CN102634545A - 一种利用蔗糖糖蜜发酵生产l-苹果酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用蔗糖糖蜜发酵生产L-苹果酸的方法，以黄曲霉为出发菌株，蔗糖糖蜜为主要生产原料，通过摇床培养考察糖蜜生产L-苹果酸的发酵条件。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种利用蔗糖糖蜜发酵生产L-苹果酸的方法。
背景技术
苹果酸，又名羟基琥珀酸或羟基丁二酸，分子式为C4H6O5，分子量134.09，结构式为HOOCCHOHCH2COOH。主要有三种苹果酸：L-型苹果酸，比较广泛的存在于自然界中，密度1.595，熔点100℃，分解点140℃，比旋光度-2.3°（8.5克/100毫升水），易溶于水、甲醇、丙酮等，不溶于苯；而D-型苹果酸和DL-混合型苹果酸则主要为化学合成，前者密度1.595，熔点101℃，分解点140℃，比旋光度+2.92°（甲醇），溶于水、甲醇、乙醇、丙酮。等量的左旋体和右旋体混合得外消旋体，密度1.601，熔点131-132℃，分解点150℃；溶于水、甲醇、乙醇、丙酮等，不溶于苯。由于L-苹果酸分子中含有羟基和羧基，因此对极性溶剂的溶解度大，化学性质较为活泼。在常温下它极易溶于乙醇及乙醚中，在水中其溶解度随水温的升高而增大，呈强酸性。其酸性随浓度的升高而增加，可进行两步解离（K1=3.9×10-4，K2=7.5×10-6）。
L-苹果酸是生物体代谢过程TCA循环中产生的一种重要有机酸，作为优良的酸味剂和保鲜剂，在食品、医药、化工、日化和保健等领域具有广泛用途。由于L-苹果酸口感接近天然苹果的酸味，且与柠檬酸相比具有酸度大、味道柔和、滞留时间长等特点，具有特殊的香味并且不损伤口腔和牙齿等特点，已被广泛用于高档饮料、食品等行业。有研究表明，L-苹果酸有可能替代柠檬酸成为新一代食品添加。苹果酸与柠檬酸配合使用，可以模拟天然果实的酸味特征，使口感更自然、协调、丰满。清凉饮料、粉末饮料、乳酸饮料、乳饮料、果汁饮料中均可添加苹果酸改善其口感和风味，苹果酸常与人工合成的二肽甜味剂阿斯巴甜(ASPARTME) 配合使用，作为软饮料的风味固定剂。也可用作天然果子露保色剂、蛋黄酱乳稳定剂、果酱调整剂、甜味辅助剂、酵母生长促进剂等。在欧美各国及日本的食品饮料生产中，苹果酸已成为不可缺少的基本原料之一。目前，美国年消耗在1500万磅以上，其中90%用于食品和饮料加工。另外 ，苹果酸可形成许多衍生物，日本近几年已成功地将苹果酸盐应用于减糖、减盐食品中，应用苹果酸某些盐类代替食盐浸渍咸菜时，其咸味仅有食盐1/5- 1/7 情况下，而浸渍效果却是食盐的两倍，同时可以做为肾炎患者的食盐代用品；在豆浆中添加苹果酸钙盐，可有效地改善其口感和风味；利用苹果酸的抗疲劳、护肝、肾、心脏作用可以开发保健饮料。食品中添加L-苹果酸可使pH得到调整，加上其本身所具有的抗菌作用，L-苹果酸亦被广泛应用于其他食品工业，如用作水产品的保鲜剂等。
苹果酸的生产方法主要有化学合成法、发酵法、转化法。化学合成法生产的苹果酸在应用上受到限制。转化法主要是固定化酶和固定化细胞转化。20世纪80年代末以来，对转化工艺的研究获得突破，并成功地应用于工业化生产。而发酵法生产苹果酸的研究还未有重大进展，非糖质原料发酵法尚处于实验室水平。糖质原料发酵法工艺中，一步发酵法和混合发酵法都有较大进展，但有关的研究报道尚少。而混合发酵法由于涉及到两种微生物，培养条件要求比较严格，发酵周期较长，产酸率较低，副产物较多。因此，本专利以黄曲霉为出发菌株，蔗糖糖蜜为主要生产原料，通过摇床培养考察糖蜜生产L-苹果酸的发酵条件，通过对培养基装液量、转速、发酵温度和氮源加入量的优化，其产酸水平最高可达70 g/L。
发明内容
本发明提供了一种利用蔗糖糖蜜发酵生产L-苹果酸的方法，本专利以黄曲霉为出发菌株，蔗糖糖蜜为主要生产原料，通过摇床培养考察糖蜜生产L-苹果酸的发酵条件，通过对培养基装液量、转速、发酵温度和氮源加入量的优化，其产酸水平最高可达70 g/L。
1. 一种利用蔗糖糖蜜发酵生产L-苹果酸的方法，其特征在于发酵时，500 mL三角瓶装一定量的培养液，发酵温度28-40℃，摇床转速150-300 r /min，发酵时间6 d。
2. 步骤1所述的发酵培养基：糖蜜用硫酸与亚铁氰化钾预处理后，稀释至总糖浓度120 g /L，加( NH4)2SO4 1 g/L，K2HPO4 0. 15 g/L，KH2PO4 0.15 g/L，CaCO3 70 g/L(单独灭菌，接种前加入)，pH 值5.5。
3. 步骤2所述的糖蜜预处理：糖蜜用1:1去离子水稀释后，加硫酸至pH值2.0-3.0，静置过夜，过滤，滤液加入新配制的石灰乳回调至pH值6.0 左右，65-70℃保温30 min，同时加1%活性炭，过滤，滤液加0.1% 亚铁氰化钾，调pH值6.5，同时加1%活性炭过滤，搅拌30 min，过滤，滤液供制备发酵培养基。
4. 步骤1所述的最佳培养液体积是90 mL。
5. 步骤1所述的最佳摇床转速为200 r/min。
6. 步骤1所述的最佳发酵温度为36℃。
7. 步骤2所述的糖蜜培养基需添加1.0 g/L硫酸铵为N源。
附图说明
图1发酵温度对L-苹果酸合成的影响。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
本专利所用的菌株为黄曲霉，购自于ATCC，编号为:31719。
实施例1
本实施例说明糖蜜预处理对黄曲霉生长与L-苹果酸产率的影响，糖蜜用1：1去离子水稀释后，加硫酸至pH 值2.0-3.0，静置过夜，过滤，滤液加入新配制的石灰乳回调至pH 值6.0 左右，65-70 ℃ 保温30 min，同时加1%活性炭，过滤，滤液加0.1% 亚铁氰化钾，调pH 值6.5，同时加1%活性炭过滤，搅拌30 min，过滤，滤液供制备发酵培养基。试验以未处理培养基作对照，未处理培养基指糖蜜不经任何预处理，直接稀释至糖浓度12%后按要求添加其发酵时，500 mL三角瓶装100 mL 培养液，发酵温度35℃，摇床转速200 r /min，发酵时间6 d。结果见表1。
由表1可以看出，硫酸处理主要是减少糖蜜中胶体物质对黄曲霉生长的抑制作用，用经预处理的糖蜜作培养基时，黄曲霉的最大生物量比未处理的要高62%; 亚铁氰化钾处理主要是减少糖蜜中的金属离子浓度，金属离子对产酸的影响很复杂，离子种类与浓度对产酸与酸的种类都有影响，表1表明，预处理对L-苹果酸产量与纯度有一定促进作用，预处理后L-苹果酸含量提高了1.27倍。
表1 糖蜜处理对黄曲霉的生长与L-苹果酸合成的影响
实施例2
本实施例说明三角瓶装液量对黄曲霉发酵产L-苹果酸产量的影响，CO2固定反应途径在L-苹果酸的产生和积累中起着重要作用，尽管CO2固定反应是不需要氧参与的，但在实际发酵中要获得较高的L-苹果酸产量，氧的供给是需要的。该试验对500 mL三角瓶的装液量对L-苹果酸产率的影响进行了研究。500 mL三角瓶装液量分别为30 mL，50 mL，70 mL，90 mL，110 mL，发酵温度35℃，摇床转速200 r /min，发酵时间6 d。
由表2可知，装液量在90 mL时，可获得较高的L-苹果酸产量为64.2 g/L。
表2 三角瓶装液量对L-苹果酸产量的影响
| 装液量/mL | 总酸（g/L） | L-苹果酸（g/L） |
| 30 | 70.6 | 43.3 |
| 50 | 72.8 | 55.4 |
| 70 | 79.5 | 60.2 |
| 90 | 85.6 | 64.2 |
| 110 | 92.7 | 59.2 |
实施例3
本实施例说明摇床转速对黄曲霉L-苹果酸产量的影响，摇床转速分别为100 r/min，150 r/min，200 r/min，250 r/min。500 mL三角瓶装液量分别为90 mL，发酵温度35℃，发酵时间6 d。
表3结果表明：摇床转速较低时，菌丝易形成菌球，不利于L-苹果酸的形成；转速在200 r/min时，对L-苹果酸形成有利。供氧不足时，总酸形成较多，L-苹果酸含量低，杂酸多; 而供氧过量时，总酸与L-苹果酸含量均较低，说明氧化代谢过度。
表3摇床转速对黄曲霉产L-苹果酸的影响
| 转速（r/min） | 总酸（g/L） | L-苹果酸(g/L) |
| 100 | 84.8 | 46.7 |
| 150 | 76.5 | 60.6 |
| 200 | 80.3 | 66.5 |
| 250 | 75.2 | 49.7 |
实施例4
本实施例说明温度对黄曲霉生产L-苹果酸产量的影响，温度分别为：20℃，24℃，28℃，32℃，36℃，40℃，500 mL三角瓶装液量分别为90 mL，200 r/min，发酵时间6 d（图1）。
由图可以看出，黄曲霉生产L-苹果酸的最适发酵温度为36℃。
实施例5
本实施例说明N源对黄曲霉生产L-苹果酸产量的影响，分别添加硫酸铵1 g/L，硝酸铵1 g/L，硝酸钾1 g/L，氯化铵1 g/L，尿素1 g/L，蛋白胨5 g/L，豆饼粉5 g/L。500 mL三角瓶装液量分别为90 mL，发酵温度36℃，200 r/min，发酵时间6 d。
糖蜜含有一定的有机N(0.1%)与生物素等有机活性物质，在选择外源N 源时主要考虑无机N。由表4 可知，无机N 源好于有机N 源。试验发现，有机N 源耗糖速度慢、残糖量高。有机N源与无机N源结合使用时，效果不如无机N 源单独使用，这可能与糖蜜有一定有机N 源，不需额外添加有关。无机N 以硫酸铵效果最好。对硫酸铵的添加量进行了试验，结果表明，硫酸铵的适合添加量在1.0 g/L。
表4 N源对黄曲霉产L-苹果酸的影响
| N源种类 | 浓度 | 生物量(g/L) | 残糖(g/L) | L-苹果酸（g/L） |
| 对照 | 0 | 8.8 | 33.6 | 42.5 |
| 硫酸铵 | 1 | 21.5 | 7.6 | 69.5 |
| 硝酸铵 | 1 | 19.8 | 6.5 | 60.7 |
| 硝酸钾 | 1 | 14.6 | 13.7 | 53.4 |
| 氯化铵 | 1 | 12.6 | 11.2 | 57.7 |
| 尿素 | 1 | 20.2 | 4.6 | 62.2 |
| 蛋白胨 | 5 | 22.4 | 5.2 | 46.2 |
| 豆饼粉 | 5 | 16.9 | 16.5 | 53.3 |
Claims (7)
1.一种利用蔗糖糖蜜发酵生产L-苹果酸的方法，其特征在于发酵时，500 mL三角瓶装一定量的培养液，发酵温度28-40℃，摇床转速150-300 r/min，发酵时间6 d。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基：糖蜜用硫酸与亚铁氰化钾预处理后，稀释至总糖浓度120 g/L，加( NH4)2SO4 1 g/L，K2HPO4 0. 15 g/L，KH2PO4 0.15 g/L，CaCO3 70 g/L(单独灭菌，接种前加入)，pH 值5.5。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于糖蜜预处理：糖蜜用1:1去离子水稀释后，加硫酸至pH值2.0-3.0，静置过夜，过滤，滤液加入新配制的石灰乳回调至pH值6.0 左右，65-70℃保温30 min，同时加1%活性炭，过滤，滤液加0.1% 亚铁氰化钾，调pH值6.5，同时加1%活性炭过滤，搅拌30 min，过滤，滤液供制备发酵培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于培养液体积是90 mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于摇床转速为200 r/min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于发酵温度为36℃。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于糖蜜培养基添加1.0 g/L硫酸铵为N源。
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