CN101932593B - 稳定蛋白和多肽的方法 - Google Patents

稳定蛋白和多肽的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101932593B
CN101932593B CN200980103486.9A CN200980103486A CN101932593B CN 101932593 B CN101932593 B CN 101932593B CN 200980103486 A CN200980103486 A CN 200980103486A CN 101932593 B CN101932593 B CN 101932593B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
seq
sequence
aminoacid sequence
nano antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200980103486.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101932593A (zh
Inventor
让-吕克·若尼奥
马克·约瑟夫·劳韦里斯
帕特里克·斯坦森斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ablynx NV
Original Assignee
Ablynx NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ablynx NV filed Critical Ablynx NV
Publication of CN101932593A publication Critical patent/CN101932593A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101932593B publication Critical patent/CN101932593B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

修饰且特别是稳定蛋白和多肽的方法，通过该方法将预先确定的氨基酸引入至所述蛋白或多肽的选择位置中以产生一小组突变体。该方法基于以下的前提，即，某些氨基酸在蛋白或多肽的稳定性方面具有关键的作用。然后可以进一步分析生成的突变体的稳定性和/或功能，例如，亲和性。此外，可以组合适当的突变体，以产生进一步优化的蛋白或多肽。另外，提供了被稳定的实例多肽和适当的鉴定和/或分析去稳定或稳定的蛋白或多肽的方法。该方法可用来研究特定氨基酸在蛋白结构和功能中的作用，和用来开发新的或改善的，例如稳定的蛋白和多肽诸如抗体和单可变结构域。

Description

稳定蛋白和多肽的方法
修饰且特别是稳定蛋白和多肽的方法，通过该方法将预先确定的氨基酸引入至所述蛋白或多肽的选择位置中以产生一小组突变体。该方法基于以下的前提，即，某些氨基酸在蛋白或多肽的稳定性方面具有关键的作用。然后可以进一步分析生成的突变体的稳定性和/或功能，例如，亲和性。此外，可以组合适当的突变体以产生进一步优化的蛋白或多肽。另外，提供了被稳定的实例多肽和适当的鉴定和/或分析失稳或稳定的蛋白或多肽的方法。该方法可用来研究特定氨基酸在蛋白结构和功能中的作用和用来开发新的或改善的，例如稳定的蛋白和多肽诸如抗体和单可变结构域。
随机化诱变或其他用于蛋白稳定的策略受到一些限制。包括在这些限制中的有，可以产生大量的突变体，在实践中不能从这些突变体中选择将是提供信息的或具有所需特性的突变体。例如，没有可靠的方式来预测蛋白或多肽中特定氨基酸的置换、缺失或插入是否将对蛋白/多肽具有局部或整体的效应，并且因此是否有可能产生有用的信息或功能。即使突变限于蛋白的某些区域，诸如蛋白的活性或结合位点处的区域或其周围，潜在突变的数目可以是非常大的，使得难以或不可能以合理的方式鉴定和评价产生的这些突变。例如，单氨基酸位点被所有其他的天然存在的氨基酸置换产生19种不同的蛋白变异体。如果几个位点一次被置换，则变异体的数目指数性地增加。对于在蛋白的10个氨基酸位点用所有氨基酸的置换，产生蛋白的19x 19x 19x 19x 19x 19x 19x 19x 19x 19或6.1 x 1012个变异体，有用的突变体必须从其中选择。由此得出结论，为了有效地在蛋白的稳定中利用诱变，突变的类型和数目必须进行接受一些限制性标准，这些标准使生成的突变蛋白的数目保持在适于分析的数目。
本发明涉及一种用于生成新的或稳定的蛋白(或多肽)的选择或诱变的方法，以及由该方法生成的突变蛋白和特定突变蛋白的文库。诱变的目标蛋白、肽或多肽可以是天然的、合成的或改造的蛋白、肽或多肽，例如，抗体，单可变结构域诸如纳米抗体或dAbs，包含一个或多个单可变结构域的多肽或变异体(例如，突变体)。在一个实施方案中，该方法包括将预先确定的氨基酸引入至蛋白的氨基酸序列的预先规定的氨基酸(或几个氨基酸)的各个位置和每个位置中。突变体可以是a)单个地生成并且因此被单独地加工和/或评价，或b)可生成蛋白文库，其含有在一个或多个预先规定的氨基酸位置以及从整体上在每个位置中具有预先确定的氨基酸的突变蛋白。该方法允许系统地评价特定氨基酸在蛋白，例如，抗体或单可变结构域的稳定中的作用。
本发明鉴定出在保存期间生成的蛋白例如抗体或单可变结构域的一些主要变体是如下的结果：
i.典型地仅在“可接近的”甲硫氨酸中发生的(多个)氧化作用事件(如果仅有一个氧化事件则为+16Da变异体)，其中在保存期间氧化作用随着温育温度和时间平行地增加，
ii.如果存在，E1的环化作用，导致焦谷氨酸的形成，以及
iii.天冬氨酸或天冬酰胺的异构化或脱酰胺作用，例如，在DG，DS，NG或NS基序中，其中在保存期间异构化作用随着温育温度和时间平行地增加。
本发明利用此观察结果并且提供了一种便利的方法以集中于这些可能的不稳定的“来源”并且使用此信息来选择先导候选物，或生成a)进一步被稳定的蛋白、抗体或单可变结构域的单个突变体，其可通过定向诱变来提供，或b)突变蛋白、抗体或单可变结构域的文库，其可通过合成编码针对含有预先确定的氨基酸的区域设计的氨基酸序列的所有变异的寡核苷酸的单一混合物来生成。在本发明的实施方案中，通过在合成的各个缩合步骤中掺入要被诱变的序列(例如，野生型序列)的核苷酸和所述预先确定的氨基酸的密码子所需的核苷酸而合成此寡核苷酸混合物。在被诱变的序列的核苷酸与所述预先确定的氨基酸的核苷酸相同时，不加入额外的核苷酸(还参见，例如WO9115581)。
在本发明的具体实施方案中，提供了预先规定的氨基酸来替换所述被鉴定的蛋白、多肽、抗体或单可变结构域的不稳定“来源”，例如，通过选择性诱变，以及随后对所述蛋白、多肽、抗体、或单可变结构域的例如功能、例如结合特性的分析而进行。
此诱变方法可用来生成小的突变蛋白或文库组，其具有用于筛选例如结合亲和力的实用的大小。该方法可用来研究特定氨基酸在蛋白稳定性和功能中的作用以及开发新的或稳定的蛋白和多肽诸如酶、抗体、其结合片段或类似物、单链抗体、单可变结构域、纳米抗体dAbs、单结构域抗体和催化抗体。
发明详述
蛋白的研究已经揭示，某些氨基酸在其稳定性和功能中具有关键的作用。例如，似乎仅有不定数目的氨基酸参与了酶的催化事件或抗体的结合。
尽管明确某些氨基酸特别易于去稳定，如果可能，也难以明确地预测氨基酸必须占用哪个(或哪些)位置以具有此类效应。不幸地是，对蛋白中氨基酸侧链的复杂空间构型和例如抗体的构架或CDR区内的不同侧链的相互关系的理解不足以进行此类预测。如上面所指出的，鉴于在甚至很小的蛋白、肽或多肽中可能的变异的庞大数目，随机化诱变对于研究蛋白稳定性和功能的实用性有限。
本发明的方法提供了一种系统的和实用的方式用于评价特定氨基酸以及它们在蛋白的规定区域内的位置对蛋白的稳定性和功能的重要性，以及用于产生有用的，例如稳定的蛋白。该方法首先假设某些预先确定的氨基酸对于蛋白，例如抗体的特殊稳定性是重要的(参见，例如AA Wakankar等，2007，Biochemistry(生物化学)，46，1534-1544对天冬氨酸在抗体的CDR区中的异构化的研究)。
使用预先确定的氨基酸的选择，通过将预先确定的氨基酸掺入至蛋白的各个选择的氨基酸位点而生成要研究的蛋白的突变体文库。如在表B-2中所列举的，根据本发明所提议的法则来生成不同的突变体。
专业技术人员理解，这是本文所述所有实施方案的普遍方面，即在选择适当的氨基酸以替换所选择的残基时，可以采用另外的考虑，例如，降低多肽包括纳米抗体或Dabs的免疫原性。例如，在纳米抗体的情况下，其可以有利地选择用于替换M(或如本文所讨论的任何其他的残基或基序)的氨基酸，其存在人构架区的相应位置中。对于其他的参考文献，专业技术人员也可考虑WO 2009/004065和/或WO 2009/004066的教导。
突变蛋白的文库包含在被设计用于替换的每个选择的氨基酸处具有预先确定的氨基酸的单个蛋白。相对于例如通过完全随机突变或例如“预排(walk through)”突变生成的突变体文库，所述蛋白文库将具有包含具有提高的稳定性并且保留了功能活性的突变体的较高可能性。因此，所需类型的突变浓缩在文库中。这是重要的，因为其允许更快地和更详细地分析在适当的时间范围内生成的突变体。
在另一个实施方案中，预先确定的氨基酸(例如，替换被鉴定的可能具有不稳定性的氨基酸的其他天然存在的19个氨基酸之一)替换蛋白的DG，DS，NG或NS基序中的已鉴定的氨基酸，其中所述基序暴露于溶剂，例如，此类已鉴定的氨基酸基序可见于抗体的CDR中。优选预先确定的氨基酸选自Q，E的组，如果D或N要被替换则优选E，或如果S或G要被替换则优选T或A。在进一步的实施方案中，预先确定的被替换的氨基酸，例如其他天然存在的19个氨基酸之一，替换已鉴定的甲硫氨酸，优选所述甲硫氨酸对强制氧化作用敏感，并且优选所述预先确定的氨基酸氨基选自由A和T组成的氨基酸的组。在进一步的实施方案中，预先确定的氨基酸，例如，其他天然存在的19个氨基酸之一，优选D，替换末端的E(如果存在的话)。基于被诱变分子和/或所需结构的结构信息或建模的其他考虑可进一步用来使诱变的候选位置的子集有组织或缩小。此外，通过某些已鉴定位点的丙氨酸筛选可快速地鉴定对要被稳定的蛋白的功能特性关键的氨基酸。在进一步的实施方案中，来自不同突变体的知识可组合在一起，并且可生成具有一个以上的诱变氨基酸(与该方法开始所使用的原始蛋白相比)的突变体。
在另一个实施方案中，本发明提供了使蛋白(诸如，例如包含单可变结构域的多肽)的稳定性以下列的方式被改变的方法，即这些蛋白被特异性地稳定，去稳定或可在去稳定措施后再稳定。假定，所需效应是使蛋白去稳定(例如，短的体内半衰期是很重要的，例如，对于功能性地参与到凝血中的分子是很重要的)，本发明的方法基本上被反向进行。简言之，在适当的区域中引入去稳定的氨基酸基序诸如DG，DS，NG或NS，即，非功能性的，例如，对于抗体来说，不直接地参与到结合中的区域，或替换例如，适当的，即暴露于溶剂的DG，DS，NG或NS基序。优选地任何此类突变体不丧失关键的生物学功能性，诸如，例如，抗体的亲和力或酶的催化活性。
文库的大小将依赖于被诱变的氨基酸的数目而变化。优选的，文库将被设计含有小于50个突变体，和更优选小于40个，更优选小于30个，更优选小于20个，更优选小于10个突变体。
在另一种方式中，目的基因存在于单链质粒上。例如，基因可被克隆进M13噬菌体载体或具有丝状噬菌体复制起点的载体中，这些载体使用辅助噬菌体而允许单链分子的扩增。单链模板可与一组简并探针复性。探针可被延伸和连接，因此将各个变体链掺入至一群分子中，这些分子可被引入至适当的宿主中(Sayers，J.R.等，Nucleic Acids Res.(核酸研究)16：791-802(1988))。此方式可绕开其中选择多个结构域用于诱变的多个克隆步骤。
聚合酶链式反应(PCR)方法学也可用来将简并寡核苷酸掺入至基因中。例如，简并寡核苷酸本身可用作延伸的引物。
在此实施方案中，A和B是编码诱变盒或“窗”的简并寡核苷酸，并且这些窗彼此互补(寡聚体的Z型部分代表简并部分)。A和B也含有与3′端上用于扩增的模板互补的野生型序列并且因此是能够生成掺入窗的扩增引物。C和D是可扩增整条基因或目的区域的寡核苷酸，包括掺入了诱变窗的那些寡核苷酸(Steffan，N.H.等，Gene(基因)77：51-59(1989))。从A和B扩增的延伸产物可通过它们的互补窗杂交，并且提供用于使用C和D作为引物产生全长分子的模板。C和D可被设计为含有用于克隆的方便位点。然后扩增的片段可被克隆。
通过上面技术或其他适当技术的任意一种生成的突变体文库可被筛选以鉴定具有所需稳定性和活性的突变体。筛选可通过任何适当的方式来完成。例如，可通过适当的测定来确定亲和力，所述测定例如，BiaCore测定，标准免疫测定和/或亲和层析。
本发明的方法可用来稳定蛋白，所述蛋白根据本发明被鉴定为具有可能的不稳定源。前面的记载集中在蛋白，但应该理解的是该方法适用于多肽、抗体、包含单可变结构域的多肽诸如纳米抗体和dAbs以及多亚基蛋白。被提议在野生型蛋白中通过本发明的方法诱变的氨基酸可以多于一个，并且优选地不影响野生型蛋白的其他特性。
通常，研究的区域将是蛋白的功能结构域诸如结合或催化结构域。例如，该区域可以是免疫球蛋白的超变区(互补决定区或CDR)、酶的催化位点或结合结构域。
如所提及的，如果氨基酸已知或被认为参与到稳定性而非目的功能中，则选择用于诱变的氨基酸通常从那些已知的氨基酸中选择。仅就其侧链而言，20种天然存在的氨基酸是不同的。各条侧链负责化学特性，使各种氨基酸变得独特。对于综述，参见G. E.Schulz和R.M.Schirner的Principles of Protein Structure(蛋白结构原理)，1988，Springer-Verlag。
从侧链的化学特性来看，似乎仅有选择数目的天然氨基酸优先地参与到催化事件中。这些氨基酸属于极性和中性氨基酸的组，诸如Ser，Thr，Asn，Gln，Tyr，和Cys，带电荷氨基酸的组，Asp和Glu，Lys和Arg，并且特别是氨基酸His。
典型的极性和中性侧链是Cys，Ser，Thr，Asn，Gln和Tyr的那些侧链。Gly也被认为是此组的临界成员。Ser和Thr在形成氢键中具有重要作用。Thr在β碳处具有额外的不对称性，因此仅使用其中一个立体异构体。酰胺酸Gln和Asn也可形成氢键，酰氨基作为氢供体起作用，羰基作为接受体起作用。Gln比Asn多一个CH.sub.2基团，其使极性基团更为柔性，并且减少其与主链的相互作用。Tyr具有非常极性的羟基(酚的OH)，其可在高pH值下解离。Tyr表现得有点类似带电荷侧链；其氢键比较强。
在表面处以及蛋白分子内可见中性的极性酸。作为内部残基，它们通常彼此或与多肽主链形成氢键。Cys可形成二硫键。
组氨酸(His)具有杂环芳族侧链，其pK值为6.0。在生理性pH范围内，在从溶液中摄取氢离子后，其咪唑环可以是不带电或带电的。因为这两种状态很容易达到，His十分适合用于催化化学反应。其见于大多数的酶的活性中心中。
在生理性pH下Asp和Glu是带负电荷的。因为其侧链短，相对于主链Asp的羧基比较刚性。这可能是为什么在许多催化位点中的羧基由Asp提供而非由Glu的原因。在蛋白的表面处通常可见带电荷的酸。
另外，Lys和Arg见于表面处。它们具有长的和柔性的侧链。在周围溶液中摆动，它们增加蛋白球状体的溶解度。在一些情况下，Lys和Arg参与形成内部盐桥或它们协助催化。因为它们暴露在蛋白的表面处，Lys是较常被酶攻击的残基，酶修饰侧链或在Lys残基的羰基端处裂解肽链。
为了向一个区域中引入对催化性重要的氨基酸的目的，本发明优先地涉及一种诱变，其中预先确定的氨基酸是下列氨基酸组中的一种：Ser，Thr，Asn，Gln，Tyr，Cys，His，Glu，Asp，Lys和Arg。然而，为了改变结合或产生新的亲和力的目的，可选择20种天然存在的氨基酸的任意一种。
重要的是，蛋白的几种不同的氨基酸可被同时或顺序地诱变。相同的或不同的氨基酸可在可能的不稳定源的各个已鉴定的氨基酸位点中“预排”，并且检查它们保留或不保留功能，例如结合特性。
本发明的方法开启了设计不同类型的稳定蛋白的新的可能性。新的结构可通过本发明的方法仅突变相关的氨基酸而构建在已有蛋白的天然“支架”上。
本发明的方法特别地用于修饰抗体分子。如本文所使用，抗体分子或抗体是指抗体或其部分，诸如全长抗体，Fv分子或其他抗体片段，其单个链或片段(例如，Fv的单链)，单链抗体，单可变结构域诸如纳米抗体或dAbs和嵌合抗体。本发明的方法所提议的改变可引入至抗体的可变区和/或构架(恒定)区中。可变区的修饰可产生具有较好稳定性而且具有较好的抗原结合性以及催化性的抗体。
本发明的方法特别适于设计包含单可变结构域的稳定多肽，以及所述包含稳定的单可变结构域诸如纳米抗体结构域抗体、单结构域抗体、“dAb”或其格式化形式的多肽，例如包含具有多价或多聚体结合特性的纳米抗体和/或dAbs的多肽在诊断学和/或治疗学中的新用途。
包含单可变结构域的多肽在诊断学和治疗学中的应用是一个正在快速扩张的领域，并且关于所述包含单可变结构域的多肽的研究正在特别地关注延长药物的体内半衰期以及获得药物在较高温度下(例如室温以上)规章可批准的长期保存性的可能性。
天然单可变结构域诸如例如来源于美洲驼(Llamas)的纳米抗体，或遗传改造的骆驼源化dAbs没有为长期保存稳定性和/或长期体内功效而优化，因此它们中的至少一些可能仍然是去稳定的，尽管它们通常被认为比常规抗体更稳定，即，它们不够稳定以适应规章所要求的特定温度下的保存时间或在机体温度下在体内延长的半衰期。
因此，在本领域中存在着鉴定包含此类单可变结构域的多肽中可能的不稳定源并且找到修饰所述多肽的方法的需求，例如使所述多肽稳定或去稳定的方法的需求。本发明特别地集中在通过氨基酸序列的特定突变来修饰所述包含单可变结构域的多肽的方法，例如使所述多肽稳定或去稳定的方法。
类似于如上所讨论的基本原理，本发明的方法提供了下列主要策略的一种或多种来达到包含至少一个单可变结构域的多肽的修饰的，例如改善的或降低的稳定性模式：a)避免Asp(D)和Asn(N)的异构化，即，检查存在Asp(D)和Asn(N)的序列，特别是单可变结构域的CDR中的Asp-Gly(DG)，Asp-Ser(DS)，Asn-Gly(NG)和Asn-Ser(NS)，并且用其他氨基酸替换Asp和/或Asn，使得保留至少一种生物活性，例如，亲和力，例如，用另一个氨基酸诸如Glu(E)或Gln(Q)替换相关的Asp和/或Asn；b)避免Met的氧化，例如，检查对氧化特别是强制氧化敏感的Met，并且如果不能抵抗氧化或强制氧化，则用其他的氨基酸替换Met，使得保留至少一种生物活性，例如，亲和力，例如，用其他氨基酸诸如例如Ala或Thr替换相关的Met；和/或c)避开或通过备选的N-末端，例如Asp替换N-末端Glu。在包含至少一个单可变结构域的多肽应该被去稳定，例如，用于急性和/或局部治疗并且其中仅需要短期功效，例如，在手术期间增加凝血的情况下，上述策略可反向使用，例如，通过NG，NS，DG或DS基序替换CDR中的NX或DX以促进Asp-或Asn-异构化，优选Asp-异构化。
在本发明的一个实施方案中，一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码N或D，优选NG，NS，DG或DS的核苷酸序列；和
b)如果存在编码所述二肽序列的所述核苷酸序列，则突变所述编码N或D的核苷酸序列；以及
c)用以此方式修饰的基因转化合适的，例如原核或真核生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
如果需要，可从生物体中分离单可变结构域，并且任选地根据本领域专业技术人员所熟悉的方法进行纯化。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码NG，NS，DG或DS的核苷酸序列；和
b)如果存在编码所述二肽序列的至少一个核苷酸序列，则生成包含多肽衍生物(或基本上由其组成)的突变体的文库，其中在要被稳定的多肽中发现NG或DG的情况下，a)中的一个或多个所述已鉴定的核苷酸序列用编码EG，QG，ES，QS，NA，NT，DA或DT，优选编码EG或QG的核苷酸序列替换，或在要被稳定的多肽中发现NS或DS的情况下用编码ES或QS的核苷酸序列替换；以及
c)用以此方式修饰的基因转化合适的例如原核或真核生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码NG，NS，DG或DS基序的核苷酸序列，其中所述氨基酸或基序是表面暴露的，并且其中供给氢键的残基紧密接近不稳定的N或D；和
b)如果a)中的核苷酸序列被鉴定，则生成包含多肽衍生物(或基本上由其组成)的突变体文库，其中在要被稳定的多肽中发现NG或DG的情况下，a)中的一个或多个所述已鉴定的核苷酸序列用编码EG，QG，ES，QS，NA，NT，DA或DT，优选编码EG或QG的核苷酸序列替换，或在要被稳定的多肽中发现NS或DS的情况下用编码ES或QS的核苷酸序列替换；以及
c)用以此方式修饰的基因转化合适的例如原核或真核生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法/过程，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法/过程包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码NG，NS，DG或DS的核苷酸序列；和
b)检查已鉴定的序列是否发生异构化(例如，通过在较高温度下延长保存期并且随后观察RPC谱型中的前峰----见实验部分)和已鉴定的序列的异构化任选地是否是失去所述多肽的至少一种活性、优选所有活性的原因；和
c)不管是否观察到异构化，生成包含多肽衍生物(或基本上由其组成)的突变体文库，其中在要被稳定的多肽中发现NG或DG的情况下，a)中的一个或多个所述已鉴定的核苷酸序列用编码EG，QG，ES，QS，NA，NT，DA或DT，优选编码EG或QG的核苷酸序列替换，或在要被稳定的多肽中发现NS或DS的情况下用编码ES或QS的核苷酸序列替换；以及
d)用以此方式修饰的基因转化原核或真核生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法/过程，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法/过程包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码NG或DG的核苷酸序列；和
b)检查已鉴定的序列是否发生异构化(例如，通过在较高温度下延长保存期并且随后观察RPC谱型中的前峰----见实验部分)和已鉴定的序列的异构化任选地是否是失去所述多肽的至少一种活性、优选所有活性的原因；和
c)不管是否观察到异构化，生成包含多肽衍生物(或基本上由其组成)的突变体文库，其中在要被稳定的多肽中发现NG或DG的情况下，a)中的一个或多个所述已鉴定的核苷酸序列用编码EG，QG，NA，NT，DA或DT，优选编码EG或QG的核苷酸序列替换；以及
d)用以此方式修饰的基因转化原核或真核生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法/过程，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法/过程包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码NS或DS的核苷酸序列；和
b)检查已鉴定的序列是否发生异构化(例如，通过在较高温度下延长保存期并且随后观察RPC谱型中的前峰----见实验部分)和已鉴定的序列的异构化任选地是否是失去所述多肽的至少一种活性、优选所有活性的原因；和
c)不管是否观察到异构化，生成包含多肽衍生物(或基本上由其组成)的突变体文库，其中在要被稳定的多肽中发现NS或DS的情况下，a)中的一个或多个所述已鉴定的核苷酸序列用编码ES，QS，NA，NT，DA或DT，优选编码ES或QS的核苷酸序列替换；以及
d)用以此方式修饰的基因转化原核或真核生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法/过程，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法/过程包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码NG，DG，NS或DS的核苷酸序列；和
b)生成包含多肽衍生物(或基本上由其组成)的突变体的文库，其中在要被稳定的多肽中发现NS或DS的情况下，a)中的一个或多个所述已鉴定的核苷酸序列用编码EG，QG，ES，QS，NA，NT，DA或DT，优选编码ES或QS的核苷酸序列替换，或在要被稳定的多肽中发现NG或DG的情况下优选用编码EG或QG的核苷酸序列替换；以及
c)用以此方式修饰的基因转化合适的，例如原核或真核生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
在本发明的一个优选的实施方案中，对具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的进行所述方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，其中在多肽的单可变结构域的基因中D或N的至少一个密码子被替换，特别是如果此D或N后紧接S或G和/或所述DG，NG，DS或NS在多肽的单可变结构域的CDR，优选CDR2或CDR3，更优选CDR3内，并且转化原核或真核生物体，且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
在本发明的一个优选的实施方案中，对具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的进行所述方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，其中在多肽的单可变结构域的基因中M的至少一个密码子被替换，特别是如果此M在多肽的单可变结构域的CDR，优选CDR2或CDR3，更优选CDR3内或M在位点77处(使用KABAT编号)，并且转化原核或真核生物体，且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
在本发明的一个优选的实施方案中，对具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的进行所述方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，其中E1(对纳米抗体的Kabat编号)，如果存在，则被替换，优选地被D替换，并且转化原核或真核生物体，且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
根据本发明的方法或过程以下列的方式使用，即包含至少一个单可变结构域的多肽(其意欲被稳定的)被测序，并且其结构域的序列与Kabat等(1991，见下)的序列中所提到的共有序列比较或其被连续地编号。限定在序列的最大同源性或同一性处的氨基酸位点。随后一个或多个密码子可根据本发明有利地通过诱变被修饰。其结果是一个密码子的特定置换可以容易地导致抗体稳定性的相当大的变化。然而，两个、三个或多个密码子优选地被修饰。当对所需应用目的很重要的抗体的其他特性(例如，亲和性、蛋白酶稳定性、选择性)被负面地影响时，达到置换数目的上限。
意欲基于实施例来阐明所述步骤：首先采用Kabat的表(1991，下面)通过序列比较(最大同源性)测定氨基酸位点。
在SEQ ID NO：2的情况下，发现氨基酸D105(连续编号，见附图，例如，图4)经历了异构化，并且此异构化是解释在较高温度下长期保存期间效力丧失的主要分子机制(见实验部分)。然而，E105替换D105，即SEQID NO：2的D105E突变体阻止所提及的在较高的温度下亲和性随时间变化的丧失，并且以二价形式被格式化时，具有与具有SEQ ID NO：2的野生型多肽相当的总体亲和性(也参见实验部分)。因此，通过使用根据本发明的方法，有可能在不丧失SEQ ID NO：2的亲和力的条件下获得稳定的形式，即SEQ ID NO：2的优选突变体，即，SEQ ID NO：2的D105E突变体。其他实施例公开在实验部分中。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生功能性多肽、其功能衍生物或片段，例如包含纳米抗体或dAbs、优选纳米抗体的多肽的方法/过程，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的文库的重组基因，所述方法/过程包括如上所公开的过程步骤的任意一个并且另外包括：
a)检查是否存在任意的M，和任选地检查M是否对强制氧化敏感，并且如果是，则通过用例如，V，L，A，K，G，I，T，优选T，L或A，更优选A或T，更优选A替换M而生成文库中的更多成员；和
b)用以此方式修饰的基因转化适当的生物体，并且表达具有所需活性的本发明的多肽、片段或衍生物。
专业技术人员将理解，在选择适当的氨基酸以替换M时，可采用其他的考虑，例如，降低多肽包括纳米抗体或Dabs的免疫原性。例如，就纳米抗体而言，其可有利地选择氨基酸以替换M，所述氨基酸存在于人构架区的相应位点中(见实验部分，例如实施例4的M78T突变)。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生纳米抗体或dAbs、优选纳米抗体肽的方法/过程，所述表达载体包含编码所述纳米抗体的文库的重组基因，所述方法/过程包括如上所公开的过程步骤的任意一个并且另外包括：
a)检查在位点77处(使用Kabat编号)是否存在M，和任选地检查M是否对强制氧化敏感，并且如果是，则通过用例如，T，V，L，A，K，G，I，优选T，L或A，更优选A或T，更优选A替换M生成文库中的更多成员；和
b)用以此方式修饰的基因转化适当的生物体，并且表达具有所需活性的本发明的多肽、片段或衍生物。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生功能性多肽、其功能衍生物或片段，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体的方法/过程，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法/过程包括如上所公开的过程步骤的任意一个并且另外包括：
a)检查是否存在任意的M，和任选地检查任意一个所述M是否对强制氧化敏感，并且如果是，则通过用例如，V，L，A，K，G，I，优选L或A，更优选A或T，更优选A替换至少一个M；和
b)并且用例如D替换N-末端的E(如果存在)；以及
c)用以此方式修饰的基因转化真核生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
为了通过根据本发明的过程稳定蛋白或多肽并且仍然保留其的其他特性诸如尤其是对抗原的亲和性，优选地置换氨基酸，达到尽可能不损害这些特性的程度。为此，优选通过保守置换替换已鉴定的氨基酸。
可根据本领域专业技术人员所熟悉的产生重组蛋白的方法来产生本发明所述的多肽、其衍生物和片段。
为了产生根据本发明修饰的多肽，例如有可能合成可变结构域的完整DNA(通过例如在Sinha等，NAR(核酸研究)12(1984)，4539-4557中所述的寡核苷酸合成的方式)。如例如Innis，编辑，PCR protocols(PCR实验技术)，Academic Press(学术出版社)(1990)和Better等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)267(1992)，16712-16118所述，寡核苷酸可通过PCR连接。通过如例如Ausubel等，编辑，Current protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术)，John Wiley and Sons，纽约(1989)和Robinson等，Hum.Antibod.Hybridomas(人抗体和杂交瘤)2(1991)84-93中所述的标准方法进行克隆和表达。特异性抗原结合活性可例如通过如Harlow等，编辑，Antibodies(抗体)；A Laboratory Manual(实验室指南)，第14章，ColdSpring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，Cold Spring Harbor(冷泉港)(1988)和Munson等，Anal.Biochem.(分析生物化学)407(1980)，220-239中所述的竞争实验来检验。
适当的宿主生物体为例如CHO细胞，不产生免疫球蛋白的淋巴细胞系，酵母，昆虫细胞和原核生物诸如大肠杆菌(E.coli)。
本发明进一步的主题是这样一种过程，其中蛋白在原核生物体(例如，大肠杆菌)中作为变性的内含体分离，并且通过本领域专业技术人员所熟悉的过程被活化(参见，例如，EP-A 0 364 926)。
本发明进一步的主题是一种过程，其中本发明的多肽根据本发明以这样的方式被稳定，即，其在胞液中生物学活性地形成并具有所需的活性，和可以活性形式从其中直接分离。
对于前面提及的所有应用领域，根据本发明的方法/过程改善了多肽和蛋白的稳定性。此外，根据本发明可产生新的稳定的多肽变体，其在以前不能以足够稳定的形式获得，诸如适合于在非生理条件下使用的多肽。
本发明进一步的主题是一种产生非破坏性的去稳定多肽的过程，例如，如果需要快速的药代动力学则可以有利地使用所述多肽。为了获得所述多肽，所以必须以与上述相反的方式进行至少一个氨基酸置换。
定义
a)术语“靶分子”或“多个靶分子”或“靶标”是指在包括细菌和病毒、优选动物、更优选哺乳动物最优选人的生物体中具有生物学功能的蛋白，其中所述生物学功能可参与到疾病的引起或进展或维持中。优选所述蛋白选自由以下组成的组：人生长激素(hGH)，N-甲硫氨酰基人生长激素，牛生长激素，甲状旁腺素，甲状腺素，胰岛素A-链，胰岛素B-链，胰岛素原，松弛素A-链，松弛素B-链，松弛素原(prorelaxin)，糖蛋白激素诸如促卵泡激素(FSH)，促甲状腺激素(TSH)和促黄体素(LH)，糖蛋白激素受体，降钙素，胰高血糖素，因子VIII，抗体，纳米抗体，被哺乳动物尤其是人良好地耐受并且当全身和/或局部施用时具有长半衰期的分子，例如，具有不同大小的聚乙二醇链，例如，PEG-20，PEG-30或PEG40，肺表面活性剂，尿激酶，链激酶，人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)，铃蟾肽(bombesin)，因子IX，凝血酶，造血生长因子，肿瘤坏死因子(TNF)-α和TNF-β，脑啡肽酶，人血清白蛋白，mullerian抑制物质(mullerian-inhibiting substance)，鼠促性腺素关联肽(mouse gonadotropin-associated peptide)，微生物蛋白诸如β内酰胺酶，组织因子蛋白，抑制素，激活素，血管内皮生长因子，激素或生长因子的受体；整联蛋白，血小板生成素，蛋白A或D，类风湿因子，神经生长因子诸如NGF-β，血小板生长因子，转化生长因子(TGF)诸如TGF-α和TGF-β，胰岛素样生长因子-I和-II，胰岛素样生长因子结合蛋白，CD-4，脱氧核糖核酸酶，潜在相关肽，红细胞生成素，骨诱导因子，干扰素诸如干扰素-α，-β，和-γ，集落刺激因子(CSFs)诸如M-CSF，GF-CSF，和G-CSF，白介素(ILs)诸如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，冯维布兰德因子(von Willebrand factor)，超氧化物歧化酶；衰变加速因子，病毒抗原，HIV包膜蛋白诸如GP120，GP140，心房钠尿肽A，B或C，免疫球蛋白，和上面列举的任意一种蛋白的片段或变异体。另外地，所述蛋白可以是上面提及的因子/细胞因子的受体和/或受体和因子/细胞因子的复合体。更优选地，所述靶分子是多聚体蛋白并且甚至更优选地是其亚基选自由下列各项组成的组的多聚体蛋白：冯维布兰德因子(vWF)，IL-6，肿瘤坏死因子-α和-β和许多其他因子。多聚体蛋白是在生物学生物体诸如人中与作为亚基的其他蛋白以多聚体结构缔合(典型地通过非共价相互作用)并且典型地仅多聚体形式能够展现其生物学功能的蛋白。这也称为蛋白的四级结构。此缔合作用也可通过二硫键和通过与反应底物或辅因子的非共价相互作用而被稳定。
b)存在于本发明的构建体中的单可变结构域可以是形成单抗原结合单位的任何可变结构域。通常，此类单可变结构域将是基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)组成的氨基酸序列；或所述氨基酸序列的任何适当的片段(然后其通常将包含至少一些形成至少一个CDR的氨基酸残基，如本文进一步所述)。所述单可变结构域和片段最优选地是这样的，即它们包含免疫球蛋白折叠或能够在适当的条件下形成免疫球蛋白折叠。因此，例如，单可变结构域可包含轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)或其适当的片段；或重链可变结构域(例如，VH-序列或VHH序列)或其适当的片段；只要其能够形成单抗原结合单位(即，基本上由单可变结构域组成的功能性抗原结合单位，使得所述单抗原结合结构域不需要与另一可变结构域相互作用以形成功能性抗原结合单位，如例如下列的情况一样，即，例如，存在于例如，需要与另一可变结构域相互作用(例如，通过VH/VL相互作用)以形成功能性抗原结合结构域的常规抗体和ScFv片段中的可变结构域)。
例如，单可变结构域可以是结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)，单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)，″dAb″或dAb(或适合用作dAb的氨基酸序列)或纳米抗体TM(NanobodyTM)(如本文所定义，并且包括但不限于VHH序列)；其他单可变结构域，或其任意一种的任意合适的片段。对于(单)结构域抗体的总体描述，还参考上面引用的现有技术，以及EP 0 368 684。对于术语“dAb’s”，参考例如，Ward等(Nature(自然)1989年10月12日；341(6242)：544-6)，Holt等，TrendsBiotechnol.(生物技术趋势)，2003，21(11)：484-490；以及例如WO04/068820，WO 06/030220，WO 06/003388和Domantis Ltd.的其他已公开的专利申请。还应该注意的是，尽管在本发明的情形中由于其不是哺乳动物来源的而不太优选，但单结构域抗体或单可变结构域可来源于某些鲨鱼物种(例如，所谓的“IgNAR结构域”，参见例如WO 05/18629)。
具体的，本发明的氨基酸序列可以是纳米抗体TM或其适当的片段。[注：纳米抗体TM(NanobodyTM)，纳米抗体TM(NanobodiesTM)和纳米克隆TM(NanocloneTM)为埃博灵克斯股份有限公司(AblyN.V.)的注册商标]。为了进一步说明VHH’s和纳米抗体，参考Muyldermans在Reviews inMolecular Biotechnology(分子生物技术综述)74(2001)，277-302中的综述论文；以及下列的专利申请，它们作为一般背景技术被提及：VrijeUniversiteit Brussel的WO 94/04678，WO 95/04079和WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591，WO 99/37681，WO 00/40968，WO 00/43507，WO00/65057，WO 01/40310，WO 01/44301，EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)的WO 97/49805，WO 01/21817，WO 03/035694，WO 03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会(National Research Council of Canada)的WO 01/90190；抗体学会(Institute of Antibodies)的WO 03/025020(＝EP 1433793)；以及埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO 04/041867，WO 04/041862，WO04/041865，WO 04/041863，WO 04/062551，WO 05/044858，WO 06/40153，WO 06/079372，WO 06/122786，WO 06/122787和WO 06/122825，和埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的其它公布的专利申请。还参考这些申请中提及的更多的现有技术，并且具体地参考国际申请WO 06/040153的第41-43页上提及的参考文件列表，它们通过引用合并于此。如这些参考文献中所述，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)可特别地以在一个或多个构架序列中存在一个或多个“标志残基(hallmarkresidues)”为特征。
对纳米抗体，包括纳米抗体的人源化和/或骆驼源化，以及其他修饰作用，部分或片段，衍生物或“纳米抗体融合体”，多价构建体(包括接头序列的一些非限制性实例)和增加纳米抗体的半衰期的不同修饰作用和它们的制备的进一步描述可见于例如，WO07/104529中。
c)如本文所使用，“高亲和性”是指在生理条件下和通过本领域中标准步骤测量，单价结合纳米抗体的解离常数(Kd)＜100nM，并且优选10nM，并且更优选1nM，并且甚至更优选100pM，并且最优选10pM。
d)如本文所使用，“高抗体亲抗原性(high avidity)”是指在生理条件下和通过本领域中标准步骤测量，二价或多价结合纳米抗体的解离常数(Kd)＜100nM，并且优选10nM，并且更优选1nM，并且甚至更优选100pM，并且最优选10pM。
e)如本文所使用，“刚性二级结构”是指显示规则的重复结构的任何多肽节段，诸如见于；α-螺旋，310螺旋，π-螺旋，平行和反平行的β-折叠，和回折。缺少可识别的几何秩序的某些“非有序”结构也包括在刚性二级结构的定义中，条件是它们形成能够与靶标相互作用的结构域或氨基酸的“补片”并且该结构的总体形状不被该结构内的氨基酸置换所破坏。相信一些非有序结构是回折的组合。这些刚性二级结构的几何形状通过围绕肽“主链”的α-碳的和χ(.psi.)扭转角而被明确地定义。二级结构要暴露于多肽的表面的要求是提供可暴露于靶分子并与靶分子结合的结构域或氨基酸残基的“补片”。正是这些通过诱变被替换的氨基酸残基初步地形成结构上相关的(突变的)结合多肽的“文库”，它们展示在噬菌体的表面上并且从中选择新的多肽配体。通常避免针对多肽内部的氨基酸残基的诱变或置换，使得保留刚性二级结构的总体结构。在刚性二级结构的内部区域上的氨基酸的一些置换，尤其是用疏水性氨基酸残基的置换，可以被耐受，因为这些保守置换不可能使多肽的总体结构变形。
f)如本文所使用，“前导序列”是指信使RNA(mRNA)和编码它的DNA的特殊部分。其在+1位(在此处开始转录)处开始并且紧接在编码区的起始密码子(通常为AUG)之前结束。其通常包含核糖体结合位点(RBS)，在细菌中也称为Shine-Delgarno序列(AGGAGGU)。5′UTR可以是一百或更多个核苷酸长，并且3′UTR甚至可以更长(直至几千个碱基长度)(Molecular Cell Biology(分子细胞生物学)，第5版，Lodish等，p113，4.2章)。除非另外指明或定义，所有使用的术语具有其在本领域中的一般含义，这对于专业技术人员来说是清楚的。例如参考标准手册，诸如Sambrook等，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室指南)″(第二版)，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)(1989)；F.Ausubel等，编辑，″Current protocols in molecular biology(现代分子生物学实验技术)″，Green Publishing and Wiley Interscience，纽约(1987)；Lewin，“Genes II(基因II)”，John Wiley & Sons，纽约，N.Y.，(1985)；Old等，“Principles of Gene Manipulation：An Introduction to GeneticEngineering(基因操作原理：遗传工程导言)”，第二版，University ofCalifornia Press(加利福尼亚大学出版社)，伯克利，CA(1981)；Roitt等，“Immunology(免疫学)”(第6版)，Mosby/Elsevier，爱丁堡(2001)；Roitt等，Roitt’s Essential Immunology(Roitt免疫学基础)，第10版，BlackwellPublishing，UK(2001)；和Janeway等，“Immunobiology(免疫学)”(第6版)，Garland Science Publishing/Churchill Livingstone，纽约(2005)，以及其中引用的一般背景技术；
g)除非另外指明，术语“免疫球蛋白序列”----无论在本文中使用是指重链抗体还是指常规的4链抗体----其用作一般术语以包括全长抗体，其单条链，以及其部分、结构域或片段(分别地，包括但不限于抗原结合结构域或片段诸如VHH结构域或VH/VL结构域)。另外，如本文所使用，术语“序列”(例如，在类似“免疫球蛋白序列”，“抗体序列”，“可变结构域序列”，“VHH序列”或“蛋白序列”的术语中)，一般应该被理解为包括相关的氨基酸序列以及编码其的核酸或核苷酸序列两者，除非上下文需要更加限制性的解释。此外，如本文所使用，术语“核苷酸序列”还包括具有所述核苷酸序列的核酸分子，因此术语“核苷酸序列”和“核酸”应该被理解为是等价的，并且在本文中可互换使用；
h)除非另外指明，所有没有具体详细描述的方法、步骤、技术和操作可以以本身已知的方式进行并且已经进行，这对于专业技术人员是清楚的。例如，仍旧参考标准手册，参考本文所提及的公知背景技术，和参考其中所引用的其它参考文献；以及参考例如下述综述：Presta，高级药物递送综述(Adv.Drug Deliv.Rev.)2006，58(5-6)：640-56；Levin和Weiss，分子生物系统学(Mol.Biosyst).2006，2(1)：49-57；Irving等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)2001，248(1-2)，31-45；Schmitz等，Placenta，2000，21增刊.A，S106-12，Gonzales等，Tumour Biol.(肿瘤生物学)，2005，26(1)，31-43，其描述了蛋白质工程技术，诸如亲和力成熟，和用于提高蛋白如免疫球蛋白的特异性和其他需要的性质的其他技术。
i)氨基酸残基按照标准的三字母或一字母的氨基酸代码显示，如在表A-2提及的；
表A-2：一字母和三字母氨基酸代码
j)出于比较两种或更多种核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列同一性”百分数可以通过用[第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置的核苷酸相同的核苷酸数目]除以[第一核苷酸序列中的核苷酸总数]并且乘以[100％]而计算，其中在第二核苷酸序列中核苷酸的每一缺失、插入、取代或添加——与第一核苷酸序列相比——都视作在单一核苷酸(位置)的差异。备选地，两种或更多种核苷酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的用于序列比对的计算机算法使用标准设置进行计算，所述计算机算法诸如NCBI Blast v2.0。例如，在WO04/037999，EP 0 967 284，EP 1 085 089，WO 00/55318，WO 00/78972，WO98/49185和GB 2 357 768-A中描述了用于确定序列同一性程度的一些其它的技术、计算机算法和设置。通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种核苷酸序列之间的“序列同一性”的百分数的目的，将具有最大核苷酸数目的核苷酸序列视作“第一”核苷酸序列，并且将另一种核苷酸序列视作“第二”核苷酸序列；
k)出于比较两种或更多种氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”百分数(在本文也称为“氨基酸同一性”)可以通过用[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基数目]除以[第一氨基酸序列中的氨基酸残基总数]并且乘以[100％]而计算，其中第二氨基酸序列中氨基酸残基的每一缺失、插入、取代或添加——与第一氨基酸序列相比——都视作在单一氨基酸残基(位置)上的差异，即，视作本发明所定义的“氨基酸差异”。备选地，两种氨基酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的计算机算法进行计算，诸如上文提及的用于确定核苷酸序列的序列同一性程度的那些，其仍旧使用标准设置。通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分数的目的，将具有最大氨基酸残基数目的氨基酸序列视作“第一”氨基酸序列，并且将另一种氨基酸序列视作“第二”氨基酸序列。此外，在确定两种氨基酸序列之间的序列同一性程度时，专业技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，其通常可以描述为这样的氨基酸取代，即，其中氨基酸残基被具有相似化学结构的另一种氨基酸残基取代，并且其对所述多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或者基本上没有影响。这种保守氨基酸取代是本领域内公知的，例如，从WO 04/037999，GB-A-2 357 768，WO 98/49185，WO 00/46383和WO 01/09300中可知；并且可以基于WO 04/037999以及WO 98/49185和其中所引用的其它参考文献的相关教导而选择这种取代的(优选)类型和/或结合。
所述保守取代优选地是这样的取代，即，其中下列组(a)-(e)内的一个氨基酸被同组内的另一氨基酸残基取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性的残基：Ala，Ser，Thr，Pro和Gly；(b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp，Asn，Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基：His，Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met，Leu，Ile，Val和Cys；以及(e)芳族残基：Phe，Tyr和Trp。
特别优选的保守取代如下：Ala取代成Gly或取代成Ser；Arg取代成Lys；Asn取代成Gln或取代成His；Asp取代成Glu；Cys取代成Ser；Gln取代成Asn；Glu取代成Asp；Gly取代成Ala或取代成Pro；His取代成Asn或取代成Gln；Ile取代成Leu或取代成Val；Leu取代成Ile或取代成Val；Lys取代成Arg，取代成Gln或取代成Glu；Met取代成Leu，取代成Tyr或取代成Ile；Phe取代成Met，取代成Leu或取代成Tyr；Ser取代成Thr；Thr取代成Ser；Trp取代成Tyr；Tyr取代成Trp；和/或Phe取代成Val，取代成Ile或取代成Leu。
用于本文所述的多肽的任何氨基酸取代还可以基于Schulz等，蛋白结构原理(Principles of Protein Structure)，Springer-Verlag，1978发展的不同物种的同源蛋白之间的氨基酸变异频率的分析，基于Chou和Fasman，生物化学(Biochemistry)13：211，1974和高级酶学(Adv.Enzymol.)，47：45-149，1978研究的结构形成潜力的分析，和基于Eisenberg等，美国国家科学院学报(Proc.Nad.Acad Sci.USA)81：140-144，1984；Kyte和Doolittle；分子生物学杂志(J Molec.Biol.).157：105-132，1981，以及Goldman等，物理化学综述年刊(Ann.Rev.Biophys.Chem.).15：321-353，1986研究的蛋白中疏水模式的分析，所有这些通过引用完全结合于此。在本文描述和上文引用的公知背景技术中给出关于纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息。此外，出于这一目的，例如，Desmyter等，自然结构生物学(NatureStructural Biology)，卷3，9，803(1996)；Spinelli等，自然结构生物学(Natural Structural Biology)(1996)；3，752-757；和Decanniere等，结构(Structure)，卷7，4，361(1999)给出来自美洲驼(llama)的VHH结构域的晶体结构。关于在常规VH结构域中形成VH/VL界面的一些氨基酸残基和在这些位置的潜在的骆驼源化(camelizing)取代的其它信息可以在上文引用的现有技术中找到。
l)如果在它们的全长有100％的序列同一性(如本文所定义)，那么认为氨基酸序列和核酸序列“完全相同”。
m)当比较两种氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比，在第一序列位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代；应该理解两种氨基酸序列可以包含1个、2个或多个这样的氨基酸差异。
n)当认为核苷酸序列或氨基酸序列分别“包括”另一个核苷酸序列或氨基酸序列，或“基本由”另一个核苷酸序列或氨基酸序列“组成”时，这可以意指后一个核苷酸序列或氨基酸序列已经分别结合在最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列中，但是更通常地，这一般意指最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列在其序列内分别包括核苷酸或氨基酸残基的序列，其分别与后一个序列具有相同的核苷酸序列或氨基酸序列，而不管实际上已经怎样产生或获得最先提及的序列(例如，其可以通过本发明所述的任何适当的方法进行)。通过非限制性实例的方式，当认为本发明的纳米抗体包括CDR序列时，这可以意指所述CDR序列已经结合在本发明的纳米抗体内，但是更通常地，这一般意指本发明的纳米抗体在其序列内包含具有与所述CDR序列相同的氨基酸序列的氨基酸残基序列，而不管已经怎样产生或获得所述本发明的纳米抗体。还应该注意到，当后一个氨基酸序列具有特异性生物学或结构功能时，它优选地具有与在最先提及的氨基酸序列中的基本相同、相似或等价的生物学或结构功能(换言之，最先提及的氨基酸序列优选是这样的，以致后一个序列能够实施基本上相同的、相似的或等价的生物学或结构功能)。例如，当认为本发明的纳米抗体分别包括CDR序列或构架序列时，在所述纳米抗体中的所述CDR序列和构架优选地分别能够作为CDR序列或构架序列行使功能。此外，当认为核苷酸序列包括另一个核苷酸序列时，最先提及的核苷酸序列优选是这样的，以致当它被表达成表达产物(例如，多肽)时，由后一个核苷酸序列编码的氨基酸序列形成所述表达产物的一部分(换言之，后一个核苷酸序列处在与所述最先提及的、较大的核苷酸序列相同的阅读框内)。
o)核酸序列或氨基酸序列视作“(以)基本上分离的(形式)”——例如，与其天然生物来源和/或其从中获得的反应介质或培养介质相比——此时其已经与其通常在所述来源或介质中与之结合的至少一种其它成分(诸如另一种核酸，另一种蛋白/多肽，另一种生物成分或高分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)分离。特别地，当它已被纯化至少2倍，特别是至少10倍，更特别地至少100倍，并且达到1000倍或更多时，认为核酸序列或氨基酸序列“基本上分离”。当使用适当技术(诸如适当的层析技术，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳技术)确定时，“以基本上分离形式”的核酸序列或氨基酸序列优选地基本上是均相的；
p)当用于本文时，术语“结构域”通常是指氨基酸序列的球状区域(如抗体链，并且特别是指重链抗体的球状区域)，或者指基本上由所述球状区域组成的多肽。通常，例如，这样的结构域包括作为片层或通过二硫键而稳定的肽环(例如3或4个肽环)；术语“结合结构域”指这样的结构域，其针对抗原决定簇(如本文定义)；
q)术语‘抗原决定簇’是指抗原上由抗原-结合分子(诸如本发明的纳米抗体或多肽)并且更特别是所述分子的抗原-结合位点而识别的表位。术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中还可以互换地使用；
r)对于特定的抗原决定簇、表位、抗原或蛋白(或对于至少其的一部分、片段或表位)可以(特异性)结合、具有亲和性和/或具有特异性的氨基酸序列(诸如本发明的纳米抗体、抗体、多肽，或通常为抗原结合蛋白或多肽或其片段)认为是“抗(against)”或者“针对(directed against)”所述抗原决定簇、表位、抗原或蛋白。
s)术语“特异性”是指特定的抗原-结合分子或抗原-结合蛋白(诸如本发明的纳米抗体或多肽)分子可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。一种抗原-结合蛋白的特异性可以依据亲和性和/或抗体亲抗原性(avidity)而确定。亲和性，表示为抗原与抗原-结合蛋白的解离平衡常数(KD)，是抗原决定簇和所述抗原-结合蛋白上抗原-结合位点之间的结合强度的量度：KD值越小，抗原决定簇和抗原-结合分子之间的结合强度越强(备选地，亲和性还可以表示为亲和常数(KA)，其为1/KD)。专业技术人员应该清楚(例如，基于本发明进一步的公开内容)，亲和性可以以本身已知的方式确定，其取决于特定的目的抗原。抗体亲抗原性是抗原-结合分子(诸如本发明的纳米抗体或多肽)和相关抗原之间的结合强度的量度。抗体亲抗原性与抗原决定簇及其在抗原-结合分子上的抗原结合位点之间的亲和性以及在所述抗原-结合分子上存在的相关结合位点的数目相关。典型地，抗原-结合蛋白(诸如本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽)将以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即，以105-1012升/摩尔或更大、并且优选地107-1012升/摩尔或更大、且更优选地108-1012升/摩尔的缔合常数(KA))而结合它们的抗原。任何大于104摩尔/升的KD值(或任何小于104M-1的KA值)升/摩尔通常认为指示非特异性结合。优选地，本发明的单价免疫球蛋白序列将以小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小于10nM诸如小于500pM的亲和性与需要的抗原结合。抗原-结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何适当的方法确定，其包括，例如，斯卡查德分析(Scatchard analysis)和/或竞争结合检测，诸如放射性免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心式(sandwich)竞争测定，和本领域本身已知的其不同的变化；以及本发明提及的其它技术。
专业技术人员应该清楚，解离常数可以是实际的或表观解离常数。确定解离常数的方法对于专业技术人员应该是清楚的，并且例如，包括本发明提及的技术。在这一点上，还应该清楚，不可能测量大于10-4摩尔/升或10-3摩尔/升(例如，10-2摩尔/升)的解离常数。任选地，专业技术人员应该清楚，可以根据(实际或表观)缔合常数(KA)利用[KD＝1/KA]的关系计算所述(实际或表观)解离常数。
亲和性表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和性通常作为KD或解离常数给出，其具有的单位为摩尔/升(或M)。亲和性还可以表示为缔合常数KA，其等于1/KD，并且具有的单位为(摩尔/升)-1(或M-1)。在本说明书中，两个分子(诸如本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽及其目的靶点)之间的相互作用的稳定性将主要以它们相互作用的KD值表示；专业技术人员应该清楚，考虑到KA＝1/KD的关系，通过其KD值表示分子相互作用的强度也可以用于计算相对应的KA值。由于KD-值通过公知的关系式DG＝RT.ln(KD)(等价于DG＝-RT.ln(KA))与结合的自由能(DG)相关，KD-值还在热力学意义上表征分子相互作用的强度，在所述关系式中，R等于气体常数，T等于绝对温度，并且ln表示自然对数。
关于认为是有意义的(例如，特异性的)生物学相互作用的KD典型地在10-10M(0.1nM)-10-5M(10000nM)范围内。相互作用越强，其KD越低。KD也可以表示为复合体的解离速率常数(表示为koff)与其缔合速率(表示为kon)的比例(因此KD＝koff/kon和KA＝kon/koff)。解离速率koff具有单位s-1(其中s是秒的SI单位符号)。缔合速率kon具有单位M-1s-1。缔合速率可以在102M-1s-1-约107M-1s-1之间变化，达到关于两分子相互作用的扩散-极限缔合速率常数。解离速率以关系式t1/2＝ln(2)/koff与给定的分子相互作用的半衰期相关。解离速率可以在10-6s-1(接近具有数天的t1/2的不可逆复合体)到1s-1(t1/2＝0.69s)之间变化。
两个分子之间的分子相互作用的亲和性可以通过本身已知的不同技术测量，诸如公知的表面等离子体共振(SPR)生物传感器技术(例如，参见Ober等，国际免疫学(Intern.Immunology)，13，1551-1559，2001)，其中将一个分子固定在生物传感器芯片上，另一个分子在流动条件下经过所固定的分子，产生kon，koff测量值以及因此产生KD(或KA)值。例如，这可以使用公知的BIACORE仪器进行。
专业技术人员还应该理解，如果测量过程以某种方式影响暗指的分子的内在结合亲和性，例如通过与一个分子的生物传感器上的涂层相关的人为产物影响，则测量的KD可以与表观KD相对应。此外，如果一个分子含有针对另一个分子的多于一个的识别位点，则可以测量表观KD。在这样的情形中，所测量的亲和性可以受到两个分子之间相互作用的抗体亲抗原性的影响。
可以用来评估亲和性的另一个方法是Friguet等(免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)，77，305-19，1985)的2步ELISA(酶联免疫吸附测定)方法。该方法建立溶液相结合平衡测量，并且避免与在支持物如塑料上的一个分子的吸附相关的可能的人为产物。
然而，KD的准确测量可能是非常费力的，并且作为结果，通常确定表观KD值来评估两个分子的结合强度。应该注意到，只要所有的测量以一致的方式(例如，保持测定条件不变)进行，表观KD测量可以用作真实KD的近似值，并且因此在本文献中，应该以同等的重要性或相关性对待KD和表观KD。
最后，应该注意到，在许多情形中，有经验的科学家可以判断相对于一些参照分子确定结合亲和力是便利的。例如，为了评估分子A和B之间的结合强度，例如，人们可以使用已知与B结合且用荧光团或生色团或其它化学部分适合标记的参照分子C，诸如在ELISA或FACS(荧光活化的细胞分选)中容易检测的生物素、或其它形式(用于荧光检测的荧光团，用于光吸收检测的生色团，用于链霉抗生物素蛋白-介导的ELISA检测的生物素)。典型地，参照分子C保持在固定的浓度，并且A的浓度关于B的给定的浓度或量变化。结果，对应于A的浓度获得IC50值，在所述A的浓度下将在不存在A的条件下C的测量信号减半。假定已知参照分子的KD，即KD ref，以及参照分子的总浓度cref，则可以通过下式获得关于A-B相互作用的表观KD：KD＝IC50/(1+cref/KD ref)。注意，如果cref＜＜KD ref，则KD≈IC50。假定以一致的方式(例如，保持cref不变)针对比较的结合剂进行IC50测量，则分子相互作用的强度或稳定性可以通过IC50进行评估，并且在本发明的整个内容中，认为该测量值等价于KD或等价于表观KD。
t)本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的半衰期通常可以定义为所述氨基酸序列、化合物或多肽的血清浓度在体内减少50％所花费的时间，例如，由于所述序列或化合物的降解和/或通过天然机制对所述序列或化合物的清除或螯合(sequestration)。本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期可以以本身已知的任何方式确定，诸如通过药物动力学分析。适当的技术对于本领域专业技术人员应该是清楚的，并且例如，通常可以包括下列步骤：将适当剂量的本发明的氨基酸序列、化合物或多肽适当施用给温血动物(即，施用给人或另一种适当的哺乳动物，诸如小鼠、兔、大鼠、猪、狗或灵长类动物，例如来自猕猴属的猴子(诸如，并且特别是食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus)))；从所述动物收集血液样品或其它样品；确定在所述血液样品中的本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的水平或浓度；并且从这样获得的数据(数据的图表)计算与在给药时的初始水平相比较直到本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的水平或浓度已经减少50％的时间。例如，参考下述实验部分，以及标准手册，诸如Kenneth，A等：药物的化学稳定性：药剂师手册(Chemical Stability of Pharmaceuticals：AHandbook for Pharmacists)和Peters等，药物动力学分子：实践方法(Pharmacokinete analysis：A Practical Approach)(1996)。还参考″药物动力学(Pharmacokinetics)″，M Gibaldi和D Perron，Marcel Dekker出版，第2综述版(2nd Rev.edition)(1982)。
专业技术人员还应该清楚(例如，参见WO 04/003019的第6和7页以及其中引用的其它参考文献)，半衰期可以用参数如t1/2-α，t1/2-β和曲线下面积(AUC)表示。在本说明书中，“半衰期增加”是指在这些参数的任何一种的增加，诸如这些参数的任何两种，或基本上所有这三种参数的增加。当用于本发明时，“半衰期增加”或“增加的半衰期”特别是指t1/2-β的增加，具有或不具有t1/2-α和/或AUC或二者的增加。
u)在本发明的上下文中，“调节(modulating)”或“调节(to modulate)”通常意指减少或抑制靶标或抗原的活性，或备选地增加靶标或抗原的活性，如使用适当的体外、细胞或体内测定法测量的。特别地，“调节(modulating)”或“调节(to modulate)”可以意指减少或抑制靶标或抗原的活性，或备选地增加靶标或抗原的(相关或目的)生物学活性，如使用适当的体外、细胞或体内测定法(其通常将取决于涉及的靶标或抗原)测量的，与在相同条件但不存在本发明的构建体的条件下，在相同测定中的所述靶标或抗原的活性相比较，至少1％，优选至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多。
专业技术人员应该清楚，“调节”还可以包括与相同条件但不存在本发明的构建体相比较，对靶标或抗原对其配体、结合配偶体、缔合成同源多聚体或异源多聚体形式的配偶体、或底物中的一种或多种的亲和力、抗体亲抗原性、特异性和/或选择性形成改变(其可以是增加或减少)；和/或对所述靶标或抗原对于在所述靶标或抗原存在于其中的介质或环境的一种或多种条件(诸如pH、离子强度、辅因子的存在、等等)的敏感性施加改变(其可以是增加或减少)。专业技术人员应该清楚，这同样可以以适当的方式和/或使用本身已知的任何适当的测定法来确定，这取决于所涉及的靶标或抗原。
“调节”还可以意指对所述靶标或抗原参与其中(或包括其(多个)底物、(多个)配体、或(多个)途径参与其中，如其信号传导途径或代谢途径以及它们相关的生物学或生理学作用)的一种或多种生物学或生理学机制、作用、反应、功能、途径或活性施加改变(即，分别作为激动剂、作为拮抗剂或作为反激动剂的活性，这取决于所述靶标或抗原和需要的生物学或生理学作用)。同样，专业技术人员应该清楚，这样的作为激动剂或拮抗剂的作用可以以任何适当方式和/或使用本身已知的任何适当的(体外且通常是细胞或体内测定法)测定法确定，这取决于所涉及的靶标或抗原。特别地，作为激动剂或拮抗剂的作用可以是这样的，以致与在相同条件下但不存在本发明的构建体的相同测定法中的生物学或生理学活性相比，分别将目的生物学或生理学活性增加或减少至少1％，优选至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多。
例如，调节还可以包括所述靶标或抗原的别构调节；和/或减少或抑制所述靶标或抗原与其底物或配体之一的结合和/或与天然配体、底物竞争与所述靶标或抗原的结合。调节还可以包括激活所述靶标或抗原或所述靶标或抗原参与其中的机制或途径。例如，调节还可以包括对所述靶标或抗原的折叠或构象、或对所述靶标或抗原折叠的能力形成改变，以改变其构象(例如，在与配体结合时)，以与其他(亚)单位缔合，或以解聚。例如，调节还可以包括对所述靶标或抗原转运其他化合物或作为其他化合物(诸如离子)的通道的能力形成改变。
调节可以是可逆的或不可逆的，但是对于药学和药理学目的，通常应该是以可逆的方式。
v)关于靶标或抗原，术语在所述靶标或抗原上的“相互作用位点”意指在所述靶标或抗原上的位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列，其是所述靶标或抗原的用于结合配体、受体或其他结合配偶体的位点、催化位点、分解位点、别构相互作用的位点、参与多聚体化(如同源多聚体化或异源多聚体化)的位点；或是在所述靶标或抗原上的参与所述靶标或抗原的生物学作用或机制的任何其他位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列。更一般地，“相互作用位点”可以是在所述靶标或抗原上的本发明的氨基酸序列或多肽可以与之结合的任何位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列，以致调节(如本文定义)所述靶标或抗原(和/或其中包括所述靶标或抗原的任何途径、相互作用、信号传导、生物学机制或生物学作用)。
w)认为这样的氨基酸序列或多肽是对第一靶标或抗原“特异性的”，即，与第二靶标或抗原相比较，当与第一抗原以是所述氨基酸序列或多肽与第二靶标或多肽结合的亲和力的至少10倍、如至少100倍、且优选至少1000倍、且多至10000倍或更多的亲和力(如上述，且适当表示为KD值、KA值、koff-速率和/或kon-速率)结合时。例如，所述第一抗原可以以比所述氨基酸序列或多肽与所述第二靶标或多肽结合的KD小至少10倍、如小至少100倍、且优选小至少1000倍、如小10000倍或者甚至更小的KD值结合所述靶标或抗原。优选地，当氨基酸序列或多肽与第二靶标或抗原相比较对第一靶标或抗原是“特异性的”时，它针对(如本文定义)所述第一靶标或抗原，但是不针对所述第二靶标或抗原。
x)术语“交叉阻断(cross-block)”，“交叉阻断的(cross-blocked)”和“交叉阻断(cross-blocking)”在本文可以互换使用，用来意指氨基酸序列或其他结合试剂(如本发明的多肽)干扰本发明的其他氨基酸序列或结合试剂与给定靶标的结合的能力。本发明的氨基酸序列或其他结合试剂能够干扰另一种对[靶标]的结合的程度，且因此其能否被认为是本发明所述的交叉阻断的，可以使用竞争结合测定法确定。一种特别适当的定量测定法使用Biacore机器，其可以使用表面等离子体共振技术测量相互作用的程度。另一种适当的定量交叉阻断测定法使用基于ELISA的方法来测量氨基酸序列或其他结合试剂之间对于它们与所述靶标的结合的竞争。
以下概括描述用于确定氨基酸序列或其他结合试剂是否交叉阻断或按照本发明能够交叉阻断的适当的Biacore测定法。应该理解，所述测定法可以与本文所述的任何氨基酸序列或其他结合试剂一起使用。按照供应商的建议使用Biacore机器(例如，Biacore 3000)。因此，在一种交叉阻断测定法中，使用标准胺偶联化学将靶蛋白偶联到CM5Biacore芯片上，以产生由所述靶标包被的表面。典型地，200-800个共振单位的靶标将被偶联到芯片上(易于给出可测量水平的结合但是易于被所用的测试试剂的浓度饱和的量)。将两种待检测它们彼此交叉阻断的能力的测试氨基酸序列(称为A*和B*)以结合位点1∶1摩尔比例混合在适当的缓冲液中，以产生测试混合物。当基于结合位点计算浓度时，假设氨基酸序列的分子量是氨基酸序列的总分子量除以所述氨基酸序列上的靶标结合位点的数目。测试混合物中每种氨基酸序列的浓度应该足够高，足以易于饱和所述氨基酸序列关于捕获在Biacore芯片上的靶标分子的结合位点。在所述混合物中的氨基酸序列处于相同的摩尔浓度(基于结合)，且所述浓度典型地为1.00-1.5微摩尔(基于结合)。还制备仅包含A*和仅包含B*的分开的溶液。在这些溶液中的A*和B*应该处在与在所述测试混合物中相同的缓冲液中并且处于相同的浓度。将测试混合物通过靶标-包被的Biacore芯片，且记录结合的总量。然后，以这样的方式处理芯片，以在不损坏芯片-结合的靶标的条件下去除结合的氨基酸序列。典型地，这通过用30mMHCl处理芯片60秒进行。然后，将仅有A*的溶液通过靶标-包被的表面，并记录结合的量。同样处理芯片，以在不损坏芯片-结合的靶标的条件下去除所有结合的氨基酸序列。然后，将仅有B*的溶液通过靶标-包被的表面，并记录结合的量。接着计算A*和B*混合物的最大理论结合，且为每种氨基酸序列在单独通过靶标表面时的结合的总和。如果实际记录的混合物的结合小于该理论最大值，则该两种氨基酸序列彼此是交叉阻断的。因此，通常，按照本发明的交叉阻断的氨基酸序列或其他结合试剂是一种在上述Biacore交叉阻断测定法中将与靶标结合的，以致在该测定法中且在存在本发明的第二氨基酸序列或其他结合试剂时，所记录的结合是组合的两种氨基酸序列或结合试剂的最大理论结合(如上文定义)的80％-0.1％(例如，80％-4％)，特别地是最大理论结合的75％-0.1％(例如，75％-4％)，且更特别地是最大理论结合的70％-0.1％(例如，70％-4％)。上述Biacore测定法是用来确定氨基酸序列或其他结合试剂彼此是否是按照本发明交叉阻断的主要测定法。在很少的情形中，特定的氨基酸序列或其他结合试剂可能不与通过胺化学偶联到CM5 Biacore芯片上的靶标结合(这通常在靶标上的相关结合位点通过与芯片的偶联而被遮蔽或破坏时发生)。在这样的情形中，交叉阻断可以使用标记形式的靶标，例如N端His-标记的形式(R & D Systems，Minneapolis，MN，USA；2005 cat# 1406-ST-025)。以这种特定的形式，抗-His氨基酸序列将被偶联到Biacore芯片上，然后将His-标记的靶标通过芯片表面，并被所述抗-His氨基酸序列捕获。交叉阻断分析将基本上按照上述进行，除了在每次芯片再生循环之后，新的His-标记的靶标将被重新负载到抗-His氨基酸序列包被的表面上。除了使用N端His-标记的[靶标]给出的实例之外，可以备选地使用C端His-标记的靶标。此外，本领域已知的各种其他标记和标记结合蛋白组合可以用于这样的交叉阻断分析(例如，具有抗-HA抗体的HA标记；具有抗-FLAG抗体的FLAG标记；具有链霉抗生物素蛋白的生物素标记)。
下述概括描述用于确定针对靶标的氨基酸序列或其他结合试剂是否如本文所定义那样交叉阻断或能够交叉阻断的ELISA测定法。应该理解，所述测定法可以与本文所述的任何氨基酸序列(或其他结合试剂，如本发明的多肽)一起使用。本测定法的一般原理是使得针对所述靶标的氨基酸序列或结合试剂包被到ELISA平板的孔上。将过量的量的第二、潜在的交叉阻断、抗-靶标氨基酸序列添加到溶液中(即，不与ELISA平板结合)。然后将有限量的靶标添加到孔中。所述包被的氨基酸序列和溶液中的氨基酸序列竞争与有限量的靶标分子的结合。洗涤平板，以去除未与包被的氨基酸序列结合的过量的靶标，且还去除第二、溶液相氨基酸序列以及在所述第二、溶液相氨基酸序列和靶标之间形成的任何复合物。然后，使用适于检测所述靶标的试剂测量结合的靶标的量。相对于在不存在第二、溶液相的氨基酸序列的条件下所述包被的氨基酸序列可以结合的靶标分子的数量，溶液中能够交叉阻断所包被的氨基酸序列的氨基酸序列将能够引起所述包被的氨基酸序列可以结合的靶标分子的数量的减少。在其中选择第-氨基酸序列如Ab-X作为固定的氨基酸序列的情形中，它被包被到ELISA平板的孔上，之后使用适当的封闭溶液来封闭该平板，以最小化随后添加的试剂的非特异性结合。然后，将过量的量的第二氨基酸序列如Ab-Y添加到该ELISA平板中，以致在包被所述ELISA平板的过程中，每孔Ab-Y[靶标]结合位点的摩尔比每孔所用的Ab-X[靶标]结合位点的摩尔高至少10倍。然后，加入[靶标]，以致每孔加入的[靶标]的摩尔比用于包被每孔的Ab-X[靶标]结合位点的摩尔低至少25倍。在适当的温育时间之后，洗涤ELISA平板，且加入用于检测所述靶标的试剂，以测量由所述包被的抗-[靶标]氨基酸序列(在该情形中为Ab-X)特异结合的靶标的量。关于该测定法的背景信号定义为在使用所述包被的氨基酸序列(在该情形中为Ab-X)、第二溶液相氨基酸序列(在该情形中为Ab-Y)、仅有[靶标]缓冲剂(即，无靶标)和靶标检测试剂的孔中获得的信号。关于该测定法的阳性对照信号定义为在使用所述包被的氨基酸序列(在该情形中为Ab-X)、仅有第二溶液相氨基酸序列缓冲剂(即，无第二溶液相氨基酸序列)、靶标和靶标检测试剂的孔中获得的信号。该ELISA测定法可以以这样的方式运行，以使得阳性对照信号是背景信号的至少6倍。为了避免由选择哪种氨基酸序列用作包被氨基酸序列和哪种用作第二(竞争剂)氨基酸序列导致的任何假象(例如，Ab-X和Ab-Y之间对于[靶标]的显著不同的亲和力)，该交叉阻断测定法可以以两种形式运行：1)形式1是其中Ab-X是包被到ELISA平板上的氨基酸序列，Ab-Y是在溶液中的竞争氨基酸序列，和2)形式2是其中Ab-Y是包被到ELISA平板上的氨基酸序列，Ab-X是在溶液中的竞争氨基酸序列。如果在形式1或在形式2中，与在不存在溶液相抗-靶标氨基酸序列的条件下(即，阳性对照孔)获得的靶标检测信号相比较，所述溶液相抗-靶标氨基酸序列能够引起靶标检测信号(即，由所述包被的氨基酸序列结合的靶标的量)减少60％-100％，特别地70％-100％，且更特别地80％-100％，则Ab-X和Ab-Y被定义为是交叉阻断的。
y)如本发明进一步所述，纳米抗体中氨基酸残基总数可以在110-130区间，优选112-115，并且最优选113。然而，应该注意纳米抗体的部分、片段、类似物或衍生物(如本发明进一步所述)不特别限制它们的长度和/或大小，只要这样的部分、片段、类似物或衍生物满足本发明列出的进一步要求，并且还优选地适于本文所述的目的；
z)除非另外指明，纳米抗体的氨基酸残基通常按照Kabat等(“免疫学目的蛋白的序列(Sequence ofproteins of immunological interest)”，美国公众健康服务中心(US Public Health Services)，NIH贝塞斯达，MD，公开号91)给出的关于VH结构域的通用编号方式进行编号，这种编号方式在Riechmann和Muyldermans，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)2000年6月23日；240(1-2)：185-195的文章中用于来自骆驼科动物的VHH结构域(例如，参见该出版物的图2)；或参照本文。按照这种编号方式，纳米抗体的FR1包括位置1-30的氨基酸残基，纳米抗体的CDR1包括位置31-35的氨基酸残基，纳米抗体的FR2包括位置36-49的氨基酸，纳米抗体的CDR2包括位置50-65的氨基酸残基，纳米抗体的FR3包括位置66-94的氨基酸残基，纳米抗体的CDR3包括位置95-102的氨基酸残基，以及，纳米抗体的FR4包括位置103-113的氨基酸残基。[在这一方面，应该注意——如在本领域内关于VH结构域和关于VHH结构域公知的——在每一CDR中的氨基酸残基的总数可以不同，并且可以不与由Kabat编号方式指示的氨基酸残基的总数相对应(即，按照Kabat编号方式的一个或多个位置可能不占据在实际序列中，或者实际序列可能包含比由Kabat编号方式允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，按照Kabat的编号方式可能与或可能不与实际序列中的氨基酸残基的实际编号方式相对应。然而，通常可以认为，按照Kabat的编号方式并且不考虑CDR中的氨基酸残基的数目，按照Kabat编号方式的位置1对应FR1的起点，并且反之亦然，按照Kabat编号方式的位置36对应FR2的起点，并且反之亦然，按照Kabat编号方式的位置66对应FR3的起点，并且反之亦然，以及按照Kabat编号方式的位置103对应FR4的起点，并且反之亦然。]。
用于编号VH结构域的氨基酸残基的备选方法是由Chothia等(自然(Nature)342，877-883(1989))所述的方法，即所谓的“AbM定义”和所谓的“联系定义”，所述方法还可以以类似的方式用于来自骆驼科动物的VHH结构域以及用于纳米抗体。然而，在本说明书、各方面和附图中，遵循由Riechmann和Muyldermans用于VHH结构域的按照Kabat的编号方式，除非另外指明；以及
aa)如本文所提到的稳定性涉及随时间变化的化学稳定性，即，本发明的蛋白、多肽或单可变结构域的结构性基本序列的稳定性。例如，如果本领域专业技术人员测试目的化合物，并且不能找到蛋白或多肽的基本序列(例如，随时间变化的基本氨基酸序列)中的任何变化(或仅有微小的变化，例如通过诸如RPC或HIC的分离技术，例如，在指定样品中小于1％，2％，3％，4％，5％，10％的其他物质)，则该蛋白或多肽被认为随着测量的时间周期和指定的条件诸如，例如，温度是稳定的。
bb)给出附图、序列表和实验部分/实施例只是进一步举例说明本发明，并且不应该被解释为或者认为以任何方式限制本发明和/或后附的权利要求的范围，除非本文中另外明确指明。
不限于此，纳米抗体，(单)结构域抗体或“dAb’s”可来源于4链抗体的可变区以及来源于重链抗体的可变区。根据下面参考文献中使用的方法学，存在于天然存在的重链抗体中的可变区也将被称为“VHH结构域”，以便将它们与存在于常规4链抗体中的重链可变结构域(本文下面将称为“VH结构域”)和存在于常规4链抗体中的轻链可变结构域(本文下面将称为“VL结构域”)相区分。
因此，不限于此，本发明的多肽或蛋白具有包括4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1-CDR3)或基本上由其组成的氨基酸序列。此类氨基酸序列优选地含有80-200个氨基酸残基，诸如90-150个氨基酸残基，诸如约100-130个氨基酸残基(尽管也可使用此氨基酸序列的合适片段，即，基本上如本文对本发明的纳米抗体或其等价物所述)，并且优选是这样的，即其形成免疫球蛋白折叠，或是这样的，即，在适当的条件下，其能够形成免疫球蛋白折叠(即，通过适当的折叠)。氨基酸序列优选地选自纳米抗体，结构域抗体，单结构域抗体或“dAb’s”，并且最优选地是如本文所述的纳米抗体。CDR’s可以是对多肽或蛋白提供所需特性的任何合适的CDR’s。
本发明的进一步优势是本发明的多肽，尤其是纳米抗体可根据本发明以稳定和较少免疫原性的形式产生。因此根据本发明的过程对于重组多肽杂合体的治疗应用是特别重要的。
另外本发明的多肽可以被定制以通过免疫系统中选择而适合大量效应器功能。此天然蛋白工程系统具有无可比拟的效率。特殊功能性单可变结构域的胞质表达使得此效应器功能被引入至细胞中。应用是有利的，其产生细胞蛋白的活性的调节。例如，这可通过蛋白-单可变结构域复合体形成而稳定靶蛋白来实现。这可导致降解动力学的变化。也有可能产生别构效应剂作用。例如，通过人工多酶复合体或诱导型操纵子的代谢物浓度的局部增加，通过三元络合物的形成和稳定，两个效应器的接近建立了影响代谢途径的另一种可能性。然而，胞质表达催化抗体是特别有利的，并且具有选择催化效率的相关可能性。对于根据本发明稳定的多肽可以简单的方式完成功能性单可变结构域的胞质表达。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽和核酸可以以本身已知的方式制备，专业技术人员应该从本文的进一步描述中而清楚。例如，本发明的纳米抗体和多肽可以以本身已知用于制备抗体且特别是用于制备抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的任何方式制备。制备所述氨基酸序列、纳米抗体、多肽和核酸的一些优选但非限制性的方法包括本发明所述的方法和技术。
本发明的其他实施方案是通过本文所述的方法衍生的或可获得的或可直接获得的蛋白，多肽，单可变结构域，文库，核苷酸或其选择物。
专业技术人员应该清楚，用于制备本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽的一种特别有用的方法通常包括下列步骤：
i)在适宜的宿主细胞或宿主生物体(本文还叫作“本发明的宿主”)中或在另一种适宜的表达系统中，表达编码所述本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的核酸(本文还叫作“本发明的核酸”)，任选地接着进行：
ii)分离和/或纯化这样获得的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。
特别地，这样的方法可以包括下列步骤：
i)在某种条件下培养和/或维持本发明的宿主，所述条件是这样的，以致所述本发明的宿主表达和/或生产至少一种本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽；任选地接着进行：
ii)分离和/或纯化这样获得的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。
本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式，并且优选地是双链DNA形式。例如，本发明的核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA或合成的DNA(诸如具有特别适用于在要用的宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子应用的DNA)。
按照本发明的一个方面，本发明的核酸是基本上分离的形式，如本文所定义。本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于载体中和/或是载体的一部分，所述载体诸如例如质粒、黏端质粒或YAC，其也可以是基本上分离的形式。本发明的核酸可以以本身已知的方法制备或获得，其基于关于本文给出的本发明的多肽的氨基酸序列的信息，和/或可以从适当的天然来源分离。为了提供类似物，例如，编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列可以进行位点定向诱变，以提供编码所述类似物的本发明的核酸。并且，专业技术人员应该清楚，为了制备本发明的核酸，一些核苷酸序列，诸如至少一种编码纳米抗体的核苷酸序列，以及例如编码一种或多种接头的核酸，还可以以适当的方法连接在一起。用于产生本发明的核酸的技术应该是专业技术人员所清楚的，并且例如可以包括但不限于，自动DNA合成；位点定向诱变；将两个或多个天然存在的和/或合成的序列(或者其两个或更多个部分)组合，引入引起截短的表达产物表达的突变；引入一个或多个限制性位点(例如，以产生可以使用适宜的限制性酶容易地消化和/或连接的盒和/或区)，和/或通过使用一个或多个“错配”引物的PCR反应的方法引入突变。这些以及其它技术应该是专业技术人员所清楚的，并且参考也参见上文提及的标准手册，诸如Sambrook等和Ausubel等，以及下文的实施例。
本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于遗传构建体中和/或是遗传构建体的一部分，这对于本领域的技术人员应该是清楚的。这样的遗传构建体通常包括至少一种本发明的核酸，其任选地与本身已知的一个或多个遗传构建体元件连接，诸如例如一个或多个适宜的调节元件(诸如适当的启动子、增强子、终止子、等等)和本文提到的其它遗传构建体元件。包括至少一种本发明的核酸的所述遗传构建体在本文也叫作“本发明的遗传构建体”。
本发明的遗传构建体可以是DNA或RNA，并且优选地是双链DNA。本发明的遗传构建体还可以是适于要用的宿主细胞或宿主生物体的转化的形式，适于结合到要用的宿主细胞的基因组DNA中的形式，或者适于在要用的宿主生物体中独立复制、维持和/或遗传的形式。例如，本发明的遗传构建体可以是载体形式，诸如例如质粒、黏端质粒、YAC、病毒载体或转座子。特别地，所述载体可以是表达载体，即，可以提供体外和/或体内表达的载体(例如，在适宜的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)。
在一个优选的但非限制性的方面中，本发明的遗传构建体包括
i)至少一种本发明的核酸；其可操作性地连接
ii)一个或多个调节元件，诸如启动子和任选地适宜的终止子；并且任选地还有
iii)本身已知的一个或多个其它遗传构建体元件；
其中术语“调节元件”、“启动子”、“终止子”和“可操作性地连接”具有它们在本领域中的通用意思(如本文进一步所述)；并且其中存在于遗传构建体中的所述“其它元件”，例如，可以是3’-或5’-UTR序列、前导序列、选择标记、表达标记/报道基因、和/或可以促进或增加转化或整合(效率)的元件。用于所述遗传构建体的这些和其它适宜的元件对于专业技术人员应该是清楚的，并且例如可能取决于所用的构建体、要用的宿主细胞或宿主生物体的类型；本发明的目的核苷酸序列在其中表达的方式(例如，通过组成型的、瞬时的或可诱导的表达)；和/或要用的转化技术。例如，本身已知用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)表达和生产的调节序列、启动子和终止子可以以基本上相似的方式使用。
优选地，在本发明的遗传构建体中，所述至少一种本发明的核酸和所述调节元件，以及任选地所述一个或多个其它元件，彼此“可操作性地连接”，这通常意指它们彼此是功能性关系。例如，如果所述启动子能够起始或者另外控制/调节编码序列的转录和/或表达，那么启动子被视为与编码序列“可操作性地连接”(其中所述编码序列应该理解为“受控于”所述启动子)。一般地，当两个核苷酸序列可操作性地连接时，它们应该在相同的方向，并且通常还在同一阅读框中。它们通常还应该基本上邻接，尽管这也可以不是必需的。
优选地，本发明的遗传构建体的调节以及其它元件是这样的，即，它们能够在要用的宿主细胞或宿主生物体内提供它们需要的生物学功能。
例如，在要用的宿主细胞或宿主生物体中，启动子、增强子或终止子应该是“可操作的”，这意味着(例如)所述启动子应该能够起始或者另外控制/调节与其可操作性地连接(如本文所定义)的核苷酸序列——例如，编码序列——的转录和/或表达。
一些特别优选的启动子包括但不限于，本身已知用于在本文提及的宿主细胞中表达的启动子；并且特别是用于在细菌细胞中表达的启动子，诸如本文提及的那些和/或在实施例中所用的那些。
选择标记应该是这样的，即，其允许——即，在适当的选择条件下——已经(成功地)转化了本发明的核苷酸序列的宿主细胞和/或宿主生物体与没有(成功地)转化的宿主细胞/生物体区分开来。所述标记的一些优选的但非限制性的实例是提供针对抗生素(诸如卡那霉素或氨苄青霉素)的抗性的基因，提供温度抗性的基因，或者在培养基中不存在某些因子、化合物和/或(食物)成分时允许所述宿主细胞或宿主生物体维持的基因，所述因子、化合物和/或(食物)成分是未转化的细胞或生物体生存所必需的。
前导序列应该是这样的，以致——在要用的宿主细胞或宿主生物体中——其允许理想的翻译后修饰和/或以致其将转录的mRNA导向细胞的理想部分或细胞器。前导序列还可以允许从所述细胞分泌表达产物。同样地，前导序列可以是在所述宿主细胞或宿主生物体中可操作的任何原-(pro-)、前-(pre-)或前原-(prepro-)序列。对于在细菌细胞中表达，前导序列可以不是必需的。例如，本身已知用于抗体和抗体片段(包括但不限于单结构域抗体和ScFv片段)表达和生产的前导序列可以以基本上相似的方式使用。
表达标记或报道基因应该是这样的，即，——在宿主细胞或宿主生物体中——其允许检测所述遗传构建体(其上存在的基因或核苷酸序列)的表达。表达标记任选地还可以允许表达产物的定位，例如，定位在细胞的特定部分或细胞器中和/或在多细胞生物体的特定细胞、组织、器官或部分中。所述报道基因还可以表达为与本发明的氨基酸序列融合的蛋白融合体。一些优选的但非限制性的实例包括荧光蛋白如GFP。
适宜的启动子、终止子和其它元件的一些优选的但非限制性的实例包括可以用于在本文提及的宿主细胞中表达的那些；并且特别是适用于在细菌细胞中表达的那些，诸如本文提及的那些和/或在下述实施例中所用的那些。关于可以存在于/用于本发明的遗传构建体的启动子、选择标记、前导序列、表达标记和其它元件的一些(其它)非限制性的实例——诸如终止子、转录和/或翻译增强子和/或整合因子——参考上文提及的通用手册，诸如Sambrook等和Ausubel等，以及WO 95/07463，WO 96/23810，WO95/07463，WO 95/21191，WO 97/11094，WO 97/42320，WO 98/06737，WO98/21355，US-A-7,207,410，US-A-5,693,492和EP 1 085 089中给出的实例。其它实例对于专业技术人员应该是清楚的。参考也参见上文引用的公知背景技术和本文引用的其它参考文献。
本发明的遗传构建体通常可以通过将本发明的核苷酸序列与上文所述的一个或多个其它元件适当地连接而提供，例如应用上文提及的通用手册诸如Sambrook等和Ausubel等中所述的技术。通常，本发明的遗传构建体通过将本发明的核苷酸序列插入到本身已知的适当的(表达)载体中而获得。适当的表达载体的一些优选的但非限制性的实例是下述实施例中所用的那些，以及本文提及的那些。
本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可以用于转化宿主细胞或宿主生物体，即，用于表达和/或生产本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。适当的宿主或宿主细胞是专业技术人员所清楚的，并且例如可以是任何适当的真菌的、原核的或真核的细胞或细胞系，或者任何适当的真菌的、原核的或真核的生物体，例如：
-细菌菌株，其包括但不限于革兰氏-阴性菌株，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株；变形菌属(Proteus)菌株，例如奇异变形菌(Proteus mirabilis)菌株；假单胞菌属(Pseudomonas)菌株，例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株；以及革兰氏-阳性菌株，诸如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株或短芽孢杆菌(Bacillus brevis)菌株；链霉菌属(Streptomyces)菌株，例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)菌株；葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株，例如肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)菌株；以及乳球菌属(Lactococcus)菌株，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株；
-真菌细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：木霉属(Trichoderma)，例如Trichoderma reesei的物种；脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；粪壳属(Sordaria)，例如大孢粪壳(Sordaria macrospora)；曲霉菌(Aspergillus)，例如黑曲霉(Aspergillusniger)或酱油曲霉(Aspergillussojae)；或其它丝状真菌；
-酵母细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：酵母属(Saccharomyces)，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；毕赤酵母属(Pichia)，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或Pichia methanolica；汉逊酵母属(Hansenula)，例如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)；Arxula，例如Arxula adeninivorans；Yarrowia，例如Yarrowia lipolytica；
-两栖类细胞或细胞系，诸如爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)；
-来源于昆虫的细胞或细胞系，诸如来源于鳞翅目(lepidoptera)的细胞/细胞系，包括但不限于贪夜蛾(Spodoptera)SF9和Sf21细胞，或者来源于果蝇属(Drosophila)的细胞/细胞系，诸如Schneider和Kc细胞；
-植物或植物细胞，例如在烟草(tobacco)植物中；和/或
-哺乳动物细胞或细胞系，例如来源于人的细胞或细胞系、来源于哺乳动物的细胞或细胞系，包括但不限于CHO-细胞、BHK-细胞(例如BHK-21细胞)，以及人细胞或细胞系，诸如HeLa，COS(例如COS-7)和PER.C6细胞；
以及本身已知的用于表达和生产抗体及抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的所有其它宿主或宿主细胞，这对于专业技术人员应该是清楚的。参考还参见上文引用的公知背景技术，以及例如WO94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken等，(1998)，同前所述；Riechmann和Muyldermans，(1999)，同前所述；van der Linden，(2000)，同前所述；Thomassen等，(2002)，同前所述；Joosten等，(2003)，同前所述；Joosten等，(2005)，同前所述；以及本文所引用的其它参考文献。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以被引入多细胞生物体的一个或多个细胞、组织或器官中并且在其中表达，例如用于预防和/或治疗目的(例如，作为基因治疗)。为了这一目的，可以将本发明的核苷酸序列以任何适当的方式引入到细胞或组织中，例如照此(例如使用脂质体)或者在它们插入到适当的基因治疗载体(例如，衍生于反转录病毒诸如腺病毒，或者细小病毒诸如腺伴随病毒)中之后。同样对于专业技术人员应该是清楚的，这样的基因治疗可以在体内进行和/或在患者体内原位进行，其通过给患者或患者的特定细胞或特定组织或器官施用本发明的核酸或者编码其的适当的基因治疗载体而进行；或者适宜的细胞(通常取自要治疗的患者的身体，诸如移植的淋巴细胞、骨髓吸出物或活组织切片)可以用本发明的核苷酸序列在体外进行治疗，然后适当地(重新)引入回到所述患者的身体内。所有这些可以使用专业技术人员公知的基因治疗载体、技术和递送系统进行，例如，在下列各项中所述：Culver，K.W.，″基因治疗(Gene Therapy)″，1994，p.xii，Mary Ann Liebert公司，出版，New York，纽约)；Giordano，自然F医学(Nature F Medicine)2(1996)，534-539；Schaper，循环研究(Circ.Res).79(1996)，911-919；Anderson，科学(Science) 256(1992)，808-813；Verma，自然(Nature) 389 (1994)，239；Isner，柳叶刀(Lancet)348(1996)，370-374；Muhlhauser，循环研究(Circ.Res).77(1995)，1077-1086；Onodera，血液学(Blood)91；(1998)，30-36；Verma，基因治疗(Gene Ther).5(1998)，692-699；Nabel，纽约科学院年刊(Ann.N.Y. Acad.Sci.)：811(1997)，289-292；Verzeletti，人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)9(1998)，2243-51；Wang，自然医学(Nature Medicine)2(1996)，714-716；WO94/29469；WO 97/00957，US 5,580,859；US 5,5895466；或Schaper，现代生物技术观点(Current Opinion in Biotechnology)7(1996)，635-640。例如，在本领域中已描述ScFv片段(Afanasieva等，基因治疗(Gene Ther.)，10，1850-1859(2003))和双抗体(Blanco等，免疫学杂志(J.Immunol)，171，1070-1077(2003))的原位表达。
对于纳米抗体在细胞中的表达，它们还可以作为所谓的“细胞内抗体”表达，例如在WO 94/02610，WO 95/22618和US-A-7004940；WO 03/014960中所述；在Cattaneo，A.和Biocca，S.(1997)细胞内抗体：开发和应用(Intracellular Antibodies：Development and Applications).Landes和Springer-Verlag；以及在Kontermann，方法(Methods)34，(2004)，163-170中所述。
例如，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以在转基因哺乳动物的乳中产生，例如在兔、母牛、山羊或绵羊的乳中(对于将转基因引入哺乳动物的通用技术参见例如US-A-6,741,957，US-A-6,304,489和US-A-6,849,992)，在植物中或植物的部分中产生，所述植物部分包括但不限于它们的叶、花、果实、种子、根或turbers(例如在烟草、玉米、大豆或苜蓿中)中，或者例如在蚕家蚕(Bombix mori)的蛹中。
此外，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以在不含细胞的表达系统中表达和/或生产，并且这样的系统的适当的实例应该是专业技术人员所清楚的。一些优选的但非限制性的实例包括在麦芽胚系统中的表达；在兔网织红细胞裂解物中表达；或者在大肠杆菌(E.coli)Zubay系统中表达。
如上文提及，应用纳米抗体的一个优点在于，基于此的多肽可以通过在适宜的细菌系统中表达而制备，并且适宜的细菌表达系统、载体、宿主细胞、调节元件等对专业技术人员是清楚的，例如参考上文引用的参考文献。然而，应该注意，本发明在其最广泛意义上并不限于在细菌系统中表达。
优选地，在本发明中，应用(体内或体外)表达系统，诸如细菌表达系统，其以适于药用的形式提供本发明的多肽，并且所述表达系统也是专业技术人员所清楚的。专业技术人员还应该清楚，适于药用的本发明的多肽可以使用肽合成技术制备。
对于工业规模的生产，用于纳米抗体或包含纳米抗体的蛋白治疗物的(工业)生产的优选的异源宿主包括大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(S. cerevisiae)的菌株，其适用于大规模表达/生产/发酵，并且特别适用于大规模药物(即，GMP级别)表达/生产/发酵。所述菌株的适当的实例是专业技术人员所清楚的。所述菌株以及生产/表达系统也可从公司诸如Biovitrum(Uppsala，瑞典)获得。
备选地，哺乳动物细胞系，特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，可以用于大规模表达/生产/发酵，并且特别用于大规模药物表达/生产/发酵。并且，所述表达/生产系统也可从上文提及的一些公司获得。
具体的表达系统的选择部分取决于特定的翻译后修饰的需要，更具体地是糖基化的需要。生产包含纳米抗体的重组蛋白，对于所述重组蛋白糖基化是理想的或者必需的，将使得应用具有将所表达的蛋白糖基化的能力的哺乳动物表达宿主成为必要。在这一方面，专业技术人员应该清楚，获得的糖基化模式(即，附着的残基的种类、数量和位置)将取决于表达所用的细胞或细胞系。优选地，使用人细胞或细胞系(即，形成基本上具有人糖基化模式的蛋白)，或者使用另一种哺乳动物细胞系，其可以提供基本上和/或功能上与人糖基化作用相同的糖基化模式或者至少模拟人糖基化作用。一般地，原核宿主诸如大肠杆菌不具有将蛋白糖基化的能力，并且应用更低等真核细胞诸如酵母通常导致与人糖基化作用不同的糖基化模式。不过，应该理解，所有前述宿主细胞和表达系统可以用于本发明，这取决于要获得的理想的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。
因此，按照本发明的一个非限制性方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽被糖基化。按照本发明的另一个非限制性方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽未被糖基化。
按照本发明的一个优选的但非限制性的方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在细菌细胞中生产，特别是在适于大规模药物生产的细菌细胞，诸如上文提及的菌株的细胞中生产。
按照本发明另一个优选的但非限制性的方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在酵母细胞中生产，特别是在适于大规模药物生产的酵母细胞，诸如上文提及的物种的细胞中生产。
按照本发明另一个优选的但非限制性的方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在哺乳动物细胞中生产，特别是在人细胞或人细胞系的细胞中，并且更特别是在适于大规模药物生产的人细胞或人细胞系的细胞中，诸如上文提及的细胞系中生产。
当应用在宿主细胞中的表达来生产本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽时，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以在细胞内产生(例如，在细胞溶质中，在周质或在内含体中)，然后从宿主细胞分离，并且任选地进一步纯化；或者可以在细胞外产生(例如，在培养所述宿主细胞的培养基中)，然后从培养基分离，并且任选地进一步纯化。当使用真核宿主细胞时，由于极大地促进进一步的分离以及获得的纳米抗体和蛋白的下游处理，所以通常优选细胞外生产。除了少数种类的蛋白诸如毒素和溶血素之外，细菌细胞诸如上文提及的大肠杆菌的菌株一般不向细胞外分泌蛋白，并且在大肠杆菌内的分泌生产是指蛋白穿过内膜易位到周质空间。周质生产相对于细胞溶质生产提供一些优点。例如，在通过特异的信号肽酶将分泌信号序列裂解之后，所分泌的产物的N-端氨基酸序列可以与天然基因产物相同。此外，在周质中比在细胞质中似乎存在少得多的蛋白酶活性。另外，由于在周质中更少的污染蛋白，所以蛋白纯化更简单。另一个优点是，由于周质提供比细胞质更加氧化性的环境，所以可以形成正确的二硫键。在大肠杆菌中过量表达的蛋白通常在不溶的聚集体，即所谓的内含体中发现。这些内含体可以位于细胞溶质中或在周质中；从这些内含体回收生物活性蛋白需要变性/重折叠步骤。许多重组蛋白，包括治疗性蛋白，是从内含体回收的。备选地，专业技术人员应该清楚，可以使用细菌已被遗传修饰的重组菌株，来分泌理想的蛋白，并且特别是本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。
因此，按照本发明的一个非限制性方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽是在细胞内产生并且从宿主细胞分离，并且特别是从细菌细胞或者从细菌细胞中的内含体中分离的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。按照本发明的另一个非限制性的方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽是在细胞外产生并且从培养宿主细胞的培养基中分离的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的启动子包括，-用于在大肠杆菌中表达：lac启动子(及其衍生物，诸如lacUV5启动子)；阿拉伯糖启动子；噬菌体λ的左向-(PL)和右向(PR)启动子；trp操纵子的启动子；杂合lac/trp启动子(tac和trc)；T7-启动子(更具体地是T7-噬菌体基因10的启动子)以及其它T-噬菌体启动子；Tn10四环素抗性基因的启动子；上述启动子的工程变体，其包括一个或多个拷贝的外来调节操纵基因序列；
-用于在酿酒酵母中表达：组成型：ADH1(醇脱氢酶1)，ENO(烯醇化酶)，CYC1(异-1细胞色素c)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)；PGK1(磷酸甘油酸激酶)，PYK1(丙酮酸激酶)；调节型：GAL1，10，7(半乳糖代谢酶)，ADH2(醇脱氢酶2)，PHO5(酸性磷酸酶)，CUP1(铜金属硫蛋白)；异源型：CaMV(花椰菜花叶病毒35S启动子)；
-用于在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达：AOX1启动子(醇氧化酶I)；
-用于在哺乳动物细胞中表达：人巨细胞病毒(hCMV)即时早期增强子/启动子；人巨细胞病毒(hCMV)即时早期启动子变体，其包含两个四环素操纵基因序列，以致所述启动子可以受Tet抑制基因调节；单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)启动子；劳斯肉瘤病毒长末端重复(RSV LTR)增强子/启动子；来自于人、黑猩猩、小鼠或大鼠的延伸因子1α(hEF-1α)启动子；SV40早期启动子；HIV-1长末端重复启动子；β-肌动蛋白启动子；
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的载体包括：
-用于在哺乳动物细胞中表达的载体：pMAMneo(Clontech)，pcDNA3(Invitrogen)，pMC1neo(Stratagene)，pSG5(Stratagene)，EBO-pSV2-neo(ATCC 37593)，pBPV-1(8-2)(ATCC 37110)，pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC 37224)，pRSVgpt(ATCC37199)，pRSVneo(ATCC37198)，pSV2-dhfr(ATCC 37146)，pUCTag(ATCC 37460)和1ZD35(ATCC37565)，以及基于病毒的表达系统，诸如基于腺病毒的那些；
-用于在细菌细胞中表达的载体：pET载体(Novagen)和pQE载体(Qiagen)；
-用于在酵母或其它真菌细胞中表达的载体：pYES2(Invitrogen)和毕赤表达载体(Invitrogen)；
-用于在昆虫细胞中表达的载体：pBlueBacII(Invitrogen)和其它杆状病毒载体；
-用于在植物或植物细胞中表达的载体：例如基于花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒的载体，适宜的农杆菌(Agrobacterium)菌株，或基于Ti-质粒的载体。
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的分泌序列包括：
-用于细菌细胞诸如大肠杆菌：PelB，Bla，OmpA，OmpC，OmpF，OmpT，StII，PhoA，PhoE，MalE，Lpp，LamB等；TAT信号肽，溶血素C-端分泌信号；
-用于酵母：α-交配因子前原-序列(α-mating factor prepro-sequence)，磷酸酶(pho1)，转化酶(Suc)，等；
-用于哺乳动物细胞：在靶蛋白是真核起源的情形中固有的信号(indigenous signal)；鼠Ig κ-链V-J2-C信号肽；等。
用于转化本发明的宿主或宿主细胞的适宜的技术对专业技术人员是清楚的，并且可以取决于要用的宿主细胞/宿主生物体和要用的遗传构建体。参考也参见上文提及的手册和专利申请。
转化后，可以进行检测并且选择已经成功转化了本发明的核苷酸序列/遗传构建体的那些宿主细胞或宿主生物体的步骤。例如，这可以是基于存在于本发明的遗传构建体中的选择标记的选择步骤，或者是包括检测本发明的氨基酸序列的步骤，例如，使用特异的抗体进行。
转化的宿主细胞(其可以是稳定的细胞系的形式)或宿主生物体(其可以是稳定的突变系或株系的形式)形成本发明的另一方面。
优选地，这些宿主细胞或宿主生物体是这样的，以致它们表达或者(至少)能够表达(例如，在适宜的条件下)本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽(并且在宿主生物体的情形中：在它的至少一种细胞、部分、组织或器官中)。本发明还包括本发明的宿主细胞或宿主生物体的其它世代、后代和/或子代，例如，其可以通过细胞分裂或者通过有性或无性生殖获得。
为了生产/获得本发明的氨基酸序列的表达，所述转化的宿主细胞或转化的宿主生物体通常可以在本发明(理想的)氨基酸序列、纳米抗体或多肽得到表达/生产的条件下保存、维持和/或培养。适宜的条件对专业技术人员是清楚的，并且通常取决于所用的宿主细胞/宿主生物体，以及取决于控制本发明的(相关)核苷酸序列表达的调节元件。此外，参考参见在上文关于本发明的遗传构建体段落中提及的手册和专利申请。
一般地，适宜的条件可以包括使用适宜的培养基，存在适宜的食物来源和/或适宜的营养素，使用适当的温度，并且任选地存在适当的诱导因子或化合物(例如，在本发明的核苷酸序列在可诱导启动子的控制下的情形中)；所有这些可以由专业技术人员选择。此外，在这样的条件下，本发明的氨基酸序列可以以组成型方式、以瞬时方式、或者只在适当地诱导时表达。
专业技术人员还应该清楚，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽可以(首先)以不成熟的形式(如上文提及)产生，其然后可以进行翻译后修饰，这取决于所用的宿主细胞/宿主生物体。并且，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽可以被糖基化，这也取决于所用的宿主细胞/宿主生物体。
然后，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽可以从宿主细胞/宿主生物体和/或从培养所述宿主细胞或宿主生物体的培养基中分离，这使用本身已知的蛋白分离和/或纯化技术，诸如(制备级)层析和/或电泳技术、差别沉淀技术、亲和技术(例如，使用与本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽融合的特异性的、可裂解的氨基酸序列)和/或制备级免疫学技术(即，使用针对要被分离的氨基酸序列的抗体)进行。
通常，对于药物应用，本发明的多肽可以配制成药物制剂或组合物，其包括至少一种本发明的多肽和至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或辅药，并且任选地一种或多种其它药物活性多肽和/或化合物。通过非限制性实例的方式，这样的制剂可以是适于下列各项的形式：口服给药，肠胃外给药(诸如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)，局部给药，通过吸入、皮肤贴片、植入物、栓剂给药，等等。所述适宜的给药形式——取决于给药的方式，其可以是固体、半固体或液体——以及制备其所用的方法和载体，对专业技术人员是清楚的，并且在本文中进一步描述。
因此，在另一个方面中，本发明涉及一种药物组合物，其包含至少一种本发明的氨基酸，至少一种本发明的纳米抗体或至少一种本发明的多肽，以及至少一种适当的载体、稀释剂或赋形剂(即，适于药用)，以及任选地一种或多种其它活性物质。
通常，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以以本身已知的任何适当的方法配制和施用，例如，关于其的参考文献参见上文引用的公知背景技术(并且特别参见WO 04/041862，WO 04/041863，WO 04/041865和WO 04/041867)，以及参见标准手册，诸如雷明顿药物科学(Remington’sPharmaceutical Sciences)，第18版，Mack出版公司，美国(1990)或雷明顿，制药科学和实践(Remington，the Science and Practice of Pharmacy)，第21版，Lippincott Williams和Wilkins(2005)。
例如，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以本身已知的用于常规抗体及抗体片段(包括ScFv’s和双抗体)和其它药物活性蛋白的任何方法配制和施用。所述制剂以及制备其的方法对于专业技术人员是清楚的，并且例如，包括适于肠胃外给药(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、腔内、动脉内或鞘内给药)或适于局部(即，经皮的或皮内)给药的制剂。
例如，用于肠胃外给药的制剂可以是适于输注或注射的无菌溶液、混悬液、分散液或乳剂。例如，用于所述制剂的适宜的载体或稀释剂包括但不限于，无菌水以及水性缓冲液和溶液，诸如生理磷酸盐缓冲液、林格溶液、葡萄糖溶液、和Hank′s溶液；水油(water oils)；甘油；乙醇；二醇诸如丙二醇，或者以及矿物油，动物油和植物油例如花生油、豆油，及它们的适宜的混合物。通常优选水性溶液或混悬液。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以使用递送的基因治疗方法进行施用。参见，例如，美国专利号5,399,346，其完全结合作为参考。使用递送的基因治疗方法，转染了编码本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的基因的原代细胞另外可以用组织特异性启动子转染，以靶向特异的器官、组织、移植物、肿瘤或细胞，并且另外可以使用用于亚细胞定位表达的信号和稳定序列进行转染。
因此，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以与药用赋形剂诸如惰性稀释剂或载体组合全身施用，例如，口服地施用。它们可以包封在硬壳或软壳的明胶胶囊中，可以压缩成片剂，或者可以直接与患者日常饮食的食物组合。对于口服治疗性施用，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以与一种或多种赋形剂组合，并且以可吸收的片剂、颊含片剂、药片、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。所述组合物和制剂应该包含至少0.1％的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。当然，所述组合物和制剂的百分数可以变化，并且可以便利地在所给单位剂型的约2-约60重量％之间。本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在这样的治疗有效组合物中的量是这样的，以致获得有效的剂量水平。
所述片剂、药片、丸剂、胶囊等还可以包含下列各项：粘合剂，诸如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；并且可以加入甜味剂，诸如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦，或者调味剂，诸如薄荷、冬青油、或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的物质之外，它还可以包含液体载体，诸如植物油或聚乙二醇。各种其它物质可以作为涂层存在，或者另外改变所述固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂、或胶囊可以用胶、蜡、紫胶或糖等包被。糖浆或酏剂可以包含本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽，作为甜味剂的蔗糖或果糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯类，染料和调味剂诸如樱桃或橙味调味剂。当然，在制备任何单位剂型中所用的任何物质都应该是药学可接受的，并且在所用的量上基本上无毒。另外，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以结合在缓释制剂和装置中。
用于口服给药的制备物和制剂还可以被提供以肠衣，所述肠衣允许本发明的构建体抵抗胃环境，并且进入肠内。更一般地，用于口服给药的制备物和制剂可以适当地配置成用于递送到胃肠道的任何理想的部分。另外，适宜的栓剂可以用于递送到胃肠道内。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以通过输注或注射进行静脉内或腹膜内施用。本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽或者它们的盐的溶液可以在水中制备，任选地与无毒表面活性剂混合。分散体还可以在甘油、液体聚乙二醇、三醋精及其混合物中以及在油中制备。在普通的保存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。
适于注射或输注的药物剂型可以包括包含活性成分的无菌的水溶液或分散液或者无菌粉剂，其适合即时制备无菌注射或输注溶液或分散体，任选地包封在脂质体中。在所有情形中，在制备和保存条件下，最终剂型必须是无菌的、流动的和稳定的。液体载体或赋形剂可以是溶剂或液体分散介质，例如，其包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其适当的混合物。可以保持适当的流动性，例如，通过形成脂质体，在分散剂的情形中通过保持需要的颗粒大小或者通过使用表面活性剂。防止微生物作用可以通过各种抗细菌和抗真菌试剂获得，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等。在许多情形中，优选地包括等渗剂，例如，糖、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶而获得。
无菌注射溶液通过将需要量的本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽结合在适当的溶剂中，当需要时，与上文列举的各种其它成分一起结合，然后进行过滤除菌而制备。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上在先前的无菌过滤溶液中存在的任何其它理想的成分的粉剂。
对于局部给药，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以以纯的形式应用，即，在它们是液体的情形中。然而，通常理想地将它们作为与皮肤病学可接受的载体结合的组合物或制剂施用到皮肤上，所述载体可以是固体或液体。
有用的固体载体包括细碎分裂的固体，诸如滑石、粘土、微晶纤维素、硅石、矾土等。有用的液体载体包括水、羟烷类或二醇类或水-醇/二醇掺合剂，其中本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以以有效水平溶解或分散，任选地在无毒表面活性剂的帮助下溶解或分散。可以添加辅药诸如香味剂和其它抗微生物剂，以将给定用途的特性最优化。得到的液体组合物可以通过吸收衬垫应用，用于浸渍的绷带及其它敷料，或者使用泵型或气溶胶喷雾器喷到感染区域。
增稠剂诸如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐及酯、脂肪醇、改性纤维素或改性的矿物质还可以与液体载体一起使用，以形成易涂开的糊剂、凝胶、药膏、皂剂等，用于直接涂覆到使用者的皮肤。
可以用于将本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽递送到皮肤的有用的皮肤病用组合物的实例是本领域已知的；例如，参见Jacquet等(美国专利号4,608,392)，Geria(美国专利号4,992,478)，Smith等(美国专利号4,559,157)和Wortzman(美国专利号4,820,508)。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽的有用剂量可以通过比较它们的体外活性和在动物模型中的体内活性而确定。将在小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人的方法是本领域已知的；例如，参见美国专利号4,938,949。
通常，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽在液体组合物诸如洗液中的浓度约0.1-25重量-％，优选地约0.5-10重量-％。在半固体或固体组合物诸如凝胶或粉剂中的浓度约0.1-5重量-％，优选地约0.5-2.5重量-％。
需要用于治疗的本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽的量不但随着所选的特定的氨基酸序列、纳米抗体或多肽而变化，而且随着施用途径、要治疗的病症的性质以及患者的年龄和病症而变化，并且最终取决于随从医生或临床医生的判断力。此外，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽的剂量变化取决于靶细胞、肿瘤、组织、移植物或器官。
理想的剂量可以便利地以单一剂量或作为在适当的时间间隔施用的分剂量而存在，例如，作为每天2、3、4次或更多的亚剂量。所述亚剂量本身可以进一步分割，例如，分割成许多次不连续的宽松间隔的施用；诸如从吸入器多次吸入，或者通过施用多滴到眼睛中。
根据本发明的稳定多肽可有利地用于所有应用领域中例如在癌症和感染的治疗中，作为免疫毒素用于药物靶向和用于基因治疗中。在影像和诊断中的应用同样是有利的，例如以便分析抗原结合物质。
根据本发明的过程对于稳定已经因为其他原因被修饰的单可变结构域，诸如例如人源化或嵌合的单可变结构域是特别有利的。这种氨基酸的修饰可导致去稳定，并且根据本发明的过程可通过这些在CDR区外的单可变结构域的额外修饰而恢复或甚至改善单可变结构域的初始稳定性。
本发明设想，天然存在的免疫球蛋白序列是序列的规范集合体，其总和应当与单可变结构域功能的所有方面相适合的。
本发明通过下面的实验部分、附图、表格和序列表更详细地进行描述。
附图描述
图1：SEQ ID NO：1的RP-HPLC层析谱的放大图以图示显示为前峰和后峰的产物相关的物质(即，主峰之前和之后的洗脱物)。指示了在标记SEQID NO：1主基准标准品BATCH 1(批次1)中存在的峰时使用的术语。
图2：在-70℃，+5℃和+25℃下保存0，1和2个月后SEQ ID NO：1批次2的RP-HPLC层析谱的相关部分。
图3：在37℃下温育0，4和8周后SEQ ID NO：1 BATCH 1的RP-HPLC层析谱的相关部分。
图4：SEQ ID NO：2(二价纳米抗体SEQ ID NO：1的单价构件)的氨基酸序列和序数编号。SEQ ID NO：1是由两个相同拷贝的SEQ ID NO：2免疫球蛋白结构域组成的单一多肽链，所述两个拷贝头对尾地融合，其间为三个丙氨酸残基接头(总计259个残基)。CDR区被下划线。在本报告中讨论的残基被突出显示；这些残基根据其在单价SEQ ID NO：2上的位置进行编号，即：E1，M34，M78，M83，D62/S63，D105/G106，和N84/S85。读者将认识到，在SEQ ID NO：1的情况下，这些名称指两个等价位置，即两个相同结构域中的每一个中各有一个，并且例如，M34还指存在于SEQ IDNO：1中165位点处的甲硫氨酸残基。还要指出此编号与本申请中其他地方也提到的KABAT编号系统不对应。
图5：在计时起点时(蓝色层析谱)和在37℃下温育8周后(红色层析谱)SEQ ID NO：1批次1的胰蛋白酶消化产物在214nm记录的RP-HPLC层析谱。标记至今已经表征的各个峰；它们的特性显示在表B-3中。未标记的峰的特性仍然要确定。比T12晚洗脱的峰可能是部分消化的产物；完整的SEQ ID NO：1也在90分钟左右洗脱。
图6：被有意氧化(虚线)的和参考的(实线；批次1)SEQ ID NO：1的RPC层析谱的相关部分的比较。插入部分显示持续强制氧化后的谱型；清晰地，在用H2O2处理期间，不仅形成单氧化(+16Da)而且形成双氧化(+32Da)的SEQ ID NO：1。
图7：用过氧化氢(H2O2，下图)和叔丁基过氧化物(TBHP，上图)有意氧化未折叠的和天然的SEQ ID NO：2。在4M盐酸胍(Gua.HCl)的存在下，当用TBHP处理时SEQ ID NO：1容易氧化，并且甚至用过氧化氢处理时仍然如此。除了非氧化物质(即，最右侧的峰)以外，在RPC层析谱中可辨别7个峰：MS分析(数据未显示)表明这些代表三种可能的单氧化形式(+16Da)，三种不同的双氧化变异体(+32Da)，和最后，在最左侧，三联氧化种类(+48Da)。当在D-PBS中对SEQ ID NO：2进行氧化时获得的谱型清晰地表明本质上在天然SEQ ID NO：2分子中仅一个单甲硫氨酸残基是易受影响的。最小的峰可认为是第二个甲硫氨酸残基对H2O2处理有点敏感的证据。图8中H2O2处理的M78A突变体的RPC谱型确认了此观点。各种混合物在RPC分析之前进行SEC(NAP5脱盐柱，GE Healthcare)。
图8：SEQ ID NO：2野生型(wt)和3种不同的M-＞A突变体的有意氧化。在各种情况下，未处理的变体(蓝色)的RPC谱型与用叔丁基过氧化物(TBHP；绿色)或过氧化氢(H2O2；红色)氧化后获得的层析谱进行比较。注意，在本实验中使用的wt SEQ ID NO：2的批次似乎含有污染物(与图7比较)。各种混合物在RPC分析之前进行SEC(NAP5脱盐柱，GE Healthcare)。
图9：具有使用正亮氨酸残基全部置换所有甲硫氨酸的SEQ ID NO：1变体的RPC(左图)和MS(右图)分析。左图显示wt SEQ ID NO：1(2.5μg批次1)和正亮氨酸变体(25μg)的RPC谱型的重叠。很显然，正亮氨酸变体的制剂包括所有可能的部分取代的变体以及一些wt SEQ ID NO：1(详情见文中；根据它们掺入正亮氨酸的数目来标记各个种类)。下面的分子质量是经实验测定的：27876(wt，预测质量为27876)；27823.5(3，具有3个正亮氨酸的变体的预测质量为27822)；27805(4，预测质量27804)；27786.5(5，预测质量27786)；27768(6，预测质量27768)。
图10：后峰2的面积和RPC柱上滞留时间之间的相关性。第一时间点对应于滞留/保留时间。对于其他实验，梯度的开始被延缓15分钟，30分钟，60分钟或120分钟。
图11：在37℃下保存4周后批次1，SEQ ID NO：1的E1Q-a变体和E1Q-b变体的RPC谱型。
图12：在37℃下保存的SEQ ID NO：1的部分肽图。在胰蛋白酶消化和RPC分析之前，批次1在37℃下保存2，4，6或8周；蓝色谱型代表计时起点的对照。在70℃下使用Zorbax 300SB-C3柱和5％-36.7％ ACN的梯度以每分钟0.33％进行RP-HPLC。
图13：批次1和SEQ ID NO：1 E1Q-a和E1Q-b变体的肽谱。蛋白用胰蛋白酶(1/50w/w比值)在37℃下在24小时内消化；将25μg各种消化的蛋白施加在柱上。RPC条件与图12中的实验相同。
图14：通过cIEF鉴定焦谷氨酸修饰。显示了电泳图的相关部分放大图以使PI差异更明显。左图：批次1和E1Q-a变体(进样样品含有0.23mg/mL的批次1和0.09mg/mL的E1Q-a)的混合物的cIEF分析。右图：批次1和E1Q-b变体(进样样品含有0.23mg/mL的批次1和0.15mg/mL的E1Q-b)的混合物的cIEF分析。样品在ICE280等电聚焦器(isoelectricfocuser)上分析之前用Zeba脱盐吸附柱(Pierce)脱盐。
图15：通过cIEF鉴定稳定性样品中的焦谷氨酸修饰。上图：含有在37℃下保存6周的批次1的样品的电泳图。下图：相同的批次1稳定性研究样品和E1Q-a变体的混合物(0.42mg/mL的批次1和0.09mg/mL的E1Q-a)的电泳图。样品在ICE280等电聚焦器上分析之前用Zeba脱盐吸附柱(Pierce)脱盐。
图16：SEQ ID NO：1批次1(上图)和SEQ ID NO：2(下图)相对于在37℃下保存时间的RP-HPLC谱型。对材料原样(对照，具有最高的主峰的曲线)，以及在37℃下保存2周(具有第二高的主峰的曲线)、4周(具有第三高的主峰的曲线)、6周(具有第四高的主峰的曲线)和8周(具有最低的主峰的曲线)后的样品进行分析。在保持于70℃下的C3柱上对样品进行层析，吸光度在280nm下测量。SEQ ID NO：2的RPC谱型显示了两个新的较早洗脱的分子种类，称为I1和I2。
图17：在计时起点时(蓝线/上迹线)和在37℃下保存8周后(红线/下迹线)wt SEQ ID NO：2与其突变体形式D105A，D105E，D105Q，D105N，和G106A的RPC谱型的比较。
图18：在计时起点时(红线/上迹线)和在37℃下保存4周后(蓝线/下迹线)野生型SEQ ID NO：2(WT)与其突变体形式D62A，D62E，和S63G的RPC谱型的比较。
图19：在37℃下保存的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中异天冬氨酸的形成。对在各种温育期后完整的SEQ ID NO：1(空心圆)、胰蛋白酶消化的SEQ ID NO：1(实心圆)或胰蛋白酶消化的SEQ ID NO：2(三角形)测量异天冬氨酸。在完整蛋白中测量到的异天冬氨酸的水平显著较低，表明需要消化来尽量减小蛋白质结构对检测异天冬氨酸残基的影响。蛋白中的异天冬氨酸丰度表示为百分比(％M∶M；摩尔异天冬氨酸∶摩尔纳米抗体)。对于某些样品，进行两次或三次独立的异天冬氨酸含量的测定。
图20：在37℃下保存期间SEQ ID NO：1(圆)及其单价副体SEQ IDNO：2(正方形)的活性丧失。数据拟合为准一级动态模型(见文中的eq.2)以推导出异构化过程的表观速率常数，该过程似乎是失活的分子机制。对于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，半衰期分别为～58天和～100天。
图21：在制备时存在或在保存期间出现的SEQ ID NO：1的主要产物相关变体。显示了SEQ ID NO：2的氨基酸序列，SEQ ID NO：2为二价纳米抗体SEQ ID NO：1的单价构件。CDR区被下划线。在本报告中讨论的残基显示为红色，即：E1，M34，M78，M83，D62/S63，D105/G106(使用根据图4的编号)。除了E1以外，这些名称指两个等价位点，即SEQ ID NO：1的两个相同结构域的每一个中各有一个。
图22：如在AlphaScreen测定(例如获自Perkin Elmer，UK的AlphaScreenTM技术)中测定，RANKL-1和RANKL-1D62E显示类似的效力。
图23：RANKL-1+RANKL-1_D62E (线或多或少相同)的RPC分析。包括具有isoD62，isoD105，和oxM78峰(也参见实施例1)的SEQ ID NO：1谱型作为阳性对照。*表示在起始物质和参考物质中也存在的峰。IsoD62和isoD105分别对应于Asp-105和Asp-62的异构化。oxM78对应于Met-78的氧化。pyroE1对应于N-末端环状焦谷氨酸的形成。
图24：在ZORBAX C3上进行IL6R203分析的214nm RP-HPLC层析谱，流速为1mL/分钟，梯度斜率为0.33％B/分钟，并使用TFA作为离子配对剂，但处于不同的柱温度下(50℃-60℃-70℃-75℃)。随着柱温度的下降峰洗脱时间增加且面积减小。
图25：在75和70℃下分析的样品的峰底区上的放大图。75℃显示第一后峰中有相当大地增加。应当注意这可能是温度效应。
图26：不同的柱温度对IL6R202的RP-HPLC谱型的作用非常大----这也见于IL6R203。获得可用的层析谱的最小温度为70℃。
图27-33：通过RPC分析IL6R201野生型和突变体：使用的柱为安捷伦(Agilent)系统上的ZORBAX 300SB C3(5μm)柱。在实验期间柱的温度为70℃。实验期间使用的缓冲液A为0.1％三氟乙酸，缓冲液B为0.1％三氟乙酸/99.9％乙腈。
图34：SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：26均在37℃下保存。4周后，样品通过RPC分析；层析谱的重叠显示在图34中。
图35：ALX-0081和VWF0001的Folts’研究。血流显示为时间的函数，表示CFR。股动脉(对照)损伤和狭窄后测量CFR 30分钟。注射盐水，并测量对CFR的作用30分钟。注射ALX-0081或VWF0001，每30分钟增加剂量。给药时间用红色箭头指示，剂量以红色指示(μg/kg)。当观察到CFR的完全抑制时，施加新的损伤。在测试项目的最高剂量后，注射肾上腺素。
图36：对于用ALX-0081和VWF0001治疗的狒狒，利托菌素诱导的聚集(％)和CFR的长度(秒)是所有剂量的函数。
图37：VHH片段IL6R201的强制氧化实验的280nm处的重叠RP-HPLC层析谱。下迹线是未处理的参考物质IL6R201的层析谱。上迹线是用10mM H2O2处理2小时的IL6R201的层析谱。
图38：119A3的强制氧化实验的280nm处的重叠RP-HPLC层析谱。上迹线：未处理的119A3参考样品；中间迹线：在6M胍的存在下用H2O2处理的119A3样品；下迹线：用H2O2处理的119A3样品。
图39：在37℃下温育8周的1SEQ ID NO：26(上迹线)和在-80℃下保存的参考物质(下迹线)的在280nm处记录的RP/HPLC/RPC层析谱。
图40：在37℃下温育8周的SEQ ID NO：25(上迹线)和在-80℃下保存的参考物质(下迹线)的在280nm处记录的RP/HPLC层析谱。
图41：RANKL-1中pH依赖性的N-末端环状焦谷氨酸形成。RANKL-1配制在不同的缓冲液中并且在37℃下保存至8周。在以63mg/ml处于10mM NaH2PO4，pH 7中(实心正方形)，以30mg/ml处于10mM NaH2PO4，pH7中(空心正方形)，以63mg/ml处于乙酸钠，pH 5.5(实心三角形)或以30mg/ml处于10mM乙酸钠，pH 5.5中(空心三角形)中的RANKL-1保存样品的RPC分析显示随着温育时间和缓冲液pH的增加焦谷氨酸变体的形成增加。表示为总积分表面积的百分比的焦谷氨酸的峰表面积在pH7下比在pH5.5下高。
图42：纳米抗体321中pH依赖性的N-末端环状焦谷氨酸形成。纳米抗体321的稳定性在2种缓冲液中评估：pH6下的组氨酸20mM与pH 6.5下的组氨酸20mM相比，两者均以5mg/mL的蛋白浓度。样品在37℃下胁迫直至6周。纳米抗体321保存样品的RPC分析显示焦谷氨酸变体的形成随着温育时间和缓冲液pH的增加而增加。上图(图42A)，在37℃下6周后RPC层析谱的实例(下迹线：-80℃参考；中间迹线：pH6；上迹线：pH6.5)。下图(图42B)，显示表示为总积分表面积的百分比的焦谷氨酸的峰表面积的图，该峰表面积在pH6.5下(空心正方形)比在pH6下(实心正方形)高。
实验部分
实施例1：vWF结合纳米抗体和纳米抗体构建体(SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2)的稳定
1)SEQ ID NO：1的化学表征
SEQ ID NO：1是二价纳米抗体单条多肽链由两个相同拷贝的免疫球蛋白结构域组成，所述两个拷贝头对尾地融合，其间为三个丙氨酸残基接头(参见WO2006122825的SEQ ID NO：98以及用于生成SEQ ID NO：1的说明书)。在每个结构域中存在一个二硫键。分析包将评估大多数典型地观察到的蛋白降解/修饰机制，更具体地为水解作用、氧化作用、脱酰胺作用、二硫键修饰作用以及凝集/沉淀。注意某些修饰作用，诸如脱磷酸作用和去糖基化作用不适用，因为没有发生这些翻译后修饰。
表B-1：使用特殊的方法对SEQ ID NO：1的各批次获得的测试结果。
通常，类似cIEF，SEC，RPC和表面等离子共振的分析方法揭示了SEQID NO：1的各批次之间的高度一致性。这在表B-1中阐明，该表中显示了最相关的产物特异性分析方法的结果。对我们而言反相层析(RPC)是最有益的方法，因为其将SEQ ID NO：1药物物质(DS)解析成许多不同的种类(参见图1)。备选地，HIC(疏水相互作用层析)也可以是分析DS中多样性的合适的方法。除了主峰以外，可辨别前峰(在主物质前洗脱的物质)和许多后峰。在到目前为止产生的批次中，前峰和后峰1分别始终表现为约2％和3.6％，而其他后峰占DS的＜1％。
以前对RPC前峰和后峰1进行了表征。通过ESI质谱法显示前峰比目的物质重16Da；结合由用H2O2处理组成的强制氧化实验，这表明前峰来自氧化作用。假设此氧化作用发生在一个或多个甲硫氨酸残基处(注意SEQ ID NO：1在两个相同的结构域的每一个中含有三个甲硫氨酸残基)。此外证明强制氧化的程度(在一定限度内)对生物活性无影响。质谱和氨基酸分析已经证明后峰1比主物质轻18Da，并且这是正亮氨酸残基错误掺入甲硫氨酸位点的结果。RPC后后峰1物质的回收表明此产物相关物质也是功能性的。实验工作揭示在收获时氧化和正亮氨酸产物相关物质都可存在于培养基中，且在下游加工期间它们的水平在一定程度上降低。
对SEQ ID NO：1的各批次的稳定性研究指出某些产物相关物质的相对丰度随时间和温度增加。图2清晰地显示了对于前峰以及后峰1均是如此。相反，并且十分令人惊奇地，后峰1的相对峰面积显然不受温育时间或温度的影响。另外，对SEQ ID NO：1观察到的RPC主峰在延长温育时似乎分裂成几种不同的种类。尤其在较高的温度下(≥25℃；见图3)。数据指出在保存期间生成了一些较早洗脱的新分子种类。
使用下面的氨基酸的单字母代码：A，丙氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；G，甘氨酸；K，赖氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸。
SEQ ID NO：1的几种不同的制剂/样品用于本报告中讨论的各种实验中，包括，例如，SEQ ID NO：1批次1，且其他的见表B-1。二价SEQ IDNO：1纳米抗体由两个相同拷贝的免疫球蛋白结构域组成，所述两个拷贝头对尾地融合，其间为三丙氨酸接头。对称为SEQ ID NO：2(参见WO2006122825的SEQ ID NO：90和用于生成SEQ ID NO：2的说明书)的单价构件的分析，结果是非常有价值的；这归因于与SEQ ID NO：1相比较低的复杂性以及以下的事实，即，与二价SEQ ID NO：1相比，对于SEQ IDNO：2，目的分子及其产物相关变体被RP-HPLC更好地解析。另外，进行突变分析，并且构建、纯化并分析SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2两者的各种突变体形式(见表B-2)。单价构件SEQ ID NO：2的氨基酸序列显示在图4中，并且突出显示在本报告中讨论的残基。至少一个批次不含有RPC后峰1(见图1)，发现其是生物合成期间正亮氨酸错误掺入的结果(见下)。表B-2：在本表征研究中使用的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的修饰/突变体形式的目录。所有重组蛋白均在大肠杆菌中产生，并且经离子交换层析，紧接着尺寸排阻层析纯化。
SED ID NO：2的其他突变体：
2)方法：
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的突变体(表B-2)的生成：
使用QuikChange定向诱变试剂盒(Stratagene，CA，USA)引入突变。使用聚合酶和循环变温仪进行QuikChange定向诱变法。PfuTurbo DNA聚合酶高保真地复制两条质粒链，而不置换突变体寡核苷酸引物。基本步骤利用含有目的插入体的超螺旋的双链DNA(dsDNA)载体和含有所需突变的两个合成的寡核苷酸引物。每个都与载体的相反链互补的寡核苷酸引物通过PfuTurbo DNA聚合酶在循环变温期间延伸。寡核苷酸引物的掺入生成了含有交错切口的突变质粒。在循环变温后，产物用Dpn I处理。Dpn I核酸内切酶(靶序列：5′-Gm6ATC-3′)对甲基化和半甲基化DNA特异，并且用来消化亲代DNA模板并选择含有突变的合成DNA。从几乎所有大肠杆菌菌株中分离的DNA均是dam甲基化的(dam-methylated)，因此对Dpn I消化敏感。
2.1)SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2及其突变体的结合效力
使用并行线路测定SEQ ID NO：1的结合效力。该方法以这样方式设计，以观察到双功能性；因此SEQ ID NO：1的单价构件SEQ ID NO：2没有效力。
SEQ ID NO：2的野生型和突变体形式对vWF的A1结构域的亲和性通过SPR技术(BIAcore)进行测定。各种浓度的SEQ ID NO：2(0.5-20nM范围)在A1传感器芯片上流过。从获得的传感图谱推导动力学常数kon和koff，并且用来计算平衡解离常数KD。在某些实验中，野生型和突变体SEQID NO：2的样品通过测量与A1传感器芯片的初始结合速率来进行比较。对于这些实验，样品稀释至2nM浓度。通过将在进样开始后5秒和25秒之间获得的数据点进行线性拟合从传感图谱的解离相中测定初始结合速率，并且报告的值为5次独立测量值的平均值。
2.2)SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2及其突变体的RP-HPLC分析
大多数对完整蛋白的RPC分析本质上如其他地方(A.A.Wakankar等，Biochemistry(生物化学)2007，46，1534-1544)所述而进行。在本报告中提及相关的差异。胰蛋白酶消化产物的RPC分析在下面更详细地描述。
2.3)通过RPC测定SEQ ID NO：1的浓度
反相-HPLC(RP-HPLC或RPC)
使用的柱为安捷伦(Agilent)系统上的ZORBAX 300SB C3(5μm)。在实验期间该柱的温度为70℃。使用的缓冲液A为0.1％三氟乙酸，缓冲液B为0.1％三氟乙酸/99.9％乙腈。使用的程序描述如下：
程序
作为通用规则，利用分光光度计测量SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2及其突变体的浓度。回收某些RP-HPLC级分中包含的物质用于直接测量生物活性。回收收率一般十分低，并且在重建的样品中SEQ ID NO：1(产物相关的变体)的浓度不允许进行浓度的分光光度计测量。在这些情况下，通过RPC再分析收集的物质和针对校正曲线的峰面积比较来确定浓度，所述校正曲线用SEQ ID NO：1批次1建立并且使SEQ ID NO：1的量与RPC总峰面积相关联。
2.4)质谱法
使用来自安捷伦(Agilent)的MSD ESI-TOF仪器进行质谱分析。如果该仪器连接到安捷伦(Agilent)1100HPLC，则其用作MS检测器以测定RPC法中各个峰的质量。对于独立样品的质量测定，在MS分析之前使用Poros-1柱用于缓冲液更换。
在根特大学蛋白质生物化学和蛋白质工程实验室(Ghent University，Laboratory of Protein Biochemistry and Protein Engineering)进行的MS和MS/MS实验在以阳离子模式工作的4700蛋白组学分析仪(ProteomicsAnalyzer)(MALDI-TOF/TOF，Applied B iosystems)或四极飞行时间仪(quadrupole time-of-flight instrument)(Q-TOF I，Micromass/Waters)上运行。在埃博灵克斯股份有限公司和布鲁塞尔自由大学(Free University ofBrussels)，使用Q-TOF Ultima(Micromass/Waters)获得ESI质谱。
对于MALDI分析，0.5μL胰蛋白酶消化产物与10μLα-氰基-4-羟基肉桂酸(10mg，在1mL 50％ACN，10％乙醇和0.1％TFA中)混合，并且点样在MALDI靶标板上。在400-4500Th的m/z范围内记录光谱。对于ESI-MS分析，在400-1200Th的m/z范围内记录光谱。最终的光谱解卷积(deconvoluted)，并且使用MaxEnt软件(Micromass/Waters)测定蛋白的分子质量。经碰撞诱导解离(CID)6进行ESI-MS/MS分析。使用MaxEnt3算法(Micromass/Waters)从MS/MS光谱中推导出序列信息。
2.5)SEQ ID NO：1的胰蛋白酶肽图
SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2(ca.1mg/mL终浓度)的样品用被还原性甲基化修饰的胰蛋白酶(Promega；约20μg/mL终浓度)消化。如果需要使用D-PBS进行稀释，并且在37℃下水解24小时，然后将该混合物在-20℃下冷冻。在于70℃工作的C3柱上进行肽分级分离。典型地，将25μL消化产物(ca.20μg蛋白)加样至柱上，并且使用从5％ACN-0.1％TFA增加至36.7％ACN-0.1％TFA的乙腈梯度在97分钟内洗脱肽。在214nm处检测各峰。图5给出了胰蛋白酶消化后获得的层析谱，该层析谱与在37℃下温育8周后获得的曲线重叠。通过质谱法确定大多数峰的身份(见表B-3)。
表B-3：在SEQ ID NO：1的胰蛋白酶图谱中观察到的峰的身份。T2-T2’代表预期的二硫键连接的肽。T2-T2和T2’-T2’是意料之外的；在SEQ ID NO：2中也观察到这些的事实表明它们反映了一些人工的二硫化物重排，并且不是错误的二硫键键合的结果。
2.6)异天冬氨酸的酶法定量
异天冬氨酸检测试剂盒(Promega Corporation，Madison，WI，USA)用于定量检测SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的异天冬氨酸残基。法使用酶蛋白异天冬氨酰甲基转移酶(PIMT)，该酶介导不规则的β-天冬氨酸肽键转变成为正常的肽键。PIMT催化S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的活性甲基转移至异天冬氨酸的α-羧基位置处，以形成O-甲基酯并且在该过程中生成S-腺苷高半胱氨酸(SAH)。此甲基酯的自发分解导致甲醇的释放和琥珀酰亚胺中间产物(即，在天冬酰胺残基的脱酰胺作用和天冬氨酸残基的重排期间形成的相同的环状酰亚胺中间产物)的形成。然后环状酰亚胺缓慢地水解以形成天冬氨酸和异天冬氨酸的混合物。在每次甲基化循环下，15-30％的不规则肽键转变为正常的肽键。异肽键向正常肽键的甲基化依赖性转变支持了PIMT在衰老损伤蛋白的修复中的生物学作用。
酶促甲基化提供了一种高度敏感的定量测定法以测定肽或蛋白中的异天冬氨酸。在一种格式中，试剂盒检测甲基化反应的副产物，即SAH。由于这是相对小的分子，其通常可从肽中分离，并且可通过反相高压液相色谱(使用Everest C18柱的RP-HPLC)来定量。在测试样品中异天冬氨酸针对靶蛋白的量通过与使用参考标准肽(序列：WAGG-IsoD-ASGE)并且借助于SAH HPLC标准品(两种试剂均由该试剂盒提供)进行的反应进行比较而确定。典型地，在使用阳性对照肽的实验中，～82％预期的异天冬氨酸被回收。根据试剂盒的供应商的使用说明书进行该测定。我们发现必须将SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的样品粉碎以尽量减小蛋白结构对异天冬氨酸残基的检测的影响。事实上观察到在完整蛋白中测量到的异天冬氨酸的皮摩尔数显著地低于消化蛋白中的皮摩尔数。用胰蛋白酶(1∶50；w∶w)在37℃下对样品进行蛋白酶消化24小时，并且用蛋白酶抑制剂PMSF(1mM终浓度；甲苯磺酰氟(phenylmethanesulphonylfluoride))终止反应。在分析中包含适当的空白/对照反应以确认不存在残余的胰蛋白酶活性，并且解释胰蛋白酶中存在的任何异天冬氨酸残基。
3)结果
3.1)RPC前峰1(和前峰3)的分析
RPC前峰(在主物质前洗脱的物质)包括占优势的前峰1。此前峰1的相对峰面积随保存时间和温度增加(见图2)。以前通过ESI质谱和强制氧化实验(参照图6)显示此前峰1代表单氧化形式，其比预期的SEQ ID NO：1重16Da。基于这是一个常见类型的蛋白化学修饰这一事实，假设此氧化作用发生在一个或多个甲硫氨酸残基处。SEQ ID NO：1含有6个甲硫氨酸残基，即两个相同结构域的每一个中有3个(图4)。有意氧化可产生另外的(多个)氧化种类，最显著地是在图6中指出的+32Da种类。如观察结果所证明，所有的氧化变体似乎都是有活性的，所述观察结果是由14％主峰和多至86％前峰组成的物质是完全功能性的。
通过直接分析在RP-HPLC分离期间收集的前峰1物质进一步证实了前峰是完全有活性的论点。为此，代表前峰1的洗脱级分使用离心浓缩器(speedvac)(miVAc浓缩器，Genevac)干燥，重新溶解在含有0.02％吐温80的PBS中，并且测定浓度后，在效力测定中进行分析。通过RPC再分析确认分离物质的身份。这也允许通过将峰面积与使用SEQ ID NO：1建立的校准曲线进行比较而定量前峰1物质(见章节6.3；注意相对低量的前峰1物质不允许分光光度测定浓度)。通过对照的方式使用相同的方法分离RPC主峰物质，重建和定量。发现RPC主峰和前峰1的效力实际上相同；主峰和前峰的相对效力分别为66.7％和65.5％。回收的主峰和前峰1物质的等同性强烈地支持氧化的SEQ ID NO：1与真实蛋白一样有活性的论点。
使用SEQ ID NO：2，即SEQ ID NO：1的单价构件，进一步研究SEQ IDNO：1纳米抗体的氧化。我们预期这将是有利的，因为SEQ ID NO：1的SEQ ID NO：2亚结构域仅含有三个甲硫氨酸残基，因此降低了复杂性，即，减少了氧化变体的理论可能数目。我们还发现与SEQ ID NO：1相比，对于SEQ ID NO：2，非氧化分子和各种氧化变体较好地被解析。图7显示天然SEQ ID NO：2纳米抗体的氧化多半发生在一个单甲硫氨酸残基上；相反，当该分子通过盐酸胍处理被展开后所有三个甲硫氨酸残基都易于被氧化。通过分析三个不同的甲硫氨酸至丙氨酸突变体，即，M34A，M78A，和M83A，获得了易发生氧化的残基的鉴定，以及，同时，明确地证明氧化作用实际上发生在甲硫氨酸处。显示在图8中的这些分析清楚地指出氧化作用发生在78位的甲硫氨酸残基上；M34A和M83A突变体仍然对氧化作用敏感，而丙氨酸对M78的置换似乎导致SEQ ID NO：2变体基本上耐受强制氧化(至少在测试条件下)。不象M34A和M83A突变体，M78A变体在制备时不含有前峰，表明前峰仅由M78氧化导致(数据未显示)。另外，也发现对于M34A和M83A所见到的小的前峰在37℃下延长保存时增加(例如，6周；数据未显示)。后一观察结果证实空气氧化和强制过氧化物介导的氧化作用靶向相同的M78残基。单价SEQ ID NO：2中基本上仅单个甲硫氨酸对氧化作用敏感的结论与在二价SEQ ID NO：1纳米抗体的持续氧化期间单氧化和双氧化种类两者的积累相一致(见图6)。似乎这一双氧化形式与RPC谱型中的前峰3相对应。
还要注意所有三种甲硫氨酸至丙氨酸突变体对固定的vWF A1结构域的亲和性与wt SEQ ID NO：2纳米抗体的结合常数(1.2nM)处于相同的范围。发现M34A，M78A，和M83A的平衡解离常数分别为1.96nM，1.46nM，和1.29nM。该结果与甲硫氨酸氧化不影响SEQ ID NO：1的效力的发现相一致。因此似乎甲硫氨酸残基不参与与vWF A1结构域的结合。
还使用胰蛋白酶肽图来检验SEQ ID NO：1的氧化。峰T10≠(见图5和表B-3)显示含有1269.6Da的肽，其恰好对应于T10的单氧化变体(1253.5+16Da)。这不允许定位在氧化敏感的甲硫氨酸残基，因为T10肽包含M78和M83两者。而且，发现T10≠峰主要由897.4Da的非特异性裂解产物组成(MVYLQMN；见表B-3和肽图显影报告)，其还包括78位和83位处的甲硫氨酸。后一片段解释了下面的观察结果，即，T10≠相对于T10的峰面积在计时起点已经很高，并且在37℃下温育期间不显著地增加。实际上，氧化作用对T10≠中存在的两个片段将具有相反的作用，一方面T10+16Da变体增加，另一方面非特异性裂解产物减少。肽作图数据的分析也显示T10峰的面积在37℃下保存期间逐渐减小。尽管这与78位处甲硫氨酸残基的氧化相一致，假如有可能与非特异性裂解相冲突，结果必须要小心处理。在37℃下温育8周后的SEQ ID NO：1中观察到的1269.6Da片段，对其进行ESI-Q-TOF MS/MS分析。在该实验中获得的部分序列数据不允许直接确认78位处的甲硫氨酰基亚砜(methionyl sulfoxide)。然而这可从83位处未修饰的甲硫氨酸的存在而推断出来。
3.2)RPC后峰1的分析
后峰1由生物合成期间在一个甲硫氨酸位点处错误掺入正亮氨酸残基而产生。这通过质谱和氨基酸分析的组合而最终确定。电喷雾电离飞行时间(ESI-TOF)测量已经显示后峰1以质量为27858 Da的蛋白占优势，其分子质量比真实的二硫键连接的SEQ ID NO：1纳米抗体小-18Da。对于-18Da差异一种可能的解释是正亮氨酸替换了甲硫氨酸残基。此假设通过纯化的主峰和后峰的氨基酸分析得到确认，该分析指出仅后峰1物质含有正亮氨酸和按比例地较少量的甲硫氨酸。应当注意，在氨基酸分析中典型地用作内部标准的正亮氨酸在这些实验中被省略。
为了测定-18Da产物相关变体的效力(即，观察亲和性测量值)，在RP-HPLC分离期间收集后峰1并直接在PLA效力测定中测量。类似于对前峰1进行的处理，代表后峰1的洗脱级分首先使用离心浓缩器(speedvac)(miVac Duo Concentrator，Genevac)干燥，然后在PBS中再溶解。以相同的方式纯化RPC主峰作为对照。进行三个独立但稍有不同的实验。在第一个实验中，用分光光度计测定重建后的浓度，并且不向PBS中加入吐温。
在第二个实验中，在干燥物质重建时，在PBS中存在0.02％吐温(以防止蛋白从相对稀的样品中损失)并且通过RP-HPLC再分析从峰面积推算浓度。RPC再分析还确认分离物质的身份。在第三个实验中，我们另外将纯化的主峰物质稀释至与后峰变体大致相同的浓度以尽可能地消除主峰和后峰样品之间的任何不一致性。在第一个实验中，在RPC分析后收集主峰和后峰1级分，在离心过滤装置(Microcon YM-3，3kDa NMW，Millipore)上浓缩，并且通过在Sephadex G-25离心柱上凝胶过滤将缓冲液更换为D-PBS。在实验期间，观察到部分物质的沉淀，并且关于效力测定中使用的浓度存在一些不精确性。发现主峰和后峰1的效力分别为参考SEQ IDNO：1的91.9％和51.6％。在第二个实验中，蛋白通过干燥和在水中再溶解而由RPC级分重建。与第一次测量相比，发现主峰和后峰1分别具有50％和81％的效力。整体上，上述结果提供了强力的证据，即后峰1具有与真实的SEQ ID NO：1相同的效力。观察到的变化归因于从H2O-TFA-ACN溶剂中回收完整物质的难度；发现回收率本身是十分低的，特别是在低丰度产物相关的变体的情况下。
为了进一步证实正亮氨酸对效力没有不良作用的假设，与在SEQ IDNO：1中的掺入位点无关，我们制备了甲硫氨酸被正亮氨酸残基全部替换的SEQ ID NO：1变体。在生长在补充了L-正亮氨酸的基本培养基中的甲硫氨酸营养缺陷株中产生此SEQ ID NO：1变异体。更具体地，细胞首先在非诱导条件下生长在丰富培养基中，然后通过离心收集并重新悬浮在含有L-正亮氨酸的基本培养基中，并且最后，在短暂的温育时间后，通过加入IPTG诱导。此方法以前已经进行了描述(Cirino等，2003，Biotechnol.Bioeng.(生物技术与生物工程)83，729-734)。SEQ ID NO：1制剂通过RPC、肽作图和MS表征；本质上，这些方法确认所有6个甲硫氨酸被正亮氨酸残基交换。然而从图9中很清楚，该制剂除了预期的正亮氨酸变体以外(图9中标记的6)，还含有小量的所有可能的部分置换的变体(图9中标记的1-5)以及一些wt SEQ ID NO：1。wt SEQ ID NO：1的存在非常可能是由于细胞在丰富培养基预培养期间启动子的不完全关闭而引起的遗漏表达的结果。部分置换形式清楚地指示在转换至基本培养基+正亮氨酸后剩余的甲硫氨酸的存在。多置换的变体的相对效力为80％(三次测量值的均值：67.9％，85.5％和86.7％)。因此，在所有6个甲硫氨酸残基被正亮氨酸完全置换的情况下，似乎SEQ ID NO：1的生物活性甚至不受影响，此结果必然暗示，单个正亮氨酸交换，不论其位置如何，也不影响效力。
单个甲硫氨酸被正亮氨酸残基置换或甲硫氨酸-78的氧化不(可测量到的)影响SEQ ID NO：1的效力的结论与下列的观察结果相一致，即所有三个甲硫氨酸至丙氨酸突变体(参见章节7.1)对固定的vWF A1结构域的亲和性与wt SEQ ID NO：2纳米抗体的结合常数处于相同的范围内。野生型，M34A，M78A，和M83A的平衡解离常数分别为1.2nM，1.96nM，1.46nM，和1.29nM。这种相对小的差异，假设它们真是这样，在二价SEQ ID NO：1与固定的vWF A1结构域结合的强烈条件下不可能被显示出来。总之，数据表明甲硫氨酸残基对SEQ ID NO：1的生物活性不是关键性的。
3.3)RPC后峰2的分析
通过RPC分析法在一定程度上形成后峰2
后峰2在制备时占总峰面积的约0.9％。观察到当改变RPC运转使得材料被洗脱之前在70℃下在柱上停留较长时间时该后峰增加。其中洗脱被延迟15分钟，30分钟，60分钟或120分钟的实验表明，后峰2面积线性地与柱上的滞留时间线性相关(参见图10)。外推至计时起点表明在不可能实施的柱上滞留时间为0的情况下，后峰2几乎不出现。这些发现使我们得出这样的结论，在制备时各批次SEQ ID NO：1均同样地缺少由后峰2代表的SEQ ID NO：1变体，并且该变体仅在RPC柱上相对短时间地暴露于70℃温度期间或保存期间形成(参见图2和SEQ ID NO：1)。
后峰2代表具有N-末端焦谷氨酸的SEQ ID NO：1
在5℃，25℃和40℃下延长温育期间形成后峰2。这也图示在图2中。然而％峰面积是扩大的，因为在柱上的RPC分析期间形成部分变体。我们已经显示后峰2应该归因于N-末端谷氨酸残基转变为环状焦谷氨酸。得出此结论的各个实验在下面讨论。
后峰2变体比真实SEQ ID NO：1轻18Da
为了鉴定作为后峰2洗脱的蛋白，在RP-HPLC分离后收集后峰，并且通过ESI-TOF质谱法测定其质量。由于在批次1标准品中可获得的浓度太低，因此用于ESI-QTOF分析的物质为在37℃下保存4周的批次1制剂。来自RPC级分的主峰具有27858Da的质量，即比天然SEQ ID NO：1(27876Da)轻18Da。尽管对此质量减少有几种不同的解释，但一致认为是N-末端谷氨酸残基的环化产生焦谷氨酸导致的水分子丢失所引起的。(类似于后峰1，后峰2代表在生物合成期间甲硫氨酸残基被正亮氨酸替换的SEQ ID NO：1变体的这种形式上的可能性被排除，因为在该情况下相对峰面积不受温育时间或温度的影响。)
改造的焦谷氨酸变体具有与RPC后峰2相同的滞留时间
通常，与谷氨酸相比，在N-末端谷氨酰胺残基的情况下，焦谷氨酸更容易出现(Gadgil等，2006，J.of the American Society of Mass Spectrometry(美国质谱学会杂志)17，867-872)。因此我们决定构建一种SEQ ID NO：1变体，其中谷氨酰胺替代N-末端谷氨酸(E1Q突变体)。此SEQ ID NO：1突变体可在monoS柱上在pH 4下被分级分离；称为E1Q-a和E1Q-b的两个丰度大约相同的种类被洗脱。两种级分被脱盐并进行ESI-TOF质谱测定；发现E1Q-b具有27874Da的质量(E1Q变异体的预期质量为27875Da)而E1Q-a具有27857 Da的质量(N-末端谷氨酰胺的环化导致损失一个NH3分子或17Da；预期质量为27858 Da)。从这些数据得出结论，E1Q-b对应于具有N-末端谷氨酰胺残基的SEQ ID NO：1，而E1Q-a代表环化的焦谷氨酸形式。RPC分析显示E1Q-a具有与后峰2相同的滞留时间，而E1Q-b谱型含有两个峰，与批次1主峰和后峰2相符合(参见图11)。最可能地，后一结果必须归因于下列的事实，即，在RPC分析期间显著部分的N-末端谷氨酰胺转变为焦谷氨酸，如对野生型SEQ ID NO：1分子所观察的那样。总之，数据支持了RPC后峰2归因于环状焦谷氨酸形式的形成的观点。
肽作图确认保存期间形成焦谷氨酸
通过肽作图确认在N-末端处形成焦谷氨酸残基(参见章节2.5)。胰蛋白酶肽的RPC分析揭示了一个峰的存在(即，表B-3所述的峰T1≠)，其质量与N-末端片段减18Da相对应。通过MS/MS分析的部分序列测定已经确认此肽实际上与N-末端T1胰蛋白酶片段相对应。根据对RPC后峰2的观察，发现在肽图中峰T1≠的相对峰面积随保存时间增加；在批次1中(几乎)不存在焦谷氨酸N-末端肽，而在37℃下保存8周后其较多地存在(参见图13)。与T1≠峰面积增加的同时，未修饰的N-末端T1肽的面积随保存时间减小(数据未显示)。另外通过对上述E1Q-a和E1Q-b变体进行肽作图证明了T1≠峰的身份。与E1Q-a代表在N-末端处具有环状焦谷氨酸的SEQ ID NO：1的观点相符合，发现此变体缺少T1肽，而是产生与T1≠峰相一致的片段。发现E1Q-b变体产生相同的T1≠峰以及另一个峰，该另一个峰被假定对应于在1位处含有谷氨酰胺而非谷氨酸残基的T1肽(参见图13)。
SEQ ID NO：1与其焦谷氨酸变体具有等同的效力
如上测定E1Q-a，即SEQ ID NO：1的焦谷氨酸变异体(参见上面)的效力，即，亲和力。相对于批次1的效力平均值为105％；在两个实验中的95％ CL为105％-113％和96％-106％。得出结论SEQ ID NO：1和其焦谷氨酸形式的效力没有显著的差异。
cIEF检测SEQ ID NO：1焦谷氨酸变体
发现焦谷氨酸修饰诱发SEQ ID NO：1等电点(pI)的迁移；这通过批次1以及批次1和上面提到的E1Q-a焦谷氨酸变体的混合物的cIEF分析来证明(参见图14)。焦谷氨酸形成清楚地产生了具有较高pI的独特峰。图14还显示谷氨酰胺替换谷氨酸(即E1Q-b变体)也对pI有作用，虽然不如环状焦谷氨酸明显。一方面焦谷氨酸对pI的明显作用，另一方面E1Q-b变体不容易被合理地解释。
在37℃下温育6周的SEQ ID NO：1的电泳图清楚地显示，除了主峰以外，保存导致许多新峰的出现(图15)。最突出的新峰，特征为较高的pI，其现在可明确地被归属为N-末端焦谷氨酸环的形成。图15显示该高pI变体与E1Q-a种类相符。N-末端焦谷氨酸产物因此可通过RP-HPLC被检测为后峰2，并且在cIEF中被检测为交高pI变体。与后峰2相反，在还没有进行保存的SEQ ID NO：1各批次中观察不到该高pI变异体；此观察结果支持了RPC条件本身诱发一些焦谷氨酸形成的观点。当考虑此作用时，如使用该两种不同技术从相对峰面积推算的焦谷氨酸形成的量良好地相符合(数据未显示)。
对于其他纳米抗体构建体也已经观察到了焦谷氨酸形成(见图41和42)。请注意，纳米抗体321的氨基酸序列列举在SEQ ID NO：38中。
纳米抗体321的氨基酸序列-SEQ ID NO：38：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSLPASGNIFNLLTIAWYRQAPGKGRELVA
TINSGSRTYYADSVKGRFTISRDNSKKTLYLQMNSLRPEDTAVYYCQTSGSGSPNFW
GQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVR
QAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYY
CTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTL
SSYAMGWFRQAPGKGREFVSRISQGGTAIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL
RPEDTAVYYCAKDPSPYYRGSAYLLSGSYDSWGQGTLVTVSS
存在着一种迹象，即使用较高的pH环境焦谷氨酸形成增加(pH6.5似乎显示焦谷氨酸形成多于pH6-参见图42)。
3.4)保存期间RPC主峰的裂峰的分析
在延长保存后RPC主峰分裂
在较高的温度下延长保存时使用SEQ ID NO：1观察到的RPC主峰似乎分成了几个不同的种类。数据表明在延长保存期间生成了一些较早洗脱的新种类(参见图3和16)。
分析发现使用单价构件SEQ ID NO：2更为简单直接，因为具有提高的解析度。RPC谱型揭示了尽管复杂性降低了，但同时主峰更容易分裂。图16显示可辨别出两个较早的新洗脱峰。如图16所指示，我们将这些峰称为I1和I2。
主峰的分裂由D105和D62的异构化产生
为了鉴定较早洗脱的I1和I2种类，在RP-HPLC分离后收集这两个峰，以及主峰，并且通过ESI-TOF质谱法测定它们的质量。用于ESI-TOF分析的物质是在37℃下保存6周的SEQ ID NO：2的制剂。发现所有三个峰具有相同的质量，即，对SEQ ID NO：2计算的质量。结果证明生成I1和I2的修饰作用不影响质量。数据使我们假设I1和I2可能由天冬氨酸的大量中性异构化引起，或可能由天冬酰胺残基的脱酰胺作用(导致重量仅增加1Da)引起。此工作假设还基于文献的数据，这些数据表明在RP层析中异构化变体典型地洗脱早于非修饰形式。SEQ ID NO：1的氨基酸序列的检查显示三个看上去似乎最可能的降解位点为N84/S85，D105/G106，和D62/S63。在每种情况下，N-或D-残基后紧接甘氨酸或丝氨酸残基，这些残基根据本发明通常被认为是最不稳定的。此外，D105位于CDR3区内，该区可被假定为较为柔性，这是已知有助于β-Asp形成的另一条件(Clarke，1987；Robinson，2002；Xie，2003)。在这一情形中，要注意已经报道了位于常规单克隆抗体的CDR区内的天冬氨酸残基的异构化(Cacia等，1996；Wakankar等，2007)。
84位处的天冬酰胺残基在所有美洲驼/单峰驼的结构中是严格保守的。其侧链完全地暴露于溶剂。对于N84的脱酰胺作用还没有发现实验证据。首先，肽作图数据显示在37℃下延长温育不能导致出现比T10峰早洗脱的分子种类。其次，发现将在N84的脱酰胺作用时形成的分子种类之一，即SEQ ID NO：2的N84D突变体，与wt种类一起洗脱出来，并且不形成RPC前峰或后峰中的任一种。
在62位和105位处的天冬氨酸残基发生异构化的最令人信服的证据来源于二肽D105/G106和D62/S63的突变分析。图17显示D105被A，E或Q替换消除了I1峰的出现，该峰清楚地见于在37℃下温育8周的wt分子的相应RPC谱型中。另一方面，在37℃下温育8周后，D105N突变体似乎完全地转变为异天冬氨酰和正常肽的混合物。β-D105与D105的平衡比为70∶30或约2.3，该数值类似于其他作者所发现的数值(Geiger和Clarke，1987，J.of Biological Chemistry(生物化学杂志)262，785-794)。D105N突变体的层析谱显示其他的产物相关变体(即，氧化形式和焦谷氨酸形式)也以相同的相对量分为D105和β-D105形式。另外，发现丙氨酸残基替换G106导致很小的I1峰。I1种类与D105的存在的关联性和另外的发现(即，I1峰可受天冬氨酸下游紧接的氨基酸的性质的调节)提供了强力的证据，即，实际上105位处的异构化是形成较早洗脱的种类I1的原因。类似地，显示A或E替换D62防止在37℃下温育期间形成I2峰(图18)。此外，甘氨酸替换S63残基清楚地促进了I2峰的形成。在后一种情况下，62位处的异构化变得比105位处的异构化更为重要，并且37℃下保存4周后的层析谱清楚地显示了β-D105/β-D62双异构化变体存在的迹象。对于上面提到的其中高丰度地形成β-D105的D105N突变体也适用。从这些数据似乎天冬氨酸异构化发生在105位和62位两处；两个修饰作用清楚地解释了在37℃下保存SEQ ID NO：2时新形成的峰。I1和I2的相对峰面积表明D62异构化的速率大大地低于105位。对于SEQ ID NO：1，在37℃温育时似乎形成多个不能分辨的峰(见图16)。我们相信考虑到二价分子(即，可生成额外的变异体，诸如在两个结构域中均具有β-D105的SEQ IDNO：1)增加的复杂性，这两个上面提到的异构化事件足以解释这些。
在62位形成β-天冬氨酸的第一个证据来源于在SEQ ID NO：1的肽图中检测到一个峰(即图5中的峰T7≠)，其随着在37℃下保存的时间而线性地增加并且在T7之前洗脱，即，该肽包含D62残基。在37℃下8周温育期后，T7≠峰代表约6.4％的总量(T7+T7≠)。发现此峰的质量对应于T7片段的理论质量(1487.5相对于1487.7Da)，并且MS/MS分析证实了该相同性。D62残基的大量中性异构化提供了对这些发现的最佳解释。在低能条件下生成的b-和y-型系列离子允许T7≠峰的全序列测定，但不能区分α和β天冬氨酸。D105的异构化不能使用肽图进行研究，因为该残基是小的5聚体肽的一部分，该5聚体肽在肽图中不能引起注意。
异天冬氨酸检测试剂盒用于在37℃保存的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中异天冬氨酸残基的定量检测。对于批次1和SEQ ID NO：2每月在37℃下β-D形成的比率分别为约7.6％和3.9％(摩尔异天冬氨酸：摩尔蛋白)。该2倍差异与这些纳米抗体的价位相一致。使用Isoquant试剂盒在SEQ ID NO：2中检测的异天冬氨酸水平与从肽图中推算的β-D62的量处于相同的范围内(即在37℃下保存8周后2x3.9％相对于6.4％)。此结果表明在完整纳米抗体或在胰蛋白酶片段中，105位处的异天冬氨酸可能不是PIMT酶的底物(或至少是非常差的一个)，尽管此酶在体外具有很宽的异天冬氨酸底物特异性。此推论得到下列观察结果的支持，即，分离的RPC峰I1仅包含约十分之一的预期量的异天冬氨酸(事后认识到，似乎检测到的水平归因于I2对I1峰的污染)----RPC主峰被并行地分离并在Isoquant测定中记分为负。分离的RPC峰通过RPC再分析验证并通过分光光度计定量测量。最终通过对合成肽A-E-IsoD-G-R及其非修饰副体A-E-D-G-R运行Isoquant测定获得确定性证据，即β-D105不是PIMT酶的底物。此肽对应于包含D105残基的胰蛋白酶片段(参照图4)，其实际上在测定条件下不是PIMT酶的底物。
在37℃下保存期间I1峰面积的增加已经用来推算在此温度下D105异构化的反应速率。线性最小二乘回归分析用来拟合数据集并且获得准一级速率常数(kobs)。下列的方程式用于拟合：
ln(I1∞-I1/I1∞)＝-kobst    [eq.1]
其中I1代表在时刻t时在SEQ ID NO：2 RPC层析谱中峰I1的相对面积，I1∞是在无穷远处(t-＞∞)的相对峰面积。I1∞设置在70％，因为预期异构化生成70∶30比值(如对D105N突变体的脱酰胺作用所观察到的；见上)。发现速率常数为0.006天-1(95％置信区间：0.0065-0.0049；等价于t1/2≈115天)，该数字与在其他蛋白/肽中发现的异构化速率一致(Stephenson和Clarke，1989，J.ofBiological Chemistry(生物化学杂志)264，6164-6170)。
关于62和105位处异构化的实验发现与结构数据良好地符合。在SEQ ID NO：1中，D62高度地暴露于溶剂；相对可及表面积为0.906。对于D105计算的较低的相对可及表面积值0.191可由晶体结构中R102和R107的侧链的接近性来解释。然而，在溶液中，精氨酸侧链非常柔性。在存在于不对称单位中的三个SEQ ID NO：1分子的每一个中，D105的侧链与G106的主链酰胺相互作用，可为在此位置处观察到的显著异构化作用提供解释。相反，D90似乎是溶剂不可及的，根据肽作图数据其是其中不发生异构化的残基(未显示的数据)。此外，此残基接受来自R67的氢键，而非与T91主链酰胺相互作用，这预期能对抗异构化。
D105的异构化是解释效力丧失的主要分子机制
在保存期间SEQ ID NO：1丧失其亲和力(本文也称为效力)。进行了几个保存研究。发现在25℃(12个月期间丧失～50％)，40℃(7周和5个月后分别为～40％和～20％残余活性)但非在5℃下该丧失是可检测的。在类似的研究中，还发现单价构件SEQ ID NO：2在保存期间丧失对vWF A1结构域的亲和性(如通过BIAcore分析确定)。考虑到由于SEQ ID NO：1分子的二价性质，该分子劣化的速度约快2倍，使用SEQ ID NO：2观察到的亲和性丧失(在37℃下温育的首个8周期间为约20％)大致与SEQ ID NO：1的效力丧失一致。
第一个线索是在105位处的异构化可能是生物活性丧失的原因，其由下列的观察结果推断而来，即SEQ ID NO：2的亲和性丧失幅度似乎与RPC峰I1的相对峰面积相关(参见图16)。此观点还得到下列事实的支持，即，D105位于CDR3中，CDR3通常被认为构成主要的抗原结合区，即，大部分结合自由能。下列的观察结果使我们得出结论，D105异构化代表主要的失活机制(参见表B-5)：
i.分离的RPC峰I1具有主峰的5％活性；这是用于Isoquant测定(见上)中的相同物质，并且应该不排除残余活性是污染的结果。
ii.D105A突变导致亲和性的10倍下降，表明D105侧链对与vWF A1结构域的结合提供很重要的贡献。
iii.在D105N突变体中，异构化作用交换为相当快的脱酰胺过程。在37℃下，天冬氨酰残基快速地修饰成～2.5∶1的比值的β-D和D的混合物；RPC分析已经指出此修饰反应在约2周后是完全的(数据未显示)。β-D对D的比值与观察到的约30％的残余活性非常吻合。
iv.大体上，除D105N外，对D105突变蛋白的稳定性研究表明它们在37℃温育期间保持其活性，或无论如何，以与野生型SEQ ID NO：2分子相比相当慢的速率失活。
表B-5：在D62/S63或D105/G106异构化位点处含有置换的SEQ ID NO：2突变蛋白的生物活性。列举了在37℃温育4，8和16周后的平衡解离常数以及活性。保存期间的活性后紧接着测定对固定在传感器芯片上的vWFA1结构域的初始结合速率(5次测量)；活性与计时起点比较，并且表示为百分比(±95％置信区间；n＝10)。
可获得的数据还证明62位处的异构化不负面地影响结合亲和力。此结论从下面的观察结果得出：(i)D105突变蛋白似乎在37℃保存期间保持其活性(见上)，和(ii)S63G突变，使得62位处的异构化比105位处的异构化更重要，其在37℃保存期间失活的速度不比野生型SEQ ID NO：2快。D62A突变体与野生型分子具有相同的亲和性的发现证明此残基不促进结合，并且与此位点处的异构化不影响亲和性的观点相一致。
D105/G106和D62/S63异构化位点的突变分析已显示丙氨酸替换106位处的甘氨酸残基去除所有活性(表B-5)。此观察结果至今未被阐明。想法是此甘氨酸残基的特征是其他氨基酸通常观察不到的phi/psi二面角，该想法没有得到晶体结构数据的支持；G106的phi/psi角(平均-86°/-5°)所处的范围对于环区并非是异常的。然而，不可排除G106残基和CDR3区在与vWF a1结构域结合时采取不同的局部构象。
基于105位处的异构化是基本的主要分子失活机制这一观点，我们使用在37℃下保存期间的活性丧失来推算D105异构化的反应速率。通过准一级拟合获自以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：1进行的稳定性研究的亲和性/效力数据来获得kobs值。使用下列的方程用于拟合：
ln(A-A∞/A0-A∞)＝-kobst    [eq.2]
其中A代表时刻t时的相对活性，A0是初始相对活性，以及A∞是无穷远处(t-＞∞)的相对活性。对于SEQ ID NO：2，A∞设置为30％，因为由D105异构化造成的活性丧失预期在～30％时达到稳定水平。对于SEQ ID NO：1，因为对于完全效力需要双官能性的事实，效力丧失预期在A∞值为～9％(＝30％ x 30％)时达到平衡。当对SEQ ID NO：2测量时表观异构化速率常数为0.007天-1(95％置信区间：0.0074-0.0062)并且当由SEQ ID NO：1测量时为0.012天-1(95％置信区间：0.0177-0.0065)。由SEQ ID NO：2稳定性数据推算的值与由I1峰面积增加推算的值(见上)良好地吻合。此确证了至少在37℃下保存第一个月内活性丧失与D105异构化相关的观点。SEQ ID NO：1的效力丧失比其单价副体SEQ ID NO：2的失活快约2倍。这与两个等价位点(即，每个结构域中的D105)的存在相符，在各个位点处的异构化将使纳米抗体失活。因此从该效力丧失数据推算的表观异构化速率也比对SEQ IDNO：2所观察到的速率高两倍。
结论
提出的结论性证据是，SEQ ID NO：1的主要产物相关物质是下列的结果：
iv.RPC前峰1：单氧化事件(+16Da)，发生在两个相同的结构域中的任一个中存在的三个甲硫氨酸中的一个特异性甲硫氨酸(M78)处，
v.RPC后峰1：生物合成期间在甲硫氨酸位点处正亮氨酸残基的单错误掺入(-18Da)，
vi.RPC后峰2：E1残基的环化，导致焦谷氨酸形成，以及
另外，发现所有三种上面提到的变体的效力与真实产物的效力没有显著的差异。这些结果，结合这些产物相关变体的相对丰度(表B-1)，得出这样的结论，基于活性，SEQ ID NO：1 DS/DP的纯度好于99％。
在较高温度(即≥25℃)下SEQ ID NO：1的延长温育导致RPC谱型的相当大的变化。上面提到的氧化和焦谷氨酸变体在保存期间与温育温度和时间平行地增加。另外，主峰分裂成几个不同的种类，表明正在生成一个或多个新的分子种类。我们已经发现RPC主峰的分裂归因于105位以及较小程度地D62处天冬氨酸的异构化。我们还显示105位处天冬氨酸残基(其位于CDR3区内)的异构化是解释在较高温度下SEQ ID NO：1的效力丧失的主要分子机制。这些发现总结在图21中。
实施例2：RANKL结合纳米抗体 构建体(SEQ ID NO：19)的稳定
1.RANKL结合纳米抗体的生成
氨基酸序列：
RANKL-1(SEQ ID NO：19)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGKGREFVSSITGSGGST
YYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYD
YWGQGTLVTVSS
RANKL-1_D62E(SEQ ID NO：20)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGKGREFVSSITGSGGST
YYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYD
YWGQGTLVTVSS
基于上面公开的氨基酸序列，本领域专业技术人员能够基于例如，多肽序列的回译，生成重叠的寡引物，PCR扩增，克隆进合适的表达载体，在合适的宿主中表达，以及所需多肽例如上面的RANKL-1(例如由诸如GeneArt，DNA-2-goTM，sloning BioTechnology的公司提供)的分离/纯化，来生成该多肽。
RANKL-1的基本序列的分析鉴定D62为异构化的潜在位点，并因此为该分子的化学不稳定性的潜在来源。为了测试此可能性，使用RANKL-1分子和突变体RANKL-1_D62E进行稳定性测定，在所述突变体中潜在的异构化位点被谷氨酸残基(E)替换。RANKL-1中的D62E突变通过重叠PCR使用下述包括突变的引物而引入：
RevRANKL-1_D62E：CCTCCCTTTGACGGATTCCGCGTAATACGT(SEQ ID NO：21)
FwRANKL-1_D62E：ACGTATTACGCGGATTCCGTCAAAGGGAGG(SEQ ID NO：22)
编码RANKL-1或RANKL-1_D62E的两个cDNA作为SfiI/BstEII片段被克隆进pAX054载体中，该载体是pUC119的衍生物。其包含LacZ启动子，该启动子能使用IPTG进行控制的表达诱导。该载体具有卡那霉素抗性基因。多克隆位点带有几个限制性位点，其中SfiI和BstEII常常用于克隆纳米抗体纳米抗体编码序列在框内，该载体编码C-末端c-myc标签和(His)6标签。信号肽为gen3前导序列，其将表达的纳米抗体转位至周质中。
为制备，RANKL-1和RANKL-1_D62E构建体接种在50ml TB/0.1％葡萄糖/卡那霉素中，并且悬浮液在37℃下温育过夜。以获得的o/n预培养物的1/100接种在5 x 400ml培养基中。培养物进一步在37℃，250rpm下温育直至OD600＞5。培养物用1mM IPTG诱导，并且进一步在37℃250rpm下保持温育4小时。培养物以4500rpm离心20分钟，之后弃去上清液。沉淀物在-20℃下保存。为纯化，将沉淀物解冻，并重新悬浮在20mLdPBS中并在4℃下温育1小时。然后，悬浮液以8500rpm离心20分钟以从周质提取物中清除细胞碎片。
经阳离子交换(Source 30S柱，洗涤缓冲液：10mM柠檬酸pH 4.0；洗脱缓冲液10mM柠檬酸/1M NaCl pH 4.0)，紧接着通过尺寸排阻层析(Superdex 75 Hiload 16/60柱；d-PBS中))纯化纳米抗体。测量OD 280nm，并计算浓度。样品保存在-20C。
α筛选
纳米抗体RANKL-1和RANKL-1_D62E的纯化样品在α筛选中分析其抑制人RANKL和人RANK-Fc之间相互作用的能力。在此测定中，1uM-10pM范围内的各种浓度的抗RANKL抗体与3nM生物素化的人RANK在384孔板中温育15分钟。随后，加入RANKL(1nM)和以抗RANKL MAb BN-12(Diaclone)包被的接纳体珠(20ug/ml)的混合物并且温育30分钟。最后，加入抗生蛋白链菌素包被的供体珠(20ug/ml)。温育1小时后，在Envison Alphascreen读数仪(PerkinElmer)上读板。所有实验重复进行2次。抑制曲线和IC50值显示在图22中。RANKL-1_D62E突变体中的D62E突变不干扰结合效力。
稳定性研究
各批次蛋白在D-PBS中稀释为1mg/mL。之后样品通过0.22微米滤器过滤。一部分样品在-80℃保存作为参考样品，其他部分在37℃下保存4周(在温育箱中)用于随后的反相-HPLC分析。
反相-HPLC分析：使用的柱为安捷伦(Agilent)系统上的ZORBAX300SB C3(5μm)。在实验期间该柱的温度为70℃。实验期间使用的缓冲液A为0.1％三氟乙酸，缓冲液B为0.1％三氟乙酸/99.9％乙腈。使用的程序描述如下：
程序
图23显示RANKL-1和RANKL-1D_62E两者均不显示暗示任何异构化(例如，D62和/或D105上的异构化)的峰，而对照纳米抗体vWF-12A2h1SEQ ID NO：2则有。对于两种RANKL纳米抗体均存在反映N-末端环状焦谷氨酸形成的峰，表明2种多肽在1位处是不稳定的(在指定条件下)。
实施例3：为RP-HPLC优化柱温度
材料-IL6R203(SEQ ID NO：23)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDIGWFRQAPGKGREGVSGISSSDGNT
YYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAEPPDSSWYLDGSPEFFK
YWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMS
WVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTA
VYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS
GFTFSDYDIGWFRQAPGKGREGVSGISSSDGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQ
MNSLRPEDTAVYYCAAEPPDSSWYLDGSPEFFKYWGQGTLVTVSS
例如，如上面所公开(通过服务提供商GeneArt)生成IL6R203(SEQ IDNO：23)，并在上述层析条件下在ZORBAX C 3柱上分析，但在4个不同的柱温度(75，70，60和50℃)下分析，以便评估柱温度对RP-HPLC谱型的作用。
HPLC条件：
流动相A：99.9％H2Oq/0.1％TFA
流动相B：0.1％TFA/99.9％乙腈
柱：ZORBAX 300SB-C3(Agilent，部件编号883995-909，系列号USKD001612)
流速：1mL/分钟
梯度：0.33％B/min(5％B(0min)-5％B(3min)-30.5％B(3.5min)-40.5％B(33.5min)-95％B(34min)-95％B(37min)-5％B(37.1min)-5％B(40min))
检测：UV 214nm(也采集280nm)
进样量：5μg
使用的柱温度：50℃-60℃-70℃-75℃
表：B-6
：使用不同的柱温度(75，70和60℃)分析IL6R203的数据的综合概述。没有综合较低柱温度的层析谱。如所见到的，降低柱温度对峰回收率具有负面效应。对主峰和称为前梯度峰的峰显示综合数据。很明显，在较低的柱温度下主峰减小。在60-70℃之间似乎达到临界点。尽管主峰面积减小，但在前梯度峰中洗脱的物质的量显著地增加。这可能表明在较低柱温度下分子的较高程度的粘性。评价：
·柱温度对洗脱峰特性具有极大地作用。获得的数据显示最佳温度在70-75℃之间。被测试的较低温度导致峰面积回收率损失(见表B-6)、解析度的损失并且诱发拖尾。在60℃下所有齐备后，峰形与在70-75℃时的峰形完全不同。
·当与70℃层析谱比较时，75℃层析谱显示几个侧峰的面积/高度增加。这些可能是温度诱导的峰并且不是IL6R203批次中的实际亚群。
IL6R202
例如，如上面所公开(通过服务提供商GeneArt)生成IL6R202(SEQ IDNO：24)，并且也对IL6R202测试相同范围的柱温度。
IL6R202：SEQ ID NO：24
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDIGWFRQAPGKGREGVSGISSSDGNT
YYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAEPPDSSWYLDGSPEFFK
YWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMS
WVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTA
VYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
HPLC条件：
流动相A：0.1％TFA
流动相B：0.1％TFA/99.9％乙腈
柱：ZORBAX 300SB-C3(Agilent，部件编号883995-909，系列号USKD001612)
流速：1mL/分钟
梯度：0.33％B/min(5％B(0min)-5％B(3min)-30.5％B(3.5min)-40.5％B(33.5min)-95％B(34min)-95％B(37min)-5％B(37.1min)-5％B(40min))
检测：UV 214nm
进样量：5μg
使用的柱温度：
50℃-60℃-70℃-75℃
表：B-7
：使用不同的柱温度(75，70和60℃)分析IL6R202的综合数据的概述。没有显示较低柱温度的层析谱。如使用IL6R203可见到的，在60-70℃之间达到临界点。在此界限的较低温度端，似乎发生峰回收率的大量损失。同时前梯度峰的面积大幅度升高。
评价：
·柱温度对IL6R202的洗脱峰谱型具有极大地作用(如对IL6R203那样)。最佳温度在70-75℃之间。
·实践中使用70℃的柱温度将是较好地，这样能尽量减少在该高柱温度下由IL6R202降解所导致的假峰的出现。
实施例4：考虑来自上述突变体研究的发现，稳定12A2h1和ALX-0081
基于我们在SEQ ID NO：1及其单价构件SEQ ID NO：2的化学稳定性方面的见解，我们改造了一个SEQ ID NO：2变体，其掺入了4个单氨基酸置换，即，E1D，D62E，M78T和D105Q(SEQ ID NO：26)。
因此，稳定的单价构件被称为稳定的12A2h1或SEQ ID NO：26，并且实施例1的稳定的vWF化合物在本文中被称为VWF0001或SEQ ID NO：25。
SEQ ID NO：25-ALX-0081 SV1，本文中也称为VWF0001的氨基酸序列
DVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGRTFS YNPMGWFRQA PGKGRELVAA ISRTGGSTYY
PESVEGRFTI SRDNAKRTVY LQMNSLRAED TAVYYCAAAG VRAEQGRVRT LPSEYTFWGQ
GTQVTVSSAA AEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGRTF SYNPMGWFRQ APGKGRELVA
AISRTGGSTY YPESVEGRFT ISRDNAKRTV YLQMNSLRAE DTAVYYCAAA GVRAEQGRVR
TLPSEYTFWG QGTQVTVSS
SEQ ID NO：26-12A2H1 SV1的氨基酸序列
DVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGRTFS YNPMGWFRQA PGKGRELVAA ISRTGGSTYY
PESVEGRFTI SRDNAKRTVY LQMNSLRAED TAVYYCAAAG VRAEQGRVRT LPSEYTFWGQ
GTQVTVSS
通过基因拼装完成12A2h1SV1和ALX-0081SV1基因的构建。一组覆盖目的基因的重叠寡核苷酸通过PCR有序地组装基因。从凝胶中纯化挽救PCR产物并用KpnI和NdeI限制性酶消化。然后片段连接在先前用KpnI/NdeI酶切割的pet28a/TAC/pelB载体中。
然后将连接混合物转化至TOP 10电感受态细胞中。加入SOC培养基并在37℃下温育1小时后，将一等分试样接种至LB/卡那霉素板上并在37℃下温育过夜。第二天使用pet28a启动子和T7终止子引物通过菌落PCR分析单个克隆。随后将关于12A2SV1和ALX-0081SV1的PCR阳性克隆在LB/卡那霉素中生长过夜。从过夜培养物中，通过小量制备(Mini-Prep)(Sigma Aldrich试剂盒)制备质粒DNA用于DNA测序。
12A2h1SV1和ALX0081SV1的表达和纯化
制备过夜起子培养物，并用来在含有卡那霉素和0.1％g/v葡萄糖的Terrific肉汤培养基中开始大规模表达。将含有300mL上述培养基的烧瓶接种以10mL起子培养物，之后在37℃下同时以250rpm振摇下生长。大约4小时后，温度降低至28℃。另外3小时后，通过加入IPTG至1mM终浓度而开始诱导，培养物进一步在28℃下温育过夜。第二天培养物以4500rpm离心30分钟。沉淀物即刻冷冻，并且在解冻后加入PBS/1mMEDTA。重新悬浮细胞后，在室温下振摇悬液2小时。将悬液以8500rpm离心20分钟以从提取物中清除细胞碎片。之后将上清液酸化至pH 3.5并在4℃下保存过夜。第二天早上，将悬液以8000rpm离心，并过滤上清液。过滤后，将溶液用水稀释至电导率低于5mS/cm。之后将溶液加样在用缓冲液A(10mM柠檬酸pH 3.5)预平衡的Source S离子交换柱上。在用缓冲液A洗涤后，结合物质用10柱体积的梯度缓冲液B(10Mm柠檬酸/1 M NaCl pH 3.5)的0-100％梯度洗脱。含有目的蛋白的级分通过SDS-PAGE鉴定并汇集在一起。之后汇集的级分在Superdex75柱上通过凝胶过滤层析加工。之后通过分光光度法在280nm处测定含有纯化的构建体的级分的蛋白浓度，由此使用计算的消光系数和分子量。蛋白的纯度通过HPLC-RPC确认。
稳定变体12A2h1SV1和ALX-0081SV1的结合功能性。
使用平行线法在Biacore 300仪器上测定ALX-0081SV1的结合效力，并且因此使用ALX-0081作为参考物质。以观察双功能性的方式设计该方法。在此测定中，我们如预期的观察到对ALX-0081SV1的亲和结合，以及对12A2h1SV1没有效力。与ALX0081(SEQ ID NO 1)比较的相对效力为约80％。
也使用Biacore仪器测定12A2h1SV1对VWF的A1结构域的亲和性。测定了动力学速率常数(kon和koff)以及平衡解离常数(KD)(见下表)。
  SEQ ID NO：2  SEQ ID NO：26
  kon(1/Ms)   1.93E+07   2.1E+07
  koff(1/s)   0.0207   0.0207
  KD(nM)   1.07   0.986
稳定的变体的化学稳定性
12A2h1 SV1和ALX-0081 SV1两者以在D-PBS中的1mg/mL浓度在37℃下温育。在不同的时间点，通过RP/HPLC分析样品。如图39和40中所示，似乎在8周后仅形成小量的变体。与图16中对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2给出的谱型相比，RP/HPLC谱型不太复杂，并且缺少主要的前峰和后峰，已经显示这些前峰和后峰由氧化、焦谷氨酸形成和天冬氨酸异构化产生。因此，通过用适当专门选择的氨基酸残基替换关键的残基，我们能够产生具有基本上相同的生物活性和大幅度改善的化学稳定性的变体(还参见实施例6的通过Folts模型和RIPA测量的体内活性)。
我们还通过Biacore测定了在37℃下保存的样品的功能性。在这些实验中，参考和稳定性样品均稀释10,000倍，并且随后流过以3500RU vWFA1结构域包被的传感器芯片。由于观察到在参考和稳定的样品之间结合传感图谱中仅有微小的差异，我们得出这样的结论，化学稳定性改善，同时结合功能性几乎不变。
对于根据SEQ ID NO：39(二价)和SEQ ID NO：40(单价构件)的突变体结合剂也分别预期具有如上所述的相似结果。
实施例5：另一纳米抗体构建体，即，IL6R结合纳米抗体 构建体(SEQ ID NO：27)的稳定
DNA序列：
IL6R201(SEQ ID NO：27；野生型：要检查其稳定性和并且有可能被稳定)：
GAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGCGGAGGTCTGGTTCAACCGGGCGGGAGCTTG
CGTCTGAGTTGCGCTGCGAGCGGTTTCACATTTAGCGACTACGACATCGGATGGT
TTCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCGCGAAGGTGTGTCTGGCATTTCAAGTTCTGA
CGGCAACACTTATTACGCAGACAGCGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCGCGTGAT
AACGCAAAGAATACCCTGTACCTTCAAATGAATAGCTTACGCCCAGAAGATACCG
CCGTTTACTATTGTGCCGCGGAACCGCCAGATAGCTCGTGGTATCTGGATGGCTCT
CCTGAATTCTTTAAATATTGGGGTCAGGGTACGCTGGTCACCGTCTCCTCATAATG
A
IL6R201的突变体：
IL6R201_D55E(SEQ ID NO：28)：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTCTGGTTCAACCGGGCGGGAGCTTG
CGTCTGAGTTGCGCTGCGAGCGGTTTCACATTTAGCGACTACGACATCGGATGGT
TTCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCGCGAAGGTGTGTCTGGCATTTCAAGTTCTGA
AGGCAACACTTATTACGCAGACAGCGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCGCGTGAT
AACGCAAAGAATACCCTGTACCTTCAAATGAATAGCTTACGCCCAGAAGATACCG
CCGTTTACTATTGTGCCGCGGAACCGCCAGATAGCTCGTGGTATCTGGATGGCTCT
CCTGAATTCTTTAAATATTGGGGTCAGGGTACGCTGGTCACCGTCTCCTCATAATG
A
IL6R201_D55Q(SEQ ID NO：29)：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTCTGGTTCAACCGGGCGGGAGCTTG
CGTCTGAGTTGCGCTGCGAGCGGTTTCACATTTAGCGACTACGACATCGGATGGT
TTCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCGCGAAGGTGTGTCTGGCATTTCAAGTTCTCA
AGGCAACACTTATTACGCAGACAGCGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCGCGTGAT
AACGCAAAGAATACCCTGTACCTTCAAATGAATAGCTTACGCCCAGAAGATACCG
CCGTTTACTATTGTGCCGCGGAACCGCCAGATAGCTCGTGGTATCTGGATGGCTCT
CCTGAATTCTTTAAATATTGGGGTCAGGGTACGCTGGTCACCGTCTCCTCATAATG
A
IL6R201_D62E(SEQ ID NO：30)：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTCTGGTTCAACCGGGCGGGAGCTTG
CGTCTGAGTTGCGCTGCGAGCGGTTTCACATTTAGCGACTACGACATCGGATGGT
TTCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCGCGAAGGTGTGTCTGGCATTTCAAGTTCTGA
CGGCAACACTTATTACGCAGAAAGCGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCGCGTGAT
AACGCAAAGAATACCCTGTACCTTCAAATGAATAGCTTACGCCCAGAAGATACCG
CCGTTTACTATTGTGCCGCGGAACCGCCAGATAGCTCGTGGTATCTGGATGGCTCT
CCTGAATTCTTTAAATATTGGGGTCAGGGTACGCTGGTCACCGTCTCCTCATAATG
A
IL6R201_D102E(SEQ ID NO：31)：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTCTGGTTCAACCGGGCGGGAGCTTG
CGTCTGAGTTGCGCTGCGAGCGGTTTCACATTTAGCGACTACGACATCGGATGGT
TTCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCGCGAAGGTGTGTCTGGCATTTCAAGTTCTGA
CGGCAACACTTATTACGCAGACAGCGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCGCGTGAT
AACGCAAAGAATACCCTGTACCTTCAAATGAATAGCTTACGCCCAGAAGATACCG
CCGTTTACTATTGTGCCGCGGAACCGCCAGAAAGCTCGTGGTATCTGGATGGCTC
TCCTGAATTCTTTAAATATTGGGGTCAGGGTACGCTGGTCACCGTCTCCTCATAAT
GA
IL6R201_D102Q(SEQ ID NO：32)：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTCTGGTTCAACCGGGCGGGAGCTTG
CGTCTGAGTTGCGCTGCGAGCGGTTTCACATTTAGCGACTACGACATCGGATGGT
TTCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCGCGAAGGTGTGTCTGGCATTTCAAGTTCTGA
CGGCAACACTTATTACGCAGACAGCGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCGCGTGAT
AACGCAAAGAATACCCTGTACCTTCAAATGAATAGCTTACGCCCAGAAGATACCG
CCGTTTACTATTGTGCCGCGGAACCGCCACAAAGCTCGTGGTATCTGGATGGCTC
TCCTGAATTCTTTAAATATTGGGGTCAGGGTACGCTGGTCACCGTCTCCTCATAAT
GA
IL6R201_D108E(SEQ ID NO：33)：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTCTGGTTCAACCGGGCGGGAGCTTG
CGTCTGAGTTGCGCTGCGAGCGGTTTCACATTTAGCGACTACGACATCGGATGGT
TTCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCGCGAAGGTGTGTCTGGCATTTCAAGTTCTGA
CGGCAACACTTATTACGCAGACAGCGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCGCGTGAT
AACGCAAAGAATACCCTGTACCTTCAAATGAATAGCTTACGCCCAGAAGATACCG
CCGTTTACTATTGTGCCGCGGAACCGCCAGATAGCTCGTGGTATCTGGAAGGCTC
TCCTGAATTCTTTAAATATTGGGGTCAGGGTACGCTGGTCACCGTCTCCTCATAAT
GA
IL6R201_D108Q(SEQ ID NO：34)：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTCTGGTTCAACCGGGCGGGAGCTTG
CGTCTGAGTTGCGCTGCGAGCGGTTTCACATTTAGCGACTACGACATCGGATGGT
TTCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCGCGAAGGTGTGTCTGGCATTTCAAGTTCTGA
CGGCAACACTTATTACGCAGACAGCGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCGCGTGAT
AACGCAA AGAATACCCTGTACCTTCAAATGAATAGCTTACGCCCAGAAGATACCG
CCGTTTACTATTGTGCCGCGGAACCGCCAGATAGCTCGTGGTATCTGCAAGGCTC
TCCTGAATTCTTTAAATATTGGGGTCAGGGTACGCTGGTCACCGTCTCCTCATAAT
GA
纳米抗体被克隆在pet28a载体中，该载体使用Tac启动子和PelB前导序列。
表达和纯化
在50ml LB/卡那霉素中开始IL6R201构建体D55E(克隆2)，D55Q(克隆4)，D102E(克隆3)，D102Q(克隆1)D108E(克隆2)和D108Q(克隆2)(pet28a/TAC/pelB载体)的预培养并在37℃下温育过夜。在3x±330mLTB I+II/卡那霉素中开始表达。每个烧瓶中接种以10mL起子培养物，之后在37℃同时以250rpm振摇下生长约4小时，之后温度降低至28℃。之后用1mM IPTG(330uL 1M母液)诱导培养物6小时，并进一步在28℃下以250rpm保持温育过夜。培养物以4500rpm离心30分钟，之后弃去上清液。沉淀物在-20℃下保存2-3小时，之后沉淀物重新悬浮在30mLPBS/1mM EDTA中，并在室温下振摇2小时。将悬液以8500rpm离心20分钟以从提取物中清除细胞碎片。
用于纯化的柱为MabCaptureA(Poros)。在此试验中的缓冲液A为D-PBS/0，5M NaCl，缓冲液B为100Mm甘氨酸pH 2，5。±30mL周质提取物以10mL/分钟的流速泵至柱上。之后该柱用缓冲液A以多个柱体积洗涤。为了洗脱结合的蛋白，我们转换为缓冲液B。
下一步，使用尺寸排阻层析。使用Superdex 75HR 26/60来进行尺寸排阻。在D-PBS中完成凝胶过滤。
测量OD 280nm，并且计算浓度。样品保存在-20C。
稳定性研究
初始的蛋白批料在D-PBS中稀释至500或1mg/mL(总体积为5mL)。之后，样品通过0.22微米滤器过滤，并且500微升在-80℃下保存作为参考样品，约4500微升在37℃下(在温育箱中)保存。
Biacore3000中的分析
通过使用初始结合速率(IBR)和斜率研究在37℃下保存4周的IL-6R201，IL-6R201 D55E，IL-6R201 D55Q，IL-6R201 D102E，IL-6R201D102Q，IL-6R201 D108E和IL-6R201 D108Q的结合特性。
显示在高密度hIL-6R芯片上，对于IL-6R201和它的突变体在0-50ng/mL的范围内校准曲线是完全线性的。因此0-50ng/ml的浓度范围将包括在本实验中(以控制线性)，并且通过将各个样品以40ng/ml的浓度加样5次来确定功能性。
首先，通过将IL-6R201加样5次对高密度hIL-6R芯片进行预处理。下一步，将0-50ng/mL浓度范围的IL-6R201加样，紧接着将所有样品加样5次。
使用BIA评价软件完成评价。在BIA评价软件中使用“通用拟合”法和线性拟合模型来确定斜率。用来测定初始结合速率(IBR)的数据是在5和25s之间选择的斜率。
反相-HPLC(RP-HPLC或RPC)
使用的柱为安捷伦(Agilent)系统上的ZORBAX 300SB C3(5μm)。在实验期间该柱的温度为70℃。使用的缓冲液A为0.1％三氟乙酸，缓冲液B为0.1％三氟乙酸/99.9％乙腈。使用的程序描述如下：
程序
评价：已经进行诱变以去除潜在的异构化位点(CDR2中的2个位点和CDR3中的2个位点)。对不同的突变体进行稳定性研究(在37℃下保存4周)。RPC中的分析将D108E和D108Q鉴定为保留活性并减少异构化的关键突变(比较图27-图33：仅将D108替换为D108E或D108Q导致防止异构化)。
实施例6：ALX-0081(SEQ ID NO：1)和VWF0001(SEQ ID NO：25)的体内 功效
Folts’模型
狒狒中的改良Folts’模型用来测定在预防急性血栓形成中的功效。Folts’模型详细地描述在WO2004/062551中的实施例18中。在野外捕捉9只健康雄性狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus))，动物重9.6-17kg，并用于本研究中。狒狒只用干的标准食物喂养。
所有操作根据‘在南非用于药物和相关物质的研究、教育、诊断和测试动物的国家法规(National Code for Animal Use in Research，Education，Diagnosis and Testing of Drug and Related Substanced in South Africa)’经‘自由州大学和自由州省政府的动物实验道德委员会(Ethics committee forAnimal Experimentation of the University of the Free State and Free StateProvincial Administration)’批准。
简言之，在全麻下将分流器(shunt)安放在股动脉和股静脉之间。分流器用于药物施用和血液采样以及用于使用血管周围超声波流量探测器(Transonic systems TS410，rpobe：ME3PXL 10O8)监测血流，该流量探测器置于分流器周围。然后通过使用镊子损伤股动脉并将夹钳置于损伤部位上，用于产生股动脉的外部狭窄。结果获得高剪切率，并且血流减少至初始流速的20％。形成富含血小板的血栓，随后机械性地将其去除，导致周期性流量减少(cyclic flow reductions，CFRs)。一次CFR是动脉的狭窄和完全闭塞(0流动)之间的时间。在可重复的CFRs的30-分钟控制期之后，冲洗分流器并施用赋形剂(盐水)作为内部对照。追踪CFRs 30多分钟。随后，增加剂量的纳米抗体经静脉内注射入分流器中并且研究对CFRs的作用。当抑制CFRs后施加新的损伤，以证实所述抑制是处理的作用而不是自然愈合现象。在施用最高剂量的纳米抗体后完全抑制CFRs后，注射肾上腺素以进一步测试纳米抗体的效力。肾上腺素再次激活血小板，并且可区分区分CFRs的弱抑制和强抑制。实际上，以前已经证明，当在同一模型中使用阿司匹林时，存在肾上腺素时CFRs重新出现。
每次用药后10分钟，取血样(6.5ml)用于实验室分析。如其他地方所述，例如，WO2004/062551的实施例18，分析RIPA，FVIII:C以及纳米抗体的血浆浓度和VWF:Ag。
进行两种不同的出血分析：皮肤出血时间(使用Surgicut装置；在纳米抗体的每次剂量后测量10分钟)和第二个手术出血实验，在该试验中，将纱布塞到腹股沟的切口中，通过对纱布称重来测量总失血。恰好在纳米抗体的各次新剂量前每30分钟更换纱布。每次剂量的失血量通过称重纱布而确定。失血相对于在对照纱布(盐水注射期间)中的失血量来表示。
RIPA
RIPA是ALX-0081的生物标志，并且测量通过抗生素利托菌素非生理性激活A1结构域后在富含血小板的血浆(PRP)的样品中分散的血小板形成聚集体的速率和程度(还参见，例如WO2004/062551的实施例18)。RIPA以两个步骤发生。在第一步骤中，在利托菌素的存在下血小板与VWF凝集，在第二步骤中，由于从血小板中内源性ADP的释放引起血小板聚集。血小板的凝集导致PRP变得不太混浊。在血小板凝集计中测量浊度的改变。
在南非布隆方舟的自由州大学(University of the Free State，Bloemfontein，South Africa)分析RIPA。在Chronolog全血和光学凝集计(Model 560CA，Chronolog，USA)上进行血小板聚集。通过将全血在1200rpm离心5分钟而制备PRP (收集在0.32mol/L柠檬酸盐上)。小心去除含有PRP的上层级分。将下层级分在3000rpm进一步离心10分钟，以制备贫血小板血浆(platelet poor plasma，PPP)。计数PRP中的血小板，并且在自体PPP中稀释至200.000个血小板/μl的最终浓度。加入3mg/ml利托菌素(DAKO)诱导聚集，并且用凝集计测量。
ALX-0081和VWF0001的功效
首先2只狒狒分别注射增加剂量的ALX-0081和VWF0001(ALX-0081_Sv或ALX-0081的稳定变体)。
在这些Folts’实验期间的血流测量值显示在图35中。
在测试化合物的每次剂量后的CFRs的平均长度总结在表B-8中。该表还指示总剂量，该总剂量是在该时间点的所有给药的累积剂量。获得CFRs的完全抑制时的剂量标记以(＞1800)。
表B-8：用ALX-0081和VWF0001处理的动物的CFRs长度(秒)。＞1800＝完全抑制达30分钟，没有血流的减少
对于ALX-0081在30μg/kg(43μg/kg的累积剂量)，且对于VWF0001在10μg/kg(13μg/kg的累积剂量)的剂量下获得CFRs的完全抑制。
在新损伤时仍保持抑制，但在输注肾上腺素后意外地丧失了。后者可以下面的事实来解释，即，由于实验持续时间太长，在注射肾上腺素时ALX-0081的血浆水平可能太低(过去我们经推注+持续输注施用ALX-0081，而现在仅推注施用)。
在盐水注射后和在ALX-0081或VWF0001的每次剂量后10分钟取的血样中测量RIPA。对于2只狒狒，来自RIPA检测的结果与CFRs长度进行比较(图36)。
在RIPA和CFRs长度之间观察到反比关系。对于2只狒狒，RIPA结果非常好地与Folts’模型中的功效结果相比较。因此，RIPA可以被认为是对vWF结合剂诸如例如ALX-0081/VWF0001的功效生物标志。
实施例7：强制氧化试验
实施例7.1使用IL6R201的强制氧化试验
我们以前证明SEQ ID NO：2(vWF-12A2h1)中78位处存在的甲硫氨酸对氧化作用敏感。在此实施例中，我们描述了我们已经在VHH片段IL6R201(SEQ ID NO：35)中引入了突变。在此突变体中，78位处的苏氨酸(苏氨酸，是在VH或VHH片段中的FR3中的此位点处经常存在的残基)改变为甲硫氨酸，并且命名为IL6R201 T78M(SEQ ID NO：36)。在纯化突变体蛋白后，使用IL6R201和IL6R201 T78M两者进行采用H2O2的强制氧化试验。通过随后在RP/HPLC上的分析，我们可以证明突变的VHH变得对氧化作用敏感(图37-上迹线)，而未突变的则对用H2O2的处理有抵抗力(图37-下迹线)。
IL6R201的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYDIGWFRQA PGKGREGVSG
ISSSDGNTYY ADSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRPED TAVYYCAAEP
PDSSWYLDGS PEFFKYWGQG TLVTVSS
IL6R201-T78M的氨基酸序列(SEQ ID NO：36)：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYDIGWFRQA PGKGREGVSG
ISSSDGNTYY ADSVKGRFTI SRDNAKNMLY LQMNSLRPED TAVYYCAAEP
PDSSWYLDGS PEFFKYWGQG TLVTVSS
实施例7.2采用H 2 O 2 的119A3的强制氧化试验
119A3的氨基酸序列(SEQ ID NO：37)
EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGRIFS LPASGNIFNL LTIAWHRQAP
GMQRELVATI NSGSRTNYAD SVKGRFTISR DNAQKTVYLQ MNNLKPEDTA
VYYCQTSGSG SPNFWGQGTQ VTVSS
119A3(SEQ ID NO：37)包含两个甲硫氨酸残基，分别是构架2中的52位处的一个甲硫氨酸和FR3中91位处的第二个甲硫氨酸。基于以前采用vWF-12A2h1(SEQ ID NO：2)的发现，我们假设在纳米抗体119A3中，仅M52是溶剂可及的，因此易于被H2O2氧化。基于我们使用vWF-12A2h1的发现，我们假设在天然条件下，仅M52对强制氧化敏感，而在未折叠条件下，两个残基应该均易于氧化。纯化后，在D-PBS中1mg/mL的119A3溶液与10mM H2O2温育2小时。在脱盐柱上去除过量的H2O2后，通过RP-HPLC分析混合物。如图38中所示，似乎被处理的物质(图38中的下迹线)发生变化，因为存在一个峰(峰移)，与未处理物质(上迹线)相比该峰较早地从柱中被洗脱下来。我们还观察到在未处理的样品中总是存在一个与氧化物质对应的小峰。
还在6M胍的存在下用H2O2处理该物质。该物质在RP-HPLC上的分析也揭示了比未处理样品早洗脱的峰(图38中的中迹线)。使用天然和未折叠样品形成的氧化变体的保留时间的差异提供了下列的证据，在天然条件下仅M52被氧化，而以未折叠状态两个残基都对氧化敏感。
优选的方面：
1.多肽，其是在1位处具有D的单可变结构域，或是在1位处具有D的人源化单可变结构域。
2.根据方面1的多肽，其中所述单可变结构域是纳米抗体或dAb，或是在1位处具有D的人源化抗体或dAb。
3.根据方面1或方面2的多肽，其中所述氨基酸序列在1位处具有D且在CDRs内没有M或在使用kabat编号的77位处没有M。
4.根据方面1-3的多肽，其中所述氨基酸序列在任意一个CDR中没有N。
5.根据方面1-4的多肽，其中所述氨基酸序列在CDR3中没有N。
6.根据方面1-3的多肽，其中所述氨基酸序列在任意一个CDR中没有D。
7.根据方面1-4的多肽，其中所述氨基酸序列在CDR3中没有D。
8.根据方面1-3的多肽，其中所述氨基酸序列在任意一个CDR中没有NG或NS基序。
9.根据方面1-4的多肽，其中所述氨基酸序列在CDR3中没有NG或NS基序。
10.根据方面1-3的多肽，其中所述氨基酸序列在任意一个CDR中没有DG或DS基序。
11.根据方面1-4的多肽，其中所述氨基酸序列在CDR3中没有DG或DS基序。
12.多肽，其是在任意一个CDR中没有DG或DS基序的单可变结构域。
13.多肽，其是在CDR3中没有DG或DS基序的单可变结构域。
14.一种在合适的生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法包括替换易于异构化的至少一个N或D的步骤。
15.一种在合适的生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法包括替换易于氧化的至少一个M的步骤。
16.一种在合适的生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法包括替换E1或Q1的步骤。
17.一种在合适的生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)如果存在E1或Q1，则用另一个天然存在的氨基酸替换E1或Q1；或
b)如果存在至少一个易于氧化的M，则用另一个天然存在的氨基酸替换所述至少一个易于氧化的M；或
c)如果存在至少一个易于异构化的N或D，则用另一个天然存在的氨基酸替换所述至少一个易于异构化的N或D；或
d)组合步骤a)和b)；或
e)组合步骤b)和c)；或
f)组合步骤a)和c)。
18.通过方面17的方法产生的突变体的文库。
19.在根据方面14-18的方法产生突变体中使用的核苷酸。
20.包含方面19的核苷酸的宿主细胞。
21.包含方面20的宿主细胞的筛选方法。
22.来自方面18的文库的选择的突变体组，其中所述突变体具有小于1000nM，优选地小于100nM，更优选地小于10nM，更优选地小于1nM的解离常数Kd。
23.来自方面18的文库的选择的突变体组，其中所述突变体具有不高于要被稳定的原始多肽的约100％，优选90％，更优选80％，更优选50％，更优选30％，更优选20％，更优选10％，更优选5％的解离常数Kd。
24.一种在合适的生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码N的核苷酸序列；和
b)如果存在编码所述二肽序列的所述核苷酸序列，则突变所述编码N的核苷酸序列；以及
c)用以此方式修饰的基因转化合适的生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
25.一种在合适的生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码D的核苷酸序列；和
b)如果存在编码所述二肽序列的所述核苷酸序列，则突变所述编码D的核苷酸序列；以及
c)用以此方式修饰的基因转化合适的生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
26.一种在合适的生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码NG或NS的核苷酸序列；和
b)如果存在编码所述二肽序列的所述核苷酸序列，则突变所述编码N的核苷酸序列；以及
c)用以此方式修饰的基因转化合适的生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
27.一种在合适的生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码DG或DS的核苷酸序列；和
b)如果存在编码所述二肽序列的所述核苷酸序列，则突变所述编码D的核苷酸序列；以及
c)用以此方式修饰的基因转化合适的生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
28.一种在合适的生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码NG，NS，DG或DS的核苷酸序列；和
b)如果存在编码所述二肽序列的所述核苷酸序列，则突变所述编码N或D的核苷酸序列；以及
c)用以此方式修饰的基因转化合适的生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
29.一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码NG，NS，DG或DS的核苷酸序列；和
b)如果存在编码所述二肽序列的至少一个核苷酸序列，则生成包含多肽衍生物(或基本上由其组成)的突变体文库，其中在要被稳定的多肽中发现NG或DG的情况下，a)中的一个或多个所述已鉴定的核苷酸序列用编码EG，QG，ES，QS，NA，NT，DA或DT，优选编码EG或QG的核苷酸序列替换，或在要被稳定的多肽中发现NS或DS的情况下用编码ES或QS的核苷酸序列替换；以及
c)用以此方式修饰的基因转化所述原核或真核生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
30.一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码NG，NS，DG或DS基序的核苷酸序列，其中所述氨基酸或基序是表面暴露的，并且其中氢键供给残基紧密接近不稳定的N或D；和
b)如果a)中的核苷酸序列被鉴定，则生成包含多肽衍生物(或基本上由其组成)的突变体文库，其中在要被稳定的多肽中发现NG或DG的情况下，a)中的一个或多个所述已鉴定的核苷酸序列用编码EG，QG，ES，QS，NA，NT，DA或DT，优选编码EG或QG的核苷酸序列替换，或在要被稳定的多肽中发现NS或DS的情况下用编码ES或QS的核苷酸序列替换；以及
c)用以此方式修饰的基因转化所述原核或真核生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
31.一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码NG，NS，DG或DS基序的核苷酸序列，其中所述氨基酸或基序是表面暴露的，并且其中氢键供给残基紧密接近不稳定的N或D；和
b)如果a)中的核苷酸序列被鉴定，则生成包含多肽衍生物(或基本上由其组成)的突变体文库，其中在要被稳定的多肽中发现NG或DG的情况下，a)中的一个或多个所述已鉴定的核苷酸序列用编码EG，QG，ES，QS，NA，NT，DA或DT，优选编码EG或QG的核苷酸序列替换，或在要被稳定的多肽中发现NS或DS的情况下用编码ES或QS的核苷酸序列替换；以及
c)用以此方式修饰的基因转化所述原核或真核生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
32.一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码NG， NS，DG或DS的核苷酸序列；和
b)检查已鉴定的序列是否发生异构化，和已鉴定的序列的异构化任选地是否是失去所述多肽的至少一种活性、优选所有活性的原因；和
c)不管是否观察到异构化，则生成包含多肽衍生物(或基本上由其组成)的突变体文库，其中在要被稳定的多肽中发现NG或DG的情况下，a)中的一个或多个所述已鉴定的核苷酸序列用编码EG，QG，ES，QS，NA，NT，DA或DT，优选编码EG或QG的核苷酸序列替换，或在要被稳定的多肽中发现NS或DS的情况下用编码ES或QS的核苷酸序列替换；以及
d)用以此方式修饰的基因转化所述原核或真核生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
33.一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽/衍生物或片段的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码NG或DG的核苷酸序列；和
b)检查已鉴定的序列是否发生异构化(例如，通过在较高温度下延长保存期并且随后观察RPC谱型中的前峰----见实验部分)和已鉴定的序列的异构化任选地是否是失去所述多肽的至少一种活性、优选所有活性的原因；和
c)不管是否观察到异构化，则生成包含多肽衍生物(或基本上由其组成)的突变体文库，其中在要被稳定的多肽中发现NG或DG的情况下，a)中的一个或多个所述已鉴定的核苷酸序列用编码EG，QG，NA，NT，DA或DT，优选编码EG或QG的核苷酸序列替换；以及
d)用以此方式修饰的基因转化所述原核或真核生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
34.一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码NS或DS的核苷酸序列；和
b)检查已鉴定的序列是否发生异构化(例如，通过在较高温度下延长保存期并且随后观察RPC谱型中的前峰----见实验部分)和已鉴定的序列的异构化任选地是否是失去所述多肽的至少一种活性、优选所有活性的原因；和
c)不管是否观察到异构化，则生成包含多肽衍生物(或基本上由其组成)的突变体文库，其中在要被稳定的多肽中发现NS或DS的情况下，a)中的一个或多个所述已鉴定的核苷酸序列用编码ES，QS，NA，NT，DA或DT，优选编码ES或QS的核苷酸序列替换；以及
d)用以此方式修饰的基因转化所述原核或真核生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
35.一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生具有改善的稳定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述表达载体包含编码所述多肽、衍生物或片段的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码NG，DG，NS或DS的核苷酸序列；和
b)生成包含多肽衍生物(或基本上由其组成)的突变体文库，其中在要被稳定的多肽中发现NS或DS的情况下，a)中的一个或多个所述已鉴定的核苷酸序列用编码EG，QG，ES，QS，NA，NT，DA或DT，优选编码ES或QS的核苷酸序列替换，或在要被稳定的多肽中发现NG或DG的情况下优选用编码EG或QG的核苷酸序列替换；以及
c)用以此方式修饰的基因转化所述原核或真核生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
36.一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生功能性多肽、其功能性衍生物或片段，例如包含纳米抗体或dAbs、优选纳米抗体的多肽的方法，所述表达载体包含编码多肽、衍生物或片段的所述文库的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码NG，DG，NS或DS的核苷酸序列；和
b)生成包含多肽衍生物(或基本上由其组成)的突变体文库，其中在要被稳定的多肽中发现NS或DS的情况下，a)中的一个或多个所述已鉴定的核苷酸序列用编码EG，QG，ES，QS，NA，NT，DA或DT，优选编码ES或QS的核苷酸序列替换，或在要被稳定的多肽中发现NG或DG的情况下用编码EG或QG的核苷酸序列替换；以及
c)检查任意一个M是否对强制氧化敏感，并且如果是，则通过用例如，V，L，A，K，G，I，T，优选L或A，更优选A替换M而生成文库中的更多成员；和
d)用以此方式修饰的基因转化真核生物体，并且表达具有所需活性的本发明的多肽、片段或衍生物。
37.一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生功能性多肽、其功能性衍生物或片段，例如包含纳米抗体或dAbs、优选纳米抗体的多肽的方法，所述表达载体包含编码多肽、衍生物或片段的所述文库的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码NG，DG，NS或DS的核苷酸序列；和
b)生成包含多肽衍生物(或基本上由其组成)的突变体文库，其中在要被稳定的多肽中发现NS或DS的情况下，a)中的一个或多个所述已鉴定的核苷酸序列用编码EG，QG，ES，QS，NA，NT，DA或DT，优选编码ES或QS的核苷酸序列替换，或在要被稳定的多肽中发现NG或DG的情况下优选用编码EG或QG的核苷酸序列替换；以及
c)检查在78位(以纳米抗体内的连续编号系统-见图4例如SEG IDNO：2中的编号)处是否存在M，并且如果M78存在，则通过用例如，V，L，A，K，G，I，优选L或A，更优选A替换M而生成文库中的更多成员；和
d)用以此方式修饰的基因转化真核生物体，并且表达具有所需活性的本发明的多肽、片段或衍生物。
38.一种在合适的例如真核或原核生物体中通过用表达载体转化而产生功能性多肽、其功能性衍生物或片段，例如包含纳米抗体或dAbs、优选纳米抗体的多肽的方法，所述表达载体包含编码多肽、衍生物或片段的所述文库的重组基因，所述方法包括以下的步骤：
a)在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中检查编码多肽的至少一个可变结构域的基因中的编码NG，DG，NS或DS的核苷酸序列；和
b)生成包含多肽衍生物(或基本上由其组成)的突变体文库，其中在要被稳定的多肽中发现NS或DS的情况下，a)中的一个或多个所述已鉴定的核苷酸序列用编码EG，QG，ES，QS，NA，NT，DA或DT，优选编码ES或QS的核苷酸序列替换，或在要被稳定的多肽中发现NG或DG的情况下优选用编码EG或QG的核苷酸序列替换；以及
c)检查任意一个M是否对强制氧化敏感，并且如果是，则通过用例如，V，L，A，K，G，I，优选L或A，更优选A替换；和
d)如果存在N-末端E，用例如D替换N-末端E；以及
e)用以此方式修饰的基因转化真核生物体，并且表达具有所需活性的多肽、片段或衍生物。
39.将包含纳米抗体或dAbs、优选纳米抗体，优选地在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中包含至少一个DS，DG，NG或NS氨基酸基序的多肽修饰为其他的多肽的方法，其中所述DS，DG，NG或NS氨基酸基序的至少一个被选自由DQ，DE，DT，DA，NT和NA组成的组中的氨基酸基序替换。
40.将包含纳米抗体或dAbs、优选纳米抗体的多肽修饰为另一蛋白的方法，其中a)所述多肽优选地在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中包含至少一个DS，DG，NG或NS氨基酸基序和b)所述DS，DG，NG或NS氨基酸基序已知在蛋白的活性位点内，其中所述DS，DG，NG或NS氨基酸基序的至少一个被选自由DQ，DE，DT，DA，NT和NA组成的组中的氨基酸基序替换。
41.由方面24-40的方法产生的包含纳米抗体或dAbs、优选纳米抗体的突变多肽的文库。
42.根据方面41的包含纳米抗体或dAbs、优选纳米抗体的突变多肽的文库，其中完成了在已鉴定的DS，DG，NG或NS氨基酸基序中的所有可能替换。
43.根据方面41的包含纳米抗体或dAbs、优选纳米抗体的突变多肽的文库，其中完成了在已鉴定的DS，DG，NG或NS氨基酸基序中的仅某些替换，例如，仅DQ或DE，优选DE。
44.稳定包含纳米抗体或dAbs、优选纳米抗体的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)检查所述多肽的一级序列，和b)如果优选地在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中鉴定到DS，DG，NG或NS氨基酸基序，则生成突变体的文库，其中每个突变体中至少一个已鉴定的氨基酸基序被选自由DQ，DE，DT，DA，NT和NA组成的组中的氨基酸基序替换，以及c)筛选单个突变体的改善的稳定性。
45.稳定包含纳米抗体或dAbs、优选纳米抗体的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)检查所述多肽的一级序列，和b)如果优选地在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中鉴定到DS，DG，NG或NS氨基酸基序，则生成突变体的文库，其中每个突变体中至少一个已鉴定的氨基酸基序被选自由DQ，DE，DT，DA，NT和NA组成的组中的氨基酸基序替换，以及c)筛选单个突变体的改善的稳定性，其中当在指定条件下的时间段与野生型蛋白相比延长时，所有这些突变体被认为具有改善的稳定性，在所述条件下在有效的分离测定中可观察到除蛋白主峰以外的另外的大峰(有效＝能够分开野生型蛋白和其中至少一个D或N被异构化的蛋白)。
46.稳定包含纳米抗体或dAbs、优选纳米抗体的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)检查所述多肽的一级序列，和b)如果优选地在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中鉴定到DS，DG，NG或NS氨基酸基序，则生成突变体的文库，其中每个突变体中至少一个已鉴定的氨基酸基序被选自由DQ，DE，DT，DA，NT和NA组成的组中的氨基酸基序替换，以及c)筛选单个突变体的改善的稳定性，其中当在例如，25℃以上或37℃的较高温度下保存的所述突变体的时间段与野生型蛋白相比延长时，所有这些突变体被认为具有改善的稳定性，所述突变体在有效的分离测定中观察到除蛋白主峰以外的另外的大峰(＝代表例如大于蛋白主峰的10或5％的峰)。
47.根据方面44-46任一方面的稳定包含纳米抗体或dAbs、优选纳米抗体的多肽的方法，其中所述已鉴定的氨基酸基序被选自由DQ或DE组成的组中的氨基酸基序，优选DE替换。
48.稳定包含纳米抗体或dAbs、优选纳米抗体的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)检查所述多肽的一级序列，和b)如果优选地在CDR环中，优选地在CDR2和/或CDR3环，更优选地在CDR3环中鉴定到DS，DG，NG或NS氨基酸基序，则生成突变体的文库，其中每个突变体中至少一个已鉴定的氨基酸基序被选自由DQ，DE，DT，DA，NT和NA组成的组中的氨基酸基序替换，以及c)检查任意一个M是否对氧化作用，例如强制氧化敏感，并且如果是，则通过用例如，T，V，L，A，K，G，I，优选T，L或A，更优选A替换；和任选地
d)如果存在N-末端E，用例如D替换N-末端E；以及
e)筛选单个突变体的改善的稳定性。
49.将包含至少一个DS，DG，NG或NS氨基酸基序的蛋白修饰为另一蛋白的方法，其中所述DS，DG，NG或NS氨基酸基序的至少一个被选自由DQ或DE组成的组中的氨基酸基序替换。
50.将蛋白，其中a)所述蛋白包含至少一个DS，DG，NG或NS氨基酸基序和b)所述DS，DG，NG或NS氨基酸基序已知在所述蛋白的活性位点内，修饰为另一蛋白的方法，其中所述DS，DG，NG或NS氨基酸基序的至少一个被选自由DQ，DE，DT，DA，NT和NA组成的组中的氨基酸基序替换。
51.由方面49或方面50的方法产生的突变蛋白的文库。
52.根据方面51的突变蛋白的文库，其中完成了在已鉴定的DS，DG，NG或NS氨基酸基序中的所有可能的替换。
53.根据方面51的突变蛋白的文库，其中完成了在已鉴定的DS，DG，NG或NS氨基酸基序中的仅某些替换，例如，仅DQ或DE，优选DE。
54.稳定蛋白的方法，其包括以下步骤：a)检查所述蛋白的一级序列，和b)如果鉴定到DS，DG，NG或NS氨基酸基序，则生成突变体的文库，其中每个突变体中至少一个已鉴定的氨基酸基序被选自由DQ，DE，DT，DA，NT和NA组成的组中的氨基酸基序替换，以及c)筛选单个突变体的改善的稳定性。
55.稳定蛋白的方法，其包括以下步骤：a)检查所述蛋白的一级序列，和b)如果鉴定到DS，DG，NG或NS氨基酸基序，则生成突变体的文库，其中每个突变体中至少一个已鉴定的氨基酸基序被选自由DQ，DE，DT，DA，NT和NA组成的组中的氨基酸基序替换，以及c)筛选单个突变体的改善的稳定性，其中当在指定条件下的时间段与野生型蛋白相比延长时，所有这些突变体被认为具有改善的稳定性，在所述条件下在有效的分离测定中可观察到除蛋白主峰以外的另外的大峰(有效＝能够分开野生型蛋白和其中至少一个D或N被异构化的蛋白)。
56.稳定蛋白的方法，其包括以下步骤：a)在稳定性试验中检查与参考化合物，例如具有相对稳定的RPC的SEQ ID NO：21多肽相比，序列是否具有改变的RPC谱型，和b)如果观察到改变，开始生成突变体的文库，其中已鉴定的可能不稳定的氨基酸来源被其他氨基酸替换。
57.稳定蛋白的方法，其包括以下步骤：a)检查所述蛋白的一级序列，和b)如果鉴定到DS，DG，NG或NS氨基酸基序，则生成突变体的文库，其中每个突变体中至少一个已鉴定的氨基酸基序被选自由XS或XG组成的组中的氨基酸基序替换，其中X是除D或N以外的任何其他氨基酸，优选X是Q或E，以及c)筛选单个突变体的改善的稳定性，其中如果与要被稳定的原始蛋白相比，检测到所述突变体的第一降解产物的时间段延长，则所有这些突变体被认为具有改善的稳定性。
58.稳定蛋白的方法，其包括以下步骤：a)检查所述蛋白的一级序列，和b)如果鉴定到DS，DG，NG或NS氨基酸基序，则生成突变体的文库，其中每个突变体中至少一个已鉴定的氨基酸基序被选自由NX或DX组成的组中的氨基酸基序替换，其中X是除G或S以外的任何其他氨基酸，优选X是A或T，以及c)筛选单个突变体的改善的稳定性，其中如果与要被稳定的原始蛋白相比，检测到所述突变体的第一降解产物的时间段延长，则所有这些突变体被认为具有改善的稳定性。
59.将在任一CDR区内包含至少一个DS，DG，NG或NS氨基酸基序的单可变结构域修饰为另一单可变结构域的方法，其中所述DS，DG，NG或NS氨基酸基序的至少一个被选自由XS或XG组成的组中的氨基酸基序替换，其中X是除D或N以外的任何其他氨基酸，优选X是Q或E。
60.修饰包含至少一个DS，DG，NG或NS氨基酸基序的单可变结构域的方法，所述氨基酸基序在较高的温度下在延长的时间段内异构化，例如，在高于25℃，例如37℃的较高温度下，在例如多于1，2，3或4周的时段内异构化，并且其中所述单可变结构域要被修饰为另一单可变结构域，其中至少一个异构化的DS，DG，NG或NS氨基酸基序被选自由XS或XG组成的组中的氨基酸基序替换，其中X是除D或N以外的任何其他氨基酸，优选X是Q或E。
61.如上所述的修饰包含至少一个DS，DG，NG或NS氨基酸基序的蛋白，多肽或单可变结构域的方法，其包括以下步骤：当所述单可变结构域在较高的温度下在延长的时间段内保存时，例如，在37℃下在4周的时段内保存时，检查所述突变的单可变结构域的RPC谱型是否改变。
62.根据方面54-61的方法，其中所述修饰的蛋白、多肽或单可变结构域与特定靶分子的解离常数等于或低于100nM，优选10nM，更优选1nM，更优选0.1nM。
63.根据方面54-61的方法，其中所述修饰的蛋白、多肽或单可变结构域与特定靶分子的解离常数仍然与未修饰的亲代或野生型单可变结构域基本上相同。
64.根据方面54-61的方法，其中所述修饰的蛋白、多肽或单可变结构域与特定靶分子的解离常数不超过10nM。
65.根据方面54-61的方法，其中所述修饰的蛋白、多肽或单可变结构域与特定靶分子的解离常数不超过1nM。
66.根据方面54-61的方法，其中所述修饰的蛋白、多肽或单可变结构域与特定靶分子的解离常数不超过0.1nM。
67.根据方面54-61的方法，其中所述蛋白、多肽或单可变结构域包括单纳米抗体、结构域抗体、单结构域抗体或“dAb”，优选纳米抗体，或基本上由其组成。
68.根据方面54-61的方法，其中所述蛋白、多肽或单可变结构域包括至少两个纳米抗体、结构域抗体、单结构域抗体或“dAb”，优选纳米抗体，或基本上由其组成。
69.根据方面54-61的方法，其中所述蛋白、多肽或单可变结构域包括至少一个针对一种表位、抗原、靶标、蛋白或多肽的纳米抗体、结构域抗体、单结构域抗体或“dAb”以及至少一个针对另一种表位、抗原、靶标、蛋白或多肽的其他的纳米抗体、结构域抗体、单结构域抗体或“dAb”，或基本上由其组成。
70.制备蛋白、多肽或单可变结构域(例如，纳米抗体)的文库的方法，所述文库缺少包含对异构化敏感的DS，DG，NG或NS基序的蛋白、多肽或单可变结构域。
71.改变蛋白、多肽或单可变结构域(例如，纳米抗体)的文库的方法，使得所述文库缺少包含对异构化敏感的DS，DG，NG或NS基序的蛋白、多肽或单可变结构域。
72.修饰包含对异构化敏感的DS，DG，NG或NS基序的蛋白、多肽或单可变结构域(例如，纳米抗体)的方法，其中所述基序改变为不含有D或N，但含有例如Q或E的基序。
73.制备核苷酸序列的方法，其包括以下步骤：
a.提供编码包含至少一个纳米抗体或dAb，优选至少纳米抗体的任意一种上述多肽的核苷酸序列，所述多肽在CDR区中，优选地在CDR2和/或CDR3区，更优选地在CDR3区中具有至少一个DS，DG，NG或NS基序，或在具有接近不稳定的N或D的H-供体基团的表面暴露区中具有至少一个DS，DG，NG或NS基序；和
b.生成突变的核苷酸序列的文库，其中编码所述DS，DG，NG或NS基序的D或N的序列被改变为编码D或N以外的氨基酸的核苷酸序列。
74.制备核苷酸序列的方法，其包括以下步骤：
a.提供编码包含至少一个纳米抗体或dAb、优选至少纳米抗体的任意一终上述多肽的核苷酸序列，所述多肽在CDR区中，优选地在CDR2和/或CDR3区，更优选地在CDR3区中具有至少一个DS，DG，NG或NS基序，或在具有接近不稳定的N或D的H-供体基团的表面暴露区中具有至少一个DS，DG，NG或NS基序；和
b.生成突变的核苷酸序列的文库，其中编码所述DS，DG，NG或NS基序的D或N的序列被改变为编码D或N以外的氨基酸的核苷酸序列；和
c.其中所述突变的序列的至少一个编码包含至少一个纳米抗体或dAb、优选至少纳米抗体的突变的多肽，所述突变的多肽具有与野生型多肽基本上相同的对靶分子的亲和性。
75.制备核苷酸序列的方法，其包括以下步骤：
a.提供编码包含至少一个纳米抗体或dAb、优选至少纳米抗体的任意一种上述多肽的核苷酸序列，所述多肽在CDR区中，优选地在CDR2和/或CDR3区，更优选地在CDR3区中具有至少一个DS，DG，NG或NS基序，或在具有接近不稳定的N或D的H-供体基团的表面暴露区中具有至少一个DS，DG，NG或NS基序；和
b.生成突变的核苷酸序列的文库，其中编码所述DS，DG，NG或NS基序的D或N的序列被改变为编码D或N以外的氨基酸的核苷酸序列；和
c.其中所述突变的序列的至少一个编码包含至少一个纳米抗体或dAb、优选至少纳米抗体的突变的多肽，所述突变的多肽与其靶分子的解离常数等于或低于100nM，优选10nM，更优选1nM，更优选100pM，更优选10pM，更优选1pM。
76.制备核苷酸序列的方法，其包括以下步骤：
a.提供编码包含至少一个纳米抗体或dAb、优选至少纳米抗体的任意一种上述多肽的核苷酸序列，所述多肽在CDR区中，优选地在CDR2和/或CDR3区，更优选地在CDR3区中具有至少一个DS，DG，NG或NS基序，或在具有接近不稳定的N或D的H-供体基团的表面暴露区中具有至少一个DS，DG，NG或NS基序；和
b.生成突变的核苷酸序列的文库，其中编码所述DS，DG，NG或NS基序的D或N的序列被改变为编码选自由Q和E组成的组的氨基酸的核苷酸序列。
77.制备核苷酸序列的方法，包括以下步骤：
a.提供编码包含至少一个纳米抗体或dAb、优选至少纳米抗体的任意一种上述多肽的核苷酸序列，所述多肽在CDR区中，优选地在CDR2和/或CDR3区，更优选地在CDR3区中具有DS，DG，NG或NS基序，或在具有接近不稳定的N或D的H-供体基团的表面暴露区中具有DS，DG，NG或NS基序；和
b.生成突变的核苷酸序列的文库，其中编码所述DS，DG，NG或NS基序的D或N的序列被改变为编码选自由Q和E组成的组的氨基酸的核苷酸序列；和
c.其中所述突变的序列的至少一个编码包含至少一个纳米抗体或dAb、优选至少纳米抗体的突变的多肽，所述突变的多肽具有与野生型多肽基本上相同的对靶分子的亲和性。
78.制备核苷酸序列的方法，包括以下步骤：
a.提供编码包含至少一个纳米抗体或dAb、优选至少纳米抗体的任意一种上述多肽的核苷酸序列，所述多肽在CDR区中，优选地在CDR2和/或CDR3区，更优选地在CDR3区中具有DS，DG，NG或NS基序，或在具有接近不稳定的N或D的H-供体基团的表面暴露区中具有DS，DG，NG或NS基序；和
b.生成突变的核苷酸序列的文库，其中编码所述DS，DG，NG或NS基序的D或N的序列被改变为编码选自由Q和E组成的组的氨基酸的核苷酸序列；和
c.其中所述突变的序列的至少一个编码包含至少一个纳米抗体或dAb、优选至少纳米抗体的突变的多肽，所述突变的多肽与其靶分子的解离常数等于或低于100nM，优选10nM，更优选1nM，更优选100pM，更优选10pM，更优选1pM。
79.根据方面73-78的制备核苷酸序列的方法，其中所述CDR区是CDR1，CDR2或CDR3区。
80.根据方面73-78的制备核苷酸序列的方法，其中所述CDR区是CDR2或CDR3区。
81.根据方面73-78的制备核苷酸序列的方法，其中所述CDR区是CDR3区。
82.制备核苷酸序列的方法，其包括以下步骤：提供编码包含至少一个纳米抗体或dAb、优选至少纳米抗体的多肽的核苷酸序列，所述多肽在CDR区中，优选地在CDR2和/或CDR3区，更优选地在CDR3区中没有DS，DG，NG或NS基序，或在具有接近不稳定的N或D的H-供体基团的表面暴露区中没有DS，DG，NG或NS基序。
83.鉴定多肽、其功能衍生物或片段中的修饰作用的方法，所述多肽包含至少一个单可变结构域，例如纳米抗体或dAbs，优选纳米抗体，所述方法包括使用反相-HPLC分析的步骤。
84.包含选自由SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：25和SEQ IDNO：26组成的组的多肽的氨基酸序列。
85.包含选自由SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26组成的组的多肽的氨基酸序列。
86.包含具有SEQ ID NO：15的多肽的氨基酸序列。
87.选自由SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26组成的组的多肽。
88.由SEQ ID NO：15组成的多肽。
89.选自由SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26组成的组的多肽。
90.编码实施方案81-86的多肽的核苷酸。
91.编码实施方案82或实施方案86的多肽的核苷酸。
92.编码实施方案83或实施方案85的多肽的核苷酸。
93.包含方面90-92的核苷酸的宿主细胞。
94.一种修饰包含对异构化敏感的DS，DG，NG或NS氨基酸基序的蛋白、多肽或单可变结构域(例如，纳米抗体)的方法，其中所述基序被改变为不含有D或N，但含有例如Q或E的基序。
95.一种修饰包含对氧化作用敏感的M氨基酸基序的蛋白、多肽或单可变结构域(例如，纳米抗体)的方法，其中所述基序被改变为不含有M，但含有例如T或A的基序。
96.一种修饰在1位处包含对焦谷氨酸形成或脱酰胺作用敏感的Q或E氨基酸基序的蛋白、多肽或单可变结构域(例如，纳米抗体)的方法，其中所述基序被改变为不含有Q或E，但含有例如D的基序。

Claims (9)

1.一种制备具有改善的化学稳定性的多肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a.从亲代多肽生成突变的多肽的文库，其中所述的亲代多肽包括至少一个单可变结构域，并且其中所述亲代多肽在CDR区中具有DS,DG,NG或NS基序，或在具有接近不稳定的N或D的H-供体基团的表面暴露区中具有DS,DG,NG或NS基序，并且其中所述突变多肽的氨基酸序列以下列的方式被改变：
i.用D替换N-末端E或N-末端Q；和
ii.用A或T替换至少一个易于氧化的M；和
iii.用Q或E替换所述DS,DG,NG或NS基序的D或N；
b.和筛选所述已生成的文库的具有高亲和性或抗体亲抗原性的多肽，其中所述高亲和性或抗体亲抗原性表示为与其靶分子的解离常数，并且所述解离常数等于或小于100nM；
c.和任选地选择一个或几个具有所述高亲和性或抗体亲抗原性的突变多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述DS,DG,NG或NS基序在CDR区。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述DS,DG,NG或NS基序在CDR2或CDR3区中。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述DS,DG,NG或NS基序在CDR3区中。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述解离常数等于或小于10nM。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述解离常数等于或小于1nM。
7.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述多肽由纳米抗体组成。
8.一种选自由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成的组的多肽。
9.一种具有选自由SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34组成的组的核苷酸序列的核酸。
CN200980103486.9A 2008-01-29 2009-01-29 稳定蛋白和多肽的方法 Active CN101932593B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6287708P 2008-01-29 2008-01-29
US61/062,877 2008-01-29
US6320608P 2008-02-01 2008-02-01
US61/063,206 2008-02-01
PCT/EP2009/000573 WO2009095235A1 (en) 2008-01-29 2009-01-29 Methods to stabilize proteins and polypeptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101932593A CN101932593A (zh) 2010-12-29
CN101932593B true CN101932593B (zh) 2014-08-20

Family

ID=40756394

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980103486.9A Active CN101932593B (zh) 2008-01-29 2009-01-29 稳定蛋白和多肽的方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20110183861A1 (zh)
EP (1) EP2238156B1 (zh)
JP (1) JP5373823B2 (zh)
CN (1) CN101932593B (zh)
AU (1) AU2009210275C1 (zh)
CA (1) CA2712432C (zh)
HK (1) HK1147505A1 (zh)
WO (1) WO2009095235A1 (zh)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007114319A1 (ja) 2006-03-31 2007-10-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の血中動態を制御する方法
KR101264473B1 (ko) 2007-05-24 2013-05-29 아블린쓰 엔.브이. Ｒａｎｋ-ｌ에 대한 아미노산 서열, 및 이를 포함하는 골 질환 및 장애 치료용 폴리펩티드
US9096651B2 (en) 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
JP4954326B2 (ja) 2008-04-11 2012-06-13 中外製薬株式会社 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子
CN105646643A (zh) * 2008-10-29 2016-06-08 阿布林克斯公司 单域抗原结合性分子的纯化方法
AU2009333791B2 (en) 2008-10-29 2013-04-04 Ablynx N.V. Formulations of single domain antigen binding molecules
US9265834B2 (en) 2009-03-05 2016-02-23 Ablynx N.V. Stable formulations of polypeptides and uses thereof
EP2403873A1 (en) 2009-03-05 2012-01-11 Ablynx N.V. Novel antigen binding dimer-complexes, methods of making/avoiding and uses thereof
PL2473528T3 (pl) * 2009-09-03 2015-05-29 Ablynx Nv Stabilne formulacje polipeptydów i ich zastosowanie
WO2011042398A1 (en) 2009-10-09 2011-04-14 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4 and other cell associated proteins and methods to generate them
WO2011073180A1 (en) 2009-12-14 2011-06-23 Ablynx N.V. Single variable domain antibodies against ox40l, constructs and therapeutic use
WO2011083141A2 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Ablynx Nv Method for generation of immunoglobulin sequences by using lipoprotein particles
WO2011098518A2 (en) 2010-02-11 2011-08-18 Ablynx Nv Delivery of immunoglobulin variable domains and constructs thereof
TWI667257B (zh) * 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的ＦｃＲｎ親和力之抗體
WO2011135026A1 (en) 2010-04-30 2011-11-03 Ablynx Nv Amino acid sequences of nanobodies directed against p19 subunit of the heterodimeric cytokine il-23
KR20130080790A (ko) 2010-05-20 2013-07-15 아블린쓰 엔.브이. Ｈｅｒ３와 관련된 생물학적 물질들
WO2011161266A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Ablynx Nv Improved immunoglobulin single variable domains and constructs thereof directed against cxcr4
WO2011161263A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Ablynx Nv Pharmaceutical compositions for cutaneous administration
KR101650995B1 (ko) 2010-11-08 2016-08-25 노파르티스 아게 Ｃｘｃｒ２ 결합 폴리펩티드
SG190727A1 (en) 2010-11-30 2013-07-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
JP6032818B2 (ja) 2011-02-25 2016-11-30 中外製薬株式会社 ＦｃγＲＩＩｂ特異的Ｆｃ抗体
UA117218C2 (uk) 2011-05-05 2018-07-10 Мерк Патент Гмбх Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f
CA2835340A1 (en) 2011-05-27 2012-12-06 Ablynx Nv Inhibition of bone resorption with rankl binding peptides
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
US20150050269A1 (en) 2011-09-30 2015-02-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
BR112014013081A2 (pt) 2011-11-30 2020-10-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha veículo contendo fármaco em célula para formação de um complexo imune
TWI617577B (zh) * 2012-02-24 2018-03-11 中外製藥股份有限公司 經ＦｃγＲＩＩＢ促進抗原消失之抗原結合分子
US9328174B2 (en) 2012-05-09 2016-05-03 Novartis Ag Chemokine receptor binding polypeptides
SG11201500873XA (en) 2012-08-24 2015-04-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fcgriib-specific fc region variant
AU2014250434B2 (en) 2013-04-02 2019-08-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
US20160015789A1 (en) * 2014-07-17 2016-01-21 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. FORMULATIONS OF AN ALBUMIN hGH FUSION PROTEIN
TW202432590A (zh) 2014-12-19 2024-08-16 日商中外製藥股份有限公司 抗肌抑素之抗體、含變異Fc區域之多胜肽及使用方法
CN114773469A (zh) 2015-02-05 2022-07-22 中外制药株式会社 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il-8-结合抗体及其应用
US11359009B2 (en) 2015-12-25 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
KR20230079499A (ko) 2016-08-05 2023-06-07 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-8 관련 질환의 치료용 또는 예방용 조성물
AU2018277343A1 (en) 2017-06-02 2020-01-02 Ablynx N.V. Adamts binding immunoglobulins
WO2019098212A1 (en) 2017-11-14 2019-05-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c1s antibodies and methods of use
CN112526966B (zh) * 2020-11-20 2024-04-05 广西玉柴机器股份有限公司 一种控制器hil自动化测试方法及系统
CN115260312A (zh) * 2021-04-30 2022-11-01 保诺科技（北京）有限公司 结合ox40的抗体或抗原结合片段
CN115975055B (zh) * 2023-01-16 2024-02-02 四川大学 一种可在温和溶液条件下用于疫苗抗原等蛋白共价连接的新型Tag/Catcher共价连接体系

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1268176A (zh) * 1997-07-02 2000-09-27 基因技术股份有限公司 改进的抗lgE抗体以及改进多肽的方法
WO2006122825A9 (en) * 2005-05-20 2007-03-29 Ablynx Nv Single domain vhh antibodies against von willebrand factor

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1340265C (en) * 1985-01-18 1998-12-15 Kirston E. Koths Oxidation resistant muteins
CN1914227A (zh) * 2003-12-12 2007-02-14 中外制药株式会社 抗Mpl抗体
US8278421B2 (en) * 2006-03-20 2012-10-02 Xoma Techolology Ltd. Human antibodies specific for gastrin materials and methods
EP2494988B1 (en) * 2006-12-07 2015-09-30 Novartis AG Antagonist antibodies against EPHB3
AR065368A1 (es) * 2007-02-15 2009-06-03 Astrazeneca Ab Anticuerpos para moleculas de ige

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1268176A (zh) * 1997-07-02 2000-09-27 基因技术股份有限公司 改进的抗lgE抗体以及改进多肽的方法
WO2006122825A9 (en) * 2005-05-20 2007-03-29 Ablynx Nv Single domain vhh antibodies against von willebrand factor

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jerry Cacia, et.al.Isomerization of an Aspartic Acid Residue in the Complementarity-Determining Regions of a Recombinant Antibody to Human IgE: Identification and Effect on Binding Affinity.《Biochemistry》.1996,第35卷(第6期), *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009210275B2 (en) 2013-04-04
JP2011511628A (ja) 2011-04-14
CN101932593A (zh) 2010-12-29
AU2009210275A1 (en) 2009-08-06
AU2009210275C1 (en) 2013-08-29
CA2712432C (en) 2018-09-25
EP2238156A1 (en) 2010-10-13
WO2009095235A1 (en) 2009-08-06
EP2238156B1 (en) 2014-10-01
HK1147505A1 (zh) 2011-08-12
US20110183861A1 (en) 2011-07-28
JP5373823B2 (ja) 2013-12-18
CA2712432A1 (en) 2009-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101932593B (zh) 稳定蛋白和多肽的方法
CN102307902B (zh) 用于治疗与血管发生相关的疾病和病症的针对血管生成素/Tie系统的氨基酸序列和包括其的多肽
CN104231082B (zh) 用于治疗骨疾病和病症的针对rank-l的氨基酸序列以及包括其的多肽
CN101248087B (zh) 针对肿瘤坏死因子α的改进的纳米体TM
CN102388069B (zh) 用于治疗il-6r相关疾病和病症的改进的针对il-6r的氨基酸序列和包含其的多肽
US8999343B2 (en) Antibodies that bind myostatin, compositions and methods
EP2744822B1 (en) Modified proteins and peptides
CN102099378B (zh) 针对CXCR4和其他GPCRs的氨基酸序列以及包含所述氨基酸序列的多肽
CN102056945A (zh) 针对Notch途径的单可变结构域
CN101970490A (zh) 针对异二聚体细胞因子和/或其受体的氨基酸序列以及包括所述氨基酸序列的多肽
EP2441838A2 (en) Fusion proteins that contain natural junctions
CN101663319A (zh) 针对血管内皮生长因子的氨基酸序列和包括其的多肽用于治疗特征在于过量和/或病理性血管发生或新血管形成的病症和疾病
CA2788993A1 (en) Peptides capable of binding to serum albumin and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
US20220089703A9 (en) Aggrecan binding immunoglobulins
CN104144945A (zh) 结合铜绿假单胞菌pcrv的单可变结构域抗体
EP3630847B1 (en) Adamts binding immunoglobulins
RU2781182C2 (ru) Связывающие adamts иммуноглобулины

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant