CN103402527A - 用于细胞移植的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于细胞移植的组合物和方法。特别地，本发明提供了包含促凝血细胞和至少一种抗凝血酶活化剂(优选为未分级肝素)以及至少一种凝血酶抑制剂(优选为比伐卢定)的组合物。
Description
技术领域
本发明一般性涉及组织再生并且特别是细胞移植领域。本发明涉及用于改进细胞移植并且特别是抑制与细胞移植相关之促凝血(procoagulant)活性的组合物和方法。
背景技术
由患病或者以另外方式损伤的或功能受损的器官引起的多种病症可以通过器官移植来治疗。特别地，心脏、肾、肝、肺、胰腺、肠和胸腺的移植可常规地进行并具有合理的成功率。然而，器官移植的一个主要缺点仍然是需要为每个受体患者寻找相容性供体，因为供体与受体之间的不相容性可导致所移植器官的排斥。可以通过血清分型确定最合适的供体-受体匹配以及通过使用免疫抑制药物来减轻移植排斥，但这些方法的适用性可因为一些情况下的医疗紧急性而降低。此外，免疫抑制药物的终身使用在副作用和顺应性方面给受体患者造成负担。
近年来，使用多种来源之细胞的细胞治疗越来越多地用于人类再生医学。细胞移植可以为器官移植提供有价值的替代疗法或附加(辅助)疗法。此外，因为并非所有器官都可以被有效地移植，所以细胞移植常常可能是唯一可用的治疗。有利地，在细胞移植中，相容性相关的并发症至少可以在理论上造成的问题更小。例如，待移植细胞有时可以分离自或源自患者自身(即，自体细胞移植)，从而降低排斥的风险。或者，同种异体或者甚至异种移植细胞可以被容易地分型(typed)并且在细胞银行或库存中储存较长时间，从所述细胞银行或库存中可以获得对大多数受体而言基因匹配或者至少可相容的细胞。
在考虑向患者施用细胞时，可优选选择细胞或细胞培养物以使得患者与所施用细胞之间的组织相容性最大化，从而减少患者的免疫系统排斥所施用细胞(移植物抗宿主排斥)的可能性。例如，有利地，通常可以选择这样的细胞：其具有与患者相同的HLA单元型(包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-D、HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ中的一种或优选更多种；优选一种或者优选全部的HLA-A、HLA-B和HLA-C)，或者其与患者共有最多的HLA抗原等位基因并且不具有或具有最少的以下HLA抗原：患者中含有的预先存在之抗HLA抗体针对所述HLA抗原。
通过细胞移植进行的组织再生过程可以通过使用多种细胞来源来实施，并且通常使用具有增殖能力的细胞。例如，在多种人先天性代谢疾病中，肝细胞移植可以恢复至少一些程度的代谢控制。在另一个实例中，胰岛的经门静脉移植在1型糖尿病中提供改善的血糖控制和胰岛素非依赖性。例如，可以使用能够分化成大量细胞品系的多能干细胞，或者发展为一种或几种细胞品系(多潜能)并且表现出不同分化程度的祖细胞作为细胞来源用于细胞移植。
尽管在临床上取得了一些成功，但是当前的细胞移植疗法仍需进一步改进。临床医生和卫生部门的一个担忧是某些移植细胞的促凝血活性对细胞植入的潜在影响以及其它并发症。例如，已报道胰岛移植物的促凝血活性导致移植物损失和经门静脉血栓性事件(Beuneu等.Diabetes.，2004，第53卷，1407-11；Moberg等.Lancet，2002，第360卷，2039-45)。在分离的原代肝细胞中也观察到了促凝血活性(Stéphenne等.Liver Transpl.，2007，第13卷，599-606)。
因此，在本领域中，仍亟需提高细胞移植成功率和细胞植入潜力，特别是减轻与细胞移植相关的促血栓性并发症。
Furlani等.Microvasc Res.，2009，第77卷，370-6利用活体显微镜检查研究了静脉内施用入SCID小鼠提睾肌血管后人间充质干细胞的动力学。作者提出，因为细胞的相对大的尺寸，动脉内间充质干细胞输注可导致远端血管闭塞，这是。
发明概述
在进行了大量体外和临床评价之后，本发明人了解到，在干细胞和祖细胞(例如间充质干细胞)中也观察到了之前报道的分离的原代细胞(例如肝细胞和胰岛细胞)的促凝血活性。干细胞和祖细胞的促凝血活性可成为移植这些细胞的担忧之处，特别是可导致非期望的血流改变、移植细胞损失、细胞植入潜力下降和/或血栓性事件。此外，用于肝细胞移植的常规抗凝剂未分级肝素(unfractionated heparin)无法控制该促凝血活性。
因此，本发明人研究了用以抵消移植细胞的促凝血活性的方式，并且发现具有促凝血活性的细胞与抗凝血酶活化剂和凝血酶抑制剂的伴随(concomitant)或者关联(associated)施用为预防有害的促凝血作用提供了特别有效且安全的组合。出乎意料地，尽管具有促凝血活性的细胞与单独的抗凝血酶活化剂或凝血酶抑制剂(抗凝血酶活化剂或凝血酶抑制剂分别为生理可接受浓度)之一的伴随施用不能充分地预防血栓性事件，但抗凝血酶活化剂与凝血酶抑制剂的组合可以有利地预防细胞治疗诱发的血栓形成和血栓形成相关并发症(例如，局部血栓形成和局部炎症的诱发)。因此，本发明人实现了可用于降低移植细胞(特别是干细胞和祖细胞)的促凝血活性的特别有利并且甚至是协同的组合疗法和临床方案。
因此，一个方面涉及组合，该组合包含具有促凝血活性的细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂。
另一个方面涉及组合，该组合包含至少一种抗凝血酶活化剂；至少一种凝血酶抑制剂；和细胞，所述细胞选自包含以下或由以下组成的组：成体肝祖细胞、间充质干细胞(优选骨髓间充质干细胞)、皮肤成纤维细胞和肝脏肌成纤维细胞(liver myofibroblast)，更优选地选自成体肝祖细胞和肝脏肌成纤维细胞。
适当时，该组合可以配置为细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂以任意顺序的分开、同时或依次施用。此外，在所述组合中，细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和/或至少一种凝血酶抑制剂可以是混合的或者可以是分开的。还公开了用于生产所述组合的方法，其包括将所述细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂相组合。
在本说明书全文中，当提及包含如本文所述的细胞(例如，特别是具有促凝血活性的细胞)、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂的组合时，或者当提及包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂的组合时，或者当提及包含或使用这样的组合的任意主题时，旨在表示该组合的各组分可以配置用于以任意顺序分开、同时或依次施用于对象，或者可以以任意顺序分开、同时或依次施用于对象。在一个实例中，细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂都可包含在待施用的细胞悬液中。在另一个实例中，细胞和至少一种抗凝血酶活化剂可包含在待施用的细胞悬液中，而至少一种凝血酶抑制剂可与所述细胞悬液分开放置，并且将与所述细胞悬液同时或依次地施用于对象。在另一个实例中，细胞与至少一种凝血酶抑制剂可包含在待施用的细胞悬液中，而至少一种抗凝血酶活化剂可与所述细胞悬液分开放置，并且将与所述细胞悬液同时或依次地施用于对象。在另一个实例中，至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂二者都可与所述细胞悬液分开放置，并且将与所述细胞悬液同时或依次地并且与彼此同时或依次地施用于对象。当依次施用组分时，应理解，应选择施用时间以使得它们的组合带来组分的期望作用。
还公开了药物组合物，其包含：(a)组合，该组合包含具有促凝血活性的细胞、至少一种抗凝血酶活化剂、至少一种凝血酶抑制剂，和(b)一种或更多种可药用赋形剂。
还公开了药物组合物，其包含：(a)组合，该组合包含至少一种抗凝血酶活化剂、至少一种凝血酶抑制剂和细胞，所述细胞选自包含以下或者由以下组成的组：成体肝祖细胞、间充质干细胞(优选骨髓间充质干细胞)、皮肤成纤维细胞和肝脏肌成纤维细胞，所述细胞更优选地选自成体肝祖细胞和肝脏肌成纤维细胞，和(b)一种或更多种可药用赋形剂。
该药物组合物可以配置用于所述细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂以任意顺序的分开、同时或依次施用。在所述药物组合物中，细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和/或至少一种凝血酶抑制剂可以是混合的或者可以是分开的。还公开了用于生产所述药物组合物的方法，该方法包括将细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂(每种分开的或者混合的)与一种或更多种可药用赋形剂混合。
还提供了成套的部件(kit of parts)或制品(article of manufacture)，其包含组合，并且任选地还包含一种或更多种可药用赋形剂，所述组合包含具有促凝血活性的细胞、至少一种抗凝血酶活化剂，和至少一种凝血酶抑制剂。
还提供了成套的部件或制品，其包含组合，并且任选地还包含一种或更多种可药用赋形剂，所述组合包含至少一种抗凝血酶活化剂、至少一种凝血酶抑制剂以及细胞，所述细胞选自包含以下或者由以下组成的组：成体肝祖细胞、间充质干细胞(优选骨髓间充质干细胞)、皮肤成纤维细胞和肝脏肌成纤维细胞，所述细胞更优选地选自成体肝祖细胞和肝脏肌成纤维细胞。
该成套的部件或制品可以配置为细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂以任意顺序分开、同时或依次施用。在所述成套的部件或制品中，细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和/或至少一种凝血酶抑制剂可以是混合的或者可以是分开的，特别地可以是分开的(例如包含在分开的容器中)。还公开了用于生产所述成套的部件或制品的方法，该方法包括将细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂以及任选的一种或更多种可药用赋形剂包含在成套的部件或制品中。还提供了用于本文所述任一种和每一种适应症中的成套的部件或制品。
还公开了以下方面中的任一个和每一个：
-组合，其包含具有促凝血活性的细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂，该组合用作药物；
-组合，其包含至少一种抗凝血酶活化剂、至少一种凝血酶抑制剂和细胞，所述细胞选自包含以下或者由以下组成的组：成体肝祖细胞、间充质干细胞(优选骨髓间充质干细胞)、皮肤成纤维细胞和肝脏肌成纤维细胞，所述细胞更优选地选自成体肝祖细胞和肝脏肌成纤维细胞，该组合用作药物；
-组合，所述组合包含如本文所述的任意细胞(例如，特别是具有促凝血活性的细胞)、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂；或者，药物组合物，所述药物组合物包含所述组合和一种或更多种可药用赋形剂，其用于所述细胞的移植；
-组合在制备用于如本文所述的任意细胞(例如，特别是具有促凝血活性的细胞)之移植的药物中的用途，所述组合包含所述细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂；
-组合，所述组合包含如本文所述的任意细胞(例如，特别是具有促凝血活性的细胞)、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂；或者，药物组合物，所述药物组合物包含所述组合和一种或更多种可药用赋形剂，其用于治疗血栓形成或血栓性并发症，特别是由所述细胞的移植引起的血栓形成或血栓性并发症；
-组合在制备用于治疗血栓形成或血栓性并发症(特别是由如本文所述的任意细胞(例如，特别是具有促凝血活性的细胞)的移植引起的血栓形成或血栓性并发症)的药物中的用途，所述组合包含所述细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂；
-组合，所述组合包含如本文所述的任意细胞(例如，特别是具有促凝血活性的细胞)、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂，或者，药物组合物，所述药物组合物包含所述组合和一种或更多种可药用赋形剂，其用于在体内抑制所述细胞的促凝血活性；
-组合在制备用于在体内抑制如本文所述的任意细胞(例如，特别是具有促凝血活性的细胞)的促凝血活性的药物中的用途，所述组合包含所述细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂；
-组合在体外抑制如本文所述的任意细胞(例如，特别是具有促凝血活性的细胞)的促凝血活性中的用途，所述组合包含所述细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂；
-用于在体外抑制如本文所述的任意细胞(例如，特别是具有促凝血活性的细胞)的促凝血活性的方法，该方法包括提供包含所述细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂的组合；
-用于将如本文所述的任意细胞(例如，特别是具有促凝血活性的细胞)移植到需要该移植的对象中的方法，该方法包括向所述对象施用治疗或预防有效量的组合或药物组合物，所述组合包含所述细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂；所述药物组合物包含所述组合和一种或更多种可药用赋形剂；
-用于在需要此治疗的对象中治疗血栓形成或血栓性并发症(特别是由如本文所述的任意细胞(例如特别是具有促凝血活性的细胞)引起的血栓形成或血栓性并发症)的方法，该方法包括向所述对象施用治疗或预防有效量的组合或药物组合物，所述组合包含所述细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂，所述药物组合物包含所述组合和一种或更多种可药用赋形剂；
-用于在需要此抑制的对象体内抑制细胞(例如，如本文所述的任意细胞)的促凝血活性的方法，该方法包括向所述对象施用治疗或预防有效量的组合或药物组合物，所述组合包含所述细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂，所述药物组合物包含所述组合和一种或更多种可药用赋形剂。
还提供了组合在任一种和每一种上述适应症中的用途，所述组合包含如本文所述的任意细胞(例如，特别是具有促凝血活性的细胞)、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂。
另一个方面涉及组合，所述组合包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂。适当时，该组合可配置用于至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂以任意顺序的分开、同时或依次施用。此外，在所述组合中，至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂可以是混合的或者可以是分开的。还公开了用于生产所述组合的方法，其包括将至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂相组合。
还公开了药物组合物，该药物组合物包含组合和一种或更多种可药用赋形剂，所述组合包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂。该药物组合物可配置用于至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂以任意顺序的分开、同时或依次施用。在所述药物组合物中，至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂可以是混合的或者可以是分开的。还公开了用于生产所述药物组合物的方法，该方法包括将至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂(每种分开或混合)与一种或更多种可药用赋形剂混合。
还提供了成套的部件或制品，其包含组合，并且任选地还包含一种或更多种可药用赋形剂，所述组合包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂。该成套的部件或制品可配置用于至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂以任意顺序的分开、同时或依次施用。在所述成套的部件或制品中，至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂可以是混合的或者可以是分开的，特别地可以是分开的(例如包含在分开的容器中)。还公开了用于生产所述成套的部件或制品的方法，该方法包括将至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂以及任选的一种或更多种可药用赋形剂包含在成套的部件或制品中。还提供了用于任一种和每一种本文所述适应症的成套的部件或制品。
还公开了任一个和每一个以下方面：
-组合，其包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂，该组合用作药物；
-组合，所述组合包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂；或者，药物组合物，所述药物组合物包含所述组合和一种或更多种可药用赋形剂，其用于具有促凝血活性的细胞的移植(即与细胞移植联合)；
-组合，所述组合包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂；或者，药物组合物，所述药物组合物包含所述组合和一种或更多种可药用赋形剂，其用于选自包含以下或者由以下组成的组中的细胞的移植：成体肝祖细胞、间充质干细胞(优选骨髓间充质干细胞)、皮肤成纤维细胞、和肝脏肌成纤维细胞，所述细胞更优选地选自成体肝祖细胞和肝脏肌成纤维细胞(即，与细胞移植联合)；
-组合在制备用于如本文所述的任意细胞(例如特别是具有促凝血活性的细胞)之移植的药物中的用途，所述组合包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂；
-组合，所述组合包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂；或者药物组合物，所述组合物包含所述组合和一种或更多种可药用赋形剂，其用于治疗血栓形成或血栓性并发症，特别是由如本文所述的任意细胞(例如，特别是具有促凝血活性的细胞)的移植引起的血栓形成或血栓性并发症；
-组合在制备用于治疗血栓形成或血栓性并发症(特别是由如本文所述的任意细胞(例如特别是具有促凝血活性的细胞)之移植引起的血栓形成或血栓性并发症)的药物中的用途，所述组合包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂；
-组合，所述组合包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂；或者药物组合物，所述药物组合物包含所述组合和一种或更多种可药用赋形剂，其用于在体内抑制细胞(例如，如本文所述的任意细胞)的促凝血活性；
-组合在制备用于在体内抑制细胞(例如，如本文所述的任意细胞)的促凝血活性的药物中的用途，所述组合包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂；
-组合在体内抑制细胞(例如，如本文所述的任意细胞)的促凝血活性中的用途，所述组合包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂；
-用于在体外抑制如本文所述的任意细胞(例如，特别是具有促凝血活性的细胞)的促凝血活性的方法，该方法包括使所述细胞与包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂的组合相接触；
-用于在需要此治疗的对象中治疗血栓形成或血栓性并发症(特别是由如本文所述的任意细胞(例如特别是具有促凝血活性的细胞)之移植引起的血栓形成或血栓性并发症)的方法，该方法包括向所述对象施用治疗或预防有效量的组合或药物组合物，所述组合包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂，所述药物组合物包含所述组合和一种或更多种可药用赋形剂；
-用于在需要此抑制的对象体内抑制细胞的促凝血活性的方法，该方法包括向所述对象施用治疗或预防有效量的组合或药物组合物，所述组合包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂；所述药物组合物包含所述组合和一种或更多种可药用赋形剂。
-优选地，任意上述方法可包括以下步骤：(a)在包含至少一种抗凝血酶活化剂的水溶液中制备包含如本文所述之细胞(例如，特别是具有抗凝血活性的细胞)的细胞悬液的组合物；(b)制备包含至少一种凝血酶抑制剂的水溶液(即，区分于或独立于组合物(a))；和(c)向对象同时、分开或依次施用如(a)中所定义的组合物和如(b)中所定义的溶液。因此，优选地，在上述方面中，(a)制备在包含至少一种抗凝血酶活化剂的水溶液中包含如本文所述之细胞(例如，特别是具有促凝血活性的细胞)的细胞悬液的组合物；(b)制备包含至少一种凝血酶抑制剂的水溶液(即，区分于或独立于组合物(a))；和(c)将如(a)中所定义的组合物和如(b)中所定义的溶液同时、分开或依次施用于对象。
还提供了包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂的组合在任一种和每一种上述适应症中的用途。
还提供了装置(arrangement)，该装置包含用于将组合物施用于对象的手术器械或设备，例如，全身地，局部地(topically)，施用于器官或组织(例如，肝的门静脉、脾、胰腺、肝、肾包膜(kidney capsule)、腹膜和网膜陷凹(omental pouch))内，并且还包含组合或药物组合物，所述组合或药物组合物包含如本文所述之细胞例如特别是如本文所教导的促凝血细胞，其中所述装置适于例如全身地，局部地，于器官或组织内施用所述组合或药物组合物。例如，合适的手术器械可能够将包含本文所教导的组合或药物组合物之液体组合物例如全身地，局部地，于器官或组织内注射。
在本说明书全文中，具有促凝血活性的细胞旨在包括任何能够激活凝血级联并且诱导凝结或凝块形成的细胞。促凝血活性可以方便地使用任何已知的凝血测试来确定，例如但不限于血栓弹力测定(thromboelastometry)。
例如，当在标准血栓弹力测定测试中，与未添加细胞的阴性对照相比，细胞表现出显著更短的凝血时间(clottingtime，CT)(p＜0.05作为合适的统计显著性检验)时，就本发明的意义而言，可表示细胞具有促凝血活性。而血栓弹力测定代表标准实验室技术，为了进行进一步指导，用于测试如本文所述之细胞的促凝血性质的适当血栓弹力测定可如下进行：
测量在
德尔塔分析仪(delta analyzer)(Pentapharm，Munich，Germany)上进行。
实时评定凝块形成和凝块溶解的动力学和性质。凝血时间(CT)被定义为从开始分析直至开始形成凝块，直至达到2mm的振幅(amplitude)的时间。在短暂的休止期之后，将300μl的全血吸取至在37℃预热的杯(cup)中。随后向全血中添加悬浮细胞(5×10exp5)(阴性对照：相等体积的没有任何悬浮细胞的悬浮介质)。将20μl包含组织因子(TF)的触发剂(在Owren缓冲剂(例如可得自Clin-Tech Ltd，UK)中稀释，最终稀释度为1：17000／0.35pM)(例如，Innovin，Siemens，Marburg，Germany)添加到细胞-血液混合物中，接着添加20μl的0.2M CaCl2。在加入钙后，测量自动开始。如果在1800秒后未观察到凝结，则停止血栓弹力测定。
在本文中，如本文所述的细胞(例如，特别是具有促凝血活性的细胞)可以为任何来源和/或分化状态的。优选地，如本文所述的细胞(例如，具有促凝血活性的细胞)选自干细胞和祖细胞。更优选地，如本文所述的细胞(例如，具有促凝血活性的细胞)是间充质干细胞。还优选地，如本文所述的细胞(例如，具有促凝血活性的细胞)是成体肝来源的祖细胞或干细胞。
在一个实施方案中，如本文所述的细胞(例如，具有促凝血活性的细胞)是在WO2007／071339中一般性描述的成体来源的人肝干细胞；更特别地，如其中所述，表达α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)和白蛋白(ALB)并且不表达细胞角蛋白-19(CK-19)的来源于成体肝的人祖细胞或干细胞；甚至更特别地，如其中所述，表达CD90、CD73、CD44、波形蛋白、ASMA和ALB并且任选地表达CYP3A4并且不表达CK-19的来源于成体肝的人祖细胞或干细胞；还更特别地，如Najimi等，Cell Transplant，2007，第16卷，717-28所述的成体来源的人肝干细胞(ADHLSC)；并且仍更特别地，根据布达佩斯条约由WO2007／071339的申请人在2006年2月20日以登记号LMBP6452CB保藏在比利时微生物合作保藏中心(BelgianCoordinated Collections of Microorganisms(BCCM／LMBP))的细胞。
在一个实施方案中，如本文所述的细胞(例如，具有促凝血活性的细胞)是在WO2006／126236中一般性描述的非卵圆(non-oval)成体人肝来源的多能祖细胞；更特别地，从成体组织分离的表达肝细胞标志物并且能够分化为成熟肝细胞、胰岛素产生细胞、成骨细胞和上皮细胞的非卵圆人肝多能祖细胞系，或者还特别地，如其中所述，从成体组织分离的表达肝细胞标志物并且能够分化为成熟肝细胞、胰岛素产生细胞、成骨细胞和内皮细胞的非卵圆人肝多能祖细胞系；甚至更特别地，如Herrera等，StemCells，2006，第24卷，2840-50所述的人肝干细胞(HLSC)。
不希望受任何理论约束，认为具有促凝血活性的细胞表达的组织因子(也称为血小板组织因子，因子III，凝血酶原激酶或CD142)至少是所述细胞的促凝血活性的部分原因(参见，例如，Beuneu等，2004，Moberg等，2002和Stéphenne等，2007，见上文)。因此，在一个实施方案中，具有促凝血活性的细胞表达组织因子。
本发明人还发现，如本文所使用的特别优选的促凝血细胞可以包含不依赖于由细胞的组织因子(TF)表达的促凝血活性组分。更特别地，如通过因子VII缺乏型血浆的血栓弹力测定所测量的，或者如当TF活性受阻时(例如通过用抗-TF抗体预孵育细胞)通过血液或正常血浆的血栓弹力测定所测量的，这样的促凝血细胞将至少部分地(例如，仅部分地或全部地)保留其促凝血活性。不希望受理论约束，因子VII缺乏型血浆中细胞的可测量促凝血活性也可以至少部分地与残留的少量因子VII相关。
本发明人还发现，如本文所使用的特别优选的促凝血细胞可包含对肝素有抗性的促凝血活性组分。更特别地，如在仅存在肝素时(即，在不存在凝血酶活化剂的情况下)通过血栓弹力测定所测量的(例如特别地在未分级肝素、依诺肝素(enoxaparin)或磺达肝素(fondaparinux)的存在下，特别地浓度分别为10UI／ml、1UI／ml和0.34mg/l时)，这样的促凝血细胞至少部分地(例如，仅部分地或全部地)保留其促凝血活性。因此，在另一些优选的实施方案中，如本文所使用的促凝血细胞可包含不依赖于细胞的组织因子(TF)表达的促凝血活性组分，并且可包含对肝素有抗性的促凝血活性组分。
在本说明书全文中，抗凝血酶活化剂旨在包括任何能够增加抗凝血酶与其任意一种或更多种靶标的结合的试剂。
在一个实施方案中，抗凝血酶活化剂选自未分级肝素和低分子量肝素，优选为未分级肝素。
在本说明书全文中，凝血酶抑制剂意为能够直接与凝血酶结合并且抑制或防止凝血酶介导的纤维蛋白原活化的试剂。
在一个实施方案中，凝血酶抑制剂选自比伐卢定(bivalirudin)和水蛭素(hirudin)，优选为比伐卢定。有利地，比伐卢定具有约35分钟至约40分钟的较短半衰期，从而使得对象迅速恢复到正常止血状态。
本发明的上述和其它方面、优选的实施方案和特征描述于下述章节和所附权利要求书中。除非有清楚的相反说明，否则本文所述的每个方面、实施方案或特征可与任何其它方面、实施方案或特征组合。特别地，本文所指出的任何特征，并且特别是指出优选或有利的任何特征可与本文所指出的任何其它特征、并且特别是指出优选或有利的任何其它特征组合。所附权利要求书的主题由此特别地并入本说明书中。
附图简述
图1.在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白中的细胞的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加以及不添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。Hep：肝细胞(白色)，ALDSC：成体来源的人肝间充质干细胞(黑色)，A：5％人白蛋白。ALDSC相比于肝细胞：Mann-Whitney检验＊p＜0.05；ALDSC相比于肝细胞相比于对照：Kruskal-Wallis检验＊＊＊p＜0.001。
图2.在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白和10UI／ml肝素(hepar)中的细胞的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。Hep：肝细胞(白色)，ALDSC：成体来源的人肝间充质干细胞(黑色)，A：5％人白蛋白。ALDSC相比于肝细胞：Mann-Whitney检验＊＊p＜0.01；ALDSC相比于肝细胞相比于对照：Kruskal-Wallis检验＊＊＊p＜0.001。
图3.在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白和肝素(hepar)(10-50-100UI／m1)中的细胞的情况下，将柠檬酸化全血孵育30分钟后获得的血浆(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。Hep：肝细胞(白色)，ALDSC：成体来源的人肝间充质干细胞(黑色)，A：5％人白蛋白。
图4.在存在或不存在细胞的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加以及不添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。Hep：肝细胞(白色)，ALDSC：成体来源的人肝间充质干细胞(黑色)，A：5％人血白蛋白，hir、hir2、hir5：在临床上使用的弹丸浓度(bolus concentration)(0.4mg／kg)的1倍、2倍、5倍的水蛭素；hepar：在细胞悬液中10UI／ml的肝素；对照：全血。
图5.在存在或不存在细胞的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加以及不添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。Hep：肝细胞(白色)，ALDSC：成体来源的人肝间充质干细胞(黑色)，A：5％人白蛋白，biv，biv2：在临床上使用的弹丸浓度(0.75mg/kg)的1倍、2倍的比伐卢定；hepar：在细胞悬液中10UI/ml的肝素；对照：全血。ALDSC相比于ALDSC biva：Mann-Whitney检验＊＊p＜0.01；A相比于ALDSC biva：Mann-Whitney检验＊＊p＜0.01；ALDSC biva相比于ALDSC biva hepar：Mann-Whitney检验＊＊p＜0.01；ALDSC hepar相比于ALDSC biva hepar：Mann-Whitney检验＊＊＊p＜0.001；ALDSC相比于ALDSC biva相比于ALDSC biva hepar：Kruskal-Wallis检验＊＊＊p＜0.001。
图6.在存在或不存在细胞的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(不添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。Hep：肝细胞(白色)，ALDSC：成体来源的人肝间充质干细胞(黑色)，BMMC：骨髓间充质干细胞，BMHC：骨髓造血干细胞，A：白蛋白。ALDSC相比于肝细胞：Mann-Whitney检验＊p＜0.05；A相比于ALDSC：Mann-Whitney检验＊＊＊p＜0.001。
图7.在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白和10UI/ml肝素(hepar)中的骨髓造血干细胞的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。
图8.通过常规RT-PCR评价的ALDSC中组织因子和组织因子途径抑制因子(TFPI)的mRNA表达。X＝ALDSC细胞；H＝肝细胞；P＝PBMC；C＝阴性对照；TF＝组织因子(第一组引物)；TF’＝组织因子(第二组引物)；TFPI＝组织因子途径抑制因子；GAPDH＝甘油醛3-磷酸脱氢酶(技术对照)。
图9.通过实时PCR评价的ALDSC的组织因子mRNA(TF和as-TF)和TFPI表达。ALDSC(X)细胞和肝细胞中TF基因(A)、替换剪接形式as-TF(B)和TFPI基因(C)mRNA的半定量表达。CAPAN-2细胞和HUVEC分别为TF、asTF和TFPI的阳性对照。
图10.(A)在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白中的细胞的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。如果不存在复钙，则不诱发凝血。肝细胞(白色)，hALPC(黑色)，对照(白蛋白)(灰色)。肝细胞相比于hALPC，p＜0.001；肝细胞相比于对照p＜0.001；hALPC相比于对照，p＜0.01；hALPC相比于肝细胞相比于对照：Kruskal-Wallis检验，＊＊＊p＜0.001。(B)由在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白中的细胞的情况下孵育的血液获得的血浆(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。肝细胞(白色)，hALPC(黑色)，对照(白蛋白)(灰色)。肝细胞相比于hALPC，p＜0.05；肝细胞相比于对照，p＜0.01；hALPC相比于对照，p＜0.01；hALPC相比于肝细胞相比于对照：Kruskal-Wallis检验＊＊＊p＜0.001。当未添加Innovin时，血液和血浆中的细胞(肝细胞和hALPC)的促凝血活性(PCA)相当。
图11.在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白中的细胞的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(不添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。如果不存在复钙，则不诱发凝血。肝细胞(白色)，hALPC(黑色)。
图12.在存在hALPC培养上清液的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。如果不存在复钙，则不诱发凝血。
图13.在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白中的hALPC、肝细胞、皮肤成纤维细胞、骨髓间充质干细胞(BMMSC)、骨髓造血干细胞(BMHSC)、肝脏肌成纤维细胞的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。成纤维细胞相比于对照，p＜0.01；BMMSC相比于对照，p＜0.01；肝脏肌成纤维细胞相比于对照，p＜0.01。
图14.在悬浮于5％人白蛋白中的细胞的存在下，缺乏凝血因子VII、V、X和II(7d Pl、5d Pl、10d Pl、2d Pl)的血浆(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。hALPC(黑色)，对照(白蛋白)(灰色)。Nl pl(正常血浆)相比于7d Pl，p＜0.01；7d Pl相比于对照，p＜0.01；Nl Pl相比于5d Pl，p＜0.01；Nl Pl相比于10d Pl，p＜0.001；Nl Pl相比于2d Pl，p＜0.001。
图15.(A)在存在或不存在悬浮于含有肝素(Hepar)之5％人白蛋白中的hALPC的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。相对地(at contrario)，将依诺肝素(Eno)或磺达肝素(Fond)即时(extemporaneously)添加到血液中与悬浮在白蛋白中的细胞相接触。hALPC(黑色)，对照(白蛋白)(灰色)。＊与hALPC相比较。f与对照相比较。(B)在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白中的hALPC的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μL))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。将比伐卢定(Biva)或水蛭素(Hir)即时添加到血液中。hALPC(黑色)，对照(白蛋白)(灰色)。＊与hALPC相比较。f与对照相比较。(C)在存在或不存在悬浮于含有肝素(Hepar)之5％人白蛋白中的肝细胞的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μL))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。相对地，将依诺肝素(Eno)或磺达肝素(Fond)即时添加到血液中与悬浮在白蛋白中的细胞相接触。肝细胞(白色)，对照(白蛋白)(灰色)。＊与肝细胞相比较。f与对照相比较。(D)在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白中的肝细胞的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μL))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。将比伐卢定(Biva)或水蛭素(Hir)即时添加到血液中。肝细胞(白色)，对照(白蛋白)(灰色)。＊与肝细胞相比较。f与对照相比较。
图16.(A)在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白(其含有即时添加到血液中的肝素(Hepar)或依诺肝素(Eno)或磺达肝素(Fond))中的hALPC的情况下，柠檬酸盐全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。当将比伐卢定(Biva)即时添加到血液中时，获得抗凝血药物的组合。hALPC(黑色)，对照(白蛋白)(灰色)。＊与hALPC相比较。f与对照相比较。$与比卢伐定相比较。(B)在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白(其含有即时添加到血液中的肝素(Hepar)或依诺肝素(Eno)或磺达肝素(Fond))中的肝细胞的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。当将比伐卢定(Biva)即时添加到血液中时，获得抗凝血药物的组合。肝细胞(白色)，对照(白蛋白)(灰色)。＊与肝细胞相比较。f与对照相比较。$与比卢伐定相比较。
图17.对置于盖玻片上并用多聚甲醛固定的hALPC(A)上进行的针对TF的免疫荧光(放大倍数20×)。细胞核通过DAPI显色(染成蓝色)。(B)阴性对照(没有一抗)。
图18.通过常规RT-PCR评价的hALPC和肝细胞中组织因子和组织因子途径抑制因子(TFPI)的mRNA表达。组织因子(TF)，替换剪接的组织因子(asTF)，组织因子途径抑制因子(TFPI)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(技术对照)。
图19.采用实时PCR评价的hALPC和肝细胞中组织因子mRNA(TF和as-TF)和TFPI的表达。hALPC细胞和肝细胞中TF基因(A)、替换剪接形式的as-TF(B)和TFPI基因(C)的mRNA半定量表达。CAPAN-2细胞和HUVEC分别为TF、asTF和TFPI的阳性对照。
图20.在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白中的细胞(细胞经TF抗体孵育(TF+)或者未经TF抗体孵育(TF-))的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。肝细胞(白色)，hALPC(黑色)，对照(白蛋白)(灰色)。hALPC TF-相比于hALPC TF+，p＜0.01；肝细胞TF-相比于肝细胞TF+，p＜0.01；hALPC TF+相比于对照，p＜0.001；肝细胞相比于对照，不显著。
图21.将悬浮于补充有或未补充肝素(Hepar)(10UI/ml、50UI/ml和100UI/ml)的白蛋白中的细胞在血液中孵育30分钟后，测量在血液离心之后获得的血浆的抗Xa活性(UI/ml)。hALPC(黑色)，肝细胞(Hep)(白色)，对照(灰色)。
图22.在细胞输注过程中，患者接受比伐卢定(1.75mg/kg)。在连续的细胞输注之间，剂量在2小时到4小时内降低至0.25mg/kg。在每次输注开始前，开始20分钟后和结束时重复进行凝血测试，该测试包括血栓弹力测定(在门静脉(port)或经中央线(centr)的CT)、血小板(PLT)(正常值：150-350 10exp3/μl)、D-二聚体水平(正常值：＜500ng/ml)、凝血酶时间(TT，正常值：15至24秒)、凝血酶原时间(PT，正常值：9至14秒)和部分促凝血酶原激酶时间(PTT，正常值：20至33秒)。A：CriglerNajjar患者；B：1a型糖原贮积病患者。
图23.(A)在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白(含有或不含有若干浓度的肝素(Hepar)(Hepar：10UI/ml、Hepar5×-50UI/ml、Hepar10×-100UI/ml))中的hALPC(黑色)的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。对照(白蛋白)(灰色)。对照相比于hALPC Hepar5×，p＜0.01。(B)在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白(含有或不含有正常浓度或增加到5×正常浓度的磺达肝素(Fond)、依诺肝素(Eno))中的hALPC(黑色)的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。对照(白蛋白)(灰色)。对照相比于hALPC Fond5×，p＜0.01；对照相比于hALPC Eno5×，p＜0.01；Fond相比于Fond5×，n.s.；Eno相比于Eno5×，n.s.。
图24.在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白中的hALPC的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。将增加的浓度的水蛭素(Hir)(2×(Hir2×)或5×(Hir5×))即时添加到血液中。hALPC(黑色)，对照(白蛋白)(灰色)。对照相比于hALPC Hir2×，p＜0.01；hALPC相比于hALPC Hir2×，p＜0.01；hALPC Hir相比于hALPC Hir2×，n.s.。
图25.在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白中的hALPC的情况下，柠檬酸盐全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。将增加的浓度的比伐卢定(Biva)(2×(Biva2×))即时添加到血液中。hALPC(黑色)，对照(白蛋白)(灰色)。对照相比于hALPC Biva2×，p＜0.01。
图26.在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白(含有或不含有肝素(Hepar))中的hALPC的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。将依诺肝素(Eno)或磺达肝素(Fond)即时添加到血液中(细胞悬浮或未悬浮于肝素中)。hALPC(黑色)，对照(白蛋白)(灰色)。对照相比于hALPCHepar+Eno，p＜0.01；对照相比于hALPC Hepar+Fond，p＜0.01。
图27.在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白(含有或不含有肝素(10UI/ml)(Hepar))中的hALPC、肝细胞、皮肤成纤维细胞、骨髓间充质干细胞(BMMSC)、骨髓造血干细胞(BMHSC)、肝脏肌成纤维细胞的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。成纤维细胞Hepar相比于对照，n.s.；肝脏肌成纤维细胞Hepar相比于对照，p＜0.01。
图28.在存在或不存在悬浮于5％人白蛋白(含有或不含有肝素(10UI/ml)(Hepar))中的肝脏肌成纤维细胞的情况下，柠檬酸化全血(300μl)复钙(添加组织因子(ExTem20μl))之后，通过ROTEM测定的凝血时间(CT)。当将比伐卢定(Biva)即时添加到血液中与悬浮在肝素中的细胞接触时，获得抗凝血药物的组合。
发明详述
除非上下文中清楚地另有说明，否则本文中不使用数量词时涵盖单数和复数指称。
本文所使用的术语“包含”、“包括”和“含有”是同义词，是是包含性的或开放式的，并且不排除额外的未详述的成员、要素或方法步骤。这样的术语还包括“由...组成”和“基本由...组成”。
通过端点描述的数值范围包括归入相应范围内的所有数字和部分(fraction)，以及所描述的端点。
而术语“一个或更多个”(例如成员组中的一个或更多个成员)本身是清楚的，通过进一步举例说明，该术语包括指所述成员中的任意一个，或者所述成员中的任意两个或更多个，例如所述成员中的任意≥3、≥4、≥5、≥6或≥7以及多至全部所述成员。
当涉及可测量值例如参数、量、持续时间等时，本文所使用的术语“约”意在包括指定值的变化和从指定值的变化，特别是+/-10％或更小，优选+/-5％或更小，更优选+/-1％或更小，还更优选指定值+/-0.1％或更小的指定值的变化和从指定值的变化，范围是这样的变量适用进行所公开的发明。应理解，修饰词“约”所指的值本身也是特别地并且优选地公开的。
本申请中所引用的全部文献均通过引用整体并入本文。
除非另有说明，否则用于公开本发明的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有本发明所属领域普通技术人员所通常理解的含义。通过进一步指导，可以包括术语定义以更好的理解本发明的教导。
如本文所述的组合、组合物、试剂盒(kit)、方法和用途中优选的细胞是成体肝祖细胞、间充质干细胞(优选骨髓间充质干细胞)、皮肤成纤维细胞或肝脏肌成纤维细胞，更优选为成体肝祖细胞或肝脏肌成纤维细胞，最优选为成体肝祖细胞。
本文所使用的术语“具有促凝血活性的细胞”包括能够激活凝血级联和诱导凝集或凝块形成或者有此倾向的细胞。
如本文所述的具有促凝血活性的细胞可以在任何阶段引发凝血级联，从而最终纤维蛋白原转化为交联成凝块的纤维蛋白。例如但不限于，具有促凝血活性的细胞可以表达组织因子，该表达可以引发因子X活化为因子Xa，从而Xa通过剪切凝血酶原为凝血酶经由凝血酶介导的纤维蛋白原转化为纤维蛋白导致凝块形成。术语“具有促凝血活性的细胞”可以与“促凝血细胞”互换使用。术语“促凝血活性”可以与“促血栓形成活性”互换使用。虽然细胞的促凝血活性可以由特定细胞特征(例如但不限于特定标记(例如，组织因子)的表达)的存在(或不存在)来确定，但细胞的促凝血活性同样可以通过例如但不限于血栓弹力测定的技术来确定。简言之，血栓弹力测定是用于血液止血测试的已建立的粘弹性方法(或通过延展(extension)含有凝血级联反应组分的任何样品，例如血浆)，其中样品的弹性变化与凝块形成相关。例如但不限于，血栓弹力测定测量可以在
德尔塔分析仪(delta analyzer)(Pentapharm，Munich，Germany)上进行。或者，促凝血活性可以通过如Johansson等(Diabetes，2005，54：1755-1762)所述的管圈法(tubing loop method)来测量。例如促凝血活性还可由特定细胞因子谱而明显并且被确定(例如在van der Poll等，Regulatory role0f cytokines in disseminated intravascular coagulation.Semin Thromb Hemost.2001，27：639-51中综述)。
如本文所述的具有促凝血活性的细胞可以特别适用于或配置用于其移植。所述细胞可以是同种异体细胞(即，分离自不同的对象，但是与将要移植细胞的对象属于同一物种)，或者可以是自体细胞(即，分离自将要移植细胞的同一对象)，或甚至可以是异种细胞(即分离自与将要移植细胞之对象属于不同物种的对象)。促凝血细胞可以是原代细胞或者可以是已经历体外操作的细胞。本文所使用的术语“体外操作”指在体外进行的任何种类的细胞操作。这样的操作的实例为(但不限于)施用在细胞中引起效果的药物或其它化合物、特定细胞组分的排除、遗传操作、基因治疗、稳定转染或瞬时转染、(假)病毒感染、或转化；分化；去分化；亚克隆等。可清楚的是，无论细胞来源为何，在移植前，细胞可经历储存(例如，低温保存)和/或增殖或传代。细胞可以被诱导表达一种或更多种特定蛋白质(无论是否是细胞本身的，即自体的)，或者增加或减少(或者完全或基本完全阻断)其表达。作为体外操作的替选，待移植细胞可以在从供体分离之前经历操作(例如，药物治疗、基因治疗等)。此外，具有促凝血活性的细胞可以是细胞系。
在一个实施方案中，如本文所述的促凝血细胞可以是非造血(干)细胞，因为所述细胞倾向于不表现促凝血活性。
除了移植细胞以恢复或改善其所提供的功能性以外，在一些非限制性实例中，待移植的细胞产物可包括但不限于癌细胞(例如，用于在动物模型中研究癌症)、基于细胞的疫苗或免疫耐受剂等。
在期望时，可以在将细胞引入对象之前，用目的核酸稳定地或瞬时地转化细胞。目的核酸序列包括但不限于编码促进所述细胞的生长、分化和／或功能性之基因产物的那些。例如但不限于，可以以稳定或瞬时方式引入通常由肝细胞表达之蛋白质的表达系统，以使用如此转化的(优选为肝)细胞来治疗获益于该蛋白质表达的疾病或病症，例如，先天性肝代谢缺陷。细胞转化的方法对于本领域技术人员而言是已知的。
如本文所述的细胞例如特别是如本文所述的促凝血细胞可以优选为动物来源的，更优选为恒温动物，更优选为脊椎动物，更优选为哺乳动物，并且仍更优选为灵长类动物来源的，并且特别地包括人或非人哺乳动物或灵长类动物来源的细胞。优选的细胞例如促凝血细胞是人来源的。在本说明书中所用的术语“哺乳动物”包括归类为例如但不限于以下的任何动物：人、家畜和农场动物、动物园动物、运动场动物(sport animal)、宠物、伴侣动物和实验动物，例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、狗、猫、豚鼠、牛、奶牛、绵羊、马、猪和灵长类动物，例如猴和猿。
如本文所述的细胞例如特别是如本文所述的促凝血细胞可包括但不限于祖细胞、干细胞或者部分或完全分化的细胞，例如终末分化细胞(即，可以是有丝分裂后的完全专门化细胞)。
优选地，如本文所述的细胞例如促凝血细胞并且特别是祖细胞或干细胞可以是成体来源的(例如，成体祖细胞或干细胞)，即，存在于或得自(例如移除自或分离自)胎儿阶段或更优选出生后(产后)的生物体。
例如并且非限制性地，如本文所述的成体来源的细胞(例如成体肝祖细胞)可以指源于新生儿组织或任何随后发育阶段的组织，例如在人的发育中通常指出的阶段，如婴儿、儿童、青少年、青年或成年。例如，就人细胞(例如人成体肝祖细胞)而言，成体来源可以指源自出生后任何时间的组织(例如肝组织)，优选足月(full term)，并且可以是例如年龄为出生后至少一个月，例如至少2个月、至少3个月，例如至少4个月、至少5个月，例如年龄为出生后至少6个月，例如年龄为出生后1年或更多、5年或更多、至少10年或更多、15年或更多、20年或更多或25年或更多。
术语“祖先细胞(progenitor)”或“祖细胞(progenitor cell)”同义并且一般指没有专门化或相对较少专门化并且具有增殖能力的细胞，这种细胞可以在适当的条件下产生至少一种相对更专门化的细胞类型，例如相对更专门化的祖细胞或者最终成为终末分化细胞等。祖细胞可以“产生”另一种相对更专门化的细胞，这例如在以下情况下发生：在之前不经历细胞分裂的情况下祖细胞分化以变成所述其它细胞，或者如果所述其它细胞在祖细胞的一轮或更多轮细胞分裂和/或分化后产生时。
术语“干细胞”一般指能够自我更新的祖细胞，即这种细胞可在适当的条件下增殖而不分化。该术语包括能够基本上无限自我更新的干细胞(即，其中至少一部分干细胞的后代基本上保持了亲代干细胞未专门化或相对较少专门化的表型、分化潜能以及增殖能力)；以及表现出有限自我更新的干细胞(即，其中与亲代细胞相比，干细胞后代进一步增殖和/或分化能力明显下降)。
如本文所述的祖细胞或干细胞可以是多能的(pluripotent)(即，根据领域公认的标准测试(例如在SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，或者在组织培养中形成所有三个胚层的可鉴定细胞的能力等)，在适当条件下能够产生不同细胞类型的后代，所述细胞类型是所有三个胚层(即，内胚层、中胚层、外胚层)的衍生物)，多潜能的(multipotent)(即，能够在适当条件下产生来自生物体的两个或更多个不同器官或组织中的每一种的至少三种细胞类型的后代，其中所述的细胞类型可以源自相同或不同的胚层，但是不能产生生物体的所有细胞类型)，或者发展为仅一个或几个(例如，一个，两个或三个)细胞品系。
原型哺乳动物多能干细胞(mPS)可以来自任何种类的哺乳动物胚胎组织，例如，胚胎、胎儿或前胎儿(pre-foetal)组织。mPS细胞的定义包括多种类型的胚胎干细胞，例如但不限于鼠胚胎干细胞，例如，如由Evans&Kaufman1981(Nature292：154-6)和Martin1981(PNAS78：7634-8)所述；大鼠多能干细胞，例如，如由Iannaccone等，1994(Dev Biol163：288-292)所述；仓鼠胚胎干细胞，例如，如由Doetschman等，1988(Dev Biol127：224-227)所述；兔胚胎干细胞，例如，如由Graves等，1993(MolReprod Dev36：424-433)所述；猪多能干细胞，例如，如由Notarianni等，1991(J Reprod Fertil Suppl43：255-60)和Wheeler1994(Reprod FertilDev6：563-8)所述；绵羊胚胎干细胞，例如，如由Notarianni等，1991(见上文)所述；牛胚胎干细胞，例如，如由Roach等，2006(Methods Enzymol418：21-37)所述；人胚胎干(hES)细胞，例如，如由Thomson等，1998(Science282：1145-1147)所述；人胚胎生殖(hEG)细胞，例如，如由Shamblott等，1998(PNAS95：13726)所述；来自其它灵长类动物的胚胎干细胞，例如恒河猴干细胞，例如，如由Thomson等，1995，(PNAS92：7844-7848)所述，或狨猴干细胞，例如，如由Thomson等1996，(BiolReprod55：254-259)所述。
如所述，原型“人ES细胞”由Thomson等1998(见上文)和US6200806描述。该术语的范围涵盖了这样的多能干细胞，其源自处于囊胚期或在细胞基本分化成三胚层之前的人胚胎。ES细胞特别是hES细胞通常源自于囊胚的内细胞团或者整个囊胚。hES细胞系由桑椹胚期的衍化已被记录，并且如此获得的ES细胞也可用于本发明(Strelchenko等，2004.Reproductive BioMedicine Online9：623-629)。如前所述，原型“人EG细胞”由Shamblott等1998所描述(同上)。这样的细胞可以源自例如，包含来自胎儿原生生殖细胞的生殖脊和肠系膜。在人中，胎儿通常可以为受精后5至11周。
除非明确地另有指明，否则术语mPS细胞可包括原代组织细胞和已建成的具有各细胞表型特征的细胞系，以及仍具有产生三个胚层中每一个之后代的能力的这种原代细胞或细胞系的衍生物。
示例性但非限制性的已建成的人ES细胞系包括在NIH人胚胎干细胞注册中心(NIH Human Embryonic Stem Cell Registry)列出的细胞系(http：／／stemcells.nih.gov／research／registry)及其子细胞系(sub-line)，例如：来自Bresagen Inc.(Athens，GA)的细胞系hESBGN-01、hESBGN-02、hESBGN-03和hESBGN-04；来自Cellartis AB(
瑞典)的细胞系Sahlgrenska1和Sahlgrenska2；来自ES Cell International(新加坡)的细胞系HES-1、HES-2、HES-3、HES-4、HES-5和HES-6；来自MizMedi Hospital(Seoul，韩国)的细胞系Miz-hES1；来自Technion-Israel Institute ofTechnology(Haifa，Israel)的细胞系I3、I3.2、I3.3、I4、I6、I6.2、J3和J3.2；来自加利福尼亚大学(University of California)(San Francisco，CA)的细胞系HSF-1和HSF-6；来自威斯康辛校友研究基金会(WisconsinAlumni Research Foundation)／WiCell研究院(WiCell Research Institute)(Madison，WI)的细胞系H1、H7、H9、H13、H14；来自细胞&基因治疗研究院(Cell & Gene Therapy Research Institute)／Pochon CHA UniversityCollege of Medicine(Seoul，韩国)的细胞系CHA-hES-1和CHA-hES-2；来自Geron Corporation(Menlo Park，CA)的细胞系H1、H7、H9、H13、H14、H9.1和H9.2；来自
University(
瑞典)的细胞系Sahlgrenska4至Sahlgrenska19；来自Maria Biotech Co.Ltd.(Seoul，韩国)的细胞系MB01、MB02、MB03；来自国家生物科学中心(NationalCentre for Biological Sciences)(Bangalore，印度)的细胞系FCNCBS1、FCNCBS2和FCNCBS3；以及Reliance Life Sciences(Mumbai，印度)的细胞系RLS ES05、RLS ES07、RLS ES10、RLS ES13、RLS ES15、RLSES20和RLS ES21a另一些示例性的建成hES细胞系包括保藏于英国干细胞银行(UK Stem CellBank)(http：／／www.ukstemcellbankorg.uk／)的那些及其子细胞系，例如，来自King's College London(伦敦，UK)的细胞系WT3和来自纽卡斯尔大学(University of Newcastle)(纽卡斯尔，UK)的细胞系hES-NCL1(Stroikovic等，2004Stem Cells22：790-7)。另一些示例性的ES细胞系包括来自Cellartis AB(
，瑞典)的细胞系FC018、AS034、AS034.1、AS038、SA111、SA121、SA142、SA167、SA181、SA191、SA196、SA203和SA204以及其子细胞系。
术语哺乳动物多能干细胞还包括可通过操作(例如遗传和/或生长因子和/或小分子介导的操作等)非多能哺乳动物细胞(例如体细胞，特别是成体哺乳动物体细胞)获得的mPS细胞，其包括使用诱导型多能性干(iPS)细胞，如由Yamanaka等2006(Cell126：663-676)、Yamanaka等2007(Cell131：861-872)和Lin等2009(Nature Methods6：805-808)所教导的。
如本文所述的优选细胞(例如如本文所述的促凝血细胞)可包括间充质干细胞。如本文所使用的术语“间充质干细胞”或“MSC”指成体中胚层来源的干细胞，其能够产生间充质品系的细胞、通常为三种或更多种典型间充质品系的细胞，例如，骨细胞(骨)、软骨细胞(软骨)、肌细胞(肌肉)、腱细胞(腱)、成纤维细胞(结缔组织)、脂肪细胞(脂肪)、基质细胞(骨髓基质)品系。通常而言(但不限于此)，如果使用标准的本领域公认的分化条件和细胞表型评价方法(例如如Pittenger等1999(Science284：143-7)或Barberi等(PLoS Med2：e161，2005)所述)，细胞能够形成脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞品系中的每一种，则可认为细胞是MSC。MSC细胞可以分离自例如骨髓、血液、脐带、胎盘、胎儿卵黄囊、真皮(尤其是胎儿和青少年的皮肤)(Young等，2001.Anat Rec264：51-62)、骨膜和脂肪组织(Zuk等2001.Tissue Eng7：211-28)。人MSC、其分离、体外扩增和分化已描述于例如Pittenger等1999(见上文)、美国专利No.5,486,359、美国专利No.5,811,094、美国专利No.5,736,396、美国专利No.5,837,539或美国专利No.5,827,740中。
该术语还包括从骨髓获得的MSC，该MSC通常被称为“骨髓间充质干细胞”、“骨髓基质干细胞”或“BMSC”。用于分离BMSC的骨髓样品可以例如从髂嵴、股骨、胫骨、脊柱、肋骨或其它髓空间中获得。在一个优选的实施方案中，如本文所使用的MSC或MSC类群可以来源于骨髓，例如，可以从骨髓样品分离和任选地扩增。来源于骨髓的MSC和MSC类群可以有不同于和/或优于来源于另一些组织之MSC的特征(例如，标记物谱、功能、扩增、分化等)，例如但不限于可以更有效地和／或更可控地分化成某些细胞品系。术语MSC和BMSC还包括MSC或BMSC的后代，例如，通过从对象的生物样品获得的MSC或BMSC的体外或离体扩增获得的后代。
如本文所述的其它细胞(例如如本文所述的促凝血细胞)可包括但不限于得自或源自(例如，移除或分离自)以下组织的成体祖细胞或干细胞：包括肌肉组织(例如，卫星细胞)、内分泌组织(例如，胰腺、性腺、肾上腺、松果体、垂体腺、甲状腺和甲状旁腺)、神经组织(例如，神经元组织或胶质组织)、血液和免疫系统组织、上皮、肝、骨、软骨、脂肪或内皮组织。
如本文所述特别优选的细胞(例如特别是具有促凝血活性的细胞)是成体肝来源的祖细胞或干细胞，更特别地例如发明概述部分详述的细胞。
如本文所使用的成体肝来源的祖细胞或干细胞或成体肝祖细胞或类似的细胞通常可表示具有祖细胞或干细胞特征并且能够分化为一种或更多种肝细胞类型(例如能够至少或只能进行肝分化(即，分化为肝细胞或肝细胞样细胞))的肝来源的细胞。
如本文所述的细胞(例如部分或完全分化或成熟的促凝血细胞，例如终末分化细胞(即，可以是有丝分裂之后的完全专门化细胞))可以包括但不限于肌肉细胞(例如，心肌细胞、肌细胞、肌小管细胞、成肌细胞、血管平滑肌细胞)、胰腺内分泌细胞(例如，β细胞、α细胞、δ细胞、PP产生细胞或ε细胞)、神经细胞(例如，神经元、胶质细胞例如星形胶质细胞、少突胶质细胞、雪旺氏细胞)、血液和免疫系统的细胞(例如，B淋巴细胞或T淋巴细胞、树突状细胞、粒细胞、巨噬细胞等)、上皮细胞(例如，角化细胞、黑素细胞、肾细胞、肺细胞)、肝细胞(例如，肝细胞，卵圆细胞)、骨细胞(成骨细胞、骨细胞、成牙质细胞)、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞(例如，血管平滑肌细胞)。还包括融合细胞，例如，细胞杂交体。
本文所使用的术语“抗凝血酶活化剂”指直接活化抗凝血酶的试剂(例如，化合物、物质或分子)。因此，抗凝血酶活化剂增加抗凝血酶对其靶标(例如凝血酶、因子Xa和/或因子IXa)的催化(拮抗)活性(即增加的速率常数)。特别优选地，抗凝血酶活化剂增加抗凝血酶对至少因子Xa的催化(拮抗)活性。在另一个优选的实施方案中，抗凝血酶活化剂可以特异性地增加抗凝血酶对因子Xa的催化(拮抗)活性(例如但不限于磺达肝素)。通过抗凝血酶活化剂进行抗凝血酶活化可通过任何方式来完成，例如并且不限于通过直接结合和诱导抗凝血酶的构象变化，导致催化(靶结合)位点的可接近性和/或活性增加。如本文所使用的“抗凝血酶”指任何已知的抗凝血酶，优选抗凝血酶III(基因符号SERPINC1)。因此，本文所使用的“抗凝血酶活化剂”优选地指抗凝血酶III的活化剂。
在一个实施方案中，根据本发明的抗凝血酶活化剂是肝素。在另一个实施方案中，根据本发明的抗凝血酶活化剂选自未分级肝素和低分子量肝素。在另一个实施方案中，根据本发明的抗凝血酶活化剂是磺达肝素，其可表示为2-脱氧-6-O-磺基-2-(磺氨基)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-β-D-吡喃葡糖醛酸基-(1→4)-O-2-脱氧-3，6-二-O-磺基-2-(磺氨基)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-2-O-磺基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸基-(1→4)-O-甲基-2-脱氧-6-O-磺基-2-(磺氨基)-α-D-吡喃葡萄糖苷癸钠盐。在一个优选的实施方案中，根据本发明的抗凝血酶活化剂是未分级肝素。本文所使用的“未分级肝素”特别地指天然肝素，其为由不同长度的分子链(通常介于约5kDa至约40kDa)组成的多分散体。本文旨在可以使用任何类型的肝素。
通常而言，药用级肝素来自宰杀的肉食动物的黏膜组织，例如猪肠或牛肺。本文所使用的“低分子量肝素”(LMWH)指平均分子量通常为小于约8kDa并且其中所有链中至少约60％的分子量小于约8kDa的肝素。LMWH是通过聚合肝素的多种分级分离(fractionation)或解聚方法获得的。LMWH的实例包括但不限于阿地肝素(ardeparin)、舍托肝素(certoparin)、依诺肝素(enoxaparin)、帕肝素(parnaparin)、亭扎肝素(tinzaparin)、达肝素(dalteparin)、瑞维肝素(reviparin)和那屈肝素(nadroparin)。
如本发明人所考虑的，某些抗凝血酶活化剂可以通过增加抗凝血酶(特异性地)对因子Xa的催化(拮抗)活性来起作用。因此，在一些方面和实施方案中，考虑了如本文所述的组合、组合物、试剂盒、方法和用途使用因子Xa抑制剂(特别是不同于抗凝血酶活化剂的因子Xa抑制剂)作为抗凝血酶活化剂的替代品或附加于抗凝血酶活化剂。这样的因子Xa抑制剂可以是间接的或者直接的因子Xa抑制剂。间接因子Xa抑制剂包括例如抑制因子X转化为因子Xa的物质。直接因子Xa抑制剂可在凝血级联中直接作用于因子Xa，而无需使用抗凝血酶作为介质，从而防止因子Xa介导的凝血酶原转化为凝血酶。例如并且非限制性地，直接因子Xa抑制剂包括阿哌沙班(Apixaban)、依杜沙班(Edoxaban)、奥米沙班(Otamixaban)、利伐沙班(Rivaroxaban)、DX9065a和YM466。
本文所使用的术语“凝血酶抑制剂”指直接与凝血酶结合并使其失活的化合物。因此，凝血酶抑制剂显著降低或理想地完全或基本完全阻断凝血酶的催化活性，如方便地通过其催化靶标(特别是纤维蛋白原)的速率常数减少来测量的。通过凝血酶抑制剂进行的凝血酶抑制可以是可逆的或不可逆的，优选是可逆的。通过凝血酶抑制剂进行的凝血酶抑制可通过任何方式来完成，例如但不限于通过直接与凝血酶的催化位点结合。
在一个实施方案中，根据本发明的凝血酶抑制剂选自比伐卢定和水蛭素。在化学上，比伐卢定(CAS No.128270-60-0)是天然药物水蛭素的合成同类物(congener)。天然的水蛭素通常包含该蛋白质的多种异构体的混合物。因此，本文所使用的术语“水蛭素”特别地包含具有天然水蛭素异构体的一级氨基酸序列的任何蛋白质，例如HV1、HV2、HV3、P1或P2等。重组水蛭素可制备为生产同种的水蛭素制剂例如但不限于来匹卢定(lepirudin)和地西卢定(desirudin)。如本文所述的水蛭素还包括水蛭素的合适的衍生物或类似物，例如，通过氨基酸替换、缺失、插入、延伸、官能化或化学修饰，所述衍生物具有凝血酶抑制剂活性；并且还包括多于一种水蛭素的杂交体，所述的杂交体可以通过基因工程产生。例如，WO91／17250描述了一种水蛭素，其由HV1的前46个残基和HV2的第47至65位氨基酸构成。
在一个优选的实施方案中，凝血酶抑制剂是比伐卢定(例如由TheMedicines Company生产的例如
或
)。而(天然或重组)水蛭素和水蛭素衍生物以及比伐卢定对于本领域技术人员而言是已知的，进一步指导可参考Fenton等Semin Thromb Hemost.，1998，第24卷，87-91等。
体现本发明原理的特别优选的组合或组合物可包括以下、基本由以下组成或或由以下组成：抗凝血酶活化剂，其选自肝素、未分级肝素、低分子量肝素和磺达肝素，优选未分级肝素；凝血酶抑制剂，其选自比伐卢定和水蛭素，优选比伐卢定；和任选的细胞，其选自成体肝祖细胞、间充质干细胞(优选骨髓间充质干细胞)、皮肤成纤维细胞或肝脏肌成纤维细胞，优选成体肝祖细胞或肝脏肌成纤维细胞，最优选成体肝祖细胞。
体现本发明原理的另一些特别优选的组合或组合物公开于表1中，即，组合或组合物包含物质1、物质2和任选的细胞，基本由它们组成或者由它们组成。
表1
| 物质1 | 物质2 | 细胞 |
| 肝素 | 水蛭素 | |
| 肝素 | 比伐卢定 | |
| 未分级肝素 | 水蛭素 | |
| 未分级肝素 | 比伐卢定 | |
| LMWH1 | 水蛭素 | |
| LMWH1 | 比伐卢定 | |
| 磺达肝素 | 水蛭素 | |
| 磺达肝素 | 比伐卢定 | |
| 肝素 | 水蛭素 | 促凝血细胞 |
| 肝素 | 比伐卢定 | 促凝血细胞 |
| 未分级肝素 | 水蛭素 | 促凝血细胞 |
| 未分级肝素 | 比伐卢定 | 促凝血细胞 |
| LMWH1 | 水蛭素 | 促凝血细胞 |
| LMWH1 | 比伐卢定 | 促凝血细胞 |
| 磺达肝素 | 水蛭素 | 促凝血细胞 |
| 磺达肝素 | 比伐卢定 | 促凝血细胞 |
| 肝素 | 水蛭素 | 成体肝祖细胞 |
| 肝素 | 比伐卢定 | 成体肝祖细胞 |
| 未分级肝素 | 水蛭素 | 成体肝祖细胞 |
| 未分级肝素 | 比伐卢定 | 成体肝祖细胞 |
| LMWH1 | 水蛭素 | 成体肝祖细胞 |
| LMWH1 | 比伐卢定 | 成体肝祖细胞 |
| 磺达肝素 | 水蛭素 | 成体肝祖细胞 |
| 磺达肝素 | 比伐卢定 | 成体肝祖细胞 |
| 肝素 | 水蛭素 | (骨髓)间充质干细胞 |
| 肝素 | 比伐卢定 | (骨髓)间充质干细胞 |
| 未分级肝素 | 水蛭素 | (骨髓)间充质干细胞 |
| 未分级肝素 | 比伐卢定 | (骨髓)间充质干细胞 |
| LMWH1 | 水蛭素 | (骨髓)间充质干细胞 |
| LMWH1 | 比伐卢定 | (骨髓)间充质干细胞 |
| 磺达肝素 | 水蛭素 | (骨髓)间充质干细胞 |
| 磺达肝素 | 比伐卢定 | (骨髓)间充质干细胞 |
| 肝素 | 水蛭素 | 皮肤成纤维细胞 |
| 肝素 | 比伐卢定 | 皮肤成纤维细胞 |
| 未分级肝素 | 水蛭素 | 皮肤成纤维细胞 |
| 未分级肝素 | 比伐卢定 | 皮肤成纤维细胞 |
| LMWH1 | 水蛭素 | 皮肤成纤维细胞 |
| LMWH1 | 比伐卢定 | 皮肤成纤维细胞 |
| 磺达肝素 | 水蛭素 | 皮肤成纤维细胞 |
| 磺达肝素 | 比伐卢定 | 皮肤成纤维细胞 |
| 肝素 | 水蛭素 | 肝脏肌成纤维细胞 |
| 肝素 | 比伐卢定 | 肝脏肌成纤维细胞 |
| 未分级肝素 | 水蛭素 | 肝脏肌成纤维细胞 |
| 未分级肝素 | 比伐卢定 | 肝脏肌成纤维细胞 |
| LMWH1 | 水蛭素 | 肝脏肌成纤维细胞 |
| LMWH1 | 比伐卢定 | 肝脏肌成纤维细胞 |
| 磺达肝素 | 水蛭素 | 肝脏肌成纤维细胞 |
| 磺达肝素 | 比伐卢定 | 肝脏肌成纤维细胞 |
1 LMWH包括阿地肝素、舍托肝素、依诺肝素、帕肝素、亭扎肝素、达肝素、瑞维肝素和那屈肝素；优选地LMWH是依诺肝素。
术语“细胞移植”具有其通常含义，并且特别地指将细胞施用于对象。术语“细胞移植”可以与“细胞治疗”互换使用。细胞移植可以通过本领域中已知的任何技术来进行。例如但不限于，可以通过输注将细胞移植入对象。通常而言，细胞输注可以在肠胃外(例如，血管内、皮下、皮内或肌内，优选血管内)进行。细胞可以例如但不限于全身地、局部地或在病变部位施用。可以清楚的是，可以根据特定应用、靶组织、治疗目的或细胞类型，在施用途径、以及配方、浓度等方面做出相应调整。
本文所使用的术语“血栓性并发症(thrombotic complication)”或“促凝血并发症”可特别地指除了凝块形成本身以外，与具有促凝血活性之细胞的移植相关的有害作用或并发症。这样的作用可以是，例如并且不限于细胞损失、细胞排斥或炎症。细胞损失或细胞排斥意为移植细胞的损失或排斥。这些作用的结果是细胞移植效率或细胞植入潜力下降、因为少于(或在极端情况下没有)所施用的总量的细胞可以在移植后执行其预期功能。细胞损失可例如由于凝块中包含所移植细胞而发生。细胞排斥发生可例如由于宿主的免疫应答而发生。炎性应答可例如与凝血级联的激活相关或者由其导致。可替代地或另外地，炎症可以与细胞排斥相关、由其引起或者引起细胞排斥反应。
还提供了组合物，该组合物包含本文所教导的组合，并且还包含一种或更多种其它组分。例如，可包括那些可以保持或提高细胞活力的组分。例如并且非限制性地，这样的组分可以包括用以确保基本等渗条件的盐、pH稳定剂例如缓冲系统(例如，用以确保基本中性的pH，例如磷酸盐或碳酸盐缓冲剂体系)、载体蛋白例如白蛋白、介质(包括基础基质和／或补充介质)、血清或血浆、营养物、碳水化合物源、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂或对于本领域技术人员而言公知的其它材料。还公开了通过将本文所教导之组合的各组分与上述一种或更多种额外的组分混合来产生所述组合物的方法。该组合物可以例如是液体或者可以是半固体或固体(例如，可以是冷冻组合物或者可以作为凝胶存在或者可以存在于固相支持物或支架上等)。冷冻保护剂(cryopreservatives)例如DMSO等在本领域中是已知的。
正如在其它地方所指出的，本文所教导的药物组合物包含一种或更多种可药用赋形剂。
本文所使用的术语“可药用”与本领域一致并且意为与药物组合物的其它成分相容并且对其受体无害。
本文所使用的“载体”或“赋形剂”包括任何和全部溶剂、稀释剂、缓冲剂(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、增溶剂、胶体、分散介质、载剂、填充剂、螯合剂(例如，EDTA或谷胱甘肽)、氨基酸(例如，甘氨酸)、蛋白质、崩解剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、芳香剂、增稠剂、用于获得储库效果(depot effect)的试剂、包衣、抗真菌剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、渗透控制剂(tonicity controllingagent)、吸收延迟剂等。这些介质和试剂在药物活性物质中的用途在本领域中是公知的。这样的材料应该是无毒的，并且不应该干扰细胞的活性。
所述载体或赋形剂或其它材料的确切性质将取决于施用途径。例如，组合物可以是肠胃外可接受水溶液的形式，其为无热原的，并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。就药物配制的一般原则而言，读者可参考由G.Morstyn和W.Sheridan编著的Cell Therapy：Stem Cell Transplantation，Gene Therapy，and Cellular Immunotherapy，Cambridge University Press，1996；和Hematopoietic Stem Cell Therapy，E.D.Ball，J.Lister和P.Law，Churchill Livingstone，2000。
液体药物组合物一般可以包含液体载体，例如水或可药用水溶液。例如可以包括生理盐水溶液、组织或细胞培养基、右旋糖(dextrose)或其它糖溶液或二元醇(例如乙二醇、丙二醇或可聚乙二醇)。
该组合物可包含一种或更多种细胞保护分子、细胞再生分子、生长因子、抗凋亡因子或调节细胞中基因表达的因子。这样的物质可使得细胞不依赖于其环境。
这样的药物组合物可包含确保其中的细胞之活力的其他组分。例如，该组合物可包含合适的缓冲体系(例如，磷酸盐或碳酸盐缓冲体系)以达到期望的pH(更通常为接近中性pH)，并且可包含足以确保细胞的等渗条件以防止渗透压力的盐。例如，用于这些目的的合适的溶液可以是如本领域中已知的磷酸缓冲盐水(PBS)、氯化钠溶液、林格氏注射液(Ringer′sInjection)或乳酸林格氏注射液(Lactated Ringer′s Injection)。另外，该组合物可包含载体蛋白质，例如白蛋白(例如，牛白蛋白或人白蛋白)，这可增加细胞的活力。
另一些合适的可药用载体或添加剂对于本领域技术人员而言公知的，并且例如可选自蛋白质(例如胶原蛋白或明胶)、碳水化合物(例如淀粉、多糖、糖(右旋糖，葡萄糖和蔗糖))、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素钠或羧甲基纤维素钙、羟丙基纤维素或羟丙基甲基纤维素)、预明胶化(pregeletanized)淀粉、果胶琼脂、角叉菜胶、粘土、亲水性树胶(金合欢树胶(acacia gum)、瓜尔胶、阿拉伯树胶(arabic gum)和黄原胶)、藻酸、藻酸盐、透明质酸、聚乙醇酸和聚乳酸、右旋糖、果胶、合成聚合物(例如水溶性丙烯酸类聚合物或聚乙烯吡咯烷酮)、蛋白聚糖、磷酸钙等。
如果期望，可以将细胞制备物施用于支持物、支架、基质或材料上以提供改善的组织再生。例如，该材料可以是颗粒状陶瓷(granular ceramic)，或生物聚合物(例如明胶、胶原蛋白或纤维蛋白原)。多孔基质可以按照标准技术合成(例如，Mikos等，Biomaterials14：323，1993；Mikos等，Polymer35：1068，1994；Cook等，J.Biomed.Mater.Res.35：513，1997)。这样的支持物、支架、基质或材料可以是可生物降解的或不可生物降解的。因此，可以将所述细胞转移和／或培养在合适的基底(例如多孔的或无孔的基底)上，以提供植入物。例如，如果必要，可以将在培养皿中增殖或正在分化的细胞转移到三维固体支持物上以通过在本发明的液体营养培养基中孵育固体支持物以便使它们扩增和／或继续分化过程。可以例如通过将所述支持物浸渍在包含所述细胞的液体悬液中来将细胞转移到三维固相支持物上。可以将以这种方式得到的经浸渍支持物植入人对象中。还可以通过在最终植入之前将这样的经浸渍支持物浸入液体培养基中来对其进行再培养。所述三维固相支持物需要是生物相容性的以使其能够植入人体内。该支持物可以是可生物降解的或不可生物降解的。
所述细胞或细胞类群可以以使得它们生存、生长、繁殖和／或分化为期望细胞类型(例如，肝细胞)的方式施用。所述细胞或细胞类群可以被移植到或迁移到和植入到预定器官(例如肝)中。可以设想将所述细胞或细胞类群植入其它位置、组织或器官，例如肝、脾、胰腺、肾囊(kidneycapsule)、腹膜或网膜。
在一个实施方案中，如上所定义的药物细胞制备物可以以液体组合物的形式施用。在一些实施方案中，包含这些的细胞或药物组合物可以全身地，局部地，于器官或器官功能障碍或病变部位施用。
优选地，所述药物组合物可以包含治疗有效量的期望细胞。术语“治疗有效量”指可以可在正接收研究者、兽医、医生或其他临床医生问诊的组织、系统、动物或人体内引起生物应答或医学应答的量，并且特别是可以预防或缓解待治疗疾病或病症的一个或更多个局部或全身症状或特征的量。
本发明的组合、药物组合物和其它相关方面特别可用于如本文所述的细胞(例如特别是促凝血细胞)的移植，甚至更特别地用于治疗可获益于对象中所述细胞的移植的疾病或病症。
除非明确的指出，否则“对象”或“患者”是可以互换使用并且指动物，优选为脊椎动物，更优选为哺乳动物，并且特别地包括人类患者和非人哺乳动物。因此，如本文所使用的“对象”或“患者”意为可施用如本文所教导的组合或组合物的任何动物、哺乳动物或人患者或对象。优选的患者是人对象。
本文所使用的术语“治疗”指治疗性治疗措施和预防或防止措施(其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或病症)两者。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解、疾病程度的缩减、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展和并发症发生的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和。“治疗”也可意为与如果不接受治疗的预期生存期相比延长生存期。
本文所使用的短语例如“需要治疗的对象”包括将获益于给定病症(优选为如上所述的病症或疾病)之治疗的对象，例如哺乳动物或人对象。这样的对象通常包括但不限于已被诊断为患有所述病症的那些、倾向于患有或发生所述病症的那些和／或待预防所述病症那些。
本文所述的组合和药物组合物可以单独使用或者与任何已知的用于相应病症的疗法或活性化合物组合施用。施用可以是同时施用或以任何顺序依次施用。
如果细胞源自自异体(即非自体)来源，则通常可例如使用免疫抑制剂(例如环孢素或他克莫司(FK506))来施用伴随免疫抑制治疗。
例如并且非限制性地，当本文所述的组合或药物组合物包含肝细胞(例如肝祖细胞或干细胞(例如，ADHLSC细胞)或肝细胞)时，它们可用于治疗肝相关疾病等，包括但不限于肝功能障碍或衰竭、肝炎和先天性代谢异常。
肝先天性代谢缺陷的非排它性实例包括苯丙酮尿症和其他氨基酸代谢症、血友病及其它凝血因子缺乏症、家族性高胆固醇血症和其它脂代谢疾病、尿素循环障碍、糖原病、半乳糖血症、果糖血症、酪氨酸血症、蛋白质和碳水化合物代谢缺陷症、有机酸尿症、线粒体疾病、过氧化物酶(peroxysomal)和溶酶体病症、蛋白合成异常、肝细胞转运体缺陷、糖基化缺陷等。
另一些肝相关的疾病或病症包括但不限于获得性进行性肝退行疾病、暴发性肝衰竭和急性或慢性肝衰竭、人嗜肝病毒感染(HBV、HAV、HCV、HEV、HDV......)。
以肝质量和／或功能损失为特征并且可以获益于包含本文所述肝细胞之组合或药物组合物的另一些疾病状态或缺陷包括但不限于艾欧吉勒综合征(Alagille综合征)、酒精性肝病(酒精诱导的肝硬化)、a1-抗胰蛋白酶缺乏症(全部表型)、高脂血症和其它脂代谢疾病、自身免疫性肝炎、布-加综合征(Budd-Chiari综合征)、胆管闭锁、进行性家族性胆汁淤积I型、II型和III型、肝癌、Caroli病、克里格勒-纳贾二氏综合征(Crigler-Najiarsyndrome)、果糖血症、半乳糖血症、碳水化合物缺乏糖基化缺陷症、其它碳水化合物代谢疾病、雷夫叙姆病(Refsum disease)和其它过氧化物酶病、尼曼-匹克病、沃尔曼氏症(Wolman disease)和其它溶酶体疾病、酪氨酸血症、三H(triple H)、以及其它氨基酸代谢疾病、Dubin-Johnson综合征、脂肪肝(非酒精脂肪性肝炎)、吉尔伯特综合征(Gilbert综合征)、糖原贮积病I型和III型、血色病、甲型-庚型肝炎、卟啉症、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、酪氨酸血症、凝血因子缺乏症、血友病B、苯丙酮尿症、威尔森氏症(Wilson’s disease)、暴发性肝衰竭、肝切除后肝衰竭、线粒体呼吸链疾病。
例如并且非限制性地，组合或药物组合物(特别是包含肝细胞的那些)可通过以下有利地施用：注射(也包括导管施用)或植入，例如局部注射、全身注射、脾内注射(另参见Gupta等，Seminars in Liver Disease12：321，1992)、注射到门静脉、注射到肝浆(例如肝被膜下方)、肠胃外施用、或者子宫内注射到胚胎或胎儿。例如，如本文所述包含肝细胞或肝来源的细胞的组合或药物组合物可以通过肝细胞移植(LCT)用于组织工程和细胞治疗。肝细胞移植和肝干细胞移植(LSCT)指以任何方式输注成熟肝细胞或肝祖细胞导致细胞的肝获取(hepatic access)和植入的技术，优选通过门静脉，以及通过直接肝注射或者通过脾内注射。在另一个实例中，如本文所述包含间充质干细胞的组合或药物组合物可用于任何实体器官修复(脑、心脏、肝、肾、胰腺、脾、肺、肠、膀胱、胆囊)以控制免疫疾病，以控制克罗恩病(
病)和其它自身免疫疾病，以控制的移植物对抗宿主病，以控制移植后的器官排斥，在另一实例中，如本文所述的包含皮肤成纤维细胞的组合或药物组合物可用于皮肤修复或骨基质形成。在另一个实例中，如本文所述包含肝脏肌成纤维细胞的组合或药物组合物可与另一些细胞组合用于治疗或修复由结缔组织疾病造成的损伤或者用于创建支架。
在当前自体单核骨髓细胞的人研究中，使用了1到4×107个细胞的经验剂量，结果鼓舞人心。然而，不同情况可需要优化施用细胞的量。因此，待施用的细胞的数量随被治疗对象的不同而不同。在一个优选的实施方案中，可以将102至1010、或102至109、或103至1010或103至109、或104至1010、或104至109，例如104至108、或105至107，例如，约1×105、约5×105、约1×106、约5×106、约1×107、约5×107、约1×108、约5×108、约1×109、约2×109、约3×109、约4×109、约5×109、约6×109、约7×109、约8×109、约9×109或约1×1010个细胞施用于人对象。在另一些实施方案中，可以将106至108个细胞每kg体重或1×107至9×107个细胞每kg体重，例如，约1×107、约2×107、约3×107、约4×107、约5×107、约6×107、约7×107、约8×107、约9×107或约1×108个细胞每kg体重施用于人对象。例如，这样的细胞数量或这样的每kg体重的细胞数量可特别地指待施用于对象的细胞总数，其中该施用可以适当地分布于一个或更多个剂量(例如，分布在2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个剂量)经一天或更多天(例如，静1、2、3、4或5天或更多天)施用。但是，治疗有效剂量的精确确定可基于每个患者的个体因素，包括其体型、年龄、组织损伤大小，从损伤发生开始的时间，并且本领域技术人员可以根据本公开和本领域中的知识很容易地确定。
合适地，在待施用的组合物中，细胞可以以如下浓度存在：约104／ml至约108／ml，优选约105／ml至约107／ml，更优选约1×106／ml至约1×107／ml，例如，约5×106／ml。
任选地与如上所定义的一种或更多种其它药物或生物活性成分组合的如本文所公开使用的活性物质(例如，抗凝血酶活化剂、凝血酶抑制剂)的剂量或量取决于个体情况并且通常使之适于个体情况从而获得最佳效果。因此，其取决于待治疗病症的性质和严重程度；并且还取决于待治疗的人类或动物的性别、年龄、体重、饮食、一般健康状况、个体应答性；所使用化合物的效力、代谢稳定性和作用时间；施用模式和时间、排泄速率；治疗是急性的或慢性的还是预防性的；或者是否施用了除本发明的活性物质以外的其他药物或生物活性成分或施加了其它疗法。
非限制性地，取决于上述因素，典型的单剂量可以为约1μg／kg至约250mg／kg体重或更多，优选为约1μg／kg至约100mg／kg体重，更优选为约0.01mg／kg至约50mg／kg体重，甚至更优选为约0.01mg／kg至约10mg／kg体重，并且仍更优选为约0.05mg／kg至约10mg／kg体重或者约0.05mg／kg至约1mg／kg体重。
就经数天或更长时间的反复施用而言，保持治疗直到发生疾病症状的期望抑制。所述试剂的优选剂量可以为约0.05mg／kg至约10mg／kg。因此，可以将约0.5mg／kg、2.0mg／kg、4.0mg／kg或10mg／kg(或其任意组合)中的一种或更多种剂量施用于患者。这样的剂量可以施用为单次日剂量、分为一次或更多次的日剂量、或者基本上是连续的(例如，采用滴注)或间歇性地(例如，每一周或每三周)。
在一些实施方案中，可以通过细胞悬液(通常构成约5至15UI／ml，更通常约8至12U1／ml，并且甚至更通常约10UI／m1)将抗凝血酶活化剂并且特别是未分级肝素施用于对象。当指出静脉内施用抗凝血酶活化剂并且特别是未分级肝素时，通常剂量可以为约10至30U1／kg／hr，更通常为约15至25UI／kg／hr，甚至更通常为约20UI／kg／hr。可以理解的是，可以根据凝血测试调节剂量。
优选地，可以向对象施用以下量的凝血酶抑制剂：约0.05至约5mg／kg体重，更优选为约0.1至约3mg／kg体重，甚至更优选为约0.2至约2mg／kg体重；就比伐卢定而言更优选为约0.50至约3.00mg／kg体重，以及更优选为约0.50至约2mg／kg体重，甚至更优选为约0.75至约1.75mg／kg体重，或者还优选为约1.75至约3.00mg／kg体重或者更优选为约2.25至约2.75mg／kg体重，例如约2.50mg／kg体重；并且就水蛭素而言更优选为约0.2至约0.6mg／kg体重，并且更优选为约0.3至约0.5mg／kg体重，甚至更优选为约0.4mg／kg体重。
现在将通过下述实施例来说明本发明，这不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：材料和方法
细胞制备
从之前所述的健康肝供体(Najimi等，Cell Transplant.，2007，第16卷：717-28)获得成体来源的人肝间充质干细胞(ALDSC、ADHLSC)。细胞悬浮在白蛋白溶液中，该白蛋白溶液包含或不含浓度为10U／ml(或当指定时更多)的肝素。使用冻存／解冻人肝细胞作为对照。肝分离和肝细胞冻存／解冻程序先前已详细公布(Sokal等Transplantation，2003，第76卷，735-738)。如前所述(Lysy等，Hepatology，2007，第46卷，1574-1585)，在签署书面知情同意书后，通过皮肤活检(前臂的中前侧)收集8岁至35岁志愿者的人成纤维细胞。通过抽吸8至67岁死后捐献者的脊椎或髂嵴来采集骨髓标本。根据前述方案(Lysy等，Cell Prolif.，2008，第41卷，36-58)，将吸出物收集到含有10％Hank’s平衡盐溶液(Invitrogen，Merelbeke，Belgium)的肝素化注射器中，并在48小时内进行处理。
成体来源的人肝间充质干细胞悬液的组织因子表达
通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析经典膜结合TF形式和TFPI的存在。按照制造商的说明书，使用Tripure分离试剂盒(Roche AppliedScience，Brussels，Belgium)从0.5×106个细胞提取信使核糖核酸(mRNA)。使用在Invitrogen合成的引物，在Thermocycler仪(Applied Biosystems，Lennik，Belgium)上进行一步RT-PCR。使用在表2中详述的引物实现TF或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的RT-PCR。
表2
| 引物 | 序列 | SEQ ID NO |
| TF正义引物 | 5-TGAATGTGACCGTAGAAGATGA-3 | 1 |
| TF反义引物 | 5-GGAGTTCTCCTTCCAGCTCT-3 | 2 |
| TFPI正义引物 | 5-GGAAGAAGATCCTGGAATATCGAGG-3 | 3 |
| TFPI反义引物 | 5-CTTGGTTGATTGCGGAGTCAGGGAG-3 | 4 |
| GAPDH正义引物 | 5-CGGACTCAACGGATTTGGTCGTAT-3 | 5 |
| GAPDH反义引物 | 5-AGCCTTCTCCATGGTGGT-3 | 6 |
| As-TF正义引物 | 5-TCTTCAAGTTCAGGAAAGAAATATTCT-3 | 7 |
| As-TF反义引物 | 5-CCAGGATGATGACAAGGATGA-3 | 8 |
产物在1％琼脂糖凝胶上通过电泳分离，并在紫外灯下用溴化乙啶可视化。
同样，使用
基因表达测定(列于表3中)，在StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems，California，USA)上实现TF、as-TF、TFPI和亲环蛋白A的实时RT-PCR。就TF表达而言，使用了两种测定，一种(TF通用)扩增存在于膜和可溶性(替换剪接，asTF)形式二者中的区，和另一种(TF膜)扩增仅存在于膜(经典)形式中的区域。针对每个cDNA样品和引物对推导出参数Ct，减去亲环蛋白A Ct以获得ΔCt。然后，通过减去校验基因Ct获得△△Ct，结果表示为mRNA量的倍数变化(图9)。asTF表达计算为TF通用与TF膜的△△Ct差异。然后，所述引物(获自Applied Biosystems)详述于表3中。
表3
成体来源的人肝间充质干细胞悬液的促凝血活性
测量在
德尔塔分析仪(
delta analyzer)(Pentapharm，Munich，Germany)上进行。ROTEM实时评估凝块形成和凝块溶解的动力学和特征。凝血时间(CT)定义为从开始分析直至开始形成凝块的时间，通常直到达到2mm的振幅。凝块形成时间被定义为直至达到20mm振幅的时间。α角定义为中线与通过2mm振幅点(这是CT的结束)曲线的切线之间的夹角。曲线的最大振幅定义为最大凝块硬度。最大溶解表示在测量过程中检测到的最大的纤维蛋白溶解。
简言之，在短暂的休止期之后，吸取300μl全血至在37℃预热的杯中。随后，将悬浮细胞添加到全血(5×105个细胞，如果没有说明的话)中。在指定时，然后向细胞-血液混合物中添加20μl的触发剂(包含在Owren缓冲剂(Siemens，Marburg，Germany)中稀释的组织因子(Innovin，Siemens，Marburg，Germany，最终稀释度1：17000/0.35pM)，接着必要地添加20μl0.2M CaCl2。在钙添加以后，测量自动开始。就血浆测定而言，将细胞(5×105个细胞，如果没有说明的话)在37℃下于3.8ml的柠檬酸化血液中孵育30分钟。孵育之后，将全血以4500rpm离心10分钟。然后300μl的所得血浆可用于该方案，吸取到杯中，接着添加或不添加组织因子和CaCl2。
统计分析
通过Mann-Whitney检验评估统计学显著(＊P＜0.05、＊＊P＜0.01、＊＊＊P＜0.001)差异。采用Kruskal-Wallis检验进行单因素ANOVA分析。
实施例2：成体来源的人肝间充质干细胞的促凝血活性
通过血栓弹力测定方法来证明成体来源的人肝间充质干细胞(ALDSC、ADHLSC)的促凝血活性。如通过血栓弹力测定测试中的凝血时间所评价的，该促凝血活性比成熟肝细胞的促凝血活性更重要(图1)。此外，并且与肝细胞的促凝血活性相反，表明单独使用的未分级肝素、低分子量肝素(数据未示出)、抗维生素K药物(数据未示出)或抗凝血酶药物(水蛭素、比伐卢定)未完全抑制ALDSC促凝血活性(图2至3)。我们发现，伴随(concomitant)使用未分级肝素和水蛭素或比伐卢定是原创性的特异性和协同组合，其使得能够调节成体来源的人肝间充质干细胞的促凝血活性(图4至5)。我们还说明了成纤维细胞、骨髓间充质干细胞的促凝血活性，但骨髓造血干细胞没有(图6至7)。使用类似的实验，伴随使用未分级肝素和水蛭素或比伐卢定也示出调节成纤维细胞和骨髓间充质干细胞的促凝血活性。
实施例3：成体来源的人肝间充质干细胞表达TF
使用RT-PCR测定了TF及其天然抑制因子TFPI在mRNA水平的表达(图8)。TF mRNA(as-TF)的膜形式和替换剪接变体二者都在成体来源的人肝间充质干细胞(ALDSC)中表达。在另外的实验中，使用实时RT-PCR来定量TF、as-TF、TFPI的mRNA水平，如图9所示。
实施例4：细胞移植
ALDSC悬浮在浓度为5×106个细胞/ml的Hibumin(5％)溶液中，该溶液包含碳酸氢盐(0.84g/l)、葡萄糖(2.5g/l)和未分级肝素(10UI/ml)。将ALDSC悬液肠胃外地输注于对象中。在细胞输注过程中，对象接受比伐卢定(1.75mg/kg)。在连续的细胞输注之间，对象接受比伐卢定(0.25mg/kg)2到4小时，这取决于血栓弹力测定测试。
清楚的是，对细胞移植伴随施用抗凝血酶活化剂(例如，肝素)和凝血酶抑制剂(例如，比伐卢定)提高了细胞移植效率和细胞植入的潜力。对细胞移植后伴随施用抗凝血酶活化剂和凝血酶抑制剂降低细胞的促凝血活性，并且预防细胞移植相关的血栓形成以及细胞移植相关的并发症(例如，细胞损失、细胞排斥和炎症)。
实施例5：比伐卢定与肝素的组合预防人肝祖细胞诱导的血栓形成的风险
方法
所述方案，包括在人样品上进行的所有实验、人抗凝血方案的标识外(off label)使用以及知情同意书均经伦理审查委员会批准。
细胞制备物
如前所述(Naiimi等，Cell Transplant.2007；16：717-728)，从健康的肝供体(n=6，年龄为9至44岁)获得hALPC细胞。研究在胰蛋白酶新鲜消化的或者在4至6代冻存/解冻后的细胞。细胞悬浮在白蛋白溶液中，该溶液包含或不含浓度为10U/mL(或更多，在指定时)的肝素。我们还使用了冻存/解冻的人肝细胞作为对照(n=5，年龄为16至44岁)。肝分离和肝细胞冻存/解冻程序之前已经详细公布(Sokal等，Transplantation.2003；76：735-738)。
通过抽吸3名年龄为8至67岁的死后捐献者的脊椎或髂嵴来收集骨髓样品。根据前述方案(Lysy等，Cell Prolif.，2008，第41卷，36-58)，将抽出物收集到含有10％Hank’s平衡盐溶液(Invitrogen，Merelbeke，Belgium)的肝素化注射器中，并在48小时内进行处理。
如之前所述(Lysy等，Hepatology，2007，第46卷，1574-1585)，在签署知情同意书之后，通过18岁到35岁的志愿者(n=3)的皮肤活检(前臂的中前侧)收集人成纤维细胞。
在我们的组织银行(Tissue Bank)进行肝分离之后获得人肝非实质细胞，过滤并对来自3个不同供体(一个新生儿的肝和两个12岁的供体)的细胞悬液进行2次低速离心。接着，根据已建成的方案(
等，JHepatol.2010；52(3)：389-397)，通过Nicodenz(Myegaard，Oslo，Norway)梯度离心来分离人星形细胞。活化的肌成纤维细胞获自分离的星形细胞。
血液
血液获自29岁到40岁的雄性供体(n=5)。
hALPC悬液的促凝血活性
测量在
德尔塔分析仪(
delta analyzer)(Pentapharm，Munich，Germany)上进行。ROTEM实时评估凝块形成和凝块溶解的动力学和特征。凝血时间(CT)定义为从开始分析直至开始形成凝块的时间，通常直到达到2mm的振幅。凝块形成时间被定义为直至达到20mm振幅的时间。α角定义为中线与通过2mm振幅点(这是CT的结束)曲线的切线之间的夹角。曲线的最大振幅定义为最大凝块硬度。最大溶解表示在测量过程中检测到的最大的纤维蛋白溶解。我们集中于CT。
简言之，在短暂的休止期之后，吸取300μl全血至在37℃预热的杯中。随后，将悬浮细胞添加到全血(5×10exp5个细胞，如果没有规定的话)中。然后向细胞-血液混合物中添加20μl的触发剂(包含在Owren缓冲剂(Siemens，Marburg，Germany)中稀释的组织因子(TF)(Innovin，Siemens，Marburg，Germany，最终稀释度1：17000/0.35pM)，接着必要地添加20μl0.2M CaCl2。在添加钙以后，测量自动开始。还确定了细胞的促凝血活性(PCA)而未添加Innovin。为了确定TF在该凝血模型中的作用，在于5％白蛋白中细致洗涤和血栓弹力测定之前，在室温下，将细胞用0.2mg/mL的mAb抗-人TF IgG1(American Diagnostica)或0.2mg/mL的mAb小鼠IgG(克隆11711.11；RnD系统，Abingdon，United Kingdom)孵育10分钟。
就血浆测定而言，将细胞(5×10exp5个细胞，如果没有规定的话)在37℃下于3.8ml的柠檬酸化血液中孵育30分钟。孵育之后，将全血以4500rpm离心10分钟。然后300μl的所得血浆可用于该方案，吸取到杯中，接着添加或不添加Innovin和CaCl2。
对于血浆缺陷测定而言，在添加Innovin和CaCl2之前，将悬浮细胞(5×10exp5个细胞，如果未指定的话)添加到300μl血浆中。
就PCA调节测定而言，将细胞悬浮于5％白蛋白(有或没有浓度为10UI/ml的未分级肝素(Heparin
Leo))中。然后向血液或血浆中添加浓度为1UI/ml的依诺肝素(
Aventis Pharma)(根据出版物，
等，J Hepatol.2010；52(3)：389-397)、浓度为0.34mg/ml的磺达肝素(
GSK)(就成体体重而言，临床剂量外推2.5mg，并且来自出版物(Feng等，Clin Ther.2009；31：1559-1567)、浓度为5.7μg/ml的水蛭素(
Celgène Europe Limited)(临床剂量外推0.4mg/kg)、浓度为10.7μg/ml的比伐卢定(
The Medicines Company)(临床剂量外推0.75mg/kg)。剂量外推基于根据体重的循环血液体积(70ml/kg)。
如果在1800秒后没有观察到凝结，则可强制停止血栓弹力测定。
管圈(tubing loop)
全血实验方案修改自先前所述的模型(Johansson等，Diabetes.2005；54：1755-1762)。由聚氯乙烯管制成(内径6.3mm，长度390mm)并且经过Corline肝素表面处理的圈购自Corline(Uppsala，瑞典)。在添加血液前，用悬浮于磷酸盐缓冲盐水中的细胞样品(5x10exp5)补充圈。然后将5ml来自健康志愿者的非抗凝血液加入到每一个圈中。为了产生约45mL/分钟的血流量，将圈装置放置在37℃孵育箱内的平台摇臂上。在开始之前和开始后30分钟，将血液样品收集到乙二胺四乙酸(终浓度为4.1mmol/L)和柠檬酸盐(终浓度为12.9mmol/L)的管中。在XE-2100自动仪(Sysmex，Japan)上对血小板进行计数并在CA-7000(Sysmex，Japan)上通过免疫比浊测定(Innovance D-Dimer，Siemens，Marburg，Germany)来评价D-二聚体。
抗Xa活性测量
使用适于CA7000(Siemens，Marburg，Germany)的Biophen肝素(LRT)试剂盒进行抗Xa活性测量。简言之，该测定是基于对恒定量的因子Xa的抑制的显色动力学方法，通过在内源性抗凝血酶的存在下检测肝素(或其它抗Xa的物质)，和通过因子Xa过量的因子Xa特异性显色底物的水解。在将悬浮在白蛋白(补充或未补充肝素(10UI/ml、50UI/ml和100UI/ml)中的细胞在血液中孵育30分钟后，在离心血液之后所得的血浆中测量抗Xa活性。
hALPC悬液的TF和TFPI表达
进行免疫荧光研究以评价TF的存在。为此，将人成体肝来源的干细胞放置在盖玻片上，并用4％多聚甲醛(Merck，Darmstadt，Germany)固定20分钟。然后，将这些细胞用Tris碱钠缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH7.4和150mmol/L NaCl)(Organics[VWR]，Leuven，Belgium)中的1％Triton X-100(Sigma，Bornem，Belgium)孵育15分钟，然后用Tris碱钠缓冲液中的3％乳孵育1小时。将一抗(鼠IgG1单克隆抗体(mAb)抗TF(免疫球蛋白[Ig]G1 n4508；American Diagnostica，Andresy，France)在Tri s碱钠缓冲液中稀释(1/50)，并用细胞孵育1小时。所使用的二抗是缀合有荧光素异硫氰酸酯的抗小鼠IgG(Sigma)。通过4-，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；Sigma)显示核。进行阴性实验对照(不存在一抗或二抗)。还通过流式细胞仪分析确定TF的存在。为了检测膜结合形式的TF，在补充有0.5％牛血清白蛋白(FACS缓冲液)的磷酸盐缓冲盐水中洗涤细胞，然后4℃下用在含有10％去补体合并人血清中稀释的FACS缓冲液中稀释的缀合有荧光素异硫氰酸酯(FITC)的IgG1 mAb(抗TF no.4508CJ)(American Diagnostica)或与相应的同型匹配对照mAb(BD Biosciences，Erembogedem，Belgium)孵育20分钟。为了检测细胞质形式的TF，将细胞在室温下用Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences孵育20mn，并用Permwash(BD Biosciences)洗涤。然后在室温下将样品用在permwash中稀释的缀合有FITC的抗TF mAb或与相应的同型匹配对照mAb(BDBiosciences)孵育20分钟。使用BD FACS CANTO II流式细胞仪测量细胞荧光并用BD FACS Diva软件进行分析。
通过免疫细胞化学技术或流式细胞术分析未得到用以评价组织因子途径抑制因子(TFPI)表达的抗TFPI抗体。
通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析了TF和TFPI的两种形式的存在。按照制造商的说明书，使用Tripure分离试剂盒(Roche AppliedScience，Brussels，Belgium)从0.5×10exp6个细胞中提取信使核糖核酸(mRNA)。使用在Invitrogen合成的引物，在Thermocycler仪(AppliedBiosystems，Lennik，Belgium)上进行一步RT-PCR。使用在表2中详述的引物实现TF或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的RT-PCR。
产物在1％琼脂糖凝胶上通过电泳分离，并在紫外灯下用溴化乙啶可视化。
同样，使用
基因表达测定(列于表B)，在StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems，California，USA)上实现TF、as-TF、TFPI和亲环蛋白的实时RT-PCR。就TF表达而言，使用了两种测定，一种(TF通用)扩增存在于膜和可溶性(替换剪接，asTF)形式二者中的区域，和另一种(TF膜)扩增仅存在于膜(经典)形式中的区域。针对每个cDNA样品和引物对推导出参数Ct，减去亲环蛋白A Ct以获得ACt。然后，通过减去校验基因Ct获得△△Ct，结果表示为mRNA量的倍数变化。asTF表达计算为TF通用与TF膜的△△Ct差异。所述引物详述于表3中。
使用CAPAN细胞系作为TF阳性对照，同时使用HUVEC细胞系作为TFPI阳性对照。
患者输注和抗凝血方案
一个3岁的女孩患有严重的OTC缺乏症(＜1％活性)，她是第一个hALPC受体。诊断在出生后12天确立，并且通过DNA分析确认，该DNA分析表明OTC基因亲本等位基因的第6个和第8个外显子的新突变。她接受了2次独立的每kg体重3000万hALPC的输注，该hALPC来自男性供体，输注之间的间隔为2周。该患者共接受了9亿祖细胞。该细胞悬浮在5％白蛋白和肝素(10UI/ml)中。
第一次hALPC输注是在全身麻醉下进行，没有任何预先服药。注射一个剂量的头孢唑啉(40mg／kg)之后，在荧光镜检和超声的引导下将经皮导管置于主门静脉分支。使用50ml注射器以100cc／h的流速进行细胞输注。使用他克莫司(
Astellas Pharma)单疗法(0，1mg／kg)(相当于每天分2mg以2个剂量以达到谷底水平6-7ng／ml)将免疫抑制施用于患者。在输注后施用预防性抗生素治疗，使用头孢唑啉(40mg／kg)进行2次，两次给药之间的间隔为8小时。输注和输注后的疗程不显著，在医院输液3天后，孩子出院。
第二次hALPC输注是在两周之后进行。当时，发生了肝内门静脉分支的局部血栓形成，并导致输入阻滞。通过肝素和香豆素抗凝剂(5mg／天)治疗了该不利事件。
在两个细胞输注疗程后，D-二聚体水平显着升高。该不利事件对患者没有影响，但对其进行了判断以进一步研究祖细胞的促凝血作用。
第二名患者是24岁的男性，他患有中间型I／II克里格勒-纳贾尔综合征(Crigler-Najjar综合征)，不响应苯巴比妥。诊断在出生后1个月确立，并通过DNA分析确认，该DNA分析表明UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1基因突变同时存在L443P突变纯合状态。在经历2天的7次输注中，该患者共接受了22亿个所施用的hALPC。在放置门静脉导管之前，该患者接受了预服药物包括头孢唑啉(1gr)。在超声控制下将导管放置在门静脉系统。在输注之前注射Solumedrol(80mg)。免疫抑制治疗由他克莫司(
Astellas Pharma)构成，目标血药水平为6-8ng／ml。已规定了特定的凝血预防治疗；细胞悬浮在5％白蛋白和浓度为10UI／ml的肝素中。在细胞输注过程中，对象接受了比伐卢定(1.75mg／kg)。根据血栓弹力测定测试，在连续的细胞输注之间，对象接受了比伐卢定(0.25mg／kg)2至4小时。在每次输注开始之前、开始20分钟后和结束时，重复进行凝血测试，其包括血栓弹力测定(CT)、血小板计数(正常值：150至35010exp3／μl)、D-二聚体水平(正常值：<500ng／ml)、凝血酶时间(TT，正常值：15至24秒)、凝血酶原时间(PT，正常值：9至14秒)和部分促凝血酶原激酶时间(PTT，正常值：20至33秒)。在每次输注之后进行肝脏多普勒超声以评价门静脉流。
第三名患者是17岁的青少年，他患有糖原贮积病1a型，通过遗传分析(G188R突变和380insC插入)和肝活检中不存在葡萄糖-6磷酸酶活性而记载。他也在门静脉导管放置前接受了抗生素预防以及在输注前接受了类固醇。应用了相同的免疫抑制方案。经历3天在7次输注中，该患者共接受了30亿所施用的祖细胞以控制复发的低血糖。应用了相同的抗凝血方案和凝血包括肝多普勒超声跟踪。
统计分析
通过Mann-Whitney检验评估统计学显著性(＊P<0.05、＊＊P<0.01、＊＊＊P<0.001)差异。根据Bonferroni校正调节显著值以避免1型误差。采用Kruskal-Wallis检验进行单因素ANOVA分析。
结果
hALPC的促凝血活性
血栓弹力测定方法和管圈
我们通过对人血液和血浆进行血栓弹力测定方法证明了人成体肝祖细胞(hALPC)的促凝血活性(PCA)。如在血栓弹力测定图中评估的，hALPC的凝血时间(CT)小于肝细胞凝血时间(在血液中，117.5±33.8秒(n=15)相比于285.8±87.0秒(n=11)，p<0.001)(在血浆中，112.6±18.4秒(n=9)相比于363.0±180.1秒(n=5)，p<0.05)(图10A和图10B)。对照CT(不添加细胞)测量为在血液中646.2±111.7秒(n=15)和在血浆中781.9±150.5秒(n=9)。在未添加外来TF时，观察到hALPC中相当的PCA(图11)。将没有细胞的hALPC培养基代替细胞放置在凝血弹性图中时，未获得PCA(图12)。
我们也在管圈模型中评价了hALPC的PCA。在用血液孵育hALPC之后，观察到血小板计数减少、D-二聚体水平增加。血小板从295000／μl到109000／μl(实验1)以及从310000／μl到134000／μl(实验2)；D-二聚体从100ng／ml至700ng／ml(实验2)以及从95ng／ml至740ng／ml(实验2)。
间充质细胞的促凝血活性
我们还通过对人全血进行血栓弹力测定方法证明了骨髓间充质干细胞的PCA(279.3±108.3秒(n=3))、皮肤成纤维细胞的PCA(121.8±26.53秒(n=3))和肝脏肌成纤维细胞的PCA(61.7±7.6秒(n=3))。使用骨髓造血干细胞作为非促凝血细胞对照(590.7±25.3秒(n=3))(图13)。
hALPC促凝血活性的调节
我们首先在凝血因子缺乏的血浆中分析了hALPC的PCA。我们表明，当使用因子VII(TF的辅因子)缺乏的血浆时，hALPC的PCA仅部分降低(298.3±42.3秒(n=3)，与正常血浆中的PCA相比p<0.01)(图14)。我们没有观察到因子II(凝血酶)或X缺陷血浆中的hALPC的PCA，就因子V缺乏血浆而言，观察到很低水平(图14)。此外，与肝细胞PCA相比(图15C)，我们发现，hALPC PCA不能完全被未分级肝素(225.8±149.8秒(n=15))、低分子量肝素(112.3±22.5秒(n=3时))或磺达肝素(209.7±149.7秒(n=3时))所抑制(图15A)，即使将剂量增加到高达5倍也是如此(图23)。当在不存在细胞时使用肝素时观察不到凝血。
凝血酶抑制剂药物水蛭素或比伐卢定使得仅部分控制hALPC的PCA(分别为256.3±11.8秒(n=3)和380.8±114.7秒(n=4))(图15B)，即使增加剂量(2×或5×)也是如此(图24和图25)。通过凝血酶抑制剂药物、水蛭素和比伐卢定控制肝细胞的PCA(图15D)。使用比伐卢定，对照血液(不存在细胞)CT为1075.0±107.2，而使用水蛭素时没有观察到可测量的凝血。
抗维生素K药(血液获自用INR2至3治疗的患者)对血栓弹力测定没有影响，甚至对于对照(无细胞)也是如此(数据未显示)。
最后，我们证明，伴随使用比伐卢定和未分级肝素(1240.0±338.7秒(n=3))或依诺肝素(725.0±90.1秒(n=3))或磺达肝素(909.0±421.4秒(n=3))是协同组合，抗凝血酶活化剂和凝血酶抑制剂允许调节hALPC的PCA(图16A和16B)。当组合肝素与依诺肝素或磺达肝素时，没有获得hALPC PCA的完全调节(图26)。
使用类似的实验，我们证明了未分级肝素可控制骨髓间充质细胞、皮肤成纤维细胞的PCA，但对肝脏肌成纤维细胞PCA无影响(图27)。与单独的比伐卢定相比，伴随使用未分级肝素与比伐卢定也示出调控肝脏肌成纤维细胞的PCA(图28)。
hALPC的PCA分析
hALPC表达TF和TFPI
首先用免疫荧光记录TF表达。如图17所示，我们发现所有的细胞都组成型地表达TF(细胞质染色均匀)。hALPC的流式细胞术分析证实了TF的阳性和特异性染色(对于膜结合形式而言为94.9±1.0％，对于细胞质形式而言为93.6±10.2％，与之相比同型对照分别为24.2±6.1％和7.6±5.8％，以及对于无标记细胞而言分别为13.2±7.1％和3.7±4.1％；n=3)。
我们还采用RT-PCR评估了TF及其抑制因子TFPI在mRNA水平的表达(图18)。TF的膜形式和替换剪接变体二者的mRNA都在hALPC中表达。还表达TFPI。在另外的实验中，我们采用实时RT-PCR来定量TF、as-TF和TFPI的mRNA水平。如图19所示，膜TF变体显著表达(n=3)。此外，与肝细胞相比，TF的表达对于hALPC而言更重要(n=3)。与此相反，肝细胞中TFPI的表达水平高于hALPC(n=3)。
通过用抗人TF IgG预孵育细胞来确定TF在PCA的诱导中的作用。如图20所示，如之前所表明的(Fisher等，Transplantation.2000；69：303-307)，与肝细胞相比，hALPC的PCA通过阻断TF仅受到部分地控制(324.8±11.4秒(n=5)，与不存在TF抗体的情况相比p<0.01)。
如图13所示中，在因子VII缺乏的血浆中，我们仅获得了hALPC的PCA的部分控制，证实hALPC的PCA并非完全与TF相关。
hALPC和肝素
在hALPC(0.05±0.03UI／ml)和浓度为10UI／ml的肝素的孵育之后所得血浆中，我们只观察到少的抗Xa活性(图21)，与单独的肝素不存在对hALPC的抗凝血作用相关。
临床应用-特异性抗凝血方案
成功地应用了抗凝血方案，因为两个病人都没有发生血栓形成或出血事件。正如预期的那样，使用比伐卢定，我们观察到TT显著增加和PT的限制。在两个患者中都观察到轻度D-二聚体增加，第一个病人达到1480ng／ml，第二个病人达到1840ng／ml。在这两个病人中都观察到了PTT增加，这与可检测的抗Xa活性相关(图22A和22B)。在两名患者中进行输液的过程中，未发现通过肝多普勒超声的门静脉血流改变。
Claims (19)
1.组合，其包含通过血栓弹力测定所确定的具有促凝血活性的细胞、至少一种抗凝血酶活化剂，和至少一种凝血酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的组合，其中所述细胞选自干细胞和祖细胞。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的组合，其中所述细胞是成体肝来源的祖细胞或干细胞、间充质干细胞(优选骨髓间充质干细胞)、皮肤成纤维细胞或肝脏肌成纤维细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合，其中所述细胞表达组织因子。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合，其中所述细胞包含不依赖于所述细胞之组织因子表达的促凝血活性组分和/或包含对肝素有抗性的促凝血活性组分。
6.组合，其包含至少一种抗凝血酶活化剂、至少一种凝血酶抑制剂，和选自成体肝祖细胞和肝脏肌成纤维细胞的细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合，其配置用于将所述细胞、至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂以任何顺序分开、同时或依次施用于对象。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合，其中所述抗凝血酶活化剂选自未分级肝素、低分子量肝素和磺达肝素，优选为未分级肝素。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合，其中所述凝血酶抑制剂选自比伐卢定和水蛭素，优选为比伐卢定。
10.药物组合物，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的组合和一种或更多种可药用赋形剂。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的组合或根据权利要求10所述的药物组合物，其用作药物。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的组合或根据权利要求10所述的药物组合物，其用于所述细胞的移植；或者用于治疗由所述细胞的移植引起的血栓形成或血栓性并发症；或者用于在体内抑制所述细胞的促凝血活性。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的用途的所述组合或药物组合物，其中所述抗凝血酶活化剂是未分级肝素，其有待通过包含约5至15UI/ml、优选约8至12UI/ml、更优选约10UI/ml的细胞悬液施用于对象，或者通过约10至30UI/kg/小时、优选约15至25UI/kg/小时、更优选约20UI/kg/hr静脉内施用，和/或其中所述凝血酶抑制剂是比伐卢定或水蛭素，其有待分别以约0.50至约3.00mg/kg体重或约0.2至0.6mg/kg体重施用于对象。
14.根据权利要求11或12中任一项所述的用途的所述组合或药物组合物，其中(a)有待制备包含所述细胞在水溶液中的细胞悬液的组合物，所述水溶液包含所述至少一种抗凝血酶活化剂；(b)有待制备包含所述至少一种凝血酶抑制剂的水溶液；以及(c)有待将(a)中定义的所述组合物和(b)中定义的所述溶液同时、分开或依次施用于对象。
15.用于在体外抑制权利要求1至6中任一项所定义之细胞的促凝血活性的方法，其包括提供组合，所述组合包含所述细胞、至少一种抗凝血酶活化剂，和至少一种凝血酶抑制剂。
16.成套的部件或制品，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的组合，并且任选地包括一种或更多种可药用赋形剂。
17.组合或药物组合物，其用于权利要求1至6中任一项所定义的细胞的移植；或者用于治疗由所述细胞的移植引起的血栓形成或血栓性并发症；或者用于在体内抑制所述细胞的促凝血活性，所述组合包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂，所述药物组合物包含所述组合和一种或更多种可药用赋形剂。
18.根据权利要求17所述的用途的所述组合或药物组合物，其还包括权利要求2至9、13或14中任一项所定义的一种或更多种表征性特征。
19.用于在体外抑制权利要求1至6中任一项所定义之细胞的促凝血活性的方法，其包括使所述细胞与包含至少一种抗凝血酶活化剂和至少一种凝血酶抑制剂的组合相接触。
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