CN105061586A - 一种铅-低密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铅-低密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用，该铅-低密度脂蛋白螯合物是由铅离子通过锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中的至少一种结构与低密度脂蛋白螯合形成。本发明建立了铅-低密度脂蛋白螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测铅-低密度脂蛋白螯合物在评价一个地区铅污染程度的应用。通过检测一个地区人群血清中铅-低密度脂蛋白螯合物可以间接反映这个地区人群受铅污染的情况，从而间接反映这个地区铅污染程度。本发明建立的铅-低密度脂蛋白螯合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提高。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域，具体涉及铅-低密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用。
背景技术
脂蛋白(lipoproteins)是蛋白质与脂质结合所形成的一种脂质-蛋白质复合物，按密度分为低密度脂蛋白低密度脂蛋白(highdensitylipoprotein，HDL)、中间密度脂蛋白(intermediatedensitylipoprotein，IDL)、低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein，LDL)、极低密度脂蛋白(verylowdensitylipoprotein,VLDL)、乳糜颗粒(chylomicron，CM)。在血液中约70％的胆固醇由LDL和VLDL所携带，而LDL所携带的胆固醇含量大于VLDL，由于LDL富含胆固醇，因而被称为“坏胆固醇”，其与多种疾病的发生、发展密切相关，特别是冠心病，糖尿病等疾病，研究发现“坏胆固醇”还可促进癌症细胞的发展和转移。
LDL是动脉粥样硬化发生和发展的主要危险因素，其改变在血清蛋白中对动脉粥样硬化有很强的影响作用，是冠状动脉疾病的重要危险因子，与心血管疾病危险程度呈正相关。因而定量检测血清中LDL对于心血管疾病具有重要意义，不仅可以用于早期识别动脉粥样硬化的危险性，而且可以作为降脂药物治疗过程的检测以及预后评价的指标之一。此外，肾病综合征、慢性肾功能衰竭、肝病及糖尿病等，也可使血清中LDL含量上升，而定量检测LDL也可用于这些疾病的早期诊断以及治疗效果监测，甚至作为预后好坏的评价指标之一。而对于营养不良、慢性贫血、骨髓瘤、急性心肌梗死、创伤和严重肝病等患者，血清LDL的含量将会下降，定量检测LDL也可用于这些疾病的早期诊断、治疗效果监测以及作为预后评价的指标之一。
铅是一种常见的有毒金属及环境污染物，广泛应用于工业生产环境中，包括冶炼锻造、铅电池生产、汽油添加剂的生产过滤中等，与人们生活息息相关。对于普通人群，主要是通过吸入铅污染的空气，或饮用以铅壶或铅锡壶盛装的酒，甚至使用或滥用含铅的药物治疗慢性疾病而摄入铅。研究表明，铅是一种全身性毒物，可以影响神经、造血、内分泌、免疫、生殖、肝脏、肾脏等组织器官，国际肿瘤研究机构也将铅及其化合物列为第2B类人致癌物。可见铅对机体的影响及其重要，不可忽视。
目前已有大量的文献证实铅可以作用于全身各个系统中的蛋白，从而影响机体各组织器官的机能。众所周知，低密度脂蛋白是一种特殊意义的蛋白质，铅是否可以作用于低密度脂蛋白，而使低密度脂蛋白结构改变、含量改变、活性改变、功能改变，这些尚缺乏相关研究。
发明内容
针对铅污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种铅-低密度脂蛋白螯合物及其制备方法，并建立铅-低密度脂蛋白螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测铅-低密度脂蛋白螯合物在评价一个地区铅污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铅-低密度脂蛋白螯合物可以间接反映这个地区人群受铅污染的情况，从而间接反映这个地区铅污染程度。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
铅-低密度脂蛋白螯合物，其是由铅离子通过锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中的至少一种结构与低密度脂蛋白螯合形成。
铅-低密度脂蛋白螯合物是由铅离子通过锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中的至少一种结构与低密度脂蛋白上的载脂蛋白B或胆固醇、甘油三酯等结合而形成的螯合物。
本发明还提供了如上所述的铅-低密度脂蛋白螯合物的制备方法，其包括以下步骤：
1)铅-低密度脂蛋白螯合物的合成步骤：
铅离子向人源的低密度脂蛋白中加入铅离子进行螯合反应；
2)铅-低密度脂蛋白螯合物的纯化步骤：
采用免疫亲和层析去除步骤1)获得的铅-低密度脂蛋白螯合物中未参与反应的低密度脂蛋白及铅离子。
所述步骤1)中包括以下步骤：
在提纯源于人体的低密度脂蛋白或/和生物学方法重组的低密度脂蛋白中加入铅离子进行螯合反应；
所述步骤2)中包括以下步骤：
A.将步骤1)制得的铅-低密度脂蛋白螯合物复溶于生理盐水中，得到复溶液；
B.平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱，将能够与低密度脂蛋白特异性结合的填料装柱后，然后用稀释缓冲液平衡层析柱；
C.上样：上样前，用稀释缓冲液稀释复溶液，然后上样，铅-低密度脂蛋白螯合物、未与铅离子反应的低密度脂蛋白均吸附在填料上，未反应的铅离子随缓冲液流出；
D.洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.10M的Na2HPO4溶液进行洗脱；
E.收集洗脱液；收集完毕后立即用使蛋白复性；
F.透析：将收集到的洗脱液装入透析袋用ddH2O透析除盐，换水2～4次后，4℃透析过夜，收集透析袋内的样本；
G.平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗新的层析柱，将能够与Pb特异性结合的填料装柱后，然后用稀释缓冲液平衡层析柱；
H.上样：上样前，用稀释缓冲液稀释样本，然后上样；铅-低密度脂蛋白螯合物吸附在填料上，未反应的低密度脂蛋白会随稀释缓冲液流出；
I.洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5-1.0M的Na2HPO4溶液进行洗脱；稀释缓冲液，此时铅-低密度脂蛋白螯合物随着洗脱液洗脱出来，
J.收集洗脱液；收集完毕后立即用使蛋白复性；
K.将收集到的洗脱液装入透析袋用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集透析袋内的样本，得到纯化的铅-低密度脂蛋白螯合物。
上述制备方法还包括3)对铅-低密度脂蛋白螯合物的鉴定步骤：
Ⅰ.制备胶床：选择琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质，制备胶床；
Ⅱ.加样：取步骤2)所制得的铅-低密度脂蛋白螯合物，加入上样缓冲液并混合均匀，然后加样于样品槽中；
Ⅲ.电泳：连接电泳板进行电泳；
Ⅳ.复溶检测：在胶床上找出含铅的蛋白条带，将该条带取出并溶解，然后利用ICP-MS法或AAS法检测该液体中是否含有铅以及铅含量。
本发明还提供了如上所述的铅-低密度脂蛋白螯合物在检测人体内铅-低密度脂蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种至少包括如上所述的铅-低密度脂蛋白螯合物作为标准品的试剂盒。
优选地，该试剂盒还包括包被液，该包被液为含有捕获低密度脂蛋白的物质或或捕获金属铅的物质。。
本发明还提供了一种定量检测铅-低密度脂蛋白螯合物的方法，以已知含量的权利要求1所述的铅-低密度脂蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯铅-低密度脂蛋白螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯铅-低密度脂蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明首次体外合成铅-低密度脂蛋白螯合物；
2.本发明首次提出铅-低密度脂蛋白螯合物在可用于制备检测人体血样中铅-低密度脂蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用。
3.本发明建立了铅-低密度脂蛋白螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测铅-低密度脂蛋白螯合物在评价一个地区铅污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铅-低密度脂蛋白螯合物可以间接反映这个地区人群受铅污染的情况，从而间接反映这个地区铅污染程度。本发明建立的铅-低密度脂蛋白螯合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提高。
附图说明
图1为本发明所述的铅-低密度脂蛋白螯合物的电泳条带图；
图2为本发明所述的铅-低密度脂蛋白螯合物的电泳条的荧光分析图。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：
本发明除特别说明外，涉及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤；所用试剂、材料如未特殊说明，均视为可从市购方式购得：
提取试剂为PEG溶液、硼酸盐缓冲液等(采用PEG法)；
酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体中的一种；
稀释缓冲液为pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液，配制方法示例：取1.5g的Na2CO3和2.93g的NaHCO3溶解加ddH2O定容至1000mL；
洗涤缓冲液为pH7.4的0.15MPBS溶液，配制方法示例：取0.2g的KH2PO4、2.90g的Na2HPO4·12H2O、8.0g的NaCl、0.2g的KCl、0.5mLTween-20，溶解加ddH2O定容至1000mL；
封闭液为牛血清白蛋白溶液，配制方法示例：取0.1g牛血清白蛋白，加入洗涤缓冲液稀释定容至100mL；
终止液为2MH2SO4，配制方法示例：取178.3mL的ddH2O，加浓H2SO4定容至200mL；
底物为甲基联苯胺(TMB)溶液，配制方法示例：取0.5mL浓度为2g/L的甲基联苯胺乙醇溶液，加底物稀释液稀释至10mL；
底物缓冲液pH为5.0，其中Na2HPO4的摩尔浓度为0.2M、柠檬酸的摩尔浓度为0.1M，配制方法示例：取1.42gNa2HPO4、0.96g柠檬酸，然后加入ddH2O至50mL，即得；
洗脱液的配制方法示例：将木瓜蛋白酶用pH8.0,0.1mol/LTris-HCI缓冲液配制成1-2mg/mL，再加入1mmol/L二硫苏糖醇(DTT)37℃孵育30min，得洗脱液；
上样缓冲液可由如下比例的组分配制而成：Tris-HCl：1％溴酚蓝：ddH2O：甘氨酸＝15.5：2.5：7：25，其中Tris-HCl的pH为6.8、摩尔浓度为1M；
电泳缓冲液的配制方法如下：取3.0gTris、14.4g甘氨酸、溶于800mLddH2O中，调pH至8.3后，定容至1L；
可捕获金属铅离子的物质(抗铅离子抗体)为与铅特异性结合的物质为鼠抗PbmAb，购买自巴傲得生物科技有限公司，货号为巴傲得AP7019。
与低密度脂蛋白特异结合的物质、捕获低密度脂蛋白的物质、抗低密度脂蛋白抗体可以是同一种物质，可通过购买得到，在本发明中选用为英国Abcam公司生产的“型号为Abcamab157795“的Anti-LDL抗体。
本发明提供了一种铅-低密度脂蛋白螯合物，其是由铅离子通过锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中的至少一种结构与低密度脂蛋白螯合形成。
铅-低密度脂蛋白螯合物是由铅离子通过锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中的至少一种结构与低密度脂蛋白上的载脂蛋白B或胆固醇、甘油三酯等螯合形成。
本发明还提供了如上所述的铅-低密度脂蛋白螯合物的一种制备方法，其包括以下步骤：
1)铅-低密度脂蛋白螯合物的合成步骤：
铅离子向人源的低密度脂蛋白中加入铅离子进行螯合反应；
2)铅-低密度脂蛋白螯合物的纯化步骤：
采用免疫亲和层析去除步骤1)获得的铅-低密度脂蛋白螯合物中未参与反应的低密度脂蛋白及铅离子。
所述步骤1)中包括以下步骤：
在提纯源于人体的低密度脂蛋白或/和生物学方法重组的低密度脂蛋白中加入铅离子进行螯合反应；
所述步骤2)中包括以下步骤：
A.将步骤1)制得的铅-低密度脂蛋白螯合物复溶于生理盐水中，得到复溶液；
B.平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱，将含有能够与低密度脂蛋白特异性结合的物质的填料装柱后，然后用稀释缓冲液平衡层析柱；
C.上样：上样前，用稀释缓冲液稀释复溶液，然后上样，铅-低密度脂蛋白螯合物、未与铅离子反应的低密度脂蛋白均吸附在填料上，未反应的铅离子随缓冲液流出；
D.洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.1M的Na2HPO4溶液进行洗脱；；
E.收集洗脱液；收集完毕后立即用使蛋白复性；
F.透析：将收集到的洗脱液装入透析袋用ddH2O透析除盐，换水2～4次后，4℃透析过夜，收集透析袋内的样本；
G.平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗新的层析柱，将能够与Pb特异性结合的填料装柱后，然后用稀释缓冲液平衡层析柱；
H.上样：上样前，用稀释缓冲液稀释样本，然后上样；铅-低密度脂蛋白螯合物吸附在填料上，未反应的低密度脂蛋白会随稀释缓冲液流出；
I.洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5-1.0M的Na2HPO4溶液进行洗脱；此时铅-低密度脂蛋白螯合物随着洗脱液洗脱出来，
J.收集洗脱液；收集完毕后立即用使蛋白复性；
K.将收集到的洗脱液装入透析袋用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集透析袋内的样本，得到纯化的铅-低密度脂蛋白螯合物。
上述制备方法还包括3)对铅-低密度脂蛋白螯合物的鉴定步骤：
Ⅰ.制备胶床：选择琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质，制备胶床；
Ⅱ.加样：取步骤2)所制得的铅-低密度脂蛋白螯合物，加入上样缓冲液并混合均匀，然后加样于样品槽中；
Ⅲ.电泳：连接电泳板进行电泳；
Ⅳ.复溶检测：在胶床上找出含铅的蛋白条带，将该条带取出并溶解，然后利用ICP-MS法或AAS法检测该液体中是否含有铅以及铅含量。
本发明还提供了一种至少包括以如上所述的铅-低密度脂蛋白螯合物作为对照品的试剂盒。该试剂盒用于检测铅-低密度脂蛋白螯合物，以提高检测的准确性，重复性，并使之在临床中得到推广。
优选地，该试剂盒还包括包被液，该包被液为捕获LDL的物质或捕获铅的物质。
在本发明中，能实现本发明目的的试剂盒可以列出以下几种，但并不限于此。
一种用于检测铅-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括：含有可捕获低密度脂蛋白的物质的包被液、封闭液、洗涤液、作为二抗的可以捕获金属pb的物质、酶标抗体、底物、终止液、样品缓冲液、阳性对照、阴性对照等。
一种用于检测铅-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括：含有可捕获低密度脂蛋白的物质的包被液、封闭液、洗涤液、洗脱液等。
一种用于检测铅-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括：含有可捕获低密度脂蛋白的物质的包被液、封闭液、洗涤液、洗脱液、硝酸、过氧化氢等。
一种用于检测铅-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括：用于提纯血液低密度脂蛋白所需溶液、复溶液、含有可捕获铅的物质的包被液、封闭液、洗涤液、酶标抗体、底物、终止液、样品缓冲液、标准品、阴性对照等。
一种用于检测铅-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括：用于提纯血液低密度脂蛋白所需溶液、复溶液等。
一种用于检测铅-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括：用于提纯血液低密度脂蛋白所需溶液、复溶液、硝酸、过氧化氢等。
一种用于检测铅-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括：用于提纯血液低密度脂蛋白所需溶液、胶床介质、复溶液、加样缓冲液、溶解胶床上含铅的蛋白条带所需液体、含有可捕获铅的物质的包被液、封闭液、洗涤液、酶标抗体、底物、终止液、样品缓冲液、标准品、阴性对照等。
一种用于检测铅-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括：用于提纯血液低密度脂蛋白所需溶液、胶床介质、复溶液、加样缓冲液、溶解胶床上含铅的蛋白条带所需液体等。
一种用于检测铅-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括用于提纯血液低密度脂蛋白所需溶液、胶床介质、复溶液、加样缓冲液、溶解胶床上含铅的蛋白条带所需液体、酸化剂(如硝酸)、过氧化氢等。
上述试剂盒中，用于提纯血液低密度脂蛋白所需溶液为PEG溶液、硼酸盐缓冲液等(采用PEG法)，捕获低密度脂蛋白的物质可以通过购买得到，在本发明中选用为“Genetexgtx16419”；所述酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体中的一种，所述述用于提纯血液低密度脂蛋白所需溶液为PEG溶液、硼酸盐缓冲液中的一种；所述胶床介质为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的一种，所述酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体中的一种，所述阳性对照或标准品为铅-低密度脂蛋白螯合物。
本发明还提供了一种定量检测铅-低密度脂蛋白螯合物的方法，以已知含量的上述的铅-低密度脂蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯铅-低密度脂蛋白螯合物与酶联免疫法、提纯铅-低密度脂蛋白螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯铅-低密度脂蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。在本发明中，用检测铅铅螯合型免疫复合物的方法可以列出的有以下几种，但并不限于以下几种。
方法一：酶联免疫法检测铅-低密度脂蛋白螯合物，按以下步骤进行检测：
1)将前面所述的可以捕获低密度脂蛋白的蛋白，如抗LDL抗体蛋白包被于固相载体上：用稀释缓冲液稀释包被蛋白至250～2000倍，加入ELISA板微孔中，4℃下过夜16-18小时，或37℃水浴1-3小时，储存冰箱；
2)封闭：移去包被液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入1％-5％牛血清白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用相应洗涤液进行洗涤。洗涤完成后，ELISA板于37℃放置1小时；
3)加待检样品，并且温育：从循环系统中取样，作待检样品；以已知含量的铅-低密度脂蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液稀释样品至10～40倍，加入微孔中，37℃作用1-2小时；
4)加入抗Pb抗体，并且温育：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释的抗Pb抗体50000～400000倍，37℃作用1-2小时，使其与低密度脂蛋白上的金属铅反应；
5)酶结合物温育：移去抗Pb抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释的酶标抗体(如HRP酶标抗体)，37℃作用1-2小时，使其与抗pb抗体反应；
6)底物温育：移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37℃下避光作用30min；
7)终止反应：滴加终止液至每一微孔；
8)加完终止液后，取450nm波长，并从ELISA试剂板中洗脱的溶液中取0.5mL液体于在酶标仪上分别读取待测样品组和标准品的OD值，通过与标准品组比较，求得待测样品中铅-低密度脂蛋白螯合物的含量。
低密度脂蛋白可以被多种来源低密度脂蛋白抗体所识别，利用酶联免疫吸附测定(ELISA)原理，可以将血清中的低密度脂蛋白提取出来，提取出来的低密度脂蛋白上部分螯合有重金属铅，而这部分低密度脂蛋白上的铅可以被抗铅的特异性抗体所捕获，之后可以再被辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体所捕获(该抗体不识别包被蛋白)，捕获上的抗体在显色剂及终止液的作用下，可以在仪器下读出OD值，而不含有螯合金属铅的低密度脂蛋白，则不会被抗铅的特异性抗体所捕获，也不会与辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体所捕获，而所用试剂中也不含有金属铅(阴性对照组结果为阴性)，因而当所读取的OD值结果显示为阳性时，即可证明检测出循环低密度脂蛋白上螯合的金属铅。
方法二：酶联免疫(ELISA)与原子吸收光谱(AAS)结合法检测铅-低密度脂蛋白螯合物，按以下步骤进行检测：
1)将前面所述的可以捕获低密度脂蛋白的蛋白，如抗LDL抗体蛋白包被于固相载体上：用稀释缓冲液稀释包被蛋白至250～2000倍，加入ELISA板的微孔中，4℃下过夜16-18小时，或37℃水浴1-3小时，储存冰箱；
2)封闭：移去包被液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入1％-5％牛血清白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用相应洗涤液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于37℃放置1小时；
3)加待检样品，并且温育：从循环系统中取样，作待检样品；以已知含量的铅-低密度脂蛋白螯合物作为标准品；用样品缓冲液稀释样品至10～40倍，加入微孔中，37℃作用1-2小时；
4)洗脱：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入稀释倍数为5-80倍的相应洗脱液，37℃下洗脱1-2小时；
5)检测：在上述ELISA试剂板中洗脱的溶液中取0.5ml液体，在原子吸收光谱仪上检测已知含量的标准品的吸光度，并绘制标准曲线，然后检测待测样品的吸光度，在标准曲线上读出相应的含量数值。
该方法在利用ELISA原理的基础上结合原子吸收光谱(AAS)原理，利用原子吸收光谱仪检测螯合于低密度脂蛋白上的铅，由于溶液中仅含有低密度脂蛋白，且所用试剂中不含任何重金属(阴性对照组结果为阴性)，不会对结果照成干扰，因而当所读取的结果显示为阳性时，即可证明检测出低密度脂蛋白上螯合的金属铅。
方法三：酶联免疫与电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)结合法检测铅-低密度脂蛋白螯合物，按以下步骤进行检测：
1)将前面所述的可以捕获低密度脂蛋白的蛋白，如抗LDL抗体包被于固相载体上：用稀释缓冲液稀释包被蛋白至250～2000倍，加入ELISA板微孔中，4℃过夜16-18小时，或37℃水浴1-3小时，储存冰箱；
2)封闭：移去包被液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入1％-5％牛血清白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用相应洗涤液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于37℃放置1小时；
3)加待检样品，并且温育：从循环系统取样，作待检样品；以已知含量的铅-低密度脂蛋白螯合物作为标准品；用样品缓冲液稀释待测样品至10～40倍，加入微孔中，37℃作用1-2小时；
4)洗脱：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入稀释倍数为5～80倍的洗脱液，37℃下作用0-2小时；
5)酸化：在微孔中加入酸化剂(如硝酸)进行酸化，封口过夜，彻底酸化；
6)检测：加入双氧水，并加热赶酸后，从赶酸后的溶液中取0.5mL液体，在电感耦合等离子体质谱仪上检测标准品上的铅，并绘制标准曲线，然后检测待测样品上的铅，读出相应数值。
该方法在利用ELISA原理的基础上结合电感耦合等离子体质谱法原理，用电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS检测螯合于低密度脂蛋白上的铅，由于溶液中仅含有低密度脂蛋白，且所用试剂中不含任何重金属(阴性对照组结果为阴性)，不会对结果照成干扰，因而当所读取的结果显示为阳性时，即可证明检测出低密度脂蛋白上螯合的金属铅。
方法四：提纯铅-低密度脂蛋白螯合物与酶联免疫法检测铅-低密度脂蛋白螯合物，按以下步骤进行检测：
1)提取LDL：采用化学沉淀法、超速离心法、高压液相层析法、凝胶过滤层析法、电泳法、ELISA等方法将LDL提纯出来，然后对LDL进行复溶；
2)用可以捕获铅的抗体包被于固相载体上：用包被缓冲液稀释包被抗体至50000～400000倍，加入ELISA板微孔中，4℃过夜16-18小时，或37℃水浴1-3小时，储存冰箱；
3)封闭：移去包被液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入1％-5％牛血清白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用相应洗涤液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于37℃放置1小时；
4)加待检样品，并且温育：从LDL复溶液中取样，作为待检样品；以已知含量的铅-低密度脂蛋白螯合物作为标准品；用样品缓冲液稀释样品至10～40倍，加入微孔中，37℃作用1-2小时；
5)酶结合物温育：移去LDL复溶液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释的酶标抗体，37℃作用1-2小时，使其与抗铅离子抗体反应；
6)底物温育：移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37℃避光作用30min；
7)终止反应：滴加终止液至每一微孔；
8)加完终止液后，在450nm波长下于在酶标仪上分别读取待测样品组和标准品的OD值，通过与标准品组比较，求得待测样品的含量。
方法五：提纯铅-低密度脂蛋白螯合物与原子吸收光谱结合法检测铅-低密度脂蛋白螯合物，按以下步骤进行检测：
1)提取低密度脂蛋白：采用化学沉淀法、超速离心法、高压液相层析法、凝胶过滤层析法、电泳法、ELISA等方法将LDL提纯出来，然后对LDL进行复溶；
2)检测：从LDL复溶液中取0.5ml液体，在原子吸收光谱仪上检测已知含量的标准品的吸光度，并绘制标准曲线，然后检测待测样品的吸光度，在标准曲线上读出相应的含量数值。
方法六：提纯铅-低密度脂蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法检测铅-低密度脂蛋白螯合物，按以下步骤进行检测：
1)提取LDL：采用化学沉淀法、超速离心法、高压液相层析法、凝胶过滤层析法、电泳法、ELISA等方法将LDL提纯出来，然后对LDL进行复溶；
2)酸化：从LDL复溶液中取适量液体，然后加入酸化剂(如硝酸)对其进行酸化，封口过夜，彻底酸化；
3)检测：加入双氧水，并且加热赶酸后取0.5mL溶液，于电感耦合等离子体质谱仪下检测螯合于低密度脂蛋白上的铅，并绘制标准曲线，读出相应数值。
方法四、方法五和方法六中，所述超速离心法具体步骤如下：
a)取全血，用NaBr调节密度至1.21g/mL，50000rpm超速离心24h，收集下层浅黄色组分；
b)用中性盐配置成密度分别为d＝1.006、d＝1.182、d＝1.478的三种溶液；
c)取4mL步骤a)血浆至容量为10mL的超离心管中的底层，上面铺盖2mLd＝1.006盐溶液，4℃2000rap/min离心30min，收集下层4mL混合血浆待用；
d)向步骤c)4mL混合血浆加入2mL1.006盐溶液，18℃40000rap/min离心17h，取上层1mL，即极低密度脂蛋白；
e)弃去1mL上层的液体，转移剩余混合液，加入2mLd＝1.182盐溶液，混匀，18℃40000rpm/min离心21h，取出上层1mL混合液，此即低密度脂蛋白；
f)弃去1mL上层的液体，转移剩余混合液，加入2mL1.478盐溶液，18℃40kr/min离心41h，取上层溶液，即低密度脂蛋白；
所述中性盐为NaBr、KBr、NaCl或KCl中的一种或两种以上。
方法四、方法五和方法六均是通过全血提取法分离出低密度脂蛋白，再采用特异性检测方法，测定铅-低密度脂蛋白螯合物上铅的含量；即先采用物理分离手段，如超速离心法、高压液相层析法、凝胶过滤层析法等，将低密度脂蛋白从待测血浆样本中分离出来并复溶于生理盐水中，再利用ELISA原理、原子吸收光谱检测或进行检测电感耦合等离子体质谱法检测铅-低密度脂蛋白螯合物上的铅含量。
方法七：电泳与酶联免疫法(ELISA)结合法检测铅-低密度脂蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
1)提取LDL：利用常规方法(如化学沉淀法、超速离心法、高压液相层析法、凝胶过滤层析法、电泳法、ELISA方法等)将LDL提纯出来，然后用复溶剂对LDL进行复溶；
2)制备胶床：根据需要选择琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶或SDS-聚丙烯酰胺凝胶等作为介质，制备好相应胶床；
3)加样：从步骤1)中的复溶液中取8μL溶液，加入加样缓冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；
4)电泳：连接电泳板，进行电泳，并根据需求将蛋白按照分子量、等电点等参数的不同进行分离。
5)检测：在胶床上找出含有铅的蛋白条带，将该条带取出并溶解，然后再利用ELISA原理检测溶于液体中的铅含量。此外，还可以利用此方法检测螯合铅的低密度脂蛋白的等电点、分子量及含量等。
在方法七中，将低密度脂蛋白从全血中提取出来，再采用凝胶电泳法对所提取的低密度脂蛋白进行分离，再找出富含铅的相应条带，再检测相关低密度脂蛋白的含量；即低密度脂蛋白从红细胞中释放后，可以用多种方法提纯出来(例如超速离心法、高压液相层析法、凝胶过滤层析法、凝胶电泳法，ELISA方法等)，将提纯出来的低密度脂蛋白用复溶剂复溶于溶液中，取一定量的低密度脂蛋白，利用电荷移动原理，进行电泳(electrophoresis，EP)，在凝胶板(可根据需要采用不同介质)上可根据分子量、等电点等不同跑出不同的条带，寻找出富含铅的相应条带，将凝胶中的蛋白质用相应复溶剂复溶于溶液中，即可以在特定波长下检测相关低密度脂蛋白的含量，也可以利用ELISA、AAS、ICP-MS等原理检测出螯合于低密度脂蛋白上的铅含量，由于溶液中仅含有低密度脂蛋白，且所用试剂中不含任何重金属(阴性对照组结果为阴性)，不会对结果照成干扰，因而当所读取的结果显示为阳性时，即可证明检测出低密度脂蛋白上螯合的金属铅。
实施例1：铅-低密度脂蛋白螯合物的制备方法一，其包括以下步骤：
1)铅-低密度脂蛋白螯合物的合成步骤：在提纯源于人体的低密度脂蛋白中加入铅离子进行螯合反应；
2)铅-低密度脂蛋白螯合物的纯化步骤：采用免疫亲和层析去除步骤1)获得的铅-低密度脂蛋白螯合物中未参与反应的LDL及铅离子，具体如下：
A.将步骤1)制得的铅-低密度脂蛋白螯合物复溶于生理盐水中，得到复溶液；
B.平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱，将含有能够与LDL特异性结合的物质或抗LDL抗体的填料装柱后，然后用稀释缓冲液平衡层析柱；
C.上样：上样前，用稀释缓冲液稀释复溶液，然后上样，铅-低密度脂蛋白螯合物、未与铅离子反应的LDL均吸附在填料上，未反应的铅离子随缓冲液流出；
D.洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱，直至基线平衡，然后使用0.05mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱，并收集洗脱液；收集完毕后立即使蛋白复性；
E.将收集到的洗脱液装入透析袋用ddH2O透析除盐，换水2～4次后，4℃透析过夜，收集透析袋内的样本；
F.平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗新的层析柱，将能够与Pb特异性结合的填料装柱后，然后用稀释缓冲液平衡层析柱；
G.上样：上样前，用上样缓冲液稀释样本，然后上样；铅-低密度脂蛋白螯合物吸附在填料上，未反应的LDL会随稀释缓冲液流出；
H.洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱，直至基线平衡，然后使用0.5mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱，此时铅-低密度脂蛋白螯合物随着洗脱液洗脱出来，收集洗脱液；收集完毕后立即使蛋白复性；
I.将收集到的洗脱液装入透析袋用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集透析袋内的样本，得到纯化的铅-低密度脂蛋白螯合物。
实施例1所述的制备方法均还包括以下对铅-低密度脂蛋白螯合物的鉴定步骤：
Ⅰ.制备胶床：选择琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质，制备胶床；
Ⅱ.加样：取步骤2)所制得的铅-低密度脂蛋白螯合物，加入稀释缓冲液并混合均匀，然后加样于样品槽中；
Ⅲ.电泳：连接电泳板进行电泳；
Ⅳ.复溶检测：在胶床上找出含铅的蛋白条带，将该条带取出并溶解，然后利用ICP-MS法或AAS法检测液体中是否含有铅以及铅含量。
鉴定结果如下
1)AAS检测结果
取步骤C)分离出的蛋白条带溶液，以石墨炉原子吸收光谱法(AAS)初步测定铅-低密度脂蛋白螯合物中重金属铅的含量，如下表1所示，以NaCl溶液、KBr溶液、KCl溶液为空白对照；
表1铅-低密度脂蛋白螯合物中重金属铅的含量
| 样本名 | Cd(μg/L) |
| 待测样本 | 3.519 |
| NaCl | 0.000 |
| KBr | 0.000 |
| KCl | 0.087 |
2)同步辐射X荧光分析
蛋白条带内微量元素含量的SRXRF分析在北京正负电子对撞机(BEPC)的4W1"同步辐射束线上完成。储存环中电子束流能量为2.2GeV，束流强度100mA。样品移动台(TSA200型，北京卓立汉光公司)可在计算机控制的步进马达驱动下沿X、Y二维方向上移动以改变入射光斑位置，移动步长为0.0025mm。从样品发射出的X射线由Si(Li)探测器(PGTInc.LS30143-DS)探测，探头与入射SR线共平面且相互垂直，距样品照射点20mm，信号用PGT多道分析仪(MCA4000)获取输出。用11.5keV的单色同步辐射光激发样品，调节入射光斑(1mmx3mm)位置使之处于条带一端，在300s的测定时间内，光斑一直沿条带均匀缓慢移动，计数结束时光斑移到该条带另一端。沿电泳方向每1mm取一个谱。采用AXIL软件处理数据，并用来源于空气且含量恒定的Ar信号峰对其它元素峰进行归一处理，以抵消束流强度变化对信号强弱产生的影响。在相同的条件下以同样的方式测量定量标准干胶膜的荧光谱。
图2为本发明所述的铅-低密度脂蛋白螯合物的电泳条的荧光分析图，图中横坐标为蛋白条带位置，纵坐标为该条带铅金属能量(含量)值。
检测条件的确定：
1.补体蛋白最佳工作浓度以及血浆的最佳稀释倍数的确定
本发明采用棋盘滴定法确定抗LDL抗体蛋白、抗Pb抗体的最佳工作浓度以及待测血浆的最佳稀释倍数，棋盘滴定法具体步骤如下：
(1)将抗LDL抗体蛋白用包被液分别按以下倍比1:250、1:500、1:1000、1:2000进行稀释，然后分别加入ELISA板微孔中，将抗LDL抗体包被于固相载体上，每个浓度包被三排，4℃过夜18小时；
(2)移去包被液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加2％牛血清白蛋白作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤；
(3)加入待测血浆，并按以下浓度1:10、1:20、1:40进行稀释，加入微孔中，按照上述包被的LDL抗体浓度，同一个浓度的抗LDL抗体的微孔中分别加入不同稀释度血浆，37℃作用1小时；
(4)移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入抗Pb抗体，抗Pb抗体稀释为四个不同浓度，即1:50000、1:100000、1:200000、1:400000，按照每一个相同抗LDL抗体浓度、血清稀释浓度，不同浓度抗Pb抗体各加2孔，37℃作用1小时，使其与抗LDL抗体蛋白上的金属铅反应；
(5)移去抗Pb抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释的HRP酶标抗体，37℃作用1小时，使其与抗Pb抗体反应；
(6)移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37℃避光作用30min；
(7)滴加终止液至每一微孔；
(8)加完终止液后，在450nm波长下于在酶标仪上分别读取各孔OD值。根据各孔OD值数值，选择LDL抗体、Pb抗体的最佳工作浓度以及血浆的最佳稀释倍数。
实验中同时以所制标准品作为阳性对照，选择LDL-Ab+封闭+Pb抗+酶标+底物(即不加检测样本)作为阴性对照1、LDL-Ab+封闭+血浆+酶标+底物(即不加Pb抗)作为阴性对照2、LDL-Ab+封闭+酶标+底物(即不加检测样本和Pb抗)作为阴性对照3、LDL-Ab+封闭+血浆+Pb抗+底物(即不加酶标)作为阴性对照4，封闭+血浆+Pb抗+酶标+底物(即不加LDL-Ab蛋白捕获LDL)作为空白对照1，只加底物作为空白对照2，只加PBS作为空白对照3。
结果见表2及表3：
表2抗LDL抗体和抗Pb抗体最佳工作浓度以及血浆最佳稀释倍数的确定
表3ELISA阳性对照及阴性对照ELISA检测结果
由表1及表2可知，当抗LDL抗体的稀释度为1:250、血浆稀释度为1:40、Pb抗稀释度为1:200000时，OD值最大，所以选此值所对应的浓度作为最佳工作浓度。
2.ELISA洗脱液最佳工作浓度及洗脱时间确定
为寻求最适宜的洗脱条件，通过酶联免疫法在抗Pb抗体与酶标抗体温育后，以不同浓度的洗脱液进行洗脱，再通过酶标仪检测OD值，具体步骤如下：
(1)包被：将抗Pb抗体包被于固相载体上，用稀释缓冲液按1：5000的倍比稀释，加入ELISA板微孔中，4℃保存16小时；
(2)封闭：移去稀释缓冲液，洗涤后，加封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并洗涤；
(3)加酶标抗体：移去封闭液，洗涤后，加入用稀释缓冲液稀释至抗体浓度为2μg/mL的HRP酶标抗体，37℃作用2小时，使其与抗Pb抗体反应；
(4)洗脱：移去酶标抗体，用稀释缓冲液对洗脱液进行稀释，使洗脱液中木瓜蛋白酶的浓度：酶标抗体中抗体的浓度＝1:80、1:40、1:20、1:10、1:5，分别放置于37℃温度下作用1h、2h、3h；移去洗脱液，洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37℃避光作用30分钟，加终止液终止反应；
(5)于450nm的检测波长下在酶标仪上分别读取每个微孔的OD值，具体结果参见表4，
表4不同洗脱液稀释倍数下的检测结果
通过比较OD值，以判断ELISA孔壁上结合的抗Pb抗体-酶标抗体复合物洗脱程度，当OD值最低时，抗Pb抗体-酶标抗体复合物洗脱程度达到最大。如表4所示，当洗脱液中木瓜蛋白酶的浓度：酶标抗体中抗体的浓度＝1:20时，抗Pb抗体-酶标抗体复合物洗脱程度达到最大；而作用时间为1h、2h、3h时，各组OD值变化不大，可见随着时间的延长，酶活力逐渐减弱，在酶浓度不变的情况下，延长消化时间并不能提高消化率，所以本实验中洗脱液的作用时间为1-3h皆可，综上所述，我们选择洗脱液1:20作为最适工作浓度，1-3h作为最适洗脱时间。
应用实施例1：
采用酶联免疫法检测100份标本血浆中的铅-低密度脂蛋白螯合物，按照以下步骤进行检测：
1)将抗LDL抗体蛋白包被于固相载体上：用稀释缓冲液以1:250的比例稀释包被蛋白，加入ELISA板微孔中，37℃水浴1小时，储存冰箱；
2)封闭：移去包被液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加作为封闭液的1％-5％牛血清白蛋白或脱脂奶粉，37℃放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤。洗涤完成后，ELISA板于37℃放置1小时；
3)加待检样品，并且温育：从循环系统中取样，作待检样品；以已知含量的铅-低密度脂蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液以1:40的比例稀释样品，加入微孔中，37℃作用1小时；
4)加入抗Pb抗体，并且温育：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液以1:200000的比例稀释的抗Pb抗体，37℃作用1小时，使其与低密度脂蛋白上的金属铅反应；
5)酶结合物温育：移去抗Pb抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释的HRP酶标抗体，37℃作用1小时，使其与抗pb抗体反应；
6)底物温育：移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37℃下避光作用30min；
7)终止反应：滴加终止液至每一微孔；
8)加完终止液后，取450nm波长，于在酶标仪上分别读取待测样品组和标准品的OD值，通过与标准品组比较，求得待测样品中铅-低密度脂蛋白螯合物的含量(也可不使用酶标仪，直接通过染色情况进行定性检测)，结果见表5。
表5100份标本血清铅-低密度脂蛋白螯合物ELISA检测结果
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| OD | 0.637 | 0.763 | 0.662 | 0.721 | 0.618 | 0.728 | 0.827 | 0.692 | 0.713 | 0.784 |
| 编号 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 |
| OD | 0.813 | 0.743 | 0.661 | 0.83 | 0.624 | 0.741 | 0.634 | 0.654 | 0.766 | 0.64 |
| 编号 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 |
| OD | 0.866 | 0.704 | 0.708 | 0.663 | 0.787 | 0.601 | 0.624 | 0.83 | 0.841 | 0.825 |
| 编号 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 |
| OD | 0.624 | 0.73 | 0.683 | 0.743 | 0.621 | 0.772 | 0.833 | 0.808 | 0.622 | 0.718 |
| 编号 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 |
| OD | 0.639 | 0.733 | 0.894 | 0.603 | 0.809 | 0.838 | 0.823 | 0.795 | 0.649 | 0.808 |
| 编号 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 |
| OD | 0.726 | 0.78 | 0.834 | 0.734 | 0.614 | 0.805 | 0.851 | 0.811 | 0.645 | 0.787 |
| 编号 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 | 69 | 70 |
| OD | 0.849 | 0.716 | 0.698 | 0.621 | 0.62 | 0.731 | 0.67 | 0.717 | 0.848 | 0.735 |
| 编号 | 71 | 72 | 73 | 74 | 75 | 76 | 77 | 78 | 79 | 80 |
| OD | 0.872 | 0.801 | 0.762 | 0.8 | 0.607 | 0.756 | 0.884 | 0.816 | 0.648 | 0.667 |
| 编号 | 81 | 82 | 83 | 84 | 85 | 86 | 87 | 88 | 89 | 90 |
| OD | 0.678 | 0.661 | 0.825 | 0.638 | 0.686 | 0.62 | 0.693 | 0.794 | 0.808 | 0.761 |
| 编号 | 91 | 92 | 93 | 94 | 95 | 96 | 97 | 98 | 99 | 100 |
| OD | 0.773 | 0.769 | 0.662 | 0.814 | 0.738 | 0.813 | 0.782 | 0.718 | 0.789 | 0.673 |
应用实施例2
采用酶联免疫与原子吸收光谱结合法(ELISA法+AAS法)检测100份标本血样中的铅-低密度脂蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
1)将抗LDL抗体蛋白包被于固相载体上：用稀释缓冲液以1:250的比例稀释包被蛋白，加入ELISA板的微孔中，4℃下过夜18小时；
2)封闭：移去包被液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加作为封闭液的1％-5％牛血清白蛋白或脱脂奶粉，37℃放置1小时，移去封闭液，并用相应洗涤液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于37℃放置1小时；
3)加待检样品，并且温育：从循环系统中取样，作待检样品；以已知含量的铅-低密度脂蛋白螯合物作为标准品；用上样缓冲液以1:40的比例稀释样品，加入微孔中，37℃作用1小时；
4)洗脱：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入稀释倍数为20倍的洗脱液，在37℃下洗脱1小时；
5)检测：从ELISA微孔中取0.5mL液体，在原子吸收光谱仪上检测已知含量的标准品的吸光度，读出相应的含量数值，检测值如表6所示。
表6100份标本血浆铅-低密度脂蛋白螯合物AAS检测结果
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| μg/L | 0.305 | 0.205 | 0.319 | 0.31 | 0.307 | 0.318 | 0.212 | 0.289 | 0.293 | 0.343 |
| 编号 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 |
| μg/L | 0.321 | 0.223 | 0.284 | 0.227 | 0.242 | 0.238 | 0.422 | 0.338 | 0.306 | 0.292 |
| 编号 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 |
| μg/L | 0.262 | 0.219 | 0.227 | 0.255 | 0.322 | 0.316 | 0.258 | 0.202 | 0.327 | 0.344 |
| 编号 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 |
| μg/L | 0.229 | 0.401 | 0.234 | 0.223 | 0.273 | 0.212 | 0.296 | 0.283 | 0.257 | 0.301 |
| 编号 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 |
| μg/L | 0.343 | 0.283 | 0.299 | 0.252 | 0.267 | 0.297 | 0.234 | 0.254 | 0.292 | 0.331 |
| 编号 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 |
| μg/L | 0.282 | 0.223 | 0.29 | 0.258 | 0.311 | 0.253 | 0.279 | 0.256 | 0.283 | 0.237 |
| 编号 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 | 69 | 70 |
| μg/L | 0.295 | 0.341 | 0.251 | 0.224 | 0.277 | 0.263 | 0.405 | 0.21 | 0.289 | 0.274 |
| 编号 | 71 | 72 | 73 | 74 | 75 | 76 | 77 | 78 | 79 | 80 |
| μg/L | 0.325 | 0.209 | 0.334 | 0.422 | 0.342 | 0.258 | 0.214 | 0.337 | 0.279 | 0.263 |
| 编号 | 81 | 82 | 83 | 84 | 85 | 86 | 87 | 88 | 89 | 90 |
| μg/L | 0.313 | 0.305 | 0.344 | 0.238 | 0.267 | 0.34 | 0.28 | 0.243 | 0.302 | 0.295 |
| 编号 | 91 | 92 | 93 | 94 | 95 | 96 | 97 | 98 | 99 | 100 |
| μg/L | 0.223 | 0.292 | 0.206 | 0.272 | 0.208 | 0.293 | 0.215 | 0.339 | 0.276 | 0.21 |
应用实施例3：
采用酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法检测100份标本血样中的铅-低密度脂蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
1)将抗LDL抗体包被于固相载体上：用稀释缓冲液以1:250的比例稀释包被蛋白，加入ELISA板微孔中，4℃过夜18小时；
2)封闭：移去包被液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加作为封闭液的1％-5％牛血清白蛋白或脱脂奶粉，37℃放置1小时，移去封闭液，并用相应洗涤液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于37℃放置1小时；
3)加待检样品，并且温育：从循环系统取样，作待检样品；以已知含量的铅-低密度脂蛋白螯合物作为标准品；用上样缓冲液以1:40的比例稀释待测样品，加入微孔中，37℃作用1小时；
4)洗脱：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入稀释倍数为20倍的洗脱液，在37℃下洗脱1小时；5)酸化：在微孔中加入硝酸进行酸化，封口过夜，彻底酸化；
6)检测：加入双氧水，并加热赶酸后，从微孔中取0.5mL液体，在电感耦合等离子体质谱仪上检测标准品上的铅，检测结果如表7所示。
表7100份标本血清铅-低密度脂蛋白螯合物ICP-MS检测结果
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| μg/L | 0.21 | 0.332 | 0.241 | 0.232 | 0.254 | 0.317 | 0.349 | 0.238 | 0.221 | 0.287 |
| 编号 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 |
| μg/L | 0.224 | 0.296 | 0.275 | 0.244 | 0.345 | 0.29 | 0.244 | 0.277 | 0.289 | 0.242 |
| 编号 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 |
| μg/L | 0.212 | 0.33 | 0.207 | 0.301 | 0.247 | 0.296 | 0.262 | 0.216 | 0.296 | 0.299 |
| 编号 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 |
| μg/L | 0.294 | 0.308 | 0.224 | 0.249 | 0.35 | 0.266 | 0.337 | 0.275 | 0.294 | 0.311 |
| 编号 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 |
| μg/L | 0.277 | 0.348 | 0.29 | 0.221 | 0.253 | 0.396 | 0.202 | 0.322 | 0.205 | 0.299 |
| 编号 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 |
| μg/L | 0.317 | 0.324 | 0.261 | 0.287 | 0.202 | 0.246 | 0.289 | 0.285 | 0.316 | 0.255 |
| 编号 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 | 69 | 70 |
| μg/L | 0.322 | 0.258 | 0.222 | 0.204 | 0.237 | 0.336 | 0.385 | 0.32 | 0.343 | 0.263 |
| 编号 | 71 | 72 | 73 | 74 | 75 | 76 | 77 | 78 | 79 | 80 |
| μg/L | 0.32 | 0.297 | 0.323 | 0.403 | 0.221 | 0.282 | 0.312 | 0.306 | 0.266 | 0.314 |
| 编号 | 81 | 82 | 83 | 84 | 85 | 86 | 87 | 88 | 89 | 90 |
| μg/L | 0.265 | 0.24 | 0.212 | 0.305 | 0.35 | 0.227 | 0.277 | 0.241 | 0.248 | 0.321 |
| 编号 | 91 | 92 | 93 | 94 | 95 | 96 | 97 | 98 | 99 | 100 |
| μg/L | 0.233 | 0.253 | 0.243 | 0.248 | 0.202 | 0.332 | 0.28 | 0.268 | 0.257 | 0.35 |
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种铅-低密度脂蛋白螯合物，其特征在于：其是由铅离子通过锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中的至少一种结构与低密度脂蛋白螯合形成。
2.一种如权利要求1所述的铅-低密度脂蛋白螯合物的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：
1)铅-低密度脂蛋白螯合物的合成步骤：
铅离子向人源的低密度脂蛋白中加入铅离子进行螯合反应；
2)铅-低密度脂蛋白螯合物的纯化步骤：
采用免疫亲和层析去除步骤1)获得的铅-低密度脂蛋白螯合物中未参与反应的低密度脂蛋白及铅离子。
3.如权利要求2所述的铅-低密度脂蛋白螯合物的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：
所述步骤1)中包括以下步骤：
在提纯源于人体的低密度脂蛋白或/和生物学方法重组的低密度脂蛋白中加入铅离子进行螯合反应；
所述步骤2)中包括以下步骤：
A.将步骤1)制得的铅-低密度脂蛋白螯合物复溶于生理盐水中，得到复溶液；
B.平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱，将含有能够与低密度脂蛋白特异性结合的物质的填料装柱后，然后用稀释缓冲液平衡层析柱；
C.上样：上样前，用稀释缓冲液稀释复溶液，然后上样，铅-低密度脂蛋白螯合物、未与铅离子反应的低密度脂蛋白均吸附在填料上，未反应的铅离子随缓冲液流出；
D.洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.10M的Na2HPO4溶液进行洗脱；
E.收集洗脱液；收集完毕后立即用使蛋白复性；
F.透析：将收集到的洗脱液装入透析袋用ddH2O透析除盐，换水2～4次后，4℃透析过夜，收集透析袋内的样本；
G.平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗新的层析柱，将能够与Pb特异性结合的填料装柱后，然后用稀释缓冲液平衡层析柱；
H.上样：上样前，用稀释缓冲液稀释样本，然后上样；铅-低密度脂蛋白螯合物吸附在填料上，未反应的低密度脂蛋白会随稀释缓冲液流出；
I.洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5-1.0M的Na2HPO4溶液进行洗脱；
J.收集洗脱液；收集完毕后立即用使蛋白复性；
K.将收集到的洗脱液装入透析袋用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集透析袋内的样本，得到纯化的铅-低密度脂蛋白螯合物。
4.根据权利要求2或4所述的铅-低密度脂蛋白螯合物的制备方法，其特征在于：还包括3)对铅-低密度脂蛋白螯合物的鉴定步骤：
Ⅰ.制备胶床：选择琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质，制备胶床；
Ⅱ.加样：取步骤2)所制得的铅-低密度脂蛋白螯合物，加入上样缓冲液并混合均匀，然后加样于样品槽中；
Ⅲ.电泳：连接电泳板进行电泳；
Ⅳ.复溶检测：在胶床上找出含铅的蛋白条带，将该条带取出并溶解，然后利用ICP-MS法或AAS法检测该液体中是否含有铅以及铅含量。
5.一种如权利要求1所述的铅-低密度脂蛋白螯合物在检测人体内铅-低密度脂蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用。
6.一种至少包括如权利要求1所述的铅-低密度脂蛋白螯合物作为标准品的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的用于检测铅-低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括包被液，该包被液为含有捕获低密度脂蛋白的物质或或捕获金属铅的物质。
8.一种检测铅-低密度脂蛋白螯合物的方法，其特征在于：以权利要求1所述的铅-低密度脂蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯铅-低密度脂蛋白螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯铅-低密度脂蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
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2015
- 2015-07-14 CN CN201510413355.8A patent/CN105061586A/zh active Pending
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