CN103596984B

CN103596984B - 抗-人epo受体的抗体及使用方法

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Publication number: CN103596984B
Application number: CN201280029140.0A
Authority: CN
Inventors: 米夏埃多·雅尔施; 奥拉夫·蒙迪戈尔
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2011-06-15
Filing date: 2012-06-14
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2032-06-14
Also published as: KR20140013076A; MX343117B; WO2012171996A1; CN103596984A; IL229764A0; RU2013158627A; AR086924A1; US8623666B2; US9187563B2; US20120321633A1; JP5984919B2; AU2012269075A1; BR112013032235A2; HK1193615A1; US20140193418A1; NZ617936A; MY166974A; EP2721067A1; MX2013013937A; JP2014528693A

Abstract

本文报道了一种抗体，所述抗体特异性结合人EPO受体，其中所述抗体结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQ？ID？NO：01)，但是所述抗体不特异性结合分子量为约66kD的可获自人内皮细胞的蛋白质。

Description

抗-人EPO受体的抗体及使用方法

发明领域

本发明涉及抗-人EPO受体的抗体及其使用方法。

背景

人红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是166个氨基酸的糖蛋白，其参与红系祖细胞的增殖和分化。这些细胞反应由人EPO受体(EPOreceptor，EPOR)介导，人EPO受体是508个氨基酸的糖蛋白。EPO受体是长度为508个氨基酸的蛋白质(SwissProtP19235)，其包含单个跨膜结构域并且已被归类为I类细胞因子受体生长激素亚家族的成员。EPO受体描述于例如，Winkelmann，J.C.等，Blood(血液)76(1990)24-30，和Jones，S.S.等，Blood(血液)76(1990)31—35)。

从例如以下文献中针对EPO受体的抗体是已知的：D’Andrea，A.D.，Blood(血液)82(1993)46-52；Elliott，S.，Blood107(2006)1892—1895；Kirkeby，A.，J.Neurosci.Methods164(2007)50-58；Miura，O.，Arch.Biochem.306(1993)200-208；Mayeux，P.等，J.Biol.Chem.266(1991)23380-23385；Westphal.G.等，Clin.Exp.Med.2(2002)45—52；Elliott，S.等，J.Immunol.Meth.352(2010)126—139，以及EP1146056、EP1327681、EP0773962、EP0776370、US2002／0031806、US2003／0215444、US2004／0058393、US2004／0071694、US2004／0175379、US2005／0227289、US2005／0244409、US2006／0018902、US6,153,190、US6,998,124、US7,053,184、US7,081,523、WO1995／005469、WO1996／003438、WO2000／061637、WO2004／035603、WO2005／100403和WO2010／022924。然而，由于已知抗体对EPO受体缺少特异性，调查EPO受体在组织样品中表达和定位的研究产生有分歧的和通常人为的结果(见，Jelkmann，W.等，Crit.Rev.Onc.Hematol.67(2008)39-61；Elliott，S.等，Blood107(2006)1892—1895；Jelkmann，W.和Laugsch，M.，J.Clin.Oncol.25(2007)1627—1628；Kirkeby，A.等，J.Neurosci.Methods164(2007)50—58；Laugsch，M.等，Int.J.Cancer122(2008)1005—1011)，或据报道，研究采用具有可疑特异性的抗体，并且观察的意义是有争议的(Elliott，S.，见上文)。

概述

已经发现，本文所述的抗体特异性结合人EPO受体，并且不与存在于内皮细胞上／内的类似大小的蛋白质交叉反应，从而允许产生明确的检测结果。

如本文中所报道的一个方面是体外检测人EPO受体的方法，所述方法包括以下步骤：通过将样品与特异性结合人EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQIDNO：01)的EPO受体的抗体温育，体外确定所述样品中人EPO受体的存在，由此体外检测人EPO受体，其中所述特异性结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQIDNO：01)的EPO受体的抗体不特异性结合具有约58kD至约70kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。

在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体不特异性结合具有约66kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。

在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体以10^-3M或更高的亲和力结合所述可获自人内皮细胞的蛋白质。

在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。

在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体是结合人EPO受体的抗体片段。

如本文中所报道的一个方面是特异性结合人EPO受体的抗体，其特征在于所述抗体结合人EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQIDNO：01)并且不特异性结合具有约58kD至约70kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。

在一个实施方案中，所述抗体的特征在于其不特异性结合具有约66kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。

在一个实施方案中，所述抗体的特征在于其以10^-3M或更高的亲和力结合所述可获自人内皮细胞的蛋白质。

在一个实施方案中，所述抗体的特征在于其是多克隆抗体或单克隆抗体。

在一个实施方案中，所述抗体的特征在于其是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

在一个实施方案中，所述抗体的特征在于其是结合人EPO受体的抗体片段。

如本文中所报道的一个方面是特异性结合人EPO受体并且可以用于如本文中所报道的方法的抗体。

如本文中所报道的一个方面是特异性结合人EPO受体的抗体，其用于如本文中所报道的方法。

在一个实施方案中，所述抗体的特征在于所述抗体结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQIDNO：01)并且不特异性结合具有约58kD至约70kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。

如本文中所报道的一个方面是特异性结合人EPO受体的抗体在检测人EPO受体中的用途，其特征在于所述抗体结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQIDNO：01)并且不特异性结合具有约58kD至约70kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。

在一个实施方案中，所述用途的特征在于所述抗体不特异性结合具有约66kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。

在一个实施方案中，所述用途的特征在于所述抗体以10^-3M或更高的亲和力结合所述可获自人内皮细胞的蛋白质。

在一个实施方案中，所述用途的特征在于所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。

在一个实施方案中，所述用途的特征在于所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

在一个实施方案中，所述用途的特征在于所述抗体是结合人EPO受体的抗体片段。

如本文中所报道的一个方面是用于预测或确定患者对用于增加红细胞数目的药物的反应性的方法，所述方法包括

-通过将患者的样品与如本文中所报道的EPO受体的抗体体外温育并且体外确定所述抗体与所述样品的结合来体外确定人EPO受体在所述患者的癌细胞上的存在，

由此，人EPO受体在患者癌细胞上的存在指示患者对用于增加红细胞数目的药物的反应性。

在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体不特异性结合具有约58kD至约70kD分子量(在一个实施方案中，约66kD)的、可获自人内皮细胞的蛋白质。

本文中报道了这样的抗体，其特异性结合具有氨基酸序列LPGPGGSVDIV(SEQIDNO：01)的人EPO受体片段并且不结合人内皮细胞。已经发现，这样的抗体可以通过以下方式获得：用具有氨基酸序列LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV(SEQIDNO：02)的EPO受体片段免疫实验动物，并且之后将获自实验动物的抗体交叉吸附(即，选择)到具有氨基酸序列LPGPGGSVDIV(SEQIDNO：01)的EPO受体片段。

如本文中所报道的一个方面是用于制备特异性结合人EPO受体的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

-用包含EPO受体片段LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV(SEQIDNO：02)的多肽免疫动物，和

-选择结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQIDNO：01)的抗体并且由此制备特异性结合人EPO受体的抗体。

在一个实施方案中，所述选择是通过将获自所述免疫的动物的抗体交叉吸附到固定的SEQIDNO：01的EPO受体片段。

如本文中所报道的一个方面是特异性结合人EPO受体的抗体，其中所述抗体结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQIDNO：01)。

在一个实施方案中，所述抗体对所述人EPO受体的亲和力为10^-7M以下。在一个实施方案中，所述抗体对所述人EPO受体的亲和力为10^-8M以下。在一个实施方案中，所述抗体对所述人EPO受体的亲和力为5x10^-9M以下。在一个实施方案中，所述抗体对所述人EPO受体的亲和力为2x10^-9M以下。在一个实施方案中，所述抗体对所述人EPO受体的亲和力为约1.8x10^-9M。在一个实施方案中，所述抗体对所述人EPO受体的亲和力为至少5x10^-10M。在一个实施方案中，所述抗体对所述人EPO受体的亲和力为至少约6.3x10^-10M。

在所有方面的一个实施方案中，所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。

在所有方面的一个实施方案中，所述抗体是小鼠抗体，或大鼠抗体，或兔抗体，或仓鼠抗体，或绵羊抗体，或山羊抗体，或鸡抗体，或猴抗体，或猪抗体，或人抗体，或人源化抗体。在一个实施方案中，所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

在一个实施方案中，所述抗体是特异性结合人EPO受体的抗体片段。

如本文中所报道的一个方面是分离的核酸，其编码如本文中所报道的抗体。

如本文中所报道的一个方面是宿主细胞，其包含编码如本文中所报道的抗体的核酸。

如本文中所报道的一个方面是制备如本文中所报道的抗体的方法，所述方法包括培养如本文中所报道的宿主细胞从而制备所述抗体。

在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：从所述宿主细胞或培养基回收抗体。

在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞或真核细胞。在一个实施方案中，所述细胞是CHO细胞，或HEK细胞，或BHK细胞，或Sp2／0细胞，或NS0细胞。

在一个实施方案中，细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞或芽孢杆菌(Bacillus)细胞。

-选择结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQIDNO：1)的抗体，和

由此生产特异性结合人EPO受体的抗体。

在一个实施方案中，所述方法包括以下额外步骤中的一个或多个：

-培养包含编码已被选择的抗体的核酸的细胞，和／或

-从细胞或培养基回收抗体。

如本文中所报道的一个方面是包含如本文中所报道的抗体和可检测的标记或细胞毒性剂的免疫缀合物。

如本文中所报道的一个方面是包含如本文中所报道的抗体和任选地药用载体的药物制剂。

如本文中所报道的一个方面是包含与可检测的标记缀合的如本文中所报道的抗体的诊断制剂。

如本文中所报道的一个方面是如本文中所报道的抗体，其用作药物。

如本文中所报道的一个方面是如本文中所报道的抗体，其用于治疗贫血。

如本文中所报道的一个方面是如本文中所报道的抗体，其用于改变患者中的红细胞数目。

如本文中所报道的一个方面是如本文中所报道的抗体在制备药物中的用途。

在一个实施方案中，所述药物用于治疗贫血。

在一个实施方案中，所述药物用于改变患者中的红细胞数目。

如本文中所报道的一个方面是治疗患有贫血的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如本文中所报道的抗体用以改变／增加个体中的红细胞数目。

如本文中所报道的一个方面是改变个体中的红细胞数目的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如本文中所报道的抗体以改变个体中的红细胞数目。

如本文中所报道的一个方面是诊断试剂盒，其包含如本文中所报道的抗体。

如本文中所报道的一个方面是用于制备包含如本文中所报道的抗体的诊断试剂盒的方法。

如本文中所报道的一个方面是如本文中所报道的抗体在确定或分析人组织样品中的人EPO受体中的用途。

在所有方面的一个实施方案中，样品是人组织或人细胞的溶解产物。

在所有方面的一个实施方案中，所述样品是组织的切片，或新鲜组织的切片，或冷冻的组织，或冷冻的组织的切片，或福尔马林固定的石蜡包埋的组织，或福尔马林固定的石蜡包埋的组织的切片。

在所有方面的一个实施方案中，所述分析通过免疫化学，免疫荧光法，或免疫组织化学进行。在一个实施方案中，所述分析通过蛋白质印迹或FACS或使用NIRF或PET的体内成像进行。

在所有方面的一个实施方案中，所述确定是通过将组织样品与如本文中所报道的抗体温育并检测所述抗体与所述组织样品的结合。

-体外确定人EPO受体在患者癌细胞上的存在，和

-将人EPO受体在患者癌细胞上的存在与患者对用于增加红细胞数目的药物的反应性相关联。

如本文中所报道的一个方面是用于确定用于治疗癌症患者的用于增加红细胞数目的药物的剂量的方法，所述方法包括：

-体外确定人EPO受体在患者癌细胞上的存在，和

-当确定存在人EPO受体时，决定不施用或施用较低剂量的增加红细胞数目的药物，和

-当确定不存在人EPO受体时，决定施用一定剂量的增加红细胞数目的药物。

-体外确定人EPO受体在患者癌细胞上的密度，

-将人EPO受体在患者癌细胞上的密度与患者对用于增加红细胞数目的药物的反应性相关联。

如本文中所报道的一个方面是用于确定用于治疗癌症患者的用于增加红细胞数目的药物的剂量，所述方法包括：

-体外确定人EPO受体在患者癌细胞上的存在，和

-在人EPO受体存在的情况下，决定不施用或施用较低剂量的增加红细胞数目的药物，和

-在不存在人EPO受体的情况下，决定施用正常剂量的增加红细胞数目的药物。

在所有方面的一个实施方案中，确定人EPO受体在癌细胞上的存在或确定人EPO受体在癌细胞上的密度是通过将患者的组织样品与如本文中所报道的EPO受体的抗体体外温育并且在体外确定所述抗体与所述样品的结合。

在一个实施方案中，增加红细胞数目的药物是红细胞生成素。

附图简述

图1对来自wt-HELA、HELA-EPOR和UT-7细胞的溶解产物的蛋白质印迹分析。

图2对wt-HELA和HELA-EPOR细胞的免疫细胞化学分析：A：EPO受体-GFP融合蛋白；B：示例的如本文中所报道的抗体。

图3对wt-HELA和HELA-EPOR细胞的免疫组织化学分析：A：野生型HELA细胞；B：EPOR-HELA。

图4对来自UT-7、HUVEC(人脐静脉内皮细胞)和HMVEC细胞(人微血管内皮细胞)的溶解产物的蛋白质印迹分析。

序列简述

SEQIDNO：01人EPO受体的片段，其具有氨基酸序列LPGPGGSVDIV。

SEQIDNO：02人EPO受体的片段，其具有氨基酸序列LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV。

SEQIDNO：03人EPO受体前体的氨基酸序列。

发明实施方案详述

I.定义

用于本文目的的“接纳体人构架”是包含获自人免疫球蛋白构架或如下所定义的人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“获自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人构架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以包含氨基酸序列的变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10以下，9以下，8以下，7以下，6以下，5以下，4以下，3以下，或2以下。在一些实施方案中，VL接纳体人构架的序列与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1：1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(也作Kd或KD或平衡常数)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法(包括本文中所描述的那些)来测量。当确定多克隆抗体的亲和力时，亲和力也被称为“表观亲和力”。用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案描述于以下。

术语“抗-人EPO受体的抗体”和“结合人EPO受体的抗体”是指能够以足够的亲和力结合SEQIDNO：03的人EPO受体，从而使得所述抗体用作靶向人EPO受体的诊断和／或治疗剂。在一些实施方案中，结合人EPO受体的抗体具有≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如，10^-8M以下，例如，10^-8M至10^-13M，例如，10^-9M至10^-13M)的解离常数(Kd)。在一些实施方案中，抗-人EPO受体的抗体结合在来自不同物种的人EPO受体中保守的人EPO受体的表位。

术语″抗体″在本文中以最广义使用，并且包括不同抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们显示所需的抗原结合活性。

″抗体片段″是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv，Fab，Fab′，Fab'-SH，F(ab′)₂；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中一部分重链和／或轻链来源于特定来源或物种，而剩余的重链和／或轻链来源于不同来源或物种。

抗体的“类别”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五个主要类别的抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步被划分为亚类(同种型)，例如，IgG₁，IgG₂，IgG₃，IgG₄，IgA₁和IgA₂。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ和μ。

术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和／或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于：放射性同位素(例如，At²¹¹，I¹³¹，I¹²⁵，Y⁹⁰，Re¹⁸⁶，Re¹⁸⁸，Sm¹⁵³，Bi²¹²，P³²，Pb²¹²和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如核酸水解酶；抗生素；毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片段和／或变体；和下面公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。

“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

试剂例如药物制剂的″有效量″是指在需要的剂量和时间阶段有效获得所需的治疗或预防结果的量。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和可变Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羰基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat，E.A.等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)，NIHPublication91—3242中所述。

″构架″或″FR″是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常出现在VH(或VL)的以下序列中：FR1—H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”、“完整的抗体”和“完整抗体”在本文被可交换地用于指结构与天然抗体结构基本相似或具有包含如本文所定义的Fc区的重链的抗体。

术语″宿主细胞″、″宿主细胞系″和″宿主细胞培养物″被可交换地使用并且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括″转化体″和″转化的细胞″，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。

“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于这样抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人共有构架”是指这样的构架，即在选择人免疫球蛋白VL或VH构架序列中，其代表最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚型中选择。一般而言，该序列的亚型是如Kabat，E.A.等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第五版，BethesdaMD(1991)，NIHPublication91—3242，卷1—3中的亚型。在一个实施方案中，对于VL，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型III。

“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。

术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的每个区域，其序列高可变和／或形成结构上限定的环(“高变环”)。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH(H1，H2，H3)中，三个在VL(L1，L2，L3)中。HVR通常包含来自高变环和／或“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列可变性和／或涉及抗原识别。示例性高变环发生在氨基酸残基26-32(L1)，50—52(L2)，91—96(L3)，26-32(H1)，53—55(H2)，和96—101(H3)。(Chothia，C.和Lesk，A.M.，J.Mol.Biol.196(1987)901—917)。示例性CDR(CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2，和CDR-H3)发生在氨基酸残基L1的24-34，L2的50-56，L3的89-97，H1的31—35B，H2的50-65，和H3的95—102。(Kabat，E.A.等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)，NIHPublication91—3242)。除了VH中的CDR1，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是与抗原接触的残基。SDR包含在被称为缩短的(abbreviated)-CDR或a-CDR的CDR区域中。示例性a-CDR(a-CDR-L1，a-CDR-L2，a-CDR-L3，a-CDR-H1，a-CDR-H2，和a-CDR-H3)发生在氨基酸残基L1的31—34，L2的50-55，L3的89-96，H1的31—35B，H2的50—58，和H3的95—102。(见Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619—1633)。除非另外说明，可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等(见上文)编号。

“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。

″分离的″抗体是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。为了回顾用于评估抗体纯度的方法，参见，例如，Flatman，S.等，J.Chromatogr.B848(2007)79-87。

″分离的″核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。

“分离的编码抗-人EPO受体的抗体的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码抗体重和轻链(或其片段)，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能的变体抗体(该变体抗体例如含有天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂的过程中出现，此类变体通常少量存在)外，构成群体的个体抗体是相同的和／或结合相同的表位。相比于通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括但不限于杂交瘤法，重组DNA法，噬菌体展示法，和利用包含所有或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这样的方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法描述于本文中。

″天然抗体″是指天然存在的具有变化的结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻链和两个相同的重链组成，所述链通过二硫键结合。从N末端至C末端，每个重链具有可变区(VH)，其也被称为可变重结构域或重链可变结构域，其后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N末端到C末端，每个轻链具有可变区(VL)，其也被称为可变轻结构域或轻链可变结构域，其后是恒定轻(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被分配给被称为kappa(κ)和lambda(λ)的两个类型中的一个。

术语“可获自人内皮细胞”在全细胞的情况中表示多聚甲醛固定的过程，而在组织切片的情况中表示去石蜡过程之后，在柠檬酸缓冲液中在97℃进行45min的表位回收。

术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商品包装中的使用说明，其包含关于适应征、用法、剂量、给药、组合疗法、禁忌症的信息和／或关于使用这样的治疗产品的警告。

相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守取代视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为此目的，％氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比较计算机程序的作者是Genentech，Inc，并且源代码已经随用户文档提交至美国版权局(WashingtonD.C.，20559)，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可通过Genentech，Inc.(SouthSanFrancisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当为在UNIX操作系统、包括数字UNIXV4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序设定了所有序列比对参数并且不变。

在ALIGN-2应用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算：

100乘以X／Y比值

其中X是用序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另外具体说明，在本文用的所有％氨基酸序列同一性的值都是用ALIGN-2计算机程序如前段所描述的那样得到的。

术语“药物制剂”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。

“药用载体”是指药物制剂中不同于活性成分的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

除非另外说明，术语“EPO受体”是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然EPO受体。该术语包括“全长”未加工的人EPO受体以及由细胞内加工产生的任何形式的人EPO受体。该术语还包括人EPO受体的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位变体。示例性人EPO受体的氨基酸序列显示在SEQIDNO：03中。

术语“治疗(treatment)”(及其语法变化如“治疗(treat)”或“treating”)指在尝试改变待治疗的个体的天然进程中的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发，缓和症状，消除疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减少疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和症状缓解或改善的预后。在一些实施方案中，将本发明的抗体用于延缓疾病的发生或减缓疾病的进展。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(VH和VL，分别地)的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt，T.J.等，KubyImmunology，第6版，W.H.FreemanandCo.，N.Y.(2007)91页)。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。此外，可以使用来自与特定抗原结合的抗体的VH或VL结构域来分离结合所述抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano，S.等，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson，T.等，Nature352(1991)624-628。

术语″载体″是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为″表达载体″。

II.组合物和方法

在一方面中，本发明部分基于这样的发现，即特异性结合人EPO受体(尤其是SEQIDNO：01的人EPO受体片段)的抗体，不显示与人上皮或内皮细胞交叉反应或交叉结合。在一些实施方案中，提供结合人EPO受体的抗体。本发明的抗体可以例如用于诊断或治疗贫血或癌症。本发明的抗体也可以用于在施用增加红细胞数目的药物之前(尤其是在施用红细胞生成素之前)给患者分层(stratification)。

A.示例的抗-人EPO受体的抗体

在一个方面中，本发明提供结合人EPO受体的分离的抗体。在一些实施方案中，抗-人EPO受体的抗体结合人EPO受体片段LPGPGGSVDIV(EpoR(361—371)；SEQIDNO：01)。

在一个实施方案中，相比于与EPO受体片段347-371结合，本文中提供的结合人EPO受体的抗体以可比的亲和力(可比的同一数量级的Kd值)结合人EPO受体片段361—371。

在一个实施方案中，本文中提供的结合人EPO受体的抗体具有的结合人EPO受体片段361—371与结合人EPO受体片段347—371的亲和力比(Kd值比)小于10，或小于5，或约3。

1.抗体亲和力

在一些实施方案中，本文中提供的抗体具有的解离常数(Kd)≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10^-8M以下，例如10^-8M至10^-13M，或例如10^-9M至10^-13M)。

在一个实施方案中，Kd通过如由以下测定所述的用目的抗体的Fab形式及其抗原进行的放射性标记的抗原结合测定法(RIA)确定。Fab对抗原的溶液结合亲和力通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况下，用最小浓度的(¹²⁵I)-标记的抗原平衡Fab，接着用抗-Fab抗体-包被的板捕获结合的抗原来测量(参见，例如，Chen，Y.等，J.Mol.Biol.293(1999)865—881)。为了确定测定的条件，将多孔板(ThermoScientific)用5μg/ml的在50mM碳酸钠(pH9.6)中的捕获抗-Fab抗体(CappelLabs)包被过夜，并随后用PBS中的2％(w／v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与目的Fab的系列稀释物混合(与在Presta，L.G.等，癌症研究(CancerRes).57(1997)4593-4599中的抗-VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。接着，将目的Fab温育过夜；然而温育可以持续更长的阶段(例如65小时)从而确保达到平衡。随后，将混合物转移到捕获板中以在室温进行温育(例如1小时)。接着，去除溶液，并将所述板用在PBS中的0.1％聚山梨醇酯20()洗涤8次。当所述板已经干燥时，加入150μl／孔的闪烁剂(MICROSCINT-20^TM；Packard)，并将所述板在TOPCOUNT^TMγ计数器(Packard)上计数10分钟。选择提供少于或等于20％的最大结合的每种Fab的浓度用在竞争性结合测定中。

根据另一个实施方案，Kd值是通过表面等离子共振测定法使用-2000或-3000仪器(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个应答单位(RU)确定的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIACOREInc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl／分钟的流速注入至获得约10个应答单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl／分钟的流速注入在含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(EvaluationSoftwareversion3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off／k_on计算(参见，例如Chen，Y.等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)293(1999)865—881)。如果根据上文表面等离子共振测定法，结合速率超过10⁶M^-1s^-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(AvivInstruments)或8000系列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯(stirredcuvette)的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH7.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发=295nm；发射=340nm，16nm带通)的升高或降低。

2.抗体片段

在一些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于，Fab，Fab’，Fab'-SH，F(ab')₂，Fv，和scFv片段，以及以下描述的其他片段。对于一些抗体片段的综述，请参见Hudson，P.J.等Nat.Med.9(2003)129—134。对于scFv片段的综述，参见，例如，Plueckthun，A.，在；ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies(单克隆抗体的药理学)，卷113，Rosenburg和Moore(编辑)，Springer-Verlag，NewYork(1994)，269-315页中；还请参见WO93／16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含拯救受体(salvagereceptor)结合表位残基和具有提高的体内半衰期的Fab和F(ab′)₂片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。

双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP0404097；WO1993／01161；Hudson，P.J.等，Nat.Med.9(2003)129—134；和Holliger，P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448。三抗体和四抗体也描述于Hudson，P.J.等，Nat.Med.9(2003)129—134中。

单一结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在一些实施方案中，单一结构域抗体是人单一结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如，美国专利号6,248,516B1)。

抗体片段可以通过不同技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)生产，如本文所述。

3.嵌合抗体和人源化抗体

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体是嵌合抗体。一些嵌合抗体于例如美国专利第4,816,567号；及Morrison，S.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81(1984)6851—6855中描述。在一个实例中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或例如猴的非人类灵长类动物的可变区)及人类恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是种类或亚类已经自亲本抗体的种类或亚类发生变化的“种类转变”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在一些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人类抗体经人源化以降低对人类的免疫原性，同时保持亲本非人类抗体的特异性及亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVRs，例如CDRs(或其部分)源自非人类抗体，且FRs(或其部分)是源自人类抗体序列。人源化抗体任选地也将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基经来自非人类抗体(例如HVR残基所源自的抗体)的相应残基置换，例如以恢复或提高抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其制备方法于例如Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633中评述，且进一步于例如Riechmann，I.等人，Nature(自然)332(1988)323—329；Queen，C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029—10033；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号和第7,087,409号；Kashmiri，S.V.等人，Methods(方法)36(2005)25-34(描述SDR(a-CDR)移植)Padlan，E.A.，Mol.Immunol.(分子免疫学)28(1991)489-498(描述“表面重整”)；Dall′Acqua，W.F.等人，Methods36(2005)43—60(描述“FR重组(shuffling)”)；及Osbourn，J.等人，Methods(方法)36(2005)61—68和Klimka，A.等人，Br.J.Cancer(英国癌症杂志)，83(2000)252-260(描述FR重组(shuffling)的“导向选择”方法)中描述。

可用于人源化的人类构架区包括，但不限于，使用“最佳拟合”法选择的构架区(参见例如Sims，M.J.等人，J.Immunol.(免疫学杂志)151(1993)2296-2308)；源自特定亚群的轻链或重链可变区的人类抗体共同序列的构架区(参见例如Carter，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(1992)4285-4289；及Presta，L.G.等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，151(1993)2623-2632)；人类成熟(体细胞突变)构架区或人类生殖系构架区(参见例如Almagro，J.C.及Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619—1633)；及源自筛选FR文库的构架区(参见例如Baca，M.等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272(1997)10678—10684及Rosok，M.J.等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)271(1996922611—22618)。

4.人抗体

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体是人抗体。可使用本领域中已知的各种技术来制备人抗体。人抗体一般描述于vanDijk，M.A.和vandeWinkel，J.G.，Curr.Opin.Pharmacol.(当前药学观点)5(2001)368-374以及Lonberg，N.，Curr.Opin.Immunol.(当前免疫学观点)20(2008)450-459。

可通过向已经经过修饰因而对于抗原攻击刺激产生完整人抗体或具有人类可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原，来制备人抗体。这些动物通常含有全部或一部分人类免疫球蛋白基因座，其替代了内源免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合于动物染色体内。在这些转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座一般已经不活化。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，N.，Nat.Biotech.(自然生物技术)23(2005)1117—1125。也参见例如描述XENO小鼠^TM技术的美国6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利第5,770,429号；描述K-M小鼠技术的美国专利第7,041,870号，及描述V_ELOCI小鼠技术的美国专利申请公开号US2007／0061900。这些动物产生的完整抗体的人类可变区可进一步修饰，例如通过与不同人类恒定区组合。

人抗体也可通过基于杂交瘤的方法制得。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤及小鼠-人融合骨髓瘤细胞系已经描述。(参见例如Kozbor，D.，J.Immunol.(免疫学杂志)，133(1984)3001—3005；Brodeur，B.R.等人，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications(单克隆抗体产生技术及应用)，MarcelDekker，Inc.，NewYork(1987)，第51—63页)；和Boerner，P.等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，147(1991)86-95)。通过人类B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也在Li，J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci..USA，103(2006)3557-3562中描述。其他方法包括例如美国专利第7,189,826号(描述由杂交瘤细胞系产生单克隆人类IgM抗体)及Ni.J.，XiandaiMianyixue，26(2006)265-268(描述人-人杂交瘤)中所述的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)也于Vollmers，H.P.和Brandlein，S.，HistologyandHistopathology(组织学和组织病理学)，20(2005)927—937，及Vollmers，H.P.和Brandlein，S.，MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology(实验和临床药学方法和发现)，27(2005)185—191中描述。

也可通过分离选自源自人噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体。随后可将这些可变结构域序列与所需人恒定结构域组合。下文描述自抗体文库选择人抗体的技术。

5.源自文库的抗体

可通过在组合文库中筛选具有所需活性的抗体来分离本发明抗体。举例来说，本领域中已知多种用于产生噬菌体展示文库并且在这些文库中筛选具有所需结合特征的抗体的方法。这些方法于例如Hoogenboom，H.R.等人，MethodsinMolecularBiology(分子生物学方法)178(2001)1—37中评述，并且进一步于例如McCafferty，J.等人，Nature(自然)348(1990)552-554；Clackson，T.等人，Nature(自然)352(1991)624-628；Marks，J.D.等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222(1992)581-597；Marks，J.D.及Bradbury，A.，MethodsinMolecularBiology(分子生物学方法)248(2003)161-175；Sidhu，S.S.等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)338(2004)299-310；Lee，C.V.等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)340(2004)1073—1093；Fellouse，F.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(2004)12467—12472；和Lee，C.V.等人，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)284(2004)119—132中描述。

在一些噬菌体展示方法中，VH及VL基因库(repertoire)是通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆并且随机重组于噬菌体文库中，随后可如Winter，G.等人，Ann.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)，12(1994)433-455中所述在其中筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常呈现单链Fv(scFv)片段或Fab片段形式的抗体片段。来自免疫来源的文库无需构建杂交瘤即可提供免疫原的高亲和力抗体。或者，天然库可经克隆(例如自人)以在无任何免疫的情况下提供针对多种非自体抗原以及自体抗原的抗体单一来源，如Griffiths，A.D.等人，EMBOJ，12(1993)725-734所述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V基因区段，并且使用含有随机序列的PCR引物来编码高变性CDR3区，并且实现体外重排来合成制得天然文库，如Hoogenboom，H.R.及Winter，G.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，227(1992)381—388所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开物包括例如：美国专利第5,750,373号，及美国专利公开第2005／0079574号、第2005／0119455号、第2005／0266000号、第2007／0117126号、第2007／0160598号、第2007／0237764号、第2007／0292936号和第2009／0002360号。

从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被视为本文的人抗体或人抗体片段。

6.多特异性抗体

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在一些实施方案中，一种结合特异性是针对人EPO受体而另一种是针对任何其他抗原。在一些实施方案中，双特异性抗体可结合至人EPO受体的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于表达人EPO受体的细胞。双特异性抗体可制成全长抗体或抗体片段形式。

制造多特异性抗体的技术包括，但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein，C.及Cuello，A.C.，Nature(自然)305(1983)537—540；WO93／08829；及Traunecker，A.等人，EMBOJ.10(1991)3655-3659)，及“凸起-入-孔洞(knob-in-hole)”工程改造(参见例如美国专利第5,731,168号)。也可通过以下方法制得多特异性抗体：工程改造用于制备抗体Fc-异二聚体的静电导引作用(WO2009／089004)；将两种或两种以上抗体或片段交联(参见例如美国专利第4,676,980号，及Brennan，M.等人Science(科学)，229(1985)81—83)；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如Kostelny，S.A.等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，148(1992)1547—1553)；使用“双抗体”技术来制得双特异性抗体片段(参见例如Holliger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90(1993)6444-6448)；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber，M.等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，152(1994)5368—5374)；及如例如Tutt，A.等人，J.Immunol.(免疫学杂志)147(1991)60-69中所述制备三特异性抗体。

本文中也包括具有三个或三个以上功能性抗原结合位点的经工程改造抗体，包括“章鱼抗体(Octopusantibodies)”(参见例如US2006／0025576)。

本文中的抗体或片段也包括包含结合至人EPO受体以及另一不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb或“DAF”(例如参见US2008／0069820)。

本文中的抗体或片段还包括以下文献中描述的多特异性抗体：WO2009／080251，WO2009／080252，WO2009／080253，WO2009／080254，WO2010／112193，WO2010／115589，WO2010／136172，WO2010／145792，和WO2010／145793。

7.抗体变体

a)糖基化变体

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体经改变以增加或降低抗体经糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一或多个糖基化位点而方便地实现。

若抗体包含Fc区，则与其连接的糖类可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含一般通过N-连接与Fc区CH2结构域的Asn297连接的分支链双触角寡糖(参见例如Wright，A.和Morrison，S.L.等人，TIBTECH15(1997)26-32)。寡糖可包括多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及与双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本发明抗体中的寡糖进行修饰以产生具有一些改良特性的抗体变体。

在一实施方案中，提供具有缺乏与Fc区连接(直接或间接)的岩藻糖的糖结构的抗体变体。举例来说，该抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于根据MALDI-TOF质谱法所测量的所有与Asn297连接的糖结构(例如复合型、杂合型及高甘露糖型结构)的总和，计算糖链内Asn297处岩藻糖的平均量来测定岩藻糖的量，例如如WO2008／077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约位置297处(Fc区残基的Eu编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可能位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，也即介于位置294与300之间。这些岩藻糖基化变体可具有提高的ADCC功能(参见例如US2003／0157108；US2004／0093621)。与“去岩藻糖基”或“岩藻糖缺乏”抗体变体有关的公开文本的实例包括US2003／0157108；WO2000／61739；WO2001／29246；US2003／0115614；US2002／0164328；US2004／0093621；US2004／0132140；US2004／0110704；US2004／0110282；US2004／0109865；WO2003／085119；WO2003／084570；WO2005／035586；WO2005／035778；WO2005／053742；WO2005／031140；Okazaki，A.等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)336(2004)1239—1249；Yamane-Ohnuki，N.等人，Biotech.Bioeng.(生物技术和生物工程)87(2004)614-622。能够产生脱除岩藻糖基的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺乏的Lec13CHO细胞(Ripka，J.等人，Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533—545；US2003／0157108；及WO2004／056312，尤其实施例11)；及基因敲除细胞系，例如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、基因敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki，N.等人，Biotech.Bioeng.(生物技术和生物工程)87(2004)614-622；Kanda，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.(生物技术和生物工程)，94(2006)680-688；及WO2003／085107)。

进一步提供具有平分型寡糖(bisectedoligosaccharide)的抗体变体，例如其中与抗体的Fc区连接的双触角寡糖经GlcNAc平分。这些抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和／或提高的ADCC功能。这些抗体变体的实例例如于WO2003／011878；美国专利第6,602,684号；及US2005／0123546中描述。也提供在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这些抗体变体可具有提高的CDC功能。这些抗体变体于例如WO1997／30087；WO1998／58964；及WO1999／22764中描述。

b)Fc区域变体

在一些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。

在一些实施方案中，本发明涵盖具有一些但非所有效应子功能的抗体变体，这使其成为一些应用的理想候选物，在所述应用中抗体的活体内半衰期是重要的，但一些效应子功能(例如补体及ADCC)是不必要或有害的。可进行体外和／或体内细胞毒性测定以确认CDC和／或ADCC活性的降低／衰竭。举例来说，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn结合能力。介导ADCC的初级细胞、NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达于Ravetch，J.V.及Kinet，J.P.，Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)9(1991)457-492的第464页上的表3中总结。评定相关分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例于美国专利5,500,362(参见例如Hellstrom，I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83(1986)7059-7063)及Hellstrom，I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82(1985)1499—1502；美国专利第5,821,337号(参见Bruggemann，M.等人，J.Exp.Med.(实验医学杂志)166(1987)1351—1361)中描述。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.MountainView，CA)及CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI)。适用于这些测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)及自然杀伤(NK)细胞。或者或另外，相关分子的ADCC活性可于体内评定，例如在例如Clynes，R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(1998)652-656中所揭示的动物模型中评定。也可进行Clq结合测定以证明抗体无法结合Clq且因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006／029879及WO2005／100402中的Clq及C3c结合ELISA。为评定补体活化，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro，H.等人，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)202(1996)163—171；Cragg，M.S.等人，Blood(血液)101(2003)1045—1052；及Cragg，M.S.及M.J.Glennie，Blood103(2004)2738-2743)。也可使用本领域中已知的方法进行FcRn结合及活体内清除／半衰期测定(参见例如Petkova，S.B.等人，Intl.Immunol.(国际免疫学)18(2006)1759—1769)。

效应子功能降低的抗体包括Fc区残基238、265、269、270、297、327及329中一个或多个置换的那些抗体(美国专利6,737,056)。这些Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或两个以上位置处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。

描述一些与FcRs的结合提高或减少的抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO2004／056312，及Shields，R.L.等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)276(2001)6591—6604)。

在一些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个提高ADCC的氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和／或334(残基的EU编号)处置换。

在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，其导致Clq结合和／或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(也即，通过提高或降低)，例如如美国专利第6,194,551号、WO99／51642和Idusogie，E.E.等人，J.Immunol.(免疫学杂志)164(2000)4178-4184中所述。

US2005／0014934中描述具有增加的半衰期及提高的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体，其中FcRn负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer，R.L.等人J.Immunol.(免疫学杂志)117(1976)587—593及Kim，J.K等人，J.Immunol.(免疫学杂志)24(1994)2429-2434)。那些抗体包含具有一或多个置换的Fc区，所述置换提高Fc区与FcRn的结合。这些Fc变体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一或多者处具有置换(例如置换Fc区残基434)的那些Fc变体(美国专利第7,371,826号)。

关于Fc区变体的其他实例，也参见Duncan，A.R.及Winter，G.，Nature(自然)322(1988)738-740；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；及WO94／29351。

c)抗体衍生物

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇／丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二烷、聚-1，3，6-三恶烷三烷、乙烯／马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷／氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中的稳定性可能具有制造优势。聚合物可具有任何分子量，且可有分支或无分支。与抗体连接的聚合物的数目可以变化，且若连接一种以上聚合物，则其可以是相同或不同分子。一般而言，用于衍生作用的聚合物数目和／或类型可以基于包括，但不限于，以下的考虑因素来确定：要提高的抗体的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的疗法等。

在另一实施方案中，提供抗体与可通过暴露于辐射来选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam，N.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院学报)102(2005)11600—11605)。该辐射可具有任何波长，且包括但不限于，不损伤普通细胞但能将非蛋白质部分加热至可杀死抗体-非蛋白质部分附近的细胞的温度的波长。

产生基本上(或几乎)没有免疫原性的连接的缀合方法是尤其合适的。因此，肽-(即酰胺-)，硫化物-，(位阻的)，二硫化物-，腙-或醚连接是尤其合适的。这些连接几乎没有免疫原性并且显示在血清内的合理的稳定性(见例如Senter，P.D.，Curr.Opin.Chem.Biol.13(2009)235—244；WO2009／059278；WO95／17886)。

取决于部分和抗体的生化性质，可以使用不同的缀合策略。在部分是天然存在的或或是具有50至500个氨基酸的重组体的情况中，在描述蛋白质缀合物合成化学的教科书中有标准方法，本领域技术人员可以容易地遵循(见例如Hackenberger，C.P.R.和Schwarzer，D.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.47(2008)10030-10074)。在一个实施方案中，使用马来酰亚胺基部分与抗体或部分内的半胱氨酸残基的反应。在例如使用抗体的Fab或Fab'-片段的情况中，这是尤其合适的偶联化学。备选地，在一个实施方案中，进行与抗体或部分的C-末端的偶联。可以例如如所述的(Sunbul，M.和Yin，J.，Org.Biomol.Chem.7(2009)3361—3371)进行蛋白质(例如Fab-片段)的C-端修饰。

通常，位点特异性反应和共价偶联是基于将天然氨基酸转化为具有与存在的其他官能团的反应性独立的(orthogonal)反应性的氨基酸。例如，稀有序列背景(context)内的特定半胱氨酸可以由酶转化为醛(见Frese，M.A.和Dierks，T.，ChemBioChem.10(2009)425-427)。还可能通过利用特定酶与给定序列环境中的天然氨基酸的特异性酶反应性获得所需的氨基酸修饰(见，例如，Taki，M.等，Prot.Eng.Des.Sel.17(2004)119—126；Gautier，A.等，Chem.Biol.15(2008)128—136；以及Bordusa，F.使用的蛋白酶催化的C-N键形成，HighlightsinBioorganicChemistry(2004)389-403)。

位点特异性反应和共价偶联也可以通过末端氨基酸与合适的改性剂的选择性反应实现。

N端半胱氨酸与苄腈的反应性(见Ren，H.等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.48(2009)9658-9662)可以用于实现位点特异性共价偶联。

天然化学连接也可以依靠C-端半胱氨酸残基(Taylor，E.Vogel；Imperiali，B，NucleicAcidsandMolecularBiology(2009)，22(ProteinEngineering)，65-96)。

EP1074563描述了缀合方法，所述方法是基于带负电的氨基酸的区段内的半胱氨酸与位于带正电的氨基酸的区段中的半胱氨酸的更快的反应。

所述部分也可以是合成肽或肽拟似物。在化学合成多肽的情况中，在这样的合成期间可以结合具有独立的化学反应性的氨基酸(见例如deGraaf，A.J.等，Bioconjug.Chem.20(2009)1281—1295)。因为已经讨论了多种多样的独立官能团并且其可以引入到合成肽中，这样的肽与接头的缀合是标准化学。

为了获得单标记的多肽，具有1：1化学计量的缀合物可以通过色谱法与其他缀合副产物分离。可以通过使用染料标记的结合对成员和带电的接头促进该过程。通过使用这种类型的标记且高度带负电的结合对成员，单缀合的多肽可以容易地与非标记的多肽和带有超过一个接头的多肽分离，因为电荷和分子量的差异可以用于分离。荧光染料可以用于从未结合的组分(如标记的单价结合物)纯化复合物。

在一个实施方案中，效应部分选自由以下各项组成的组：结合部分、标记部分和生物活性部分。

B.重组方法和组合物

抗体可以使用例如在美国专利号4,816,567中描述的重组方法和组合物产生。在一个实施方案中，提供了编码本文描述的抗人EPO受体的抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体VL的氨基酸序列和／或包含其VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和／或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，用下述各项转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp2／0细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗人EPO受体的抗体的方法，其中所述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。

为了重组生产抗-人EPO受体的抗体，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体)的核酸，并插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和／或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。

用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见，例如，美国专利号5,648,237，5,789,199和5,840,523。(还见Charlton，K.A.，In：分子生物学中的方法(MethodsinMolecularBiology)，卷248，Lo，B.K.C.(编辑)，Humana出版社，Totowa，NJ(2003)，第245-254页，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以从可溶级分中的细菌细胞糊状物分离，并且可以进一步纯化。

除了原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是关于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经进行“人源化”，导致生产具有部分或完全人糖基化模式的抗体(参见Gerngross，T.U.，Nat.Biotech.(自然生物技术)22(2004)1409—1414，和Li，H.等，Nat.Biotech.(自然生物技术)24(2006)210-215)。

适于表达糖基化抗体的宿主细胞也获自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。

还可利用植物细胞培养物作为宿主。见，例如，美国专利号5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978和6,417,429(其描述了在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如Graham，F.L.等，遗传病毒学杂志(J.GenVirol.)36(1977)59-74中所描述的)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如在Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243—252中描述的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳瘤(MMT060562)；TRI细胞，如例如Mather，J.P.等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所描述的；MRC5细胞；并且FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR^-CHO细胞(Urlaub，G.等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77(1980)4216-4220)；并且骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2／0。关于适合生产抗体的一些哺乳动物宿主细胞系的综述见例如Yazaki，P.和Wu，A.M.，在分子生物学中的方法(MethodsinMolecularBiology)，卷248，Lo，B.K.C.(编辑)，HumanaPress，Totowa，NJ(2004)，第255-268页。

C.测定

本文中提供的抗-人EPO受体的抗体可以对其物理／化学特性和／或生物活性，通过本领域中已知的不同测定来识别、筛选或表征。

1.免疫组织化学染色测定

在一个方面中，对组织切片进行去石蜡，即除去石蜡，之后进行表位回收，使用例如柠檬酸缓冲液(如可获自VectorLaboratories的)，用于在升高的温度的处理，如在97℃处理45min。在封闭(例如用ProteinBlockSerum-Free(货号X0909，可获自DAKODeutschlandGmbH))后，将组织切片与第一抗体温育60min，例如在如本文中所报道的抗体的情况中，浓度为127.5ng／ml。之后，例如利用Envision多克隆兔检测试剂盒(DAKODeutschlandGmbH)测定结合的抗体。最后，对样品进行复染，脱水和安装。

2.通过确定癌细胞的EPO受体状态对患者进行分层(stratification)

来自患者的样品材料收集自来自(例如用于治疗癌症疾病的)肿瘤切除的组织材料，或是通过肿瘤活组织检查收集。根据组织学标准方法，将收集的肿瘤组织用福尔马林固定并包埋在石蜡中。使用如本文中所报道的抗-EPO受体的抗体的免疫组织化学在该肿瘤材料的切片上进行(见上文和实施例)。对染色的组织切片的组织病理学评估允许确定肿瘤组织是EPO受体阳性的还是EPO受体阴性的。该评估可以基于打分系统，所述系统考虑了肿瘤细胞的染色强度和在限定的切片区域内的染色肿瘤细胞数目。

对患者肿瘤组织的EPO受体状态的评估可以是确定对癌症患者的最佳治疗的基础。这包括肿瘤进展的预后，抗肿瘤疗法如放疗、化疗、通过特异性抗肿瘤剂的治疗的强度，化疗或肿瘤疾病相关贫血的治疗，用于校正患者贫血状态的红细胞生成刺激剂(ESA)的剂量或施用方案的改变，利用ESA的抗贫血治疗的中止，从一种特定类型的ESA到另一种类型的ESA的改变，从利用ESA的抗贫血治疗转变到血液或分离的和浓缩的红细胞(压缩的红细胞)的灌输，或推迟或停止利用ESA进行以后的治疗的决定。

ESA是例如通过刺激红细胞生成素受体刺激红细胞生成的药剂，如重组的人红细胞生成素，或epoetin，修饰的红细胞生成素，连续的红细胞生成素受体刺激物，小分子或肽性红细胞生成素受体激动剂，缺氧可诱导因子的稳定剂等。

D.用于诊断和检测的方法和组合物

在一些实施方案中，本文中提供的任何抗-人EPO受体的抗体可以用于检测人EPO受体在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在一些实施方案中，生物样品包括细胞或组织，如PBMC(外周血单核细胞)，来自正常或染病组织、新鲜组织、冷冻的组织、福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)组织的组织切片或样品。

在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法的抗-人EPO受体的抗体。在另一个方面中，提供检测人EPO受体在生物样品中的存在的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗-人EPO受体的抗体在允许抗-人EPO受体的抗体与人EPO受体结合的条件下接触，并检测在抗-人EPO受体的抗体和人EPO受体之间是否形成复合物。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗-人EPO受体的抗体用于选择适合利用重组人EPO(epoetin)，高糖基化的人红细胞生成素，红细胞生成素受体激动剂，红细胞生成素拟肽，化学红细胞生成素受体激活化合物或其他红细胞生成刺激剂(ESA)的治疗的受试者，例如其中人EPO受体是用于对患者进行选择和／或分层(stratification)的生物标记物，或调节用于这样的治疗的剂量。

可以使用本发明的抗体诊断的示例疾病包括例如癌症或者也包括用于组织再生的干细胞的EPOR状态。

在一些实施方案中，提供标记的抗-人EPO受体的抗体。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用进行。示例性标记包括但不限于，放射性同位素³²P，¹⁴C，¹²⁵I，³H，和¹³¹I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，荧光素酶(luceriferase)，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素(luciferin)，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HR)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶解酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，偶联于利用过氧化氢氧化染料前体的酶如HRP，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶(microperoxidase)，生物素／亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。

E.药物制剂

如本文所述的抗-人EPO受体的抗体的药物制剂通过将具有所需纯度的所述抗体与一种或多种任选的药用载体(Remington′sPharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A.(编)(1980))混合来制备，以冻干制剂或水溶液的形式。药用载体通常在所用剂量及浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄铵、氯化六羟季铵、氯苄烷铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐平衡离子，如钠；金属复合体(例如Zn-蛋白质复合体)；并且／或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药用载体还包括药物间质分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(BaxterInternational，Inc.)。一些示例性sHASEGPs及使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005／0260186及2006／0104968中。在一方面中，sHASEGP与一种或多种其他葡糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。

示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006／044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。

本文的制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。

可以将活性成分截留于例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微囊，例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊中、胶状药物传递系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)中或粗滴乳状液中。这些技术披露于Remington′sPharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A.(编)(1980)中。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

欲用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以例如借助通过无菌过滤膜的过滤而轻易地实现。

F.治疗方法和组合物

本文中提供的任何抗-人EPO受体的抗体都可以在治疗方法中使用。

在另一方面中，本发明提供抗-人EPO受体的抗体在制备或生产药物中的用途。

在另一个方面中，本发明提供药物制剂，所述药物制剂包含任何本文提供的抗-人EPO受体的抗体。在一个实施方案中，药物制剂包含任何本文提供的抗-人EPO受体的抗体和药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含任何本文提供的抗-人EPO受体的抗体和至少一种另外的治疗剂，例如，如以下所述的。

在治疗中，本发明的抗体可以单独使用或与其他药剂组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂共同给药。

这样的以上所述的组合疗法包括组合给药(其中两种以上治疗剂被包含在相同或分开的制剂中)，和分别给药，其中，本发明抗体的给药可以发生在另外的治疗剂和／或佐剂的给药前、同时和／或之后。本发明的抗体还可以与放射疗法一起使用。

本发明的抗体(以及任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肺内给药和鼻内给药，并且，如果局部治疗需要，病变内给药。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。

本发明的抗体将以与良好医疗实践相一致的方式配制、给药和施用。在该背景下考虑的因素包括待治疗的具体病症、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状态、病症的原因、递送试剂的位点、施药方法、施药时间安排、和医疗从业者已知的其他因素。所述抗体不需要，但任选地，与目前用于预防或治疗待讨论病症的一种或多种试剂一起配制。所述其他试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型、和以上讨论的其他因素。这些一般以相同剂量，并使用如本文中所述的施药途径，或以本文中所述的剂量的约1—99％，或以通过经验／临床确定合适的任意剂量和任何途径来使用。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的合适剂量(当单独或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和进程、所述抗体是以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗体的应答，和主治医师的判断力。所述抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg／kg-15mg／kg(例如0.1mg／kg-10mg／kg)的抗体可以是用于向患者施用的最初候选剂量，无论，例如，通过一次或多次分别施药，或通过连续输注。一个典型的每日剂量可以在约1μg／kg-100mg／kg或更多的范围内，其取决于上文提及的因素。为了重复施用数日或更长，根据病症，通常将持续治疗直至出现疾病症状的理想抑制。所述抗体的一个示范性剂量应该在约0.05mg／kg-约10mg／kg范围内。因此，约0.5mg／kg、2.0mg／kg、4.0mg／kg或10mg／kg(或其任意组合)的一个或多个剂量可以施用于患者。这样的剂量可以间隔地，例如每周或每三周施用(例如以使得患者接受约2-约20或例如约6剂量的所述抗体)。可以施用最初较高的负荷剂量，随后是一个或多个较低的剂量。然而，其它治疗方案可以是有用的。该疗法的进展可以容易地通过常规方法和测定来监测。

要理解，任何以上制剂或治疗方法可以使用本发明的免疫缀合物进行以代替抗-人EPO受体的抗体或作为抗-人EPO受体的抗体的补充。

III.制品

在本发明的另一方面中，提供一种制品，所述制品包含可用于治疗、预防和／或诊断上述病症的材料。该制品包括容器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书(packageinsert)。适合的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液包等。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有组合物，所述组合物是单独地或与可有效用于治疗、预防和／或诊断所述病症的另一种组合物结合，对于所述疾患的治疗有效的组合物，并且可以具有无菌的存取口(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性试剂是本发明的抗体。标签或包装说明书标明该组合物是用于治疗特定的病症。此外，所述制品可以包含(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性剂或其他的治疗剂。本发明的该实施方案中的制品还可以包括包装说明书，所述包装说明书指明所述组合物可以用于治疗特定病症。备选地，或另外地，所述制品还可以包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，Ringer溶液和葡萄糖溶液。从商业和用户立场，它还可以包括所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤膜、针头和注射器。

要理解，任何以上制品可以包括本发明的免疫缀合物以代替抗-人EPO受体的抗体或作为抗-人EPO受体的抗体的补充。

IV.实施例

以下是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，根据以上提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。

实施例1

制备针对人EPOR的胞内结构域的抗体

将对应于成熟人红细胞生成素受体的残基347-371的25个氨基酸的合成肽(LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV，SEQIDNO：02)用作免疫原(对应于EPO受体前体SEQIDNO：03的氨基酸残基371—395)。

为了免疫，将肽通过C-端半胱氨酸残基与KLH(钥孔血蓝蛋白)偶联。用所述蛋白对兔进行每4周3—5次免疫。根据已经建立的方法，通过在包被以蛋白或生物素化的肽的ELISA微量滴定板上进行测试，进行对特异性抗体的第一级筛选。

通过硫酸铵沉淀多克隆血清。将IgG通过DEAE色谱法分离并且通过在含有成熟hEPO受体的氨基酸残基361—371(SEQIDNO：01)的肽递呈柱上的免疫亲和吸附进一步纯化。使用丙酸pH2.6从所述柱上回收IgG。使用TRIS缓冲液(2.5M，pH8.5)将获得的溶液调节至pH7.3。接下来，将纯化的IgG对50mM磷酸钾／150mMKCl缓冲液透析，之后在Superdex200柱(GEHealthcare)上使用相同的缓冲液进行凝胶过滤，并且最后使用0.2μm薄膜过滤器进行无菌过滤。

实施例2

制备表达EPO受体的HELA细胞

为了制备表达重组人EPO受体(EPOR)的稳定转染的HELA细胞，用来自用编码EPO受体或EPO受体-eGFP(作为融合蛋白连接至胞内的C-末端，Invitrogen)的反转录病毒表达载体和pVSV-G(编码棒状病毒疱疹性口炎病毒的G糖蛋白的表达载体)瞬时转染的HEK293细胞的上清液诱导细胞。转导两天后，用含有0.2mg／mlzeocin的新鲜补充的RPMI替换所述培养基。

为了进行瞬时转染实验，将8x10⁴个HELA细胞涂板在盖玻片上，在12孔板好，在1ml培养基中，使用FuGENE转染试剂(RocheMolecularBiochemicals货号1815075)。具体地，将3μl的FuGENE6加入到97μl不含FCS的RPMI1640中，在室温温育5min。之后，加入1μgDNA混合物并且在室温温育15min。最后，将50μl的DNA／FuGENE6溶液加入到在盖玻片上的含有细胞的1ml细胞培养基中。

实施例3

制备表达EPO受体的UT7细胞

UT-7细胞系是人因子依赖性红白血病细胞系(人骨髓急性髓性白血病细胞系DSMZ：ACC137)，其需要EPO以进行长期生长。将UT7细胞保持在补充以L-谷氨酰胺(2mM)、非必需氨基酸(1x)、丙酮酸钠(1mM)、10％胎牛血清和10U／mlGM-CSF的RPMI培养基中。将转导的细胞(UT7／EPOR)保持在与非转导的细胞相同的培养基中，其中用25U／mlGM-CSF替代10U／ml并且加入0.4mg／mlzeocin。在每种刺激前，通过在补充以L-谷氨酰胺(2mM)、非必需氨基酸(1x)、丙酮酸钠(1mM)和0.1％胎牛血清的RPMI培养基中过夜温育使细胞饥饿。

用来自用编码EPO受体和pVSV-G的反转录病毒表达载体瞬时转染的HEK293细胞的上清转导UT-7细胞。在转导后两天，用含有0.4mg／mlzeocin和25U／mlGM-CSF的新鲜补充的RPMI替换所述培养基。在选择后，获得在其表面稳定表达EPO受体的UT-7细胞的细胞系。

实施例4

SDS-PAGE和蛋白质印迹

根据标准程序和Invitrogen的NuPAGE凝胶系统进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。对应于不同数目细胞的提取物被加载在NuPAGENovex4—12％Bis-Tris凝胶的每道中。在凝胶电泳后，将蛋白转移到PVDF膜上，并且与在实施例1中获得的抗-EPO受体的抗体在4℃过夜温育。在洗涤后，将所述膜与缀合抗-小鼠或抗-兔IgG-HRP温育并且使用ECL试剂(PLUS蛋白印迹法底物，RocheDiagnosticsGmbH，Mannheim，Germany)进行显影。结果显示在图1中。

实施例5

BIACORE分析

在25℃确定抗-EPO受体的抗体GBb与EPO受体片段结合的动力学。

抗体GBb显示与EPO受体片段361—371的纳摩尔亲合力(avidity)以及与EPO受体片段347-371的纳摩尔亲合力。所述抗体显示长的解离常数(t/2diss)。

使用山羊抗-兔Fcγ抗体将抗体GBb捕获至传感器芯片的流动细胞，之后分别用EPO受体片段347—371或361—371灌注。

在3000仪器上在25℃在HBS-EP-缓冲液，pH7.4(10mMHEPES、150mMNaCl、3.4mMEDTA、0.005％聚山梨酯20(w／v))进行测量。加入1.0mg／mlCMD(羧甲基右旋糖苷)以减少非特异性结合。GBb抗体显示与相应的SEQIDNO：01的EPO受体片段的纳摩尔结合亲合力。

实施例6

免疫细胞化学I

对纯化的针对EPO受体的多克隆抗体在瞬时转染的HELAEPOR细胞上的亲和力的免疫细胞化学分析如下进行：对培养在玻璃盖玻片上的HELA细胞进行转染以瞬时表达EPO受体-GFP融合蛋白，PFA(多聚甲醛)固定，并且用1.0—10μg/ml纯化的与EPO受体结合的多克隆抗体的IgG染色。结合的抗体通过CY3山羊抗-人IgG第二抗体检测。将样品在LEICA共聚焦激光扫描显微镜SP2上成像，分别使用488nm和543nm激发用于AlexaFluor488和CY3。发现抗-EPO受体的抗体免疫反应性与EPO受体-GFP融合蛋白的绿色荧光密切地共定位。所述抗体还识别新合成的被限制到ER／高尔基区的EPO受体。在非转染的细胞中缺少任何可检测的标记也确认了如本文中所报道的抗-EPO受体多克隆抗体的高特异性。

结果显示在图2中。

实施例7

免疫组织化学II

将来自HELAEPOR或野生型HELA细胞(对于EPOR表达为阴性的)的异种移植组织的组织切片去石蜡，之后在柠檬酸缓冲液(VectorLaboratories)中在97℃进行表位回收45分钟。自动化染色在Labvision仪器上进行。以127.5ng／ml的终浓度使用抗-EPO受体的抗体。使用Envision多克隆兔检测试剂盒(DAKODeutschlandGmbH)检测第一抗体。在ZeissAxiovisionRel4.8显微镜上摄取图像(见图3)。

实施例8

对UT-7细胞、人脐静脉(HUVEC)和人微血管内皮(HMVEC)细胞的蛋白质印迹分析。

使用如在实施例4中所述的方法。

图4中的图A显示抗体结合EPO受体片段LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV(SEQIDNO：02)的免疫反应性。

图4中的图B显示抗体交叉吸附到EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQIDNO：01)的免疫反应性。

虽然为了清楚的理解，已经借助于附图和实施例在一些细节上描述了上述发明，但是说明书和实施例不应当被视为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地清楚并入。

Claims

1.特异性结合人EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQIDNO:01)的EPO受体的抗体在制备体外检测人EPO受体的诊断试剂盒中的用途，所述试剂盒用于包括以下步骤的方法：

通过将样品与所述特异性结合人EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQIDNO:01)的EPO受体的抗体温育，体外确定所述样品中人EPO受体的存在，由此体外检测人EPO受体，

其中所述特异性结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQIDNO:01)的EPO受体的抗体不特异性结合具有约66kD分子量的能够获自人内皮细胞的蛋白质，

其中所述抗体能够通过包括以下步骤的方法制备：

-用包含EPO受体片段LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV(SEQIDNO:02)的多肽免疫动物，和

-选择特异性结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQIDNO:01)的抗体并且由此制备特异性结合人EPO受体的抗体。

2.特异性结合人EPO受体的抗体，其特征在于所述抗体结合人EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQIDNO:01)并且不特异性结合具有约66kD分子量的能够获自人内皮细胞的蛋白质，其中所述抗体能够通过包括以下步骤的方法制备：

3.能够用于根据权利要求1所述的用途的特异性结合人EPO受体的抗体，其中所述抗体能够通过包括以下步骤的方法制备：

4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于所述抗体结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQIDNO:01)并且不特异性结合具有约66kD分子量的能够获自人内皮细胞的蛋白质。

5.特异性结合人EPO受体的抗体在制备检测人EPO受体的诊断试剂盒中的用途，其特征在于所述抗体结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQIDNO:01)并且不特异性结合具有约66kD分子量的能够获自人内皮细胞的蛋白质，

其中所述抗体能够通过包括以下步骤的方法制备：

6.权利要求2至4中任一项所述的EPO受体的抗体在制备预测或确定患者对增加红细胞数目的药物的反应性的诊断剂中的用途，所述诊断剂用于包括以下步骤的方法：

-通过将所述患者的样品与权利要求2至4所述的EPO受体的抗体体外温育和体外确定权利要求2至4所述的抗体与所述样品的结合，体外确定人EPO受体在所述患者的癌细胞上的存在，和

-将人EPO受体在所述患者的癌细胞上的存在与所述患者对增加红细胞数目的药物的反应性相关联。

7.用于制备特异性结合人EPO受体的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

8.根据权利要求1或6所述的用途，根据权利要求7所述的方法，根据权利要求2至4中任一项所述的抗体，或根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述抗体不特异性结合具有58kD至70kD分子量的能够获自人内皮细胞的蛋白质。

9.根据权利要求1或6所述的用途，根据权利要求7所述的方法，根据权利要求2至4任一项所述的抗体，或根据权利要求5的用途，其特征在于所述抗体以10^-3M或更高的亲和力结合能够获自人内皮细胞的蛋白质。

10.根据权利要求1或6所述的用途，根据权利要求7所述的方法，根据权利要求2至4中任一项所述的抗体，或根据权利要求5所述的用途，其中所述抗体是多克隆抗体。

11.根据权利要求1或6所述的用途，根据权利要求7所述的方法，根据权利要求2至4中任一项所述的抗体，或根据权利要求5所述的用途，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

12.药物制剂，其包含权利要求2至4中任一项所述的抗体和药用载体。

13.分离的核酸，其编码根据权利要求2至4中任一项所述的抗体。

14.宿主细胞，其包含权利要求13所述的核酸。

15.诊断试剂盒，其包含根据权利要求2至4中任一项所述的抗体。

16.根据权利要求2至4中任一项所述的抗体在制备分析人组织或细胞样品中的EPO受体的诊断剂中的用途。

17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于所述样品是人组织或细胞的溶解产物，或人组织的切片。

18.根据权利要求16所述的用途，其特征在于所述样品是新鲜人组织的切片，或冷冻的人组织，或冷冻的人组织的切片，或福尔马林固定的石蜡包埋的人组织，或福尔马林固定的石蜡包埋的人组织的切片。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的用途，其特征在于所述分析通过免疫化学，免疫荧光或免疫组织化学进行。

20.根据权利要求16至18中任一项所述的用途，其特征在于所述分析通过蛋白质印迹进行。