120 125
Leu Asp
130
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 6
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Ser Leu Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 7
Val Ala Thr Asp Leu Ala
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 8
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 9
Thr Asp His Tyr Ile Ile
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 10
Glu Ile Tyr Pro Gly Asn Gly His Thr Tyr Tyr Asn Glu Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 11
Ser Arg Tyr Tyr Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
1 5 10
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gccggatcca tgtctgataa tggaccccaa aa 32
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gccgtcgaca ggcctgagtt gagtcagcac 30

Claims (10)

1.一种抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白的单克隆抗体，包括轻链和重链，其特征在于，轻链的可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为RASENIYSSLA、VATDLA和QHFWGTPWT；重链的可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为TDHYII、EIYPGNGHTYYNERFKG和SRYYGPFAYWG。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为全长抗体、Fab抗体或F(ab’)2抗体。
4.编码如权利要求1～3任一所述单克隆抗体的基因。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于，编码轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.2所示；编码重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
6.如权利要求1～3任一所述单克隆抗体在制备用于检测SARS-CoV-2的试剂盒中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，检测方式为血清学检测。
8.一种用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～3任一所述单克隆抗体。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒或使用免疫层析试纸条的免疫层析诊断试剂盒。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所取待检测样本为静脉血。
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