CN104672191B - 胡枝子酚e1类化合物及制备方法和应用 - Google Patents

胡枝子酚e1类化合物及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种胡枝子酚E1类化合物及制备方法和应用，具体是胡枝子酚E1类化合物的制备及其在抗肿瘤药物和治疗糖尿病药物中的应用。本发明首次合成出胡枝子酚E1及其衍生物，并对所合成的化合物针对人白血病细胞(K562)、人结肠癌细胞(HT‑29)、人胃癌细胞(MGC‑803)进行了抗肿瘤活性测试，结果表明这类化合物的IC50<100μM；同时进行了α‑葡萄糖苷酶抑制活性测试，结果表明胡枝子酚E1的IC50<10μM。本发明提供的化合物原料易得，制备方法简单，在治疗肿瘤药物和治疗糖尿病药物中的有着良好的应用前景。

Description

胡枝子酚E1类化合物及制备方法和应用
技术领域
本发明属于新化合物制备方法及药物领域，尤其是胡枝子酚E1类衍生物的制备治疗肿瘤药物和治疗糖尿病药物中的应用。
技术背景
胡枝子酚E1又名8-香叶基异黄酮，主要存在于天然豆科植物同裂胡枝子的根茎中。研究表明，胡枝子酚E1具有抗氧化活性和抑制BACE1活性。在已知文献报道中，具有香叶基的黄酮类化合物的生物活性有明显提高，如抗肿瘤、抗氧化、抗炎等生物活性。本发明首次合成了胡枝子酚E1及其衍生物对该类化合物的生物活性的进一步研究提供一定的帮助。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胡枝子酚E1类化合物及制备方法和应用，胡枝子酚E1类化合物在治疗肿瘤药物和治疗糖尿病药物中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
胡枝子酚E1类化合物，结构通式如下：
其中R1、R2、R3为氢、甲基。
所述的胡枝子酚E1类化合物的制备及其在抗肿瘤药物和治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于：所述的R1为氢、R2为氢、R3为氢，即胡枝子酚E1。
而且R1为甲基、R2为甲基、R3为甲基，即三甲基胡枝子酚E1。
而且R1为氢、R2为甲基、R3为甲基，即7，4’-二甲基胡枝子酚E1。
胡枝子酚E1类衍生物的制备，合成路线如下：
其中R1、R2、R3为氢、甲基。
本发明首次合成出胡枝子酚E1及其衍生物，并进行了体外细胞抗肿瘤活性的测定，所测定的3种肿瘤细胞分别为人白血病细胞(K562)、人结肠癌细胞(HT-29)和人胃癌细胞(MGC-803)，结果显示这类衍生物具有较好的抗肿瘤生物活性(IC50<100μM)；进行了体外α-葡萄糖苷酶抑制活性测试，结果表明：胡枝子酚E1具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性(IC50<10μM)。本发明具有操作简单、反应条件温和、合成工艺和纯化方法简单、收率高、测定方法简单等优点，并且对肿瘤细胞和α-葡萄糖苷酶有很好的抑制作用，可应用于制备抗肿瘤和治疗糖尿病药物。
附图说明
图1为胡枝子酚E1核磁共振氢谱。
图2为三甲基胡枝子酚E1核磁共振氢谱。
图3为7，4’-二甲基胡枝子酚E1核磁共振氢谱。
图4降糖活性动物实验测试血糖值。
具体的实施方式
为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
下面通过实施例具体说明制备方法。
第一部分：胡枝子酚E1类化合物的制备
1、制备3-((4’-甲氧甲氧基)苯基)-5,7-二甲氧甲氧基-4H-苯丙吡喃-4-酮
将金雀异黄素(2.0g，7.40mmol)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF，20mL)中，在0℃条件下先分批加入60％NaH(0.8g，33.30mmol)，再缓慢滴加氯甲基甲醚(2.68g，33.30mmol)， 反应体系用氩气保护。继续低温反应1h后，升至室温反应，经TLC检测反应完全后，将反应液缓慢倒入冰水(100mL)中淬灭。用二氯甲烷萃取(50mL×3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，再用无水硫酸钠干燥，蒸干，硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝15:1，v/v)，得3-((4’-甲氧甲氧基)苯基)-5,7-二甲氧甲氧基-4H-苯丙吡喃-4-酮2.2g，白色固体，收率87％。
化合物结构确证数据为：1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.48(s，3H)，3.51(s，3H)，3.54(s，3H)，5.19(s，2H)，5.24(s，2H)，5.31(s，2H)，6.74(s，1H)，6.75(s，1H)，7.07(d，J＝8.8Hz，2H)，7.46(d，J＝8.8Hz，2H)，7.78(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ55.9，56.4，56.6，94.3，94.4，95.5，97.0，102.0，111.3，116.0，125.4，125.8，130.4，150.3，157.1，158.6，159.4，161.1，175.2；LRMS(ESI)m/z：403.1[M+H]+。
2、制备3-((4’-甲氧甲氧基)苯基)-5,7-二甲氧甲氧基-8-溴-4H-苯丙吡喃-4-酮
将步骤1中获得的3-((4’-甲氧甲氧基)苯基)-5,7-二甲氧甲氧基-4H-苯丙吡喃-4-酮(2.0g，5.86mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，在搅拌下加入N-溴代丁二酰亚胺(1.15g，6.45mmol)，室温反应2h。经TLC检测反应完全后，将反应液缓慢倒入冰水(100mL)中搅拌，有白色固体析出，抽滤，得3-((4’-甲氧甲氧基)苯基)-5,7-二甲氧甲氧基-8-溴-4H-苯丙吡喃-4-酮2.3g，白色固体，产率为93％。
化合物结构确证数据为：1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.48(s，3H)，3.54(s，3H)，3.55(s，3H)，5.20(s，2H)，5.32(s，2H)，5.35(s，2H)，6.99(s，1H)，7.08(d，J＝8.8Hz，2H)，7.46(d，J＝8.4Hz，2H)，7.90(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ55.9，56.7，56.8，93.5，94.3，95.1，95.9，100.4，112.2，116.1，124.9，125.8，130.4，150.4，155.3，157.3，157.9，158.0，175.0；LRMS(ESI)m/z：481.3[M+H]+。
3、制备3-((4’-甲氧甲氧基)苯基)-5,7-二甲氧甲氧基-8-香叶基-4H-苯丙吡喃-4-酮
将步骤2获得的3-((4’-甲氧甲氧基)苯基)-5,7-二甲氧甲氧基-8-溴-4H-苯丙吡喃-4-酮(240mg，0.50mmol)溶于无水DMF(2mL)中，再分别加入香叶基硼酸脂(198mg，0.75mmol)，无水碳酸铯(227mg，0.70mmol)，催化剂[1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(18.2mg，0.025mmol)，反应体系用氩气保护。90℃条件下反应8h，经TLC检测反应完全后，加入乙酸乙酯(20mL)稀释，再用水(10mL)洗三次。有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，再用无水硫酸钠干燥，蒸干，硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝10:1，v/v)，得3-((4’-甲氧甲氧基)苯基)-5,7-二甲氧甲氧基-8-香叶基-4H-苯丙吡喃-4-酮190mg，黄色油状物，产率71％。
化合物结构确证数据为：1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.56(s，3H)，1.63(s，3H)，1.81(s，3H)，1.97(t，J＝8.0Hz，2H)，2.03-2.08(m，J＝14.8Hz，2H)，3.48(s，3H)，3.50(s，3H)，3.51(s，2H)，3.54(s，3H)，5.05(t，J＝8.8Hz，1H)，5.19(m，3H)，5.28(s，2H)，5.29(s，2H)，6.90(s，1H)，7.07(d，J＝8.4Hz，2H)，7.47(d，J＝8.4Hz，2H)，7.85(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ16.1，17.6，21.9，25.6，26.6，39.7，55.9，56.3，56.6，94.3，96.2，100.5，111.4，112.6112.7，116.0，121.6，124.1，125.2，125.6，130.3，131.3，135.6，150.5，156.4，156.5，157.0，158.3，175.7；LRMS(ESI)m/z：539.1[M+H]+。
4、制备胡枝子酚E1
将步骤3获得的3-((4’-甲氧甲氧基)苯基)-5,7-二甲氧甲氧基-8-香叶基-4H-苯丙吡喃-4-酮(100mg，0.1mmol)溶于甲醇(5mL)和四氢呋喃(1mL)中，在0℃条件下滴加2M盐酸溶液(2mL)，继续低温反应1h后，升温至60℃回流反应。用TLC检测反应完全后，加入乙酸乙酯(20mL)稀释，再用水(10mL)洗三次，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，再用无水硫酸钠干燥，蒸干，硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝10:1，v/v)，得胡枝子酚E161mg，黄色固体，产率81％。
化合物结构确证数据为：1H NMR(400MHz，MeOD)：δ1.52(s，3H)，1.57(s，3H)，1.79(s，3H)，1.97(t，J＝7.2Hz，2H)，2.05(m，J＝7.6Hz，2H)，3.41(d，J＝7.2Hz，2H)，5.01(t，J＝6.8Hz，1H)，5.20(t，J＝6.8Hz，1H)，6.27(s，1H)，6.84(d，J＝8.8Hz，2H)，7.37(d，J＝8.4Hz，2H)，8.12(s，1H)；13C NMR(100MHz，MeOD)：δ14.8，16.2，20.7，24.4，26.1，39.3，98.1，104.8，106.5，114.8，122.0，122.1，122.9，123.9，130.0，130.6，134.5，153.4，155.4，157.3，160.0，161.8，181.2；LRMS(ESI)m/z：407.1[M+H]+。
5、制备三甲基胡枝子酚E1
将步骤4获得的胡枝子酚E1(20mg，0.05mmol)溶于DMF(1mL)中，在搅拌下分别加入碳酸钾(21.8mg，0.15mmol)和碘甲烷(22.4mg，0.15mmol)，反应体系用氩气保护。室温条件下反应1h，经TLC检测反应完全后，将反应液倒入冰水(10mL)中淬灭，用二氯甲烷萃取(5mL×3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，再用无水硫酸钠干燥，蒸干，硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝15:1，v/v)，得三甲基胡枝子酚E120mg，白色固体，收率91％。
化合物结构确证数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.56(s,3H),1.62(s,3H),1.79(s,3H),1.97(t,J＝8.8Hz,2H),2.14(m,2H),3.45(d,J＝7.2Hz,2H),3.82(s,3H),3.94(s,3H),3.96(s,3H),5.05(t,J＝6.8Hz,1H),5.17(t,J＝6.8Hz,1H),6.42(s,1H),6.93(d,J＝8.8Hz,2H),7.49(d,J＝8.8Hz,2H),7.82(s,1H)；13C NMR(100MHz,CDCl3):δ16.1,17.6,21.6,25.6,26.6,19.7,55.3,55.8,56.4,91.9,109.6,109.9,113.6,121.8,124.2,124.5,125.1,130.3,131.3,135.4,150.2,156.5,159.3,159.8,160.8,176.0；HRMS(ESI)m/z:Calcd.for C28H32O5[M+H]+449.2323.Found 449.2323
6、制备7，4’-二甲基胡枝子酚E1
将步骤4获得的胡枝子酚E1(20mg，0.05mmol)溶于DMF(1mL)中，在搅拌下分别加入碳酸钾(13.6mg，0.1mmol)和碘甲烷(13.9mg，0.1mmol)，反应体系用氩气保护。室温条件下反应1h，经TLC检测反应完全后，将反应液倒入冰水(10mL)中淬灭，用二氯甲烷萃取(5mL×3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，再用无水硫酸钠干燥，蒸干，硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝15:1，v/v)，得三甲基胡枝子酚E119mg，白色固体，收率89％。
化合物结构确证数据为：1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.57(s，3H)，1.63(s，3H)，1.79(s，3H)，1.97(t，J＝7.2Hz，2H)，2.06(m，2H)，3.42(d，J＝6.8Hz，2H)，3.84(s，3H)，3.90(s，3H)，5.05(t，J＝7.2Hz，1H)，5.16(t，J＝6.2Hz，1H)，6.42(s，1H)，6.98(d，J＝8.0Hz，2H)，7.47(d，J＝8.0Hz，2H)，7.92(s，1H)，12.94(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ16.0，17.6，21.3，25.6，26.6，39.7，55.3，56.0，95.2，105.7，107.9，114.1，121.8，123.0，123.1，124.2，130.1，131.3，135.5，152.8，154.6，159.7，161.0，162.9，181.3；LRMS(ESI)m/z：435.2[M+H]+。
第二部分：MTT法细胞增殖抑制活性筛选
一、本发明抗肿瘤活性测定所用3肿瘤细胞：人白血病细胞(K562)、人结肠癌细胞(HT-29)和人胃癌细胞(MGC-803)。
1、抗肿瘤活性测定的具体步骤：
溶液的配制：
PRMI1640培养液的配制：购买HyClone PRMI1640培养基，每瓶500mL，加入10％的胎牛血清和1％的青链霉素溶液，即每瓶培养基加入50mL的胎牛血清和5mL的青链霉素，培养基的配置在超净工作台中进行，后放置冰箱4℃保存。
DMEM/F-12培养液的配制：购买HyClone DMEM/F-12培养基，每瓶500mL，加入10％的胎牛血清和1％的青链霉素溶液，即每瓶培养基加入50mL的胎牛血清和5mL的青链霉素，培养基的配置在超净工作台中进行，后放置冰箱4℃保存。
PBS缓冲液的配制：在1000mL锥形瓶中，称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，十二水合磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.2g，加入800mL纯净水充分搅拌溶解后定容至1000mL，高压灭菌后放置冰箱4℃保存。
MTT溶液的配制：称取MTT干粉0.5g，溶于100mL PBS缓冲液中，用0.22μM滤膜过滤除菌后，放置冰箱-12℃保存。
2、利用利用人白血病细胞K562活性测试
K562细胞使用的培养液为含1％的青霉素-链霉素溶液，10％的胎牛血清的PRMI1640细胞培养液，培养条件为37℃、含5％CO2的恒温培养箱。具体步骤：
(1)用血球计数板对细胞进行计数后，用RPMI培养液将其稀释至5x104个/mL；
(2)在96孔板的每个孔里加入100μL细胞悬液，培养箱37℃温育2h；
(3)将所要测试化合物稀释至5种浓度：2mM,0.2mM,20μM,2μM,0.2μM，按照浓度依次加药0.5μL/孔，培养箱37℃温育48h；
(4)加入浓度为5mg/mL的MTT，培养箱37℃温育4小时；
(5)加异丙醇与盐酸裂解液，酶标仪测570nm和630nm下的OD值；
(6)处理数据，根据OD值计算IC50值。
3、利用利用人结肠癌细胞HT-29活性测试
HT-29细胞使用的培养液为含1％的青霉素-链霉素溶液，10％的胎牛血清的DMEM/F-12细胞培养液，培养条件为37℃、含5％CO2的恒温培养箱。具体步骤：
(1)用血球计数板对细胞进行计数后，用用DMEM/F-12培养液将其稀释至5x104个/mL；
(2)在96孔板的每个孔里加入100μL细胞悬液吹打混匀，培养箱37℃温育24h；
(3)将所要测试化合物稀释至5种浓度：2mM,0.2mM,20μM,2μM,0.2μM，按照浓度依次加药0.5μL/孔，培养箱37℃温育48h；
(4)加入浓度为5mg/mL的MTT，培养箱37℃温育4h；
(5)加DMSO将细胞溶解，酶标仪测490nm和630nm下的OD值；
(6)处理数据，根据OD值计算IC50值。
4、利用人胃癌细胞MGC-803活性测试
MGC-803细胞使用的培养液为含1％的青霉素-链霉素溶液，10％的胎牛血清的DMEM细胞培养液，培养条件为37℃、含5％CO2的恒温培养箱。具体步骤：
(1)用血球计数板对细胞进行计数后，用用DMEM low glucose培养液将其稀释至5x104个/mL；
(2)在96孔板的每个孔里加入100μL细胞悬液吹打混匀，培养箱37℃温育24h；
(3)将所要测试化合物稀释至5种浓度：2mM,0.2mM,20μM,2μM,0.2μM，按照浓度依次加药0.5μL/孔，培养箱37℃温育48h；
(4)加入浓度为5mg/mL的MTT，培养箱37℃温育4h；
(5)加DMSO将细胞溶解，酶标仪测490nm和630nm下的OD值；
(6)处理数据，根据OD值计算IC50值。
抗肿瘤活性测定实验结果见表1。
表1合成的胡枝子酚E1类化合物的体外细胞增殖抑制活性
注：IC50表示半数抑制浓度。
从表1可以看出合成的胡枝子酚E1类化合物的体外细胞增殖抑制活性比金雀异黄素有很大提高。胡枝子酚E1对人白血病细胞(K562)、人结肠癌细胞(HT-29)和人胃癌细胞(MGC-803)均有很好的生长抑制活性。
二、采用微孔板筛选模型，以对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖为底物，测试化合物不同浓度梯度下的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，并计算IC50值。实验分为空白组、不加抑制剂的对照 组和待测样品组。临床使用的α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖作为阳性对照药物。抑制剂和阿卡波糖溶于DMSO，DMSO在酶测试体系中含量为5％；缓冲液为磷酸盐缓冲液(pH＝6.8，0.05M)，对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖溶于磷酸盐缓冲液。
(1)空白组：加缓冲液和不同浓度的抑制剂，总体积200μL。
(2)对照组：加缓冲液(180μL)和α-葡萄糖苷酶(0.04U，20μL)，不加抑制剂。
(3)阳性对照组：加入缓冲液(150μL)、α-葡萄糖苷酶(0.04U，20μL)，抑制剂阿卡波糖的DMSO溶液和底物对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖(0.5M，30μL)的水溶液。
(4)待测样品组：加入缓冲液(140μL)、α-葡萄糖苷酶(0.04U，20μL)，待测样品的DMSO溶液(10μL)和底物对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖(0.5M，30μL)，。
在96孔板中，依次加入上述的各种试剂，于37℃温敷5min，再加入底物对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖，温敷30min，在酶标仪405nm波长处测定吸光度，根据下列公式计算该抑制剂对α-葡萄糖苷酶的抑制率，当抑制率为50％时，所得抑制剂的浓度，即为该抑制剂对底物的IC50值。实验结果见表2。
表2合成的胡枝子酚E1类化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性测试结果
注：IC50表示半数抑制浓度。
从表2可以看出只有胡枝子酚E1具有很好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。甲基化的胡枝子酚E1类化合物没有α-葡萄糖苷酶抑制活性，说明羟基是活性必须基团。
三、降糖活性动物实验测试
1材料与仪器
实验小鼠
102只清洁级雄性小鼠，体重20-24g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，每笼5只，隔日换一次垫料以保持笼内干净。实验室保持安静通风，室温22-24℃，湿度20-50％，光暗周期(12h/12h)。随意取72只小鼠给予高脂饲料(粗蛋白≥20％，粗脂肪≥4.0％，粗纤维≥5.0％，水分≤10.0％，灰分≤8.0％，钙1.0-1.8％，磷0.6-1.2％)，其他空白组和急性毒性实验组给予普通食料，所用饲料为中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，饮用水为自来水。
试剂及仪器
安准型血糖仪及检测试纸条、SF-400C型天平、METTLERE ROLEDO实验室pH计、FA1204B电子天平、链脲佐菌素(STZ)、生理盐水0.9％、0.1mol/L柠檬酸缓冲液pH4.4。
2方法
(1)模型建立
取72只成年健康雄性ICR小鼠(20-24g)，对给予高脂食料喂养第21天晚禁食过夜，第22天上午采尾血测定血糖，血糖值无>11.1mmol/L。随意取25只小鼠给予一次性腹腔注射STZ 100mg/kg，另取取20只小鼠腹腔注射STZ 80mg/kg，隔48h后再次给予腹腔注射STZ60mg/kg。剩余小鼠高脂食料继续喂养一周后，禁食6h给予一次性腹腔注STZ 100mg/kg。在七天后取尾血测血糖，以血糖>11.1mmol/L为糖尿病。
溶液的的配制
①柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液：准确称取柠檬酸2.10g，用无菌去离子水配制成0.1mol/L的柠檬酸溶液100mL；准确称取柠檬酸钠2.94g，用无菌去离子水配制成0.1mol/L柠檬酸钠溶100mL，分别量取57.0mL柠檬酸溶液和43.0mL柠檬酸钠溶液，混匀，用pH计配成pH4.4的柠檬酸一柠檬酸纳缓冲液，现配现用。
②链脉佐菌素(STZ)溶液：将STZ粉末(-20℃保存)溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，配制100mg/mL的STZ溶液，现配现用，冰浴、避光保存。
③化合物20悬浮液：分别准确称取制备的0.040g加入生理盐水至4.0mL溶解(给予小鼠100mg/kg剂量)。
④麦芽糖溶液：准确称取麦芽糖2.4g，加入生理盐水至8.0mL溶解。
⑤阿卡波糖溶液：准确称取阿卡波糖(拜糖平)22mg，加入生理盐水至4.0mL溶解。
糖耐量的测定
末次给药前禁食不禁水6h，测量血糖值，给药1h后按2g/kg的剂量灌服麦芽糖溶液，之后分别于10min、30min、60min、90min、120min尾尖采血，用血糖仪测定血糖。
血糖值见图4，胡枝子酚E1能够明显降低餐后血糖，并且血糖峰值由10min延迟至30min，降糖方式与阳性对照药阿卡波糖具有一定相似性，但降糖活性胡枝子酚E1比阿卡波糖强。

Claims (2)

1.一种胡枝子酚E1类化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于：胡枝子酚E1类化合物具有以下结构通式：
其中R1、R2、R3选甲基，所述肿瘤为人白血病、人结肠癌、人胃癌。
2.一种胡枝子酚E1类化合物的制备方法，其特征在于：合成路线如下：
其中R1、R2、R3选甲基。
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