CN107576639A - 便携式全集成dna现场检验微型全分析系统检测光路 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种便携式全集成DNA现场检验微型全分析系统检测光路，其特征在于，该检测光路包括激发光聚焦系统、微流控电泳芯片、荧光收集聚焦传导系统、荧光分光及探测系统。本发明能够将宽波长的荧光分成多个有色带；同时波分复用器中的聚焦镜可以将荧光光束聚焦为微米级的光斑，适用于低噪声探测器和因敏感面大而噪声高的探测器。本发明具有多个荧光通道的高通量、高灵活性、工艺调试简单、成本低的光路结构，模块独立化，工艺调试简单，稳定性好，电泳通道及荧光通道可扩展度高、可以广泛应用于DNA检测、现场检测、毛细管电泳检测等特定应用领域。

Description

便携式全集成DNA现场检验微型全分析系统检测光路

技术领域

本发明涉及一种便携式全集成DNA现场检验微型全分析系统检测光路，属于生物检测技术领域。

背景技术

DNA测序技术是在核酸、蛋白、细胞等工程中采用的生物物理学技术。在DNA测序技术中，毛细管电泳分离技术使不同长度的DNA片断以不同的速度在管道中运动，荧光检测技术对标记不同荧光信息的长短不同的DNA片断进行电泳图谱的多参数分析。微芯片技术是以分析化学为基础，以微机电系统加工技术为依托，将微型全分析芯片系统技术与集成化技术结合起来，将采样、稀释、进样、分离、检测等功能集成在微芯片上，实现便携化、智能性操作。DNA测序技术具有包括在分子生物学、植物生物学领域中的多项应用，而具有现场化、微型化、集成化的微芯片DNA检测实验室对实现法医DNA领域的现场检测提供了可能。

2011年，全国DNA物证检验量为1783339份，而全国公安机关共有DNA检验人员1505名，相对于检验量而言，检验人员的工作量和压力都非常大，很多大要案往往需要彻夜加班检验，以便及时为案件提供科学的线索和证据。DNA现场检验微型全分析系统整合了DNA提取-PCR扩增-毛细管电泳等过程，其可以进行口腔拭子和血斑等样品的检验，实现“样本进-结果出”自动化检验，整个流程在2小时内完成，可以同时进行4～6份样品检验。整个DNA序列的微流控芯片毛细管电泳检测平台包括以下主要部件：微流控毛细管电泳芯片，电泳通道2-10条，由电泳胶携带DNA片断流过电泳通道；荧光检测光路系统，其耦连到电泳芯片的扫描区域，检测通过电泳管道的DNA片断；转化系统，用于将检测光路输出的信号转换成计算机可处理的数据；计算机，用于分析由转换系统所生成的数据。荧光检测光路主要由激发光路和荧光收集及感测光路组成，激发光路提供聚焦的光束，通常为单一波长的激光或者多个波长的激光，因此可以有一个或者多个光源；荧光收集及感测光路由收集物镜收集荧光光束并由一个或者多个检测器探测。

共焦扫描方式是一种国际上流行的荧光检测光路结构，可以进行多通道、大面积(100毫米×100毫米)、中等分辨率(5微米～50微米)、检测速度相对较快(<100kHz)的微流体芯片信号检测，并存储生成数字图象，但其传统的关键部件扫描收集物镜结构复杂，价格昂贵，例如文献Citation:Rev.Sci.Instrum.81,113105(2010)中使用的共聚焦扫描收集物镜，由5片直径为5mm的透镜组成小型物镜，价格昂贵达10万人民币，加工工艺复杂；选用的Nikon，Plan Fluor镜头价格同样昂贵达6万人民币，且体积大，质量大，对电机要求高，长期扫描稳定性差。传统激光器价格昂贵，体积大且耗电。例如公开号为CN205368375U专利采用光纤耦合输出式激光器，将激光器出射激光耦合到光纤中，并经过光纤端面的准直镜准直，此方法因光纤耦合效率及光传输损耗，会降低激光的光利用率，降低系统灵敏度，同时激光到光纤的耦合调试工艺复杂。而最近，激光二极管“LD”已经可以使用。与传统激光器不同，新一代LD具有成本效益高、结构紧凑且节能，适应新一代便携生物医学仪器的需求。LD发射椭圆形横截面的光斑，其中，经常被称为快轴的椭圆长轴垂直于LD的接头，而经常被称为慢轴的椭圆短轴平行于LD的接头。而对于目前芯片毛细管电泳，经过光路的多次反转及扫描物镜聚焦后，能够可靠的聚焦成椭圆形光束，且可以提高微流控电泳芯片通道纵向扫描分辨率。现有毛细管电泳检测平台的光路大都采用振镜扫描方式，荧光经光栅分光后进入检测器CCD或者CMOS，例如专利CN104641217A公开了一种流式细胞仪，其中公开了大数值孔径，宽输出准直光束的荧光显微镜与WDM的组合对标记了荧光的细胞进行荧光检测，WDM用于对多波长荧光进行分割，但其WDM内置结构的中继成像镜用凹面镜，其目的是使准直光束路径有效地加倍，而不扩大光束直径，然而这一定会在入射荧光处用双胶合透镜以消除在凹面镜处产生的色差，这种设计结构存在系统光学结构复杂，调试困难，对机械加工精度要求高，机械成本高，光学成本也高。

综上所述，针对全集成DNA现场检验系统中的微流控毛细管芯片，均存在一定的局限性，无法实现微流控芯片与检测系统的集成，达不到便携式全集成DNA微分析系统检测的要求，主要问题为：1)应用在微流控芯片毛细管电泳中，光源采用点光源，在径向分辨率要求高的情况下，激光器功率要求高，成本高；2)振镜扫描方式，要求工作距离短，物镜焦距小，因此会使扫描行程短，电泳通道通量小，效率降低，调试工艺难度大，如果想提高效率，则要求扫描物镜的焦距增大，则数值孔径减小，荧光灵敏度降低，仪器荧光采集性能下降，则要求样品量增加，提取、扩增、电泳几个步骤的效率要提高，从而使全流程难度加大；3)采用多透镜物镜，物镜体积大，质量大，成本高，整机稳定性降低；4)采用光栅分光，要求进入光栅的荧光准值性好，对物镜的性能要求高，设计复杂，工艺难度大，成本高，同时采用光栅分光，光栅位置相对物镜唯一，空间要求大，且空间摆放不灵活；与之匹配的探测器，为提高检测灵敏度，CCD或者CMOS带有制冷模块，体积大，成本高；5)空间分光模式，占空间大，且位置唯一。针对以上现有技术缺点和存在的局限性，无法实现微流控芯片与检测系统的集成，达不到便携式全集成DNA微分析系统检测的要求。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种电泳通道及荧光通道可扩展度大、通道间检测信号一致性好的便携式全集成DNA现场检验微型全分析系统检测光路。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种便携式全集成DNA现场检验微型全分析系统检测光路，其特征在于，该检测光路包括：激发光聚焦系统，所述激发光聚焦系统包括激光器、激光荧光二向色镜、全反射棱镜和非球面物镜，所述激光器输出的激光经准直后发射到所述激光荧光二向色镜，经所述激光荧光二向色镜出射的激光信号经所述全反射棱镜反射进入所述非球面物镜，所述非球面物镜将激光会聚为椭圆光斑并聚焦到微流控电泳芯片的电泳通道，设置在所述电泳通道内的检测样品被激发发出荧光，其中，所述全反射镜与非球面物镜固定安装在一机械结构件，所述机械结构件通过电机驱动在一个平面内做一维方向的扫描；荧光收集聚焦传导系统，所述荧光收集聚焦传导系统还包括荧光聚焦镜和多模光纤，所述非球面物镜对收集的荧光信号进行准直，准直后的荧光信号经所述全反射棱镜全反射后发射到所述激光荧光二向色镜，所述激光荧光二向色镜将激发的荧光经所述荧光聚焦镜聚焦进入所述多模光纤；荧光分光及探测系统，所述荧光分光及探测系统包括波分复用器和探测器，所述波分复用器用于准直从所述多模光纤出射的荧光，并将宽波长范围的荧光分成多个有色带通过不同通道输出，所述探测器用于检测经所述波分复用器输出的不同通道的荧光。

进一步地，所述波分复用器包括光纤接口、激光滤色镜以及交叉排布的第一～第N通道分光模块，每一所述通道分光模块均包括二向色镜、滤色镜和聚焦镜；所述多模光纤将宽波段的荧光进行准直后经所述激光滤色镜发到第一通道二向色镜，经所述第一通道二向色镜反射的荧光依次经第一通道滤色镜和第一通道聚焦镜聚焦，经所述第一通道二向色镜透射的荧光发射到第二通道二向色镜；经所述第二通道二向色镜反射的荧光经第二通道滤色镜和第二通道聚焦镜聚焦，经所述第二通道二向色镜透射的荧光发射到第三通道二向色镜…依次类推，宽波段的荧光经N个通道输出N个有色带均被相应的所述探测器探测。

进一步地，所述多模光纤通过陶瓷插芯与所述波分复用器的光纤接口连接。

进一步地，所述多模光纤通过光纤三维调节架进行支撑调节。

进一步地，对光信号准直采用能够对光束进行准直的光学元件，所述光学器件为准直透镜，所述准直透镜采用平凸透镜、球面镜、非球面镜或双胶合镜。

进一步地，所述激光器采用固体激光器、光纤激光器或二极管激光器。

进一步地，所述非球面物镜的单个焦距F为2～6mm，数值孔径0.60，所述非球面物镜采用平凸镜、双凸镜或胶合透镜。

进一步地，所述荧光聚焦镜采用双胶合透镜，所述双胶合透镜的焦距f约为30mm。

进一步地，所述探测器采用单通道或多通道探测器。

进一步地，所述全反射棱镜采用45度直角棱镜，经所述激光荧光二向色镜出射的光束穿过所述45度直角棱镜的其中一直角面在斜面发生全反射改变光束传输方向，使得X方向传播的激光经所述45度直角棱镜反射后延Z方向传播，全反射光束穿过另一直角面发射到所述非球面物镜。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明的激发光聚焦系统将二极管激光器经过准直镜、激光荧光二向色镜、全反射棱镜及非球面物镜聚焦的微米级光斑聚焦在微流控电泳芯片的电泳通道中央，电泳通道中央激发出的荧光由荧光收集聚焦传导系统收集并聚焦于多模光纤跳线后传导给荧光分光及探测系统，本发明通过全反射棱镜的加入使光轴面发生90度翻转，解决了扫描位置与激发光源和荧光聚焦传导位置的不可以共面的问题，激光荧光二向色镜的选择可以使激发光路和荧光光路在同一平面分开为不同的方向。2、本发明的激光器采用体积小、输出椭圆光斑的激光二极管，经准直透镜对快轴方向准直后，最终由非球面镜聚焦为5μm×3μm的椭圆光斑，相对电泳通道，本发明提高径向分辨率的同时，可以降低激光器的功率到60mW，提高径向电泳DNA序列分辨率的同时，降低激光功率，从而降低整机功耗和成本。3、本发明的物镜用大数值孔径的非球面物镜，其与全反射棱镜组合后匹配二极管激光器、微流控电泳芯片和直线扫描电机，达到检测系统荧光灵敏度、电泳通道通量和DNA序列分辨率要求，扫描信号稳定性提高、以及检测系统长期稳定性和可靠性加强。4、本发明采用直线电机的直线扫描方式，与小尺寸非球面物镜匹配，使得扫描视场范围可扩展度加大，另外，本发明非球面物镜的工作距离小，从而减小空间尺寸，以适应微流控电泳芯片的尺寸和结构设计；进一步，直线电机配合物镜的扫描方式也降低了对物镜的设计要求，提高了激光聚焦光斑在微流控芯片电泳管道处的光斑质量以及提高荧光聚焦镜后的荧光光斑的质量，提高了输出信号的对称性、稳定性和一致性，便于后端转化系统的信号处理。5、本发明的荧光收集聚焦传导系统基于多模光纤的进行荧光收集，体积小，空间位置灵活，能够缩短荧光的传播光程，达到复杂显微物镜镜头的荧光收集效率。6、本发明荧光分光及探测系统采用波分复用器，其内部结构根据系统荧光通道的通道数，荧光通道的波长及带宽特性进行分光设计，使其更便携，可以模块化、小型化、在有限的空间范围内可扩展度大、荧光效率更高、可替换性强，从而使整机结构和体积、尺寸不变的情况下灵活扩展或者减少荧光通道数，本发明能够将宽波长的荧光分成多个有色带；同时波分复用器中的聚焦镜可以将荧光光束聚焦为微米级的光斑，适用于低噪声探测器和因敏感面大而噪声高的探测器。综上，本发明具有多个荧光通道的高通量、高灵活性、工艺调试简单、成本低的光路结构，模块独立化，工艺调试简单，稳定性好，可以广泛应用于DNA检测、现场检测、毛细管电泳检测等特定应用领域。

附图说明

图1是本发明的便携式全集成DNA现场检验微型全分析系统检测光路示意图；

图2是本发明的波分复用器(WDM)结构示意图；

图3是本发明的激光器的聚焦光斑示意图；

图4是本发明的荧光聚焦镜的聚焦光斑示意图；

图5是本发明的DNA序列分型图谱效果图。

具体实施方式

以下结合附图来对本发明进行详细的描绘。然而应当理解，附图的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。其中，本发明的X方向是指在平行于水平面的平面上的直角坐标系中的X轴；Y方向是指在平行于水平面的平面上的直角坐标系中的Y轴；Z方向是指垂直于水平面的轴向。

本发明提供的便携式全集成DNA现场检验微型全分析系统检测光路，包括激发光聚焦系统、微流控电泳芯片、荧光收集聚焦传导系统、荧光分光及探测系统。

如图1所示，激发光聚焦系统包括激光器1、准直镜2、激光荧光二向色镜3、全反射棱镜4和非球面物镜5。激光器1输出的激光经准直镜2准直后发射到激光荧光二向色镜3，经激光荧光二向色镜3出射的激光信号经全反射棱镜4反射进入非球面物镜5，非球面物镜5将激光会聚为椭圆光斑并聚焦到微流控电泳芯片6的电泳通道,设置在电泳通道内的检测样品被激发荧光。其中，本发明的全反射镜4与非球面物镜5固定安装在一个机械结构件上，机械结构件通过直线扫描电机进行驱动可以在一个平面内做一维方向的扫描，使得扫描聚焦光斑质量好、在不同扫描位置的光斑光密度分布一致，从而使不同电泳通道间信号一致性好，本发明荧光信号最佳的扫描行程范围最大可以达到20mm，可以同时扫描检测8个电泳通道。

荧光收集聚焦传导系统还包括荧光聚焦镜7和多模光纤8。非球面物镜5对收集的荧光信号进行准直，荧光信号经全反射镜4全反射后发射到激光荧光二向色镜3，激光荧光二向色镜3将激发的荧光经荧光聚焦镜7聚焦进入多模光纤8，由于光束在整个传播光程内扩散，多模光纤8因其体积小，空间位置灵活，可以缩短荧光的传播光程，从而弥补且能达到复杂显微物镜镜头的荧光收集效率。

荧光分光及探测系统包括波分复用器(WDM)9和探测器10。波分复用器(WDM)9采用光通讯领域常用的波分复用器件，用于准直从多模光纤8出射的荧光，并将宽波长范围的荧光分成多个有色带并通过不同通道输出，探测器10用于检测经波分复用器(WDM)9输出的不同通道的荧光信号。

在一个优选的实施例中，如图2所示，波分复用器(WDM)9包括光纤接口91、准直镜92、激光滤色镜93、第一～第N通道分光模块，本发明实施例中采用五个荧光分光模块，以此为例，不限于此。每一通道分光模块均包括二向色镜、滤色镜和聚焦镜；多模光纤8将宽波段的荧光发送到准直镜92进行准直，准直后的荧光经激光滤色镜发到第一通道二向色镜941，经第一通道二向色镜941反射的荧光依次经第一通道滤色镜942和第一通道聚焦镜943聚焦成为小光斑，经第一通道二向色镜941透射的荧光发射到第二通道二向色镜951；经第二通道二向色镜951反射的荧光经第二通道滤色镜952和第二通道聚焦镜953聚焦成为小光斑，经第二通道二向色镜952透射的荧光发射到第三通道二向色镜961，依次类推，宽波段的荧光经五个通道输出五个有色带均被相应的探测器进行探测，本发明的通道分光模块交叉排布，以减小空间，后续可以采用探测器10分别探测五个荧光通道的荧光信号。

在一个优选的实施例中，多模光纤8可以通过陶瓷插芯11与波分复用器(WDM)9的光纤接口91连接，多模光纤8可以通过光纤三维调节架进行支撑调节。

在一个优选的实施例中，准直透镜2可以采用平凸透镜、球面镜、非球面镜、双胶合镜等可以对光束进行准直的光学元件。

在一个优选的实施例中，激光器1采用体积小、输出椭圆光斑的二极管激光器，本发明采用的二极管激光器的光斑大小为2.5mm×1.2mm，发散角为0.4mrad×0.6mrad，光斑长轴为1.2mm，短轴长为0.7mm，经准直透镜2准直后，最终由非球面物镜5聚焦为5μm×3μm的椭圆光斑，如图3所示，本发明还可以采用固体激光器、光纤激光器等其他激光器。

在一个优选的实施例中，非球面物镜5的单个焦距F约为2～6mm，数值孔径0.60，聚焦能量密度高，体积小，重量轻，扫描可靠性高，以适应微流控电泳芯片6的结构特点，非球面物镜5也可以采用平凸镜、双凸镜、胶合透镜或其它多透镜组合的物镜。

在一个优选的实施例中，荧光聚焦镜7采用双胶合透镜，双胶合透镜的焦距f约为30mm，其相对非球面物镜5的放大倍数约为10倍，成像点列图如图4所示，根据系统灵敏度要求和装调难度可以采用纤芯为50～200um的多模光纤7。

在一个优选的实施例中，探测器10可以采用单通道或多通道探测器，例如PMT、光子记数器、光电池或光电二极管。

在一个优选的实施例中，全反射棱镜4可以采用45度直角棱镜，经激光荧光二向色镜3出射的光束穿过45度直角棱镜4的其中一直角面在斜面发生全反射，光束改变传输方向，使得X方向传播的激光经棱镜反射后延Z方向传播，全反射的光束穿过另一直角面沿非球面物镜5聚焦在微流控电泳芯片6。

经实验，本发明的便携式全集成DNA现场检验微型全分析系统能够检测8个电泳通道，5个荧光通道，整个结构灵巧，简单，成本低，调试工艺简单、稳定性高。本发明的整个检测系统的荧光灵敏度可以达到1nM，DNA序列的分辨率达到1bp，如图5所示实验结果。

上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、连接方式和制作工艺等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。

Claims (10)

1.一种便携式全集成DNA现场检验微型全分析系统检测光路，其特征在于，该检测光路包括：

激发光聚焦系统，所述激发光聚焦系统包括激光器、激光荧光二向色镜、全反射棱镜和非球面物镜，所述激光器输出的激光经准直后发射到所述激光荧光二向色镜，经所述激光荧光二向色镜出射的激光信号经所述全反射棱镜反射进入所述非球面物镜，所述非球面物镜将激光会聚为椭圆光斑并聚焦到微流控电泳芯片的电泳通道，设置在所述电泳通道内的检测样品被激发发出荧光，其中，所述全反射镜与非球面物镜固定安装在一机械结构件，所述机械结构件通过电机驱动在一个平面内做一维方向的扫描；

荧光收集聚焦传导系统，所述荧光收集聚焦传导系统还包括荧光聚焦镜和多模光纤，所述非球面物镜对收集的荧光信号进行准直，准直后的荧光信号经所述全反射镜全反射后发射到所述激光荧光二向色镜，所述激光荧光二向色镜将激发的荧光经所述荧光聚焦镜聚焦进入所述多模光纤；

荧光分光及探测系统，所述荧光分光及探测系统包括波分复用器和探测器，所述波分复用器用于准直从所述多模光纤出射的荧光，并将宽波长范围的荧光分成多个有色带通过不同通道输出，所述探测器用于检测经所述波分复用器输出的不同通道的荧光。

2.如权利要求1所述的便携式全集成DNA现场检验微型全分析系统检测光路，其特征在于，所述波分复用器包括光纤接口、激光滤色镜以及交叉排布的第一～第N通道分光模块，每一所述通道分光模块均包括二向色镜、滤色镜和聚焦镜；所述多模光纤将宽波段的荧光进行准直后经所述激光滤色镜发到第一通道二向色镜，经所述第一通道二向色镜反射的荧光依次经第一通道滤色镜和第一通道聚焦镜聚焦，经所述第一通道二向色镜透射的荧光发射到第二通道二向色镜；经所述第二通道二向色镜反射的荧光经第二通道滤色镜和第二通道聚焦镜聚焦，经所述第二通道二向色镜透射的荧光发射到第三通道二向色镜…依次类推，宽波段的荧光经N个通道输出N个有色带均被相应的所述探测器探测。

3.如权利要求2所述的便携式全集成DNA现场检验微型全分析系统检测光路，其特征在于，所述多模光纤通过陶瓷插芯与所述波分复用器的光纤接口连接。

4.如权利要求1所述的便携式全集成DNA现场检验微型全分析系统检测光路，其特征在于，所述多模光纤通过光纤三维调节架进行支撑调节。

5.如权利要求1所述的便携式全集成DNA现场检验微型全分析系统检测光路，其特征在于，对光信号准直采用能够对光束进行准直的光学元件，所述光学器件为准直透镜，所述准直透镜采用平凸透镜、球面镜、非球面镜或双胶合镜。

6.如权利要求1所述的便携式全集成DNA现场检验微型全分析系统检测光路，其特征在于，所述激光器采用固体激光器、光纤激光器或二极管激光器。

7.如权利要求1所述的便携式全集成DNA现场检验微型全分析系统检测光路，其特征在于，所述非球面物镜的单个焦距F为2～6mm，数值孔径0.60，所述非球面物镜采用平凸镜、双凸镜或胶合透镜。

8.如权利要求1所述的便携式全集成DNA现场检验微型全分析系统检测光路，其特征在于，所述荧光聚焦镜采用双胶合透镜，所述双胶合透镜的焦距f约为30mm。

9.如权利要求1所述的便携式全集成DNA现场检验微型全分析系统检测光路，其特征在于，所述探测器采用单通道或多通道探测器。

10.如权利要求1所述的便携式全集成DNA现场检验微型全分析系统检测光路，其特征在于，所述全反射棱镜采用45度直角棱镜，经所述激光荧光二向色镜出射的光束穿过所述45度直角棱镜的其中一直角面在斜面发生全反射改变光束传输方向，使得X方向传播的激光经所述45度直角棱镜反射后延Z方向传播，全反射光束穿过另一直角面发射到所述非球面物镜。