CN103571776B - 高耐胆盐能力的菌株及胆盐水解酶基因 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高耐胆盐能力的菌株及胆盐水解酶基因，菌株的保藏编号为CGMCCNo.8198，具有很强的耐酸、耐胆盐、硝酸盐还原等能力，并扩增出该菌株的三种胆盐水解酶基因，并对其进行了克隆、测序和异源表达，由此产生的胆盐水解酶具有很高的活性。本发明的菌株和胆盐水解酶可用于食品、医药、农业等领域，如用作食品及饲料发酵剂、微生态制剂、药物表达载体、饲料添加剂等，胆盐水解酶可用于开发为重组蛋白产品，亦可用作乳酸菌基因工程表达系统的筛选标记，用于乳酸菌菌种的分子改造。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及产胆盐水解酶的乳杆菌属的新菌株，以及该菌株分离得到的相关基因。
背景技术
益生菌是指当摄入一定数量，能以活菌状态到达胃肠道，通过调节肠道菌群组成，发挥对人体或动物健康起促进作用的单一或特定微生物的混合物。作为人和动物胃肠道内重要的生理性有益菌，益生菌具有维持胃肠道正常的微生态平衡、抑制病原菌的入侵与感染、增强机体免疫力、预防和抑制肿瘤发生、降低胆固醇以及抗氧化等作用。益生菌目前仍然以乳酸菌为主。
胆固醇存在于人和动物的血液、脊髓及脑中，正常人血清胆固醇含量为1.50-2.50g/L。研究表明，血清中胆固醇含量过高是引起动脉粥样硬化、冠心病、高血压等心脑血管疾病的重要因素。目前心脑血管疾病是引起人们死亡的主要杀手，而且逐年呈上升趋势。同时，人体总胆固醇浓度与膳食脂质摄入之间有着密切的关系，因此降低食品中胆固醇水平关系到人类的健康。
在肝脏中，胆固醇的主要去路是转变成胆酸，胆酸衍生的甘氨胆酸和牛磺胆酸是人类的主要胆汁酸，胆汁酸均以钠盐或钾盐形式存在，即胆汁酸盐，简称胆盐，具有促进脂类的消化与吸收和抑制胆汁中胆固醇析出的作用。胆汁酸可分为两类：一类是胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸和石胆酸等游离胆汁酸；另一类是游离胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合形成的结合胆酸，主要有甘氨胆酸，牛磺胆酸，甘氨鹅脱氧胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸，是人胆汁中的主要胆汁酸。
国内外一些研究表明，乳酸菌能够降低发酵食品和人体血清胆固醇的水平，尤以乳杆菌降低人体血液胆固醇水平的研究受到了越来越广泛的关注和重视。目前的研究证实，乳杆菌降低血液胆固醇水平与胆盐水解酶的存在有一定的关系。胆盐水解酶（Bilesalthydrolase，BSH）是微生物（主要是乳酸菌）生长、繁殖过程中产生的一种代谢物，它能水解结合形胆酸盐，将其转变成氨基酸和游离胆酸盐，造成吸收效率降低，从而使大量的游离胆酸盐从粪便中排出。胆固醇是形成胆酸的前体物质，排出体外的部分游离胆酸盐需要胆固醇的转化来弥补，从而加速了胆固醇的分解代谢，使胆固醇浓度的降低，促进血清中胆固醇水平的降低。
目前，针对微生物中胆盐水解酶的作用机理还没有确切的定论，大多是几种假设，主要是以吸收同化作用和共沉淀作用为主。但根据实验结果推测，乳酸菌降胆固醇的机理可能是由多种机制协同作用的结果。胆盐水解酶基因bsh编码区的调节在各个种属之间是有所差异的，BSH酶的大小、亚基组成、最适pH值、底物特异性及动力学性质等变化也较大。更有趣的是在有些菌株，如植物乳杆菌WCFS1中同时存在4个bsh同源基因，这对于研究bsh基因的功能具有重要的意义。因此，明确不同菌株或同一菌株不同BSHs的功能和作用机制对于揭示乳酸菌的耐胆盐作用机理及开发降胆固醇发酵乳制品具有重要的实用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供高耐胆盐能力的菌株，该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CGMCCNo.8198菌株，已于2013年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC），中国北京市朝阳区北辰西路1号院。
本发明还提供三种来自L.plantarumCGMCCNo.8198的胆盐水解酶(BSHs)及其基因bsh2、bsh3、bsh4。以L.plantarumCGMCCNo.8198基因组为模板，克隆三种bshs基因，连接到大肠杆菌表达载体pET22b中，并在E.coliRosetta(DE3)中诱导表达，所得到的三种胆盐水解酶具有相对很高的水解结合型胆酸盐的能力。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种高耐胆盐能力的菌株，所述菌株为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，保藏编号为CGMCCNo.8198，于2013年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC），地址，中国北京市朝阳区北辰西路1号院。
一种胆盐水解酶基因，基因序列如序列1所示。
一种胆盐水解酶基因，基因序列如序列2所示。
一种胆盐水解酶基因，基因序列如序列3所示。
一种胆盐水解酶基因组，包括如如序列1、2、3所示基因序列。
一种胆盐水解酶，由高耐胆盐能力的菌株发酵获得。
一种产胆盐水解酶的基因工程菌，包括胆盐水解酶基因组中任一基因。
上述工程菌发酵获得胆盐水解酶。
本发明的优点和积极效果如下：
1、本发明提供一种高耐胆盐能力的菌株，通过实验发现本菌株具有很强的硝酸盐还原能力和耐酸能力，在pH为5.0～8.0范围内均能较好的生长，在含有0.3%胆盐的MRS培养基中培养4h存活率仍能达到48.32%，属于具有很高的耐胆盐能力的菌株。
2、本发明还提供了该菌株的三种胆盐水解酶基因，并对其进行了克隆、测序和异源表达，由此产生的胆盐水解酶具有很高的活性。
3、本发明的菌株和胆盐水解酶可用于食品、医药、农业等领域，如用作食品及饲料发酵剂、微生态制剂、药物表达载体、饲料添加剂等，胆盐水解酶可用于开发为重组蛋白产品，亦可用作乳酸菌基因工程表达系统的筛选标记，用于乳酸菌菌种的分子改造。
附图说明
图1为本发明L.plantarumCGMCCNo.8198在不同浓度胆盐下的存活率；
图2为本发明三种胆盐水解酶在E.coliRosetta(DE3)中的诱导表达；
图3为本发明三种胆盐水解酶水解不同结合型胆盐的能力；
图4为本发明不同浓度胆盐对bsh2-4表达的调控。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
以下实施例分别从菌株的获得、该菌株胆盐水解酶基因的分离获得以及胆盐水解酶的表达三个方面来说明本发明的技术方案，具体内容如下：
一、L.plantarumCGMCCNo.8198的分离鉴定
以下实验均在无菌条件下操作。
1.菌株的富集
称取青贮饲料5g，加入20mL无菌生理盐水均质，将得到的匀浆适当稀释后取100μL涂布于含有0.3%猪胆盐的MRS平板上，37℃厌氧培养箱倒置培养36-72h，观察菌落生长状况。
2.菌株的分离
挑取1中的菌落，涂于载玻片上，革兰氏染色，观察菌体形态特征，选取革兰氏阳性菌作为目的菌株。
3.菌株的纯化
挑取2中所得的菌落在含有0.3%猪胆盐的MRS平板上划线，37℃厌氧培养24-36h，挑取单菌落镜检，直至所得的菌株为纯菌。
4.菌株的鉴定
对3中获得的纯菌进行生理生化实验研究，发现该菌具有很强的硝酸盐还原能力和耐酸能力，在pH为5.0～8.0范围内均能较好的生长。在含有0.3%胆盐的MRS培养基中培养4h存活率仍能达到48.32%（如图1所示），这在文献报道中，属于具有很高的耐胆盐能力的菌株。对该菌株进行16SrRNA鉴定，确定为乳杆菌属中的一株新的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，该菌株已于2013年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC），保藏号为CGMCCNo.8198，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院。在MRS琼脂培养基上生长30h，形成乳白色、圆形大菌落，边缘光滑，中央凸起，具有一定的黏性，属于兼性厌氧菌，在显微镜下观察革兰氏染色阳性，呈杆状。
该菌株在培养过程中使用MRS培养基。
二、L.plantarumCGMCCNo.8198的胆盐水解酶基因（bsh）的克隆表达
将已经获得的L.plantarumCGMCCNo.8198具有很高的耐胆盐能力，表明该菌株可以高产胆盐水解酶，从而将结合型胆盐水解，提高自己的存活率，本发明通过引物扩增出L.plantarumCGMCCNo.8198中的胆盐水解酶基因。
1.bsh基因的克隆
以GenBank中已公布的L.plantarumWCFS1(NC_004567.2)的胆盐水解酶基因为模板设计引物（如表1所示），以L.plantarumCGMCCNo.8198的基因组为模板，利用PCR扩增L.plantarumCGMCCNo.8198中相关的胆盐水解酶基因。PCR体系如表2所示，
扩增条件为：95℃，5min；95℃，30s；退火59℃，40s；72℃，1min，30个循环；72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳显示获得3个不同大小的DNA片段，分别命名为bsh2、bsh3和bsh4。
表1PCR引物序列
表225μLPCR反应体系
2.载体pET22b-bsh的构建
将基因片段bsh2、bsh3和bsh4分别连接到表达载体pET22b上，连接体系如表3所示，构建成表达载体pET22b-bsh2、pET22b-bsh3和pET22b-bsh4。16℃连接过夜，取10μL连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆提取质粒，用XhoI和BamHI进行双酶切验证，酶切体系如表4所示，验证正确后再将上述三个载体送往Invitrogen（北京）公司测序，结果如序列1.2.3所示，通过比较发现，本发明获得的基因与现有胆盐水解酶基因具有明显区别。
表3质粒构建连接体系
表4质粒双酶切验证体系
3.胆盐水解酶在大肠杆菌中的表达和分离纯化
将pET22b-bsh2、pET22b-bsh3和pET22b-bsh4分别转化E.coliRosetta(DE3)，在IPTG的诱导下大量表达胆盐水解酶BSH2、BSH3和BSH4（如图2所示），图2中第1道为未诱导的Rosetta-pET22b，第2道为诱导的Rosetta-pET22b，第3道为未诱导的Rosetta-pET22b-bsh2，第4道为诱导的Rosetta-pET22b-bsh2，第5道为未诱导的Rosetta-pET22b-bsh3，第6道为诱导的Rosetta-pET22b-bsh3，第7道为未诱导的Rosetta-pET22b-bsh4，第8道为诱导的Rosetta-pET22b-bsh4。诱导后的菌体超声破碎，离心取上清，利用镍柱亲和层析分离纯化三种蛋白。
上述三个基因工程使用LB普通培养基培养即可。
4.三种胆盐水解酶体外水解不同结合型胆盐的活力检测
在700μL的反应缓冲液（0.1M磷酸盐缓冲液，pH6.0）中加入100μL纯化后的胆盐水解酶，100μL结合型胆盐（终浓度10mM），100μL液体石蜡，混合物在37℃反应30min后加入200μL15%的三氯乙酸终止反应。15000g离心10min，取上清即为反应样品，利用高效液相色谱检测反应样品中的氨基酸产量。1个单位的胆盐水解酶活力定义为1分钟内水解底物产生1nM氨基酸所需要的酶。氨基酸的检测采用2,4-二硝基氟苯柱前衍生法，检测波长360nm，流速1mL/min，进样量20μL，流动相为0.05M的乙酸钠和50%的乙腈。上述反应采用的结合型胆盐为甘氨脱氧胆酸钠(GDCA)和牛磺脱氧胆酸钠(TDCA)，相对酶活为每毫克纯的胆盐水解酶1分钟内水解底物产生的氨基酸的量，结果如图3所示。三种胆盐水解酶对GDCA和TDCA都有很高的水解能力，以BSH2水解GDCA的能力最为突出。上述结果表明L.plantarumCGMCCNo.8198本身高耐胆盐的能力是由它所产生的胆盐水解酶发挥作用的。
三、不同浓度的胆盐对L.plantarumCGMCCNo.8198胆盐水解酶表达的影响
本发明采用RT-PCR的方法研究L.plantarumCGMCCNo.8198胆盐水解酶的表达是否受生长环境影响。结果发现在L.plantarumCGMCCNo.8198的培养基中添加胆盐，会上调bsh基因的表达，而且对胆盐具有浓度依赖性。以第二部分克隆获得的三个胆盐水解酶基因bsh2、bsh3和bsh4为模板，设计RT-PCR引物（引物序列如表5）。
表5RT-PCR引物序列
L.plantarumCGMCCNo.8198生长到对数生长期时，加入不同浓度的胆盐（0%，0.1%，0.2%，0.3%）,继续培养16h，收集菌体，提取总的RNA，逆转录成cDNA。选取16SrRNA作为内标基因，引物序列如表5中的P13和P14。以cDNA为模板，bsh2的引物为P7和P8，bsh3的引物为P9和P10，bsh4的引物为P11和P12，进行PCR扩增，结果如图4所示。随着胆盐浓度的增加，bsh2-4的表达量不断增加，尤以bsh2和bsh3的表达量较高，说明胆盐能够上调bsh基因的表达，而且具有浓度依赖性。
Claims (1)
1.一种高耐胆盐能力的菌株，其特征在于：所述菌株为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，保藏编号为CGMCCNo.8198，于2013年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址，中国北京市朝阳区北辰西路1号院。
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