CN100375636C - 一种对微生态制剂有保护作用的糖类组合物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对微生态制剂有保护作用的糖类组合，属于医药技术领域。微生态制剂正成为维护健康的重要生物制剂。本发明所述微生态制剂包括双歧杆菌和乳杆菌等。由于双歧杆菌对生存条件要求极为苛刻，在液体及干燥状态下都难于贮藏。目前市场上出现的微生态产品菌体存活率低，且需低温存放，流通成本较高，推广应用受到限制。本发明提供了一种在干燥及贮藏过程中对微生态制剂有保护作用的糖类组合(保护剂)，即利用透明质酸和海藻糖的双重和协同保护作用使微生物存活率提高，存活期延长，且可以在常温长期存放。本试验证明此糖类组合应用于微生态制剂，可显著提高冻干过程微生物的存活率、贮藏稳定性和活力，且保护效果较单一保护剂及常规保护剂明显提高。
Description
技术领域：
本发明是一种在干燥和贮藏过程中对微生态制剂有保护作用的糖类组合(保护剂)，属于医药技术领域。
背景技术：
近10年来随着微生态学在我国的飞速发展，以微生态制剂为主的新的一类药品、保健食品已经或正在形成产业，成为人们防治疾病、维护健康的重要生物制剂。它既有见效快的近期效果，如：预防和治疗急慢性腹泻、便秘，改善胃肠功能等。还有显著的远期效果，如：通过降低人体内毒素水平、改善营养状况、促进肝细胞生长、提高人体免疫力等而起到对肝脏的保护作用，辅助改善肝病症状；对于用化学、放射、免疫抑制剂治疗中的不良反应导致菌群失调的症状如食欲降低、乏力、白细胞计数下降等，微生态制剂可以改善前述症状，提高抗病能力。此外，肠道正常菌群直接参与食物的消化吸收，其代谢产物中有多种维生素和酶，可以作为老、幼、病人的营养保健食品。因此微生态制剂的最大特点是“有病治病，未病防病，无病保健”。我国微生态学奠基人魏曦教授曾经预言：“抗生素之后的时代将是生态制剂的时代”。21世纪，微生态产业将形成创造巨大社会效益和经济效益的产业。
本发明所保护的微生态制剂包括双歧杆菌(Bifidobacterium)和乳杆菌(Lactobacillus)等。常用于肠道微生态制剂中的双歧杆菌是较难长期贮藏的G+、无芽孢、不运动的专一性厌氧菌，对生存条件要求极为苛刻，外界环境的少许变化就易引起该菌的死亡。加之在其生命活动过程中还会产生一些危及自身正常生长繁殖的乳酸、乙酸等代谢产物，故不但在液体条件下难以贮藏，即使在干燥状态下也不易长期贮藏。因此，如何提高菌体的存活率、保证微生态制剂的货架寿命，是目前困扰活菌制剂行业的技术难题之一。目前市场上出现的微生态产品菌体存活率低，且均需在低温下长期存放，使流通成本增加，推广应用受到限制。利用透明质酸和海藻糖的双重和协同保护作用，可使微生物存活率提高，存活期延长，且可以在常温长期存放。也可以在微生态制剂中加入双歧因子，如异麦芽低聚糖、低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、低聚乳酮糖、低聚异麦芽酮糖、低聚木糖、低聚乳果糖、低聚甘露糖、异构化乳糖、低聚龙胆糖、棉子糖、水苏糖、木糖醇、甘露醇、山梨醇、酪蛋白水解产物、α-乳清蛋白、乳铁蛋白、茶多酚、人参皂苷等，促进双歧杆菌增殖。
1透明质酸的结构、性质和主要作用
透明质酸是由葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖为双糖单位组成的直链黏多糖。在水溶液中，透明质酸分子相互作用形成具有一定刚性的大分子网状结构，该结构可以将微生物镶嵌在网眼中起到保护作用；较高浓度下透明质酸玻璃化，处于玻璃态的物质的分子很不活跃，透明质酸在微生物外部形成玻璃态，从而起到保护作用。
透明质酸为生物体正常组成成分，无毒副作用。
2海藻糖的结构、性质和主要作用
海藻糖是由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合而成的双糖。海藻糖有三种异构体，即α，α-型、α，β-型和β，β-型。海藻糖存在二水晶体、非晶体和无水晶体三种形态。海藻糖性质非常稳定。
海藻糖广泛存在于自然界，如低等蕨类植物、藻类、细菌、真菌、酵母、昆虫及无脊椎动物中。是一种对于环境变化形成的应激状态具有高抗性的物质，是生物体内的一种典型的应激代谢物。在各种恶劣环境下，海藻糖表现出对物种的生物膜、蛋白质和核酸等良好的保护作用。最新研究表明，外源性的海藻糖具有良好的非特异性保护作用。
海藻糖无毒无害，对人体无不良反应。
海藻糖的生物保护机制：
“水替代”假说：生物分子周围包着一层水膜，当干燥、冷冻等条件下失去水膜时，海藻糖分子能在失水部位与生物分子以氢键连接，以代替失去的结构水膜，而不致使生物分子丧失活性。
“玻璃态”假说：当生物成分干燥时，海藻糖紧密地包住相邻的分子，形成一种在结构上与玻璃状的冰相类似的糖玻璃体，其扩散系数很低，分子运动和分子变性非常微弱，能够使生物分子维持一定的空间结构。
“优先排阻”假说：海藻糖优先与蛋白质表面的水分子结合，结果蛋白质的溶剂化层半径减小，分子结构更紧密，构象更稳定，有利于抵御外界极端环境的影响。
由上可以看出，生物体脱水过程中，海藻糖对生物膜、蛋白质等起到独特的保护作用，提高微生物的存活率。
3透明质酸和海藻糖组合作为微生态制剂的保护剂的优势
由于透明质酸为大分子化合物，不能进入微生物细胞内部，但可形成三维网状结构将微生物镶嵌在网眼中。海藻糖为小分子化合物，能够渗透进入细胞内部发挥作用。我们将透明质酸和海藻糖组合使用，这样在微生物细胞内外均存在保护剂，保护作用优于单一保护剂及常规保护剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种在干燥和贮藏过程中对微生态制剂有保护作用的糖类组合(保护剂)。
本发明对微生态制剂有保护作用的糖类组合为透明质酸和海藻糖，两者浓度分别为0.01％～1.5％、0.1％～50％。
本发明透明质酸是指任何来源的透明质酸，包括由动物组织提取分离而得、微生物发酵而得及基因工程制备而得等。
本发明透明质酸包括透明质酸及其盐类如：透明质酸钠(又称玻璃酸钠)、透明质酸锌(又称玻璃酸锌)等。
本发明透明质酸是指任何相对分子质量的透明质酸。
本发明海藻糖是指任何来源的海藻糖，包括由植物、动物组织提取分离而得，微生物发酵而得及基因工程制备而得等。
本发明海藻糖是指任何存在形式的海藻糖，包括α，α-型、α，β-型和β，β-型，二水晶体、非晶体和无水晶体。
本发明所保护的微生态制剂包括双歧杆菌和乳杆菌。
本发明所保护的双歧杆菌包括两歧双歧杆菌(B.bifidum)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、婴儿双歧杆菌(B.infants)、长双歧杆菌(B.longum)和短双歧杆菌(B.breve)中的一种或几种。乳杆菌包括嗜酸乳杆菌(L.acidophilus )、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、干酪乳杆菌(L.casei)、格氏乳杆菌(L.gasseri))和罗伊乳杆菌(L.reuteri)中的一种或几种。
本发明所保护的微生态制剂也可以加入双歧因子，促进双歧杆菌增殖。双歧因子包括异麦芽低聚糖、低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、低聚乳酮糖、低聚异麦芽酮糖、低聚木糖、低聚乳果糖、低聚甘露糖、异构化乳糖、低聚龙胆糖、棉子糖、水苏糖、木糖醇、甘露醇、山梨醇、酪蛋白水解产物、α-乳清蛋白、乳铁蛋白、茶多酚、人参皂苷等。
本发明所保护的微生态制剂具有维持肠道微生态平衡，治疗因菌群失调引起的便秘、腹泻等肠道疾病；增强机体免疫功能；降低血胆固醇和甘油三酯；预防、抑制肿瘤发生；抗衰老等作用。
本发明在干燥和贮藏过程中对微生态制剂有保护作用的糖类组合(保护剂)配方为：以100mL保护剂溶液计，其中透明质酸0.01～1.5g，海藻糖0.1～50g，其余为去离子水。
本发明在干燥和贮藏过程中对微生态制剂有保护作用的糖类组合(保护剂)制备方法是：按本发明对微生态制剂有保护作用的糖类组合配方及用量，将一定量透明质酸、海藻糖置于少量去离子水中搅拌溶解后，加去离子水至一定体积定容，得到含透明质酸和海藻糖的溶液，将该溶液用微孔滤膜过滤除菌，即为本发明保护剂。
本发明在干燥和贮藏过程中对微生态制剂有保护作用的糖类组合的应用方法是：双歧杆菌、乳杆菌菌种活化，分别于37℃恒温厌氧培养和CO2培养16～18h，使菌体浓度均达到1×1011cfu/mL以上，将上述菌液于4℃分别以4000r-min-1离心20min收集菌体，用冷的无菌去离子水洗涤两次，再次离心收集，两种菌体以1∶1比例混合，悬浮于保护剂溶液中，保护剂的加量使菌体浓度大约在l×1011cfu/mL。可以加入双歧因子，双歧因子事先经过除菌处理。将混合菌液进行干燥处理。干燥方法包括冷冻干燥、真空干燥和喷雾干燥。
具体实施方式：
本发明实施例1：
取透明质酸0.01g、海藻糖1g，用去离子水溶解混匀，定容至10ml，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得本发明保护剂。取上述保护剂0.5mL，称取离心后的湿菌体0.1mg，悬浮于保护剂中。再根据需要添加一定量经事先除菌的双歧因子，得混合菌液。
将混合菌液分装于无菌具塞玻璃瓶内，先预冻至约-35℃，再放入冻干机内冷冻干燥约25h，得冻干菌粉。要求产物中残余水分达2％～3％。
本发明实施例2；
取透明质酸0.01g、海藻糖1g，用去离子水溶解混匀，定容至10ml，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得本发明保护剂。取上述保护剂0.5mL，称取离心后的湿菌体0.1mg，悬浮于保护剂中。再根据需要添加一定量经事先除菌的双歧因子，得混合菌液。
将混合菌液分装于无菌具塞玻璃瓶内，置真空干燥机中于真空度20～30Pa、品温30℃下真空干燥约48h，得干燥菌粉。要求产物中残余水分达2％～3％。
本发明实施例3：
取透明质酸0.01g、海藻糖1g，用去离子水溶解混匀，定容至10ml，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得本发明保护剂。取上述保护剂0.5mL，称取离心后的湿菌体0.1mg，悬浮于保护剂中。再根据需要添加一定量经事先除菌的双歧因子，得混合菌液。
将混合菌液分装于无菌具塞玻璃瓶内，置离心式喷雾干燥机内进行喷雾干燥，进口温度为120℃，出口温度为80℃，得干燥菌粉。要求产物中残余水分达2％～3％。
本发明实验研究数据
本实验以不加保护剂的菌液经同样方式冻干后为阴性对照，以10％蔗糖、10％乳糖、0.1％透明质酸和10％海藻糖分别为保护剂的冻干菌粉组为阳性对照，考察了本发明实施例中保护剂对冻干微生态制剂的保护效果，考察指标为菌体存活率和菌体产酸力。实验结果如表1～表3所示。
表1本发明实施例中保护剂对冻干菌体存活率的影响
| 组别 | 存活率(％) |
| 无保护剂10％蔗糖10％乳糖0.1％透明质酸10％海藻糖本发明保护剂 | 55.275.580.971.485.695.3 |
表2本发明实施例中保护剂对冻干菌体产酸力的影响
| 组别 | 产酸力(％) | |
| 冻干前 | 冻干后 | |
| 无保护剂10％蔗糖10％乳糖0.1％透明质酸10％海藻糖本发明保护剂 | 0.200.210.230.220.210.23 | 0.080.100.120.090.150.19 |
表3本发明实施例中保护剂对冻干菌体贮藏稳定性的影响
| 组别 | 每1克冻干菌粉活菌数(1gN) | |
| 4℃ | 25℃ | |
| 0d 30d 60d | 0d 30d 60d | |
| 无保护剂10％蔗糖10％乳糖0.1％透明质酸10％海藻糖本发明保护剂 | 10.11 9.10 8.0710.59 10.08 9.1410.82 10.32 9.3710.56 10.10 9.0410.92 10.37 10.1611.59 10.94 10.59 | 10.11 8.76 7.2410.59 9.17 7.5210.82 9.34 7.7310.56 9.02 7.1710.92 9.98 9.0511.59 10.71 10.11 |
以上结果表明，透明质酸和海藻糖组合应用于微生态制剂的保护剂，可显著提高冻干过程微生物的存活率、活力和贮藏稳定性，单独使用透明质酸和海藻糖均具有保护作用，但效果不如本发明实施例中两者组合使用。本发明保护剂比常规保护剂(如蔗糖、乳糖)的保护效果明显提高。
Claims (5)
1.透明质酸和海藻糖组合物在微生态制剂干燥和贮藏过程中作为保护剂的用途。
2.权利要求书1所述的用途，其中组合物中透明质酸的浓度为0.01％～1.5％，海藻糖的浓度为0.1％～50％，其余为去离子水。
3.权利要求1所述的用途，其中微生态制剂为双歧杆菌和乳杆菌。
4.权利要求3所述的用途，其中双歧杆菌为两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌和短双歧杆菌中的一种或几种；乳杆菌为嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、格氏乳杆菌和罗伊乳杆菌中的一种或几种。
5.权利要求书1或2所述的用途，其中透明质酸为透明质酸及其盐：透明质酸钠、透明质酸锌。
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