CN104450611B - 一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，包括以下步骤：提供人类羊膜组织、用PBS缓冲液冲洗然后剪碎、加入质量浓度为0.1～0.3％的胰蛋白酶进行消化、加入I型胶原酶及高糖DMEM基本培养基至I型胶原酶终浓度为0.1～0.2％消化、离心分离，取沉淀物、沉淀物用PBS溶液重悬，过滤后离心分离，弃去上清液，获得人羊膜间充质干细胞。与现有技术相比，本发明利用少量胰蛋白酶预处理羊膜组织，使羊膜组织疏松，进而利用组织特异性更好的I型胶原酶处理羊膜，大大缩短了消化的时间，简化了原代分离的步骤，而且能够获得较高的干细胞产量，获得的干细胞活力也相比现有技术大大提高。

Description

一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是中胚层来源的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多功能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为神经细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等。MSCs是多能干细胞，具有“横向分化”或“跨系分化”的能力，不仅支持造血干细胞的生长，还可以在不同诱导条件下，在体外分化为多种组织细胞。MSCs具有广阔的临床应用前景，是细胞替代治疗和组织工程的首选种子细胞。

骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)是较早被认识的一种间充质干细胞，但由于抽取骨髓会给患者带来极大的痛苦，而且随着年龄的增长，细胞数量显著下降，分化能力逐渐降低，从而较难进行推广使用。目前已从脂肪、脾脏、脐血、脐带、胎肝及胎肾等组织器官中分离出间充质干细胞，但均存在一定的局限性，如取材困难、受年龄限制、涉及伦理问题、组织中间充质干细胞含量少等。所以寻求一种来源丰富，干细胞含量高，取材方便，无创性并且不受伦理学限制的MSCs来源已然成为如今的研究热点。

最近有研究发现，AMSCs具有与BMSCs相似的表型，且具有自我更新和多向分化潜能，且增殖能力比BMSCs更强。AMSCs低表达HLA-ABC，而不表达HLA-DR，从而说明AMSCs具有低免疫原性，用于同种异体、异种异体移植后，均不会发生免疫排斥反应，而且AMSCs无致瘤性，这为各种疾病的细胞替代治疗提供了新的选择。

人羊膜来源于人胎盘组织，无血管、神经及淋巴，具有一定的弹性，厚0.02～0.5mm。在电镜下，其分为5层：上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层。羊膜属于孕妇生产后的废弃物，一个胎盘的羊膜面积大约有600cm²，而且羊膜易于从胎盘剥离，所以因羊膜具有取材方便，原料充足的特点而被认为是目前间充质干细胞的最佳来源。目前，hAMSCs原代分离培养方法可分为组织块培养法和酶消化培养法两种，组织块培养法由于不是每个组织块都能成功培养出细胞，且容易混入其他杂细胞，同时培养周期较长，不利于快速大量获取细胞，难以满足干细胞研究的需求。酶消化培养法是目前羊膜干细胞分离方法的主流，不过鉴于羊膜组织结构致密，消化酶的类型选择会对干细胞分离后的活性有着至关重要的影响。现有技术利用II型胶原酶分离的技术有着耗时长，细胞得量低以及活性下降等弱点。

发明内容

发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，该方法利用少量胰蛋白酶预处理羊膜组织，使羊膜组织疏松，进而利用组织特异性更好的I型胶原酶处理羊膜，大大缩短了消化的时间，简化了原代分离的步骤，而且能够获得较高的干细胞产量，获得的干细胞活力也相比现有技术大大提高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)提供人类羊膜组织；

(2)用PBS缓冲液冲洗，然后将羊膜组织剪碎；

(3)加入质量浓度为0.1～0.3％的胰蛋白酶进行消化；

(4)消化后的羊膜组织用PBS缓冲液冲洗，然后将羊膜组织剪碎；

(5)加入I型胶原酶及高糖DMEM基础培养基，至I型胶原酶终浓度为0.1～0.2％消化至羊膜组织块融化；

(6)用PBS缓冲液稀释消化后的组织液，离心分离，取沉淀物；

(7)沉淀物用PBS溶液重悬，过滤后离心分离，弃去上清液，获得人羊膜间充质干细胞；

(8)使用无血清培养基重悬人羊膜间充质干细胞，调整细胞密度为(3～10)×10⁵/mL置于添加了EGF的培养皿中，移入CO₂培养箱中培养48h后换液，去除杂质，每隔2～3d换一次培养基。

优选地，步骤(2)将羊膜组织剪碎至6×6cm²分装于50mL离心管中，步骤(3)胰酶添加量为45mL，并在恒温摇床中消化，消化时间为30min，消化温度为37℃,转速为150～300r/min。

优选地，步骤(4)将羊膜组织剪碎至1mm²后转移至125mL储液瓶中，加入20mL质量浓度为0.5％的I型胶原酶及高糖DMEM基础培养基，至I型胶原酶终浓度为0.1～0.2％进行消化，消化在恒温摇床中进行，消化温度为37℃,转速为250～300r/min,消化至组织块融化。

优选地，所述无血清培养基为UltraCULTURE MEDIUM培养基。

优选地，步骤(6)离心速度为1500～2000r/min，离心时间为5min。

优选地，步骤(7)经100μm,离心速度为1500～2000r/min，离心时间为5min。

优选地，步骤(8)采用规格为10cm的培养皿，EGF添加量为100μL,浓度为1μg/mL。

优选地，待原代人羊膜间充质干细胞生长至80％融合时，即用0.25％的EDTA-Trypsin消化，进行传代培养。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本专利利用少量胰蛋白酶预处理羊膜组织，使羊膜组织疏松，进而利用组织特异性更好的I型胶原酶处理羊膜，从而缩短了消化的时间，提高了产量与细胞活力。

1、本发明探索出最适合人羊膜组织特点的酶解种类、酶解的顺序、酶解的条件，通过本发明的技术方案能够将人羊膜组织彻底酶解，将人羊膜间充质干细胞释放出来，获得数量较多、纯度较高的干细胞，同时不会破坏干细胞的结构，不影响干细胞的活性，保证获得的干细胞具有较高的活力，可以大量培养，满足研究需求。

2、在本发明中，前期采用少量的胰蛋白酶进行消化，在规定的酶的用量及消化条件下，可以使羊膜组织处于刚好疏松，此时羊膜表层的上皮细胞也刚好被去除，最适合利用对人羊膜组织特异性更好的I型胶原酶去酶解消化，消化过程对细胞损伤小，细胞活率高，消化后得到的干细胞量大且纯度高，在之后的传代培养过程中能够保持良好的细胞活性及增殖能力。

3、本发明获得人羊膜间充质干细胞的周期短，产量及活性高，分离出来的羊膜间充质干细胞接种后三天可生长融合至80％-90％，有利于快速大量获取干细胞，适合大规模化生产应用

4、本发明使用无血清培养基(UltraCULTURE MEDIUM)进行细胞培养，可以避免含血清培养基重血清对细胞的具有潜在毒性作用和血清源性污染。

附图说明

图1为本发明的人羊膜间充质干细胞原代细胞的表面标准物的表达情况图；

图2为本发明的人羊膜间充质干细胞P2代细胞的增殖曲线图；

图3为本发明的人羊膜间充质干细胞P2代细胞成脂诱导后细胞形态变化图；

其中，A为阴性对照，未诱导的羊膜间充质干细胞形态图；B为成脂诱导后10天，无油红O染色的细胞形态图；C为成脂诱导10天后，油红O染色的细胞形态图；D为成脂诱导10天后，油红O染色的细胞形态图。

图4为本发明的人羊膜间充质干细胞P2代细胞成骨诱导后细胞形态变化图；

其中，A:阴性对照，即未诱导成骨分化的细胞形态；B:成骨诱导28天后，未染色的细胞形态；C:成骨诱导28天后，用茜素红染色的细胞形态。

图5为本发明的人羊膜间充质干细胞与现有技术获得的人羊膜间充质干细胞的细胞形态对比图；

其中，A1：本发明原代细胞第2天40倍显微镜下的细胞形态图，

A2：本发明原代细胞第2天100倍显微镜下的细胞形态图，

A3：本发明原代细胞第4天40倍显微镜下的细胞形态图，

A4：本发明原代细胞第4天100倍显微镜下的细胞形态图，

A5：本发明P2代细胞第3天40倍显微镜下的细胞形态图，

A6:本发明P2代细胞第3天100倍显微镜下的细胞形态图，

B1:现有技术原代细胞第2天40倍显微镜下的细胞形态图，

B2：现有技术原代细胞第2天100倍显微镜下的细胞形态图，

B3：现有技术原代细胞第4天40倍显微镜下的细胞形态图，

B4：现有技术原代细胞第4天100倍显微镜下的细胞形态图，

B5：现有技术P2代细胞第3天40倍显微镜下的细胞形态图，

B6:现有技术P2代细胞第3天100倍显微镜下的细胞形态图。

具体实施方式

下面通过具体实施例子对本发明做进一步详细介绍，以便清楚理解本发明所要保护的技术方案。

实施例一

一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，具体包括以下步骤：

1、人羊膜间充质干细胞原代分离

在无菌条件下，取产后弃置的新鲜胎盘于无菌托盘中，采用手术器械将羊膜从胎盘组织上剥离，用PBS缓冲溶液冲洗数次以清除残留血迹。在15cm玻璃平皿中将羊膜组织剪成6×6cm2，分装至50mL离心管中(每管含有羊膜组织10～15cm)，加0.1-0.3％胰酶至45mL。将离心管转移至恒温摇床中，37℃，150-300r/min，消化30min，且每隔10min剧烈摇晃数次，以去除上皮细胞。将胰酶消化后的羊膜组织转移至250mL储液瓶中，加入150mLPBS缓冲溶液，剧烈摇动，重复此操作2次。将羊膜组织转移至100mL小烧杯中，剪碎至1mm3。后转移至125ml储液瓶中，加入20mL0.5％I型胶原酶以及高糖DMEM基础培养基，至胶原酶终浓度为0.075-0.2％。在恒温摇床中，37℃，250r/min，消化至组织块基本融化。用PBS缓冲溶液稀释消化后的组织液，并1500r/min，离心5min，收集沉淀。沉淀用PBS缓冲溶液重悬后，采用100μm过滤筛网过滤，滤液1500r/min，离心5min，获得羊膜间充质干细胞。用无血清培养基重悬细胞，台盼兰染色后用countstar细胞计数仪计数，调整细胞密度为3-10×105/mL进行接种接种于10cm培养皿中，每皿添加100μL 1μg/mL EGF。将细胞移至CO2培养箱中，培养48h后进行换液，去除未贴壁的血细胞和其他杂质。之后每2～3d换一次培养基。

2、人羊膜间充质干细胞传代培养

待原代人羊膜间充质干细胞生长至80％融合时，即用0.25％的EDTA-Trypsin消化，进行传代培养。

实例二

分离羊膜干细胞的流式鉴定

待原代人羊膜间充质干细胞生长至80％～90％时，胰酶消化后收集细胞，取两个1.5mlEP管,每管1x10⁶个细胞，用染色缓冲液(10％FBS+90％PBS)洗两遍，每管加入200μl染色缓冲液，样品加入下列四个抗体CD45、CD59、HLADR、CD90各5μl，阴性对照不加抗体，4℃孵育20min,用染色缓冲液洗两遍，后用500μl 1640培养基重悬，用流式细胞仪采集30000个样本，检测其表面标志物CD45、CD59、CD90、HLA-DR等的表达情况。结果见附图1。

从附图1的结果可以看出，样本表达CD59、CD90；低表达HLA-DR、CD45，符合间充质干细胞特性，也可以看出本方法原代即可获得纯度较高的间充质干细胞。

实例三

分离干细胞的增殖曲线

胰酶消化收集P2代的hAMSCs，接种细胞于96孔板中，2000个/孔。在37℃，5％CO₂培养箱中连续培养7d。分别在1d,3d,5d,7d,对细胞进行检测。在待检测孔中加入10ul染色剂，37℃，5％CO₂培养2h。用酶标仪测450nm处的吸光值，每个样本做6个重复，结果见表1。

表1

	1	2	3	4	5	6	平均值	方差
									1d	0.23	0.22	0.2	0.24	0.22	0.21	0.22	0.014142
3d	0.36	0.38	0.38	0.37	0.39	0.36	0.373333	0.012111
									5d	0.72	0.69	0.71	0.68	0.69	0.7	0.698333	0.01472
7d	0.82	0.84	0.91	0.88	0.87	0.9	0.87	0.034641

以OD值为纵坐标，时间为横坐标，画制增殖曲线，如附图2所示。

由表1和附图2可看出，本发明分离培养所得的干细胞具有较强的增殖能力。

实例四

分离干细胞的成脂分化能力

收集P2代的人羊膜间充质干细胞，分别以10⁵个/mL的细胞密度接种于6孔板中，培养至60～70％融合时，换用成脂诱导培养液培养，每2天更换新鲜的诱导培养基，2周之后采用油红O染色检测成脂分化结果。结果见附图3。附图3为hAMSCs成脂诱导后细胞形态变化(×200)。

hAMSCs在体外向脂肪细胞诱导过程中，细胞由原来的成纤维状，缩短成为短梭形，诱导10d可见大多数细胞呈圆形或多边形，并且在高倍镜下可见细胞周围有不同数量的明亮的油滴空泡(图3-B)。诱导10d，油红染色可见有红色的脂滴(图3-C),15d后可见大多数细胞充满红色的油滴空泡(图3-D)。未诱导的细胞形态不变(图3-A)。

实例五

分离干细胞的成骨分化能力

收集P2代的人羊膜间充质干细胞，分别以10⁵个/mL的细胞密度接种于6孔板中，培养至60～70％融合时，换用成骨诱导培养液，每2天更换新鲜的诱导培养基，3周之后采用茜素红染色检测成骨分化结果。结果见附图4。

由附图4可以看出，hAMSCs在体外成骨诱导分化过程中，在诱导后第7d开始由长梭形变为多角形,继而复层生长，2周左右形成散在的细胞结节，以后出现钙盐沉着,结节中央逐渐变浓,直至不透光，21d时可见明显的矿化结节，28d时矿化结节增多且互相融合(图4-B)，用茜素红染色可将其形成的钙结节染成红色(图4-C)。而对照组细胞形态不变仍为长梭形(图4-A)。

实施例六

人羊膜间充质干细胞分离对比试验

在无菌条件下，取健康(HCV、HBV、HIV、梅毒均为阴性)产妇(经产妇同意)的胎盘于无菌托盘中，采用手术器械将羊膜从胎盘组织上剥离，用PBS缓冲溶液冲洗数次以清除残留血迹。在15cm玻璃平皿中将羊膜组织剪成6×6cm²，分成两份，分别用于组一和组二的试验。

组一：将剪碎后的羊膜组织分装至两个50mL离心管中(每管含有羊膜组织10～15cm)，加0.1-0.3％胰酶至45mL。将离心管转移至恒温摇床中，37℃，150-300r/min，消化30min，且每隔10min剧烈摇晃数次，以去除上皮细胞。将胰酶消化后的羊膜组织转移至250mL储液瓶中，加入150mLPBS缓冲溶液，剧烈摇动，重复此操作2次。将羊膜组织转移至100mL小烧杯中，剪碎至1mm³，后均分为三份。每份加入0.5％I型胶原酶以及高糖DMEM基础培养基，至I型胶原酶终浓度为0.1-0.2％；在恒温摇床中，37℃，250r/min，消化至组织块基本融化。用PBS缓冲溶液稀释消化后的组织液，并1500r/min，离心5min，收集沉淀。沉淀用PBS缓冲溶液重悬后，采用100μm过滤筛网过滤，滤液1500r/min，离心5min，获得羊膜间充质干细胞。用无血清培养基重悬细胞，台盼兰染色后用countstar细胞计数仪计数，调整细胞密度为3-10×10⁵/mL进行接种接种于10cm培养皿中，每皿添加100μL 1μg/mL EGF。将细胞移至CO₂培养箱中，培养48h后进行换液，去除未贴壁的血细胞和其他杂质。之后每2～3d换一次培养基。

组二：将剪碎后的羊膜组织用2.5g/L胰蛋白酶37℃，150-300r/min，消化10min；加入含5％小牛血清的DMEM终止消化，过200目细胞筛后加入1.0g/L II型胶原酶消化，37℃，消化30min；加入含5％小牛血清的DMEM终止消化,过200目细胞筛后，收集细胞；1000r/min，离心5min，获得人羊膜间充质干细胞。台盼兰染色后用countstar细胞计数仪计数，调整细胞密度为1×10⁶/mL进行接种接种于10cm培养皿中，每皿添加100μL 1μg/mL EGF。将细胞移至CO2培养箱中，培养48h后进行换液，去除未贴壁的血细胞和其他杂质。之后每2～3d换一次培养基。待原代人羊膜间充质干细胞生长至80％融合时，即用0.25％的EDTA-Trypsin消化，进行传代培养。

1、细胞形态观察

细胞接种后，连续在显微镜下对细胞进行观察，并拍照，记录细胞的生长情况以及细胞形态，结果见表2及附图5。

表2原代分离

附图5记录了组一和组二原代培养两天后在40倍、100倍显微镜下细胞形态，原代培养四天后在40倍、100倍显微镜下细胞形态，以及传代P2代培养三天后在40倍、100倍显微镜下细胞形态。

从表2及附图5可以看出，从处理时间，细胞活力，细胞数量及原代传代后的细胞状态等方面均可以看出，本发明的技术方案的技术效果远远优于现有技术方案的技术效果。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (4)

1.一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)提供人类羊膜组织；

(2)用PBS缓冲液冲洗，然后将羊膜组织剪碎；

(3)加入质量浓度为0.1～0.3％的胰蛋白酶进行消化；

(4)消化后的羊膜组织用PBS缓冲液冲洗，然后将羊膜组织剪碎；

(5)将羊膜组织剪碎至1mm²后转移至125mL储液瓶中，加入20mL质量浓度为0.5％的I型胶原酶及高糖DMEM基础培养基，至I型胶原酶终浓度为0.075～0.2％进行消化，消化在恒温摇床中进行，消化温度为37℃,转速为250～300r/min,消化至组织块融化；

(6)用PBS缓冲液稀释消化后的组织液，离心分离，取沉淀物；

(7)沉淀物用PBS溶液重悬，过滤后离心分离，弃去上清液，获得人羊膜间充质干细胞；

(8)使用无血清培养基重悬人羊膜间充质干细胞，调整细胞密度为(3～10)×10⁵/mL置于添加了EGF的培养皿中，移入CO₂培养箱中培养48h后换液，去除杂质，每隔2～3d换一次培养基；

其中，所述无血清培养基为UltraCULTURE MEDIUM培养基；步骤(2)将羊膜组织剪碎至6×6cm²分装于50mL离心管中，步骤(3)胰酶添加量为45mL，并在恒温摇床中消化，消化时间为30min，消化温度为37℃，转速为150～300r/min；步骤(8)采用规格为10cm的培养皿，EGF添加量为100μL，浓度为1μg/mL。

2.如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，其特征在于：步骤(6)离心速度为1500～2000r/min，离心时间为5min。

3.如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，其特征在于：步骤(7)经100μm过滤筛网过滤，离心速度为1500～2000r/min，离心时间为5min。

4.如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，其特征在于：待原代人羊膜间充质干细胞生长至80％融合时，用0.25％的EDTA-Trypsin消化，进行传代培养。