CN104855703A - 一种提高鱼类免疫力的中药微生物发酵制剂及其制备方法和用途 - Google Patents

一种提高鱼类免疫力的中药微生物发酵制剂及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种提高鱼类免疫力的中药微生物发酵制剂，它是以中药为原料，经益生菌发酵制备而成，其中，所述中药包括如下重量配比的组分：枸杞子14～17份、甘草4-6、五倍子14～36份、黄芪6～7份。本发明中药微生物发酵剂可以改善水质，同时能够提高鱼体免疫力，促进水产动物健康成长，且本发明中药微生物发酵剂的主要成分是嗜酸乳杆菌等益生菌和中药，副作用小，临床应用前景良好。

Description

一种提高鱼类免疫力的中药微生物发酵制剂及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种提高鱼类免疫力的中药微生物发酵制剂及其制备方法和用途。
背景技术
由于环境保护意识不强，中国许多水质都遭到污染，需要有效治疗，改善水质。目前大多采用包括网栏、沉淀、过滤、工程性措施等物理方法，只能清除一些可见的悬浮物(粪便、残饵等)。药物消毒等化学方法可以有效去除部分有害物质，但如果处理操作不当，很可能会出现药物的毒、副作用与耐药性的产生，需要寻找副作用小的改善水质的药剂。
另一方面，由于水质遭到污染，许多鱼类的生存现状堪忧，提高鱼类免疫力非常紧迫。目前常用的是在饲料中添加部分糖类物质或者几种灭活疫苗等措施，但是，饲料添加剂使用不当，造成水体内饲料过剩，会污染养殖水体；部分灭活疫苗的研制，耗时长，造价高，且对水产动物的生长存在一定的风险，需要寻找副作用小的提高鱼类免疫力的药剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高副作用小的鱼类免疫力的中药微生物发酵制剂及其制备方法和用途。
本发明提高鱼类免疫力的中药微生物发酵制剂，它是以中药为原料，经益生菌发酵制备而成，其中，所述中药包括如下重量配比的组分：枸杞子13～20份、甘草3-10、五倍子13～40份、黄芪6～10份。
优选地，所述中药包括如下重量配比的组分：枸杞子14～17份、甘草4-6、五倍子14～36份、黄芪6～7份。
其中，所述益生菌的用量为中药重量的1～3％。
所述益生菌包括如下重量配比的组分：嗜酸乳杆菌1～3份，唾液乳杆菌1～3份,枯草芽孢杆菌1～3份,短小芽孢杆菌1～3份。优选地，所述益生菌包括如下重量配比的组分：嗜酸乳杆菌0.063～0.09份，唾液乳杆菌0.010～0.030份,枯草芽孢杆菌0.021～0.077份,短小芽孢杆菌0.010～0.053份。
其中，所述益生菌包括如下重量份的组分：嗜酸乳杆菌0.063～0.09份，唾液乳杆菌0.010～0.030份,枯草芽孢杆菌0.021～0.077份,短小芽孢杆菌0.010～0.053份。
它是由如下方法制备得到：
(1)按配比称取中药和益生菌；
(2)原料处理：将中药粉碎，加入中药重量35％的麦麸和7～10倍重量的水，混匀，50～70℃恒温水浴10min，用7层纱布或者8层纱布过滤，得滤渣；
(3)制备菌悬液：在益生菌中加入3倍重量的水，混匀，得菌悬液；
(4)发酵：将步骤(2)的滤渣与步骤(3)的菌悬液混匀，密封，在37℃条件下培养24h。
其中，所述剂型固体制剂或者液体制剂。优选地，所述固体制剂为散剂。
本发明提高鱼类免疫力的中药微生物发酵制剂的制备方法，它包括如下操作步骤：
(1)按配比称取中药和益生菌；
(2)原料处理：将中药粉碎，加入中药重量35％的麦麸和7～10倍重量的水，混匀，50～70℃恒温水浴10min，用7层纱布或者8层纱布过滤，得滤渣；
(3)制备菌悬液：在益生菌中加入3倍重量的水，混匀，得菌悬液；
(4)发酵：将步骤(2)的滤渣与步骤(3)的菌悬液混匀，密封，在37℃条件下培养24h。
本发明还提供了前述中药微生物发酵制剂在制备提高鱼类免疫力的药品中的用途。
本发明还提供了前述中药微生物发酵制剂在制备改善水质的药品或者日化用品中的用途。
本发明中药微生物发酵制剂可以提高鱼类免疫力。
综上，本发明中药微生物发酵剂可以改善水质，同时能够提高鱼体免疫力，促进水产动物健康成长，且本发明中药微生物发酵剂的主要成分是嗜酸乳杆菌等益生菌和中药，副作用小，临床应用前景良好。
以下结合附图和实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。
附图说明
图1鲤鱼水池氨氮含量的变化情况
图2鲤鱼水池亚硝酸盐变化情况
图3鲤鱼水池溶解氧含量的变化情况
图4鲤鱼水池硫化物含量的变化情况
图5鲤鱼水池pH值变化情况 
具体实施方式
实施例1  本发明中药微生物发酵制剂的制备
1.1材料及仪器 
中草药：枸杞子17份，甘草4份，五倍子36份，黄芪7份，均重约为2.5g；麦麸2.9g，蒸馏水92.3g，益生菌：嗜酸乳杆菌0.063g，唾液乳杆菌0.030g,枯草芽孢杆菌0.077g,短小芽孢杆菌0.053g。植物粉碎机，水浴锅，恒温培养箱。
1.2.方法
将四种中草药70℃烘干4h,混合后用植物粉碎机粉碎，倒入锥形瓶，加入35％混合中草药重量麦麸约2.9g和7倍中草药与麦麸混合重量蒸馏水约92.3g，混合均匀，70℃恒温水浴10min,再用8层纱布过滤除去43g的蒸馏水。将四种益生菌分别混合入一个EP管里，加入3倍益生菌重量的双蒸水约0.6g，制成菌悬液。将菌悬液加入装有中草药的锥形瓶中，用封口膜封住瓶口，再盖上棉塞，置恒温培养箱内37℃恒温培养24h，每隔4h将锥形瓶置于37℃水浴锅内轻摇1min。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果
实验例1  本发明中药微生物发酵制剂在鲤鱼养殖中的应用
复方制剂：实施例1制备的中药微生物发酵剂。
一、实验方法 
1.1试验设计与饲养管理
试验共设计4个处理对照组、A组(复方发酵制剂组)、B组(温和气单胞菌加复方发酵制剂组)、C组(温和气单胞菌组)，试验鱼均重为50g的鲤鱼60尾，随机分成四组，放入4个不同处理的水族箱(0.68m×0.48m×0.35m)中，有效体积为114L。试验前水池充分曝气除碌7d，鲤鱼饲料驯化7d,正式试验从2014年11月6日开始，共31d。每天投喂3次，时间为8:30、13:30、18：30，连续投喂16d,第16-25d之内不投喂，第26日投喂1d，后期均不投喂益生菌。按照复方制剂筛选时用药剂量比例，设置投菌量为16×106个/ml。试验期间，平均水温(20±2)，每隔3d换1/3水，不吸污，除测定水样的2h前不充气外，其他时间连续充氧。
1.2水样的收集和分析
分别在试验的5、8、12、14、16、26、31d的下午18：00定点0.25m水深处采取水样，每次采集水样地点相同。取水样前2h停止充气,且将养殖水体充分混合均匀。采集水样200ml，于4000r/min，离心5min,取上清液。采用pH-3C酸度计测定养殖水体中的pH值；采用碘量法测定水体中溶氧含量； 采用水杨酸法测定水体中氨氮含量；采用重氮-偶合法测定水体中亚硝酸盐含量；采用DPD法测定水体中的硫化物含量。
1.3鲤鱼血清生理生化指标的测定
试验第5、12、16、26、31天测定鲤鱼各种免疫指标。每次从每组挑选体重均匀的6尾鱼，用1.0ml注射器尾静脉取血，室温静置2h，待其凝血后用冷冻离心机4℃，4000rpm离心10min，分离血清，将血清分为3份，0.2ml用于测定碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)。
采用试剂盒测定鲤鱼血清AKP、ACP、T-SOD、CAT、T-AOC活性。
1.4统计分析
试验数据采用SPSS17.0软件进行单因子方差(ANOVA)分析，并用Duncan进行组间多重比较，结果均以平均数±标准差表示，显著性差异为0.05。
二、实验结果 
1对水质的影响 
1.1鲤鱼水池氨氮含量的变化情况
表1鲤鱼水池氨氮含量的变化情
注：同列数据肩注的不同的小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同的小写字母表示差异不显著(P＞0.05)。
由图1和表1可见，试验5d后，各组氨氮量急剧降低，5d-16d氨氮含量趋于平缓，16d后急剧上升。由表1可见A(复方制剂)组的氨氮含量一直最低，与对照组相比，12d、14d和16d差异显著，分别比对照组降低了96％(P＜0.05)、98％(P＜0.05)和98％(P＜0.05)，停止加入复方制剂后，试验26d氨氮量高于对照组，31d与对照组相比降低了26％。B(致病菌加复方制剂)组的氨氮含量试验12d、16d显著低于对照组，分别比对照组降低了41％(P＜0.05)、94％(P＜0.05)，试验16d-31d仅加入一次复方制剂的养殖水体中的氨氮含量均高于与对照组。C(致病菌)组氨氮含量一直高于对照组，变化趋势与其他三组相似。
与对照组相比，本发明复方制剂组(A组)的氨氮含量显著降低(P＜0.05)；与致病菌组(C组)相比，增加本发明复方制剂(B组)后，氨氮含量显著降低(P＜0.05)。实验结果说明，本发明复方制剂可以有效降低水质 中的氨氮含量。
1.2鲤鱼水池亚硝酸盐含量的变化情况
表2鲤鱼水池亚硝酸盐含量的变化情况
注：同列数据肩注的不同的小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同的小写字母表示差异不显著(P＞0.05)。
由图2、表2可见，试验0-5d，对照组与A组养殖水体中的氨氮含量呈显著性上升(P＞0.05)，B、C两组显著性降低(P＜0.05)。 12d-26d A组亚硝酸盐含量较其他三组显著性下降(P＜0.05)，与对照组相比，试验5d-31d亚硝酸盐含量低于对照组，其中差异显著，处理组分别比对照组降低了30％(P＜0.05)、65％(P＜0.05)、58％(P＜0.05)。B组亚硝酸盐含量高于对照组和B组，变化趋势与对照组和B组一致。C组在试验5-31d时亚硝酸盐含量显著高于其他三组。
与对照组相比，本发明复方制剂组(A组)的亚硝酸盐含量显著降低(P＜0.05)；与致病菌组(C组)相比，增加本发明复方制剂(B组)后，亚硝酸盐含量显著降低(P＜0.05)。实验结果说明，本发明复方制剂可以有效降低水质中的亚硝酸盐含量。
1.3鲤鱼水池溶解氧含量的变化情况
表3鲤鱼水池溶解氧含量的变化情况
注：同列数据肩注的不同的小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同的小写字母表示差异不显著(P＞0.05)。
由表3、图3可见，随着时间的延长，对照组养殖水体的溶氧量呈波动性变化趋势。试验12d时，养殖水体的溶解氧比试验3d的溶解氧下降了40.5％。各试验组的溶解氧在前8d都表现出不同程度增加的相同变化趋势(P＞0.05)，随和呈不同程度的变化趋势。其中，试验组A水体中的溶解氧呈现显著性升高趋势(P＜0.05)。而试验组B水体中的溶解氧在小幅度范围内变动(P＞0.05)。与对照组相比，试验组C水体中的溶解氧呈显著性(P＜0.05)降低趋势。结果表明养殖水体中添加复方制剂能够维持养殖水体中的溶解氧。
与对照组相比，本发明复方制剂组(A组)的溶解氧含量显著升高(P＜0.05)；与致病菌组(C组)相比，增加本发明复方制剂(B组)后，溶解氧含量显著升高(P＜0.05)。实验结果说明，本发明复方制剂可以有效提高溶解氧含量。
1.4鲤鱼水池硫化物含量的变化情况
表4鲤鱼水池硫化物含量的变化情况
注：同列数据肩注的不同的小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同的小写字母表示差异不显著(P＞0.05)。
由图4、表4可见，试验0d-8d，对照组与试验B、C组养殖水体中的硫化物含量呈显著性(P＜0.05)上升，复方制剂组先降低后上升，差异不显著(P＞0.05)；8d-31d各试验组呈波动性变化趋势。8d-16d A组硫化物含量较其他三组显著性下降(P＜0.05)，与对照组相比，整个试验过程中，试验A组硫化物含量均低于对照组，其中12d、16d、26d差异显著，处理组分别比对照组降低了60％(P＜0.05)、50％(P＜0.05)、50％(P＜0.05)。B组12d-16d硫化物含量低于对照组且高于A组，其中12d差异显著，处理组比对照组降低了40％(P＜0.05)；停止添加复方制剂后，26d时B组硫化物含量显著高于对照组；添加复方制剂后，31d时硫化物含量再次出现显著性降低，与对照组相比，硫化物含量降低了50％(P＜0.05)。试验C组6d-26d养殖水体中硫化物含量均高于其他三组，并呈现波动变化趋势。
与对照组相比，本发明复方制剂组(A组)的硫化物含量显著降低(P＜0.05)；与致病菌组(C组)相比，增加本发明复方制剂(B组)后，硫化物含量显著降低(P＜0.05)。实验结果说明，本发明复方制剂可以有效降低水质中的硫化物含量。
1.5鲤鱼养殖水体pH值变化情况 
由图5可见，试验组pH值保持在7.0—8.0，pH值属于正常养殖水平。温和气单胞菌组pH值小于含有益生菌的两组，正常组pH值最低；投喂14d后，单独添加益生菌的一组pH值小于前期添加温和气单胞菌的一组。
实验结果说明，本发明复方制剂能够有效降低水的氨氮含量、亚硝酸盐含量和硫化物含量，同时能显著提高溶解氧含量，说明中药微生物发酵剂可以去除水中的有毒物质，增加溶解氧，改善水质。
2对鱼免疫力的影响
1.1复方制剂对鲤鱼血清碱性磷酸酶的影响
表5复方制剂对鲤鱼血清碱性磷酸酶的影响
注：同列数据肩注的不同的小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同的小写字母表示差异不显著(P＞0.05)。
由表可见，在加入复方制剂饲养31d内AKP活性随着时间延长呈先升高后降低的趋势，各试验组第12天和第16天，AKP活性均与对照组差异显著(P＜0.05)；停止施用复方制剂试验第26天，AKP活性显著性(P＜0.05)下降，试验结束时B、C两组的AKP活性均高于对照组和C组。试验第12-16天复方制剂组AKP活性最高，第16天AKP酶活性是对照组的3倍。试验前16天，试验B组AKP酶活性高于对照组与试验C组，第16天AKP酶活性是对照组的2倍。停止施用复方制剂试验第26天，AKP活性显著性(P＜0.05)下降。试验期间除第16天之外，C组AKP活性均低于其他三组。
与对照组相比，本发明复方制剂组(A组)的鲤鱼血清碱性磷酸酶显著升高(P＜0.05)；与致病菌组(C组)相比，增加本发明复方制剂(B组)后，鲤鱼血清碱性磷酸酶含量显著升高(P＜0.05)。实验结果说明，本发明复方制剂可以有效提高鲤鱼血清碱性磷酸酶含量。
1.2复方制剂对鲤鱼血清酸性磷酸酶的影响
表6复方制剂对鲤鱼血清酸性磷酸酶的影响
注：同列数据肩注的不同的小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同的小写字母表示差异不显著(P＞0.05)。
由表6可见，在加入复方制剂饲养31d内ACP活性随着时间延长试验组A呈逐渐升高的趋势.试验第12天-31天，ACP活性均与对照组差异显著(P＜0.05),均高于对照组，其中施用复方制剂期间第12d、16d、31d差异最显著。第16天ACP酶活性约为对照组的6倍。试验组B在整个试验期间ACP活性均高于对照组，在第5d、12d、26d、31dACP活性均高于试验C组，加入复方制剂后第12天，试验C组与对照组比较差异最显著(P＜0.05)，约为对照组的9倍。
与对照组相比，本发明复方制剂组(A组)的鲤鱼血清酸性磷酸酶显著升高(P＜0.05)；与致病菌组(C组)相比，增加本发明复方制剂(B组)后，鲤鱼血清酸性磷酸酶含量显著升高(P＜0.05)。实验结果说明，本发明复方制剂可以有效提高鲤鱼血清酸性磷酸酶含量。
1.3复方制剂对鲤鱼血清总超氧化物歧化酶(T-SOD)的影响
表7复方制剂对鲤鱼血清总超氧化物歧化酶的影响
注：同列数据肩注的不同的小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同的小写字母表示差异不显著(P＞0.05)。
由表7可见，在加入复方制剂饲养31d内T-SOD活性随着时间延长呈现波动性变化的趋势，各试验组第5-16天，T-SOD活性均与对照组差异显著(P＜0.05)；停止施用复方制剂试验第26天，T-SOD活性显著性(P＜0.05)下降，试验结束时，复方制剂组T-SOD活性显著性(P＞0.05)升高。试验第5、16、31天复方制剂组AKP活性最高，其中，第15天T-SOD酶活性是对照组 的2倍。试验前16天与试验结束时，后期添加复方制剂的B组T-SOD活性显著性(P＜0.05)高于致病菌组。试验期间添加复方制剂时，C组T-SOD活性均低于其他三组。
与对照组相比，本发明复方制剂组(A组)的鲤鱼血清总超氧化物歧化酶显著升高(P＜0.05)；与致病菌组(C组)相比，增加本发明复方制剂(B组)后，鲤鱼血清总超氧化物歧化酶含量显著升高(P＜0.05)。实验结果说明，本发明复方制剂可以有效提高鲤鱼血清鲤鱼血清总超氧化物歧化酶含量。
1.4复方制剂对鲤鱼血清过氧化氢酶(CAT)的影响
表8复方制剂对鲤鱼血清过氧化氢酶的影响
注：同列数据肩注的不同的小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同的小写字母表示差异不显著(P＞0.05)。
由表8可见，在加入复方制剂饲养31d内CAT活性随着时间延长呈波动性变化趋势，各试验组第12-16天，CAT活性均与对照组差异显著(P＜0.05)，试验第16天和31天CAT活性显著性(P＜0.05)下降。A组第12-31天，CAT活性均显著性(P＜0.05)高于对照组，其中试验结束时CAT活性最高。B组第5、16、31天CAT活性高于对照组，整个试验过程CAT活性均显著性(P＜0.05)高于C组。C组在第12、14天和试验结束时CAT活性都显著性低于其他三组。
与对照组相比，本发明复方制剂组(A组)的鲤鱼血清过氧化氢酶显著升高(P＜0.05)；与致病菌组(C组)相比，增加本发明复方制剂(B组)后，鲤鱼血清过氧化氢酶含量显著升高(P＜0.05)。实验结果说明，本发明复方制剂可以有效提高鲤鱼血清鲤鱼血清过氧化氢酶。
1.5复方制剂对鲤鱼血清总抗氧化能力(T-AOC)的影响
表9复方制剂对鲤鱼血清总抗氧化能力(T-AOC)的影响
组别AOC 5d 12d 16d 26d 31d
对照组 19.12±1.12a 10.78±3.77a 17.35±4.83a 28.47±4.46a 11.51±10.65a
A 50.32±8.20c 26.77±13.42a 44.04±27.88a 51.95±0.51a 14.11±1.71a
B 23.59±1.59a 10.54±2.19a 40.15±2.13a 31.39±13.08a 47.20±22.03a
C 28.64±3.63ab 42.74±48.31a 29.44±34.33a 40.15±37.85a 3.40±2.75b
注：同列数据肩注的不同的小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同的小写字母表示差异不显著(P＞0.05)。
由表9可见，试验组A在加入复方制剂饲养31d内T-AOC活性随着时间延长呈波动的变化趋势。整个试验过程中T-AOC活性均与对照组差异显著(P＜0.05)，试验第5天和12天CAT活性约为对照组的2.6倍。B组除了第12天之外，T-AOC活性均显著性(P＜0.05)高于对照组，其中试验结束时T-AOC活性最高，约为对照组的4倍；与试验C组相比，第16d与试验结束时T-AOC活性差异显著，其中试验结束时，T-AOC活性约为C组的12倍。
与对照组相比，本发明复方制剂组(A组)的鲤鱼血清总抗氧化能力显著升高(P＜0.05)；与致病菌组(C组)相比，增加本发明复方制剂(B组)后，鲤鱼血清总抗氧化能力显著升高(P＜0.05)。实验结果说明，本发明复方制剂可以有效提高鲤鱼血清总抗氧化能力。
实验结果说明，本发明复方制剂能够有效提高鲤鱼的碱性磷酸酶含量、酸性磷酸酶含量、总超氧化物歧化酶含量、过氧化氢酶、总抗氧化能力，可以提高鱼类免疫力。
综上，本发明中药微生物发酵剂可以改善水质，同时能够提高鱼体免疫力，促进水产动物健康成长，临床应用前景良好。

Claims (10)

1.一种提高鱼类免疫力的中药微生物发酵制剂，其特征在于：它是以中药为原料，经益生菌发酵制备而成，其中，所述中药包括如下重量配比的组分：枸杞子14～17份、甘草4-6、五倍子14～36份、黄芪6～7份。
2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于：所述益生菌的用量为中药重量的1～3％。
3.根据权利要求2所述的制剂，其特征在于：所述益生菌包括如下重量配比的组分：嗜酸乳杆菌0.06～0.10g，唾液乳杆菌0.01～0.04g,枯草芽孢杆菌0.02～0.08g,短小芽孢杆菌0.01～0.06g。
4.根据权利要求3所述的制剂，其特征在于：所述益生菌包括如下重量配比的组分：嗜酸乳杆菌0.063～0.09份，唾液乳杆菌0.010～0.030份,枯草芽孢杆菌0.021～0.077份,短小芽孢杆菌0.010～0.053份。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的制剂，其特征在于：它是由如下方法制备得到：
(1)按配比称取中药和益生菌；
(2)原料处理：将中药粉碎，加入中药重量35％的麦麸和7～10倍重量的水，混匀，50～70℃恒温水浴10min，用7层纱布或者8层纱布过滤，得滤渣；
(3)制备菌悬液：在益生菌中加入3倍重量的水，混匀，得菌悬液；
(4)发酵：将步骤(2)的滤渣与步骤(3)的菌悬液混匀，密封，在37℃条件下培养24h。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的保健品或药物组合物，其特征在于：所述剂型固体制剂或者液体制剂。
7.根据权利要求6所述的保健品或药物组合物，其特征在于：所述固体制剂为散剂。
8.权利要求1～7任意一项所述提高鱼类免疫力的中药微生物发酵制剂的制备方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：
(1)按配比称取中药和益生菌；
(2)原料处理：将中药粉碎，加入中药重量35％的麦麸和7～10倍重量的水，混匀，50～70℃恒温水浴10min，用7层纱布或者8层纱布过滤，得滤渣；
(3)制备菌悬液：在益生菌中加入3倍重量的水，混匀，得菌悬液；
(4)发酵：将步骤(2)的滤渣与步骤(3)的菌悬液混匀，密封，在37℃条件下培养24h。
9.权利要求1～8任意一项所述中药微生物发酵制剂在制备提高鱼类免疫力的药品中的用途。
10.权利要求1～8任意一项所述中药微生物发酵制剂在制备改善水质的药品或者日化用品中的用途。
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