CN105793422B - 酸性α-葡糖苷酶中反义诱导的外显子2纳入 - Google Patents

酸性α-葡糖苷酶中反义诱导的外显子2纳入 Download PDF

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Abstract

本发明涉及反义寡核苷酸和相关的组合物以及用于诱导的外显子纳入作为治疗II型糖原贮积病(GSD‑II)(也称为庞帕病、II型糖原病、酸麦芽糖酶缺乏(AMD)、酸性α‑葡糖苷酶缺乏，和溶酶体α‑葡糖苷酶缺乏)的方法，并且更具体地涉及诱导外显子2的纳入并由此恢复由GAA基因编码的酶促活性酸性α‑葡糖苷酶(GAA)蛋白的水平。

Description

酸性α-葡糖苷酶中反义诱导的外显子2纳入
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2013年9月5日提交的美国申请号61/874,261和2014年1月27日提交的美国申请号61/932,195的优先权；其全文各自通过引用纳入本文。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本形式代替纸质版提供，并且因此通过引用纳入说明书。包含序列表的文本文件的名称为SATH_001_02WO_ST25.txt。该文本文件为约62KB，其在2014年9月5日生成，并且通过EFS-Web电子提交。
背景
发明领域
本发明涉及反义寡聚体和相关的组合物以及用于诱导的外显子纳入作为对II型糖原贮积病(GSD-II)(也称为庞帕病、II型糖原病、酸麦芽糖酶缺乏(AMD)、酸性α-葡糖苷酶缺乏和溶酶体α-葡糖苷酶缺乏)的治疗的方法，并且更具体地涉及诱导外显子2的纳入并由此恢复由GAA基因编码的酶促活性酸性α-葡糖苷酶(GAA)蛋白的水平。
相关领域描述
可变剪接通过从单一基因产生多个蛋白质增加了人基因组的编码潜力。不合适的可变剪接也与不断增加的人类疾病相关。
GSD-II是一种由称为酸性α-葡糖苷酶(GAA)的酶的缺乏所导致的遗传常染色体隐性溶酶体贮积症。GAA在体内的作用是降解糖原。GAA活性水平的降低或缺失导致糖原在受影响的组织，包括心脏、骨骼肌(包括参与呼吸的那些)、肝脏和神经系统中积累。这种糖原积累被认为在患有GSD-II的个体中导致进行性肌无力和呼吸功能不全。GSD-II可发生于婴儿、小儿或成人，并且其预后根据发作的时间和症状的严重性而变化。临床上，GSD-II可能以广泛且连续的严重谱产生影响，范围从严重(婴儿)到较温和的迟发成人形式。患者最终由于呼吸功能不全而死亡。疾病的严重性与残留的酸性α-葡糖苷酶活性之间有良好的相关性，该活性在迟发中是正常情况的10-20％并且在疾病的早发形式中不到2％。估计GSD-II在全世界影响大约5000至10000人。
与疾病的成人发生形式相关的最常见突变是IVS1-13T＞G。在三分之二的成人发生的GSD-II患者中发现，这种突变可能在杂合个体中赋予选择性优势或者是非常老的突变。带有这种突变的成人发生的GSD-II个体的广泛族群变化与常见发现对立。
GAA基因由跨20kb的20个外显子组成。3.4kb mRNA编码大约105kD的分子量的蛋白。IVS1-13T＞G突变导致丢失外显子2(577个碱基)，其含有起始AUG密码子。
对GSD-II的治疗已经包括药物治疗策略、饮食处理，和骨髓移植，而没有明显成功。近年来，酶替换疗法(ERT)已向GSD-II患者提供新的希望。例如，一种重组GAA蛋白药物，在2006年在美国和欧洲得到批准用于患有GSD-II疾病的患者。
Figure BDA0000982490820000022
依赖于GAA蛋白表面上的甘露糖-6-磷酸(M6P)来递送至溶酶体。
最常用于RNA下调的反义技术(antisense technology)近来已经适用于改变剪接过程。对许多基因的主要基因转录本(前体mRNA)的处理包括去除内含子和精确剪接外显子，其中供体剪接位点联接至受体剪接位点。剪接是一个精确的处理过程，包括配位识别供体和受体剪接位点，以及分支点(受体剪接位点上游)和其余的正外显子剪接增强子(主要位于外显子内)和负剪接基序(主要位于内含子内的剪接沉默子)。
能够改变GAA前体mRNA的剪接的有效试剂可能在治疗上用于GSD-II的改善的治疗。
概述
本发明的实施方式涉及反义寡聚体以及相关的组合物和用于增加细胞中含外显子2的GAA-编码mRNA的水平的方法，包括将该细胞与具有足够的长度和互补性以足以特异性地杂交GAA基因的前体mRNA内的区的反义寡聚体接触，其中反义寡聚体与该区的结合增加了细胞中含外显子2的GAA-编码mRNA的水平。
因此，在一些实施方式中，本发明涉及10-40个核苷酸或核苷酸类似物的反义寡聚体，包括具有足够的长度和互补性以足以特异性杂交人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQ ID NO：1)、外显子2(SEQ ID NO：2)或内含子2(SEQ ID NO：3)内的区的靶向序列。
在某些实施方式中，本发明涉及反义寡聚体化合物，包含：
非天然化学主链，其选自氨基磷酸酯或磷二酰胺吗啉代寡聚体(PMO)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚体、三环-DNA寡聚体、三环-硫代磷酸酯寡聚体、2’O-Me-修饰的寡聚体，或前述的任意组合；和
与人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQ ID NO：1)、内含子2(SEQ ID NO：2)，或外显子2(SEQ ID NO：3)内的区互补的靶向序列。
在一些实施方式中，反义寡聚体特异性杂交表1所列的内含子1、外显子2、和/或内含子2GAA序列内的区。在一些实施方式中，反义寡聚体特异性杂交内含子剪接沉默子元件或外显子剪接沉默子元件。在某些实施方式中，反义寡聚体包含表2所列的靶向序列、表2中靶向序列的至少10个连续核苷酸的片段，或与表2中的靶向序列有至少80％序列相同性的变体。在具体实施方式中，反义寡聚体由表2所列的靶向序列组成或基本由其组成。
在某些实施方式中，反义寡聚体是氨基磷酸酯或磷二酰胺吗啉代寡聚体(PMO)、PMO-X、PPMO、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚体、三环-DNA寡聚体、三环-硫代磷酸酯寡聚体、2’O-Me-修饰的寡聚体，或前述的任意组合。
在一些实施方式中，反义寡聚体含有约、至少约，或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个阳离子核苷间连接。在某些实施方式中，反义寡聚体含有约，或至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％阳离子核苷间连接。在某些实施方式中，反义寡聚体含有约、至少约，或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷间连接，其显示出约4.5至约12的pKa。在一些实施方式中，反义寡聚体含有约，或至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％核苷间连接，其显示出约4.5至约12的pKa。在一些实施方式中，反义寡聚体具有同时含有碱性氮和烷基、芳基或芳烷基的核苷间连接。在一些实施方式中，反义寡聚体包含吗啉基。
在某些实施方式中，本发明的反义寡聚体是式(I)的化合物：
Figure BDA0000982490820000041
或其药学上可接受的盐，其中：
各Nu是核碱基，一起形成靶向序列；
x是8-38的整数；
各Y独立地选自O或-NRa，其中Ra选自氢、-T1-NRcRdRe和-[(C(O)CHR′NH)m]R″，其中：
R′是天然产生的氨基酸或其一个或两个碳的同系物的侧链，R″选自氢或酰基，m是1-60的整数，Rc选自氢、C1-C6烷基、芳烷基和-C(＝NH)NH2，Rd选自氢、芳烷基和C1-C6烷基，或者Rc和Rd与其附连的氮原子一起形成5-7元环，当RC和Rd各自独立地是C1-C6烷基或芳烷基时，其中该环任选地被选自C1-C6烷基、苯基、卤素和芳烷基的取代基取代，并且Re选自电子对、氢、C1-C6烷基和芳烷基；
各L独立地选自-P(O)2OH-、-P(O)2R1-、哌嗪基、羰基、H(O(CH2)sO)w-、-(OCH2CH2O)w、和-[(C(O)CHR′NH)m]R″，其中w是3-20的整数，S是1-8的整数；
n是0-3的整数；
各R1独立地选自-N(CH3)2、-NR5R6、-OR7、
式(II)的部分：
Figure BDA0000982490820000051
其中，R8选自氢、甲基、-C(＝NH)NH2、-Z-T2-NHC(＝NH)NH2和-[(C(O)CHR′NH)m]R″，其中Z是羰基或直接键，R9选自电子对、氢、C1-C6烷基和芳烷基，并且各R10独立地选自氢或甲基；和
式(III)的部分：
Figure BDA0000982490820000052
其中q是0-2的整数，R11选自氢、C1-C6烷基、芳烷基，和-C(＝NH)NH2，R12选自氢、芳烷基，和C1-C6烷基，或者R11和R12和其附连的氮原子一起形成5-7元环，其中该环任选地被选自C1-C6烷基、苯基、卤素，和芳烷基的取代基取代，并且R13选自电子对、氢、C1-C6烷基，和芳烷基；
R2选自氢、OH、核苷酸、-(CH2)mC(O)NRfRg，其中Rf和Rg独立地选自H、酰基、C1-C6烷基，和-[(C(O)CHR′NH)m]R″、-[(C(O)CHR′NH)m]R″、H(O(CH2)sO)w-、H(OCH2CH2O)w-、三苯甲基、-C(＝O)ORf，和酰基，其中Rf是C1-C30烷基，其包含一个或多个氧或羟基部分或其组合，或R2不存在；
R3选自氢、C1-C6烷基、核苷酸、-[(C(O)CHR′NH)m]R″、-C(＝NH)NH2、三苯甲基、-C(＝O)ORg、酰基、-C(O)(CH2)mC(O)，和T4-(4-(4，6-(NR2)-1，3，5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基，其中Rg是C1-C30烷基，其包含一个或多个氧或羟基部分或其组合，T4选自-C(O)(CH2)6C(O)-或-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-，并且R是-(CH2)OC(O)NH(CH2)6NHC(NH)NH2；
R4选自电子对、氢、C1-C6烷基，和酰基，并且
各R5独立地选自氢或甲基；
各R6和各R7独立地选自氢或-T3-NRcRdRe；并且
各T1、T2，和T3独立地是长度至多为18个原子的任选接头，其包括烷基、烷氧基或烷氨基，或其组合，
其中，靶向序列与人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQ IDNO：1)、内含子2(SEQ ID NO：2)，或外显子2(SEQ ID NO：3)内的区互补。
在某些实施方式中，本发明的反义寡聚体是式(IV)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
各Nu是核碱基，一起形成靶向序列；
x是15-25的整数；
各Y是O；
各R1独立地选自下组：
Figure BDA0000982490820000072
其中，至少一个R1是-N(CH3)2，并且
其中，靶向序列选自SEQ ID NO：4-120，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
在某些实施方式中，反义寡聚体还包含增强细胞摄入的肽部分。
本发明的范围内还包括反义寡聚体，其包括具有足够的长度和互补性以足以特异性杂交人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQ ID NO：1)、外显子2(SEQID NO：2)或内含子2(SEQ ID NO：3)(如表2所示)内的区的靶向序列。在一些实施方式中，靶向序列包含选自SEQ ID NO：4-120的靶向序列的至少10个连续核苷酸，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。在某些实施方式中，靶向序列与选自SEQ ID NO：4-120的靶向序列具有至少80％序列相同性，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
在某些实施方式中，反义寡聚体是氨基磷酸酯或磷二酰胺吗啉代寡聚体(PMO)、PMO-X、PPMO、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚体、三环-DNA寡聚体、三环-硫代磷酸酯寡聚体、2’O-Me-修饰的寡聚体，或前述的任意组合。
还包括药物组合物，包含生理上可接受的运载体和本文所述的反义寡聚体。
某些实施方式还包括增加细胞中含外显子2的酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)mRNA的水平的方法，包括将该细胞与具有足够的长度和互补性以足以特异性地杂交GAA基因的前体mRNA内的区的反义寡聚体接触，其中反义寡聚体与该区的结合增加了细胞中含外显子2的GAA mRNA的水平。
在一些实施方式中，相对于对照，细胞中含外显子2的GAA mRNA的水平增加至少约10％。在某些实施方式中，相对于对照，细胞中功能性GAA蛋白的水平增加至少约10％。在某些实施方式中，细胞在其基因组的一个或多个等位基因中有IVS1-13T＞G突变，其(在没有反义治疗的情况下)导致含外显子2的GAA mRNA表达减少。
在一些实施方式中，该细胞在有此需要的对象中，并且该方法包括向该对象给予反义寡聚体。在一些实施方式中，该对象患有II型糖原贮积病(GSD-II)或具有患II型糖原贮积病的风险。本发明的一些实施方式涉及治疗有此需要的对象中的II型糖原贮积病(GSD-II；庞帕病)的方法，包括向该对象给予有效量的本发明的反义寡聚体。而某些实施方式涉及用于制备用于治疗II型糖原贮积病(GSD-II；庞帕病)的药物的反义寡聚体。
在某些实施方式中，该对象患有婴儿GSD-II或具有患婴儿GSD-II的风险。在具体实施方式中，该对象患有迟发GSD-II或具有患迟发GSD-II的风险。在某些实施方式中，该方法包括，相对于对照，使对象的一种或多种组织中的糖原水平降低至少约10％。
另外，本发明还包括检测人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因mRNA中外显子2纳入的方法，该方法包括：
用至少一种聚合酶链反应引物扩增GAA mRNA，该引物包含选自SEQ ID NO：121、122或123的碱基序列。
本发明的这些和其它方面将在参考以下详细说明和附图之后变得显而易见。本文中公开的所有参考文献通过引用全文纳入本文，就如同它们单独纳入那样。
附图说明
图1显示了一种机制，相对于外显子缺失的GAA mRNA，空间阻断反义寡聚体通过该机制能增强含外显子2的GAA mRNA的水平。
图2显示了使用针对外显子1(正向)和外显子3(反向)的引物的，从含有外显子2的野生型GAA基因扩增的约1177个碱基的PCR扩增产物(参见实施例2)。
图3A-3C显示了来自实施例2的表E1的2’-O-甲基修饰的反义寡聚体的结果。图3A显示寡聚体9(GAA-IVS1(-74-55))和12(GAA-IVS1(-158-140))诱导携带IVS1-13G＞T突变的人细胞中的外显子2-纳入，如约600个碱基的扩增子的减少的扩增(相对于全长约1177个碱基的扩增子)所示。图3B显示寡聚体14(GAA-IVS2(-53-72))诱导外显子2纳入，并且图3C显示寡聚体20(GAA-IVS2(-173-192))和22(GAA-IVS2(-338-364))也诱导一定程度的外显子2纳入。
图4A-4C显示表4A的PMO反义寡聚体的RT-PCR结果。
发明详述
I.定义
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但本文描述优选的方法和材料。出于理解本发明的目的，定义以下术语。
本文使用冠词“一个”和“一种”表示一个或一个以上的(即至少一个)该冠词语法上的宾语。举例而言，“一种元件”表示一个元件或者一个以上的元件。
“约”指量、水平、值、数量、频率、百分比、维度、尺寸、用量、重量或长度相对于参考的量、水平、值、数量、频率、百分比、维度、尺寸、用量、重量或长度偏差达到30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
“编码序列”表示产生基因的多肽产物的密码的任何核酸序列。相反，“非编码序列”是指不直接产生基因的多肽产物的密码的任何核酸序列。
整篇说明书中，除非上下文需要另外说明，术语“包括”、“包含”和“含有”应理解为指示包括所述步骤或元素或者步骤或元素组而不排除任何其他步骤或元素或者步骤或元素组。
“由……组成”指包括但限于词组“由……组成”中的列举。因此，词组“由……组成”指所列元素是必须的或强制的，并且没有其他元素出现。“基本由……组成”指在词组中所列举的任何元素，但是限于其他不干扰或有助于本文特定列举元素的活性或作用的元素。因此，词组“基本由……组成”指所列举元素是必须的或强制的，但是其他元素是可选的，并且可以出现或可以不出现，取决于它们是否影响所列举元素的活性或作用。
本文所用术语“接触细胞”、“引入”或“递送”包括通过本领域常规方法将本发明的寡聚体递送到细胞中，例如，转染(例如，脂质体、磷酸钙、聚乙烯亚胺)、电穿孔(例如，核转染)、微注射。
本文所用术语“烷基”旨在包括线性(即，非支链或无环)、支链、环状，或多环非芳族烃基，其任选地被一个或多个官能团取代。除非另外说明，“烷基”含有1-8个，并且优选1-6个碳原子。C1-C6烷基意图包括C1、C2、C3、C4、C5和C6烷基基团。低级烷基是指含有1-6个碳原子的烷基。烷基的示例包括但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、戊基、异戊基、树戊基、环戊基、己基、异己基、环己基等。烷基可以是取代的或未取代的。示例性的取代的烷基包括，但不限于，氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、四氟甲基、2-氟乙基、3-氟丙基、羟甲基、2-羟乙基、3-羟丙基、苄基、取代的苄基、苯乙基、取代的苯乙基等。
本文所用的术语“烷氧基”表示烷基的亚组，其中具有所示数量的碳原子的如上定义的烷基通过氧桥附连。例如，“烷氧基”是指-O-烷基，其中烷基含有1-8个线性、支链、环状构象的碳原子。“烷氧基”的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基、正丁氧基、仲戊氧基等。
本文所用术语“芳基”，单独使用或作为“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基-烷基”的部分使用，是指具有6-14个环原子的芳环基团，如苯基、1-萘基、2-萘基、1-蒽基和2-蒽基。“芳基”环可含有一个或多个取代基。术语“芳基”可与术语“芳环”互换使用。“芳基”也包括稠合的多环芳环系统，其中芳环稠合至一个或多个环。可用的芳环基团的非限制性示例包括苯基、羟苯基、卤代苯基、烷氧基苯基、二烷氧基苯基、三烷氧基苯基、亚烷基二氧基苯基、萘基、菲基、蒽基、菲并等，以及1-萘基、2-萘基、1-蒽基和2-蒽基。如本文所用，术语“芳基”的范围内还包括其中芳环与一个或多个非芳环稠合的基团，如茚满基、苯邻二甲酰亚胺基，或四氢萘基，其中基团或附连点在芳环上。
术语“酰基”表示C(O)R基团(其中R指如上所述的H、烷基或芳基)。酰基的示例包括甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、苯基乙酰基和类似基团。
本文所用术语“同源物”表示通过连续添加相同的化学基团而具有规则差异的化合物。例如，化合物的同源物的差别可在于添加一个或多个-CH2-基团、氨基酸残基、核苷酸，或核苷酸类似物。
术语“细胞穿透肽(CPP)”或“增强细胞摄入的肽部分”可互换使用并且指代阳离子细胞穿透肽，也称为“转运肽”、“载体肽”，或“肽转导结构域”。肽，如本文所示，具有给定细胞培养群的约或至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或100％的细胞内诱导细胞穿透的能力，并且允许大分子在全身性给药之后在体内多种组织中移位。在一些实施方式中，CPP是式-[(C(O)CHR′NH)m]R″，其中R′是天然氨基酸或其一个或两个碳的同源物的侧链，R″选自氢或酰基，并且m是高至50的整数。其它CPP是本领域所熟知的，并且公开于例如美国申请号2010/0016215，其通过引用全文纳入本文。在其它实施方式中，m是1-50的整数，其中，当m是1时，该部分是单一氨基酸或其衍生物。
本文使用的“氨基酸”是指由附连伯氨基、羧酸基团、侧链和氢原子的碳原子组成的化合物。例如，术语“氨基酸”包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和精氨酸。另外，本文所用的“氨基酸”也包括氨基酸的衍生物，如酯，和酰胺、以及盐，和其它衍生物，包括在代谢成活性形式之后具有药物性质的衍生物。因此，术语“氨基酸”被理解为包括天然产生的和非天然产生的氨基酸。
“电子对”是指不结合或与其它原子共享的电子的价对。
“同源性”是指相同或构成保守性取代的氨基酸的百分数。可使用比较程序如GAP(Deveraux等，1984，Nucleic Acids Research 12，387-395)来确定同源性。通过这种方式，可通过向比对中插入缺口来比较与本文所述的那些相似或明显不同长度的序列，例如，可通过GAP所用的比较算法来确定这类缺口。
“分离的”表示明显或基本没有其天然状态中通常伴随的组分的物质。例如，本文所用的“分离的多核苷酸”、“分离的寡核苷酸”，或“分离的寡聚体”可以指已经从其天然状态中侧接的序列中纯化或移出的多核苷酸，例如，从在基因组中与该片段相邻的序列中移出的DNA片段。与细胞相关的术语“分离”是指从来源对象(例如，患有多核苷酸重复疾病的对象)中纯化细胞(例如，成纤维细胞、淋巴母细胞)。在mRNA或蛋白质的内容中，“分离”是指从来源，例如细胞中回收mRNA或蛋白质。
术语“调节”包括一种或多种可定量参数“增加”或“降低”任选的限定和/或统计学显著的量。“增加”或“提高”、“增强”或“强化”，或“促进”或“刺激”一般是指相对于无反义化合物或对照化合物产生的响应，一种或多种反义化合物或组合物在细胞或对象中产生或导致更大的生理学响应(即，下游效应)。相关生理或细胞响应(体内或体外)对本领域技术人员而言将是显而易见的，并且可包括GAA-编码前体mRNA中外显子2纳入的增加，或有此需要的细胞、组织或对象中功能性GAA酶的表达增加。“增加的”或“增强的”量一般是“统计学显著的”量，并且可包括增加1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多倍(例如，500、1000倍)的由无反义化合物(没有试剂)或对照化合物产生的量，包括之间并大于1的所有整数和小数(例如，1.5、1.6、1.7、1.8)。术语“减少”或“抑制”一般可以指一种或多种反义化合物或组合物“减少”相关生理或细胞响应的能力，如本文所述的疾病或病症的症状，如诊断领域中的常规技术所测量。相关生理或细胞响应(体内或体外)对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且可包括糖原贮积病如庞帕病的症状或病理的减少，例如，一种或多种组织中糖原积累减少。与由无反义化合物或对照组合物产生的响应相比，响应的“减少”可以是“统计学显著的”，并且可包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，或100％的减少，包括之间的所有整数。
本文所用术语“反义寡核苷酸”、“反义寡聚体”，或“寡核苷酸”是指核苷酸的线性序列，或核苷酸类似物，其使核碱基通过Watson-Crick碱基配对与RNA中的靶序列杂交，以在靶序列内形成寡聚体：RNA异源双链体。术语“反义寡核苷酸”、“反义寡聚体”、“寡聚体”和“化合物”可以互换使用来指代寡聚体。环状亚基可基于核糖或另一种戊糖或者，在某些实施方式中，吗啉基基团(参见下文中吗啉代寡聚体的描述)。还可考虑肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、三环-DNA寡聚体、三环-硫代磷酸酯寡聚体，和2’-O-甲基寡聚体等其它本领域已知的反义试剂。
包括非天然产生的寡聚体，或“寡核苷酸类似物”，其包括寡聚体，所述寡聚体具有(i)经修饰的主链结构，例如，不同于天然产生的寡核苷酸和多核苷酸中发现的标准磷酸二酯键的主链，和/或(ii)修饰的糖部分，例如，不同于核糖或脱氧核糖部分的吗啉代部分。寡聚体类似物支持能够通过Watson-Crick碱基配对与标准多核苷酸碱基形成氢键的碱基，其中类似物主链以一定方式显示碱基以允许这种氢键在标准多肽(例如，单链RNA或单链DNA)中在寡聚体类似物分子和碱基之间呈序列特异性的方式。优选的类似物是具有基本不带电的、含磷主链的那些。
“核酸酶耐受性”寡聚体是指主链对核酸酶切割有明显耐受性的寡聚体，以非杂交或杂交形式；通过体内常见的胞外和胞内核酸酶(例如，外切核酸酶如3’-外切核酸酶、内切核酸酶、RNA酶H)；即，寡聚体在体内寡聚体暴露的正常核酸酶条件下显示很少或没有核酸酶切割。“核酸酶耐受性异源双链体”是指通过反义寡核苷酸与其互补靶标的结合形成的异源双链体，使得异源双链体对胞内和胞外核酸酶的体内降解有明显耐受性，这些核酸酶能够切割双链RNA/RNA或RNA/DNA复合物。“异源双链体”是指反义寡聚体和靶标RNA的互补部分之间的双链体。
本文所用的“核碱基”(Nu)、“碱基配对部分”或“碱基”可互换使用以指代天然DNA或RNA中发现的嘌呤或嘧啶(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤)，以及天然产生的嘌呤和嘧啶的类似物，其(例如对寡聚体的结合亲和性)提供改善的性质。示例性的类似物包括次黄嘌呤(核苷肌苷的碱基组分)；2，6-二氨基嘌呤；5-甲基胞嘧啶；C5-丙炔基-修饰的嘧啶；9-(氨基乙氧基)吩噁嗪(G-钳)等。
碱基配对部分的其它示例包括，但不限于，其相应氨基被以下部分保护的尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和次黄嘌呤：酰基保护基团、2-氟尿嘧啶、2-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、氮杂胞嘧啶、嘧啶类似物如假异胞嘧啶和假尿嘧啶和其它修饰的核碱基如8-取代的嘌呤、黄嘌呤或次黄嘌呤(后两者是天然降解产物)。也考虑Chiu和Rana，RNA，2003，9，1034-1048，Limbach等，Nucleic Acids Research，1994，22，2183-2196以及Revankar和Rao，Comprehensive Natural Products Chemistry，第7卷，313中公开的修饰的核碱基。
碱基配对部分的其它示例包括，但不限于，尺寸扩大的核碱基，其中加入一个或多个苯环。考虑Glen研究目录(www.glenresearch.com)；Krueger AT等，Acc.Chem.Res.，2007，40，141-150；Kool，ET，Acc.Chem.Res.，2002，35，936-943；Benner S.A.等，Nat.Rev.Genet.，2005，6，553-543；Romesberg，F.E.等，Curr.Opin.Chem.Biol.，2003，7，723-733；Hirao，I.，Curr.Opin.Chem.Biol.，2006，10，622-627中所述的核碱基取代可用于本文所述的寡聚体合成。尺寸扩大的核碱基的示例如下所示：
Figure BDA0000982490820000151
共价连接至核糖、糖类似物或吗啉基的核碱基包括核苷。“核苷酸”包括核苷和一个磷酸基团。磷酸基团将相邻核苷酸互相共价连接以形成寡聚体。
如果寡聚体在生理条件下以明显大于40℃或45℃的Tm，优选至少50℃，并且一般为60℃-80℃或更高，与靶标杂交，则寡聚体与靶多核苷酸“特异性杂交”。这种杂交优选对应于严格杂交条件。在给定的离子强度和pH下，Tm是50％的靶序列与互补多核苷酸杂交的温度。这种杂交可发生于反义寡聚体与靶序列“近似”或“基本”互补，以及精确互补。
本文所用的“足够的长度”是指反义寡聚体与GAA内含子1、外显子2或内含子2的区，或跨越任意前述的区中的至少8个，更通常8-40个连续核碱基互补。足够的长度的反义寡聚体具有至少能够与突变RNA中的GAA前体mRNA的区特异性杂交的最小数量的核苷酸。优选地，足够的长度的寡聚体长度是8-30个核苷酸。更优选地，足够的长度的寡聚体长度是9-27个核苷酸。
本文所用术语“序列相同性”或者，例如，包含“与……50％相同的序列”是指在比较窗中序列在核苷酸或氨基酸的基础上相同的程度。因此，“序列相同性百分比”的计算方法可为在比较窗中比较两条最优比对的序列，确定两条序列上出现的相同核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位点数目以得出匹配位点的数目，将匹配位点的数目除以比较窗中总位点数目(即窗口大小)，并将结果乘以100以得出序列相同性百分比。用于比对比较窗的任选的序列比对可通过计算机执行算法来进行(威斯康星遗传学软件包发布版本7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算组(Genetics ComputerGroup)，科学大道575号(575Science Drive)，美国威斯康星州麦迪逊)或通过检查和最佳比对(即，导致比较窗上的最高百分比同源性)，其通过所选的多种方法中的任意生成。也参考BLAST程序家族，例如，Altschul等，Nucl.Acids Res.25：3389，1997所述。
“对象”或“有此需要的对象”包括哺乳动物对象，如人对象。示例性的哺乳动物对象患有GSD-II(或庞帕病)，或具有患GSD-II(或庞帕病)的风险。本文所用的术语“GSD-II”是指II型糖原贮积病(GSD-II或庞帕病)，这是一种常染色体隐性疾病，其一般的特征在于患病个体中GAA蛋白质的低表达。在某些实施方式中，对象在一种或多种组织，例如心脏、骨骼肌、肝脏和神经系统组织中有减少的GAA蛋白质的表达和/或活性。在一些实施方式中，对象在一种或多种组织，例如心脏、骨骼肌、肝脏和神经系统组织中有增加的糖原积累。在具体实施方式中，对象具有IVS1-13T＞G突变或其它突变，其导致功能性GAA蛋白质的表达减少(参见例如，Zampieri等，European J.Human Genetics.19：422-431，2011)。
本文所用术语“靶标”是指RNA区，并且具体指由GAA基因鉴定的区。在具体实施方式中，靶标是GAA-编码前体mRNA的内含子1或内含子2内的区，其负责对促进外显子2纳入的信号的抑制。在另一个实施方式中，靶标区是GAA外显子2的mRNA的区。
术语“靶序列”是指寡聚体类似物所针对的靶RNA的部分，即，寡聚体类似物将通过与互补序列的Watson-Crick碱基配对而杂交的序列。
术语“靶向序列”是寡聚体或寡聚体类似物中与RNA基因组中的“靶序列”互补(还表示，基本互补)的序列。反义寡聚体的完整序列或仅一部分可以与靶序列互补。例如，在具有20-30个碱基的寡聚体中，约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28，或29个可以是与靶标区互补的靶向序列。通常，靶向序列由寡聚体中的连续碱基形成，但是可替代性地由非连续序列形成，其放置在一起时，例如来自寡聚体的相反末端时，构成跨越靶序列的序列。
出于本发明的目的，“靶向序列”可与靶序列“近似”或“基本”互补并且仍然发挥功能，即，仍然是“互补的”。优选地，本发明中所用的寡聚体类似物化合物在10个核苷酸中与靶序列具有至多一个错配，并且优选在20个核苷酸中有至多一个错配。或者，所用的反义寡聚体与本文设计的示例性靶向序列有至少90％序列同源性，并且优选地至少95％序列同源性。
本文所用的术语“定量”或其它相关词语是指确定单位体积中核酸、多核苷酸、寡聚体、肽、多肽或蛋白质的量、质量或浓度。
本文所用的对象(例如，哺乳动物，如人)或细胞的“治疗”是指尝试改变个体或细胞中的天然过程中使用的任意类型的介入。治疗包括，但不限于，给予药物组合物，并且可预防性地或者在病理事件开始或接触病原物质之后进行。还包括“预防性”治疗，其可涉及减少治疗的疾病或病症的发展速率，延缓该疾病或病症的发生，或减少其发生的严重性。“治疗”或“预防”不一定表示疾病或病症或其相关症状的完全根除、治愈或防止。
II.用于GAA剪接调节的序列
某些实施方式涉及相对于细胞中外显子2缺失的GAA mRNA增强含外显子2的GAA-编码mRNA的水平的方法，包括使细胞与具有足够的长度和互补性以足以与GAA基因内的区特异性杂交的反义寡聚体接触，使得相对于细胞中外显子2缺失的GAA mRNA增强含外显子2的GAA mRNA的水平。在一些实施方式中，该细胞在对象中，并且该方法包括向该对象给予反义寡聚体。
反义寡聚体可经设计以阻断或抑制或调节mRNA的翻译或抑制或调节前体mRNA剪接加工，或者诱导靶向的mRNA的降解，并且可以说“针对”或“靶向”其杂交的靶序列。在某些实施方式中，靶序列包括包含预处理的mRNA的3’或5’剪接位点、分支点或参与剪接调节的其它序列的区。靶序列可在外显子内或内含子内或者跨内含子/外显子连接。
在某些实施方式中，反义寡聚体与靶RNA(即，调节剪接位点选择的RNA)有足够的序列互补性以通过有效方式阻断靶RNA(例如，前体mRNA)的区。在示例性实施方式中，这种GAA前体mRNA的阻断用于调节剪接，通过遮蔽天然蛋白质的结合位点(该位点在其它情况下会调节剪接)和/或通过改变靶向的RNA的结构来调节剪接。在一些实施方式中，靶RNA是靶前体mRNA(例如，GAA基因前体mRNA)。
反义寡聚体具有对靶RNA序列的足够的序列互补性以调节靶RNA的剪接表示该反义试剂具有的序列足以引发天然蛋白的结合位点的遮蔽，其在其它情况下会调节剪接，和/或改变靶向的RNA的三维结构。类似地，寡聚体试剂具有对靶RNA序列的足够序列互补性以调节靶RNA的剪接表示，该寡聚体试剂具有的序列足以引发对天然蛋白的结合位点的遮蔽，其在其它情况下会调节剪接，和/或改变靶向的RNA的三维结构。
在示例性实施方式中，反义寡聚体具有足够的长度和对人GAA前体mRNA的内含子1、人GAA前体mRNA的外显子2，或人GAA前体mRNA的的内含子2中的序列的互补性。还包括与跨越人GAA前体mRNA的内含子1/外显子2的区，或跨越人GAA前体mRNA的外显子2/内含子2的区互补的反义寡聚体。人GAA基因的内含子1(SEQ ID NO：1)、外显子2(SEQ ID NO：2)，和内含子2(SEQ ID NO：3)的序列示于下表1(SEQ ID NO：1的3’端附近高亮的T/G是上述的IVS1-13T＞G突变；该位置的核苷酸是T或G)。
Figure BDA0000982490820000191
Figure BDA0000982490820000201
Figure BDA0000982490820000211
Figure BDA0000982490820000221
Figure BDA0000982490820000231
在某些实施方式中，反义靶向序列被设计成与表1所列的一个或多个靶序列的区杂交。可使选择的反义靶向序列更短，例如，约12个碱基，或更长，例如，约40个碱基，并且可包含小量的错配，只要序列具有足够互补性以使与靶序列杂交后的剪接调节有效，并且任选地与RNA形成Tm为45℃或更高的异源双链体即可。
在某些实施方式中，靶序列和反义靶向序列之间的互补程度足够形成稳定的双链体。反义寡聚体与靶标RNA序列互补的区可以短至8-11个碱基，但可以是12-15个碱基或更多，例如，10-40个碱基、12-30个碱基、12-25个碱基、15-25个碱基、12-20个碱基，或15-20个碱基，包括这些范围之间的所有整数。具有约14-15个碱基的反义寡聚体一般足够长以具有独特的互补序列。在某些实施方式中，可能需要互补碱基的最小长度来实现所需的结合Tm，如本文所述。
在某些实施方式中，长达40个碱基的寡聚体可以是合适的，其中至少最小数量的碱基，例如10-12个碱基，与靶序列互补。在一些实施方式中，以小于约30个碱基的寡聚体长度优化细胞中促进的或激活的摄取。对于PMO寡聚体，如本文进一步所述，结合稳定性和摄取的最优平衡一般发生在18-25个碱基的长度。本发明包括由约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基组成的反义寡聚体(例如，PMO，PMO-X，PNA，LNA，2’-OMe)，其中至少约6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续或非连续碱基与表1的靶序列(例如，SEQ ID NO：1-3，跨越SEQ ID NO：1/2或SEQ ID NO：2/3的序列)互补。
反义寡聚体一般包含与人GAA基因的前体mRNA序列的内含子1、外显子2或内含子2之内或附近的区或序列足够互补的碱基序列。理想地，反义寡聚体能够有效调节GAA前体mRNA的异常剪接，并由此增加活性GAA蛋白质的表达。当寡聚体化合物能够被哺乳动物细胞主动摄取，并且一旦摄取即与靶标mRNA以超过约40℃或45℃的Tm形成稳定双链体(或异源双链体)时，这种要求被任选地满足。
在某些实施方式中，反义寡聚体可与靶序列100％互补，或者可包括错配，例如，以适应变体，只要寡聚体和靶序列之间形成的异源双链体足够稳定以耐受细胞核酸酶和体内可能发生的其它降解模式即可。因此，某些寡聚体可具有充分的互补性，这表示，在寡聚体和靶序列之间具有约或至少约70％序列互补性，例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列互补性。本文描述了不易被核酸酶切割的寡聚体主链。错配，如果存在，一般趋于杂交双链体的末端区的情况比处于中间的情况的失稳性更低。根据双链体稳定性的充分理解的原理，允许错配的数量将取决于寡聚体的长度，双链体中G∶C碱基对的百分比，和双链体中错配的位置。虽然，这种反义寡聚体不必与v靶序列100％互补，其有效地以稳定且特异性的方式结合至靶序列，以调节靶标前体RNA的剪接。
寡聚体和靶序列之间形成的双链体的稳定性随着结合Tm和双链体对细胞酶促切割的易感性变化。可通过常规方法测量寡聚体相对于互补序列RNA的Tm，如Hames等，《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization)，IRL出版社，1985，第107-108页或Miyada C.G.和Wallace R.B.，1987，寡聚体杂交技术(Oligomer Hybridization Techniques)，MethodsEnzymol.第154卷，第94-107页中所述的那些方法。在某些实施方式中，反义寡聚体可对应于互补序列RNA具有超过体温，并且优选超过约45℃或50℃的结合Tm。也包括范围为60-80℃或更高的Tm。按照熟知的原理，寡聚体对应于基于互补的RNA杂交体的Tm可通过增加双链体中C∶G配对碱基的比例，和/或通过增加异源双链体的长度(碱基对)来提高。同时，出于优化细胞摄取的目的，优选限制寡聚体的尺寸。出于该原因，在25或更少碱基长度下显示高Tm(45-50℃或更高)的化合物一般优于对于高Tm值需要大于25个碱基的那些化合物。
下表2显示与人GAA基因的内含子1、外显子2或内含子2前体mRNA序列完全互补的示例性靶向序列(5’-至-3’取向)。
Figure BDA0000982490820000261
Figure BDA0000982490820000271
Figure BDA0000982490820000281
Figure BDA0000982490820000291
因此，某些反义寡聚体可包含，或由以下组成或基本由以下组成：表1中的某序列(例如，SEQ ID NO：4-120)或其变体或连续或非连续部分。例如，某些反义寡聚体包含SEQID NO：4-120中任一个的约或至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个连续或非连续核苷酸。对于非连续部分，间插核苷酸可被删除或用不同的核苷酸取代，或可添加间插核苷酸。变体的其它示例包括在SEQ ID NO：4-120中任一个的完整长度上具有约或至少约70％序列相同性或同源性，例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性或同源性的寡聚体。
可按照本领域常规技术来测试反义寡聚体及其变体的活性。例如，可通过多种熟知的方法中的任一种来测试调查的RNA和蛋白质的剪接形式和表达水平，以检测转录的核酸或蛋白质的剪接形式和/或表达。这类方法的非限制性示例包括RNA的剪接形式的RT-PCR，之后是PCR产物的尺寸分离，核酸杂交方法，例如，Northern印迹和/或使用核酸阵列；核酸扩增方法；用于检测蛋白质的免疫学方法；蛋白质纯化方法；和蛋白质功能或活性试验。
可通过从细胞、组织或生物体中制备mRNA/cDNA(即，转录的多核苷酸)，并且将mRNA/cDNA与待分析核酸互补的参照多核苷酸或其片段杂交，来评价RNA表达水平。cDNA可任选地使用多种聚合酶链反应或体外转录方法中的任一种扩增，之后与互补多核苷酸杂交；优选地，其不经扩增。也可使用定量PCR来检测一种或多种转录本的表达以评价转录本的表达水平。
III.反义寡聚体化学
A.一般特征
本发明的某些反义寡聚体特异性杂交内含子剪接沉默子元件或外显子剪接沉默子元件。一些反义寡聚体包含表2所列的靶向序列、表2中靶向序列的至少10个连续核苷酸的片段，或与表2中的靶向序列有至少80％序列相同性的变体。具体反义寡聚体由或基本由表2所列靶向序列组成。在一些实施方式中，所述寡聚体是核酸酶耐受性的。
在某些实施方式中，反义寡聚体包含选自以下的非天然化学主链：氨基磷酸酯或磷二酰胺吗啉代寡聚体(PMO)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚体、三环-DNA寡聚体、三环-硫代磷酸酯寡聚体、2’O-Me-修饰的寡聚体，或前述的任意组合，以及与人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQ ID NO：1)、内含子2(SEQ ID NO：2)，或外显子2(SEQ ID NO：3)内的区互补的靶向序列。例如，在一些实施方式中，靶向序列选自SEQID NO：4-120，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
本发明的反义寡聚体一般包含多种核苷酸亚基，各自含有核碱基，其一起形成或包含靶向序列，例如，如上所述。因此，在一些实施方式中，反义寡聚体的长度为约10至约40个亚基，更优选约10至30个亚基，并且一般是15-25个亚基。例如，本发明的反义化合物的长度可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39，或40个亚基，或其范围是10个亚基至40个亚基、10个亚基至30个亚基、14个亚基至25个亚基、15个亚基至30个亚基、17个亚基至30个亚基、17个亚基至27个亚基、10个亚基至27个亚基、10个亚基至25个亚基，和10个亚基至20个亚基。在某些实施方式中，反义寡聚体的长度是约10至约40或约5至约30个核苷酸。在一些实施方式中，反义寡聚体的长度是约14至约25或约17至约27个核苷酸。
在一些实施方式中，反义寡聚体的主链基本不带电，并且任选地被识别为供于主动或促进的跨细胞膜转运的底物。在一些实施方式中，所有的核苷间连接是不带电的。寡聚体与靶标RNA形成稳定双链体的能力还可与主链的其它特征相关，包括反义寡聚体相对于靶标的互补程度和长度、G∶C与A∶T碱基配对的比率，和任意错配碱基的位置。反义寡聚体耐受细胞核酸酶的能力可能促进该物质向细胞胞质的持续和最终递送。示例性的反义寡聚体靶向序列列于表2(同上)。
在某些实施方式中，反义寡聚体具有在生理pH下带正电或阳离子的至少一个核苷间连接。在一些实施方式中，反义寡聚体具有显示约5.5至约12的pKa的至少一个核苷间连接。任选地，反义寡聚体具有含有碱性氮和烷基、芳基或芳烷基的至少一个核苷间连接。在具体实施方式中，一个或多个阳离子核苷间连接包含4-氨基哌啶-1-基(APN)基团或其衍生物。虽然不受任意理论限制，认为寡聚体中阳离子连接的存在(例如，APN基团或APN衍生物)促进与靶核苷酸中带负电的磷酸酯的结合。因此，突变RNA和含阳离子连接的寡聚体之间的异源双链体的形成可同时通过离子吸引力和Watson-Crick碱基配对保持在一起。
在一些实施方式中，阳离子连接的数量是至少2并且不超过总核苷间连接的约一半，例如，约或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个阳离子连接。然而，在一些实施方式中，至多所有核苷间连接是阳离子连接，例如总核苷间连接中的约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个是阳离子连接。在具体实施方式中，约19-20个亚基的寡聚体可具有2-10，例如4-8个阳离子连接，并且其余是不带电的连接。在其它具体实施方式中，14-15个亚基的寡聚体可具有2-7，例如2、3、4、5、6或7个阳离子连接，并且其余是不带电的连接。因此，寡聚体中阳离子连接的总数可在约1至10至15至20至30或更多(包括其间的所有整数)，并且可在整个寡聚体中间插。
在一些实施方式中，反义寡聚体可是每2-5或2、3、4、或5个不带电连接具有约或至多约1个阳离子连接，如每10个不带电连接有约4-5、或4或4个。
某些实施方式包括反义寡聚体，其含有约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％阳离子连接。在某些实施方式中，如果约25％的主链连接是阳离子性的，则可显示反义活性的最优改善。在某些实施方式中，小量，例如，10-20％阳离子连接，或者50-80％范围内，如约60％的阳离子连接数量，可显示增强。
在一些实施方式中，阳离子连接沿着主链间插。这类寡聚体任选地含有至少2个连续的不带电连接；即，任选地，寡聚体沿着其完整长度没有严格交替的模式。在具体情况中，1个或2个阳离子连接各自沿着主链相隔至少1、2、3、4或5个不带电的连接。
还包括具有阳离子连接的嵌段和不带电连接的嵌段的寡聚体。例如，不带电连接的中心嵌段可侧接阳离子连接的嵌段，反之亦然。在一些实施方式中，寡聚体具有大致等长度的5’、3’和中心区，并且中心区中的阳离子连接的百分比大于阳离子连接总数的约50％、60％、70％或80％。
在某些反义寡聚体中，阳离子连接的分布整体靠近“中心区”主链连接，例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个最中心的连接。例如，16、17、18、19、20、21、22、23或24-聚寡聚体的至少50％、60％、70％或80％的总阳离子连接可位于8、9、10、11或12个最中心连接处。
B.主链化学特征
反义寡聚体可采用多种反义化学物。寡聚体化学物的示例包括，但不限于，肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯、2’O-Me-修饰的寡聚体、吗啉基、PMO、PPMO、PMO加(PMOplus)，和PMO-X化学物，包括前述的任意组合。通常，PNA和LNA化学物可采用较短的靶向序列，因为它们相对于PMO和2’O-Me寡聚体具有较高的靶标结合强度。硫代磷酸酯和2’O-Me-修饰的化学物通常结合以产生2’O-Me-硫代磷酸酯主链。参见例如，PCT公开号WO/2013/112053和WO/2009/008725，其通过引用全文纳入本文。
在一些情况中，反义寡聚体如PMO可偶联至细胞穿透肽(CPP)以促进胞内递送。肽-偶联的PMO也称为PPMO并且某些实施方式包括PCT公开号WO/2012/150960中所述的那些，其通过引用全文纳入本文。
1.肽核酸(PNA)
肽核酸(PNA)是DNA的类似物，其中主链与脱氧核糖主链结构上同态，由附连嘧啶或嘌呤碱基的N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元组成。含天然嘧啶和嘌呤碱基的PNA按照Watson-Crick碱基配对法则与互补寡聚体杂交，并且在碱基对识别上模拟DNA(Egholm，Buchardt等，1993)。PNA的主链由肽键而非磷酸二酯键形成，使得它们非常适于反义应用(参见以下结构)。主链不带电，产生显示高于正常热稳定性的PNA/DNA或PNA/RNA双链体。PNA并不被核酸酶或蛋白酶识别。PNA的非限制性示例如下所示：
Figure BDA0000982490820000331
且不论对于天然结构的基团结构变化，PNA能够以螺旋形式序列特异性地结合DNA或RNA。PNA的特征包括对互补DNA或RNA的高结合亲和性，由单碱基错配产生的失稳作用，对核酸酶和蛋白酶的耐受性，与盐浓度无关的与DNA或RNA的杂交，和与同型嘌呤DNA的三链体形成。PANAGENE.TM.已经开发了专有的Bts PNA单体(Bts；苯并噻唑-2-磺酰基团)和专有的寡聚工艺。使用Bts PNA单体的PNA寡聚化包括去保护、偶联和加帽的重复循环。PNA可用本领域已知的任何技术合成。参见例如，美国专利号6,969,766、7,211,668、7,022,851、7,125,994、7,145,006和7,179,896。PNA的制备还参见美国专利号5,539,082、5,714,331和5,719,262。PNA化合物的其它教导参见Nielsen等，Science，254：1497-1500，1991。上述参考文献各自通过引用全文纳入本文。
2.锁核酸(LNA)
反义寡聚体化合也可含有“锁核酸”亚基(LNA)。“LNA”属于一类称为桥连的核酸(BNA)的修饰。BNA的特征在于锁定C30-内源(北)糖褶皱(C30-endo(northern)sugarpucker)中核糖环的构象的共价连接。对于LNA，桥连包括2’-O和4’-C位之间的亚甲基。LNA增强主链预组织和碱基堆叠，以增加杂交和热稳定性。
LNA的结构可见于，例如，Wengel等，Chemical Communications(1998)455；Tetrahedron(1998)54：3607，和Accounts of Chem.Research(1999)32：301)；Obika等，Tetrahedron Letters(1997)38：8735；(1998)39：5401，和Bioorganic MedicinalChemistry(2008)16：9230。LNA的非限制性示例如下所示：
Figure BDA0000982490820000351
本发明的化合物可纳入一个或多个LNA；在一些情况中，化合物可完全由LNA组成。在例如美国专利号7,572,582、7,569,575、7,084,125、7,060,809、7,053,207、7,034,133、6,794,499和6,670,461中描述了单个LNA核苷亚基的合成及其纳入寡聚体的方法，其各自通过引用全文纳入本文。典型的亚基间接头包括磷酸二酯和硫代磷酸酯部分；或者，可采用不含磷的接头。一个实施方式中含LNA的化合物，其中各LNA亚基由DNA亚基分开。某些化合物由交替的LNA和DNA亚基组成，其中亚基间接头是硫代磷酸酯。
3.硫代磷酸酯
“硫代磷酸酯”(或S-寡聚体)是正常DNA的变体，其中非桥连氧之一被硫替换。硫代磷酸酯的非限制性示例如下所示：
Figure BDA0000982490820000352
核苷酸间键的硫化减少了内切核酸酶和外切核酸酶的作用，包括5’至3’和3’至5’DNA POL 1外切核酸酶、核酸酶S1和P1、RNA酶、血清核酸酶和蛇毒磷酸二酯酶。通过2种主要途径来制备硫代磷酸酯：通过二硫化碳中单质硫溶液对氢膦酸酯的作用，或通过用二硫化四乙基秋兰姆(TETD)或3H-1，2-苯并二巯基-3-酮1，1-二氧化物(BDTD)硫化亚磷酸三酯的方法(参见，例如，Iyer等，J.Org.Chem.55，4693-4699，1990)。后一种方法避免了单质硫在大多数有机溶剂中不溶以及二硫化碳毒性的问题。TETD和BDTD方法也产生更高纯度的硫代磷酸酯。
4.三环-DNA和三环-硫代磷酸酯核苷酸
三环-DNA(tc-DNA)是一类限制的DNA类似物，其中各核苷酸通过引入环丙烷环来修饰以限制主链的构象挠性并优化扭转角γ的主链几何学。含同碱性腺嘌呤和胞嘧啶的tc-DNA与互补RNA形成极稳定的A-T碱基对。三环-DNA及其合成描述于国际专利申请公开号WO 2010/115993。本发明的化合物可纳入一个或多个三环-DNA核苷酸；在一些情况中，化合物可完全由三环-DNA核苷酸组成。
三环-硫代磷酸酯核苷酸是具有硫代磷酸酯亚基间连接的三环-DNA核苷酸。三环-硫代磷酸酯核苷酸及其合成描述于国际专利申请公开号WO 2013/053928。本发明的化合物可纳入一个或多个三环-DNA核苷酸；在一些情况中，化合物可完全由三环-DNA核苷酸组成。三环-DNA/三环-硫代磷酸酯的非限制性示例如下所示：
Figure BDA0000982490820000361
5.2’O-甲基寡聚体
“2’O-Me寡聚体”分子在核糖分子的2’-OH残基处携带甲基。2’-O-Me-RNA显示与DNA相同(或相似)的性质，但是被保护免受核酸酶降解。2’-O-Me-RNA也可与硫代磷酸酯寡聚体(PTO)组合用于进一步稳定化。可按照本领域的常规技术合成2’O-Me寡聚体(磷酸二酯或硫代磷酸酯)(参见，例如，Yoo等，Nucleic Acids Res.32：2008-16，2004)。2’O-Me寡聚体的非限制性示例如下所示：
Figure BDA0000982490820000371
2’O-Me寡聚体也可包含硫代磷酸酯键(2’O-Me硫代磷酸酯寡聚体)。
6.吗啉代寡聚体
“吗啉代寡聚体”或“PMO”是指具有支持能够与典型的多核苷酸形成氢键的核碱基的主链，其中该聚合物缺少戊糖主链部分，而是含有吗啉环。因此，在PMO中，吗啉环结构支持碱基配对部分，以形成碱基配对部分的序列，其一般被设计成与治疗的细胞或对象中的选择的反义靶标杂交。示例性的“吗啉代”寡聚体包含通过氨基磷酸酯(phosphoramidate)和磷二酰胺(phosphorodiamidate)连接方式连接在一起的吗啉代亚基结构，将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的4’环外碳接合，各亚基包含有效于通过碱基特异性氢键结合至多核苷酸中的碱基的嘌呤或嘧啶核碱基。例如，在美国专利号5,698,685、5,217,866、5,142,047、5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,521,063、5,506,337，和在审美国专利申请12/271,036、12/271,040，和PCT公开号WO/2009/064471和WO/2012/043730中详细描述了吗啉代寡聚体(包括反义寡聚体)，其全部通过引用全文纳入本文。
在寡聚体结构内，磷酸酯基团通常是指形成寡聚体的“核苷间连接”。RNA和DNA的天然产生的核苷间连接是3’至5’磷酸二酯键。“氨基磷酸酯(phosphoramidate)”基团包含具有3个附连的氧原子和1个附连的氮原子的磷，而“磷二酰胺(phosphorodiamidate)”基团包含具有2个附连的氧原子和2个附连的氮原子的磷。在本文所述的PMO和/或PMO-X寡聚体的不带电或阳离子亚基间连接中，一个氮总是在主链之侧。磷二酰胺连接中的第二个氮一般是吗啉环结构中的环氮。
“PMO-X”是指具有带有(i)与吗啉环的氮原子的共价键和(ii)与4-氨基哌啶-1-基(即，APN)或4-氨基哌啶-1-基的衍生物的环氮的第二共价键的磷原子的磷二酰胺吗啉代寡聚体(PMO)。示例性的PMO-X寡聚体公开于PCT申请号PCT/US2011/38459和PCT公开号WO/2013/074834，其各自通过引用全文纳入本文。“PMO-apn”或“APN”是指PMO-X寡聚体，其包含至少一个核苷间连接，其中磷原子连接至吗啉基团和4-氨基哌啶-1-基的环氮(即，APN)。在具体实施方式中，包含表2所示的靶向序列的反义寡聚体包含至少一个含APN的连接或含APN衍生物的连接。具体实施方式包括具有约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的含APN/APN衍生物的连接的PMO，其中剩余的连接(如果低于100％)是不带电的连接，例如，总核苷间连接中的约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个是含APN/APN衍生物的连接。
在一些实施方式中，反义寡聚体是式(I)的化合物：
Figure BDA0000982490820000391
或其药学上可接受的盐，其中：
各Nu是核碱基，一起形成靶向序列；
x是8-38的整数；
各Y独立地选自O或-NRa，其中Ra选自氢、-T1-NRcRdRe和-[(C(O)CHR′NH)m]R″，其中：
R′是天然产生的氨基酸或其一个或两个碳的同系物的侧链，R″选自氢或酰基，m是1-60的整数，Rc选自氢、C1-C6烷基、芳烷基和-C(＝NH)NH2，Rd选自氢、芳烷基、和C1-C6烷基，或者Rc和Rd与其附连的氮原子一起形成5-7元环，当Rc和Rd各自独立地是C1-C6烷基或芳烷基时，其中该环任选地被选自C1-C6烷基、苯基、卤素和芳烷基的取代基取代，并且Re选自电子对、氢、C1-C6烷基和芳烷基；
各L独立地选自-P(O)2OH-、-P(O)2R1-、-P(O)2(N(CH3)3-N(CH3)CH2C(O)NH2、哌嗪基、羰基、H(O(CH2)sO)w-、-(OCH2CH2O)w和-[(C(O)CHR′NH)m]R″，其中w是3-20的整数，S是1-8的整数；
n是0-3的整数；
各R1独立地选自-N(CH3)2、-NR5R6、-OR7，
式(II)的部分：
Figure BDA0000982490820000401
其中，R8选自氢、甲基、-C(＝NH)NH2、-Z-T2-NHC(＝NH)NH2和-[(C(O)CHR′NH)m]R″，其中Z是羰基或直接键，R9选自电子对、氢、C1-C6烷基和芳烷基，并且各R10独立地选自氢或甲基；和
式(III)的部分：
Figure BDA0000982490820000402
其中q是0-2的整数，R11选自氢、C1-C6烷基、芳烷基和-C(＝NH)NH2，R12选自氢、芳烷基和C1-C6烷基，或者R11和R12和其附连的氮原子一起形成5-7元环，其中环任选地被选自C1-C6烷基、苯基、卤素和芳烷基的取代基取代，并且R13选自电子对、氢、C1-C6烷基和芳烷基；
R2选自氢、OH、核苷酸、-(CH2)mC(O)NRfRg，其中Rf和Rg独立地选自H、酰基、C1-C6烷基和-[(C(O)CHR′NH)m]R″、-[(C(O)CHR′NH)m]R″、H(O(CH2)sO)w-、H(OCH2CH2O)w-、三苯甲基、-C(＝O)ORf和酰基，其中Rf是C1-C30烷基，其包含一个或多个氧或羟基部分或其组合，或R2不存在；
R3选自氢、C1-C6烷基、核苷酸、-[(C(O)CHR′NH)m]R″、-C(＝NH)NH2、三苯甲基、-C(＝O)ORg、酰基、-C(O)(CH2)mC(O)和T4-(4-(4，6-(NR2)-1，3，5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基，其中Rg是C1-C30烷基，其包含一个或多个氧或羟基部分或其组合，T4选自-C(O)(CH2)6C(O)-或-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-，并且R是-(CH2)OC(O)NH(CH2)6NHC(NH)NH2；
R4选自电子对、氢、C1-C6烷基和酰基，并且
各R5独立地选自氢或甲基；
各R6和各R7独立地选自氢或-T3-NRcRdRe；并且
各T1、T2、和T3独立地是长度至多为18个原子的任选接头，包括烷基、烷氧基或烷氨基，或其组合，
其中，靶向序列与人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQ IDNO：1)、内含子2(SEQ ID NO：2)或外显子2(SEQ ID NO：3)内的区互补。
在一些实施方式中，R3是部分T4-(4-(4，6-(NR2)-1，3，5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基，其中T4选自-C(O)(CH2)6C(O)-或-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-，并且R是-(CH2)OC(O)NH(CH2)6NHC(NH)NH2。这类部分还描述于美国专利号7,935,816，其通过引用全文纳入本文。
在某些实施方式中，R3可包括以下部分：
Figure BDA0000982490820000411
在某些实施方式中，各R1是-N(CH3)2。在一些实施方式中，约50-90％的R1基团是二甲基氨基(即，-N(CH3)2)。在某些实施方式中，约66％的R1基团是二甲基氨基。
在一些实施方式中，靶向序列选自SEQ ID NO：4-120，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。在一些实施方式中，各R1是-N(CH3)2并且靶向序列选自SEQ ID NO：4-120，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
在本发明的一些实施方式中，R1可选自下组：
Figure BDA0000982490820000421
在一些实施方式中，至少一个R1是：
Figure BDA0000982490820000422
在某些实施方式中，n是2，R2和L一起是下式：
Figure BDA0000982490820000431
并且，每次出现的Y是O。
在其它实施方式中，反义寡聚体是式(IV)的化合物：
Figure BDA0000982490820000432
或其药学上可接受的盐，其中：
各Nu是核碱基，一起形成靶向序列；
x是8-38的整数；
各L独立地选自-P(O)2OH-、-P(O)2R1、-P(O)2(N(CH3)3-N(CH3)CH2C(O)NH2、哌嗪基、羰基、H(O(CH2)sO)w-、-(OCH2CH2O)w、和-[(C(O)CHR′NH)m]R″，其中w是3-20的整数，S是1-8的整数；R′是天然产生的氨基酸或其一个或两个碳的同系物的侧链，R″选自氢或酰基，m是1-60的整数；
n是0-3的整数；
R2选自氢、OH、核苷酸、-(CH2)mC(O)NRfRg，其中Rf和Rg独立地选自H、酰基、C1-C6烷基和-[(C(O)CHR′NH)m]R″、-[(C(O)CHR′NH)m]R″、H(O(CH2)sO)w-、H(OCH2CH2O)w-、三苯甲基、-C(＝O)ORf和酰基，其中Rf是C1-C30烷基，其包含一个或多个氧或羟基部分或其组合，或R2不存在；
R3选自氢、C1-C6烷基、核苷酸、-[(C(O)CHR′NH)m]R″、-C(＝NH)NH2和酰基；并且
R4选自电子对、氢、C1-C6烷基和酰基，
其中，靶向序列与人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQ IDNO：1)、内含子2(SEQ ID NO：2)或外显子2(SEQ ID NO：3)内的区互补。
在一些实施方式中，n是2，R2和L一起是下式：
R3是氢；并且R4是电子对。
在一些实施方式中，反义寡聚体是式(V)的化合物：
Figure BDA0000982490820000451
或其药学上可接受的盐，其中：
各Nu是核碱基，一起形成靶向序列；
x是8-38的整数；各L独立地选自-P(O)2OH-、-P(O)2R1-、-P(O)2(N(CH3)3-N(CH3)CH2C(O)NH2、哌嗪基、羰基、H(O(CH2)sO)w-、-(OCH2CH2O)w和-[(C(O)CHR′NH)m]R″，其中w是3-20的整数，S是1-8的整数，R′是天然产生的氨基酸或其一个或两个碳的同系物的侧链，R″选自氢或酰基，m是1-60的整数；
n是0-3的整数；并且
R2选自氢、OH、核苷酸、-(CH2)mC(O)NRfRg，其中Rf和Rg独立地选自H、酰基、C1-C6烷基和-[(C(O)CHR′NH)m]R″、-[(C(O)CHR′NH)m]R″、H(O(CH2)sO)w-、H(OCH2CH2O)w-、三苯甲基、-C(＝O)ORf和酰基，其中Rf是C1-C30烷基，其包含一个或多个氧或羟基部分或其组合，或R2不存在，
其中，靶向序列与人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQ IDNO：1)、内含子2(SEQ ID NO：2)、或外显子2(SEQ ID NO：3)内的区互补。
在一些实施方式中，n是2；并且
R2和L一起是下式：
Figure BDA0000982490820000461
在某些实施方式中，本发明的反义寡聚体是式(VI)的化合物：
Figure BDA0000982490820000462
或其药学上可接受的盐，其中：
各Nu是核碱基，一起形成靶向序列；
x是15-25的整数；
各Y是O；
各R1独立地选自下组：
Figure BDA0000982490820000471
其中，至少一个R1是-N(CH3)2，并且
其中，靶向序列选自SEQ ID NO：4-120，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。在一些实施方式中，各R1是-N(CH3)2。
在一些实施方式中，包括式(I)、(IV)、(V)和(VI)的化合物的本发明的反义寡聚体的各Nu独立地选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、次黄嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C5-丙炔基-修饰的嘧啶、和9-(氨基乙氧基)吩噁嗪。在一些实施方式中，包括式(I)、(IV)、(V)和(VI)的化合物的本发明的反义寡聚体的靶向序列选自SEQ ID NO：4-120，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
在某些实施方式中，反义寡聚体是式(VII)的化合物：
Figure BDA0000982490820000472
或其药学上可接受的盐，其中：
各Nu是核碱基，一起形成靶向序列；并且
x是8-38的整数；
其中，靶向序列选自SEQ ID NO：4-120，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
可按照本发明使用的其它反义寡聚体/化学物包括以下专利和专利公开文本中所述的那些，其内容通过引用全文纳入本文：PCT公开号WO/2007/002390、WO/2010/120820和WO/2010/148249；美国专利号7,838,657；和美国申请号2011/0269820。
C.用碱性氮核苷间接头制备PMO-X
可例如美国专利号5,185,444和7,943,762所述制备吗啉代亚基，修饰的亚基间连接，以及包含它们的寡聚体，其通过引用全文纳入本文。可按照以下通用反应方案I来制备吗啉代亚基。
反应方案1吗啉代亚基的制备
Figure BDA0000982490820000481
参照反应方案1，其中B代表碱基配对部分并且PG代表保护基团，吗啉代亚基可从所示的相应核糖核苷(1)制备。可任选地通过与合适的保护基团前体，例如三苯甲基氯的反应来保护吗啉代亚基(2)。如下文详述，一般在固态寡聚体合成期间去除3’保护基团。碱基配对部分可经合适地保护以用于固相寡聚体合成。合适的保护基团包括针对腺嘌呤和胞嘧啶的苯甲酰基，针对鸟嘌呤的苯基乙酰基，和针对次黄嘌呤的新戊酰氧基甲基(I)。可将新戊酰氧基甲基导入次黄嘌呤杂环碱基的N1位上。虽然，可采用未保护的次黄嘌呤亚基，但当碱基受到保护时，产生的活化反应优越得多。其它合适的保护基团包括共同在审的美国申请号12/271,040中公开的那些，其通过引用全文纳入本文。
3与活化的含磷化合物4的反应产生具有所需连接部分5的吗啉代亚基。可使用本领域技术人员已知的任意数量的方法制备结构4的化合物。例如，可通过将相应的胺与氧氯化磷反应来制备这类化合物。在这一方面，可使用本领域已知的任意技术来制备胺起始材料，例如实施例和美国专利号7,943,762中公开的那些方法。
结构5的化合物可用于固相自动化寡聚体合成，用于制备包含亚基间连接的寡聚体。此类方法是本领域众所周知的。简言之，可在5’末端修饰结构5的化合物以含有连至固体支持物的接头。例如，化合物5可通过包含L11和L15的接头连接至固体支持物。示例性的方法显示于图1和2。一旦得到支持，去除保护基团(例如，三苯甲基)并且游离的胺与结构5的第二化合物的活化的含磷部分发生反应。重复这一顺序直至得到所需长度的寡聚体。如果需要5’-修饰，5’末端中的保护基团可去除或者保留。可使用任意数量的方法来从固体支持物上去除寡聚体，例如，用DTT处理之后用氢氧化铵处理，如图3和4所示。
在实施例中更详细地描述了修饰的吗啉代亚基和吗啉代寡聚体的制备。可使用本文所述的方法、本领域已知的方法和/或本文中参考文献所述的方法来制备含任意数量的修饰的键的吗啉代寡聚体。实施例中还描述了如前所述制备的吗啉代寡聚体的整体修饰(参见，例如，PCT公开号WO2008036127)。
术语“保护基团”是指封阻化合物的一些或全部部分并且在去除保护基团之前阻止这些部分参与化学反应的化学部分，例如，T.W.Greene，P.G.M.Wuts，《有机合成中的保护基团》(Protective Groups in Organic Synthesis)，第三版，约翰威利父子公司(JohnWiley&Sons)(1999)中所列和所述的那些部分。采用不同保护基团，其中通过不同手段去除各(不同)保护基团是优选的。在完全不同的反应条件下切割的保护基团允许这类保护基团的差异去除。例如，可由酸、碱和水解来去除保护基团。如三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、缩醛和叔丁基二甲基甲硅烷基的基团是酸不稳定的并且可用于在用Cbz基团保护的氨基存在下保护羧基和羟基反应性基团，其可通过水解去除，以及Fmoc基团，其是碱不稳定的。在用酸不稳定基团(如氨基甲酸叔丁酯)或酸和碱都稳定但可水解去除的氨基甲酸酯封闭的胺存在下，可用碱不稳定基团封闭羧酸部分，诸如但不限于甲基或乙基，并且可用碱不稳定基团封阻羟基反应部分，如乙酰基。
也可用水解可去除的保护基团，如苄基，来封阻羧酸和羟基保护部分，而用碱不稳定基团如Fmoc来封阻胺基团。用于式(I)的化合物的合成的特别有用的胺保护基团是三氟乙酰胺。可用可氧化去除的保护基团如2，4-二甲氧基苄基来封阻羧酸反应性部分，并且可用氟化物不稳定氨基甲酸硅烷来封阻共同存在的氨基。
在酸和碱保护基团存在下可使用烯丙基封阻基团，由于其是稳定的并且可随后通过金属或pi-酸催化剂去除。例如，在酸不稳定的氨基甲酸叔丁酯或碱不稳定的乙酸胺保护基团存在下，可用钯(0)-催化的反应来对烯丙基封阻的羧酸进行去保护。另一种形式的保护基团是可附连化合物或中间体的树脂。只要残基与树脂附连，功能性基团即被封阻并且无法反应。一旦从树脂上释放，功能性基团可发生反应。
一般的封阻/保护基团是本领域已知的并且包括，但不限于以下部分：
除非另外说明，所有的化学物都获自西格玛-奥德里奇-伏路卡公司(Sigma-Aldrich-Fluka)。苯甲酰基腺嘌呤、苯甲酰基胞嘧啶和苯基乙酰基鸟嘌呤获自英国的Carbosynth有限公司。
含本文所述的其它连接修饰的PMO、PMO+、PPMO和PMO-X的合成使用本领域已知和在审美国申请号12/271,036和12/271,040以及PCT公开号WO/2009/064471中所述的方法进行，其通过引用全文纳入本文。
基本如PCT公开号WO/2009/064471中所述合成带3’三苯甲基修饰的PMO，除了省去去三苯甲基步骤以外。
IV.制剂
本发明的化合物也可与其它分子、分子结构或化合物的混合物，例如脂质体、靶向受体的分子、口服、直肠、局部或其它制剂混合、包封、偶联或结合，用于辅助摄取、分布和/或吸收。教导这类摄取、分布和/或吸附辅助的制剂的代表性美国专利包括，但不限于，美国专利号5,108,921、5,354,844、5,416,016、5,459,127、5,521,291、5,543,158、5,547,932、5,583,020、5,591,721、4,426,330、4,534,899、5,013,556、5,108,921、5,213,804、5,227,170、5,264,221、5,356,633、5,395,619、5,416,016、5,417,978、5,462,854、5,469,854、5,512,295、5,527,528、5,534,259、5,543,152、5,556,948、5,580,575和5,595,756，其各自通过引用纳入本文。
本发明的反义化合物包括任何药学上可接受的盐、酯或这类酯的盐，或任何其它化合物，其在给予动物(包括人)之后能够(直接或间接)提供生物活性的代谢物或其残基。因此，例如，本发明也涉及本发明的化合物的前药和药学上可接受的盐、这类前药的药学上可接受的盐，及其它生物等效物。
术语“前药”是指以无活性形式制备的治疗剂，其通过内源性酶或其它化学物和/或条件的作用在体内或细胞内转化成活性形式(即，药物)。具体地，本发明的寡聚体的前药形式按照1993年12月9日公开的Gosselin等的WO 93/24510或Imbach等的WO 94/26764和美国专利号5,770,713中所述的方法制备成SATE[(S-乙酰基-2-硫代乙基)磷酸酯]衍生物。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的生理上和药学上可接受的盐：即，保留母核化合物的所需生物活性并且其不具有不希望的毒理学影响的盐。对于寡聚体，药学上可接受的盐及其用途的示例还描述于美国专利号6,287,860，其通过引用全文纳入本文。
本发明还包括包含本发明的反义化合物的药物组合物和制剂。根据是否需要局部或全身治疗和待治疗的区域，本发明的药物组合物还可通过多种方式给予。给予可以是局部(包括眼部和粘膜，包括阴道和直肠递送)，肺，例如，通过粉末或气溶胶吸入或吹入，包括通过喷雾器；气管内，鼻内，表皮和透皮)，口服或胃肠外形式。胃肠外给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输液；或颅内如鞘内或心室内给药。认为带有至少一个2′-O-甲氧基乙基修饰的寡聚体可特别用于口服给药。外用给药的药物组合物和制剂可包括透皮贴片、油膏剂、乳液、软膏剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷剂、液体和粉末。常规药学载体、水、粉末或油状基底、增稠剂等可能是必须或需要的。也可使用包被的避孕套、手套等。
可按照制药工业熟知的常规技术制备本发明的药物制剂，其可以单位剂型形式方便地存在。这类技术包括将活性成分与药物运载体或赋形剂结合在一起的步骤。一般通过使活性成分与液体载体，或精细磨碎的固体载体或二者均匀且紧密地结合，然后(如果需要)使产品成形，来制备制剂。
本发明的组合物还可配制成许多可能剂型中的任一种，诸如但不限于，片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软胶、栓剂和灌肠剂。也可利用水性、非水性或混合的介质将本发明的组合物配制成混悬液。水性悬液还可包含增加悬液粘度的物质，例如，羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或右旋糖苷。悬液也可含有稳定剂。
本发明的药物组合物包括，但不限于，溶液、乳液、泡沫和含脂质体制剂。本发明的药物组合物和制剂可包含一种或多种渗透强化剂、运载体、赋形剂或其它活性或无活性成分。
乳液一般是以直径通常超过0.1μm的液滴形式分散在一种液体中的另一种液体的非均相体系。除了包含分散相以外，乳液可含有其它组分，且活性药物可以水相、油相存在于溶液中或其本身作为独立的相存在。本发明的实施方式包括微乳液。乳液及其用途是本领域熟知的并且还描述于美国专利号6,287,860，其通过引用全文纳入本文。
本发明的制剂包括脂质体制剂。本发明所用术语“脂质体”表示以球形双层排列的两性脂质组成的囊泡。脂质体是单层或多层囊泡，其具有由亲脂材料形成的膜和含有待递送的组合物的水性内腔。阳离子脂质体是带正电的脂质体，其被认为能与带负电的DNA分子相互作用以形成稳定的复合物。pH-敏感或带负电的脂质体被认为能捕获DNA而不是与其复合。阳离子和非阳离子脂质体都已经用于向细胞递送DNA。
脂质体也包括“空间上稳定化的”脂质体，本文使用的这一术语是指包含一种或多种专门的脂质的脂质体，当纳入脂质体时，专门的脂质能获得相对于缺少这种专门的脂质的脂质体增强的循环寿命。空间上稳定化的脂质体的示例是脂质体的囊泡形成脂质部分的一部分包含一种或多种糖脂，或者用一种或多种亲水性聚合物衍生化，如聚乙二醇(PEG)部分。脂质体及其用途的示例还描述于美国专利号6,287,860，其通过引用全文纳入本文。
本发明的药物制剂和组合物也可包括表面活性剂。表面活性剂在药物产品、制剂和乳液中的用途是本领域熟知的。表面活性剂及其用途的示例还描述于美国专利号6,287,860，其通过引用全文纳入本文。
在一些实施方式中，本发明采用多种渗透增强剂来实现核酸(尤其是寡聚体)的高效递送。除了辅助非亲脂性药物扩散穿过细胞膜以外，渗透增强剂也增强亲脂性药物的渗透性。渗透增强剂可被分类为属于5种大类之一，即，表面活性剂、脂肪酸、胆盐、螯合剂、和非螯合非表面活性剂。渗透增强剂及其用途的示例还描述于美国专利号6,287,860，其通过引用全文纳入本文。
本领域技术人员会认识到通常按照它们的预定用途，即给药途径设计制剂。
用于局部给药的制剂包括其中本发明的寡聚体与局部递送剂如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些。脂质和脂质体包括中性(例如，二油酰基磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰基磷脂酰胆碱)、带负电(例如，二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油DMPG)和阳离子(例如，二油酰基四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰基磷脂酰乙醇胺DOTMA)。
对于局部或其它给药，本发明的寡聚体可包封在脂质体内或可与其形成复合物，尤其是阳离子脂质体。或者，寡聚体可与脂质，尤其是阳离子脂质络合。脂肪酸和酯，其药学上可接受的盐及其用途的示例还描述于美国专利号6,287,860，其通过引用全文纳入本文。局部制剂详述于1999年5月20日提交的美国专利申请系列号09/315,298，其通过应用全文纳入本文。
口服给药的组合物和制剂包括，粉末或颗粒、微颗粒、纳米颗粒、水或非水性基质中的溶液或悬浮液、胶囊、凝胶胶囊、囊袋、片剂或小型片剂。可能需要增稠剂、风味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘结剂。口服制剂是其中本发明的寡聚体与一种或多种渗透增强剂、表面活性剂和螯合剂联合给予的那些。表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆酸和/或其盐。胆酸/盐和脂肪酸及其用途的示例还描述于美国专利号6,287,860，其通过引用全文纳入本文。在一些实施方式中，本发明提供了渗透增强剂，例如脂肪酸/盐与胆酸/盐的组合。示例性的组合是UDCA、癸酸和月桂酸的钠盐。其它渗透增强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡醇醚。本发明的寡聚体可口服递送，以颗粒形式包括喷雾的干燥颗粒，或复合以形成微颗粒或纳米颗粒。寡聚体络合剂及其用途的示例还描述于美国专利号6,287,860，其通过引用全文纳入本文。寡聚体的口服制剂及其制备物详述于美国申请系列号09/108,673(1998年7月1日提交)、09/315,298(1999年5月20日提交)和10/071,822(2002年2月8日提交)，其各自通过引用全文纳入本文。
用于胃肠外、鞘内或心室内给药的组合物和制剂可包括无菌水溶液，其也可含有缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂，诸如但不限于，渗透增强剂、运载体化合物和药学上可接受的其它运载体或赋形剂。
本发明的某些实施方式提供了含有一种或多种寡聚化合物和一种或多种其它化疗剂的药物组合物，所述其它化疗剂通过非反义机制发挥作用。这类化疗剂的示例包括但不限于癌症化疗剂，如柔红霉素、道诺霉素、更生霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、依索比星、博来霉素、马磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷、双-氯乙基亚硝基脲、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、光神霉素、氯泼尼松、羟孕酮、睾酮、他莫昔芬、达卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基亚硝基脲、氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷、羟基脲、脱氧共生-间型霉素、4-羟基过氧环磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷(5-FudR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙素、紫杉醇、长春新碱、长春花碱、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、拓扑替康、吉西他滨、替尼泊甙、顺铂和己烯雌酚(DES)。当与本发明的化合物联用时，这类化疗剂可单独使用(例如，5-FU和寡聚体)、依次使用(例如，5-FU和寡聚体，一段时间之后用MTX和寡聚体)，或与一种或多种其它这类化疗剂(例如，5-FU、MTX和寡聚体，或者5-FU、放疗和寡聚体)联用。抗炎药物，包括但不限于非甾体抗炎药物和皮质类固醇，和抗病毒药物，包括但不限于利巴韦林、阿糖腺苷、阿昔洛韦和更昔洛韦，也可与本发明的组合物组合。反义化合物和其它非反义药物的组合也在本发明的范围内。2种或更多种组合的药物可一起或依次使用。
在另一个相关的实施方式中，本发明的组合物可含有一种或多种靶向第一核酸的反义化合物，尤其是寡聚体，乙基一种或多种靶向第二核酸靶标的其它反义化合物。或者，本发明的组合物可含有靶向相同核酸靶标的不同区的2种或更多种反义化合物。反义化合物的多种示例是本领域已知的。2种或更多中组合的药物可一起或依次使用。
V.使用方法
某些实施方式涉及使用本发明的反义寡聚体增加含外显子2的GAA mRNA和/或蛋白质的表达用于治疗目的(例如，治疗患有GSD-II的对象)的方法。因此，在一些实施方式中，本发明提供了治疗患有GSD-II或具有发展GSD-II的风险的个体的方法，包括向该对象给予有效量的本发明的反义寡聚体。在一些实施方式中，反义寡聚体包含核苷酸序列，所述核苷酸序列具有足够的长度和互补性以足以特异性杂交酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA内的区，其中反义寡聚体与该区的结合增加了对象的细胞和/或组织中含外显子2的GAA mRNA的水平。示例性的反义靶向序列示于表2。
还包括用于制备用于治疗II型糖原贮积病(GSD-II；庞帕病)的药物的反义寡聚体，所述反义寡聚体包含核苷酸序列，其具有足够的长度和互补性以足以特异性杂交酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA内的区，其中反义寡聚体与该区的结合增加了对象的细胞和/或组织中含外显子2的GAA mRNA的水平。
在治疗GSD-II的方法或用于治疗GSD-II的药物的一些实施方式中，反义寡聚体化合物包含：
非天然化学主链，其选自氨基磷酸酯或磷二酰胺吗啉代寡聚体(PMO)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚体、三环-DNA寡聚体、三环-硫代磷酸酯寡聚体、2’O-Me-修饰的寡聚体，或前述的任意组合；和
与人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQ ID NO：1)、内含子2(SEQ ID NO：2)，或外显子2(SEQ ID NO：3)内的区互补的靶向序列。
如上所述，“GSD-II”是指II型糖原贮积病(GSD-II或庞帕病)，这是一种常染色体隐性疾病，其一般的特征在于患病个体中GAA蛋白质的低表达。包括患有婴儿GSD-II的对象和患有该疾病的迟发形式的那些对象。
在某些实施方式中，对象在一种或多种组织(例如，相对于健康对象或更早的时间点)，包括心脏、骨骼肌、肝脏和神经系统组织中有减少的GAA蛋白质的表达和/或活性。在一些实施方式中，对象在一种或多种组织(例如，相对于健康对象或更早的时间点)，包括心脏、骨骼肌、肝脏和神经系统组织中有增加的糖原积累。在具体实施方式中，该对象具有至少一个IVS1-13T＞G突变(也称为c.336-13T＞G)，其可能与其它突变联合以导致功能性GAA蛋白表达减少。用于GSD-II的分子遗传测试的总结示于下表3。
Figure BDA0000982490820000571
某些实施方式涉及增加细胞、组织和/或对象中含外显子2的GAA mRNA或蛋白质的表达的方法，如本文所述。在一些情况中，相对于对照，例如，对照细胞/对象，不含反义寡聚体的对照组合物，缺少治疗，和/或较早时间点，含外显子2的GAA mRNA或蛋白质增加约或至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。还包括相对于健康对照的水平维持含外显子2的GAA mRNA或蛋白质的表达的方法。
一些实施方式涉及增加细胞、组织和/或对象中功能性/活性GAA蛋白质的表达的方法，如本文所述。在某些情况中，相对于对照，例如，对照细胞/对象，不含反义寡聚体的对照组合物，缺少治疗，和/或较早时间点，功能性/活性GAA蛋白质增加约或至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。还包括相对于健康对照的水平维持功能性/活性GAA蛋白质的表达的方法。
具体实施方式涉及减少一种或多种细胞、组织和/或对象中糖原积累的方法，如本文所述。在某些情况中，相对于对照，例如，对照细胞/对象，不含反义寡聚体的对照组合物，缺少治疗，和/或较早时间点，糖原积累减少约或至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。还包括在细胞、组织和/或对象中维持正常或健康糖原水平(例如，无症状水平或与GSD-II症状减少相关的水平)的方法。
还包括减少有此需要的对象中GSD-II的一种或多种症状的方法。具体实施方式包括婴儿GSD-II的症状，如心脏肥大、张力减退、心肌病、左心室流出道梗阻、呼吸窘迫、运动发育迟缓(motor delay)/肌无力，和喂食困难/发育停滞。其它示例包括晚发GSD-II的症状，如肌无力(例如，骨骼肌无力，包括进展型骨骼肌无力)、咳嗽受损、反复胸部感染、张力减退、延迟的运动发育指标(delayed motor milestones)、吞咽或咀嚼困难，和降低的肺活量或呼吸功能不全。
本发明的反义寡聚体可给予对象以(预防性或治疗性)治疗GSD-II。可考虑药物基因组学(即，研究个体的基因型与该个体对外来化合物或药物的响应之间的关系)与这类治疗联用。通过改变药学上活性药物的血液浓度和剂量之间的关系，治疗物的代谢差异可能导致严重毒性或治疗失败。
因此，医生或临床医师可考虑应用相关药物基因组学研究中获得的知识来确定是否给予治疗剂以及裁量用治疗剂治疗的剂量和/或治疗方案。
反义寡聚体向靶核酸的有效递送是治疗的一个方面。反义寡聚体递送的途径包括，但不限于，各种全身途径，包括口服和胃肠外途径，例如静脉内、皮下、腹膜内、和肌肉内，和吸入、透皮，以及局部递送。本领域技术人员可确定合适的途径，其适于治疗中的对象的病症。血管或血管外循环，血液或淋巴系统，和脑脊液是其中可引入RNA的一些非限制性部位。可采用直接CNS递送，例如，大脑室内或鞘内给药可用作给药途径。
在具体实施方式中，通过肌肉内注射(IM)向对象给予反义寡聚体，即，它们通过肌肉内给药或递送。肌肉内注射部位的非限制性示例包括手臂的三角肌、大腿的股外侧肌，和髋的前腹侧股臀肌，和臀的臀大肌。在具体实施方式中，通过IM给予PMO、PMO-X、或PPMO。
在某些实施方式中，有此需要的对象在中枢神经系统组织中有糖原积累。示例包括GSD-II中中枢神经系统病理导致呼吸缺陷的情况(参见，例如，DeRuisseau等，PNASUSA.106：9419-24，2009)。因此，本文所述的反义寡聚体可通过任意本领域公认的方法递送至对象的神经系统，例如，在患有涉及CNS的GSD-II的对象情况中。例如，可使用本发明的反义寡聚体的外周血注射来通过扩散和/或主动方式将所述试剂递送至外周神经元。或者，反义寡聚体可经修饰以促进穿过血脑屏障(BBB)以实现将所述试剂递送至中枢神经系统(CNS)的神经元细胞。反义寡聚体技术和递送策略的近期具体进展已经拓宽了反义寡聚体对神经元疾病的使用的范围(参见，例如，Forte，A.等，2005.Curr.Drug Targets 6：21-29；Jaeger，L.B.和W.A.Banks.2005.Methods Mol.Med.106：237-251；Vinogradov，S.V.等，2004.Bioconjug.Chem.5：50-60；前述通过引用全文纳入本文)。例如，本发明的反义寡聚体可以肽核酸(PNA)化合物形式生成。PNA试剂已经各自鉴定为穿过BBB(Jaeger，L.B.和W.A.Banks.2005.Methods Mol.Med.106：237-251)。也已经描述了用例如血管活性药物治疗对象来促进转运穿过BBB(同上)。也可使用将本发明的反义寡聚体系连至主动转运穿过BBB的试剂作为递送机制。给予反义试剂和造影剂如碘海醇(例如，分开，同时，在同一制剂中)也可促进递送穿过BBB，如PCT公开号WO/2013/086207中所述，其通过引用全文纳入本文。
在某些实施方式中，本发明的反义寡聚体可通过透皮方法递送(例如，通过在例如乳液中纳入反义寡聚体，这类反义寡聚体任选地包装到脂质体中)。这类透皮和乳液/脂质体-介导的递送方法描述用于递送本领域的反义寡聚体，例如，描述于美国专利号6,965,025，其内容通过引用全文纳入本文。
本文所述的反义寡聚体也可通过可植入装置递送。这种装置的设计是本领域熟知的方法，例如，用例如美国专利号6,969,400中所述的合成植入设计，其内容通过引用全文纳入本文。
可使用本领域熟知的技术(例如，转染、电穿孔、融合、脂质体、胶体聚合物颗粒，与病毒和非病毒载体以及本领域已知的其它手段)将反义寡聚体导入细胞中。所选的递送方法将至少取决于寡聚体化学性质、待治疗的细胞和细胞的位置，并且对本领域技术人员而言是显而易见的。例如，可通过带特定标记物的脂质体在表面上实现定位以引导脂质体、引导注射到含靶细胞的组织中、特异性受体介导的摄取等来实现定位。
如本领域所知，反义寡聚体可使用包括以下的方法来递送，例如，脂质体-介导的摄取、脂质偶联物、聚赖氨酸-介导的摄取、纳米颗粒-介导的摄取，和受体-介导的内吞作用、以及其它非内吞递送模式如微注射、透化(例如，链球菌溶血素-O透化、阴离子肽透化)、电穿孔，和本领域已知的各种非侵入性的非内吞递送方法(参考Dokka和Rojanasakul，Advanced Drug Delivery Reviews 44，35-49，通过引用全文纳入本文)。
反义寡聚体可在任何生理上和/或药学上可接受的方便载剂或运载体中递送。这种组合物可包含本领域技术人员采用的标准药学上可接受的多种运载体中的任一种。示例包括，但不限于，盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、水、乙醇水溶液、乳液如油/水乳液或甘油三酯乳液、片剂和胶囊。合适的生理上可接受的运载体的选择将根据所选的给药模式变化。“药学上可接受的运载体”旨在包括与药物给予相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学活性物质的这类介质和试剂的用法是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂都与活性化合物不相容，否则应考虑在组合物中使用这些介质或试剂。补充性活性化合物也可掺入所述组合物。
本发明的化合物(例如，反义寡聚体)一般可以游离酸或游离碱形式使用。或者，本发明的化合物可以酸加成盐或碱加成盐的形式使用。可通过本领域熟知的方法制备本发明的游离氨基化合物的酸加成盐，并且可从有机和无机酸形成。合适的有机酸包括马来酸、富马酸、苯甲酸、抗坏血酸、琥珀酸、甲磺酸、乙酸、三氟乙酸、草酸、丙酸、酒石酸、水杨酸、柠檬酸、葡糖酸、乳酸、扁桃酸、肉桂酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、乙醇酸、谷氨酸，和苯磺酸。
合适的无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸，和硝酸。碱加成盐包括与羧酸根阴离子形成的盐并且包括与有机和无机阳离子形成的盐，如选自碱和碱土金属(例如，锂、钠、钾、镁、钡和钙)，以及铵离子及其取代衍生物(例如，二苄基铵、苄基铵、2-羟乙基铵等)。因此，术语“药学上可接受的盐”往往包括任何和所有可接受的盐形式。
另外，前药包括在本发明的内容中。前药是当该前药给予患者时在体内释放化合物的任何共价结合的运载体。一般通过以一定方式修饰官能团来制备前药，从而所述修饰通过常规操作或在体内被切割，产生母体化合物。前药包括，例如，本发明的化合物，其中羟基、胺或巯基结合至任意基团，其在给予患者时切割以形成羟基、胺或巯基。因此，前药的代表性示例包括(但不限于)本发明的反义寡聚体的醇和胺官能团的乙酸盐或酯、甲酸盐或酯和苯甲酸盐或酯衍生物。此外，在羧酸(-COOH)情况中，可采用酯，如甲酯、乙酯等。
在一些情况中，脂质体可用于促进反义寡聚体摄入细胞(参见，例如，Williams，S.A.，Leukemia 10(12)：1980-1989，1996；Lappalainen等，Antiviral Res.23：119，1994；Uhlmann等，“反义寡聚体：新治疗原理”(antisense oligomers：a new therapeuticprinciple)，Chemical Reviews，第90卷，第4期，25第544-584页，1990；Gregoriadis，G.，第14章，《脂质体，生物和医学中的药物运载体》(Liposomes，Drug Carriers in Biology andMedicine)，第287-341页，学术出版社(Academic Press)，1979)。水凝胶也可用作反义寡聚体给药的载剂，例如，WO 93/01286中所述。或者，可在微球或微颗粒中给予寡聚体。(参见，例如，Wu，G.Y.和Wu，C.H.，J.Biol.Chem.262：4429-4432，30 1987)。或者，使用与反义寡聚体复合的气体填充的微气泡可增强向靶标组织的递送，如美国专利号6,245,747所述。也可使用缓释组合物。这些可包括成形制品如膜或微囊形式的半渗透性聚合物基质。
在一个实施方式中，向显示溶酶体贮积症的症状的哺乳动物对象，例如，人或家养动物，给予合适药物运载体中的反义寡聚体。在该方法的一个方面中，对象是人对象，例如，诊断患有GSD-II(庞帕病)的患者。在一个优选的实施方式中，药学上可接受的运载体中含有反义寡聚体，并且口服递送。在另一个优选的实施方式中，药学上可接受的运载体中含有寡聚体，并且静脉内(i.v.)递送。
在一个实施方式中，以有效的量和方式给予反义化合物，以产生至少200-400nM反义寡聚体的峰值血液浓度。一般而言，通常以约1至2周的有规律间隔给予一剂或多剂反义寡聚体。口服给药的优选剂量是约1-1000mg寡聚体/70kg。在一些情况中，可能需要超过1000mg寡聚体/患者的剂量。对于静脉内给药，优选的剂量是约0.5mg-1000mg寡聚体/70kg。可以短时间的有规律间隔，例如每天给予反义寡聚体持续2周或更短时间。然而，在一些情况中，在较长时间内间歇给予寡聚体。给药之后或给药同时可以给予抗生素或其它治疗。治疗方案可如所示调节(剂量、频率、途径等)，基于对治疗中的对象的免疫试验、其它生化测试和生理检查的结果。
使用本发明的反义寡聚体的有效体内治疗方案可按照给药的持续时间、剂量、频率和途径，以及治疗中对象的情况而变化(即，预防性给药对比响应局部或全身感染的给药)。因此，这种体内治疗通常需要通过适于特定类型的治疗中的疾病的测试监测，以及在剂量或治疗方案中的相应调节，以实现最优的治疗结果。
例如，可通过本领域已知的疾病的一般指标来监测治疗。可从在给予反义寡聚体之前、期间和之后取自对象的生物样品(组织、血液、尿液等)中确定体内给予的本发明的反义寡聚体的功效。这类样品的试验包括(1)使用本领域技术人员已知的方法，例如，电泳凝胶迁移试验监测与靶和非靶序列形成的异源双链体的存在或缺失；(2)监测突变mRNA相对于参照正常mRNA或蛋白质的量，如标准技术如RT-PCR、Northern印迹、ELISA或Western印迹所测定。
在一些实施方式中，反义寡聚体被哺乳动物细胞主动摄取。在其他实施方式中，反义寡聚体可偶联至本文所述的转运部分(例如，转运肽或CPP)以促进这种摄取。
VI.定量给药
治疗组合物的制剂及其后续给药(定量给药)被认为是本领域技术人员所知的。定量给药取决于待治疗的疾病状态的严重程度和响应性，治疗的过程持续数天至数月，或直到达到痊愈或实现疾病状态的减少。可通过测量患者体内的药物积累来计算最优定量给药方案。本领域普通技术人员可易于确定最优剂量、给药方法和重复频率。最优剂量可根据单个寡聚体的相对效力变化，并且一般可基于发现在体内和体外动物模型中有效的EC50来估计。一般而言，剂量为0.01μg至100g/kg体重，并且可每天、每周、每月或每年一次或多次，或者甚至每2-20年一次。本领域普通技术人员可易于基于测量的药物在体液或组织中的残留时间和浓度估计定量给药的重复频率。在成功治疗之后，可能需要患者经过维持治疗以防止疾病状态的复发，其中以0.01μg至100g/kg体重，每天一次或多次至每20年一次的维持剂量给予寡聚体。
虽然本发明已经按照某些实施方式具体描述，但是以下实施例仅用于说明本发明而非限制本发明。本申请的中各参考文献、专利、专利申请、GenBank登录号等通过引用全文纳入本文。
VII.实施例
实施例1
反义靶向序列的设计
设计反义寡聚体靶向序列用于与人GAA基因中的IVS1-13T＞G突变相关的治疗性剪接转换应用。本文中，预期剪接转换寡聚体将抑制内含子和外显子剪接沉默子元件(分别是ISS和ESS元件)并且由此促进成熟GAA mRNA中外显子2的保持。然后，正常或接近正常的GAA表达的恢复将允许合成功能性酶，从而向GSD-II患者提供临床益处。
因此设计某些反义靶向序列以遮蔽GAA基因的外显子2内或其侧接内含子内的剪接沉默子元件。潜在的沉默子元件靶标的非限制性示例包括hnRNPA1基序(TAGGGA)、Tra2-β基序，和9G8基序。也采用对内含子1和2(分别是IVS1和IVS2)mRNA的计算机模拟二级结构分析(mFold)来鉴定可能提供合适的反义靶序列的远距离相互作用。该分析产生的反义靶向序列示于表2(也参见SEQ ID NO：4-120)。
包含示于表2的靶向序列的示例性寡聚体在该实施例中制备成具有硫代磷酸酯主链的2’-O-甲基修饰的反义寡聚体。这些反义寡聚体与阳离子递送剂(Lipofectamine2000、Lipofectin或类似物)复合并转染到携带IVS1-13T＞G突变的GSD-II患者-衍生的成纤维细胞和/或淋巴细胞中，如以下实施例2所述。
在其它实验中，将包含表2所示的靶向序列的其它示例性寡聚体制备成PMO。也如下文实施例2所述，使用核转染方案将这些反义寡聚体引入患者衍生的成纤维细胞和/或淋巴细胞。
实施例2
反义寡聚体诱导GSD-II患者衍生的成纤维细胞中的外显子2纳入
进行实验来测试反义寡聚体在衍生自患有GSD-II的个体的成纤维细胞和/或淋巴细胞中诱导外显子2纳入的能力。在一组实验中，按照标准方案制备2’-O-甲基修饰的反义寡聚体并且转染到携带IVS1-13G＞T突变的GSD-II患者衍生的成纤维细胞和/或淋巴细胞中。在另一组实验中，按照标准方案制备PMO并且通过核转染引入这些相同的细胞。然后通过RT-PCR测量含外显子2的mRNA的水平。
GSD-II细胞。按照标准方案在含10％FBS的伊氏极限必需培养基(Eagle’s MEM)中培养来自患有GSD-II的个体的患者衍生的成纤维细胞或淋巴细胞(Coriell细胞系GM00443、GM11661、GM14463和/或GM14484)。细胞在实验前3-5天传代并且在大约80％融合时转染或核转染。
GM00443成纤维细胞来自30岁男性。成人形式；在三十多岁发病；通过抗体检测到正常尺寸和量的GAA的mRNA，GAA蛋白，但是仅有9-26％的正常酸性α-1，4葡糖苷酶活性；在CCR时传代3次；供体对象是具有携带在GAA基因的内含子1的受体位点的位置-13处的T＞G转化的一个等位基因的杂合子，产生第一编码外显子缺失的交替剪接转录本[外显子2(IVS1-13T＞G)]。
GM11661成纤维细胞来自38岁男性。异常肝功能测试；身体活动期间大腿的偶发肌肉痉挛；早晨头痛；对油腻食物不耐受；腹部囊肿；缺陷型成纤维细胞和WBC酸-α-1，4葡糖苷酶活性；供体对象是复合杂合子：等位基因1携带GAA基因的内含子1的受体位点的位置-13处的T＞G转化(IVS1-13T＞G)；所得的交替剪接转录本具有外显子2的框架内缺失，其含有起始密码子；等位基因2携带外显子18的缺失。
GM14463淋巴细胞来自26岁女性。临床影响；成人发病；严重的全身性肌无力和肌肉萎缩；严重的呼吸功能不全；肌肉活检显示酸麦芽糖酶缺乏；供体对象是复合杂合子：1个等位基因在GAA基因的内含子1的受体位点的位置-13处有T＞G转化(IVS1-13T＞G)产生缺失第一编码外显子，外显子2的交替剪接转录本；第二等位基因在外显子2的核苷酸366处有1bp缺失(c.366delT)产生移码和蛋白质截短[Gln124SerfsX18)。
GM14484淋巴细胞来自61岁男性。临床影响；成人发病；供体对象是复合杂合子：1个等位基因在GAA基因的内含子1的受体位点的-13位处有T＞G转化(IVS1-13T＞G)产生缺失第一编码外显子，外显子2的交替剪接转录本；第二等位基因在外显子2的核苷酸172处有C＞T转变(c.172C＞T)在密码子58处产生终止[Gln58Ter(Q58X)]。
GSD-II患者细胞在抵达后经增殖并且冷冻等分物用于长期储存。然后，细胞经增殖并且，在从细胞中提取的总RNA上进行RT-PCR以确认外显子2从成熟GAA-编码转录本上消失。
转染方案。简言之，2’-O-修饰的反义寡聚体与阳离子脂质体制备物如Lipofectamine 2000混合并以0、2.5、5、10、25、50、100和200nM的浓度范围加到培养的细胞中。转染后5小时，更换培养基并且在37℃下在5％CO2中孵育细胞持续24-72小时。包括伪转染和未处理的细胞作为阴性对照。从细胞制备物中提取总RNA并用作RT-PCR试验的模板，用于监测GAA表达中的变化，尤其是观察成熟GAA转录本中外显子2增加的纳入/保持。转染的2’-O-甲基修饰的反义寡聚体示于下表E1。对于该实施例，SEQ ID NO：119的120的各X是尿嘧啶(U)。
Figure BDA0000982490820000661
Figure BDA0000982490820000671
核转染方案。反义PMO在无核酸酶的水中(未用DEPC处理)制备成1-2mM母液，从中可制备合适的稀释物用于核转染。GSD-II细胞用胰蛋白酶消化，计数，并在90g下离心10分钟，并且每孔1-5x105个细胞重悬于核转染溶液P2(Lonza)。然后向Nucleocuvette 16-孔试条中的每孔加入PMO溶液和细胞，并用程序EN-100脉冲。细胞在室温下孵育10分钟，然后一式两份转移到12-孔板中。按照生产商推荐的方案使用GE Illustra 96Spin试剂盒在48小时之后从经处理的细胞中分离总RNA。分析之前，回收的RNA在-80℃下保存。
GAA RT-PCR。对含外显子2的mRNA的PCR检测，从外显子1(正向)至外显子3(反向)选择引物序列。跨越外显子1-3的RT-PCR将生成约1177个碱基的全长扩增子(参见图2的来自正常人细胞的全长扩增子)。完整扩增子(约1177个碱基)和缺失外显子2(外显子2为约578个碱基)的约600个碱基的转录本之间的尺寸差异表示存在对更短的产物的明显优先扩增。这将在测试反义寡聚体诱导全长转录本或含外显子2的转录本的剪接的功效中设置高的基准。
进行逆转录酶PCR以使用SuperScript III一步RT-PCR系统(英杰公司(Invitrogen))来扩增GAA等位基因。从核转染的细胞中分离的400ng的总RNA经逆转录并用基因特异性引物扩增。
一步试剂盒中提供的扩增溶液补充Cy5-标记的dCTP(GE)以能够通过荧光观察条带。经消化的样品在预浇制10％丙烯酰胺/TBE凝胶(英杰公司)上跑动并且在Typhoon Trio(GE)上使用633nm激发激光和670nm BP30发射滤光片，在平台表面处的焦平面观察。用ImageQuant(GE)分析凝胶以测定条带的强度。来自所有含外显子2的条带的强度加在一起以代表纳入分析中全外显子2转录本水平。
或者，在Caliper生物分析仪或Agilent 2200Tape Station仪器上分析PCR扩增产物用于确定外显子纳入百分比。
图3A-3C显示了来自表E1的2’-O-甲基修饰的反义寡聚体的结果。图3A显示寡聚体9(GAA-IVS1(-74-55))和12(GAA-IVS1(-158-140))诱导携带IVS1-13G＞T突变的人细胞中的外显子2-纳入，如约600个碱基的扩增子减少的扩增(相对于全长约1177个碱基的扩增子)所示。图3B显示寡聚体14(GAA-IVS2(-53-72))诱导外显子2纳入，并且图3C显示寡聚体20(GAA-IVS2(-173-192))和22(GAA-IVS2(-338-364))同样诱导一定程度的外显子2纳入。
实施例3
反义寡聚体在GSD-II患者衍生的成纤维细胞中诱导升高水平的酶活性酸性A-葡糖苷酶
用本发明的反义寡聚体治疗的GSD-II患者细胞(如上所述)显示由于含外显子2的GAA mRNA表达增加而具有升高水平的功能性/活性GAA。制备经处理的细胞并且使用标准方案提取蛋白质。测定蛋白质浓度并且测量定量的提取的蛋白质的GAA酶活性。诱导较高水平的GAA的反义寡聚体是本发明的优选实施方式。
实施例4
反义PMO诱导的GSD-II患者衍生的成纤维细胞中剂量依赖性的外显子2纳入
基于上述实施例2中所述的初始GAA外显子2纳入结果，使用上述核转染方法来处理GM00443成纤维细胞并且反义序列制成PMO。具有下表4A中鉴定的靶向序列的20uM的式(VII)的PMO如前所述核转染，并且在37℃下用5％CO2孵育细胞24小时，之后分离总RNA。使用Caliper LabChip分析用表4B的引物FWD124(SEQ ID NO：121)、FWD645(SEQ ID NO：122)和REV780(SEQ ID NO：123)的RNA的RT-PCR扩增，以确定外显子2纳入百分比，其结果示于图4A(内含子1靶向的PMO)、4B(外显子2靶向的PMO)和4C(内含子2靶向的PMO)。
Figure BDA0000982490820000691
Figure BDA0000982490820000701
Figure BDA0000982490820000711
Figure BDA0000982490820000721
因此，本发明还包括检测人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因mRNA中外显子2纳入的方法，该方法包括：
用至少一种聚合酶链反应引物扩增GAA mRNA，该引物包含选自SEQ ID NO：121、122或123的碱基序列。
Figure IDA0000982490890000011
Figure IDA0000982490890000021
Figure IDA0000982490890000031
Figure IDA0000982490890000041
Figure IDA0000982490890000051
Figure IDA0000982490890000061
Figure IDA0000982490890000071
Figure IDA0000982490890000081
Figure IDA0000982490890000091
Figure IDA0000982490890000101
Figure IDA0000982490890000111
Figure IDA0000982490890000121
Figure IDA0000982490890000131
Figure IDA0000982490890000141
Figure IDA0000982490890000151
Figure IDA0000982490890000161
Figure IDA0000982490890000171
Figure IDA0000982490890000181
Figure IDA0000982490890000191
Figure IDA0000982490890000201
Figure IDA0000982490890000211
Figure IDA0000982490890000221
Figure IDA0000982490890000231
Figure IDA0000982490890000241
Figure IDA0000982490890000261
Figure IDA0000982490890000271
Figure IDA0000982490890000281
Figure IDA0000982490890000291
Figure IDA0000982490890000301
Figure IDA0000982490890000311
Figure IDA0000982490890000321
Figure IDA0000982490890000331
Figure IDA0000982490890000351
Figure IDA0000982490890000361
Figure IDA0000982490890000371
Figure IDA0000982490890000381
Figure IDA0000982490890000391
Figure IDA0000982490890000401
Figure IDA0000982490890000421
Figure IDA0000982490890000431
Figure IDA0000982490890000441
Figure IDA0000982490890000461
Figure IDA0000982490890000471
Figure IDA0000982490890000481
Figure IDA0000982490890000491
Figure IDA0000982490890000501
Figure IDA0000982490890000511
Figure IDA0000982490890000521

Claims (18)

1.10-40个核苷酸或核苷酸类似物的反义寡聚体化合物，所述化合物包含：
非天然化学主链，其选自氨基磷酸酯或磷二酰胺吗啉代寡聚体(PMO)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚体、三环-DNA寡聚体、三环-硫代磷酸酯寡聚体、2’O-Me-硫代磷酸酯寡聚体，或前述的任意组合；和
与人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQ ID NO:1)、内含子2(SEQID NO:2)、或外显子2(SEQ ID NO:3)内的区互补的靶向序列，其中，所述靶向序列选自SEQID NO:4-6、9、11、13、16、24、25、45、50、54、59-61、68、72、73、77、82、83、84、85、89和91，X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
2.一种式(I)的化合物：
Figure FDA0002143005120000011
或其药学上可接受的盐，其中：
各Nu是核碱基，一起形成靶向序列；
x是8-38的整数；
各Y独立地选自O或–NRa，其中Ra选自氢、-T1-NRcRdRe和–[(C(O)CHR'NH)m]R”，其中：
Rc选自氢、C1-C6烷基、芳烷基和-C(＝NH)NH2，
Rd选自氢、芳烷基和C1-C6烷基，或者
当RC和Rd各自独立地是C1-C6烷基或芳烷基时，Rc和Rd与其附连的氮原子一起形成5-7元环，其中所述环任选地被选自C1-C6烷基、苯基、卤素和芳烷基的取代基取代，并且
Re选自电子对、氢、C1-C6烷基和芳烷基；
各L独立地选自
和–[(C(O)CHR'NH)m]R”，其中w是3-20的整数，并且S是1-8的整数；
n是0-3的整数；
各R1独立地选自-N(CH3)2、-NR5R6、-OR7、
式(II)的部分：
Figure FDA0002143005120000022
其中：
R8选自氢、甲基、-C(＝NH)NH2、-Z-T2-NHC(＝NH)NH2和–[(C(O)CHR'NH)m]R”，其中Z是羰基或直接键，
R9选自电子对、氢、C1-C6烷基和芳烷基；
各R10独立地选自氢或甲基；和
式(III)的部分：
Figure FDA0002143005120000031
其中：
q是0-2的整数，
R11选自氢、C1-C6烷基、芳烷基和-C(＝NH)NH2，
R12选自氢、芳烷基和C1-C6烷基，或者
R11和R12与其附连的氮原子一起形成5-7元环，其中所述环任选地被选自C1-C6烷基、苯基、卤素和芳烷基的取代基取代，并且
R13选自电子对、氢、C1-C6烷基和芳烷基；
R2选自氢、OH、核苷酸、-(CH2)mC(O)NRfRg，其中Rf和Rg独立地选自H、酰基、C1-C6烷基和–[(C(O)CHR’NH)m]R”、H(O(CH2)sO)w-、H(OCH2CH2O)w-、三苯甲基、-C(＝O)ORf和酰基，其中Rf是C1-C30烷基，其包含一个或多个氧或羟基部分或其组合，或R2不存在；
R3选自氢、C1-C6烷基、核苷酸、–[(C(O)CHR'NH)m]R”、-C(＝NH)NH2、三苯甲基、-C(＝O)ORg、酰基、-C(O)(CH2)mC(O)和T4-(4-(4,6-(NR2)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基，，其中Rg是包含一个或多个氧或羟基部分或其组合的C1-C30烷基，
T4选自–C(O)(CH2)6C(O)-或–C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-，且R是–(CH2)OC(O)NH(CH2)6NHC(NH)NH2；
R4选自电子对、氢、C1-C6烷基和酰基；
R5独立地选自氢或甲基；
R6和R7独立地选自氢或–T3-NRcRdRe；并且
各T1、T2、和T3独立地是长度至多为18个原子的任选接头，包括烷基、烷氧基或烷氨基，或其组合，
其中，在-[(C(O)CHR'NH)m]R”中：
R'是天然产生的氨基酸或其一个或两个碳的同系物的侧链，
R”选自氢或酰基，
m是1-60的整数，
其中，所述靶向序列与人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQ IDNO:1)、内含子2(SEQ ID NO:2)或外显子2(SEQ ID NO:3)内的区互补，其中，所述靶向序列选自SEQ ID NO:4-6、9、11、13、16、24、25、45、50、54、59-61、68、72、73、77、82、83、84、85、89和91，X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，各Nu独立地选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、次黄嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、C5-丙炔基-修饰的嘧啶，和9-(氨基乙氧基)吩噁嗪。
4.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，各R1是-N(CH3)2。
5.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述至少一个R1选自下组：
Figure FDA0002143005120000041
6.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，50-90％的所述R1基团是-N(CH3)2。
7.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，66％的所述R1基团是-N(CH3)2。
8.如权利要求2所述的化合物，其特征在于：
n是2；
R2和L一起是下式：
Figure FDA0002143005120000051
以及
每次出现的Y是O。
9.一种式(IV)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
各Nu是核碱基，一起形成靶向序列；
x是15-25的整数；
各Y是O；
各R1独立地选自下组：
Figure FDA0002143005120000062
其中，至少一个R1是–N(CH3)2，并且
其中，所述靶向序列选自SEQ ID NO:4-6、9、11、13、16、24、25、45、50、54、59-61、68、72、73、77、82、83、84、85、89和91，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
10.一种药物组合物，其包含10-40个核苷酸或核苷酸类似物的反义寡聚体化合物和药学上可接受的运载体，所述化合物包含：
非天然化学主链，其选自氨基磷酸酯或磷二酰胺吗啉代寡聚体(PMO)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚体、三环-DNA寡聚体、三环-硫代磷酸酯寡聚体、2’O-Me-硫代磷酸酯寡聚体，或前述的任意组合；和
与人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQ ID NO:1)、内含子2(SEQID NO:2)或外显子2(SEQ ID NO:3)内的区互补的靶向序列，其中，所述靶向序列选自SEQID NO:4-6、9、11、13、16、24、25、45、50、54、59-61、68、72、73、77、82、83、84、85、89和91，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
11.一种药物组合物，其包含式(I)的化合物：
Figure FDA0002143005120000071
或其药学上可接受的盐，其中：
各Nu是核碱基，其一起形成靶向序列；
x是8-38的整数；
各Y独立地选自O或–NRa，其中Ra选自氢、-T1-NRcRdRe和–[(C(O)CHR'NH)m]R”，其中：
Rc选自氢、C1-C6烷基、芳烷基和-C(＝NH)NH2，
Rd选自氢、芳烷基和C1-C6烷基，或者
当Rc和Rd各自独立地是C1-C6烷基或芳烷基时，Rc和Rd与其附连的氮原子一起形成5-7元环，其中所述环任选地被选自C1-C6烷基、苯基、卤素和芳烷基的取代基取代，并且
Re选自电子对、氢、C1-C6烷基和芳烷基；
各L独立地选自
Figure FDA0002143005120000081
和–[(C(O)CHR'NH)m]R”，其中w是3-20的整数，并且S是1-8的整数；
n是0-3的整数；
各R1独立地选自-N(CH3)2、-NR5R6、-OR7，
式(II)的部分：
其中：
R8选自氢、甲基、-C(＝NH)NH2、-Z-T2-NHC(＝NH)NH2和–[(C(O)CHR'NH)m]R”，其中Z是羰基或直接键，
R9选自电子对、氢、C1-C6烷基和芳烷基；
各R10独立地选自氢或甲基；和
式(III)的部分：
Figure FDA0002143005120000091
其中：
q是0-2的整数，
R11选自氢、C1-C6烷基、芳烷基和-C(＝NH)NH2，
R12选自氢、芳烷基和C1-C6烷基，或者
R11和R12与其附连的氮原子一起形成5-7元环，其中所述环任选地被选自C1-C6烷基、苯基、卤素和芳烷基的取代基取代，并且
R13选自电子对、氢、C1-C6烷基和芳烷基；
R2选自氢、OH、核苷酸、-(CH2)mC(O)NRfRg，其中Rf和Rg独立地选自H、酰基、C1-C6烷基和–[(C(O)CHR’NH)m]R”、H(O(CH2)sO)w-、H(OCH2CH2O)w-、三苯甲基、-C(＝O)ORf和酰基，其中Rf是C1-C30烷基，其包含一个或多个氧或羟基部分或其组合，或R2不存在；
R3选自氢、C1-C6烷基、核苷酸、–[(C(O)CHR'NH)m]R”、-C(＝NH)NH2、三苯甲基、酰基、-C(O)(CH2)mC(O)和T4-(4-(4,6-(NR2)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基，其中
Rg是包含一个或多个氧或羟基部分或其组合的C1-C30烷基；T4选自–C(O)(CH2)6C(O)-或–C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-，且R是–(CH2)OC(O)NH(CH2)6NHC(NH)NH2；
R4选自电子对、氢、C1-C6烷基和酰基；
R5独立地选自氢或甲基；
R6和R7独立地选自氢或–T3-NRcRdRe；并且
各T1、T2、和T3独立地是长度至多为18个原子的任选接头，包括烷基、烷氧基或烷氨基，或其组合；
其中，在-[(C(O)CHR'NH)m]R”中：
R'是天然产生的氨基酸或其一个或两个碳的同系物的侧链，
R”选自氢或酰基，
m是1-60的整数，
其中，所述靶向序列与人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQ IDNO:1)、内含子2(SEQ ID NO:2)，或外显子2(SEQ ID NO:3)内的区互补，其中，所述靶向序列选自4-6、9、11、13、16、24、25、45、50、54、59-61、68、72、73、77、82、83、84、85、89和91，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，和
药学上可接受的运载体。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，各R1是-N(CH3)2。
13.如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于：
n是2；
R2和L一起是下式：
以及
每次出现的Y是O。
14.10-40个核苷酸或核苷酸类似物的反义寡聚体化合物在制备用于治疗有需要的对象中II型糖原贮积病的药物中的应用，其中所述10-40个核苷酸或核苷酸类似物的反义寡聚体化合物包含：
非天然化学主链，其选自氨基磷酸酯或磷二酰胺吗啉代寡聚体(PMO)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚体、三环-DNA寡聚体、三环-硫代磷酸酯寡聚体、2’O-Me-硫代磷酸酯寡聚体，或前述的任意组合；和
与人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQ ID NO:1)、内含子2(SEQID NO:2)，或外显子2(SEQ ID NO:3)内的区互补的靶向序列，其中，所述靶向序列选自SEQID NO:4-6、9、11、13、16、24、25、45、50、54、59-61、68、72、73、77、82、83、84、85、89和91，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
15.式(I)的反义寡聚体化合物在制备用于治疗有需要的对象中II型糖原贮积病的药物中的应用，其中：
Figure FDA0002143005120000111
或其药学上可接受的盐，其中：
各Nu是核碱基，其一起形成靶向序列；
x是8-38的整数；
各Y独立地选自O或–NRa，其中Ra选自氢、-T1-NRcRdRe和–[(C(O)CHR'NH)m]R”，其中：
Rc选自氢、C1-C6烷基、芳烷基和-C(＝NH)NH2，
Rd选自氢、芳烷基和C1-C6烷基，或者
当Rc和Rd各自独立地是C1-C6烷基或芳烷基时Rc和Rd与其附连的氮原子一起形成5-7元环，其中所述环任选地被选自C1-C6烷基、苯基、卤素和芳烷基的取代基取代，并且
Re选自电子对、氢、C1-C6烷基和芳烷基；
各L独立地选自
Figure FDA0002143005120000121
和–[(C(O)CHR'NH)m]R”，其中w是3-20的整数，且S是1-8的整数；
n是0-3的整数；
各R1独立地选自-N(CH3)2、-NR5R6、-OR7，
式(II)的部分：
Figure FDA0002143005120000122
其中：
R8选自氢、甲基、-C(＝NH)NH2、-Z-T2-NHC(＝NH)NH2和–[(C(O)CHR'NH)m]R”，其中Z是羰基或直接键，并且
R9选自电子对、氢、C1-C6烷基和芳烷基；
各R10独立地选自氢或甲基；和
式(III)的部分：
Figure FDA0002143005120000131
其中：
q是0-2的整数，
R11选自氢、C1-C6烷基、芳烷基和-C(＝NH)NH2，
R12选自氢、芳烷基和C1-C6烷基，或者
R11和R12与其附连的氮原子一起形成5-7元环，其中所述环任选地被选自C1-C6烷基、苯基、卤素和芳烷基的取代基取代，并且
R13选自电子对、氢、C1-C6烷基和芳烷基；
R2选自氢、OH、核苷酸、-(CH2)mC(O)NRfRg，其中Rf和Rg独立地选自H、酰基、C1-C6烷基和–[(C(O)CHR’NH)m]R”、H(O(CH2)sO)w-、H(OCH2CH2O)w-、三苯甲基、-C(＝O)ORf和酰基，其中Rf是C1-C30烷基，其包含一个或多个氧或羟基部分或其组合，或R2不存在；
R3选自氢、C1-C6烷基、核苷酸、–[(C(O)CHR'NH)m]R”、-C(＝NH)NH2、三苯甲基、酰基、-C(O)(CH2)mC(O)和T4-(4-(4,6-(NR2)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基，其中
Rg是包含一个或多个氧或羟基部分或其组合的C1-C30烷基；T4选自–C(O)(CH2)6C(O)-或–C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-，且R是–(CH2)OC(O)NH(CH2)6NHC(NH)NH2；
R4选自电子对、氢、C1-C6烷基和酰基；
R5独立地选自氢或甲基；
R6和R7独立地选自氢或–T3-NRcRdRe；并且
各T1、T2、和T3独立地是长度至多为18个原子的任选接头，包括烷基、烷氧基或烷氨基，或其组合，
其中，在-[(C(O)CHR'NH)m]R”中：
R'是天然产生的氨基酸或其一个或两个碳的同系物的侧链，
R”选自氢或酰基，
m是1-60的整数，
其中，所述靶向序列与人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQ IDNO:1)、内含子2(SEQ ID NO:2)或外显子2(SEQ ID NO:3)内的区互补，其中，所述靶向序列选自SEQ ID NO:4-6、9、11、13、16、24、25、45、50、54、59-61、68、72、73、77、82、83、84、85、89和91，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，各R1是-N(CH3)2。
17.如权利要求15所述的应用，其中：
n是2；
R2和L一起是下式：
Figure FDA0002143005120000141
以及
每次出现的Y是O。
18.一种反义寡聚体，其包含具有足够的长度和互补性以特异性杂交人酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的前体mRNA的内含子1(SEQ ID NO:1)、外显子2(SEQ ID NO:2)或内含子2(SEQID NO:3)内的区的靶向序列，其中，所述靶向序列选自SEQ ID NO:4-6、9、11、13、16、24、25、45、50、54、59-61、68、72、73、77、82、83、84、85、89和91，其中X选自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
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